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FACULDADE DE ODONTOLOGIA ASSOCIAÇÃO ENTRE O USO DE BISFOSFONATOS E OSTEONECROSE DOS MAXILARES: ESTUDO EM RATOS MARCIA ANGELICA PETER MAAHS 2008
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FACULDADE DE ODONTOLOGIA
ASSOCIAÇÃO ENTRE O USO DE BISFOSFONATOS E
OSTEONECROSE DOS MAXILARES:
ESTUDO EM RATOS
MARCIA ANGELICA PETER MAAHS
2008
PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
MARCIA ANGELICA PETER MAAHS
ASSOCIAÇÃO ENTRE O USO DE BISFOSFONATOS E OSTEONECROSE DOS
MAXILARES: ESTUDO EM RATOS
PORTO ALEGRE
2008
MARCIA ANGELICA PETER MAAHS
ASSOCIAÇÃO ENTRE O USO DE BISFOSFONATOS E OSTEONECROSE DOS
MAXILARES: ESTUDO EM RATOS
Tese apresentada como requisito para obtenção do título de Doutor pelo Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Área de Concentração em Estomatologia Clínica, Faculdade de Odontologia, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Orientador(a): Dra. Karen Cherubini
Consultor: Dr. Alan Arrieira Azambuja
PORTO ALEGRE
2008
DEDICATÓRIA
Dedico esta tese aos meus pais, Darci e Clarinha, por serem
muito importantes em minha vida. Ao meu esposo Gerson que,
através do nosso amor, é meu grande companheiro e sempre
apóia minhas decisões. Aos meus filhos Gerhard e Thomas,
meus grandes amigos, por fazerem a vida valer muito a pena. À
minha irmã Débora, por sempre me incentivar, e aos demais
familiares, pelo convívio motivador.
AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS
Agradeço à minha orientadora, professora Dra. Karen Cherubini que de forma
serena, séria e responsável objetivou e se fez presente em todas as etapas desta tese, e por ser
um grande exemplo de caráter.
Ao médico oncologista Dr. Alan Arrieira Azambuja que, por meio de seus
conhecimentos e empenho, muito colaborou com o trabalho.
Aos professores deste Curso de Doutorado, que atuaram de forma profissional, séria e
estimulante com o objetivo de ensinar. Em especial, à professora Dra. Liliane Soares Yurgel,
que se fez presente em muitos momentos durante a pesquisa.
Aos professores de Ortodontia da UFRGS Drs. Eduardo Silveira Ferreira, José
Renato Prietsch e Karina Santos Mundstock, por serem meus exemplos profissionais. Em
especial, ao professor Enio Barcellos Ferreira que, até hoje, possibilita-me desfrutar de seus
conhecimentos, ao professor Telmo Bandeira Berthold por estar presente desde o princípio
em minha formação profissional e ao professor Carlos Alberto Mundstock, pelas
oportunidades científicas.
Aos meus colegas do Curso de Doutorado Elaini Hosni, Sérgio Miguens e Tissiana
Rossi, pela troca de experiências durante as disciplinas cursadas.
Ao laboratório farmacêutico Novartis, por fornecer o zoledronato.
À Faculdade de Farmácia da PUCRS, por disponibilizar o local para realização do
experimento. Em especial, às professoras Fernanda Morroni e Maria Martha Campos,
pela permissão e assessoramento técnico respectivamente.
À patologista Dra. Ana Geyer, pelo auxílio por meio de seus conhecimentos.
Ao professor Dr. Vinícius Duval da Silva, do Laboratório de Anatomia Patológica do
Hospital São Lucas da PUCRS, por disponibilizar o equipamento para o processo de captura e
análise das imagens histológicas.
Ao professor Dr. Jefferson Braga Silva e ao técnico de laboratório Gilmar Pontes
Moreira, do Laboratório da Faculdade de Medicina - Técnica Operatória, Anatomia
Patológica e Microcirurgia da PUCRS, pelo apoio técnico na fase inicial.
À minha colega e amiga Dra. Cínthia Cense Corrêa, por ter auxiliado no início desta
pesquisa.
A Deus, pela vida e saúde!
EPÍGRAFE
Uma pessoa permanece jovem na medida em que
ainda é capaz de aprender, adquirir novos hábitos
e tolerar contradições.
Marie von Ebner- Eschenbach (1830-1916)
RESUMO
RESUMO
A presente pesquisa teve por objetivo investigar se a terapia com bisfosfonato
nitrogenado é fator suficiente à ocorrência de osteonecrose maxilar em indivíduos submetidos
a exodontias, bem como avaliar os eventos macro e microscópicos que caracterizam a área
submetida a exodontias nesses indivíduos. Trinta e um ratos fêmeas (Rattus norvegicus,
Wistar) foram distribuídos em 3 grupos submetidos a exodontias: (1)11 animais tratados com
alendronato por via oral; (2)10 animais tratados com zoledronato por via parenteral e (3)10
animais que não receberam bisfosfonato. Aos 45 dias do início da terapia, os grupos foram
submetidos a exodontias e, concluído o prazo de 145 dias, os animais foram mortos. Após
avaliação macroscópica, que investigou a presença de solução de continuidade da mucosa,
cortes histológicos da área das exodontias foram corados por hematoxilina e eosina (HE) e
submetidos a processamento imunoistoquímico empregando-se o anticorpo monoclonal anti-
VEGF (VG1). As lâminas coradas por HE foram submetidas à avaliação das variáveis
osteonecrose, infiltrado celular inflamatório, colônias microbianas, tecido epitelial, tecido
conjuntivo fibroso, resto radicular e osso vital. A expressão imunoistoquímica do VEGF em
campo de tecido ósseo vital também foi avaliada. As variáveis foram quantificadas aplicando-
se o método da contagem manual de pontos por meio do software Image Pro Plus 6.0. Na
avaliação macroscópica, verificou-se que o grupo zoledronato está associado à presença de
solução de continuidade da mucosa (qui-quadrado, análise de resíduos ajustados, P<0,001).
Nas variáveis osteonecrose, infiltrado celular inflamatório e colônias microbianas, o grupo
zoledronato exibiu percentuais significativamente maiores do que os demais grupos. Nas
variáveis tecido epitelial, tecido conjuntivo fibroso, resto radicular, osso vital (Kruskal-
Wallis, teste de comparações múltiplas, α=0,05) e marcação positiva para VEGF (ANOVA,
P=0,860) não houve diferença significativa entre os grupos avaliados. Os resultados permitem
concluir que (1) a administração de bisfosfonato nitrogenado por via parenteral está associada
à osteonecrose dos maxilares e é condição suficiente para que esta ocorra em indivíduos
submetidos a exodontias; (2) o bisfosfonato nitrogenado administrado por via oral não
constitui condição suficiente para a ocorrência de osteonecrose maxilar em indivíduos
submetidos a exodontias; (3) a administração de bisfosfonato nitrogenado, por via oral ou
parenteral, não está associada à diminuição da expressão imunoistoquímica do VEGF em
tecido ósseo vital na área das exodontias.
Palavras-chave: Bisfosfonatos. Osteonecrose dos Maxilares. Angiogênese. Zoledronato.
Alendronato.
SUMMARY
SUMMARY
The aim of this work was to investigate if nitrogen bisphosphonate therapy is a
sufficient condition to determine the occurrence of maxillary osteonecrosis in individuals
undergoing tooth extraction, as well to assess the macro- and microscopic features at the site
of tooth extraction in this population. Thirty-one female rats (Rattus norvegicus, Wistar) were
allocated into 3 groups: (1)11 rats treated with oral alendronate; (2)10 rats treated with
parenteral zoledronate, and (3)10 rats without bisphosphonate treatment. At the 45th day of
drug administration, all groups were submitted to tooth extractions and, as completed 145-day
period, the animals were euthanized. After a macroscopic evaluation for the presence of oral
mucosal lesion, histological slices of the site of tooth extraction were processed for
hematoxilin/eosin staining and immunohistochemistry with anti-VEGF monoclonal antibody
(VG1). Osteonecrosis, inflammatory cell infiltrate, microorganism colonies, epithelial tissue,
connective tissue, root fragment and vital bone were determined with HE staining. The tooth
extraction site was also analyzed for VEGF immunohistochemical expression of vital bone
tissue. Variables were quantified by the manual point counting method using the software
Image Pro Plus 6.0. Macroscopic analysis showed that the zoledronate group was associated
with the occurrence of oral mucosal lesion (chi-square, residual adjusted analysis, P<0.001).
The zoledronate group also showed significant higher incidences of osteonecrosis,
inflammatory cell infiltrate and microorganism colonies in comparison to the other groups.
There was no significant difference for incidence of epithelial tissue, connective tissue, root
fragment, vital bone (Kruskal-Wallis, multiple comparison test, α=0.05) and positive staining
for VEGF (ANOVA, P=0.860) among the groups analyzed. According to the results, (1)
parenteral therapy with nitrogen bisphosphonate is associated with maxillary osteonecrosis
and represents sufficient condition for the occurrence of osteonecrosis in individuals
submitted to tooth extraction; (2) oral therapy with nitrogen bisphosphonate is not a sufficient
condition for the occurrence of maxillary osteonecrosis in individuals submitted to tooth
extraction; (3) neither oral or parenteral nitrogen bisphosphonate therapy is associated with
lower immunohistochemical VEGF expression of vital bone tissue at the tooth extraction site.
Key words: Bisphosphonates. Osteonecrosis of the Jaws. Angiogenesis. Zoledronate.
Alendronate.
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE FIGURAS
Figura 1– Estrutura química dos bisfosfonatos ........................................................................26
Figura 2 – Administração dos fármacos: (A) pesagem dos animais; (B) administração do
alendronato, técnica de gavagem oral; (C) administração intraperitoneal do zoledronato .....42
Figura 3 – Avaliação clínica.....................................................................................................42
Figura 4 – Etapas das Exodontias: (A) anestesia; (B) posicionamento do animal e instrumental
empregado; (C) procedimento cirúrgico; (D) molares superiores extraídos ............................44
Figura 5 – Exame macroscópico: (A) sondagem com sonda clínica n˚ 5 evidencia solução de
continuidade da mucosa; (B) espécime sem solução de continuidade da mucosa ...................45
Figura 6 – Desenho esquemático do preparo do espécime para processamento histológico ...46
Figura 7 – Preparo do espécime para processamento histológico ............................................46
Figura 8 – Área das exodontias (lado direito) e área oposta (com dentes) contempladas tanto no
espécime macroscópico (A) quanto no corte histológico (B, C). HE, aumento aproximado:
100X ............................................................................................................................................... 48
Figura 9 – Imagens capturadas no sítio das exodontias. HE, objetiva 5X ...............................49
Figura 10 – Quantificação das variáveis histológicas (HE) pelo método de contagem manual
de pontos...................................................................................................................................49
Figura 11 – Quantificação da expressão imunoistoquímica do VEGF pelo método de
contagem manual de pontos .....................................................................................................50
Figura 12 – Distribuição da amostra segundo a presença das variáveis histológicas avaliadas,
Porto Alegre, 2008....................................................................................................................54
Figura 13 – Mediana das variáveis histológicas nos grupos zoledronato, alendronato e
controle, Porto Alegre, 2008.....................................................................................................56
Figura 14 – Osteonecrose: osso não-vital e colônias microbianas. HE, aumento aproximado:
200X .........................................................................................................................................57
Figura 15 – Osso não-vital (A) contíguo ao osso vital (B). HE, aumento aproximado:100X.58
Figura 16 – Colônias microbianas compatíveis com Actinomyces sp. e infiltrado inflamatório.
HE, aumento aproximado: 400X..............................................................................................58
Figura 17 – Osteonecrose, colônias microbianas e infiltrado inflamatório. HE, aumento
aproximado: 200X ....................................................................................................................59
Figura 18 – Infiltrado inflamatório (áreas próximas aos restos radiculares): linfócitos,
plasmócitos e células gigantes multinucleadas (seta). HE, aumento aproximado: 400X.........59
Figura 19 – Reparo cicatricial: osso vital, tecido conjuntivo fibroso e revestimento por epitélio
pavimentoso estratificado ceratinizado. HE, aumento aproximado: 100X ..............................60
LISTA DE TABELAS
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Distribuição da amostra segundo presença/ausência de solução de continuidade na
mucosa oral ao exame macroscópico (área das exodontias), Porto Alegre, 2008....................52
Tabela 2 – Distribuição da amostra de acordo com presença/ausência das variáveis
histológicas avaliadas na área das exodontias, Porto Alegre, 2008..........................................54
Tabela 3 – Quantificação das variáveis histológicas (HE) na área das exodontias nos grupos
zoledronato, alendronato e controle, Porto Alegre, 2008.........................................................55
Tabela 4 – Expressão imunoistoquímica do VEGF em área de osso vital nos grupos
zoledronato, alendronato e controle, Porto Alegre, 2008.........................................................57
SUMÁRIO
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................22
2 REVISÃO DA LITERATURA ..........................................................................................25
2.1 BISFOSFONATOS ............................................................................................................25
2.1.1 Estrutura Química.........................................................................................................25
2.1.2 Farmacocinética.............................................................................................................26
2.1.3 Mecanismo de Ação .......................................................................................................27
2.1.4 Indicações .......................................................................................................................29
2.1.5 Efeitos Adversos.............................................................................................................31
2.1.5.1 Osteonecrose.................................................................................................................32
3 PROPOSIÇÃO ....................................................................................................................38
3.1 HIPÓTESE .........................................................................................................................38
3.2 OBJETIVOS.......................................................................................................................38
3.2.1 Objetivo Geral ...............................................................................................................38
3.2.2 Objetivos Específicos .....................................................................................................38
4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................40
4.1 DELINEAMENTO.............................................................................................................40
4.2 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA ............................................................................40
4.3 PROCEDIMENTOS...........................................................................................................40
4.3.1 Manutenção dos Animais ..............................................................................................40
4.3.2 Administração dos Fármacos .......................................................................................41
4.3.3 Avaliação Clínica ...........................................................................................................42
4.3.4 Exodontias ......................................................................................................................43
4.3.5 Eutanásia, Avaliação Macroscópica e Preparo dos Espécimes .................................44
4.3.6 Confecção das Lâminas Histológicas ...........................................................................47
4.4 ANÁLISE HISTOLÓGICA ...............................................................................................47
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................................................50
5 RESULTADOS ....................................................................................................................52
5.1 AVALIAÇÃO CLÍNICA ...................................................................................................52
5.2 AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA....................................................................................52
5.3 AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA ........................................................................................53
5.3.1 Distribuição da Amostra de Acordo com as Variáveis Histológicas (HE) ...............53
5.3.2 Quantificação das Variáveis Histológicas na Área das Exodontias (HE) ................55
5.3.3 Quantificação da Expressão Imunoistoquímica do VEGF em Área de Osso Vital.56
5.3.4 Análise Descritiva (HE).................................................................................................57
5.3.4.1 Osteonecrose.................................................................................................................57
5.3.4.2 Colônias Microbianas ...................................................................................................58
5.3.4.3 Infiltrado Inflamatório ..................................................................................................59
5.3.4.4 Reparo Cicatricial .........................................................................................................60
6 DISCUSSÃO ........................................................................................................................62
7 CONCLUSÕES....................................................................................................................70
REFERÊNCIAS .....................................................................................................................72
ANEXOS .................................................................................................................................86
INTRODUÇÃO
22
1 INTRODUÇÃO
A primeira síntese dos bisfosfonatos ocorreu na metade do século XIX, em 1865 na
Alemanha, para aplicação na indústria. Em seres humanos, o uso iniciou há cerca de 40 anos
(FLEISCH, 1998). Esses compostos têm, em sua estrutura química, uma ligação P-C-P e
agem como eficazes inibidores da reabsorção óssea mediada pelos osteoclastos. Tal
propriedade lhes confere indicação no manejo de desordens do cálcio e do metabolismo ósseo
(FLEISCH, 1987) caracterizadas por aumento da reabsorção óssea, como a doença de Paget,
hipercalcemia, metástases ósseas de neoplasias malignas, hiperparatireoidismo primário e
secundário e osteoporose (VASIKARAN, 2001).
Desde 2003, a literatura tem relatado casos de osteonecrose dos maxilares em
pacientes submetidos à terapia com bisfosfonatos, principalmente após exodontias (CARTER
et al., 2005; MARX, 2003; MORTENSEN et al., 2007; RUGGIERO et al., 2004; ZUAZAGA
et al., 2006). Fatos intrigantes e ainda não esclarecidos como a restrição da lesão ao
complexo maxilomandibular sem acometer outros sítios do esqueleto (MARX et al., 2005) e o
desafio que representa à abordagem terapêutica têm despertado a atenção da comunidade
científica (MARX, 2003; MIGLIORATI, 2003; MIGLIORATI et al., 2005; PURCELL;
BOYD, 2005).
Há relatos de que o uso oral dos bisfosfonatos compreende menor risco à
osteonecrose, enquanto a administração intravenosa representa risco elevado (FARRUGIA et
al., 2006; PURCELL; BOYD, 2005). Uso de corticosteróides, quimioterapia (SCHWARTZ,
1982; TARASSOFF; CSERMAK, 2003), radioterapia, presença de anemia, coagulopatias,
infecções, doenças orais pré-existentes (NOVARTIS ONCOLOGY MEDICAL AFFAIRS &
SERVICES, 2004), história familiar, estilo de vida, uso de álcool e tabaco (MIGLIORATI et
al., 2005), entre outros, são apontados como fatores de risco. Entretanto, a real necessidade de
sua participação no desenvolvimento das lesões ainda é assunto controverso.
Seria o uso do bisfosfonato fator suficiente para o desenvolvimento de osteonecrose
em pacientes submetidos a trauma do tecido ósseo do complexo maxilomandibular? O papel
dos fatores de risco é fator indispensável à ocorrência das lesões? Existe efetiva diferença de
risco à osteonecrose a depender da via de administração do bisfosfonato? As informações de
que se dispõe até o momento são, em sua maioria, resultado de pesquisas clínicas que avaliam
pacientes portadores da condição. A presente pesquisa teve por objetivo investigar em
modelos animais se a terapia com bisfosfonato, pelas vias oral e parenteral, é fator suficiente à
23
ocorrência de osteonecrose maxilar em indivíduos submetidos a exodontias, bem como
avaliar os eventos macro e microscópicos que caracterizam a área submetida a exodontias
nesses indivíduos.
REVISÃO DA LITERATURA
25
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 BISFOSFONATOS
2.1.1 Estrutura Química
Os bisfosfonatos compõem uma classe de substâncias químicas que exibem a ligação
P-C-P em sua estrutura. São análogos químicos do ácido pirofosfórico (Figura 1) que, no
organismo humano, ocorre como pirofosfato, um inibidor natural da reabsorção óssea. O
pirofosfato não pode ser empregado como agente terapêutico no tratamento de doenças
ósseas, pois sofre rápida hidrólise enzimática. Os bisfosfonatos, por sua vez, são seus
análogos sintéticos, em que o átomo central de oxigênio é substituído por um átomo de
carbono. Essa modificação faz com que sejam mais resistentes à degradação enzimática e
tenham meia-vida biológica maior, o suficiente para influenciar o metabolismo ósseo
(LICATA, 1997). Diferentes substituintes nos radicais R1 e R2, ligados ao carbono central,
conferem características únicas para cada fármaco (Figura 1). O grupo R1 confere aos
bisfosfonatos afinidade pelos cristais ósseos, enquanto o grupo R2 é responsável pela potência
e atividade farmacológica (FLEISCH, 1989). A presença do grupamento hidroxila (OH) em
R1 confere maior fixação ao osso e é característica dos fármacos alendronato, etidronato,
ibandronato, pamidronato, risedronato e zoledronato. Por outro lado, a presença de cloro (Cl)
em R1, como acontece com o clodronato, significa fixação reduzida (RESZKA, 2004).
26
Figura 1- Estrutura química dos bisfosfonatos Fonte: Modificado de Reszka (2004)
Existem três gerações de bisfosfonatos. A primeira é composta pelos não-
nitrogenados, que inclui os análogos do trifosfato de adenosina (ATP) etidronato, clodronato
(LEHENKARI et al., 2002; RESZKA, 2004) e o tiludronato (CARTER et al., 2005), que
possui potência anti-reabsortiva similar à do clodronato (ROGERS et al., 2000). A segunda e
a terceira gerações são compostas pelos nitrogenados. Os da segunda geração, alendronato,
pamidronato (TENENBAUM et al., 2002) e ibandronato (PONTE FERNÁNDEZ et al.,
2006), são de 10 a 1000 vezes mais potentes que os da primeira (LIN, 1996). Os da terceira
geração contêm uma cadeia cíclica (ROGERS et al., 2000), sendo seus representantes o
risedronato e o zoledronato (TENENBAUM et al., 2002). Este último, cuja potência é 100 a
850 vezes superior à do pamidronato, é o mais potente entre os já submetidos a testes in vitro
e in vivo (BODY, 1997).
2.1.2 Farmacocinética
Os bisfosfonatos administrados por via oral são pouco absorvidos pelo organismo
(FARIAS, 2005; GERTZ et al., 1991; LIN et al., 1991), com taxa de absorção igual ou
27
inferior a 1% da dose administrada. A absorção é quase totalmente prevenida com o uso de
alimentos que contenham cálcio ou outros íons divalentes que façam o quelamento do
fármaco (GERTZ et al., 1991; LIN et al., 1991). Se administrados por infusão intravenosa,
são rapidamente removidos do plasma e exibem taxa de excreção renal de 40% nas primeiras
24 horas. Não ocorre metabolização pelo tecido ósseo (KHAN et al., 1997), a excreção renal é
a única rota de eliminação. Por outro lado, uma vez ligados ao tecido ósseo, só são liberados
quando este sofre reabsorção (LIN, 1996). São resistentes à degradação enzimática, e a meia-
vida no esqueleto pode ser superior a um ano (LICATA, 1997). A droga tem efeito
cumulativo no tecido ósseo, e dados sugerem que nem toda a fração acumulada seja ativa,
apenas aquela que está na superfície óssea, por isso a necessidade de reposição (SATO et al.,
1991). Os bisfosfonatos sofrem baixa absorção intestinal em humanos, com
biodisponibilidade de cerca de 0,7% para o alendronato, por exemplo (LIN, 1996).
2.1.3 Mecanismo de Ação
A estrutura química dos bisfosfonatos determina, além da fixação ao osso e de sua
potência, efeitos intracelulares (LEHENKARI et al., 2002). Os dois efeitos biológicos
fundamentais são: inibição da calcificação (normal e ectópica), quando administrados em
altas doses, e inibição da reabsorção óssea (FLEISCH, 1998). O mecanismo de ação baseia-se
na alta afinidade ao cálcio esqueletal e na prevenção da dissolução dos cristais ósseos
(LICATA, 1997). Como não são metabolizados, mantêm-se em altas concentrações no osso
por muito tempo (RODAN; FLEISCH, 1996), unidos fortemente aos cristais de hidroxiapatita
(BARRIOS GONZÁLEZ; GARCÍA NIETO, 2005; LICATA, 1997). Durante a reabsorção,
são internalizados pelos osteoclastos (BARRIOS GONZÁLEZ; GARCÍA NIETO, 2005;
LICATA, 1997), o que leva, posteriormente, à perturbação desse processo (RODAN;
FLEISCH, 1996).
Os diferentes grupos de bisfosfonatos podem atuar por mecanismos distintos, porém
seu efeito final é a diminuição do desempenho dos osteoclastos, bem como a indução dos
mesmos à apoptose. A droga causa redução precoce da reabsorção seguida por redução tardia
da formação óssea. Também in vitro, inibem a reabsorção óssea por parte dos osteoclastos,
que é estimulada por uma variedade de agentes osteotrópicos, como o hormônio da
paratireóide (PTH), o calcitriol, as prostaglandinas e as citocinas. A redução da reabsorção
28
induz à redução do nível sérico de cálcio, o que leva ao aumento do PTH (VASIKARAN,
2001).
Pesquisas com marcadores bioquímicos demonstraram que os bisfosfonatos inibem a
reabsorção e diminuem o turnover ósseo (McCLUNG et al., 2005; OYAJOBI; MUNDY,
2004). O efeito sobre os osteoclastos ocorre em vários níveis: inibição do recrutamento
(HUGHES et al., 1989; FLEISCH, 1993), diminuição do tempo de vida (HUGHES et al.,
1995), inibição da atividade do osteoclasto na superfície óssea (MURAKAMI et al., 1995) e
ativação da apoptose (FLEISCH, 1993; IGARASHI et al., 1996).
Também tem sido postulado que os bisfosfonatos induzem os osteoblastos, que
controlam o recrutamento e a atividade dos osteoclastos em condições fisiológicas e
patológicas (COLLIN et al., 1992), a secretar um inibidor da reabsorção osteoclástica (VITTÉ
et al., 1996), a osteoprotegerina (VIERECK et al., 2002). Reinholz et al. (2000), ao
empregarem osteoblastos fetais humanos, demonstraram que estes sofrem ação tanto do
pamidronato quanto do zoledronato, o que aumenta a formação óssea.
Os bisfosfonatos exibem distintos mecanismos de ação, conforme sejam nitrogenados
ou não-nitrogenados. Evidências sugerem que os nitrogenados, que incluem o zoledronato e o
alendronato, possuem mecanismo de ação e propriedades farmacológicas sobre a atividade de
osteoclastos e células tumorais (SUZUKI et al., 2006), por meio da inibição de uma enzima-
chave na via do mevalonato, a farnesil pirofosfato sintase (FPP-sintase), que bloqueia uma via
colateral responsável pelo controle da prenilação e ativação das proteínas de sinalização
intracelular (SUZUKI et al., 2006; RESZKA, 2004; VASCONCELLOS et al., 2004). Tais
eventos conduzem à inativação de GTPases e interferência na transmissão de sinais de
algumas citocinas, o que leva à apoptose dos osteoclastos e inibição de sua atividade
(RESZKA, 2004; VASCONCELLOS et al., 2004). GTPases como a Ras e a Rho suprimem a
reabsorção óssea, levando a mudanças na morfologia e motilidade dos osteoclastos
(RESZKA, 2004) e são importantes na organização do citoesqueleto (RESZKA, 2004;
VASCONCELOS et al., 2004).
Os bisfosfonatos não-nitrogenados são metabolizados em análogos citotóxicos de
ATP, responsáveis pela inibição da função mitocondrial dos osteoclastos, o que resulta em
apoptose (ROGERS et al., 2000). A ativação das proteases chamadas caspases tem
importância na indução da apoptose. As caspases 3, 8 e 9 podem ser ativadas nos osteoclastos,
o que determina a hidrólise de diversas proteínas ao nível da seqüência de aminoácidos
DEVD (RESZKA, 2004).
29
Embora o mecanismo de ação dos bisfosfonatos ainda seja pobremente compreendido
(BAGAN et al., 2005; RUGGIERO et al., 2004), há relatos sobre seu efeito antiangiogênico
(FOURNIER et al., 2002; KAPITOLA et al., 2000; WOOD et al., 2002). A angiogênese
constitui resposta ao aumento da massa tecidual, ou a alterações na tensão de oxigênio, ou
ambas, sendo que o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) aumenta com a hipóxia.
Em adultos sob condições fisiológicas, a angiogênese só ocorre em situações específicas
como a consolidação de fraturas. Na artrite reumatóide, bem como em doenças malignas e
cardiovasculares, a mesma é patológica e pode ser excessiva ou insuficiente (SIVAKUMAR
et al., 2004). Diminuição da proliferação e aumento da apoptose de células endoteliais foram
observados em ratos sob ação dos bisfosfonatos, o que sugere que estes inibam a angiogênese
(FOURNIER et al., 2002). O efeito antiangiogênico do zoledronato foi comprovado em ratos,
propriedade que respalda seu emprego no tratamento de doenças ósseas malignas e também
de outras enfermidades ósseas com componente angiogênico (WOOD et al., 2002). O
pamidronato diminui significativamente o suprimento sangüíneo ósseo em ratos (KAPITOLA
et al., 2000), bem como os níveis séricos de VEGF em pacientes portadores de neoplasia
maligna (SANTINI et al., 2002).
2.1.4 Indicações
Os bisfosfonatos são empregados no tratamento de enfermidades com repercussão no
metabolismo ósseo. A prescrição da droga a crianças limita-se a casos de osteoporose
localizada ou generalizada (osteogênese imperfeita, osteoporose idiopática juvenil,
osteoporose secundária a corticosteróides, hiper e hipofosfatasia), enfermidades metabólicas
ósseas (displasia fibrosa poliostótica, miosite ossificante), calcificações de tecidos moles e
condições de hipercalcemia, como hipercalcemias próprias de enfermidades malignas,
hipercalcemias da imobilização (crianças com dano cerebral que desenvolvem calcificações
heterotópicas em algumas articulações) e hiperparatireoidismo primário (BARRIOS
GONZÁLEZ; GARCÍA NIETO, 2005). Também são empregados no tratamento da
fibrodisplasia e no alívio dos sintomas da osteogênese imperfeita (VASCONCELLOS et al.,
2004), já que diminuem o tempo de vida dos osteoclastos (VEINSTEIN et al., 2002). Em
adultos, os bisfosfonatos são empregados no manejo de alterações do cálcio e do metabolismo
ósseo (FLEISCH, 1987) em que ocorre excessiva atividade dos osteoclastos, tais como
30
hiperparatireoidismo primário e secundário e osteoporose, entre outras (FLEICSH, 1998).
Atualmente, com o aumento da expectativa de vida da população, a osteoporose tornou-se um
importante problema de saúde pública (FERNANDES et al., 2005), o que acarretou o
incremento do uso dos bisfosfonatos em sua prevenção, com o objetivo de reduzir a
incidência de fraturas (VASIKARAN, 2001).
Os bisfosfonatos são indicados no tratamento da hipercalcemia moderada a severa
associada ao câncer e de lesões osteolíticas metastáticas associadas ao câncer de mama e ao
mieloma múltiplo, juntamente a agentes quimioterápicos (HILLNER et al., 2000;
BERENSON et al., 2002), sendo os intravenosos mais eficazes para este fim (BROWN;
COLEMAN, 2002; FARIAS, 2005; PAPAPOULOS et al., 2000). Também são empregados
no tratamento da doença de Paget e para metástases ósseas de câncer de pulmão (COLEMAN,
2000) e de próstata (PAPAPOULOS et al., 2000). O zoledronato tem sido o tratamento de
eleição para hipercalcemia e dor óssea associadas a neoplasias malignas (BROWN;
COLEMAN, 2002) e no tratamento de metástases ósseas do câncer de próstata (GOFFINET
et al., 2006). Os bisfosfonatos de administração oral são mais indicados para o tratamento da
osteoporose, pois não são tão eficazes no tratamento de lesões osteolíticas malignas
(RUGGIERO et al., 2004).
Até 2001, os bisfosfonatos empregados na clínica eram: etidronato, clodronato,
pamidronato, alendronato, risedronato, ibandronato e tiludronato (VASIKARAN, 2001). Já
em 2002, o zoledronato passa a ser o mais potente (MACERATA, 2002). Segundo Altundal e
Gursoy (2005), o alendronato estimula a formação óssea em enxertos autógenos de ratos,
pode ser empregado como opção terapêutica para estimular neoformação tecidual em
diferentes casos de remodelação óssea. Ainda, tem sido pesquisado na redução da reabsorção
dentária e de enxertos, bem como na perda óssea alveolar (LEVIN et al., 2001; SCHENK et
al., 1986).
Os bisfosfonatos também foram testados para reforço de ancoragem e contenção
dentária, no sentido de minimizarem-se recidivas em pacientes submetidos a tratamento
ortodôntico. Um estudo em ratos demonstrou que tanto a reabsorção óssea, quanto a radicular
foram significativamente inibidas durante a movimentação ortodôntica no grupo experimental
com administração sistêmica diária de bisfosfonato (IGARASHI et al., 1994). Liu et al.
(2004) injetaram clodronato no subperiósteo adjacente ao primeiro molar superior em ratos
Wistar submetidos à movimentação ortodôntica. Os autores verificaram redução da
movimentação, que foi dose-dependente, diminuição da reabsorção radicular e, ao exame
histológico, diminuição significativa do número de osteoclastos.
31
O zoledronato pode ter efeito antitumoral direto em linhagens hematopoéticas. A
droga induz apoptose em linfócitos malignos de origem B independentemente de o paciente já
ter ou não recebido algum tipo de quimioterápico e exibir ou não o fenótipo funcional da
resistência múltipla a drogas. Assim, o zoledronato tem papel complementar importante na
terapia dessas neoplasias (MAIA; VASCONCELLOS, 2004).
Outras aplicações relevantes dos bisfosfonatos têm sido relatadas. Esses fármacos têm-
se mostrado ativos sobre o metabolismo de vários protozoários, podendo ser empregados no
tratamento da doença de Chagas, da leishmaniose visceral, da malária e da toxoplasmose,
doenças que acometem milhões de indivíduos em todo o mundo (FERNANDES et al., 2005).
2.1.5 Efeitos Adversos
Os bisfosfonatos são medicamentos bem tolerados tanto por via oral como
intravenosa, mas possuem alguns efeitos adversos. Por via oral, os efeitos adversos mais
freqüentes são: cefaléia, dispepsia, diarréia e constipação intestinal. Embora rara, esofagite
corrosiva também pode ocorrer, o que contra-indica o uso por via oral. Os efeitos adversos
mais freqüentes da administração intravenosa são elevação da temperatura e síndrome gripal,
facilmente contornadas com analgésicos e antipiréticos. Podem ocorrer hipocalcemia e
hipofosfatemia transitórias, geralmente sem repercussão clínica (BARRIOS GONZÁLEZ;
GARCÍA NIETO, 2005). Úlcera gástrica e estenose do esôfago também foram relatadas
(PONTE FERNÁNDEZ et al., 2006). Também podem inibir a mineralização óssea, levando a
um quadro clínico e histológico de osteomalácia (ADAMSON et al., 1993). Entre os efeitos
adversos orais, foram relatadas ulceração do assoalho bucal após uso de alendronato (PONTE
FERNÁNDEZ et al., 2006; SCHMUTZ et al., 2005), e osteonecrose dos maxilares (BROOKS
et al., 2007; CAPSONI et al., 2006; CARTER et al., 2005; ESTEFANIA FRESCO et al.,
2006; GEGLER et al., 2006; GIBBS et al., 2005; MARX, 2003; McCLUNG, 2006; MELO et
al., 2005; MORTENSEN et al., 2007; NASE; SUZUKI, 2006; OLSON et al., 2005;
RUGGIERO et al., 2004; SANNA et al., 2006; WYNGAERT et al., 2006; WOO et al., 2006;
ZUAZAGA et al., 2006).
32
2.1.5.1 Osteonecrose
A osteonecrose é definida como uma necrose avascular do osso (ASTRAND;
ASPENBERG, 2002), que ocorre em pacientes portadores de câncer submetidos a
radioterapia, quimioterapia e uso de medicamentos como esteróides (MIRZAI et al., 1999;
SCHWARTZ, 1982). É resultante da perda temporária ou permanente do suprimento
sangüíneo, sem o qual o osso necrosa e pode entrar em colapso (NASE; SUZUKI, 2006).
Usuários de bisfosfonatos podem desenvolver necrose do osso alveolar. A maioria dos casos
de osteonecrose relacionados ao uso de bisfosfonatos tem sido conseqüente à administração
intravenosa do medicamento, mas também podem decorrer da administração por via oral
(FARRUGIA et al., 2006; PURCELL; BOYD, 2005), e muitos desses pacientes têm história
de exodontia recente (MIGLIORATI et al., 2005).
A osteonecrose avascular induzida por bisfosfonatos é caracterizada pela destruição do
complexo vascular dos maxilares e infecção secundária da matriz óssea (MARX, 2003). Sua
definição inclui o critério de que os pacientes com a lesão não tenham sido submetidos à
radioterapia de cabeça e pescoço (RUGGIERO et al., 2004). A terminologia proposta
inicialmente foi avascular necrosis of the jaws (MARX, 2003). Posteriormente, outros termos
foram surgindo como oral cavity avascular bone necrosis (MIGLIORATI, 2003),
osteonecrosis of the jaw (ONJ) (RUGGIERO et al., 2004), bisphosphonate-associated
osteonecrosis (BON) (MIGLIORATI et al., 2005), bisphosphonate associated osteonecrosis
of the jaws (BONJ) (MALDEN; PAI, 2007), bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaws
(BRONJ) (HEWITT; FARAH, 2007).
Ao exame físico, observa-se osso necrótico e infectado exposto ao meio bucal
(MIGLIORATI, 2003), bem como eritema e edema do tecido mole circundante (BERTÈ et
al., 2006). A área é dolorida, o que compromete a alimentação, a fala e a higiene oral do
paciente. A ocorrência de ulceração da mucosa é freqüente, e o osso necrótico exposto
apresenta coloração branco-amarelada. O tecido mole circundante geralmente está inflamado
em função de infecção secundária, a sondagem do osso é assintomática e não ocorre
sangramento. No primeiro estágio, o osso exposto é liso e, com a progressão da lesão, torna-se
irregular e sujeito a fraturas durante a mastigação. A dor parece resultar de infecção
secundária dos tecidos moles ou de trauma causado pelas irregularidades ósseas aos tecidos
adjacentes. A necrose óssea é progressiva e envolve os dentes adjacentes, o que compromete a
higiene, facilita a infecção local e leva ao aumento da necrose, com subseqüente mobilidade e
33
perda dentária (MIGLIORATI et al., 2005). Também pode ocorrer comunicação buco-
sinusal, fístula cutânea com supuração (MORTENSEN et al., 2007), inflamação crônica e
odor fétido da lesão (FARRUGIA et al., 2006).
A área posterior da mandíbula, na região de molares, é a mais acometida (MARX et
al., 2005; PONTE FERNÁNDEZ et al., 2006), seguida da região posterior da maxila (MARX
et al., 2005), principalmente em casos em que são realizadas exodontias. Porém, mesmo sem
história de procedimento dento-alveolar recente, pode haver sinais de osteólise (RUGGIERO
et al., 2004) e ocorrer necrose avascular dos maxilares com exposição óssea espontânea
(MARX, 2003; MIGLIORATI, 2003). Os casos espontâneos podem ser atribuídos a
características anatômicas e fisiológicas, pois geralmente ocorrem na região posterior da
mandíbula, que apresenta mucosa de espessura fina (MARX, 1983). Também existem relatos
de casos em que a prótese parcial removível, ao traumatizar a mucosa, foi considerada fator
desencadeante da osteonecrose em pacientes usuários dos bisfosfonatos (BROOKS et al.,
2007; GEGLER et al., 2006). Além disso, os casos espontâneos na mandíbula podem resultar
das peculiaridades da vascularização nesse osso, cujas artérias são terminais. Esse é um dos
motivos por que a quimioterapia também está associada a casos de osteonecrose (BAGAN et
al., 2005).
A supressão dos osteoclastos altera a qualidade do osso e favorece a ocorrência da
osteonecrose (NASE; SUZUKI, 2006), juntamente a outros fatores como trauma local que
não cicatriza, o que propicia infecção pela microbiota comensal (BAGAN et al., 2005;
WYNGAERT et al., 2006). O tratamento ortodôntico também pode aumentar o potencial para
osteonecrose em pacientes que fazem uso de bisfosfonatos (IGARASHI et al., 1994), pois
estes levam à diminuição significativa do número de osteoclastos (LIU et al., 2004), o que
torna o tratamento ortodôntico mais longo (IGARASHI et al., 1994). É necessário cautela na
avaliação ortodôntica de tais pacientes, pois, em seus tratamentos, devem ser evitadas terapia
invasiva com laser, ancoragem com miniimplantes e exodontias (GRAHAM, 2006).
Embora exodontias e cirurgias orais sejam consideradas fatores desencadeantes,
existem evidências de que o osso alveolar pode estar envolvido previamente. Como fator de
risco, em pacientes com câncer, a quimioterapia e a corticoterapia concomitante
(SCHWARTZ, 1982; TARASSOFF; CSERMAK, 2003) podem resultar em imunossupressão
e predispor à ocorrência de infecção após traumas orais menores (PURCELL; BOYD, 2005).
A radioterapia também é fator de risco, e existem condições de co-morbidade como anemia,
coagulopatias, infecções, doenças orais pré-existentes (NOVARTIS ONCOLOGY MEDICAL
AFFAIRS & SERVICES, 2004), história familiar, estilo de vida, bem como uso de álcool e
34
tabaco (MIGLIORATI et al., 2005). Com base na história, características clínicas, resposta à
cirurgia e aos antibióticos que pacientes portadores de osteonecrose sob terapia com
bisfosfonatos desenvolveram, parece que a patogênese da enfermidade está associada à
insuficiência vascular local. Uma vez comprometido o suprimento vascular por radioterapia
ou drogas, necrose e osteomielite podem ocorrer (RUGGIERO et al., 2004).
A osteonecrose associada aos bisfosfonatos parece restringir-se ao complexo
maxilomandibular. Não há na literatura relato de lesão em outros ossos do corpo decorrente
do uso dessas drogas. A explicação para tal fato seria a presença dos dentes (MARX et al.,
2005), pois os maxilares são os únicos ossos do corpo expostos ao meio externo via dentes
(MARX, 2003; RUGGIERO et al., 2004). Além disso, essas estruturas apresentam,
freqüentemente, doença periodontal, abscessos, lesões endodônticas e outras lesões (MARX
et al., 2005), o que requer metabolismo ósseo e suprimento sangüíneo adequados para manter
o equilíbrio. Assim, o turnover ósseo alterado pela inibição da reabsorção osteoclástica e
insuficiência vascular é incapaz de responder adequadamente às exigências metabólicas, o
que resulta em necrose óssea avascular (RUGGIERO et al., 2004). Ainda, os ossos maxilares
estão constantemente submetidos a forças de impacto e conseqüente alta taxa de remodelação
óssea (MIGLIORATI et al., 2005). Os bisfosfonatos, por sua vez, ao inibirem tal
remodelação, a despeito da maior demanda necessária à manutenção da vitalidade,
predispõem o tecido à osteonecrose (McMAHON et al., 2004).
Em estudo de revisão de 119 casos de osteonecrose dos maxilares induzida por
bisfosfonatos, foi verificado que 45 casos (37,8%) ocorreram após exodontia, em 34 (28,6%),
havia doença periodontal evidente; em cinco (11,2%), havia sido realizada cirurgia
periodontal; em quatro (3,4%), implante dentário; e, em um (8%), apicectomia. Porém, 30
casos (25,2%) tiveram osteonecrose espontânea, a despeito da ausência de problemas
dentários aparentes ou de traumas (MARX et al., 2005). A avaliação de pacientes por um
período de seis anos verificou que, em cada 100 indivíduos portadores de câncer que
utilizaram bisfosfonatos, ocorreram 5,48 eventos nos maxilares e, em cada 100 pacientes com
câncer que não utilizaram bisfosfonatos, apenas 0,30 eventos ocorreram (WILKINSON et al.,
2007).
As características histológicas da osteonecrose maxilar incluem osso necrótico com
colônias bacterianas e tecido de granulação (MORTENSEN et al., 2007), bem como
diminuição da vascularização e do número de osteoblastos (MIGLIORATI et al., 2005).
Segundo Bertè et al. (2006), espécimes biopsiados da lesão exibem colônias fúngicas e
bacterianas. Em pacientes neoplásicos, tais lesões ocorrem independentemente da existência
35
de metástases nos maxilares (FARRUGIA et al., 2006; MIGLIORATI et al., 2005;
MORTENSEN et al., 2007).
Embora, ao exame físico, a osteonecrose associada aos bisfosfonatos seja semelhante à
osteorradionecrose, ao exame histológico ambas constituem condições distintas. Na
osteorradionecrose, as lesões exibem áreas homogêneas extensas de osso completamente
necrótico, enquanto nas lesões associadas aos bisfosfonatos o osso necrótico ocorre junto a
áreas de osso vital residual. Colônias de Actinomyces sp. e infiltrado inflamatório estão
presentes tanto nos casos de osterradionecrose, quanto nos de osteonecrose por bisfosfonatos
(HANSEN et al., 2006).
Por meio de exames de cultura, Mortensen et al. (2007) verificaram que os pacientes
com osteonecrose por uso de bisfosfonatos apresentavam microbiota oral normal. Badros et
al. (2006) investigaram casos de osteonecrose mandibular em pacientes portadores de
mieloma múltiplo. Ao exame histológico, foram observadas inflamação similar à osteomielite
e áreas de osso necrótico acelular. O exame microbiológico exibiu Actinomyces sp. em sete
dos 20 pacientes da amostra. Outras espécies como Peptostreptococcus sp., Streptococcus sp.,
Eikenella sp, Prevotella sp., Porphyromonas sp. e Fusobacterium sp. foram observadas em
nove pacientes, porém sua contribuição à infecção de tecidos moles e osteomielite é
desconhecida.
Nase e Suzuki (2006) relatam o caso de uma paciente que fazia uso de alendronato, via
oral, havia cinco anos e apresentou osteonecrose do osso alveolar. A mesma havia sido
submetida a procedimento periodontal de aumento de coroa clínica. Brooks et al. (2007)
relatam dois casos associados ao risedronato, um em toro mandibular com uso de prótese
parcial removível e outro após enxerto e implante dentário em região posterior da maxila. Ao
revisarem 22 artigos, Wyngaert et al. (2006) verificaram 225 casos de osteonecrose dos
maxilares associada ao uso de bisfosfonatos, o que correspondeu à prevalência de 1,5%. Os
bisfosfonatos nitrogenados envolvidos eram pamidronato, zoledronato, alendronato e
risedronato. Embora a dor tivesse sido o sintoma predominante (81,7%), 12,2% dos casos
eram assintomáticos. Em 69,3% dos casos havia sido realizada exodontia prévia. No momento
do diagnóstico, 74,5% dos pacientes relatavam quimioterapia e 38,2%, uso de
corticosteróides. Embora vários tratamentos conservadores e cirúrgicos tivessem sido
tentados, em 72,5% dos casos persistiram sítios residuais de osteonecrose.
O diagnóstico precoce das lesões ósseas em pacientes sob terapia com bisfosfonatos é
essencial à prevenção e redução da morbidade resultante de lesões destrutivas avançadas do
osso maxilar (RUGGIERO et al., 2004). A interrupção do uso do medicamento previamente
36
às exodontias não garante a prevenção da osteonecrose, uma vez que o fármaco persiste no
tecido ósseo (MARX et al., 2005; PURCELL; BOYD, 2005), e as lesões costumam aumentar
de tamanho a despeito das tentativas de tratamento (BERTÈ et al., 2006; MIGLIORATI,
2003). A remoção do osso adjacente à lesão está contra-indicada, pois pode causar exposição
óssea ainda maior. A remoção de dentes alivia a dor momentaneamente, mas pode levar a
maior exposição óssea e dor. O recobrimento do osso com retalhos não é eficaz, pois estes
podem fistulizar e intensificar a exposição óssea (MARX, 2003). Inúmeras abordagens
terapêuticas já foram propostas, como uso de colutórios (PURCELL; BOYD, 2005),
antibióticos sistêmicos, oxigênio hiperbárico e cirurgia, mas nenhuma se mostrou efetiva
(MIGLIORATI et al., 2005; PURCELL; BOYD, 2005). Os pacientes têm baixa qualidade de
vida em função da complicação oral, mesmo que a neoplasia maligna esteja estabilizada
(MIGLIORATI, 2003).
A prevenção das lesões requer avaliação e adequação bucal dos pacientes (PURCELL;
BOYD, 2005). Exame clínico-radiográfico da cavidade oral bem como qualquer intervenção
invasiva que se faça necessária precisam ser realizados previamente à instituição da terapia
com bisfosfonato. Se o paciente for submetido a procedimento oral invasivo, preconiza-se
aguardar um mês para completa cicatrização antes de iniciar a terapia. Exame clínico da
cavidade oral deve ser realizado a cada quatro meses, com recomendação de controle de placa
e medidas efetivas de higiene oral. Por ocasião das avaliações, o cirurgião-dentista tem o
dever de examinar cuidadosamente a cavidade oral no intuito de investigar exposição de
tecido ósseo. Exame radiográfico completo para avaliar sinais de osteólise, osteoesclerose,
espessamentos do espaço periodontal e lesão de furca deve ser requerido. Se houver
necessidade de prótese, a mesma deverá ser, preferentemente, fixa e bem aliviada, a fim de
evitarem-se úlceras traumáticas (PONTE FERNÁNDEZ et al., 2006). O número crescente de
pacientes portadores de osteonecrose dos maxilares, a pobre resposta da condição ao
tratamento cirúrgico e o envolvimento de fatores dentários exigem cuidados odontológicos
profiláticos em pacientes de alto risco (WALTER et al., 2007), uma vez que o melhor
caminho é a prevenção (DIEGO et al., 2007; HEWITT; FARAH, 2007).
PROPOSIÇÃO
38
3 PROPOSIÇÃO
3.1 HIPÓTESE
A administração de bisfosfonatos nitrogenados, por via oral ou parenteral, está
associada ao desenvolvimento de osteonecrose maxilar em indivíduos submetidos a
exodontias.
3.2 OBJETIVOS
3.2.1 Objetivo Geral
Verificar se o uso de bisfosfonatos nitrogenados é condição suficiente para o
desenvolvimento de osteonecrose dos maxilares em indivíduos submetidos a exodontias.
3.2.2 Objetivos Específicos
a) Verificar os eventos macro e microscópicos da região submetida a exodontias
em ratos sob terapia com bisfosfonatos nitrogenados;
b) Verificar se o uso de bisfosfonatos nitrogenados está associado à diminuição
da angiogênese.
MATERIAL E MÉTODOS
40
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 DELINEAMENTO
O presente estudo classifica-se como experimental verdadeiro, sob o paradigma
quantitativo (CAMPBELL; STANLEY, 1979).
4.2 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
A amostra foi constituída por 31 ratos (fêmeas, Rattus norvegicus, linhagem Wistar)
provenientes do Biotério da Universidade Federal de Pelotas (UFPEL, RS) com idade média
de 140 dias e peso médio de 240,66g.
Os animais foram distribuídos, aleatoriamente, em três grupos:
a) grupo alendronato: 11 animais aos quais foi administrado bisfosfonato
nitrogenado por via oral (alendronato) e que foram submetidos a exodontias;
b) grupo zoledronato: 10 animais aos quais foi administrado bisfosfonato
nitrogenado por via parenteral (zoledronato) e que foram submetidos a exodontias;
c) grupo-controle: 10 animais que foram submetidos a exodontias sem fazerem
uso de bisfosfonato.
4.3 PROCEDIMENTOS
4.3.1 Manutenção dos Animais
O projeto do presente estudo foi aprovado pela Comissão Científica e de Ética da
Faculdade de Odontologia da PUCRS e pelo Comitê de Ética em Pesquisa- PUCRS (Anexos
41
A e B). Os critérios empregados para manipulação dos animais no laboratório basearam-se
em Lopes (1992) e Paiva et al. (2005).
Os animais foram identificados com números nas caudas, mantidos em caixas
plásticas apropriadas, dispostas em estante ventilada (Alesco, Monte Mor, SP, Brasil), com
temperatura controlada (22 oC) e ciclo claro-escuro de 12 h (luzes acesas às 07h00min; luzes
apagadas às 19h00min). A maravalha foi trocada três vezes por semana e ração (Nuvilab,
Colombo, PR, Brasil) e água filtrada foram disponiblizadas ad libitum. Nenhum procedimento
experimental foi realizado no espaço destinado à manutenção dos animais, a fim de evitar-se
qualquer tipo de estresse comportamental. Os tratamentos e procedimentos cirúrgicos foram
conduzidos no Laboratório de Farmacologia Aplicada da Faculdade de Farmácia – PUCRS.
4.3.2 Administração dos Fármacos
Os bisfosfonatos empregados foram o alendronato de sódio (Galena Química e
Farmacêutica, Campinas, SP, Brasil) e o zoledronato (Zometa®, Novartis, São Paulo, SP,
Brasil). Para administração dos fármacos, o animal foi contido colocando-se a mão sobre o
dorso e a caixa torácica, e a cabeça foi segurada com o polegar e o indicador, imediatamente
atrás da mandíbula. A primeira administração de ambos os fármacos foi realizada ao início do
experimento, após identificação e pesagem dos animais. Posteriormente, a administração do
alendronato foi realizada a cada 7 dias, na dosagem de 0,05mg/kg, pela técnica de gavagem
oral (HUANG et al., 2005; LEHMAN JUNIOR et al., 2004), por 23 semanas. Aos animais do
grupo zoledronato foram administradas 5 doses de 0,6mg/kg, por via intraperitoneal com
seringa de insulina, a intervalos de 28 dias (MACERATA, 2002). A pesagem dos animais
para cálculo das dosagens foi realizada a cada 28 dias em todos os grupos (Figura 2).
42
Figura 2 – Administração dos fármacos: (A) pesagem dos animais; (B) administração do alendronato, técnica de gavagem oral; (C) administração intraperitoneal do zoledronato
4.3.3 Avaliação Clínica
Foi realizada oroscopia após a anestesia prévia às exodontias com o objetivo de avaliar
presença/ausência de lesão oral (Figura 3).
Figura 3 – Avaliação clínica
43
4.3.4 Exodontias
As exodontias foram realizadas 45 dias após o início do experimento, sob anestesia
profunda com mistura de quetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), administrada por via
intraperitoneal (GRATTON et al., 1995; WAYNFORTH; FLECKNELL, 1994). A anestesia
ocorre entre 2 e 5 minutos após a injeção da mistura anestésica e dura aproximadamente 40
minutos. Essa mistura anestésica é também indutora de profunda analgesia. A recuperação
total acontece em cerca de 2 horas e não deixa seqüelas.
O animal foi posicionado em decúbito dorsal, mantendo-se abertura de boca com
elásticos (tipo atilho) ancorados nos incisivos superiores e inferiores, distendidos e fixados à
mesa operatória por meio de alfinetes. O dispositivo proporcionou imobilização da maxila e
adequado acesso ao campo operatório durante as exodontias. Foram extraídos os 3 molares
superiores do lado direito empregando-se movimento de alavanca com espátula 3s (SSWhite,
Duflex, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) adaptada para luxação e fórceps (Edlo, Canoas, RS, Brasil)
cuja porção ativa foi adaptada ao tamanho dos dentes. Durante o procedimento cirúrgico, foi
realizada irrigação com soro fisiológico. Não houve necessidade de sutura pós-operatória em
função da pequena exposição óssea provocada (Figura 4). Os animais fizeram uso de
paracetamol gotas para analgesia (10 gotas em 20 ml de água) em sua própria mamadeira e à
vontade, durante 4 dias.
44
Figura 4 – Etapas das exodontias: (A) anestesia; (B) posicionamento do animal e instrumental empregado; (C) procedimento cirúrgico; (D) molares superiores extraídos
4.3.5 Eutanásia, Avaliação Macroscópica e Preparo dos Espécimes
A eutanásia foi realizada por anestesia profunda com isoflurano (Cristália, Porto
Alegre, RS, Brasil) como postulado por Close et al. (1996, 1997) e Waynforth e Flecknell
(1994), decorridos 106 dias das exodontias no grupo-controle, 113 dias no grupo zoledronato
e 119 dias no grupo alendronato. Após a eutanásia, os animais foram decapitados para
facilitar a dissecção da maxila. As maxilas foram dissecadas e submetidas à avaliação
macroscópica que teve por objetivo verificar presença/ausência de solução de continuidade da
mucosa oral na área das exodontias, por meio de sondagem com sonda clínica número 5
(SSWhite, Duflex, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) (Figura 5). Os espécimes (maxilas) foram,
então, fixados durante 24 horas em solução de formalina a 10% tamponada constituída por
formaldeído a 37% (2 L, TopGlass, Porto Alegre, RS, Brasil), água destilada (18 L, TopGlass,
45
Porto Alegre, RS, Brasil), fosfato de sódio monobásico (80g, Cromoline, Diadema, SP,
Brasil) e fosfato de sódio bibásico (130g, Synth, Diadema, SP, Brasil).
Figura 5 – Exame macroscópico: (A) sondagem com sonda clínica n˚ 5 evidencia solução de continuidade da mucosa; (B) espécime sem solução de continuidade da mucosa
Após a fixação, as maxilas foram seccionadas em sentido látero-lateral, obtendo-se
uma secção transversal que contemplava tanto a área das exodontias quanto a área oposta, em
que os molares foram preservados. O objetivo de tal procedimento consistiu em obter-se um
espécime de tamanho adequado e com parâmetros suficientes para a identificação dos sítios e
reparos anatômicos por ocasião da inclusão em parafina, bem como ao exame histológico. O
espécime foi, então, dividido em dois fragmentos (A e B) em sentido látero-lateral (Figuras 6
e 7), com auxílio de disco de lixa de aço em baixa rotação. Neste momento, foi realizado um
ponto de sutura na porção externa de cada um dos fragmentos a fim de que, durante a
inclusão, fosse identificada a superfície interna como superfície de corte, o que garantiu a
contemplação da área das exodontias nos cortes histológicos.
Subseqüentemente, procedeu-se à descalcificação em solução de ácido fórmico
durante 24 horas. Essa solução foi constituída por 780 ml de citrato de sódio tribásico P.A. a
10% (Cromoline, Diadema, SP, Brasil) e 220 ml de ácido fórmico P.A. a 85% (Synth,
Diadema, SP, Brasil). Concluída a descalcificação, os espécimes foram processados pela
técnica da parafina.
46
Figura 6 – Desenho esquemático do preparo do espécime para processamento histológico
Figura 7 – Preparo do espécime para processamento histológico
47
4.3.6 Confecção das Lâminas Histológicas
Os espécimes foram incluídos em parafina de modo que a superfície interna do
fragmento constituísse a superfície de corte, sendo a porção externa identificada por meio do
ponto de sutura. A partir dos 31 animais, foram confeccionados 62 blocos, 31 deles com
fragmentos A e 31, com fragmentos B. De cada bloco foram obtidos dois cortes, cada um
deles com 4 µm de espessura e confeccionadas as respectivas lâminas histológicas. Uma das
lâminas foi submetida à coloração por hematoxilina e eosina e a outra, a processamento
imunoistoquímico. Neste, as lâminas foram submetidas à recuperação antigênica em banho-
maria por 30 minutos a 99ºC, utilizando tampão Tris/EDTA, pH 9 (20 mM Tris/0,65 mM
EDTA). O bloqueio da peroxidase endógena foi feito com solução de peridrol a 3% (H2O2 em
álcool metílico) por 30 minutos. As secções foram incubadas com anticorpo monoclonal de
rato anti-VEGF (clone VG1, ZymedR Laboratories, South San Francisco, CA, USA) na
diluição de 1:300. O sistema de detecção utilizado foi o Kit Dako LSAB (Dako, Carpinteria,
CA, USA). Os cortes foram revelados por meio de cromógeno 3,3`- diaminoazobenzidina
(DAB) e tampão PBS em solução de peróxido de hidrogênio a 0,002% e contracorados com
hematoxilina, sendo desidratados, clarificados e montados com lamínula. Como controle
positivo foram empregados cortes histológicos de carcinoma de cólon, e como controle
negativo, alguns cortes da amostra foram processados na ausência do anticorpo.
4.4 ANÁLISE HISTOLÓGICA
A captura das imagens foi realizada por meio de microscópio óptico Zeiss Axioskop
40 (Zeiss, Oberkohen, Alemanha), conectado por videocâmera Roper Scientific (Media
Cybernetics, Silver Spring, USA) a um microcomputador Pentium IV 2.2 GHz com 512 MB
de memória RAM, disco rígido de 160 GB e placa de captura Image Pro Capture Kit (Media
Cybernetics, Silver Spring, USA). Para a análise das imagens, foi empregado o programa
Image Pro Plus versão 6.0. O programa permite a captura da imagem digital com
possibilidade de inserção de grade de correção, marcação e contagem das áreas de interesse.
As imagens foram capturadas em objetiva de 5x e armazenadas no formato TIFF (True Image
Format File). A análise histológica foi realizada por um observador calibrado e cegado. A
48
calibração consistiu na avaliação de uma série de 20 imagens histológicas em dois momentos
distintos. Os resultados da avaliação foram submetidos ao teste t pareado e ao teste de
correlação de Pearson que evidenciaram, respectivamente, ausência de diferença significativa
entre as análises (P=1) e forte correlação (r=0,999).
Nas lâminas coradas por hematoxilina e eosina foi realizada a análise quantitativa
(proporção) das variáveis osteonecrose, infiltrado inflamatório, colônias microbianas, tecido
epitelial, tecido conjuntivo fibroso, resto radicular e osso vital no sítio das exodontias. Em
cada lâmina, foram selecionados 4 campos, de forma padronizada, de modo que
contemplassem a área da exodontia (Figuras 8 e 9). Da mesma forma, foi realizada a análise
quantitativa da expressão imunoistoquímica do VEGF em campo de tecido ósseo vital, na
área da exodontia, que foi selecionado de forma padronizada em todas as imagens. A leitura
foi realizada pelo programa Image Pro Plus 6.0, aplicando-se uma grade de 798 pontos sobre
cada campo selecionado e mensurando-se cada uma das variáveis histológicas por meio da
técnica de contagem manual de pontos (Figuras 10 e 11).
Figura 8 – Área das exodontias (lado direito) e área oposta (com dentes) contempladas tanto no espécime macroscópico (A) quanto no corte histológico (B, C). HE, aumento aproximado: 100X
49
Figura 9 – Imagens capturadas no sítio das exodontias. HE, objetiva 5X
Figura 10 – Quantificação das variáveis histológicas (HE) pelo método de contagem manual de pontos
50
Figura 11 – Quantificação da expressão imunoistoquímica do VEGF pelo método de contagem manual de pontos
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram analisados por meio de estatística descritiva e dos testes Kruskal-
Wallis, ANOVA e qui-quadrado, ao nível de significância de 5%. Por meio dos testes, a
ocorrência das variáveis solução de continuidade da mucosa, osteonecrose, osso vital,
infiltrado inflamatório, colônias microbianas, tecido conjuntivo fibroso, tecido epitelial, resto
radicular e expressão do VEGF foram comparadas entre os grupos alendronato, zoledronato e
controle. Os testes qui-quadrado e Kruskall-Wallis foram complementados, respectivamente,
pela análise de resíduos ajustados e pelo teste de comparações múltiplas.
RESULTADOS
52
5 RESULTADOS
5.1 AVALIAÇÃO CLÍNICA
À oroscopia, realizada previamente às exodontias, nenhum animal, nos três grupos
avaliados, exibiu lesão da mucosa oral.
5.2 AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA
A avaliação macroscópica, realizada após a eutanásia, evidenciou que 10 animais
(100%) do grupo zoledronato exibiram solução de continuidade da mucosa, enquanto para os
grupos alendronato e controle essa freqüência foi, respectivamente, de 8 (72,7%) e 1 (10%).
Por meio do teste do qui-quadrado (χ2), complementado pela análise de resíduos ajustados, ao
nível de significância de 5%, verificou-se que o grupo zoledronato está associado à presença
de solução de continuidade, e o grupo-controle à ausência (P<0,001, Tabela 1).
Tabela 1 – Distribuição da amostra segundo presença/ausência de solução de continuidade na mucosa oral ao exame macroscópico (área das exodontias), Porto Alegre, 2008
Solução de Continuidade da Mucosa
Presente Ausente Grupo
n % n %
Zoledronato 10* 100,0 0 0,0
Alendronato 8 72,7 3 27,3
Controle 1 10,0 9* 90,0
χ2=18,01; P<0,001
* Análise de Resíduos Ajustados: P<0,05
53
5.3 AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA
5.3.1 Distribuição da Amostra de Acordo com as Variáveis Histológicas (HE)
A tabela 2 e a figura 12 exibem os resultados de freqüência (presença/ausência) das
variáveis histológicas nos grupos avaliados. No grupo zoledronato, 8 animais (80%) tiveram
osteonecrose, enquanto nos grupos alendronato e controle não foi observada ocorrência dessa
variável. Infiltrado inflamatório foi observado em todos os animais tanto do grupo
zoledronato quanto do grupo-controle e em 7 (63,6%) do grupo alendronato. Para colônias
microbianas, a freqüência verificada foi de 10 (100%) no grupo zoledronato, de 4 (36,4%) no
grupo alendronato e 5 (50%) no grupo-controle. Restos radiculares estavam presentes em 6
animais (60%) do grupo zoledronato, em 6 (54,5%) do alendronato e em 10 (100%) do grupo-
controle. As variáveis tecido conjuntivo fibroso, tecido epitelial e osso vital estiveram
presentes em todos os animais dos grupos avaliados.
Por meio do teste χ2 complementado pela análise de resíduos ajustados, ao nível de
significância de 5%, verificou-se que: (1) o grupo zoledronato está associado à presença, e os
grupos alendronato e controle à ausência de osteonecrose (P<0,001); (2) o grupo alendronato
está associado à ausência de infiltrado inflamatório (P=0,015); (3) o grupo zoledronato está
associado à presença, e o grupo alendronato, à ausência de colônias microbianas (P=0,008).
54
Tabela 2 – Distribuição da amostra de acordo com presença/ausência das variáveis histológicas avaliadas na área das exodontias, Porto Alegre, 2008
Grupo
Zoledronato (n=10) Alendronato (n=11) Controle (n=10)
Presente Ausente Presente Ausente Presente Ausente
P Variáveis
histológicas
n % n % n % n % n % n %
Osteonecrose 8* 80 2 20 0 0 111* 100 0 0 10* 100 <0,001
Infiltrado
inflamatório 10 100 0 0 7 63,6 4* 36,4 10 100 0 0 0,015
Colônias
microbianas 10* 100 0 0 4 36,4 7* 63,6 5 50 5 50 0,008
Resto radicular 6 60 4 40 6 54,5 5 45,5 10* 100 0 0 0,047
Tecido conjuntivo
fibroso 10 100 0 0 11 100 0 0 10 100 0 0 -
Tecido epitelial 10 100 0 0 11 100 0 0 10 100 0 0 -
Osso vital 10 100 0 0 11 100 0 0 10 100 0 0 -
P= nível mínimo de significância do Teste χ2 * Análise de Resíduos Ajustados: P<0,05
Figura 12 – Distribuição da amostra segundo a presença das variáveis histológicas avaliadas, Porto Alegre, 2008
55
5.3.2 Quantificação das Variáveis Histológicas na Área das Exodontias (HE)
A tabela 3 e a figura 13 exibem os resultados da quantificação das variáveis
histológicas na área das exodontias nos três grupos pesquisados. Por meio do teste não-
paramétrico de Kruskal-Wallis complementado por seu teste de comparações múltiplas, ao
nível de significância de 5%, verificou-se que, nas variáveis osteonecrose, infiltrado
inflamatório e colônias microbianas, o grupo zoledronato exibiu percentuais
significativamente maiores do que os demais grupos. Nas variáveis tecido epitelial, tecido
conjuntivo fibroso, resto radicular e osso vital, não houve diferença significativa entre os
grupos avaliados.
Tabela 3 – Quantificação das variáveis histológicas (HE) na área das exodontias nos grupos zoledronato, alendronato e controle, Porto Alegre, 2008 Zoledronato (%) Alendronato (%) Controle (%) Variáveis histológicas Média DP Mediana Média DP Mediana Média DP Mediana
Osteonecrose
10,96
11,47
7,8*
0
0
0
0
0
0
Infiltrado inflamatório
4,34
4,12
2,5*
1,27
2,11
0,7
1,18
1,78
0,6
Colônias microbianas
4,82
7,60
1,4*
0,28
0,75
0
0,26
0,54
0
Tecido epitelial
13,07
5,01
11,3
16,88
6,05
15,3
15,30
6,32
13,2
Tecido conjuntivo fibroso
30,77
5,90
31
37,68
9,36
37,9
36,70
7,67
36,3
Resto radicular
4,33
7,10
3,4
3,43
5,48
3,1
4,72
6,42
4,6
Osso vital
31,68
16,41
36,8
40,42
13,12
41,2
41,81
11,30
42,9
DP=Desvio-padrão * Kruskal-Wallis complementado por seu teste de comparações múltiplas, P<0,05
56
7,8
2,51,4
31
3,4
0 0,7 00 0,6 0,1
4,6
11,3
36,8
15,3
37,9
41,2
3,1
13,2
36,3
42,9
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Osteonecrose Infiltrado
inflamatório
Colônias
microbianas
Tecido epitelial Tecido
conjuntivo
fibroso
Resto radicular Osso vital
Med
ian
a
Zoledronato
Alendronato
Controle
Figura 13 – Mediana das variáveis histológicas nos grupos zoledronato, alendronato e controle, Porto Alegre, 2008
5.3.3 Quantificação da Expressão Imunoistoquímica do VEGF em Área de Osso Vital
A tabela 4 exibe a proporção de expressão imunoistoquímica do VEGF em área de
osso vital nos grupos zoledronato, alendronato e controle. Por meio do teste da Análise de
Variância, verificou-se não haver diferença significativa da média do percentual de marcação
positiva para VEGF nos diferentes grupos (P=0,860).
57
Tabela 4 – Expressão imunoistoquímica do VEGF em área de osso vital nos grupos zoledronato, alendronato e controle, Porto Alegre, 2008
Expressão imunoistoquímica do VEGF (%) Grupo n
Média Desvio-padrão Mínimo Máximo
Zoledronato 10 21,79 5,84 11,59 29,90
Alendronato 11 22,36 6,27 9,83 34,60
Controle 10 23,28 6,22 15,84 32,99
ANOVA, P=0,860
5.3.4 Análise Descritiva (HE)
5.3.4.1 Osteonecrose
As áreas de osteonecrose identificadas ao exame histológico contemplavam
fragmentos de osso não-vital, cujos osteoplastos estavam vazios, bem como colônias
microbianas na periferia, nos espaços medulares e em áreas adjacentes (Figura 14). A porção
de osso não-vital era contígua ao osso vital subjacente (Figura 15).
Figura 14 – Osteonecrose: osso não-vital e colônias microbianas. HE, aumento aproximado: 200X
58
Figura 15 – Osso não-vital (A) contíguo ao osso vital (B). HE aumento aproximado: 100X
5.3.4.2 Colônias Microbianas
As imagens microscópicas de colônias microbianas eram, em sua maioria,
morfologicamente compatíveis com Actinomyces sp. (Figura 16).
Figura 16 – Colônias microbianas compatíveis com Actinomyces sp. e infiltrado inflamatório. HE, aumento aproximado: 400X
59
5.3.4.3 Infiltrado Inflamatório
Nas áreas de osteonecrose, além de linfócitos e plasmócitos, houve intenso infiltrado de
polimorfonucleares neutrófilos próximos às colônias microbianas (Figura 17). Nas áreas
próximas aos restos radiculares, que foram observados em todos os grupos pesquisados, o
infiltrado inflamatório foi composto por linfócitos, plasmócitos, polimorfonucleares neutrófilos
e, em alguns espécimes, células gigantes multinucleadas e formação de granuloma (Figura 18).
Figura 17 – Osteonecrose, colônias microbianas e infiltrado inflamatório. HE, aumento aproximado: 200X
Figura 18 – Infiltrado inflamatório (áreas próximas aos restos radiculares): linfócitos, plasmócitos e células gigantes multinucleadas (seta). HE, aumento aproximado: 400X
60
5.3.4.4 Reparo Cicatricial
Nos espécimes em que se observou reparo cicatricial da ferida exodôntica sem
ocorrência de osteonecrose, o mesmo ocorreu às expensas de tecido conjuntivo fibroso e osso
vital. A mucosa de revestimento suprajacente exibia epitélio pavimentoso estratificado
ceratinizado (Figura 19).
Figura 19 – Reparo cicatricial: osso vital, tecido conjuntivo fibroso e revestimento por epitélio pavimentoso estratificado ceratinizado. HE, aumento aproximado: 100X
DISCUSSÃO
62
6 DISCUSSÃO
A verificação de que nenhum animal nos três grupos avaliados, zoledronato,
alendronato e controle, exibiu lesão de mucosa oral previamente às exodontias respalda a
idéia de que as lesões detectadas posteriormente estejam, de fato, associadas ao procedimento
cirúrgico e ao uso dos bisfosfonatos, e não a outros fatores locais ou sistêmicos. A
macroscopia após a eutanásia, por sua vez, revelou que todos os animais do grupo zoledronato
exibiam solução de continuidade da mucosa, enquanto, nos grupos alendronato e controle,
essa freqüência foi, respectivamente, oito e um. Ao considerar-se que no grupo zoledronato
oito animais exibiram osteonecrose ao exame histológico, justifica-se a presença da solução
de continuidade, já que, nas áreas de osteonecrose, a mucosa é incapaz de epitelizar e coaptar
as margens da ferida (LANDESBERG et al., 2008). O questionamento seria: qual a causa da
solução de continuidade ao exame macroscópico em dois animais do grupo zoledronato que
não exibiram osteonecrose ao exame microscópico? Talvez a osteonecrose estivesse presente,
mas não foi contemplada pelo corte histológico. Talvez, de fato, os animais não tivessem
osteonecrose, mas a cicatrização dos tecidos moles, da mesma forma, foi comprometida, já
que, ao exame microscópico, colônias microbianas estavam presentes em todos os animais do
grupo em questão, bem como restos radiculares fraturados durante a exodontia. Isso parece
plausível, uma vez que o fato repetiu-se no grupo alendronato, em que, embora nenhum
animal tivesse exibido osteonecrose à microscopia, oito tiveram solução de continuidade da
mucosa à macroscopia. É preciso acrescer a essa conjectura o achado de que, no grupo-
controle, um animal exibiu solução de continuidade da mucosa, enquanto todos eles tiveram
restos radiculares e cinco tiveram colônias microbianas. Ou seja, mesmo exibindo as variáveis
resto radicular e colônias microbianas em freqüência semelhante aos grupos zoledronato e
alendronato, o grupo-controle não teve a mesma freqüência de solução de continuidade da
mucosa. Haveria algum efeito, direto ou indireto, sobre os tecidos moles exercido pelos
bisfosfonatos que pudesse justificar esse achado?
Efeitos adversos incomuns como aumento dos níveis séricos de creatinina, fadiga,
artralgia, náusea, complicações gastrintestinais e hipocalcemia são relatados (DIEGO et al.,
2007; DIMITRAKOPOULOS et al., 2006; MIGLIORATI et al., 2005). Ainda, os
bisfosfonatos nitrogenados causam dano à mucosa gástrica, como infiltração de neutrófilos
independentemente da ação sobre a microvasculatura, efeito associado ao uso tópico que
sugere propriedades irritantes da droga (WALLACE et al., 1999). Entretanto, o aspecto mais
63
importante a ser considerado é o fato de existirem indícios de que esses compostos inibem os
ceratinócitos envolvidos na cicatrização da mucosa oral, retardando-a, o que pode ter papel
significativo na iniciação da osteonecrose dos maxilares, pois não está bem claro se esta lesão
inicia na mucosa oral ou deriva do osso subjacente. Dosagens de pamidronato similares às
dosagens terapêuticas empregadas na rotina clínica são tóxicas às células epiteliais in vitro. A
droga induz as células à perda de adesividade, evento que sugere a possibilidade de indução
de necrose (LANDESBERG et al., 2008). Tais fatos permitem sugerir o uso do bisfosfonato
como possível fator responsável pela elevada prevalência de solução de continuidade da
mucosa oral no grupo alendronato.
A osteonecrose foi o foco do presente estudo e foi verificada, ao exame microscópico,
em 80% dos animais do grupo zoledronato e em nenhum animal dos grupos alendronato e
controle. Tal achado confirma a associação entre osteonecrose e o uso do zoledronato já
verificada em estudos clínicos (MARX, 2003; MIGLIORATI, 2003; MIGLIORATI et al.,
2005; PURCELL; BOYD, 2005; RUGGIERO et al., 2004). Ainda, torna evidente que o uso
do fármaco associado ao trauma provocado pela exodontia constitui condição suficiente para
a ocorrência da osteonecrose, sem que esta dependa de fatores de risco ou de co-morbidades
como já sugerido em alguns estudos (MARX et al., 2005; PURCELL; BOYD, 2005;
SCHWARTZ, 1982).
No grupo alendronato, nenhum animal exibiu osteonecrose, a despeito da presença de
restos radiculares, processo inflamatório, colônias microbianas e solução de continuidade da
mucosa. Tal achado excluiria a possibilidade de este fármaco estar associado à osteonecrose?
É preciso considerar alguns fatores importantes, já que há relatos na literatura de pacientes
que desenvolveram osteonecrose dos ossos maxilares com o uso de alendronato (MARX
2003; MIGLIORATI, 2003; MIGLIORATI et al., 2005; NASE; SUZUKI, 2006; PURCELL;
BOYD, 2005; RUGGIERO et al., 2004). A menor absorção da droga por via oral (FARIAS,
2005; GERTZ et al., 1991; LIN et al., 1991) pode ser apontada como uma justificativa para tal
fato. Além disso, a presença, em sua estrutura química, de dois átomos de nitrogênio em um
anel heterocíclico, torna o zoledronato mais potente que o alendronato (RESZKA, 2004). O
zoledronato exibe potência aproximadamente 20 vezes superior à do alendronato
(FERNANDES et al., 2005; FERREIRA JUNIOR et al., 2007; NEVES et al., 2003). Assim,
exerce efeitos sobre o tecido ósseo e sobre a angiogênese mais precocemente que o
alendronato podendo, inclusive, afetar a angiogênese de tecidos não mineralizados (WOOD et
al., 2002). Os bisfosfonatos nitrogenados de administração intravenosa, portanto, representam
64
risco maior de osteonecrose do que os de administração oral, como já relatado por outros
pesquisadores (FARRUGIA et al., 2006; PURCELL; BOYD, 2005).
Os fatores tempo de uso e dosagem do alendronato podem estar associados ao fato de
nenhum animal ter desenvolvido osteonecrose neste grupo. Há relatos de que períodos de até
três anos de uso desse fármaco estão isentos de associação com lesão e que, somente depois
de decorrido tal prazo, o alendronato passaria a representar risco para o desenvolvimento de
osteonecrose (AMERICAN ASSOCIATION OF ORAL AND MAXILLOFACIAL
SURGEONS, 2007; MARX et al., 2005). Ou seja, a manutenção dos animais sob terapia com
alendronato durante tempo superior ao que foi estabelecido na presente pesquisa poderia
resultar em achados diferentes. Por outro lado, segundo Araújo (2007), cerca de 25 meses de
vida do rato correspondem a 70 anos de vida em humanos. Ao considerar-se essa proporção, o
prazo de três anos em humanos para que o alendronato passe a representar risco de
osteonecrose corresponderia a 30 dias no rato. No presente estudo, as exodontias foram
realizadas 45 dias após o início da administração do fármaco, e os animais foram mantidos
sob terapia durante cinco meses, o que representaria aproximadamente 15 anos em humanos.
Sendo assim, do ponto de vista teórico, o tempo de administração do alendronato aos animais
estaria adequado. Entretanto, é preciso considerar que esse é um cálculo aproximado, bem
como o fato de que fatores metabólicos específicos do indivíduo interferem na resposta às
drogas. Talvez, um período mais prolongado de administração do alendronato previamente às
exodontias fosse capaz de surtir resultados diferentes. Por outro lado, há evidência de que
estudos em modelos animais com até um mês de duração identificam 90% dos efeitos tóxicos
(GREAVES et al., 2004), o que respalda a idéia de que o tempo de tratamento empregado na
presente pesquisa estaria adequado.
Outro aspecto a considerar é a dosagem de alendronato empregada na presente
pesquisa. Foram administrados 0,05mg/kg, uma vez por semana para cada animal por 23
semanas. A dosagem foi estabelecida considerando-se DL/DE (dose letal/dose equivalente)
que seria 5 µg/kg/dia, o que equivale a 0,035 mg/kg/semana (HUANG et al., 2005). Embora
esse cálculo já tivesse considerado o fato de que a eliminação da droga é mais rápida em ratos
do que em humanos (MORRIS, 1999), optou-se por elevá-la a 0,05mg/kg/semana, uma vez
que algumas pesquisas aplicaram dosagens superiores de alendronato por via oral (LEHMAN
JUNIOR et al., 2004; PINTO et al., 2006). É possível que dosagens ainda maiores tivessem
sido capazes de induzir lesões, tanto osteonecrose quanto lesões de outra natureza, ou até
mesmo a morte dos animais. Entretanto, optou-se pela dosagem de 0,05mg/kg/semana, com o
objetivo de reproduzir nos modelos animais a situação clínica vivenciada pelos pacientes. Ou
65
seja, a dosagem ideal a ser empregada para os animais seria aquela equivalente a 1
mg/kg/semana por via oral, que é a dosagem terapêutica empregada em humanos (HUANG et
al., 2005). Pesquisas que investiguem o efeito de diferentes dosagens de alendronato no
reparo de feridas exodônticas, incluindo dosagens superiores às empregadas no presente
estudo, poderiam gerar informações mais elucidativas sobre esse tópico.
Há suspeitas de que fumo (AMERICAN ASSOCIATION OF ORAL AND
MAXILLOFACIAL SURGEONS, 2007), uso crônico de álcool (AGARWALA et al., 2002;
AMERICAN ASSOCIATION OF ORAL AND MAXILLOFACIAL SURGEONS, 2007),
diabetes mellitus (MIGLIORATI et al., 2005), hipoproteinemia (CARTER et al., 2005),
corticoterapia, quimioterapia (HELLSTEIN; MAREK, 2005; PURCELL; BOYD, 2005;
RUGGIERO et al., 2004; SCHWARTZ, 1982; TARASSOFF; CSERMAK, 2003;
WYNGAERT et al., 2006), terapia imunossupressora (AGARWALA et al., 2002; PURCELL;
BOYD, 2005), lesões endodônticas, doença periodontal, abscessos (MARX et al., 2005),
higiene oral deficiente (AMERICAN ASSOCIATION OF ORAL AND MAXILLOFACIAL
SURGEONS, 2007) e insuficiência renal seriam co-fatores no desenvolvimento da
osteonecrose por bisfosfonatos (NASE; SUZUKI, 2006). É preciso considerar, portanto, que,
no caso do alendronato, sendo este menos potente que o zoledronato, os co-fatores poderiam
exercer papel fundamental no desenvolvimento da osteonecrose. Estudos que investiguem
essa possibilidade tornam-se pertinentes, já que a monitorização de co-fatores passíveis de
serem controlados (fumo, álcool, diabete, uso de corticosteróides, saúde bucal precária) seria
uma forma de prevenir a lesão, ou mesmo, esses co-fatores constituiriam contra-indicação ao
uso dos bisfosfonatos.
O fato de animais nos grupos controle e alendronato também terem exibido restos
radiculares e não terem desenvolvido osteonecrose reafirma a associação entre esta e o
zoledronato. Além disso, tal achado corrobora os relatos de que os bisfosfonatos de
administração intravenosa representam risco maior de osteonecrose do que os de
administração oral (FARRUGIA et al., 2006; PURCELL; BOYD, 2005).
A alta freqüência de microrganismos no grupo zoledronato resultou dos eventos de
osteonecrose que acometeram esse grupo. O grupo alendronato não exibiu casos de
osteonecrose, mas teve a ocorrência de fatores predisponentes ao processo infeccioso como
solução de continuidade na mucosa e restos radiculares. Entretanto, a despeito desses fatores,
o grupo exibiu freqüência de colônias microbianas significativamente menor que a verificada
para o grupo zoledronato e também menor que a do grupo-controle. Muitos aspectos do
mecanismo de ação dessas drogas ainda estão por ser esclarecidos (BAGAN et al., 2005;
66
RUGGIERO et al., 2004). Há relatos de sua atividade sobre o metabolismo de vários
protozoários e, por isso, poderiam ser empregados no tratamento da doença de Chagas,
leishmaniose visceral, malária e toxoplasmose. Nessas situações, o mecanismo de ação dos
bisfosfonatos consistiria na inibição da formação de proteínas de importância vital para esses
parasitas (FERNANDES et al., 2005). O pamidronato e o risedronato inibem a TcHPRT
(enzima transferase de purinas de Trypanosoma cruzi) (FERNÁNDEZ, 2003). Também foi
verificado que alguns bisfosfonatos bloqueiam enzimas usadas pelas bactérias para trocar
genes e adquirir ou propagar a sua resistência a antibióticos, efeito que já foi demonstrado em
Escherichia coli (LEON et al., 2006).
Na presente pesquisa, não foi verificada diferença significativa da expressão
imunoistoquímica do VEGF entre os grupos zoledronato, alendronato e controle. A ausência
de diferença significativa para expressão de VEGF entre o grupo-controle e ambos os grupos-
teste sugere que as drogas avaliadas não induzam inibição da angiogênese e que não seria este
o fator associado à osteonecrose observada nos animais do grupo zoledronato. Tal achado não
parece estar em consonância com os relatos da literatura de que um dos efeitos dos
bisfosfonatos seja a inibição da angiogênese.
Embora o mecanismo de ação dos bisfosfonatos ainda seja pobremente conhecido
(BAGAN et al., 2005; RUGGIERO et al., 2004), algumas pesquisas demonstram seu efeito
sobre a angiogênese (FOURNIER et al., 2002; KAPITOLA et al., 2000; WOOD et al., 2002).
O zoledronato é capaz de inibir, in vitro, a proliferação de células endoteliais humanas
estimuladas com soro fetal bovino, fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF) e VEGF
(WOOD et al., 2002), bem como reduzir a proliferação, induzir apoptose e diminuir a
formação de tubos capilares, in vitro, quando empregados no tratamento de células endoteliais
(FOURNIER et al., 2002). O alendronato reduz a neoangiogênese intratumoral, mas não
altera a expressão imunoistoquímica do VEGF, efeito que resulta, em parte, da ação
antiangiogênica diretamente nas células endoteliais intratumorais por inibição da
geranilgeranilação do Rho (HASHIMOTO, 2007), GTPase importante na manutenção da
integridade do citoesqueleto e tráfego de vesículas nas células (VANCONCELLOS et al.,
2004) . Tal relato poderia justificar a ausência de diferença de expressão imunoistoquímica do
VEGF entre os grupos alendronato e controle. Entretanto, não explica esse mesmo achado
para o grupo zoledronato.
O campo eleito para avaliação imunoistoquímica correspondeu ao osso vital presente
na região das exodontias, a despeito de o espécime exibir ou não osteonecrose. Tal escolha foi
embasada no fato de que os bisfosfonatos têm afinidade pelo tecido ósseo em sítios de
67
metabolismo ativo, onde atingem concentrações terapêuticas (FLEISCH, 2002). Além disso, o
VEGF aumenta com a hipóxia, e a angiogênese ocorre em situações fisiológicas específicas,
como a consolidação de fraturas (SIVAKUMAR et al., 2004). O reparo cicatricial da ferida
exodôntica também constitui processo de maior atividade metabólica (CALIXTO et al., 2001;
ZIED et al., 2005), o que faz pensar que requeira aumento da angiogênese. No rato, é comum
o processo de cicatrização, em sua fase final, decorridas seis semanas após exodontias,
apresentar aumento progressivo de trabéculas ósseas maduras e diminuição do volume de
tecido conjuntivo (CALIXTO et al., 2001; ZIED et al., 2005). Entretanto, em alguns animais
do presente estudo, o reparo cicatricial formou mais tecido conjuntivo fibroso do que osso.
Teria o osso avaliado a mesma exigência metabólica que o tecido conjuntivo presente na área
das exodontias? Estaria mais indicado avaliar-se a expressão do VEGF no tecido conjuntivo
ou mesmo no soro desses animais, como realizado em outros estudos (SANTINI et al., 2002,
2003)? Seriam esses os aspectos que explicariam a ausência de diferença significativa da
expressão imunoistoquímica do VEGF em osso vital entre os três grupos? Ainda, sabendo-se
que a maior exigência metabólica ocorre na fase inicial do processo cicatricial (CALIXTO et
al., 2001; ZIED et al., 2005), é preciso considerar se a avaliação do VEGF não deveria ter
ocorrido em um período mais precoce, logo após as exodontias.
Por outro lado, há autores que defendem a idéia de que a inibição da angionêse in vivo
por parte dos bisfosfonatos não está definitivamente comprovada, uma vez que a maioria dos
relatos do efeito antiangiogênico provêm de estudos in vitro ou com modelos animais
transgênicos (LANDESBERG et al., 2008; SANTINI et al., 2002; WOOD et al., 2002). O
presente estudo foi realizado em ratos Wistar e presume-se que a resposta por parte desses
modelos animais, salvo restrições inerentes às pecualiaridades da espécie, simule a situação
em humanos. No modelo animal empregado, não foi observada diferença de expressão
imunoistoquímica do VEGF em osso vital entre os grupos alendronato, zoledronato e
controle. Ou seja, o resultado está em consonância com Landesberg et al. (2008) que
argumentam que o efeito antiangiogênico dos bisfosfonatos in vivo não é comprovado. Pampu
et al. (2008), por sua vez, observaram, em estudo histomorfométrico por HE, aumento, e não
diminuição, de vasos sangüíneos no tecido ósseo de coelhos tratados com zoledronato.
O termo angiogênese foi empregado por John Hunter em 1787 para nomear o
crescimento de novos vasos (GUPTA; ZHANG, 2005). Existem cerca de 40 indutores e
inibidores endógenos da angiogênese (POON et al., 2003), porém o VEGF é o fator pró-
angiogênico predominante (SHWEIKI et al., 1992). Estudos têm demonstrado que a
expressão do VEGF é fortemente dependente de células endoteliais de vasos neoformados,
68
mas não de vasos pré-existentes em tumores (BENJAMIN et al., 1999). Os anticorpos anti-
CD31, anti-CD34, anti-CD105 e anti-FVIII (anti-fator VIII) são os mais empregados para
marcação de vasos em imunoistoquímica (VERMEULEN et al., 2002), mas o VEGF também
é bastante aplicado (GLEICH et al., 1997). O anti-FVIII tem a capacidade de identificar vasos
maduros e imaturos (LAITAKARI et al., 2004). O anti-CD105 parece ser um marcador
promissor, porém poucos estudos utilizam-no (VERMEULEN et al., 2002). Uma vez que os
bisfosfonatos são apontados como inibidores da angiogênese, a expressão do VEGF estaria
bem indicada no presente estudo. Por outro lado, diante das especificidades e indicações de
cada um desses anticorpos, também se faz necessário analisar a pertinência de testes que
comparem a expressão de distintos marcadores de angiogênese, inclusive por meio de outros
métodos além da imunoistoquímica, principalmente ao avaliar-se o alendronato.
O critério imunoistoquímico de positividade para o VEGF corresponde a grânulos
marrons em células endoteliais vasculares (VOLM et al., 1997), entretanto, a expressão
também pode ocorrer em citoplasma de fibroblastos (FREITAS et al., 2005). Considerando
este possível viés, no presente estudo a avaliação da expressão do VEGF empregou como
critério de positividade não apenas a marcação de cor marrom, mas também a morfologia da
estrutura histológica marcada. Ainda, a padronização dos mesmos critérios de positividade
aplicados aos três grupos estudados subsidia a confiabilidade das avaliações.
O advento dos bisfosfonatos ao cenário da área biomédica tem configurado um
paradoxo. Ao mesmo tempo em que representaria a solução para condições patológicas cuja
característica principal é a reabsorção óssea, esse grupo de drogas também traz consigo um
novo problema a resolver, que é a osteonecrose, bem como outros possíveis efeitos
indesejáveis ainda desconhecidos. O risco da osteonecrose maxilar de fato existe, e o uso
racional desses fármacos requer a ponderação entre gravidade da doença, condições clínicas
do paciente, potência do fármaco e adequação do uso. A intensificação das pesquisas na busca
de respostas a tantos aspectos ainda obscuros viabilizará a racionalização do uso da droga.
Nesse ínterim, cautela parece ser o caminho mais adequado, e a adequação bucal prévia ao
início da terapia torna-se indispensável.
CONCLUSÕES
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7 CONCLUSÕES
Os resultados da presente pesquisa permitem estabelecer as seguintes conclusões:
a) A administração do bisfosfonato nitrogenado zoledronato por via parenteral
está associada à osteonecrose dos maxilares e é condição suficiente para que
esta ocorra em indivíduos submetidos a exodontias.
b) O bisfosfonato nitrogenado alendronato administrado por via oral não constitui
condição suficiente para a ocorrência de osteonecrose maxilar em indivíduos
submetidos a exodontias.
c) A administração de bisfosfonato nitrogenado por via oral (alendronato) ou
parenteral (zoledronato) não está associada à diminuição da expressão
imunoistoquímica do VEGF em tecido ósseo vital na área das exodontias.
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ANEXOS
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