3.1 EXTRACÇÃO DA Mb Hb A CALIXARENOS EM S...

RESULTADOS E DISCUSSÃO

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3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 EXTRACÇÃO DA Mb c E DA Hb A COM CALIXARENOS EM SOLVENTES ORGÂNICOS

3.1.1 Variação dos Parâmetros de Extracção Foram testadas inicialmente várias condições de extracção para a Mb c e para a Hb A, com os derivados ácidos de calix[4,6,8]arenos e para dois solventes orgânicos (CHCl3 e CH2Cl2), como se indica (vide Tabelas 2.1 e 2.2). A eficiência da extracção dos três derivados ácidos de calix[4,6,8]arenos, foi testada para a Mb c e para Hb A, variando a concentração de calixarenos na gama de 0 a 3mM em CHCl3. Através das Figuras 3.1 e 3.2, pode observar-se que o perfil da absorvância da banda de Sorét em clorofórmio (ASoret, org) acompanha o aumento do grau de extracção (E), avaliado através da diminuição da absorvância da mesms banda da solução aquosa após extracção (Aaq, in) da Mb c e da Hb A, respectivamente. Figura 3.1 – Dependência da concentração de derivados ácidos calix[4,6,8]areno em CHCl3 na extracção da Mb c, com [Mb c]ini =14,7µM e pHini = 5,0: A – extracção com tbutil[4]CH2COOH; B – extracção com tbutil[6]CH2COOH; C – extracção com tbutil[8]CH2COOH.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 50 100 150 200 250

[tbutil[4]CH2COOH]/[Mioglobina]

E (-)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Asoret, org

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0 50 100 150 200 250


E (-)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Asoret, org

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 50 100 150 200 250


E (-)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Asoret, org

A B

C


54

Comparando os valores de E para os três calixarenos em estudo verifica-se que o valor máximo atingido foi de 0,92 na extracção da Mb c a uma concentração de tbutil[6]CH2COOH de 3mM. Em termos de ASoret, observou-se um aumento neste parâmetro na seguinte ordem de calixareno: C8 > C6 > C4. Tal como para a Mb c, a Hb A apresentou o valor mais elevado de E (0,96) usando C6 3mM, no processo de extracção. Contudo, o C8 demonstrou uma actuação semelhante à do C4 em termos de extracção das proteínas na fase orgânica. Figura 3.2 – Dependência da concentração de derivados ácidos de calix[4,6,8]areno em CHCl3 na extracção da Hb A, com [Hb A]ini =3,9 µM e pHini = 5,1: A – extracção com tbutil[4]CH2COOH; B – extracção com tbutil[6]CH2COOH; C – extracção com tbutil[8]CH2COOH. O valor máximo da relação estequiométrica calixareno:proteína foi de 6,8 para a Mb c, em quanto que a Hb A apresentou um valor de 96,8. Esta diferença será, aparentemente, devida à estrutura quaternária da Hb A ao passo que a Mb c contém apenas uma cadeia polipeptídica e por conseguinte não possui estrutura quaternária.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0 200 400 600 800 1000

[tbutil[4]CH2COOH]/[Hemoglobina]

E (-)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

Asoret, org

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0 200 400 600 800 1000


E (-)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

Asoret, org

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0 200 400 600 800 1000


E (-)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Asoret, org

A B

C


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No entanto, para a Hb A não foram testadas relações estequiométricas inferiores a 96,8, podendo o máximo não corresponder exactamente a este valor. Para além do CHCl3, foi utilizado CH2Cl2 para preparar as soluções dos derivados ácidos de calix[4,6,8]arenos. Com o CH2Cl2, foram preparadas soluções com concentração mais baixa, 1 mM, uma vez que após extracção ocorre uma precipitação (turvação) da fase orgânica, que dificulta a leitura da absorvância da banda de Sorét. Nas Figuras 3.3 e 3.4 estão representados os graus de extracção da Mb c e da Hb A, para os três calixarenos, em função do pH da solução inicial de proteína com as concentrações de 14,7 µM e 3,9 µM, respectivamente. Pode constatar -se que não estão representados alguns valores de E, devido à dificuldade de leitura da ASoret, originada pela turvação das amostras. Neste trabalho, não foi possível efectuar a extracção da Hb A com o C4 em CH2Cl2.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0pH

E (%

)

C4 C6 C8

Figura 3.3 – Efeito do pH e tipo de calixareno (C4, C6 e C8 1 mM) em CH2Cl2 sobre o parâmetro de extracção (E) para a Mb c; N.D. – ensaios não determinados. Os resultados apresentados na Figura 3.3 sugerem fortemente que as melhores condições de extracção envolvem a utilização de C6 a pH 7,0 e C8 a pH 6,0, para a Mb c. Por outro lado, a Figura 3.4 demonstra que a extracção da Hb A é máxima com C6 a pH 6,0 e com C8 a pH 9,0. Deste modo, verificou-se que a extracção das proteínas é promovida na presença do calix[4,6,8]areno a valores de pH superiores ao pI da Mb c e da Hb A, sugerindo que as interacções da proteína com o calixareno podem não se limitar às ligações iónicas com os grupos carboxílicos do C4, C6 e C8. Segundo Kolusheva et al. (2006), para além das interacções electrostáticas, existem factores que influenciam as interacções proteína – calixareno, que estão

N.D

. N

.D.

N.D

.

N.D

.

N.D

.


56

dependentes basicamente da proteína a extrair: nomeadamente da polaridade global da proteína, da topologia da sua superfície, da localização dos aminoácidos com carga à sua superfície, assim como do seu tamanho.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0pH

E (%

)

C6 C8

Figura 3.4 – Efeito do pH e tipo de calixareno (C6 e C8 1 mM) em CH2Cl2 sobre o parâmetro de extracção (E) para a Hb A.

De forma a verificar qual a interferência do aumento de força iónica da solução aquosa inicial na interacção da proteína com o calixareno, foram efectuadas extracções de Mb c 14,7 µM, contendo concentrações de KCl na gama de 0 a 2,0 M, com os derivados ácidos de calix[4,6,8]arenos 1 mM em CH2Cl2. Para estes ensaios foram apenas realizadas leituras dos picos de absorvância da banda de Sorét das fases orgânicas devido a dificuldades de leitura das absorvâncias das restantes fases. No entanto, para concentrações superiores a 0,4M de KCl, na extracção com o C4, também não foi possível realizar estas leituras, assim como para valores de [KCl] superiores a 1M com o C6. Os resultados apresentados na Figura 3.5 revelam que a máxima extracção de Mb c ocorreu a [KCl] de 0,2 M em relação à proteína sem sal. Este resultado sugere que a presença do sal aumenta as interacções da proteína com o C6. Na extracção com C4, obteve-se uma extracção máxima com [KCl] de 0,1 M e com C8 nenhuma das concentrações de KCl adicionadas superaram a extracção em relação à proteína sem sal. Com o C8, não se observou nenhuma variação significativa com a adição das várias concentrações de KCl às soluções aquosas iniciais, sugerindo que a adição de sal não interfere significativamente na capacidade de extracção deste calixareno.


57

0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,0

0,0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,5 2,0[KCl] (M)

A sor

et,o

rg

C4 C6 C8

Figura 3.5 – Efeito da [KCl] na extracção da Mb c 14,7 µM e pH 5, com C4, C6 e C8 1 mM em CH2Cl2. Oshima et al. (2005) testaram a adição de NaCl, KCl e CsCl nas fases aquosas contendo Cyt c e lisozima, verificando-se a formação de agregados do complexo calixareno-lisozima na interface na interface orgânica-aquosa. Justificaram este fenómeno pela baixa hidrofobicidade deste complexo para a transferência da proteína para a fase orgânica. Deste modo, os sais foram adicionados com o objectivo de diminuir a tensão interfacial, e verificaram que a adição de NaCl suprime a precipitação do complexo calixareno-lisozima, mas que no entanto a partir de determinadas concentrações de sal a extracção do Cyt c diminui. Segundo estes autores, a presença de excesso destes sais nas fases aquosas, promove a competição entre os iões metal-alcalinos e as proteínas, na complexação com o calix[6]areno. A molécula de calix[6]areno demonstra uma elevada capacidade de extracção para os iões metal-alcalinos com raio iónico mais elevado (CsCl), devido ao tamanho da sua cavidade. De uma maneira geral, o C8 apresentou um comportamento semelhante ao do C6, no que se refere à extracção das proteínas. Este aspecto está de acordo com a estrutura do calixareno, uma vez que estes dois macrocíclos possuem uma cavidade mais larga do que a do C4. Segundo Oshima et al. (2002), o tamanho da cavidade dos calixarenos é um dos factores mais importantes na extracção de proteínas. Existem vários artigos publicados que descrevem o fenómeno de inclusão pelos calixarenos (Ludwig, 2005, Kolusheva et al., 2006 e Schrader e Koch, 2007). De um modo geral, como os derivados de calix[6]arenos e calix[8]arenos possuem uma cavidade relativamente larga, são habitualmente utilizados na inclusão de moléculas orgânicas. Em particular, os calix[6]arenos são os mais ávidos por aminas protonadas. A pseudocavidade construída pelos seis oxigénios do grupo carboxílico dos calix[6]arenos, ajusta-se da melhor forma aos grupos amino protonados. Assim,

N.D

.

N.D

.

N.D

. N

.D.

N.D

. N

.D.

N.D

. N

.D.


58

a simetria da estrutura do C6 é estereoquimicamente favorável às interações entre os átomos de oxigénio com os grupos –NH3

+ presentes na superfície das proteínas. Assim, a forte ligação que os calix[6]arenos promovem é eficaz no reconhecimento de vários compostos de amónio (Nakashima et al., 2002, Oshima et al., 2002 e Oshima et al., 2004). O C6 induz a formação de um “par iónico hidrofóbico” entre as moléculas de calixareno e a proteína, fazendo com que a superfície da proteína se torne suficientemente hidrofóbica, para que seja transferida e solubilizada na fase orgânica. Uma vez que o C6 não forma agregados moleculares, o teor de água presente na fase orgânica não é alterada antes e após a extracção (Oshima et al., 2002). Pelas razões acima expostas, o C6 foi seleccionado para a extracção da Mb c e da Hb A nos restantes ensaios experimentais deste trabalho.

3.1.2 Extracção da Mb c e da Hb A com tbutil[6]CH2COOH em Clorofórmio A extracção da Mb c, foi efectuada a partir de soluções aquosas de proteína com a concentração de 14,7 µM variando o valor de pH de 4,5 a 9,0, com C6 3 mM em CHCl3.

Figura 3.6 – Perfil da extracção da Mb c em TF com C6 3mM em CHCl3: A – logo após a adição das fases; B – após 30 min de extracção a 28ºC.

BB

TTUUBBOO 11 TTUUBBOO CCOONNTTRROOLLOO

Fase Orgânica

Fase Aquosa

TTUUBBOO 11 TTUUBBOO CCOONNTTRROOLLOO

AA


59

As fotografias da Figura 3.6 mostram o aspecto do perfil de extracção da Mb c em TF com C6 3mM em CHCl3, após 30min de extracção (TUBO 1). Como se pode também observar através desta figura, a Mb c não apresenta extracção para a fase orgânica no tubo que contém o solvente orgânico sem o calixareno (TUBO CONTROLO). Como já foi referido no Capítulo 2, foram efectuados espectros de UV-Vis, a todas as soluções aquosas e orgânicas, após a extracção da Mb c com C6 em CHCl3, nas várias condições de extracção. Na Figura 3.7, estão representados exemplos dos espectros obtidos para a Mb c em TF e após a extracção com o C6 em CHCl3.

Figura 3.7 – Espectros UV-Vis (230-590 nm) da Mb c em TF, do complexo Mb c – C6 em CHCl3 e da fase aquosa após extracção. Os espectros de absorção de UV-Vis das hemeproteínas, apresentam duas bandas de transições electrónicas, uma banda muito forte conhecida como a banda de Sorét (ou banda B) e duas bandas mais fracas designadas por bandas Q (500-600 nm). A banda de Sorét a 407-410 nm, está relacionada com a ligação ao átomo de Fe do heme na 6ª posição de coordenação e com a “bolsa” distal altamente polar (Li e Mabrouk, 2003). Tal como seria de esperar, o espectro UV-Vis obtido da solução aquosa de Mb c em TF apresenta uma absorvância máxima a 409 nm, correspondente à banda de Sorét do grupo heme (Witting et al., 2002 e Wiwatchaiwong et al., 2006). Este aspecto é bastante importante, uma vez que a banda de absorção do heme na zona visível (banda de Sorét) pode indicar informações sobre a possível desnaturação das hemeproteínas (Zhou et al., 2005).

Mioglobina 14,7 µM em TF Fase Aquosa: após extracção

Fase orgânica: Complexo Mioglobina – C6 em CHCl3

C6 3mM em CHCl3

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

230 260 290 320 350 380 410 440 470 500 530 560 590

Comprimento de onda (nm)

Abs

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

480 510 540 570 600


Abs


60

São também observados, no espectro UV-Vis da Mb c em solução aquosa, dois picos de absorvância a 504 e 582 nm (bandas Q), que tendem a desaparecer com a diminuição dos valores de pH. Quando a Mb c se encontra ligada ao C6 em CHCl3, a banda de Sorét sofre um ligeiro desvio para 404 nm. Este desvio verifica-se também para certos valores de pHini, isto é, para valores de pHini superiores a 7, o máximo de absorvância é desviado para 411 nm, e a um pHini de 3,5, a banda fica mais larga e com um pico de absorvância mais pequeno, a 405 nm. Nestes espectros, as bandas Q não estão presentes. Wiwatchaiwong et al. (2006) obtiveram desvios semelhantes da banda de Sorét, para Mb c modificada quimicamente com óxido de polietileno (PEO) solubilizada em CHCl3 e noutros solventes orgânicos. A fase aquosa após extracção, apresenta uma banda entre aproximadamente 260-300 nm, verificando-se deste modo a passagem do C6 para a fase aquosa, durante o processo de extracção. Assim, depois da realização destes espectros, foi possível determinar o grau de extracção e a ASorét, org em função do pH inicial da proteína, verificando-se que o pH óptimo de extracção é de 6,5 para a Mb c (Figura 3.8).

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

4,5 5,5 6,5 7,5 8,5

pHini

E (-)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

ASoret, org

Figura 3.8 – Efeito do pH inicial da solução aquosa de Mb c 14,7 µM sobre o grau de extracção, com C6 3mM em CHCl3. O perfil da variação da ASoret, org em função do pHini acompanha a variação do E, tendo como base a diminuição de absorvância da Mb c em fase aquosa após extracção. Estes resultados confirmam que o C6, possui um elevado potencial para a solubilização da Mb c em solventes orgânicos. À semelhança da Mb c, foram efectuadas extracções da Hb A com C6 3mM em CHCl3, usando soluções aquosas de 3,9 µM na gama de pH 4,5 a 9,0. Para a


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determinação dos parâmetros de extracção, foram efectuados espectros de UV-Vis, das fases aquosas e orgânicas, antes e após a extracção. Na Figura 3.9, apresentam-se os espectros da Hb A em TF, da fase aquosa após a extracção e da Hb A depois de extraída com C6 em CHCl3, assim como da fase orgânica antes da extracção.

Figura 3.9 – Espectros UV-Vis (230-590 nm) da Hb A em tampão glicina 10mM pH 7,5, do complexo Hb A – C6 em CHCl3, do C6 em CHCl3 e da fase aquosa após extracção. O espectro UV-Vis da solução aquosa de Hb A (tampão glicina 10mM pH 7,5) apresenta uma ASoret a 406 nm. O pico da banda de Sorét, vai sofrendo ligeiros desvios com a variação do pH. À medida que o pH diminui, esta banda vai sendo desviada até 395 nm. Os espectros UV-Vis da Hb fornecem informações importantes acerca das interacções heme – proteína, da sua oxidação e do estado das ligações da proteína a um ligando (Kristinsson, 2002). Assim, à medida que o pH diminui, as bandas de Sorét, são desviadas sendo o valor de ASoret reduzido. As soluções aquosas de Hb A apresentam também dois pequenos picos de absorvância a 538 e 573 nm, que correspondem às bandas Q, que vão diminuindo à medida que os valores de pH também diminuem. Estes resultados estão de acordo com os obtidos por Kristinsson (2002). Segundo este autor, as alterações verificadas na banda de Sorét à medida que o pH diminui, indicam alterações na conformação na “bolsa” do heme, correspondendo à perda de contacto do heme com a His proximal (pH < 3). Relativamente aos dois picos entre 500 e 600 nm, estes vão diminuindo à medida que o pH também diminui, traduzindo a perda de capacidade da proteína de se ligar ao O2. Relativamente ao espectro do complexo Hb A – C6 em CHCl3, a banda de Sorét sofre um pequeno desvio para 404 nm, não se observando os picos entre 500 e 600 nm. Ao compararmos o espectro UV-Vis, da fase aquosa após extracção com o

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

230 260 290 320 350 380 410 440 470 500 530 560 590


Abs

Hemoglobina 3,9 µM pH 7,5 Fase Aquosa: após extracção

Fase orgânica: Complexo Hemoglobina – C6 em CHCl3

C6 3mM em CHCl3

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

480 510 540 570 600


Abs


62

C6 3 mM em CHCl3, verifica-se uma banda comum entre 260-300 nm, o que sugere a transferência de moléculas de C6 para a fase aquosa durante a extracção. Desta forma, após a realização dos espectros UV-Vis, foi possível determinar os parâmetros de extracção (E) e as ASoret,org, em função do pHini da Hb A. Os resultados apresentados na Figura 3.10, revelam que o pH óptimo de extracção da Hb A é de 5,5.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5

pHini

E (-)

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

1,8

ASoret, org

Figura 3.10 – Efeito do pH inicial da solução aquosa de Hb A 3,9 µM sobre o grau de extracção, com C6 3mM em CHCl3. A variação da ASoret, org acompanha, de um modo geral, o perfil do E em função do pH. Podemos mais uma vez, confirmar que o C6 tem uma elevada capacidade para a solubilização da Hb A em solventes orgânicos. Através dos resultados obtidos para a Mb c e para a Hb A, verifica-se que a extracção das proteínas é promovida na presença da calixareno a valores de pH superiores ao pI das referidas proteínas, sugerindo que as interacções da proteína com o calixareno podem não se limitar apenas às ligações iónicas com os grupos carboxílicos do C6. Assim, para além das interacções electrostáticas, existem outros factores que influenciam as interacções proteína – calixareno, como a polaridade global da proteína, a localização dos aminoácidos com carga à superfície da proteína (formação de domínios), topologia da superfície e tamanho da proteína (Zadmard et al., 2004 e Kolusheva et al., 2006). A Tabela 3.1 apresenta algumas informações sobre a estrutura das duas proteínas usadas neste trabalho. Em termos de resíduos aminoacídicos com cadeias laterais carregadas positivamente, a Hb A apresenta um maior número deste tipo de resíduos do que a Mb c. Este aspecto é importante realçar na medida em que os


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trabalhos publicados sobre a extracção de proteínas com calixarenos referem o papel desempenhado pelos resíduos da Lys no Cyt c, considerando que o toctil[6]CH2COOH extrai selectivamente proteínas “ricas em Lys” (Oshima et al., 2002 e Oshima et al., 2005).

Tabela 3.1 – Informações moleculares das duas proteínas usadas neste trabalho.

NÚMERO DE RESÍDUOS CATIÓNICOS PROTEÍNA

MASSA MOLECULAR

RELATIVA PI

His Lys Arg

Mb c 16 951 6,8 11 19 2

Hb A 64 500 7,1 36 44 12

A pH inferior ao valor de pI, os resíduos de Arg, de Lys e de His, localizados à superfície das proteínas, encontram-se com carga positiva, enquanto que os resíduos de Asp e de Glu podem apresentar carga negativa, não sendo portanto uniforme a distribuição da carga da superfície destas biomoleculas. Uma molécula de Mb c, através da sua estrutura tridimensional, demonstra que se encontram à sua superfície 19 Lys dispostas irregularmente, 2 Arg e 6 a 7 His também acessíveis. Mesmo a pH 9,0, embora a carga global da superfície da Mb c seja negativa, mantém-se um número considerável de resíduos aminoacídicos carregados positivamente à sua superfície (Hemdan et al., 1989, Stoyanov et al., 2002 e Yang et al., 2007). Este aspecto justifica o facto de valores de pH superiores ao valor de pI, se verificar a extracção da Mb c para a fase orgânica com calix[4,6,8]arenos. O mesmo pode ser considerado para a Hb A, uma vez que possui 27 His (Chen et al., 1996), não sendo possível, no entanto, conhecer o número de resíduos de Lys e Arg distribuídos à superficie da Hb.


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3.2 BIOCATÁLISE Uma vez optimizado o processo de extracção das proteínas Mb c e Hb A na presença de C6 em solventes orgânicos, avançou-se para o estudo da biocatálise de ambas as proteínas quer em meio aquoso quer em meio orgânico.

3.2.1 Oxidação Catalítica da Seringaldazina pela Mb c e pela Hb A A actividade catalítica de peroxidase da Mb c e da Hb A, na oxidação da seringaldazina foi determinada como descrito nos Materiais e Métodos, em 2.2.3.1.

3.2.1.1 Em Meio Aquoso As reacções de oxidação da seringaldazina catalisadas pela Mb c e pela Hb A em solução aquosa foram acompanhadas através das curvas de progresso da formação de produto (A550 durante cerca de 4,5 min). Na Figura 3.11, estão representados exemplos das curvas obtidas para a determinação da velocidade inicial de reacção, assim como as referentes aos ensaios controlo. Figura 3.11 – Curvas de progresso da reacção de oxidação da seringaldazina em meio aquoso catalisadas, utilizando: (A) Mb c 4,9 µg em TF; (B) Hb A 5 µg em TF. Deste modo, pode-se verificar também que sem a presença de enzima (controlo 1) não ocorre reacção, assim como sem substrato (controlo 2).

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 2,8 3,2 3,6 4,0 4,4

Tempo (min)

Abs

550

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 2,8 3,2 3,6 4,0 4,4

Tempo (min)

Abs

550

A B

Proteína

Controlo 1 (Tampão TF + Seringaldazina 1mM em etanol)

Controlo 2 (Tampão TF + etanol + proteína)


65

3.2.1.2 Em Meio Orgânico A solubilização com calixarenos é um método eficaz para dissolver proteínas em meios orgânicos. A oxidação da seringaldazina em CHCl3, foi efectuada na presença de Mb c e de Hb A extraídas com C6, conforme descrito em 2.2.3.1.2. Na Figura 3.12, estão representadas curvas de progresso de formação de produto em CHCl3, assim como as dos ensaios em branco.

Figura 3.12 – Curvas de progresso da reacção de oxidação da seringaldazina em meio orgânico, na presença de: (A) C6 - Mb c, 4,5 µg proteína em CHCl3; (B) C6 - Hb A, 4,9 µg proteína em CHCl3. Da mesma forma como em meio aquoso, foram determinadas as velocidades iniciais de oxidação, através das curvas de progresso obtidas.

3.2.2 Determinação do pH Óptimo na Oxidação da Seringaldazina pela Mb c e pela Hb A A variação do pH na actividade de peroxidase da Mb c e da Hb A foi efectuada em fase aquosa, com diferentes soluções tampão, variando o pH numa gama de 3,5 a 9,0. Claramente, a pseudoactividade de peroxidase da Mb c e da Hb A é dependente do pH do meio reaccional. Através da Figura 3.13, é possível verificar que a Mb c apresentou um pH óptimo de actividade entre 4,5 e 5,5. Quanto à Hb A, esta proteína revelou um pH óptimo de actividade de 5,5 (Figura 3.14).

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 2,8 3,2 3,6 4,0 4,4

Tempo (min)

Abs

550

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 2,8 3,2 3,6 4,0 4,4

Tempo (min)

Abs

550

C6 - proteína

Controlo 1 (CHCl3 + Seringaldazina 1mM em etanol)

Controlo 2 (etanol + C6 – proteína em CHCl3)


66

0

1

2

3

4

5

6

7

3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5pH

Activ

idad

e de

Per

oxid

ase

da M

b c

x10

-2 (U

. mg

prot

eína

-1)

Figura 3.13 – Variação do pH na actividade de peroxidase da Mb c. A actividade de peroxidase foi doseada com 9 µg de proteína, em várias soluções tampão, com Syr 1mM em etanol na presença de H2O2 (0,18mM), à temperatura ambiente, de acordo com os Materiais e Métodos.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5

pH

Activ

idad

e de

Per

oxid

ase

da H

b A

x 10

-2 (U

. mg

prot

eína

-1)

Figura 3.14 – Variação do pH na actividade de peroxidase da Hb A. A actividade de peroxidase foi doseada com 5 µg de proteína, em várias soluções tampão, com Syr 1mM em etanol na presença de H2O2 (0,18mM), à temperatura ambiente, de acordo com os Materiais e Métodos. Estes resultados estão de acordo com os obtidos por Zheng et al. (2005), utilizando OPDA como substrato (pH 5,0 – 5,6) na presença de H2O2 e por Gabbianelli et al. (2004) para a Hb de truta (pH 5,4) na oxidação do guaiacol. Ao compararmos com o valor de pH óptimo obtido para a peroxidase de raízes de milho na oxidação da Syr (pH 7,5), este valor é bastante diferente (Grison e Pilet, 1985). No entanto, coincide com os valores observados de pH 5,5 e 5,2 para a peroxidase de narciso (Narcissus pseudonarcissus) (Renaldo et al., 1981) e para a de tomate (Fleuriet e Deloire, 1982), respectivamente. Também está de acordo com o pH óptimo obtido por Karmali e Santos (1988), para a peroxidase de agulhas de pinheiro, usando o-dianisidina como substrato (pH 5,0).


67

Porém, as peroxidases da classe III (peroxidases clássicas de origem vegetal) apresentam habitualmente pH óptimo entre 3,0 e 5,5 (Franzen et al., 2007). De acordo com Carlsen et al. (2003) a pseudoactividade de peroxidase da Mb e da Hb, aumenta com a diminuição do pH, o que condiz com os resultados obtidos. No entanto, podemos verificar que a valores de pH 3,5 ambas as proteínas não apresentam actividade catalítica.

3.2.3 Determinação da Actividade Específica O efeito da concentração de proteína na velocidade inicial de reacção de oxidação da Syr na presença de H2O2, foi determinada utilizando uma concentração de Syr e de H2O2 constante.

3.2.3.1 Em Meio Aquoso A Mb c apresentou pseudoactividade de peroxidase em meio aquoso com um comportamento linear em função da sua concentração obtendo-se a actividade específica de 1,08 x 10-1 U. mg proteína-1, a pH 6,5 (Figura 3.15). Por outro lado, também se verificou que a Hb A apresentou actividade de peroxidase com actividade específica de 1,04 U. mg proteína-1 a pH 5,5 (Figura 3.16).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025

Mioglobina (mg)

Act

ivid

ade

de P

erox

idas

e x

10-3

(U)

y = 1,08E-01x + 2E-05

Figura 3.15 – Efeito da variação da concentração da Mb c sobre a actividade de peroxidase em meio aquoso, a pH 6,5.


68

0

2

4

6

8

10

12

0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010 0,012

Hemoglobina (mg)

Act

ivid

ade

de P

erox

idas

e x

10-3

(U)

y = 1,04x - 1,27E-04

Figura 3.16 – Efeito da variação da concentração da Hb A sobre a actividade de peroxidase em meio aquoso, a pH 5,5.

De acordo com a literatura, ambas as proteínas apresentaram uma pseudoactividade de peroxidase usando como substrato ABTS, guaiacol, OPDA, óxido de estireno, pirogalol, entre outros (Matsui et al., 1998, Hayashi et al., 1999, Ozaki et al., 2000, Fedeli et al., 2001, Rayner et al., 2004, Zheng et al., 2005, Gao et al., 2005, Saha et al., 2005). As actividades específicas da Mb, referidas na literatura estão na gama de valores de 1,38 U.mg proteína-1 para a oxidação do guaiacol e 1,47 U.mg proteína-1 para a oxidação do ABTS (Matsui et al., 1998, Hayashi et al., 1999, Ozaki et al., 2000). Relativamente às actividades específicas da Hb A, é referido o valor de 13,51 U.mg proteína-1 para a oxidação do pirogalol, na presença de H2O2 176 mM (Saha et al., 2005). Contudo, torna-se difícil a análise comparativa destes valores da literatura com os do presente trabalho, na medida em que foi usado um substrato diferente (Syr) na reacção catalisada quer pela Mb c e quer pela Hb A, assim como diferentes concentrações de H2O2. Para a Mb c, obtiveram-se valores de actividade específica com a Syr entre 6,11 x 10-2 e 1,0 x 10-1 U.mg proteína-1 em função do pH (Figura 3.15). Enquanto que para a Hb A, foram encontradas actividades específicas que variaram entre 5,7 x 10-1 e 1,04 U.mg proteína-1 em função do pH (Figura 3.16). No entanto, pode ser estabelecida uma comparação dos valores de actividade específica obtidos para estas duas proteínas com as existentes na literatura para a peroxidase convencional que catalisa a oxidação da Syr. Nos trabalhos desenvolvidos por Grinson e Pilet (1985), para a peroxidase extraída das raízes do milho, está descrita uma actividade específica de 1,01 U.mg peso fresco-1. Para as isoenzimas de peroxidase extraídas das raízes do tomate, Quiroga et al. (2000)


69

obtiveram valores entre 2,07 e 62,09 U.mg proteína-1. Como seria de esperar, os valores da actividade específica da Mb c e da Hb A, são mais baixos do que os referidos para as peroxidases vegetais, embora a Hb A apresente valores na mesma ordem de grandeza. Ao comparamos os valores obtidos, com os referidos por Hiner et al. (1996) para a peroxidase de rábano silvestre (HRP), utilizando ABTS e guaiacol, verifica-se que os valores para a HRP são cerca de 1000 vezes mais elevados com o ABTS e cerca de 100 vezes com o guaiacol. Para a peroxidase de agulhas de pinheiro, na oxidação de o-dianisidina, a actividade específica determinada por Karmali e Santos (1988), foi também bastante mais elevada (948 U. mg proteína-1). A actividade específica máxima, em meio aquoso, da Mb c e da Hb A é a pH 6,5 em TF e a pH 5,5 em tampão citratos 50 mM, respectivamente (Figuras 3.17 e 3.18).

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5pH

Act

ivid

ade

Espe

cífic

a x

10-1

(U.m

g pr

oteí

na-1

)

Figura 3.17 – Estudo da actividade específica em função do pH da solução inicial da Mb c, em meio aquoso.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5

pH

Act

ivid

ade

Espe

cific

a (U

.mg

prot

eína

-1)

Figura 3.18 – Estudo da actividade específica em função do pH da solução inicial da Hb A, em meio aquoso.


70

Em termos de actividade específica máxima destas proteínas, não é possível a análise comparativa com os valores da literatura porque os mesmos não são mencionados (Hayashi et al., 1999 e Zheng et al., 2005). E por outro lado os substratos utilizados nos trabalhos descritos na literatura são diferentes do substrato utilizado neste trabalho.

3.2.3.2 Em Meio Orgânico Posteriormente, foi analisada a pseudoactividade de peroxidase do complexo Mb c – C6 extraído em meio orgânico. Surpreendentemente, este complexo apresentou pseudoactividade de peroxidase verificando-se uma relação linear entre a actividade catalítica e a concentração de Mb c, com uma actividade específica de 1,37 x 10-1 U. mg de proteína-1 a pH 6,5 (Figura 3.19). Por outro lado, o complexo Hb A – C6 também possui actividade de peroxidase, com uma actividade específica a pH 7,5 de 9,92 x 10-2 U. mg de proteína-1 (Figura 3.20).

0

4

8

12

16

20

0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010 0,012 0,014 0,016Mioglobina (mg)

Act

ivid

ade

de P

erox

idas

e x

10-4

(U)

y = 1,37E-1x - 4E-4

Figura 3.19 – Efeito da variação da concentração da Mb c ligada ao C6, sobre a actividade de peroxidase em meio orgânico, tendo a Mb c pHini 6,5.

O efeito da concentração de proteína na velocidade inicial da reacção, foi determinada para as soluções de proteína com C6, após extracção e consoante o valor inicial do pH da solução aquosa da proteína (pHini).


71

0

4

8

12

16

20

24

0,000 0,004 0,008 0,012 0,016 0,020 0,024Hemoglobina (mg)

Act

ivid

ade

de P

erox

idas

e x

10-4

(U)

y = 9,92E-02x - 2E-4

Figura 3.20 – Efeito da variação da concentração da Hb A ligada ao C6, sobre a actividade de peroxidase em meio orgânico, tendo a Hb A pHini 7,5. Os valores de actividade específica da Hb A em meio não convencional são inferiores aos obtidos em meio aquoso ao passo que estes valores são semelhantes para a Mb c a pH 6,5 em ambos os meios.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5pH

Act

ivid

ade

Espe

cific

a x1

0-1

(U.m

g pr

oteí

na-1

)

Figura 3.21 – Efeito do pHini da solução aquosa de Mb c sobre a actividade específica, em meio orgânico.


72

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5

pH

Act

ivid

ade

Espe

cífic

a x1

0-1

(U. µ

g pr

oteí

na-1

)

Figura 3.22 – Efeito do pHini da solução aquosa de Hb A sobre a actividade específica, em meio orgânico. O fenómeno de “memória de pH” é bem conhecido na biocatálise em meios não convencionais (Zaks e Klibanov, 1985, Ke e Klibanov, 1998 e Gupta e Roy, 2004), tendo sido também investigado neste trabalho. Assim, a Figura 3.21 apresenta uma actividade específica máxima a pH 6,5 para a Mb c extraída com C6 em clorofórmio. O valor da actividade específica a este pH, como já foi referido, é ligeiramente superior ao valor obtido em meio aquoso, sugerindo que a formação do complexo proteína – C6 promove o aumento da eficiência catalítica desta proteína em meios não convencionais. Contudo, a Hb A apresenta uma actividade específica máxima a pH 7,5, em meio orgânico, sendo este valor de actividade específica inferior por um factor de 6,3 em relação ao meio aquoso (Figura 3.22). Por outro lado, devido à alteração do microambiente destas proteínas nos dois meios, verifica-se que os vários parâmetros (pH e actividade específica) são distintos sendo esta diferença mais acentuada para a Hb A (Figuras 3.17, 3.18, 3.21 e 3.22). Quanto à pseudoactividade de peroxidase destas proteínas sob a forma de complexo com as moléculas de C6, os autores não têm conhecimento de trabalhos publicados na literatura sobre este tipo de comportamento de biocatálise para ambas as hemeproteínas. Efectivamente, existem 3 artigos publicados na literatura, que envolvem a utilização do Cyt c sob a forma de complexo com moléculas de ácido carboxílico derivado do p-tert-octilcalix[6]areno, apresentando pseudoactividade de peroxidase em meio orgânico (Oshima et al., 2002, Oshima et al., 2005, Shimojo et al., 2007).


73

Actualmente, as reacções enzimáticas em meios não convencionais, têm sido alvo de grande interesse científico e industrial, em virtude de se obter taxas de bioconversão muito elevadas em comparação com o meio aquoso (Vermuë e Tramper, 1995). Como já foi referido anteriormente, existem várias metodologias de solubilização de enzimas em meios orgânicos, nomeadamente a modificação química com PEG e solubilização em micelas invertidas (Adlercreutz, 2000 e Aires-Barros, 2002). A solubilização de proteínas com calixarenos apresentado neste trabalho, consiste num método inovador para dissolver proteínas em meio orgânico, tendo sido publicados apenas três artigos sobre este assunto. Por outro lado, estas proteínas solubilizadas apresentam actividade catalítica que é uma característica muito interessante do ponto de vista industrial. Tal como nos trabalhos efectuados por Oshima et al. (2002) com o Cyt c, também neste estudo as actividades enzimáticas determinadas, são dependentes do pHini da fase aquosa. A pseudoactividade de peroxidase dos complexos Mb c – C6 e Hb A – C6, poderá estar também dependente do tipo de solvente orgânico utilizado. Contudo, o tempo não permitiu a realização deste estudo tendo sido utilizado apenas o clorofórmio. Segundo Oshima et al. (2002), solventes com o valor de log P elevado (ex: clorofórmio, Log P = 2,0, tolueno, Log P = 2,5 e o p-xileno, Log P = 3,1) favorecem a reacção de oxidação do 2,6 – DMP na presença do Cyt c, ao passo que esta proteína sofre inactivação em solventes com valores de Log P mais baixos (ex: acetonitrilo, Log P = -0,33 e THF, Log P = 0,49) .

3.2.4 Determinação dos Parâmetros Cinéticos O comportamento cinético da pseudoactividade de peroxidase destas proteínas foi avaliado em meio aquoso e em meio orgânico. Assim, os parâmetros cinéticos (Vmáx, Km, kcat e kcat/Km) foram determinados quer pela representação gráfica de Michaelis-Menten quer pela representação gráfica de Lineweaver-Burk, com o auxílio de software apropriado (Enzyme Kinetics - SigmaPlot v.10.0). A reacção da Mb c e da Hb A com o H2O2, traduz-se na activação da Mb c (MbFe(III)) e da Hb A (HbFe(III)) dando origem a um análogo do composto I (•MbFe(IV) e •HbFe(IV)). Esta reacção é independente do pH da mistura reaccional e é determinante para a actividade do composto I (vide 1.1.4). Estas proteínas reagem mais lentamente com o H2O2 (≈ 102 M-1s-1) do que as peroxidases convencionais (≈ 107 M-1 s-1) (Dunford, 2002 e Carlsen et al., 2005). No entanto, a reacção catalítica de oxidação do substrato fenólico pelo composto II da Mb c e da Hb A selvagens, é mais lenta permitindo acompanhar com mais facilidade a reacção.


74

Assim, para a determinação dos parâmetros cinéticos, da reacção de oxidação catalítica da Syr, foram utilizadas diferentes concentrações deste substrato, mantendo as concentrações de proteína e de H2O2 constantes.

3.2.4.1 Em Meio Aquoso Os parâmetros cinéticos foram determinados da reacção catalisada quer pela Mb c quer pela Hb A, em meio aquoso a diferentes valores de pH. Foram efectuadas as representações de Michaelis-Menten bem como de Lineweaver-Burk de forma a determinar os valores de Vmáx e Km. Na Figura 3.23, estão exemplificadas as representações gráficas para a Mb c a pH 6,5. De um modo geral, os valores dos parâmetros cinéticos obtidos através destas duas representações (Tabela 3.2) são semelhantes. Figura 3.23 – Representações gráficas: de Michaelis-Menten (A) e de Lineweaver-Burk (B) para a Mb c em TF, utilizando seringaldazina como substrato, de acordo com os Materiais e Métodos. Analisando os valores de Vmáx para a reacção catalisada pela Mb c, em meio aquoso, apresentam um valor máximo a pH 4,5, pela representação de Michaelis-Menten com 2,17 × 10-1 U.mg proteína-1 (Tabela 3.2). O valor de Km mais baixo, 1,17 × 10-2 mM de Syr corresponde a pH 8,1 através da representação de Lineweaver-Burk, e 1,29 × 10-2 mM de Syr a pH 9,0 através da representação de Michaelis-Menten. Em termos de literatura, Hayashi et al. (1999) obtiveram um valor de Km para a Mb c de 7,4 mM na oxidação do guaiacol (pH 7) na presença de H2O2 9,7 mM. A Mb c apresenta um valor de Km mais elevado na ordem de 20,9 mM usando OPDA como substrato a pH 5,6 e na presença de H2O2 1mM (Zheng et al., 2005).

[Seringaldazina] (mM)

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30

Act

ivid

ade

de P

erox

idas

e da

Mb

c x

10-3

(U.m

g pr

oteí

na-1

)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

[Seringaldazina]-1 (mM-1)

-20 -10 0 10 20 30 40

(Act

ivid

ade

de P

erox

idas

e da

Mio

glob

ina)

-1 (U

. mg

prot

eína

-1)-1

500

1000

1500

2000

2500

A B


75

O kcat para a pseudoactividade de peroxidase da Mb c com Syr foi de 7 x 10-2 s-1 (Lineweaver-Burk) e 6,12×10-2 s-1 (Michaelis-Menten), a pH 4,5 (Tabela 3.2). Contudo, Hayashi et al., 1999 e Zheng et al., 2005 obtiveram valores de kcat de 1,1 e 1,48 s-1

para guaiacol e OPDA, na presença de Mb c, respectivamente. Quanto aos valores de kcat/Km, o valor mais elevado surge a pH 9,0, em ambas as representações (Tabela 3.2). Podemos verificar que a actividade catalítica da Mb c vai decrescendo com o aumento do pH (Tabela 3.2), cujos resultados são concordantes com os obtidos por Carlsen et al. (2003), que utilizaram o ABTS como substrato. Como se pode verificar os substratos utilizados nos estudos descritos na literatura são diferentes do usado neste trabalho, assim como a concentração de H2O2, dificultando a sua análise comparativa. Existem, no entanto, outras publicações que apresentam valores de Km semelhantes aos obtidos neste trabalho, utilizando a Mb de esperma de baleia na oxidação do ABTS e ácido p-hidroxifenilpropiónico (Matsui et al., 1998, Ozaki et al., 2000 e Casella et al., 2002). Tabela 3.2 – Parâmetros cinéticos da actividade de peroxidase da Mb c em meio aquoso, através das representações gráficas de os métodos de Michaelis-Menten e Lineweaver-Burk.

LINEWEAVER-BURK

pH 4,5 5,5 6,5 7,5 8,1 9,0

Parâmetros Cinéticos

Km (mM) 9,52×10-2 ± 2,65×10-3 6,45×10-2 ± 5,77×10-3 5,65×10-2 ± 3,46×10-3 2,37×10-2 ± 2,79×10-3 1,17×10-2 ± 8,51×10-4 1,28×10-2 ± 3,26×10-3

kcat (s-1) 7,10×10-2 ± 3,75×10-3 4,73×10-2 ± 7,42×10-4 2,89×10-2 ± 1,34×10-3 1,63×10-2 ± 2,25×10-4 1,39×10-2 ± 7,48×10-4 1,46×10-2 ± 1,46×10-3

Vmáx (U.mg proteína-1) 2,51×10-1 ± 1,33×10-2 1,67×10-1± 2,62×10-3 1,02×10-1 ±4,73 ×10-3 5,77×10-2 ±7,95 ×10-4 4,92×10-2 ±2,65 ×10-3 5,17×10-2±5,12 ×10-3

kcat / Km (mM-1s-1) 0,75 ± 1,42×10-3 0,73 ± 1,29×10-4 0,51 ± 8,70×10-3 0,69 ± 8,10×10-5 1,19 ± 8,80×10-5 1,14 ± 4,48×10-4

MICHAELIS-MENTEN

pH 4,5 5,5 6,5 7,5 8,1 9,0


Km (mM) 7,91×10-2 ± 2,19×10-3 9,31×10-2 ± 2,50×10-3 5,64×10-2 ±9,87×10-3 2,31×10-2 ± 3,85×10-3 1,91×10-2 ± 4,32×10-3 1,29×10-2 ± 2,52×10-3

kcat (s-1) 6,12×10-2 ± 6,91×10-3 5,50×10-2 ± 6,73×10-3 2,92×10-2 ± 1,84×10-3 1,57×10-2 ± 6,58×10-4 1,56×10-2 ± 8,12×10-4 1,45×10-2 ± 6,62×10-3

Vmáx (U.mg proteína-1) 2,17×10-1 ± 2,45×10-2 1,95×10-1 ± 2,38×10-2 1,03×10-1 ± 6,65×10-3 5,57×10-2 ± 2,33×10-3 5,51×10-2 ± 2,88×10-3 5,12×10-2 ± 2,34×10-3

kcat / Km (mM-1s-1) 0,77 ± 3,16×10-2 0,59 ± 2,69×10-2 0,52 ± 1,86×10-2 0,68 ± 1,71×10-2 0,82 ± 1,88×10-2 1,12 ± 4,44×10-2

Neste trabalho não foi possível estudar o efeito da concentração de H2O2 sobre a pseudoactividade da Mb c e da Hb A, quer em meio aquoso quer em meio orgânico. Contudo está descrito na literatura que baixas concentrações de H2O2 induzem a pseudoactividade de peroxidase ao passo que a altas concentrações este composto promove danos oxidativos na proteína inibindo a sua actividade catalítica. Todavia,


76

os substratos aromáticos apresentam efeitos protectores da actividade de peroxidase. (Ryu et al., 2002 e Roncone et al., 2005). Na Figura 3.24, apresenta-se um exemplo das representações gráficas para a Hb A a pH 7,5. Os valores dos parâmetros cinéticos, em meio aquoso, para a Hb A em função do pH estão indicados na Tabela 3.3, tendo-se obtido valores, de um modo geral, concordantes através das duas representações.

Figura 3.24 – Representações gráficas: de Michaelis-Menten (A) e de Lineweaver-Burk (B) para a Hb A em tampão glicina 10mM pH 7,5, utilizando seringaldazina como substrato, de acordo com os Materiais e Métodos. O valor mais baixo de Km para pseudoactividade de peroxidase da Hb A na oxidação de Syr, foi obtido a pH 7,5 e o valor mais alto a pH 6,5 (Tabela 3.3). Quanto ao valor máximo de Vmáx este corresponde a pH 6,5. Wang et al. (2004) obtiveram um valor de Vmáx e de Km, de 1,8 U. mg proteína-1 e 2,85 mM, para a Hb A em meio aquoso, na oxidação de o-penilenediamina (OPD) e na presença de H2O2 25 mM, respectivamente. Ao comparamos estes valores descritos na literatura com os obtidos neste trabalho, verifica-se que o valor de Vmáx

encontra-se na mesma ordem de grandeza, sendo o valor de Km mais baixos (Tabela 3.3). Quanto ao kcat e ao kcat/Km, estes autores obtiveram 0,87 s-1 e 0,31 mM-1 s-1, respectivamente, verificando-se que o valor de kcat é semelhante ao obtido neste trabalho para pH 5,5, enquanto que o valor de kcat/Km é mais baixo do que todos os valores determinados para a Hb A neste trabalho (Tabela 3.3). Está descrito na literatura que a Hb A apresenta um valor de Km superior por um factor de 8 para a oxidação de OPDA (pH 5,6), na presença de H2O2 1mM (Zheng et al., 2005). No entanto, a Hb bovina apresenta um valor de Km de 0,21 mM para a

A B


0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25

Activ

idad

e de

Per

oxid

ase

da H

emog

lobi

na (U

.mg

prot

eina

-1)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4


-100 -50 0 50 100 150

(Act

ivid

ade

de P

erox

idas

e da

hem

oglo

bina

)-1 (U

. mg

prot

eína

-1)-1

500

1000

1500

2000

2500


77

oxidação de 2-metoxifenol (guaiacol) na presença de H2O2 3 mM, a pH 7 (Gao et al., 2005). Relativamente ao kcat este parâmetro apresenta um valor máximo a pH 6,5 (Tabela 3.3), ao passo que kcat/Km possui um valor máximo a pH 7,5. Em relação à literatura, Zheng et al. (2005) obtiveram um kcat e kcat/Km de 2,67× 10-2 s-1 e de 0,13 mM-1s-1,

respectivamente para a Hb A utilizando como substrato OPDA, ao passo que com Hb bovina, Gao et al. (2005), obtiveram kcat = 0,36 s-1 e kcat/Km = 1,71 mM-1s-1. À semelhança da Mb c, os trabalhos descritos na literatura sobre a Hb A utilizam substratos diferentes do usado no decorrer deste trabalho, assim como foram utilizadas diferentes concentrações de H2O2, dificultando a sua análise comparativa. Tabela 3.3 – Parâmetros cinéticos da actividade de peroxidase da Hb A em meio aquoso, através das representações gráficas de Michaelis-Menten e Lineweaver-Burk.

LINEWEAVER-BURK

pH 4,5 5,5 6,5 7,5 8,1 9,0


Km (mM) 1,14×10-1 ± 1,25×10-2 5,13×10-2 ± 6,67×10-3 1,09 ± 1,37×10-1 1,40×10-2 ± 1,45×10-3 8,63×10-2 ± 6,79×10-3 2,23×10-2 ± 8,07×10-3

kcat (s-1) 3,07×10-1 ± 3,29×10-2 6,50×10-1 ± 2,09×10-2 1,23 ± 1,40×10-1 2,67×10-1 ± 1,17×10-2 4,99×10-1 ± 2,80×10-2 3,41×10-1± 2,90×10-2

Vmáx (U.mg proteína-1) 2,85×10-1 ± 3,06×10-2 6,04×10-1± 1,94×10-3 1,14 ± 1,30 ×10-1 2,48×10-1± 1,09 ×10-2 4,63×10-1 ±2,61 ×10-2 3,17×10-1±2,70 ×10-2

kcat / Km (mM-1 s-1) 2,70 ± 2,16×10-1 12,7 ± 3,14×10-1 1,12 ± 1,02×10-1 19,0 ± 8,07×10-1 5,78 ± 4,12×10-1 15,3 ± 3,59×10-1

MICHAELIS-MENTEN

pH 4,5 5,5 6,5 7,5 8,1 9,0


Km (mM) 1,76×10-1 ± 2,65×10-3 9,36×10-2 ± 2,91×10-3 7,27×10-1 ± 2,32×10-2 1,36×10-2 ± 2,53×10-3 5,96×10-2 ± 1,54×10-2 2,24×10-2 ± 4,36×10-3

kcat (s-1) 4,43×10-1 ± 6,53×10-3 8,59×10-1 ± 1,12×10-1 1,37 ± 2,19×10-1 2,58×10-1 ± 1,07×10-2 4,27×10-1 ± 3,59×10-2 3,53×10-1 ± 1,71×10-2

Vmáx (U.mg proteína-1) 4,12×10-1 ± 6,07×10-2 7,99×10-1 ± 1,04×10-1 1,20 ± 3,90×10-1 2,40×10-1 ± 9,96×10-3 3,97×10-1 ± 3,34×10-2 3,28×10-1 ± 1,59×10-2

kcat / Km (mM-1 s-1) 2,52 ± 2,46×10-3 9,17 ± 3,84×10-2 1,49 ± 1,21×10-1 18,9 ± 4,23×10-3 7,16 ± 2,33×10-2 15,8 ± 3,92 ×10-1

Os valores apresentados nas Tabelas 3.2 e 3.3 estão também representados nas Figuras 3.27, 3.28, 3.29 e 3.30, para a Mb c, e nas Figuras 3.31, 3.32, 3.33 e 3.34 para a Hb A.

3.2.4.2 Em Meio Orgânico À semelhança das reacções catalisadas em meio aquoso, foram determinados os parâmetros cinéticos aparentes para as reacções catalisadas em meio orgânico, na presença das hemeproteínas. Estas determinações foram realizadas para a Mb c e a Hb A, de acordo com o pHini da solução aquosa da qual a proteína foi extraída.


78

As representações gráficas para a determinação de V’max e K’m estão apresentadas na Figura 3.25, para a Mb c a pHini 5,5.

Figura 3.25 – Representações gráficas: de Michaelis-Menten (A) e de Lineweaver-Burk (B) para a Mb c pHini 5,5, extraída com C6 em CHCl3, utilizando seringaldazina como substrato, de acordo com os Materiais e Métodos. Os valores dos parâmetros cinéticos aparentes da oxidação da Syr em CHCl3, com o complexo Mb c - C6 foram determinados apenas para valores de pHini entre 4,5 e 7,5 (Tabela 3.4), devido à baixa actividade catalítica apresentada pela Mb c extraída com C6 a pHini 8,1 e 9,0. Para um pHini de 6,5 foram obtidos parâmetros cinéticos aparentes V’máx, K’m, k’cat e k’cat/K’m de 5,33 × 10-2 U. mg proteína-1, 4,55 × 10-2 mM , 1,51 × 10-2 s-1 e 3,31 × 10-1 mM-1 s-1, respectivamente (Tabela 3.4). Bindhu e Abraham (2003) determinaram valores de V’máx entre 41,67 e 100 U. mg proteína-1 para a peroxidase de rábano silvestre (HRP) em tolueno e dioxano, para a oxidação de OPD e guaiacol na presença de H2O2 0,5 mM e 4 mM. Como seria de esperar, verifica-se que estes valores são mais elevados por um factor de cerca de 100 em relação à Mb c. No entanto, os valores de K’m obtidos por estes autores são mais elevados, variando entre 1,11 e 8,33 mM. Os valores de k’cat em tolueno e dioxano são bastante mais elevados, variando entre 200 e 480 s-1, reflectindo os valores de k’cat/K’m superiores em relação aos obtidos neste trabalho.

BA


0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

Act

ivid

ade

de P

erox

idas

e da

Mb

c x

10-4

(U. m

g pr

oteí

na-1

)

0

1

2

3

4

5

6


-5 0 5 10 15 20 25 30 35(A

ctiv

idad

e de

Per

oxid

ase

da M

b c)

-1 (U

.mg

prot

eína

-1) -1

10000

20000

30000

40000

50000


79

Tabela 3.4 – Parâmetros cinéticos da actividade de peroxidase da Mb c em meio não aquoso, através das representações gráficas de Michaelis-Menten e Lineweaver-Burk.

LINEWEAVER-BURK

pH 4,5 5,5 6,5 7,5


K’m (mM) 4,91×10-1 ± 1,82×10-2 6,40×10-1 ± 1,01×10-1 6,54×10-2 ± 5,18×10-3 5,85×10-2 ± 5,07×10-3

k’cat (s-1) 7,17×10-3 ± 2,64×10-5 1,60×10-2 ± 1,74×10-3 1,59×10-2 ± 6,41×10-4 6,64×10-3 ± 2,87×10-5

V’máx (U.mg proteína-1) 2,54×10-2 ± 9,33×10-5 5,65×10-2 ± 6,17×10-3 5,64×10-2 ±2,27 ×10-3 2,35×10-2 ±1,01 ×10-3

k’cat / K’m (mM-1 s-1) 1,46×10-2 ± 1,45×10-3 2,49×10-2 ± 1,74×10-3 2,43×10-1 ± 1,11×10-3 1,13×10-1 ± 5,67×10-3

MICHAELIS-MENTEN

pH 4,5 5,5 6,5 7,5


K’m (mM) 3,83×10-1 ± 1,12×10-2 6,35×10-1 ± 1,56×10-2 4,55×10-2 ±2,09×10-3 5,41×10-2 ± 3,23×10-3

k’cat (s-1) 7,00×10-3 ± 1,03×10-3 1,59×10-2 ± 2,45×10-3 1,51×10-2 ± 1,14×10-3 6,40×10-3 ± 6,68×10-4

V’máx (U.mg proteína-1) 2,48×10-2 ± 3,66×10-3 5,64×10-2 ± 8,66×10-3 5,33×10-2 ± 4,03×10-3 2,26×10-2 ± 2,36×10-3

k’cat / K’m (mM-1 s-1) 1,83×10-2 ± 9,19×10-3 2,51×10-2 ± 2,50×10-3 3,31×10-1 ± 5,45×10-3 1,18×10-1 ± 2,07×10-3

Na Figura 3.26, estão demonstradas as representações gráficas Michaelis-Menten e de Lineweaver-Burk referentes à Hb A pHini 6,5.

Figura 3.26 – Representações gráficas: de Michaelis-Menten (A) e de Lineweaver-Burk (B) para a Hb A pHini 6,5, extraída com C6 em CHCl3, utilizando seringaldazina como substrato, de acordo com os Materiais e Métodos. Tal como para a Mb c, os valores dos parâmetros cinéticos para a pseudoactividade de peroxidase da Hb A extraída com C6 em CHCl3, usando como substrato Syr foram determinados para pHini entre 4,5 e 7,5 (Tabela 3.5). De um modo geral, os valores obtidos para as duas representações são concordantes.


0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

Act

ivid

ade

de P

erox

idas

e da

Hb

A x

10-3

(U. m

g pr

oteí

na -1

)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4


-5 0 5 10 15 20 25 30 35

(Act

ivid

ade

de P

erox

idas

e da

Hb

A) -1

(U.m

g pr

oteí

na-1

) -1

2000

4000

6000

8000

10000

12000

BA


80

Analisando a Tabela 3.5, verifica-se que os valores de V’máx e de k’cat determinados pela representação de Michaelis-Menten, são mais elevados para pHini 4,5 e 7,5. Em contrapartida, os valores mais elevados de K’m são para pHini 5,5 e 6,5. O k’cat/K’m apresenta um máximo a pH 7,5. Wang et al. (2004) determinaram valores de V’máx de 6,89 x 10-3 U. mg proteína-1, 4,82 x 10-2 U. mg proteína-1 e 0,496 U. mg proteína-1, para a Hb A em dioxano, acetonitrilo e tolueno, respectivamente, para a oxidação de OPD na presença de H2O2 25 mM. Como se pode observar, estes valores aumentam consoante o aumento da hidrofobicidade do solvente (Log P = - 1,1 para o dioxano; Log P = - 0,33 para o acetonitrilo; Log P = 2,5 para o tolueno). A análise comparativa dos resultados obtidos neste trabalho revela que os valores da bibliografia referentes ao tolueno e ao acetonitrilo estão na mesma gama de valores obtidos neste trabalho, apesar da utilização do CHCl3 (Log P = 2,0). Estes autores apenas apresentaram valores de K’m e de k’cat/K’m de 2,85 mM e de 0,03 mM-1 s-1, respectivamente referentes à Hb em tolueno. Quanto aos valores de k’cat, os mesmos autores obtiveram 0,24 s-1, 0,02 s-1 e 0,01 s-1, em tolueno, em acetonitrilo em dioxano, respectivamente. Assim, podemos verificar que o valor de K’m descrito na literatura (Wang et al., 2004) é bastante mais elevado em relação ao valor obtido neste trabalho e por conseguinte o correspondente k’cat/K’m é menor. No entanto, os valores de k’cat em tolueno e em acetonitrilo descritos na literatura são da mesma ordem de grandeza em relação aos obtidos neste estudo. Tabela 3.5 – Parâmetros cinéticos da actividade de peroxidase da Hb A em meio não aquoso, através das representações gráficas de Michaelis-Menten e Lineweaver-Burk.

LINEWEAVER-BURK

pH 4,5 5,5 6,5 7,5


K’m (mM) 3,91×10-2 ± 5,25×10-3 8,51×10-1 ± 4,07×10-2 1,521 ± 1,99×10-1 6,68×10-2 ± 9,75×10-3

k’cat (s-1) 7,06×10-3 ± 1,56×10-5 3,37×10-2 ± 4,26×10-4 1,56×10-1 ± 1,23×10-3 5,03×10-2 ± 1,91×10-4

V’máx (U.mg proteína-1) 6,57×10-3 ± 1,45×10-4 5,65×10-2 ± 6,17×10-3 1,45×10-1 ±1,14 ×10-2 4,68×10-2 ±1,78 ×10-3

k’cat / K’m (mM-1 s-1) 1,81×10-1 ± 2,97×10-3 3,96×10-2 ± 1,06×10-3 1,29×10-1 ± 3,08×10-3 7,53×10-1 ± 1,96×10-4

MICHAELIS-MENTEN

pH 4,5 5,5 6,5 7,5


K’m (mM) 4,41×10-2 ± 5,51×10-3 9,00×10-1 ± 2,91×10-2 9,06×10-1 ±1,62×10-1 9,25×10-2 ± 1,38×10-2

k’cat (s-1) 7,11×10-3 ± 1,76×10-4 1,52×10-1 ± 1,12×10-3 1,09×10-1 ± 7,26×10-4 5,50×10-2 ± 1,85×10-4

V’máx (U.mg proteína-1) 6,61×10-3 ± 1,64×10-3 1,42×10-1 ± 1,04×10-2 1,01×10-1 ± 6,76×10-2 5,12×10-2 ± 1,72×10-3

k’cat / K’m (mM-1 s-1) 1,61×10-1 ± 1,36×10-2 1,69×10-1 ± 3,85×10-2 1,20×10-1 ± 4,48×10-2 5,95×10-1 ± 1,34×10-2


81

Nas figuras apresentadas em seguida (Figuras 3.27 a 3.34), estão representados os valores dos parâmetros cinéticos aparentes para as duas proteínas em função do pH, no sentido de comparar os resultados obtidos na fase aquosa com os da fase orgânica. Figura 3.27 – Variação da Velocidade máxima (Vmax) da Mb c em função do pH, em meio aquoso e em meio orgânico, calculada através das representações gráficas: de Michaelis-Menten (A) e de Lineweaver-Burk (B), utilizando seringaldazina como substrato, de acordo com os Materiais e Métodos.

Figura 3.28 – Variação da constante de Michaelis (Km) da Mb c em função do pH, em meio aquoso e em meio orgânico, calculada através das representações gráficas: de Michaelis-Menten (A) e de Lineweaver-Burk (B), utilizando seringaldazina como substrato, de acordo com os Materiais e Métodos.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,1 9,0pH

Vm

áx x

10-1

(U. m

g pr

oteí

na-1

)

Fase Aquosa-Mb Fase Orgânica-MbB

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,1 9,0pH

V máx

x 1

0-1 (U

. mg

prot

eína

-1)

Fase Aquosa-Mb Fase Orgânica-MbA

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,1 9,0pH

K m (

mM

)


0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,1 9,0pH

Km

(m

M)



82

Figura 3.29 – Variação da constante catalítica (kcat) da Mb c em função do pH, em meio aquoso e em meio orgânico, calculada através das representações gráficas: de Michaelis-Menten (A) e de Lineweaver-Burk (B), utilizando seringaldazina como substrato, de acordo com os Materiais e Métodos. Figura 3.30 – Variação da eficiência catalítica (kcat/Km) da Mb c em função do pH, em meio aquoso e em meio orgânico, calculada através das representações gráficas: de Michaelis-Menten (A) e de Lineweaver-Burk (B), utilizando seringaldazina como substrato, de acordo com os Materiais e Métodos. Segundo Zaks e Klibanov (1985), as enzimas possuem a capacidade de memorizar, em meio orgânico, o estado electrólito correspondente ao pH da última solução aquosa com a qual a enzima teve contacto. Assim, de uma maneira geral a variação da actividade catalítica em meio orgânico coincide com a actividade detectada em meio aquoso. Contudo, no caso da Mb c, não se verificou a mesma variação em ambos os doseamentos. Através das representações gráficas, é possível verificar que os valores dos parâmetros cinéticos determinados em meio aquoso são mais elevados por um factor de 3 a 4 e de 6 para a Mb c – C6 e Hb A – C6, respectivamente em relação aos valores determinados em meio orgânico, com excepção dos valores de K’m.

Efectivamente, este parâmetro cinético aparente apresenta valores elevados por um

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,1 9,0pH

k cat

x 1

0-1 (s

-1)


0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,1 9,0pH

k cat

x 1

0-1 (s

-1)


0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,1 9,0

pH

k cat

/ K m

(m

M-1

s-1

)


0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,1 9,0

pH

k cat

/ K m

(m

M-1

s-1

)



83

factor de 6 e de 10 em meio orgânico, para a Mb c e Hb A, respectivamente em comparação com o meio aquoso. Contudo, esta diferença nos parâmetros catalíticos determinados em ambos os meios é mais acentuada para a Hb A do que para a Mb c. A obtenção de altos valores de K’m quer para a Mb c quer para a Hb A em meio orgânico em comparação com o meio aquoso, está de acordo com os resultados obtidos por Wang et al. (2004), para a oxidação de OPD pela Hb A, em tolueno, acetonitrilo e dioxano. Ryu e Dordick (1992) constataram que a presença de solventes orgânicos afecta a estrutura e a função da HRP. Segundo estes autores, a presença dos solventes mais polares não provoca a desnaturação completa da enzima e a actividade catalítica mensurável da enzima em meios quase anidros pode ser atribuída ao elevado grau de integridade da estrutura nativa do centro activo da enzima. Estes autores utilizaram compostos fenólicos como substratos no estudo da biocatálise da HRP, em acetonitrilo, tolueno e dioxano, sugerindo que a partição do substrato no centro activo da enzima, em meios não aquosos, envolve apenas interacções hidrofóbas. Estabeleceram ainda, que a perda de actividade enzimática da HRP em meios orgânicos, pode ser devida à combinação de vários factores, dos quais se podem destacar: (I) a estabilização do “ground state” das moléculas dos compostos fenólicos no meio orgânico comparado com o meio aquoso. Esta estabilização manifesta-se nos elevados valores de Km dos substratos em meios não polares; (II) a penetração do solvente orgânico no centro activo da enzima, diminuindo a polaridade local e fortalecendo as ligações de hidrogénio do substrato à enzima; (III) alterações globais da estrutura terciária da proteína que provoca a alteração da estrutura do centro activo da enzima e (IV) alteração da termodinâmica de reacção em meios orgânicos comparada com meios aquosos. Da mesma forma, Torres et al. (1996) consideraram que as propriedades do substrato são também um factor determinante na biocatálise em meios orgânicos, ao estudarem a pseudoactividade de peroxidase do Cyt c em THF. Segundo estes autores, este facto é devido à partição do substrato entre o heme e o solvente. Assim, os factores descritos podem de certa forma justificar os resultados obtidos para a Mb c e para a Hb A, extraídas com C6 em CHCl3. Rodakiewicz-Nowak (2000) confirmou que as velocidades das reacções de oxidação catalítica de substratos fenólicos em meios não convencionais são inferiores em relação aos ensaios efectuados em meio aquoso. A presença dos solventes orgânicos nestas reacções, pode afectar as etapas individuais destas complexas reacções catalíticas. A cinética das reacções enzimáticas nos vários meios


84

orgânicos, baseia-se predominantemente no facto de as constantes de ligação do substrato dependerem da sua solubilidade, partição e transporte da enzima no meio orgânico seleccionado. No entanto, a imobilização das enzimas/proteínas permite ultrapassar este obstáculo na medida em que é possível aumentar a actividade enzimática em meio orgânico, designadamente em estudos efectuados em CHCl3 com Mb, Hb e HRP (Ryu et al., 2002, Wang et al., 2004, Bindhu e Abraham, 2003 e Zhang et al., 2006).

Figura 3.31 – Variação da Velocidade máxima (Vmax) da Hb A em função do pH, em meio aquoso e em meio orgânico, calculada através das representações gráficas: de Michaelis-Menten (A) e de Lineweaver-Burk (B), utilizando seringaldazina como substrato, de acordo com os Materiais e Métodos.

Figura 3.32 – Variação da constante de Michaelis (Km) da Hb A em função do pH, em meio aquoso e em meio orgânico, calculada através das representações gráficas: de Michaelis-Menten (A) e de Lineweaver-Burk (B), utilizando seringaldazina como substrato, de acordo com os Materiais e Métodos.

0

2

4

6

8

10

12

14

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,1 9,0pH

Vm

áx x

10-1

(U. m

g pr

oteí

na-1

)

Fase Aquosa-Hb Fase Orgânica-HbA

0

2

4

6

8

10

12

14

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,1 9,0pH

Vm

áx x

10-1

(U. m

g pr

oteí

na-1

)

Fase Aquosa-Hb Fase Orgânica-HbB

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,1 9,0pH

K m (

mM

)

Fase Aquosa-Hb Fase Orgânica - HbA

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,1 9,0pH

K m

(mM

)

Fase Aquosa-Hb Fase Orgânica - HbB


85

Figura 3.33 – Variação da constante catalítica (kcat) da Hb A em função do pH, em meio aquoso e em meio orgânico, calculada através das representações gráficas: de Michaelis-Menten (A) e de Lineweaver-Burk (B), utilizando seringaldazina como substrato, de acordo com os Materiais e Métodos.

Figura 3.34 – Variação da eficiência catalítica (kcat/Km) da Hb A em função do pH, em meio aquoso e em meio orgânico, calculada através das representações gráficas: de Michaelis-Menten (A) e de Lineweaver-Burk (B), utilizando seringaldazina como substrato, de acordo com os Materiais e Métodos. A comparação dos resultados obtidos em meio aquoso neste trabalho com os da peroxidase de raízes de milho que utilizaram a Syr como substrato (Km = 5,6 x 10-2 mM, Grinson e Pilet, 1985), permite verificar que estes valores são mais elevados para a Hb A encontrando-se na mesma ordem de grandeza para a Mb c. A mesma situação se verifica quando comparamos estes valores com os das isoenzimas da peroxidase das raízes do tomate, onde os valores de Km variam na gama de 0,8 x 10-2 a 4,6 x 10-2 mM (Quiroga et al., 2000). Quanto aos valores de kcat e kcat/Km para as referidas peroxidases, os mesmos são mais elevados por um factor de cerca de 10 e de 100 em relação à Hb A e Mb c, respectivamente.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,1 9,0pH

k cat

x 1

0-1 (s

-1)


0

2

4

6

8

10

12

14

16

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,1 9,0pH

k cat

x 1

0-1 (s

-1)


0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,1 9,0

pH

k cat

/ K m

(m

M-1

s-1

)


0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,1 9,0

pH

k cat

/ K m

(m

M-1

s-1

)



86

Hiner et al. (1996) estudaram 9 tipos de HRP de origem comercial e obtiveram valores de kcat bastante elevados, usando ABTS e guaiacol, que variaram na gama de 756 – 1070 s-1 e 63 – 191 s-1, respectivamente. A diferença nos valores dos parâmetros cinéticos aparentes entre a Mb e a peroxidase convencional é habitualmente atribuída às diferenças estruturais existentes entre a “bolsa” do heme da Mb e da peroxidase. A maior parte das peroxidases convencionais possuem resíduos aminoacídicos com carga na “bolsa” do heme que favorecem as reacções desencadeadas no ciclo da peroxidase. Pelo contrário, a Mb não possui resíduos aminoacídicos carregados na “bolsa” do heme, e através da substituição de aminoácidos com cadeia carregadas por mutagénese dirigida na “bolsa” do heme observa-se um aumento significativo da sua pseudoactividade de peroxidase (Carlsen et al., 2005). Outra razão apontada para a menor actividade da Mb e da Hb em relação à peroxidase convencional, reside no facto destas poteínas não possuírem ligação específica do substrato (Hayashi et al., 1999).


87

3.3 DETERMINAÇÃO DO TEMPO DE MEIA VIDA A estabilidade da Mb c e da Hb A ligadas ao C6 e solubilizadas em CHCl3, foi determinada de acordo com o descrito em 2.2.6. O decréscimo da pseudoactividade enzimática de peroxidase em função do tempo encontra-se representada nas Figuras 3.35 e 3.36.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8

t (dias)

Act

ivid

ade

Res

idua

l (%

)

Mb c pH 6,5 Mb c pH 5,5

Figura 3.35 – Estabilidade da Mb c a pHini 6,5 (2,08 x 10-6 U.mg proteína-1) e 5,5 (1,75 x 10-6 U.mg proteína-1) ligada ao C6 e solubilizada em CHCl3, em função do tempo.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8

t (dias)

Activ

idad

e R

esid

ual (

%)

Hb A pH 6,5 Hb A pH 5,5

Figura 3.36 – Estabilidade da Hb A a pHini 6,5 (6,86 x 10-7 U.mg proteína-1) e a 5,5 (4,34 x 10-7 U.mg proteína-1) ligada ao C6 e solubilizada em CHCl3, em função do tempo.


88

Utilizando o modelo de desactivação de primeira ordem foram determinados os tempos de meia vida (t1/2), que correspondente ao tempo necessário para se observar 50% de decaimento da pseudoactividade de peroxidase das proteínas (Tabela 3.6). Tabela 3.6 – t1/2 para a Mb c e para a Hb A, ligadas ao C6 e solubilizadas em CHCl3 e conservadas a 4ºC.

PROTEÍNA LIGADA AO C6 pHini t 1/2

(DIAS)

6,5 2,64 Hb A

5,5 1,96

6,5 5,24 Mb c

5,5 3,55

Com base nos resultados apresentados na Tabela 3.6, observam-se elevados valores de t1/2 para ambas as proteínas a altos valores de pH. Por outro lado, a pseudoactividade da Mb c apresenta valores de t1/2 mais elevados em relação à Hb A. A análise dos valores de t1/2 apresentados na Tabela 3.6 na gama de 2 - 5 dias, permite concluir que é possível efectuar estudos cinéticos de biocatálise em solventes orgânicos destas proteínas com C6 num dia sem afectar significativamente a pseudoactividade destas proteínas. Contudo, não é possível comparar estes resultados com os da literatura na medida em que os trabalhos publicados, sobre os complexos proteína–C6 não mencionam valores de t1/2 (Oshima et al., 2002 e 2005). A estabilidade da Mb c e da Hb A em solução aquosa, foi também determinada de acordo com o descrito em 2.2.6. Surpreendentemente verificou-se que ambas as proteínas apresentam uma elevada estabilidade em TF e em tampão citratos 50 mM pH 5,5, observando-se inclusive um aumento da pseudoactividade de peroxidase das duas proteínas ao longo do tempo, conservadas a 4º C (Figuras 3. 37 e 3.38). A Hb A em tampão citratos 50 mM pH 5,5, no entanto, ao fim de 16 dias apresenta um decréscimo de cerca de 50 % da sua actividade. Este comportamento surpreendente da biocatálise de ambas as proteínas em meio aquoso poderá ser explicado com base na alteração de conformação das proteínas nas soluções tampão apropriados ao longo do tempo com aumentos de pseudoactividade de peroxidase na gama de 100 a 200%. É importante referir que ambas as proteínas foram adquiridas na forma liofilizada e provavelmente ocorreu uma activação no meio aquoso em função do tempo devido à alteração de conformação das proteínas durante o processo de liofilização. Existem vários artigos na literatura que demonstram que o processo de liofilização de proteínas é responsável pela perda significativa de actividade


89

enzimática bem como pela alteração da sua estrutura secundária de proteínas. A sua liofilização não é um processo isento de provocar alterações de conformação (Roy e Gupta, 2004).

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

t (dias)

Act

ivid

ade

Res

idua

l (%

)Mb c pH 6,5 Mb c pH 5,5

Figura 3.37 – Estabilidade da Mb c a pH 6,5 (3,13 x 10-6 U.mg proteína-1) e 5,5 (3,28 x 10-6 U.mg proteína-1), em função do tempo.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

t (dias)

Act

ivid

ade

Res

idua

l (%

)

Hb A pH 6,5 Hb A pH 5,5

Figura 3.38 – Estabilidade da Hb A a pH 6,5 (4,79 x 10-5 U.mg proteína-1) e 5,5 (5,02 x 10-5 U.mg proteína-1), em função do tempo.


90

3.4 RECUPERAÇÃO DA Mb C E DA Hb A PARA UMA SOLUÇÃO AQUOSA FRESCA Após o processo de extracção das proteínas usando C6 3mM solubilizado em CHCl3, o passo seguinte consistiu na sua recuperação para soluções aquosas frescas. Esta recuperação foi testada quer para a Mb c quer para a Hb A, solubilizadas em solução aquosa a pHini de 6,5. Após a extracção com C6, os complexos proteína-calixareno, foram tratados com soluções aquosas cujo pH variou de 3,5 a 14,0 (vide 2.2.4.1), podendo deste modo determinar-se o parâmetro de recuperação (E’) (Figura 3.39).

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,1 9,0 9,5 10,0 10,5 11,0 13,0 14,0

pHrecuperação

E' (

-)

Mb Hb

Figura 3.39 – Pârametros de recuperação (E’) das proteínas (Mb c e Hb A) para solução aquosa em função do pH. Como se pode verificar através da figura anterior, a recuperação das duas proteínas ocorre quando as mesmas são tratadas com soluções aquosas a pH alcalino. O valor mais elevado de E’ foi obtido com solução aquosa a pH 9,5, para ambas as proteínas. No entanto, a análise comparativa permite-nos observar-se que este E’ é mais elevado para a Mb c com soluções aquosas de pH mais elevado. Embora a Hb A também apresente recuperação na solução aquosa fresca, os valores de E’ são mais baixos nomeadamente com soluções aquosas ácidas. A pseudoactividade de peroxidase da Mb c e da Hb A foi doseada em fase orgânica após a extracção, em fase aquosa antes da extracção e em fase aquosa após a recuperação em solução aquosa fresca.


91

A recuperação em termos da pseudoactividade de peroxidase encontra-se representada na Figura 3.40, para as soluções cujos valores de pH não foram neutralizados (sem acerto de pH), e na Figura 3.41 para as soluções cujo pH foi neutralizado (com acerto de pH).

0

50

100

150

200

250

300

350

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,1 9,0 9,5 10,0 10,5 11,0 13,0 14,0

pHrecuperação

Rec

uper

ação

da

Act

ivid

ae d

e Pe

roxi

dase

(%)

Mb Hb

Figura 3.40 – Recuperação da pseudoactividade de peroxidase para uma solução aquosa fresca da Mb c e da Hb A (sem acerto de pH).

0

50

100

150

200

250

300

350

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,1 9,0 9,5 10,0 10,5 11,0 13,0

pHrecuperação

Rec

uper

ação

da

Act

ivid

ae d

e Pe

roxi

dase

(%)

Mb Hb

Figura 3.41 – Recuperação da pseudoactividade de peroxidase para uma solução aquosa fresca da Mb c e da Hb A (com acerto de pH). A recuperação da pseudoactividade de peroxidase para uma solução aquosa fresca apresentou valores bastante elevados, destacando-se os da Mb c a pH de recuperação de 10,5 e 11,0, atingindo valores da ordem de 300% para as soluções cujo pH não foi neutralizado posteriormente. Estas recuperações acima de 100% da pseudoactividade destas proteínas podem ser atribuídas às alterações estruturais e


92

conformacionais que as proteínas em estudo sofreram, no decorrer dos processos de recuperação para soluções aquosas frescas. Contudo, a recuperação da pseudoactividade de peroxidase da Hb A para uma solução aquosa fresca apresentou valores mais baixos da ordem de 150% do que em relação à Mb c devido a diferenças estruturais de ambas as proteínas designadamente a forma tetramérica da Hb A. Os trabalhos publicados na literatura (Oshima et al. 2002 e 2005) descrevem a recuperação do Cyt c extraído com tOct[6]CH2COOH em CHCl3, para uma nova solução aquosa ácida (pH < 2), contendo etanol, metanol e petan-1-ol. Contudo, estudos mais recentes (Shimojo et al. 2007) demonstraram que a utilização de um solvente orgânico polar (butan-1-ol; Log P =0,88) na fase aquosa provoca a redução na interacção entre a o tOct[6]CH2COOH e o Cyt c de forma a promover uma maior recuperação da proteína, da fase orgânica para a fase aquosa fresca. Estes investigadores obtiveram uma recuperação significativa com soluções aquosas ácidas (pH <2,5) contendo 30% (v/v%) de butan-1-ol. Estes autores também estudaram os efeitos provocados pelo processo de recuperação na estrutura terciária e na pseudoactividade de peroxidase do Cyt c, verificando que a sua estrutura terciária se encontrava desnaturada após a recuperação para a nova solução aquosa, devido à acidez e à presença do álcool na solução. Contudo, esta desnaturação era reversível na medida em que a neutralização da solução proteica permitiu a recuperação da pseudoactividade de peroxidase de cerca de 67% (Oshima et al.2005). Esta perda de actividade de cerca de 1/3 após a neutralização da nova solução aquosa foi atribuída à presença do álcool na referida solução proteica.


93

3.5 EXTRACÇÃO E PURIFICAÇÃO DE Hb A COM CALIXARENOS, A PARTIR DE SANGUE HUMANO

3.5.1 Extracção da Hb A com o Ácido Carboxílico Derivado de p-tert-butilcalix[6]areno

De forma a testar a ligação específica do C6 a determinadas proteínas, em particular à Hb A, numa mistura proteica, foram efectuadas extracções da Hb A a partir de amostras de sangue humano lisado a pH 5,8 e 6,5, com C6 3mM em CHCl3, como foi descrito em 2.2.6.2. Neste processo foram determinados os parâmetros de extracção e a actividade enzimática de peroxidase da Hb A no sangue lisado (fase aquosa inicial) antes da extracção e ligada ao C6 (fase orgânica) após a extracção (Tabela 3.7). Tabela 3.7 – Parâmetro de extracção (E) e Actividade de peroxidase da Hb A, em amostras de sangue lisado e ligada ao C6 solubilizada em CHCl3, em função do pHini.

pHini E

PSEUDOACTIVIDADE DE PEROXIDASE DA

FASE AQUOSA INICIAL (U)

PSEUDOACTIVIDADE DE PEROXIDASE DA FASE ORGÂNICA

(U)

6,5 0,54 2,5 x 10-1 2,6 x 10-2

5,8 0,13 5,5 x 10-1 5,6 x 10-3

A extracção da Hb A de sangue lisado para a fase orgânica apresenta um baixo rendimento de actividade em relação à actividade da fase aquosa inicial. Este resultado é devido à saturação do C6 com a utilização de uma elevada quantidade de proteína do sangue. Contudo estes resultados permitem concluir que este sistema é útil na extracção de proteínas a partir de uma mistura de proteínas.

3.5.2 Purificação da Hb A com Polímero contendo Unidades de Calix[6]areno

A Hb A foi purificada a partir de uma amostra de sangue num só passo cromatográfico, numa coluna (1 x 5cm) contendo a matriz cromatográfica PC6. Numa primeira tentativa, e uma vez que não existe nenhuma referência à utilização desta matriz cromatográfica na purificação de proteínas, foi aplicada uma amostra de sangue (diluição 1:10 em TF) de modo a verificar a adsorção da Hb A à coluna. Neste processo, verificou-se uma perda de pseudoactividade de peroxidase da Hb A


94

na etapa de lavagem com TF (fracções Nº1 a 3), sugerindo que esta proteína apresentou adsorção parcial à coluna (Figura 3.42). Este resultado pode ser devido à saturação da matriz cromatográfica com uma elevada quantidade da amostra de sangue lisado. A desadsorção da Hb A da coluna foi efectuada com uma solução de Na2CO3 0,1 M a pH 11 e as fracções foram recolhidas em microtubos contendo 1 volume da solução tampão citratos 50mM pH 3,5 (1:1), de modo a obter um pH neutro da solução final das fracções cromatográficas. Assim, obteve-se um factor de purificação de 33, para uma actividade específica da Hb A de 6 x 10-2 U. mg proteína-1 e um rendimento de pseudoactividade de peroxidase de cerca de 38% (Tabela 3.8). Figura 3.42 – Perfil cromatográfico do sangue lisado em coluna contendo PC6 de acordo com os Materiais e Métodos.

Tabela 3.8 – Tabela de purificação da Hb A de sangue humano.

PROTEÍNA

TOTAL (mg)

ACTIVIDADE TOTAL

(U)

ACTIVIDADE ESPECIFICA

(U/mg proteína)

RECUPERAÇÃO (%)

FACTOR DE PURIFICAÇÃO

1. Sangue Lisado 16,45 3,00 × 10-2 1,82 × 10-3 100 1

2. Eluído da Coluna 0,19 1,14 × 10-2 6,00 × 10-2 38 33

Posteriormente, foi efectuado outro processo de purificação aumentando o volume de resina PC6 (4mL), com o objectivo de minimizar as perdas da pseudoactividade

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

0 5 10 15 20 25

Fracção Nº (1.5mL)

A28

0

0

2

4

6

8

10

12

14

Act

ivid

ade

de P

erox

idas

e x

10-3

(U/F

racç

ão)

Desadsorção da Hb A com Na2CO3 0,1M


95

de peroxidase da Hb A na etapa de lavagem tentando adsorver a máxima quantidade de Hb A na coluna. Esta alteração da coluna, não foi eficaz uma vez que as perdas de actividade na etapa de lavagem não foram minimizadas (Figura 3.41) e o factor de purificação diminuiu para 12, assim como a actividade específica para 3,03 x 10-2 U. mg proteína-1 (Tabela 3.9).

Figura 3.43 – Perfil cromatográfico do sangue lisado em coluna contendo PC6 de acordo com os Materiais e Métodos.

Tabela 3.9 – Tabela de purificação da Hb A de sangue humano.

PROTEÍNA

TOTAL (mg)

ACTIVIDADE TOTAL

(U)

ACTIVIDADE ESPECIFICA

(U/mg proteína) RECUPERAÇÃO

(%) FACTOR DE

PURIFICAÇÃO

1. Sangue Lisado 14,67 3,69 × 10-2 2,51 × 10-3 100 1

2. Eluído da Coluna 0,42 1,27 × 10-2 3,02 × 10-2 34,42 12

O factor de purificação obtido neste trabalho é aparentemente muito elevado tendo em consideração que a Hb A representa cerca de 75% da proteína total do sangue humano (Karmali, 1983 e Stryer, 1988). No entanto, esta discrepância pode ser explicada pelo facto do factor de purificação ter sido calculado em função da pseudoactividade da peroxidase da Hb A e não em função da concentração da Hb A, de acordo com a maioria dos trabalhos publicados na literatura sobre a Hb A. Efectivamente, a pesudoactividade da peroxidase do sangue lisado poderá ter sofrido uma inibição pelos metabolitos presentes nos eritrócitos e/ou Hb A apresentar uma alteração de conformação no sangue lisado com baixa actividade de peroxidase. Assim, a actividade específica da peroxidase da Hb A do sangue lisado

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

0 4 8 12 16 20 24 28 32

Fracção Nº (1.5mL)

A 280

0

2

4

6

8

10

12

Act

ivid

ade

de P

erox

idas

e x

10-3

(U/F

racç

ão)

Desadsorção da Hb A com Na2CO3 0,1M


96

apresentou um baixo valor resultando num elevado factor de purificação na tabela acima mencionada. Esta inibição da actividade de uma enzima/anticorpo monoclonal no sangue lisado/extracto celular microbiano/sobrenadante da cultura já foi observado por diversos autores (Karmali, 1983, Cruz, 1995 e Martins et al., 2007) Este elevado factor de purificação poderá ser devido aos factores a seguir mencionados: (I) à inibição da pesudoactividade da peroxidase do sangue lisado pelos metabolitos presentes nos eritrócitos; (II) à Hb A apresentar uma alteração de conformação no sangue lisado com baixa pseudoactividade de peroxidase; (III) à desadsorção da Hb A da matriz cromatográfica provocar uma alteração na sua conformação que apresenta uma maior pseudoactividade de peroxidase em relação ao sangue lisado. Com base nestas explicações, a actividade específica da peroxidase da Hb A do sangue lisado apresentou um baixo valor resultando num elevado factor de purificação na tabela acima mencionada. Esta inibição da actividade de uma enzima/anticorpo monoclonal no sangue lisado/extracto celular microbiano/sobrenadante da cultura já foi observada por diversos autores (Karmali, 1983, Cruz, 1995 e Martins et al., 2007). O aumento de pseudoactividade de peroxidase da Hb A recuperada numa solução aquosa fresca a pH 11.0 (vide 3.4) já foi referida obtendo-se recuperações da pseudoactividade de peroxidase superiores a 100%. Este aumento de pesudoactividade de peroxidase sugere aparentemente uma alteração da conformação da Hb A com elevada actividade enzimática

3.5.3 Análise Electroforética da Hb A Purificada O processo de purificação da Hb A foi analisado quer em SDS-PAGE quer em PAGE nativa. A Hb A purificada, com factor de purificação de 12, apresentou uma banda de proteína predominante em SDS-PAGE com um Mr de 16 kDa (Figura 3.42), correspondendo aparentemente à massa molecular de uma subunidade da Hb A. (Cheung et al., 1984) Contudo observam-se duas bandas de proteína de fraca intensidade, podendo corresponder a moléculas de Hb A que não sofreram desnaturação, uma vez que apresentam um Mr de 61,5 e 59,6 kDa.


97

Figura 3.44 – SDS-PAGE. A separação electroforética foi efectuada num gel de resolução contendo 12,5% (p/v) de acrilamida. Poços: 1 – Sangue lisado (14,7 µg); 2 – Fracções Nº 19 à 21 (1,7 µg). Na margem esquerda do gel, estão indicados os marcadores de massa molecular utilizados, de acordo com os Materiais e Métodos. A análise electroforética da preparação purificada de Hb A por PAGE nativa, revelou uma única banda de proteína com Mr de 61,64 kDa (Figura 3.43), correspondendo aparentemente à molécula nativa de Hb A. Esta banda de proteína foi detectada por actividade “in situ” com Syr na presença H2O2, conforme descrito em 2.2.6.3.1.

Figura 3.45 – PAGE nativa da Hb A purificada. A separação electroforética foi efectuada num gel de resolução contendo 7,5% (p/v) de acrilamida. (A) Corado pelo método de coloração com nitrato de prata; (B) Determinação da actividade enzimática no gel de poliacrilamida, com Syr 1mM em etanol e H2O2 0,8mM. Poços: 1 – Sangue lisado (3,7 µg); 2 – Fracções Nº 19 à 21 (1,4 µg); 3 - Fracções Nº 19 à 21 (1,67 µg); 4 - Sangue lisado (52,8 µg). Na margem esquerda dos géis, estão indicados os marcadores de massa molecular utilizados, de acordo com os Materiais e Métodos.

66 kDa

45 kDa

14,2 kDa 16 kDa

1 2⎯

+

29 kDa 24,5 kDa

1 2 3 4⎯

+ (B) (A)

132 kDa

45 kDa

196 kDa

66 kDa

14,2 kDa

61,64 kDa


98

Foi realizada outra análise electroforética em PAGE nativa de modo a detectar a actividade “in situ” através da utilização de o-dianisidina como substrato na presença de H2O2 (Figura 3.44). A preparação purificada de Hb A apresentou uma única banda de proteína com um valor de Mr de 58,09 kDa, coincidente com uma banda de actividade enzimática in situ.

Figura 3.46 – PAGE nativa da Hb A purificada. A separação electroforética foi efectuada num gel de resolução contendo 7,5% (p/v) de acrilamida. (A) Corado pelo método de coloração com nitrato de prata; (B) Determinação da actividade enzimática no gel de poliacrilamida, com o-dianisidina 17mM em etanol e H2O2 0,8mM. Poços: 1 – Sangue lisado (3,7 µg); 2 – Fracções Nº 19 à 21 (1,4 µg); 3 - Fracções Nº 19 à 21 (1,67 µg); 4 - Sangue lisado (52,8 µg). Na margem esquerda dos géis, estão indicados os marcadores de massa molecular utilizados, de acordo com os Materiais e Métodos. Estes resultados sugerem aparentemente que a Hb A apresenta um elevado grau de pureza, apesar da obtenção de um baixo rendimento de pseudoactividade de peroxidase. Contudo, não é possível comparar estes resultados da purificação desta proteína na coluna empacotada com PC6, porque não existem trabalhos publicados na literatura sobre este tipo de matriz cromatográfica.

132 kDa

45 kDa

196 kDa

66 kDa

14,2 kDa

⎯

+

1 2 3 4

58,09 kDa

(B) (A)

3.1 EXTRACÇÃO DA Mb Hb A CALIXARENOS EM S...

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