AVALIAÇÃO PULMONAR DE MODELOS EXPERIMENTAIS EXPOSTOS A RESÍDUOS PROVENIENTES DA NEBULIZAÇÃO DE HERBICIDAS AGRÍCOLAS

UTILIZADOS EM LAVOURAS DE CANA-DE-AÇÚCAR DO PONTAL DO PARANAPANEMA.

Pré-projeto de pesquisa submetido à seleção

do programa de Mestrado em Meio

Ambiente e Desenvolvimento Regional

(MMADRE) da Universidade do Oeste

Paulista.

Orientadora: Profa. Dra. Renata Calciolari Rossi e Silva

Presidente Prudente

2015

RESUMO

A economia do Pontal do Paranapanema é baseada na agropecuária, sendo que a

cana-de-açúcar ocupava em 2008, 18% do total da área da região. Durante o

período de safra o risco oferecido à população é devido à pulverização de

herbicidas, onde existem pessoas que desenvolvem doenças apenas porque moram

próximas de lavouras, e a contaminação chega pelo ar. O 2,4-D, nome simplificado

do ácido diclorofenoxiacético, é um dos herbicidas mais comuns e antigos do

mundo, apresenta classificação toxicológica I (extremamente tóxico) e classificação

do potencial de periculosidade ambiental III (perigoso ao meio ambiente). Devido à

grande área de contato entre a superfície do sistema respiratório e o meio ambiente,

a qualidade do ar interfere diretamente na saúde respiratória, provocando uma

resposta inflamatória, mediada predominantemente por citocinas da família das

interleucinas (IL-1) e fator de necrose tumoral (TNF) e de efeitos múltiplos sobre

vários tecidos, causando a liberação de um segundo conjunto de citocinas, que

incluem além dos próprios IL-1 e TNF, também interleucina 6 (IL-6) e interleucina 8

(IL-8) e as proteínas inflamatórias e quimiotáticas de macrófagos. O presente estudo

tem como objetivo avaliar a histologia dos pulmões de modelos experimentais

submetidos à pulverização do herbicida 2,4-D, utilizando-se métodos histoquímicos,

além de suas repercussões quando expostos à população humana. Para a

realização dos experimentos, serão utilizados 80 camundongos Swiss adultos

machos, divididos em quatro grupos, que serão expostos à nebulização do herbicida

através de duas caixas ligadas a dois nebulizadores ultrassônicos, que irão

“pulverizar” o herbicida com concentração e tempo preconizados para cada grupo.

Para a análise dos resultados será utilizado o programa Sigma Stat® versão 2.0. Nos

casos de distribuição normal será utilizada a análise de variância, seguido pelo

Tukey, se necessário, em caso contrário será utilizado o teste não paramétrico como

o de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn. Serão significantes os valores de p

menor que 5% (p<0,05).

Palavras chave: pulmão. herbicidas. inflamação.

1 INTRODUÇÃO

1.1 PONTAL DO PARANAPANEMA E A CANA-DE-AÇÚCAR

De acordo com o Ministério Público do Estado de São Paulo, o Pontal do

Paranapanema, se localiza no extremo oeste de São Paulo, é assim chamado por

ser demarcado pelos rios Paraná e Paranapanema, é a segunda região mais pobre

do rico estado paulista, 84% do que resta da Mata Atlântica no Planalto Paulista está

localizada nessa região. Abrange uma área de 18.444,60 Km² e é composto por 32

municípios: Alfredo Marcondes, Álvares Machado, Anhumas, Caiuá, Caiabu,

Emilianópolis, Estrela do Norte, Euclides da Cunha Paulista, Iepê, Indiana, João

Ramalho, Marabá Paulista, Martinópolis, Mirante do Paranapanema, Nantes,

Narandiba, Piquerobi, Pirapozinho, Presidente Bernardes, Presidente Epitácio,

Presidente Prudente, Presidente Venceslau, Rancharia, Regente Feijó, Ribeirão dos

Índios, Rosana, Sandovalina, Santo Anastácio, Santo Expedito, Taciba, Teodoro

Sampaio e Tarabai. A população total do território é de 583.766 habitantes, dos

quais 59.911 vivem na área rural, o que corresponde a 10,26% do total, segundo o

censo do IBGE de 2010.19,29

O Sistema de Informações Territoriais demonstra que a economia regional é

baseada na agropecuária, com expressiva participação da cana-de-açúcar e

pecuária bovina. A área total ocupada com atividades agropecuárias, segundo o

Levantamento das Unidades de Produção Agropecuária (LUPA), permaneceu

praticamente estável entre 1995 e 2008, contudo a área ocupada com a cana-de-

açúcar teve um aumento de 338% no mesmo período. A cana-de-açúcar ocupava

em 2008, 18% do total da área da região.27,29

Figura 1: Distribuição geográfica da área cultivada de cana-de-açúcar 2007/2008, região de Presidente Prudente e Estado de São Paulo:

Fonte: Secretaria de Agricultura e Abastecimento27

Durante o período de safra o risco oferecido à população é devido à

pulverização de herbicidas, a chamada deriva técnica, já que esse é espalhado pelo

vento, contaminando toda a população. Ela sempre acontece, mesmo que todas as

normas técnicas de aplicação sejam seguidas, segundo afirma Londres (2003,

citado por Chain): “Ela é estimada em pelo menos 30% do produto aplicado. Em

alguns casos a deriva pode ultrapassar 70%.” Sendo assim não existe uma dose

segura, que não comprometa as pessoas que trabalham ou vivem próximas a essa

área. Há pessoas que desenvolvem doenças apenas porque moram próximas de

plantações onde se usa muito veneno, e a contaminação chega pelo ar.17

Londres ainda afirma:

“Os profissionais da saúde, por sua vez, enfrentam no Brasil uma enorme dificuldade para diagnosticar, registrar e até mesmo encaminhar pacientes intoxicados por herbicidas. Sabe-se que o número de registros é muito menor que o número real de intoxicações – a própria Organização Mundial da Saúde reconhece que, para cada caso registrado de intoxicação pelos herbicidas, há 50 não notificados!”.15

1.2 UTILIZAÇÃO DE HERBICIDAS

Araújo et al afirma que os herbicidas são responsáveis por mais de 20.000

mortes não intencionais por ano, sendo que a maioria ocorre no Terceiro Mundo,

onde se estima que 25 milhões de trabalhadores agrícolas são intoxicados de forma

aguda anualmente. Cerca de 70% dos praguicidas produzidos por ano são

consumidos em países considerados desenvolvidos. No entanto, a maior quantidade

de mortes decorrentes da exposição humana a esses agentes é observada nos

países em desenvolvimento.2

Segundo Londres, entre 2001 e 2008, o Brasil alcançou a posição de maior

consumidor mundial de herbicidas agrícolas, quando a venda destes produtos no

país saltou de pouco mais de US$ 2 bilhões para mais US$ 7 bilhões. Foram 986,5

mil toneladas de herbicidas aplicados. Em 2009 o consumo foi ainda maior,

ultrapassando a marca de 1 milhão de toneladas – o que representa nada menos

que 5,2 kg de veneno por habitante. Os dados são do próprio Sindag (Sindicato

Nacional da Indústria de Produtos para Defesa Agrícola), o sindicato das indústrias

de herbicidas. Devido à repercussão negativa que o aumento do uso de herbicidas

começou a causar nos meios de comunicação, a organização não divulgou o volume

de herbicidas comercializados em 2010, mas apenas o faturamento do setor: US$

7,2 bilhões (9% a mais que o ano anterior).17

Levantamentos do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) e do

Sindag, ambos de 2009, apresentam o crescimento de 4,59% da área cultivada no

período entre 2004 e 2008. Por outro lado, as quantidades vendidas de herbicidas,

no mesmo período, subiram aproximadamente 44,6%. “E os números não levam em

conta a enorme quantidade de herbicidas contrabandeados para o país.” (Carneiro,

F. e Soares, V., 2010).19

Para Londres isso se dá porque as pragas agrícolas possuem a capacidade

de desenvolver resistência aos herbicidas aplicados: com o tempo, os herbicidas vão

perdendo eficácia e levando os agricultores a aumentar as doses aplicadas e/ou

recorrer a novos produtos. A indústria está sempre trabalhando no desenvolvimento

de novas moléculas, que são anunciadas como a solução para o controle das

pragas, doenças ou plantas invasoras, que com o tempo serão substituídas por

outras novas, e assim infinitamente. Trata-se de um círculo vicioso do qual o

agricultor não consegue se libertar.17

De acordo com Pignati et. al., os acidentes com herbicidas estão

intrinsicamente relacionados ao efeito esperado destas substâncias, pois com a

finalidade de combater as pragas da lavoura, o homem contamina intencionalmente

o local de trabalho, que é o próprio ambiente agrícola, atingindo em maior ou menor

intensidade os trabalhadores, a produção e o meio ambiente.24

Londres ainda afirma que um dos maiores perigos representados pelos

herbicidas diz respeito aos efeitos que eles podem provocar na saúde das pessoas,

principalmente daquelas que, no campo ou na indústria, ficam expostas ao contato

direto com os venenos. Há pessoas que desenvolvem doenças apenas porque

moram próximo a plantações onde se usa muito veneno, e a contaminação chega

pelo ar.17

1.3 ÁCIDO DICLOROFENOXIACÉTICO (2,4-D)

O 2,4-D, nome simplificado do ácido diclorofenoxiacético, é um dos herbicidas

mais comuns e antigos do mundo. Foi desenvolvido na década de 40 como parte do

esforço de um grupo de cientistas. Hoje, o 2,4-D é usado mundialmente como

ferramenta básica na agricultura moderna. A razão para isso é devido a sua grande

atividade como herbicida, mas também por possuir um dos melhores perfis

toxicológicos disponíveis e um preço muito acessível. Existem vários produtos

comerciais que possuem o 2,4-D em suas formulações, entre eles estão: U-46 Fluid

(Agripec), AMINOL 806 (Milenia), DMA 806 (Dow Agrosciences), Aminamar, Capri,

Deferon, Herbi D-480 e Tento 867 CS.30

A toxicidade da maioria dos herbicidas é expressa em valores referentes à

Dose Média Letal (DL50), por via oral, representada por miligramas do ingrediente

ativo do produto por quilograma de peso vivo, necessários para matar 50% da

população de ratos ou de outro animal teste. A DL50 é usada para estabelecer as

medidas de segurança a serem seguidas para reduzir os riscos que o produto pode

apresentar à saúde humana. Os herbicidas são agrupados em classes, de acordo

com a sua toxicidade, como demonstrado na tabela abaixo:11

Quadro 1 - Classificação dos defensivos agrícolas de acordo com os efeitos à

saúde humana.

Fonte: Embrapa11

O 2,4-D tem classificação toxicológica I (extremamente tóxico) e classificação

do potencial de periculosidade ambiental III (perigoso ao meio ambiente). Na bula do

produto é indicado que não entre na área em que o produto foi aplicado antes da

secagem completa da calda (no mínimo 24 horas após a aplicação). Caso haja

necessidade de reentrar nas áreas tratadas antes deste período, é necessário que

se utilize os equipamentos de proteção individual (EPIs). Porém devido à deriva, o

produto sai do seu alvo e pode atingir a população vizinha.

Bauer et. al. Afirma que a deriva pode ser minimizada se utilizarmos técnicas

adequadas de aplicação e respeitarmos condições climáticas como ventos inferiores

a 10 Km/h; Umidade Relativa superior a 55% e temperatura inferior a 30ºC, e se

utilizarmos pulverizadores com regulagens e bicos adequados.5

1.4 A POLUIÇÃO AMBIENTAL E O SISTEMA RESPIRATÓRIO

Os pulmões são órgãos elaborados com a função de realizar a troca de gases

entre o ar inspirado e o sangue. O aparelho respiratório divide-se em porção

condutora (nariz, nasofaringe, laringe, traquéia, brônquios e bronquíolos terminais) e

porção respiratória (bronquíolos respiratórios, ductos alveolares e alvéolos). A

primeira condiciona o ar para que o mesmo entre nos pulmões, ou seja: filtra-o,

umidifica-o e aquece-o enquanto a segunda faz a troca gasosa entre o ar alveolar e

o sangue. Devido à grande área de contato entre a superfície do sistema respiratório

e o meio ambiente, a qualidade do ar interfere diretamente na saúde respiratória.

Além disso, uma quantidade significante dos poluentes inalados atinge a circulação

sistêmica através dos pulmões e pode causar efeitos deletérios em diversos órgãos

e sistemas.3,14,21

Duchiade definiu como poluente atmosférico qualquer forma de matéria ou

energia com intensidade e em quantidade, concentração, tempo ou características

em desacordo com os níveis estabelecidos e que torne ou possa tornar o ar:

Impróprio, nocivo ou ofensivo à saúde;

Inconveniente ao bem estar público;

Danoso aos materiais, à fauna e flora;

Prejudicial à segurança, ao uso e gozo da propriedade e as atividades

normais da comunidade.10

Consideram-se como poluentes aéreos os contaminantes do ar do exterior e

do interior que incluem partículas e gases, potencialmente tóxicos quando inalados

por pessoas ou animais, e podem afetar a vida das plantas e o ambiente em geral,

ao modificarem a atmosfera da terra. Partículas líquidas sólidas ou em suspensão,

tais como aqueles presentes em aerossóis, são classificadas de acordo com as suas

propriedades aerodinâmicas (que são os determinantes de transporte das partículas,

a penetração e a deposição nas vias aéreas respiratórias) como se segue:

grosseiros (de 2,5 a 10 μ m de diâmetro aerodinâmico ), fino (inferior a 2,5 μ m de

diâmetro) e ultrafinas (menos do que 0,1 μ m de diâmetro).12,23

Segundo Gomes, as partículas inaladas podem depositar-se nas vias aéreas

e interferir com os mecanismos de limpeza dos pulmões ou depositar-se no pulmão

profundo e eventualmente contribuir para o desenvolvimento da doença pulmonar

obstrutiva crônica (DPOC), enfisema ou cancro do pulmão, se a exposição se

mantiver durante anos. O pulmão pode ainda servir de porta de entrada para a

circulação sistêmica e serem atingidos vários órgãos. A inalação crônica de gases e

vapores pode causar por via sistêmica lesões de vários órgãos e sistemas,

nomeadamente fígado e medula óssea.12

Os principais fatores externos de doenças respiratórias são tabagismo e

poluição, segundo dados da Organização Mundial de Saúde (OMS) as doenças

respiratórias crônicas são responsáveis por mais de 5% das mortes no mundo. Em

março de 2014 em Genebra, a OMS apresentou dados que relatavam que em 2012,

7 milhões de pessoas morreram no mundo por causa da poluição do ar, o que

representa 1 de cada 8 mortes, o que nos leva a certeza que, reduzir a poluição do

ar salvaria milhões de vidas.28

Gomes afirma que as exposições aos poluentes pode-se fazer de forma

crônica ou aguda. Diz-se que a exposição é crônica quando ocorre repetidamente

durante um largo período de tempo até vários anos e aguda, quando ocorre num

período de tempo curto, de algumas horas ou um dia com concentrações elevadas

de poluentes. 12

De acordo com Voltarelli, todos os seres vivos possuem mecanismos

adaptativos para responder a estímulos agressivos, para manter assim o equilíbrio

homeostático. Essa resposta inflamatória age localmente no sentido de restringir as

consequências e a extensão do dano tecidual, podendo passar muitas vezes

despercebido. 33

Voltareli ainda afirma que independente da natureza do estímulo

desencadeante, a resposta inflamatória aguda é mediada predominantemente por

citocinas da família da interleucina (IL-1) e fator de necrose tumoral (TNF), de efeitos

múltiplos sobre vários tecidos, causando a liberação de um segundo conjunto de

citocinas, que incluem além dos próprios IL-1 e TNF, também interleucina 6 (IL-6) e

interleucina 8 (IL-8) e as proteínas inflamatória e quimiotática de macrófago. Está

última proteína, juntamente com outras citocinas, atraem para o foco inflamatório

monócitos e neutrófilos, que por sua vez, secretam um terceiro grupo de citocinas,

que retroalimentam o processo inflamatório. 33

Citocinas pró-inflamatórias, tais como a interleucina 1 alfa (IL-1α) e

interleucina 1 beta (IL-1β), IL-6, TNF alfa (TNFα) são mediadores fundamentais

sintetizados pelos estímulos agressivos, promovem o recrutamento ativo de

leucócitos no local da inflamação. Enquanto a IL-6 é mais eficaz na resposta de fase

aguda, IL-1β e TNFα são eficientes principalmente nos estímulos externos,

produzidas pelos macrófagos. 15,22

Um estudo com pulmões de ratos feito por Grattendick et al, demonstrou que

no local de inflamação ocorre um aumento de neutrófilos derivado de

mieloperoxidase recombinante enzimaticamente ativa e inativa que estimulam

macrófagos alveolares, resultando num aumento do estado inflamatório e

citotóxicos, contribuindo assim para a resposta inflamatória geral do pulmão.33

No Brasil, os padrões de qualidade do ar foram estabelecidos pela Resolução

do Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA) nº 3/1990, e não mudaram

desde a década de 1990, no entanto, os limites de partículas adotados pela

Organização Mundial de Saúde (OMS) em 2005 apresentam valores até três vezes

menor do que as normas nacionais. O Brasil tem sido, portanto, alertado sobre a sua

legislação menos rigorosa, como o país pode estar respirando ar mais prejudicial,

especialmente para os grupos com maior vulnerabilidade à poluição, como as

crianças. Uma série de estudos têm mostrado uma clara associação entre a poluição

atmosférica e os efeitos negativos sobre a saúde humana, o que demonstra a

preocupação da comunidade científica sobre este tema.23

De acordo com Matute-Bello, G. et al, os modelos animais fornecem uma

ponte entre pacientes e bancada de laboratório. Sendo assim, a exposição de

modelos experimentais ao herbicida 2,4-D é baseada em reproduzir a exposição dos

seres humanos, levando em consideração as características específicas de cada

um, já que as características de resposta inflamatórias em ambas já é conhecida. 18

Na literatura são encontrados estudos que avaliam alterações pulmonares de

indivíduos expostos a materiais particulados. No entanto, embora a pesquisa sobre o

impacto do uso do herbicida 2,4-D sobre o meio ambiente e a saúde humana tenha

crescido nos últimos anos, até o momento, poucos estudos foram realizados com o

objetivo de verificar o impacto da pulverização aérea dos canaviais na saúde

pulmonar de trabalhadores expostos e população próxima às lavouras.2,3,6,10

A relevância do tema é destacada ao se considerar a dimensão da área de

utilização deste herbicida no Pontal do Paranapanema e a diversidade de pessoas

expostas ao produto, sendo assim os resultados deste estudo poderão contribuir

para a conscientização das empresas quanto aos riscos à saúde, dando início a

discussões quanto à criação de projetos sustentáveis, que melhorem a saúde e a

qualidade de vida dos trabalhadores e da população.

A hipótese deste estudo é que modelos experimentais submetidos à

pulverização do herbicida 2,4-D em diferentes intervalos de tempo e tipos de

concentrações apresentarão mais processos patológicos gerais no epitélio

pulmonar, identificando assim os malefícios pulmonares que podem afetar as

pessoas expostas, principalmente trabalhadores e população próxima às lavouras

de cana-de-açúcar.

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a histologia dos pulmões de modelos experimentais submetidos à

pulverização do herbicida 2,4-D e suas repercussões quando expostos à população

humana, utilizando-se de métodos histoquímicos.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar e comparar a histologia dos pulmões de modelos experimentais

submetidos à pulverização do herbicida 2,4-D em diferentes concentrações,

através da técnica de coloração por Hematoxilina/eosina e Alcian Blue.

Identificar os malefícios pulmonares causados pela exposição ao herbicida

2,4-D.

Analisar a partir de qual concentração o herbicida 2,4-D pulverizado é

prejudicial aos tecidos pulmonares.

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 ASPECTOS DE NATUREZA ÉTICA

Este estudo faz parte de outro que já se encontra aprovado pelo Comitê de

Ética em Animais da Universidade do Oeste Paulista (UNOESTE) sob o protocolo

2563 e será realizado de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de

Laboratório do Instituto Nacional de Saúde (USA).

3.2 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA

Para a realização dos experimentos, serão utilizados 80 camundongos Swiss

adultos machos (30-45g), fornecidos pelo Biotério Central da UNOESTE, alocados

em gaiolas plásticas coletivas (5 animais por gaiola) medindo 600 X 415 milímetros,

a temperatura média de 22 ± 2ºC, com ciclos de 12 horas de luminosidade, sendo

das 07:00 as 19:00 horas (período claro) e 19:00 as 07:00 horas (período escuro).

Os animais serão divididos aleatoriamente em quatro grupos:

GS (grupo salina): composto por 20 camundongos que serão expostos

à nebulização com solução de cloreto de sódio (NaCl) por aproximadamente 10

minutos, em diferentes intervalos de tempo (24h, 48h, 72h e 7 dias), sendo 5

animais para cada período.

GBC (grupo de baixa concentração): composto por 20 camundongos

que serão expostos à nebulização do herbicida, com 15 μL de 2,4-D diluídos em 5

ml de cloreto de sódio, por aproximadamente 10 minutos em intervalos de tempos

diferentes (24h, 48h, 72h e 7 dias), sendo 5 animais para cada período.

GMC (grupo de média concentração): composto por 20 camundongos

que serão expostos à nebulização do herbicida, com 25 μL de 2,4-D diluídos em 5

ml de cloreto de sódio, por aproximadamente 10 minutos em intervalos de tempos

diferentes (24h, 48h, 72h e 7 dias), sendo 5 animais para cada período.

GAC (grupo de alta concentração): composto por 20 camundongos que

serão expostos à nebulização do herbicida, com 37 μL de 2,4-D diluídos em 5 ml de

cloreto de sódio, por aproximadamente 10 minutos em intervalos de tempos

diferentes (24h, 48h, 72h e 7 dias), sendo 5 animais para cada período.

3.3 PROTOCOLO DE EXPOSIÇÃO AO HERBICIDA 2,4-D

O protocolo de experimentação contará com duas caixas (32 x 24 x 32 cm),

cada uma ligada a um nebulizador ultrassônico da marca Pulmosonic Star®, onde

será administrada as seguintes concentrações diluídas em 5 ml de cloreto de sódio

0,9%:

GS: Apenas 5 ml de cloreto de sódio 0,9%

GBC: Solução composta por 15 μL de 2,4-D diluídos em 5 ml de cloreto

de sódio 0,9%;

GMC: Solução composta por 25 μL de 2,4-D diluídos em 5 ml de

cloreto de sódio 0,9%

GAC: Solução composta por 37 μL de 2,4-D diluídos em 5 ml de cloreto

de sódio 0,9%.

O tempo de exposição será de aproximadamente 10 minutos, tempo este

necessário para que toda a solução seja nebulizada.Figura 2- Caixa de inalação.

FONTE: Lea Chioca.7

Na primeira exposição, todos os 80 camundongos serão submetidos à

nebulização com a concentração preconizada para cada grupo. Após 24 horas, 20

animais, sendo cinco de cada grupo, serão eutanasiados para a coleta do material.

Após 48 horas, outros 20 animais que já receberam a segunda nebulização, também

serão eutanasiados, então após 72 horas, outros 20 animais que receberam a

terceira nebulização, e finalmente, após 7 dias, os últimos 20 animais, que também

já receberam as três nebulizações, serão eutanasiados.

Figura 3: Organograma de execução

3.4 COLETA DO MATERIAL

Os modelos experimentais serão eutanasiados utilizando-se de tiopental

sódico (30 mg/kg do peso corporal) por via intraperitoneal. Após esta etapa será

20 (GS) 60 (2,4-D)

80 animais

1 Neb

2 Neb

3 Neb

1 Neb 2 Neb 3 Neb

5 animais

(24h)

5 animais

(48h)

5 animais

(72h)

5 animais

(GBC-24h)

5 animais

(GBC-48h)

5 animais

(GBC-72h)

5 animais

(GMC-24h)

5 animais

(GMC-48h)

5 animais

(GMC-72h)

5 animais

(GAC-24h)

5 animais

(GAC-48h)

5 animais

(GAC-72h)

5 animais

(7 dias)

5 animais

(7 dias)

5 animais

(7 dias)

5 animais

(7 dias)

realizada autopsia para retirada dos pulmões e posterior análise. Para que os

pulmões possam manter sua arquitetura morfológica e pressão constante (20

cmH2O) será introduzida região da traqueia formalina tamponada 10%. O tecido

pulmonar será coletado aleatoriamente de áreas centrais e periféricas dos pulmões

de cada animal para o processamento e confecção dos blocos em parafina.32

3.5 PROTOCOLO DE DESIDRATAÇÃO E INCLUSÃO DO MATERIAL

A desidratação será feita através de imersão numa bateria de soluções

alcoólicas em concentrações graduais. A graduação nas concentrações é

imprescindível para que ocorra a desidratação homogênea dos tecidos, evitando que

ocorram danos na estrutura tecidual. Para a inclusão do material, o mesmo será

imerso em parafina líquida a 60°C, obtendo-se, em temperatura ambiente, um bloco

que contém o fragmento de tecido em seu interior. A partir desta etapa, serão

levados para a microtomia, os cortes coletados em lâminas de vidro, e

encaminhados para a coloração.

3.6 ANÁLISE HISTOLÓGICA

Cortes de 5µm das amostras serão corados com Hematoxilina e Eosina para

subsequente seleção das vias aéreas mais apropriadas para avaliação morfológica e

do infiltrado inflamatório, com inclusão no estudo das lâminas com as vias aéreas

localizadas em região distal do pulmão e com preservação da arquitetura histológica.

Para a investigação da secreção de muco serão utilizadas preparações com a

coloração de Alcian Blue.

O protocolo da técnica de Hematoxilina e Eosina consiste inicialmente em

desparafinizar, alcoolizar (álcool absoluto) e hidratar. Após este procedimento

mergulha-se em Hematoxilina de Harris por 5 minutos e lava-se em água corrente,

em seguida mergulha-se a lâmina no diferenciador por 4 segundos (álcool ácido

clorídrico) e lava-se rapidamente em água corrente. Álcool absoluto. Após esta fase,

o fragmento é então mergulhado em Eosina por 5 minutos, seguido por álcool

absoluto, para posterior montagem em meio sintético com entelan.

O protocolo da técnica de Alcian Blue também se inicia com a

desparafinização e hidratação com H2O destilada. Após esse procedimento deve-se

mergulhar em Alcian Blue por 30 minutos, depois lavar em H2O corrente por 10

minutos e em seguida com H2O destilada. Descansar por 15 minutos em ácido

periódico 0,5% e depois lavar novamente em H2O corrente por 10 minutos, em

seguida lavar com H2O destilada e secar bem. Reativo de Schiff por 15 minutos e

sem lavar, passar em Metabissulfito de Sódio 1% por 5 minutos. Depois lava-se

novamente em H2O corrente por 10 minutos e por último H2O destilada. Desidratar

e montar.

3.7 ANÁLISE DOS RESULTADOS MORFOLÓGICOS

Após realizada a coloração de hematoxilina eosina, as células serão

quantificadas na região peribrônquica onde se procederá a avaliação do infiltrado

inflamatório por método semiquantitativo proposto por Carnieli et al. Este sistema

classifica o infiltrado inflamatório em score de 1 a 3, sendo: 1 (áreas de inflamação

ocasionais); 2 (inflamação em maioria das áreas, cercadas por uma camada fina de

células) e 3 (maioria das áreas inflamadas circundadas por uma camada grossa de

células). Para a investigação da secreção de muco serão utilizadas preparações

com a coloração de Alcian Blue. Todo material de coloração azul contido no interior

das vias aéreas e de células caliciformes localizadas no epitélio será classificado

como muco e posteriormente quantificados utilizando software analisador de

imagens Image pro plus.

As lâminas contendo os cortes histológicos serão cegadas para que os

examinadores não saibam o grupo analisado e, desta forma, emitam falsos

resultados.

3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Para a análise estatística será utilizado o programa Sigma Stat® versão 2.0.

Os casos em que os dados apresentarem as distribuições normais e

homocedásticas serão analisados utilizando-se de testes paramétricos como a

análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste de Tukey quando necessário. Caso

contrário, serão utilizados testes não paramétricos, como o de Kruskal-Wallis

seguido pelo teste de Dunn quando necessário. As diferenças serão consideradas

estatisticamente significantes quando p for menor que 5% (p<0,05).

REFERÊNCIAS

1. Acompanhamento da Safra Brasileira, Cana-de-açúcar, v.1-safra 2014/15, n.2

– Segundo levantamento, Brasília, p.1-20, ago.2014. Disponível em

<http://www.conab.gov.br> Acesso em 05/11/2014.

2. ARAUJO A.C.P., NOGUEIRA D.P., AUGUSTO L.G.S. Impacto dos praguicidas na saúde: estudo da cultura do tomate. Rev. Saúde Pública vol.34 n.3 São

Paulo Jun. 2000

3. ARBEX M.A. et al. A Poluição do Ar e o Sistema Respiratório. Jornal Bras. de

Pneumologia. Vol. 38, n 5, set/out, 2012.

4. BARRETO, M.J., THOMAZ JUNIOR, A. A Expansão da Agroindústria Canavieira no Pontal do Paranapanema e a Precarização do Trabalho. Rio

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