9 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE … · Angélica, Cecília, Gabi, Manu, Isabelle e...

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DIEGO DE SOUSA DANTAS

ESTUDO IN SILICO DA INTERAÇÃO DA ALBUMINA DE SORO HUMANO COM O

IBUPROFENO

NATAL – RN

2013

DIEGO DE SOUSA DANTAS

ESTUDO IN SILICO DA INTERAÇÃO DA ALBUMINA DE SORO HUMANO COM O

IBUPROFENO

Dissertação apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Ciências

Biológicas da Universidade Federal do

Rio Grande do Norte, como exigência

parcial para obtenção do título de

Mestre em Ciências Biológicas com área

de concentração: Biologia Funcional e

Estrutural. Linha de Pesquisa: Biofísica.

ORIENTADOR: Prof. Dr. Umberto Laino

Fulco

NATAL-RN

2013

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de

Biociências

Dantas, Diego de Sousa.

Estudo in silico da interação da albumina de soro humano com o

ibuprofeno / Diego de Sousa Dantas. – Natal, RN, 2013.

79 f.: il.

Orientador: Prof. Dr. Umberto Laino Fulco.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do

Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Ciências

Biológicas.

1. Modelagem molecular – Dissertação. 2. Albumina de soro humano –

Dissertação 3. Ibuprofeno – Dissertação. I. Fulco, Umberto Laino. II.

Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 577.2

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

A dissertação intitulada “Estudo in silico da interação da albumina de soro humano

com o ibuprofeno” foi aceita pelo programa de Pós-Graduação em Ciências

Biológicas, do centro de Ciências Biológicas, da Universidade Federal do Rio Grande

do Norte, defendida por Diego de Sousa Dantas, julgada e aprovada pelos membros

da banca:

__________________________________________________

Prof. Dr. Umberto Laino Fulco (Orientador)

Departamento de Biofísica e Farmacologia - UFRN

__________________________________________________

Prof. Dr. Eudenilson Lins Albuquerque


__________________________________________________

Prof. Dr. Maurizio Serva


__________________________________________________

Prof. Dr. Valder Nogueira Freire

Departamento de Física - UFC

Pelo amor incondicional e exemplos de

caráter e perseverança, dedico esse

trabalho à minha mãe!

AGRADECIMENTOS

A conclusão de mais uma etapa na minha vida, não significa o término de algo,

mas a recompensa devida pelo esforço e dedicação, que não teriam sido os mesmos

sem o apoio e influencia de vocês. Por isso, gostaria de agradecer...

A Deus por me mostrar que tudo acontece no momento certo e que com ele o

caminho nem sempre é mais fácil, mas a recompensa é maior.

A minha mãe, Antonia Maria de Sousa, que é meu maior exemplo de vida, e que sofreu

com a dor da distância.

A meu irmão, Jeysibel Dantas, que nos momentos de fraqueza, me levantou e me

mostrou que era possível seguir em frente.

Ao meu orientador Umberto Laino Fulco pela confiança em mim depositada, desde a

aceitação da orientação até a conclusão desse trabalho.

Ao prof. Eudenilson Lins Albuquerque, pela cultura e conhecimento científico;

Ao prof. Valder Freire pela proposição do trabalho, bem como pelas sugestões sempre

pertinentes e bem-vindas.

As professoras Eunice André e Vanessa Rachetti, pelas contribuições para o

engrandecimento do trabalho.

Aos meus amigos de laboratório, que me foram tão importantes durante todo o

período, mas principalmente no início, quando tudo era novo e difícil: Aranthya

Hevelly, Gabriela Ourique, Jefferson Caio, Jéssica Azevedo, Jéssica Viana, José Xavier,

Jonas Ivan, Katy, Raquel Rodrigues, Raniere da Mata e Edvan Moreira.

Aos meus familiares e amigos que, por conta desse meu projeto foram obrigados a

conviver com minha ausência física, em especial a Rejane Ferreira, Renan Cavalcanti,

Josemberg Dantas, Josebel Dantas, Alana Garcia, Deniele Lós, Izabel Dantas, Felipe

Figueiredo e Júnior Marinho.

Aos meus mestres de graduação: profa. Cláudia Holanda, que me ensinou a ser

Humano; as profas. Alba Lúcia, Alecsandra Tomaz e Railda Shelsea, que sempre me

incentivaram a seguir a carreira acadêmica e vibraram comigo em cada conquista.

Aos mestres e funcionários da Faculdade de Ciências da Saúde do Trairí, que dividiram

comigo os momentos de aflição e felicidade.

Aos meus queridos alunos do Curso de Fisioterapia, pelo feedback e demonstrações de

incentivo.

A Ana Beatriz, seu Lusimar e Dona Rosário, que me acolheram como família em Natal.

A Alexsandro Coura, companheiro de apartamento e do saber científico, com quem

comecei a desbravar o novo e com quem aprendi grandes lições;

Ao meu brother, Diego Neves Araújo, que acompanhou todos os meus passos e com

quem compartilho o mesmo ideal científico.

Aos alunos do PPGENF, que me permitiram ser o agregado-mor, em especial a Ana

Angélica, Cecília, Gabi, Manu, Isabelle e aos demais amigos, Arthur e Marcelo, que fiz

através dessa galera massa.

Ao meu amigo Paulo André, pelas noites de estudo, pelas farras, conversas, sonhos,

enfim por tudo!

As amigas Hylarina Diniz e Thalita Rolim, pelo exemplo de dedicação e

responsabilidade.

A Rhu e Dyla, meus amores, que também preencheram meus dias com muita alegria.

Ao amigo Ítalo Morais, pelo ombro amigo e palavras de incentivo.

Aos amigos, Thiago Araujo, Arthur Barbosa, Glaucio Tavares, Francisco Júnior, Karol

Hannah, Marcio Gutemberg, Rodrigo Lima, Daniela Garcia e Julinho Neto, por terem

modificado meus dias e amizade substancial.

Ao amigo Tertuliano Avellar pelo apoio, paciência e incentivo.

A Silmara Dantas e Lívia Oliveira, pessoas iluminadas, pelo encontro de almas.

E a todas as pessoas que não citei, mas que contribuíram para o meu crescimento

pessoal e execução desse trabalho.

A todos vocês o meu muito obrigado!

“O mundo inteiro se abre quando vê

passar alguém que sabe aonde vai!”

Antoine de Saint-Exupery

RESUMO

Na atualidade, os métodos computacionais vêm sendo cada vez mais utilizados para auxiliar a biologia molecular na caracterização de sistemas biológicos, principalmente quando esses possuem relevância para a saúde humana. O ibuprofeno é um antiinflamatório não-esteroidal de larga utilização na clínica. Uma vez na corrente sanguínea, boa parte do ibuprofeno fica ligada a albumina de soro humano, a principal proteína do plasma sanguíneo, diminuindo a sua biodisponibilidade e necessitando de maiores doses para a produção de seu efeito antiinflamatório. Este estudo teve por objetivo caracterizar, através da energia de interação, como ocorre a ligação do ibuprofeno à albumina e estabelecer quais os principais aminoácidos e interações moleculares envolvidas no processo. Para tal desenvolveu-se um estudo in silico, com utilização de cálculos de mecânica quântica, baseada na Teoria do Funcional da Densidade (DFT), com aproximações do Gradiente Generalizado (GGA) para descrição dos efeitos de correlação e troca. A energia de interação de cada aminoácido do sítio de ligação, com o ligante foi calculada com base no método de fragmentação molecular com capas conjugadas (MFCC). Além da energia, foram calculadas as distâncias, tipos de interações moleculares e grupos atômicos envolvidos. Os modelos teóricos utilizados foram satisfatórios e demonstraram uma descrição mais precisa com a utilização da constante dielétrica ε=40. Os achados corroboram com a literatura colocando o sítio Sudlow I (I-FA3) como o principal sítio de ligação e o sítio I-FA6 como sítio secundário. Contudo, difere quanto à identificação dos aminoácidos mais importantes, que por meio da energia de interação, em ordem decrescente de energia, são: Arg410, Lys414, Ser 489, Leu453 e Tyr411 para o Sítio I-FA3 e Leu481, Ser480, Lys351, Val482 e Arg209 para o sítio I-FA6. A quantificação da energia de interação e a descrição dos aminoácidos mais importantes abre caminhos para novos estudos que visem a manipulação da estrutura do ibuprofeno, no sentido de diminuir a interação desse com a albumina, e consequentemente aumentar a sua distribuição. PALAVRAS-CHAVE: modelagem molecular; energia de interação; fragmentação molecular com capas conjugadas; albumina de soro humano; ibuprofeno.

ABSTRACT

Currently, computational methods have been increasingly used to aid in the characterization of molecular biological systems, especially when they relevant to human health. Ibuprofen is a nonsteroidal antiinflammatory or broadband use in the clinic. Once in the bloodstream, most of ibuprofen is linked to human serum albumin, the major protein of blood plasma, decreasing its bioavailability and requiring larger doses to produce its antiinflamatory action. This study aimes to characterize, through the interaction energy, how is the binding of ibuprofen to albumin and to establish what are the main amino acids and molecular interactions involved in the process. For this purpouse, it was conducted an in silico study, by using quantum mechanical calculations based on Density Functional Theory (DFT), with Generalized Gradient approximation (GGA) to describe the effects of exchange and correlation. The interaction energy of each amino acid belonging to the binding site to the ligand was calculated the using the method of molecular fragmentation with conjugated caps (MFCC). Besides energy, we calculated the distances, types of molecular interactions and atomic groups involved. The theoretical models used were satisfactory and show a more accurate description when the dielectric constant ε = 40 was used. The findings corroborate the literature in which the Sudlow site I (I-FA3) is the primary binding site and the site I-FA6 as secondary site. However, it differs in identifying the most important amino acids, which by interaction energy, in order of decreasing energy, are: Arg410, Lys414, Ser 489, Leu453 and Tyr411 to the I-Site FA3 and Leu481, Ser480, Lys351, Val482 and Arg209 to the site I-FA6. The quantification of interaction energy and description of the most important amino acids opens new avenues for studies aiming at manipulating the structure of ibuprofen, in order to decrease its interaction with albumin, and consequently increase its distribution. KEY-WORDS: Molecular modeling; Binding energy; Molecular fragmentation with conjugated caps; Human serum albumin; Ibuprofen.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Esquema representativo da estrutura da Albumina de Soro Humano,

destacando seus subdomínios e as pontes dissulfídicas .............................. 20

Figura 2: Estrutura da albumina de soro humano evidenciando seus domínios e

subdomínios. Subdomínio IA (azul escuro), IB (Azul ciano), IIA (Verde), IIB

(Verde limão), IIIA (amarelo) e IIIB (vermelho) ............................................ 21

Figura 3: Estrutura da Albumina de Soro Humano,com visualização para sítios de

ligação dos ácidos graxos (AF), numerados de 1 a 8. ................................... 23

Figura 4: Síntese das interações da ASH com alguns fármacos. ..................................... 25

Figura 5: Representação planar do ibuprofeno com destaque para suas cadeias. ........ 26

Figura 6: Esquema simplificado da síntese de tromboxano e prostaglandinas, via

ciclooxigenase 1 e 2 respectivamente, mostrando a ação inibitória do

ibuprofeno sobre ambas as ciclooxigenases, e consequentemente sobre

ambos os processos. ..................................................................................... 29

Figura 7: Imagens da Interface do software Materials Studio® com os parâmetros

selecionados para o processo de otimização de geometria. ....................... 46

Figura 8: Representação gráfica para as equações envolvidas no cálculo da energia de

interação entre o resíduo (Ri), em vermelho, e o fármaco ou ligante (Li), em

laranja, através da utilização das capas, constituídas de cinco aminoácidos

à direita, em verde, Ci*, e à esquerda, em azul Ci. ............................................................ 49

Figura 9: Imagem da tela do script, mostrando a configuração dos parâmetros e as

categorias escolhidas, vermelho e azul respectivamente. Os parâmetros

antecedidos pelo símbolo #, em verde, não foram selecionados para as

otimizações. .................................................................................................. 50

Figura 10: Nomeclatura, estrutura química e classificação dos vinte tipos de

aminoácidos. ................................................................................................. 55

Figura 11: Albumina de soro humano, mostrando o ibuprofeno nos seus sítios de

ligação. .......................................................................................................... 56

Figura 12: Representação planar do ibuprofeno com destaque para suas cadeias em A

e mapa eletrostático do ibuprofeno, evidenciando a região i como mais

eletronegativa em B ..................................................................................... 57

Figura 13: Curva de protonação (pKa) do ibuprofeno, mostrando que sua forma neutra

ocorre até um pH de 4,91, e acima disso, ele passa a ocorrer na forma

desprotonada................................................................................................ 58

Figura 14: Curvas de convergência energética do sistema variando por raio em

diferentes constantes dielétricas parra os dois sítios, acima o

comportamento energético para uma constante dielétrica de zero e abaixo

para uma constante de quarenta. Os aminoácidos com energias mais

negativas em um raio de 12 Å do centroide do fármaco estão destacados.60

Figura 15: Energia total do sistema em diferentes raios e constantes dielétrica. .......... 62

Figura 16: Energias de interação e contatos intermoleculares dos resíduos que mais

contribuem para a estabilidade do ibuprofeno no sítio I-FA3 e I-FA6,

respectivamente. As barras horizontais rachuradas e pretas expressam a

energia de interação do resíduo com o ibuprofeno, utilizando uma

constante dielétrica de zero e quarenta, respectivamente. No canto direito

da figura, em verde, encontram-se os valores da menor distância entre os

resíduos e o ibuprofeno, e ao lado de cada barra está identificado a região

do fármaco que interage com o resíduo. ..................................................... 66

Figura 17: Esquema representativo das principais interações químicas que acontecem

no sítio I-FA3. ................................................................................................ 68

Figura 18: Interações moleculares que acontecem nas diferentes regiões do

Ibuprofeno no sítio I-FA3. ............................................................................. 69

Figura 19: Interações moleculares que acontecem nas diferentes regiões do

Ibuprofeno no sítio I-FA6. ............................................................................. 70

Figura 20: Representação tridimensional dos sítios de ligação I-FA3 com o ibuprofeno e

principais resíduos. ....................................................................................... 72

Figura 21: Representação tridimensional dos sítios de ligação I-FA6 com o ibuprofeno e

principais resíduos. ....................................................................................... 73

Figura 22: Ilustração do sítio de interação I-FA3 (a cima) e I-FA6 (abaixo) com o

ibuprofeno e os principais resíduos próximos e pós-próximos.................... 74

Figura 23: Isosuperfícies de potencial eletrostático para os resíduos mais atrativos e

repulsivos para os sítios I-FA3 e I-FA6. ......................................................... 75

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Estatísticas de refinamento cristalográfico para diferentes ligantes

associados a Albumina de Soro Humano, com destaque para as

propriedades do cristal que contem o Ibuprofeno. ........................................ 44

Tabela 2: Dados da interação entre os resíduos e o ibuprofeno no sítio I-FA3. ............. 63

Tabela 3: Dados da interação entre os resíduos e o ibuprofeno no sítio I-FA6. ............. 64

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AG –ÁCIDO GRAXO

AINES - ANTIINFLAMATÓRIOS NÃO ESTEROIDAIS

ASH - ALBUMINA DE SORO HUMANO

COX-1 - CICLOOXIGENASE 1

COX-2 - CICLOOXIGENASE 2

DFT - TEORIA DO FUNCIONAL DA DENSIDADE

DRBE - DESENHO RACIONAL DE FÁRMACOS BASEADOS EM ESTRUTURAS

EXC - ENERGIA DE TROCA-CORRELAÇÃO (EXC)

FMO – FRAGMENTAÇÃO DE ORBITAL MOLECULAR

GGA - APROXIMAÇÃO DO GRADIENTE GENERALIZADO

IBP - IBUPROFENO

LDA - APROXIMAÇÃO DE DENSIDADE LOCAL

MFCC – FRAGMENTAÇÃO MOLECULAR COM CAPAS CONJUGADAS

PDB – BANCO DE DADOS DE PROTEÍNAS

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 16

1.1 ALBUMINA DE SORO HUMANO ................................................................................. 19

1.2 IBUPROFENO.............................................................................................................. 26

1.3 OBJETIVOS ................................................................................................................. 30

REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 31

2 TEORIA QUÂNTICA APLICADA À SIMULAÇÃO COMPUTACIONAL ........................... 35

2.1 TEORIA DO FUNCIONAL DA DENSIDADE ................................................................... 36

2.1.1 Teoremas de Hohenberg e Kohn .................................................................... 37

2.1.2 Equações de Kohn-Sham ................................................................................ 39

2.2 APROXIMAÇÕES PARA ENERGIA DE TROCA E CORRELAÇÃO .................................... 40

REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 42

3 MATERIAL E MÉTODO .................................................................................................. 43

3.1 TIPOLOGIA DO ESTUDO ............................................................................................. 43

3.2 OBTENÇÃO DAS ESTRUTURAS CRISTALOGRÁFICAS .................................................. 43

3.3 ESTADO DE PROTONAÇÃO DO LIGANTE ................................................................... 44

3.4 OTIMIZAÇÃO DOS HIDROGÊNIOS .............................................................................. 45

3.5 ESTABELECENDO OS LIMITES DO SÍTIO DE LIGAÇÃO ................................................ 46

3.6 CÁLCULOS REALIZADOS ............................................................................................. 47

3.7 PARÂMETROS DA SIMULAÇÃO COMPUTACIONAL ................................................... 49

REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 53

4 BIOQUÂNTICA DA INTERAÇÃO DO IBUPROFENO COM A ALBUMINA DE SORO

HUMANO ............................................................................................................... 55

REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 77

5 CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS ............................................................. 78

16

1 INTRODUÇÃO

Um dos maiores desafios da atualidade para a biologia molecular é entender

como ocorrem os mecanismos de reconhecimento receptor-ligante. Além disso, tal

entendimento é ponto chave para o sucesso na descoberta e planejamento de novos

fármacos. Dentre as várias metodologias existentes, a obtenção de uma descrição

acurada e automatizada através dos processos computacionais é motivada em virtude

da possibilidade de redução de custos e tempo no desenvolvimento de novos

medicamentos.

A palavra fármaco vem do grego phármakon e significa substância química

empregada como medicamento. O fármaco corresponde a uma micromolécula que

atua no organismo, modulando a resposta biológica por atuar como agonista, ligando-

se e ativando o receptor, ou antagonista ligando-se ao receptor e bloqueando a ligação

de outra substância a esse receptor ou ao pelo menos ao mesmo sítio (MAGALHAES;

BARBOSA; DARDENNE, 2007).

A necessidade de processos mais sistemáticos, a necessidade de novas drogas

terapêuticas, bem como o avanço de técnicas experimentais para identificação,

isolamento e preparação de proteínas impulsionaram o surgimento do paradigma do

Desenho Racional de Fármacos Baseados em Estruturas (DRBE).

Assim, a área de simulação computacional vem despertando o interesse de

vários pesquisadores, por permitir um estudo teórico prévio, baseado em

conhecimentos físicos sobre as interações receptor-ligante, economizando tempo e

recursos gastos no processo de desenho de fármacos (KUNTZ, 1992; HE; MERZ, 2010).

Metodologias de docking receptor-ligante são amplamente utilizadas dentro do

DRBE, seja para a descoberta de novas moléculas bioativas, através da triagem virtual,

ou para a otimização e refinamento de compostos protótipos já identificados. A figura

1 traz um esquema das etapas do DRBE que vão desde a identificação de um alvo

terapêutico, a seleção das estruturas tridimensionais, tratamento computacionais,

testes in vitro, in vivo e clínicos e ao final o desenvolvimento de um novo fármaco.

17

Durante o processo de reconhecimento molecular, o receptor e o ligante

sofrem mudanças conformacionais, que implica no tratamento de centenas de

milhares de graus de liberdade, por parte de algoritmos. Além disso, o reconhecimento

molecular é um processo altamente dinâmico e complexo, envolvendo um grande

número de interações intermoleculares entre o ligante, a molécula receptora e o

solvente (MAGALHAES; BARBOSA; DARDENNE, 2007).

Atualmente, métodos sofisticados de simulação computacional se apropriam

da química quântica para descrição desses complexos. Devido à alta precisão na

estimativa da afinidade de ligação fármaco-receptor, investigações quânticas estão se

tornando cada vez mais importantes e populares em pesquisas com fármacos

baseados no paradigma do DRBE. Evidenciam-se, assim, os estudos que quantificam as

contribuições individuais de cada resíduo do receptor para a energia de interação total

do sistema, os quais permitem o desenho de novos derivados do ligante com ação

inibitória mais eficiente, resistência a mutações e com menos efeitos adversos

(MAGALHAES; BARBOSA; DARDENNE, 2007).

Infelizmente, essas pesquisas são limitadas pelo tamanho do sistema.

Convencionalmente, apenas um modelo bastante pequeno, aproximadamente 20-200

átomos (o que corresponde ao ligante e até 20 aminoácidos do receptor), é

explicitamente estudado de forma puramente quântica. Contudo, recentemente, o

elevado custo computacional relacionado ao tratamento de um macrossistema é

superado por técnicas de separação e fatiamento do mesmo - Fragment-based

Methods (CHEN; ZHANG; ZHANG, 2004).

A ideia central desses métodos é dividir o bioreceptor em uma série de

pequenos fragmentos para predizer as propriedades do sistema como um todo, a

partir dos cálculos quânticos (energéticos) convencionais direcionados em seus

subsistemas.

Dessa forma, pode-se quantificar e comparar energias de ligação de vários

fármacos dentro de uma mesma classe terapêutica (receptor comum). Com isso, é

possível identificar o fármaco que mais fortemente interage no sítio de ligação, o qual

18

provavelmente será aquele de mais intensa e duradoura atividade farmacológica.

Dados experimentais de IC50 comprovam tal estimativa em diferentes sistemas.

A albumina de soro humano (ASH) se configura como um importante marcador

da atividade farmacocinética de várias moléculas. Por isso, em estudos clínicos ou

estudos que busquem o desenvolvimento de novos fármacos, é importante

determinar a afinidade da ligação com a albumina de soro humano, para aperfeiçoar o

comportamento farmacocinético desses, uma vez que grande parte dos fármacos fica

ligados à albumina de soro humano e, portanto, não desempenham sua função

(COLMENAREJO, 2003).

O ibuprofeno foi escolhido como fármaco de interesse em virtude de sua larga

utilização na clínica médica, sendo considerado um medicamento indispensável à

saúde humana (WHO, 2010). Além disso, seus impactos vão além da simples resolução

de patologias, já sendo comprovado cientificamente seus danos à ecossistemas

aquáticos, em virtude da adsorção do fármaco no meio ambiente (SARAVANAN et al.,

2012).

Embora exista uma ampla variedade de dados cristalográficos relativos à

ligação de diferentes fármacos à albumina, o número de trabalhos nos quais se faz

uma análise no escopo da biofísica molecular destas ligações é bastante limitado.

Dessa forma, objetivou-se nesse trabalho, descrever como ocorre a interação

entre o ibuprofeno e a albumina de soro humano, em uma perspectiva teórica através

de simulações de dinâmica molecular e cálculos baseados na teoria do Funcional de

Densidade (DFT).

Para isso, quantificou-se as energias de interação e as distâncias de ligação e

comparou-se o efeito de diferentes constantes dielétricas para a descrição do sistema.

Além disso, esse trabalho objetivou a descrição comparativa dos dois sítios de ligação

do ibuprofeno à albumina de soro humano.

19

1.1 ALBUMINA DE SORO HUMANO

O nome albumina possui origem alemã e deriva do termo albumen, usado

geralmente para indicar proteínas, que por sua vez, deriva da palavra latina albus, que

faz referência a parta branca do ovo, rica em proteínas. Biologicamente, a palavra

albumina refere-se a um grupo proteico heterogêneo, que além de agrupar o

componente proteico da clara do ovo, inclui a albumina do soro, albumina do leite e

proteínas urinárias (FANALI et al., 2012).

A albumina de soro humano é uma proteína altamente abundante no plasma

humano (0,6 mM), compreendendo 50-60% do total de proteínas plasmática em

humanos e pertence também a uma família de proteínas homólogas que possuem

características estruturais distintas e propriedades de ligação com ligantes peculiares,

da qual também fazem parte a α-fetoproteina, afamina e a proteína ligadora de

vitamina D (SIMARD et al., 2006; FASANO et al., 2007).

A albumina de soro humano é sintetizada por uma cópia única de gene, o ALB,

localizado no braço longo do cromossomo 4, próximo ao centrômero, na posição q11-

22. Esse gene possui 15 éxons e 14 íntrons.

O processo de síntese se inicia no citoplasma dos hepatócitos na forma de pré-

pro-albumina que é clivada cotraducionalmente para remover o pré-peptídeo, no

lúmen do retículo endoplasmático, e em seguida, no complexo de Golgi, é clivada para

a retirada o pro-peptídeo e secretada no sangue, onde possui um período de meia vida

de 28-36 dias (GALIANO et al., 1999; ROCHE et al., 2008).

Ao contrário da albumina sérica de outras espécies, a albumina de soro

humano é normalmente não glicosilada, uma vez que não possui o tripepitídeo

aceitador (Asn-X-Thr/Ser) para a N-glicosilação, embora em indivíduos diabéticos e em

algumas formas variantes, ocorre o aumento de uma forma glicosilada não enzimática

(COLMENAREJO et al., 2003; FANALI et al., 2012 ).

A albumina de soro humano consiste em uma macromolécula monomérica com

um peso molecular de 66,438 Da, contendo 585 aminoácidos, 17 pontes dissulfeto e

uma cisteína livre na posição 34. Embora seja monomérica, a albumina possui três

20

domínios em α-hélice (68%) separados por loops extensos e desordenados, sem

nenhum elemento de folha beta (FALANI et al., 2012). São eles: Domínio I (resíduo1-

195), domínio II (196-383) e domínio III (384-585) (SUGIO et al., 1999).

A estrutura secundária da albumina de soro humano revela subdomínios de α-

hélices. Os subdomínios A são compostos por seis α-hélices, estando quatro

agrupadas, formando um cluster (a-h1 a a-h4), ladeados por duas α-hélices curtas (ah-

5 e a-h6). Os subdomínios B, por sua vez, correspondem a um cluster de quatro α-

hélices (b-h1 a b-h4) (SUGIO et al., 1999) (Figura 1).

Figura 1: Esquema representativo da estrutura da Albumina de Soro Humano, destacando seus subdomínios e as pontes dissulfídicas.

Fonte:SUGIO et al., 1999.

21

O Domínio III, que se projeta a partir de subdomínio IIB, forma um conjunto em

forma de Y com os domínios II e III, interage apenas com subdomínio IIB. Domínios I e

III são separados por um grande canal criado pelos subdomínios IB, IIIA, IIIB e estão

ligadas por poucos contatos. Tal montagem confere à ASH, com dimensões

aproximadas de 80x80x 30 Å, um formato de coração (COLMENAREJO, 2003; ASCENZI;

FASANO, 2010).

Figura 2: Estrutura da albumina de soro humano evidenciando seus domínios e subdomínios. Subdomínio IA (azul escuro), IB (Azul ciano), IIA (Verde), IIB (Verde limão), IIIA (amarelo) e IIIB (vermelho).

Fonte: Dados da pesquisa

22

O primeiro relato de correlação fisiopatológica da ASH foi feito por Hipócrates

400 a.c. quando o mesmo associou a presença de albumina na urina, ao aspecto

espumoso, apresentado por pacientes com doença renal. Contudo, hoje se sabe que a

albumina de soro humano é um biomarcador valioso de muitas doenças incluindo

câncer, artrite reumatoide, isquemia, obesidade pós-menopausal e doenças que

necessitam de monitoramento do controle glicêmico (FANALI et al., 2012).

Em virtude da sua enorme capacidade de ligação, a albumina funciona como

bolsão carreador de muitos componentes endógenos e exógenos, sendo o principal

carreador de ácidos graxos, afeta a atividade farmacocinética de muitas drogas,

promove alterações metabólicas em alguns ligantes, atua como principal antioxidante

do plasma humano e ainda apresenta propriedades pseudo-enzimáticas (ROCHE, 2008;

FANALI et al., 2012).

Abordando especificamente sua relação com os ácidos graxos (AG), a albumina

de soro humano está ligada a mais do que 99% dos ácidos graxos não esterificados

presentes no sangue e atua no transporte passivo dos AGs pela circulação sanguínea,

graças à alta afinidade da albumina com essas moléculas e à presença de múltiplos

sítios de ligação e ligações cooperativas que contribuem para a sua solubilização

(PETITPAS et al., 2001; COLMENAREJO et al., 2003).

Além disso, a ASH apresenta uma distribuição uniforme nos vários tecidos, e

desempenha um segundo papel de remoção dos AG a partir de células doadoras,

minimizando os efeitos das taxas variáveis de produção de ácidos graxos (PETERS,

1996; SIMARD et al., 2005).

Além de ser utilizada clinicamente no tratamento de situações clínica severas,

incluindo hipovolemia, choque, queimaduras, traumas, hemorragias, insuficiência

hepáticas agudas e crônicas, a albumina também é administrada em procedimentos

clínicos como circulação extracorpórea, hemodiálise, suporte nutricional e resuscitação

(FANALI et al., 2012).

Já na biotecnologia, a albumina vem sendo empregada para a fabricação de

adesivos cirúrgicos, biomateriais, na biocromatografia, no aprisionamento de ligantes

e para a fusão de proteínas (FANALI et al., 2012).

23

Um ponto crucial no entendimento dos múltiplos papéis e possíveis aplicações

da ASH corresponde ao estudo de como ocorre a sua ligação aos diferentes ligantes.

A partir da estrutura cristalográfica da albumina de soro humano com o ácido

mirístico (PDB 1bj5) Curry e colaboradores (1998) identificaram cinco sítios de ligação

para os ácidos graxos, um no subdomínio IB (FA1), um entre o subdomínio IA e IIA

(FA2), dois sítios no subdomínio IIIA (FA3 e FA4) e outro no domínio IIIB (FA5). Em

adição a esses, Petitpas et al. (2001), usando novas imagens cristalográficas,

encontraram dois sítios adicionais, um entre os subdomínios IIA e IIB (FA6), um no

subdomínio IIA (FA7) e outro no subdomínio IA (FA8) (Figura 3).

Baseado na diversidade bioquímica e nas estruturas cristalográficas observa-se

que os ácidos graxos de cadeia média e os de cadeia longa possuem afinidade

específica para alguns sítios de ligação (BHATTACHARYA; CURRY; FRANKS, 2000).

Figura 3: Estrutura da Albumina de Soro Humano,com visualização para sítios de ligação dos ácidos graxos (AF), numerados de 1 a 8.

Fonte: Adaptado de BHATTACHARYA; CURRY; FRANKS, 2000.

24

Os ácidos de cadeia longa possuem maior afinidade para a ligação com os cinco

sítios de ligação descritos para o ácido mirístíco, pois esses consistem em longos bolsos

hidrofóbicos onde as caudas de polimetileno se ligam por interações hidrofóbicas,

juntamente com as faces básicas e polares da cadeia lateral, onde os grupos

carboxilato interagem através de pontes salinas e pontes de hidrogênio. Enquanto os

ácidos graxos de cadeia média demonstram preferência pelos sítios localizados nos

subdomínios IIA e IIIA (COLMENAREJO, 2003).

Além dos ácidos graxos, a albumina de soro humano também se liga e

transporta substâncias endógenas, a exemplo da bilirubina hepática, sais biliares,

hormônios esteróides, hematina, triptofano, tiroxina, algumas vitaminas, alguns sais

metálicos, como o zinco (COLMANAREJO, 2003; GUO et al., 2009 VUSSE, 2009).

Em virtude da sua alta concentração no plasma sanguíneo, a albumina de soro

humano também apresenta um papel de destaque na farmacocinética.

Dos quatro processos farmacocinéticos básicos (absorção, distribuição,

metabolismo e excreção), a distribuição é um dos processos controlados pela ASH, que

por se ligar a essas substâncias hidrofóbicas, contribui para uma distribuição

homogênea, aumentando o tempo de meia vida do fármaco, por impedir que eles

sejam metabolizados precocemente (SIMARD et al., 2006).

Os sítios de ligação da ASH para os fármacos foram descobertos por Sudlow, e

por isso são denominados Sudlow 1 ou sítio da Warfarina, sítio localizado no

subdomínio IIA, e que apresenta afinidade por compostos carregados negativamente e

heterocíclicos grande; e Sudlow 2 ou sítio indolbenzodiazepínico, localizado no

subdomínio IIIA, que se liga preferencialmente a ácidos carboxílicos aromáticos

pequenos (FANALI et al., 2012).

Além dos sítios Sudlow 1 e 2, os sítios menores, a exemplo dos oito sítios de

ligação para os ácidos graxos, também podem se ligar à fármacos, permitindo ligações

múltiplas e simultânea, resultando em uma maior capacidade para a ligação de drogas

(GHUMAN et al., 2005). Uma síntese dos sítios de ligação a alguns fármacos está

representada na figura 4.

25

Figura 4: Síntese das interações da ASH com alguns fármacos.

Fonte: GHUMAN et al., 2005.

Embora a albumina de soro humano apresente uma estrutura tridimensional

bem estabilizada, a mesma em virtude da grande quantidade de aminoácidos

carregados negativamente e positivamente em seu interior, sofre isomerizações

conformacionais reversíveis de acordo com a mudança do pH, o que pode provocar

prejuízos na interação e transporte de outras moléculas (ASCENZI;FASANO, 2010).

De acordo com o pH, a albumina pode assumir a forma expandida (E), que é

composta por 35% de α-hélice; em um pH maior do que 2,7, sofre transição para a

forma rápida (F), composta por 45% de α-hélice, em um pH por volta de 4,3 a 8,0 sofre

transição para o estado normal (N). Acima do pH 8,0 a albumina muda sua

conformação para a forma básica (B) (CARTER; HO, 1994; ASCENZI;FASANO, 2010).

26

1.2 IBUPROFENO

O ibuprofeno (IBP) ou [(R, S) 2-[4-(2-metilpropil)fenil]ácido propanôico,

conforme nomeclatura IUPAC (DRUGBANK, 2012) é uma droga antiinflamatória não

esteroidal, derivada do ácido propriônico e largamente utilizada e tolerada pelos

pacientes (DEWLAND; READER; BERRY, 2009).

Introduzida no mercado para comercialização em 1974 (MUSA; ERIKSSON,

2007), devido ao seu grande consumo em escala mundial, da ordem de centenas de

toneladas por ano, o ibuprofeno é considerado atualmente como um dos

medicamentos essenciais à vida humana (WHO, 2010).

No tocante às características estruturais, podemos dividir o ibuprofeno em três

regiões: a cadeia lateral ácida (região i), a cadeia central, representada pelo anel

benzênico (região ii) e a cadeia lateral hidrofóbica (região iii) (Figura 5).

Figura 5: Representação planar do ibuprofeno com destaque para suas cadeias.


A cadeia lateral ácida representa a região mais importante da molécula e

associada com a sua atividade biológica antiinflamatória, isso porque, esta região

27

encontra-se associada à lipofilicidade e à energia de desprotonação (MUSA; ERIKSSON,

2007).

Além de apresentar uma estrutura linear, a estrutura química do ibuprofeno é

flexível graças à ausência de ligações de hidrogênio, deixando o grupamento carboxila

sempre livre e voltado para fora do plano que contém o anel (OKULIK; JUBERT, 2006).

É um ácido fraco (pka 4.91) e pouco solúvel em água ou soluções levemente

ácidas, por isso ocorre geralmente na forma desprotonada em condições fisiológicas

(MUSA; ERIKSSON, 2007; NAYAK; JAIN, 2011).

Com relação às propriedades farmacocinéticas o Ibuprofeno é rapidamente

absorvido após a administração por via oral, devido a alta solubilidade em lipídios na

forma não ionizada, sendo conduzida por difusão passiva pelo sistema gastrointestinal

e apresentando uma biodisponibilidade de 80% a 90% (GRAHAM; WILLIAMS, 2004).

O ibuprofeno, que geralmente é administrado em uma mistura racêmica, sofre

conversão da sua forma R-ibuprofeno, para a forma mais ativa S-ibuprofeno, e é

oxidado principalmente pelo citocromo P45O para posterior eliminação pelo sistema

renal (GRAHAM; WILLIAMS, 2004).

Essa rápida absorção do ibuprofeno é o que o torna um dos medicamentos

mais elegíveis para crises dolorosas, bem como é ponto de inúmeros estudos que

tentam modificar suas formulações.

Na literatura são descritas várias formulações a exemplo do ibuprofeno

combinado com arginato, ibuprofeno associado a lisina, ibuprofeno sódico diidratado,

ibuprofeno associado a poloxamer, e todas essas novas formulações ainda não tão

populares no comércio, possuem tempo de absorção menor do que sua forma ácida

(DEWLAND; READER; BERRY, 2009).

Na clínica sua utilização ocorre em larga escala, sendo utilizado no tratamento

de dores musculares, cefaleia, dor de dente, dismenorreia, estados febris, artrite

reumatoide, osteoartrose, pós-operatórios odontológicos e cuidados neonatais. Além

desses benefícios estudos apontam uma possível ação antitumoral desempenhada por

esse fármaco, embora seu mecanismo de ação ainda não esteja totalmente

28

compreendido (MUSA; ERIKSSON, 2007; ADATIA; RAINSFORD; KEAN, 2012; JOHNSTON

et al., 2012).

Uma vez na corrente sanguínea, grande parte do ibuprofeno liga-se

reversivelmente e covalentemente às proteínas plasmáticas, principalmente à

albumina de soro humano (GRAHAM; WILLIAMS, 2004).

Devido a sua meia-vida curta, o pico de concentração plasmática e efeito

analgésico máximo são observados cerca de 1,5-2 horas após a administração oral,

havendo uma correlação positiva entre os níveis plasmáticos de ibuprofeno e a

diminuição da dor, especialmente uma hora após a sua administração (DEWLAND;

READER; BERRY, 2009; CHEN et al., 2012).

A ligação do ibuprofeno com a albumina de soro humano acaba provocando

uma diminuição na distribuição dessa droga, pois parte da mesma fica ligada nos

bolsões hidrofóbicos da albumina (GHUMAN et al., 2005). Contudo essa ligação é

saturável e pode ser revertida com o aumento da dose empregada (ALBERT et

al.,1984).

Em contrapartida, nos fluídos cerebrais o ibuprofeno acaba possuindo

concentrações maiores do que quando comparado ao plasma sanguíneo, devido a

ausência das proteínas de ligação no fluido cerebrospinal normal (BANNWARTH et al.,

1995).

Além disso, o ibuprofeno pode ainda estar ligado às proteínas teciduais, a

exemplo da actina, de maneira reversível, porém com ligações mais fracas do que

quando ligado a albumina de soro humano (GRAHAM; WILLIAMS, 2004).

Assim como outras drogas antiinflamatórias não esteroidais (AINEs), o

ibuprofeno atua por reduzir a biosíntese de prostaglandinas através da inibição não

seletiva das ciclooxigenases, inibindo tanto a ciclooxigenase 1 (COX-1) e a

ciclooxigenase 2 (COX-2) (RAO; KNAUS, 2008; HALEN et al., 2009) (Figura 6).

As prostaglandinas são hormônios sintetizados a partir de ácidos graxos, via

ácido araquidônico, e funcionam como mediadores fisiológicos e patológicos

implicados em vários processos, entre eles a dor, inflamação, câncer, glaucoma,

osteoporose, doença cardiovascular, estresse e asma (RAO; KNAUS, 2008).

29

Dessa forma ao inibir a formação das prostaglandinas, via inibição da Cox-2, os

AINEs desempenham seus efeitos analgésicos, antipiréticos e antiinflamatório

(DEWLAND; READER; BERRY, 2009). Porém em contrapartida, a inibição da atividade

da COX-1, altera dramaticamente a produção dos prostanóides, isoenzimas protetoras

da mucosa gástrica, reguladoras do fluxo sanguíneo e indutoras de agregação

plaquetária (MUSA; ERIKSSON, 2007).

Figura 6: Esquema simplificado da síntese de tromboxano e prostaglandinas, via

ciclooxigenase 1 e 2 respectivamente, mostrando a ação inibitória do ibuprofeno sobre

ambas as ciclooxigenases, e consequentemente sobre ambos os processos.

Fonte: arquivo do pesquisador

Em virtude das suas inúmeras aplicações na clínica humana e da sua venda não

necessitar de receituário médico, os AINEs de modo geral, e entre eles o ibuprofeno,

acabam sendo utilizados por longos períodos pela população humana.

Fato preocupante e que tem chamado a atenção dos pesquisadores, para

sintetizar novas formulações mais eficientes, pois a administração prolongada de

30

AINEs apresentam diversos efeitos colaterais indesejados, sendo os mais importantes

as irritações e ulcerações gastrointestinais, inicialmente atrelada apenas aos efeitos da

inibição da COX-1, mas relacionada a inibição de ambas as ciclooxigenases

(VONKEMAN; VAN DE LAAR, 2010; TAKEUCHI, 2012)

Além dos efeitos adversos que causam no organismo, as altas dosagens

utilizadas essas drogas já são facilmente detectáveis no meio ambiente, interferindo

em todo o contexto ambiental e estando cientificamente já relacionada a

desequilíbrios ambientais, por exemplo, em ambientes aquáticos (SARAVANAN et al.,

2012 Dado que reforça a necessidade e urgência de pesquisas que venham a diminuir

a dosagem necessária e maior eficiência da droga.

1.3 OBJETIVOS

1.3.1 Objetivo geral

Descrever através de métodos quânticos como ocorre a interação da albumina

de soro humano com o ibuprofeno.

1.3.2 Objetivos específicos

Quantificar, por meio de cálculos quânticos, a energia e a distância de interação

entre os aminoácidos e diferentes regiões do fármaco;

Avaliar o efeito da constante dielétrica na descrição e convergência energética

do sistema biológico;

Comparar a interação nos dois diferentes sítios de ligação

31

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34

Acesso em: 10.03.2012

35

2 TEORIA QUÂNTICA APLICADA À SIMULAÇÃO COMPUTACIONAL

Nesse capítulo será descrito de maneira breve o formalismo quântico

empregado nas simulações computacionais e que, portanto, fundamentam o método

utilizado neste trabalho.

Métodos que utilizam a mecânica quântica têm sido desenvolvidos ao longo

das últimas décadas e aplicados com sucesso no estudo das propriedades químicas

para moléculas de tamanho pequeno e médio (HE; MERZ, 2010).

O objetivo central da química quântica é resolver a equação de Schrödinger ou

alguma equação análoga de mecânica quântica. As soluções da equação de

Schrödinger descrevem o estado quântico de um sistema, possuindo a informação de

onde pode-se derivar outras propriedades físicas do sistema. De modo prático, a

resolução dessa equação é extremamente difícil e inviável muitas vezes, a depender do

número de elétrons envolvidos, sendo necessário o desenvolvimento de métodos de

aproximação (CASTRO; CANUTO, 2007).

Dentre as várias teorias que fundamentam métodos quânticos, nesse trabalho

foi utilizado a Teoria do Funcional da Densidade (DFT). Isso porque, os cálculos usando

DFT são geralmente muito mais precisos do que os métodos semi-empíricos, além

disso, permitem a aplicação de simulações em sistemas relativamente maiores, por

exemplo, modelos de sítios ativos da ordem de 100 átomos ou mais (LONSDALE;

RANAGHAN, MULHOLHAND, 2010).

Uma outra vantagem dessa teoria é a possibilidade de encontrar a densidade

eletrônica que minimiza a energia do sistema, para uma dada configuração nuclear.

Esse processo inicial minimiza os custos computacionais, pois, a densidade eletrônica é

resolvida de uma maneira simplificada, em dependência de apenas três coordenadas

espaciais, ao invés de 3N coordenadas, para N elétrons, como utilizam outros métodos

de mecânica quântica.

36

2.1 TEORIA DO FUNCIONAL DA DENSIDADE

A Teoria do Funcional da Densidade (DFT) do inglês, density functional theory,

nas últimas décadas vem se configurando como um dos principais métodos de estudo

da estrutura eletrônica de sólidos e moléculas.

Problemas que antes eram resolvidos através de métodos ab initio Hartree-

Fock ou pós-Hartree-Fock, são agora trabalhados usando-se o DFT, o que possibilita

maior concordância dos estudos teóricos com os dados experimentais disponíveis

(HOLTHAUSEN, 2001).

Parte desse atrativo da DFT está no fato de que sistemas de tamanho

moderado a grande, com mais de 20 átomos, podem ser estudados, com precisão

química aceitável, a um custo computacional bem menor daquele obtido utilizando-se

métodos correlacionados tradicionais, a exemplo da teoria de pertubação e coupled

cluster. Além disso, outro fator que vem impulsionando a utilização do DFT é o

desenvolvimento de funcionais de troca-correlação mais precisos e algoritmos

eficientes de integração numérica (DUARTE; ROCHA, 2007).

O uso da densidade eletrônica – ρ(r)- como variável básica na descrição de um

sistema eletrônico remonta ao início do século XX, quando Drude aplicou a teoria dos

gases a um metal, considerado como um gás homogêneo de elétrons, com o objetivo

de desenvolver a sua teoria sobre a condução térmica e elétrica (MORGON;

CUSTODIO, 2005).

Desde então, vários modelos foram propostos e aperfeiçoados, a exemplo

Drude, Sommerfeld, Thomas, Fermi, Dirac; até que o uso da densidade eletrônica

como variável básica foi rigorosamente legitimada com a publicação de dois teoremas

por Hohenberg e Kohn, em 1964, que forneceram os fundamentos da Teoria do

Funcional da Densidade moderna e fez com que Walter Kohn fosse agraciado com o

Prêmio Nobel de Química em 1998.

A partir do formalismo de Hohenberg e Kohn, conceitos importantes na

descrição química – tais como potencial químico, maciez e dureza, além dos princípios

dos ácidos e bases duros e macios de Pearson, e o da equalização da

37

eletronegatividade, de Sanderson, são definidos de uma maneira exata a partir dessa

teoria (DUARTE; ROCHA, 2007).

Em 1965, Kohn e Sham estabeleceram uma forma de contornar o problema de

se encontrar o funcional de energia cinética exato – o método KS- que permitiu assim,

realizar cálculos DFT. O desenvolvimento da metodologia computacional para fazer

cálculos DFT leva, invariavelmente, as equações matemáticas semelhantes às

equações Hartree-Fock-Roothan.

Contudo, diferentemente de ouitros métodos, a exemplo dos semi-empíricos,

que tentam tanto quanto possível, se aproximar do método Hartree-Fock, a DFT

relaciona-se com a solução exata do problema de muitos elétros e seus cálculos devem

ser interpretados à sua luz.

2.1.1 Teoremas de Hohemberg e Kohn

O primeiro teorema de Hohenberg-Kohn (HK) estabelece que o potencial

externo é um funcional único de ρ(r) além de uma constante aditiva. De uma forma

mais simples, esse teorema demonstra que a densidade eletrônica de um sistema

determina o potencial externo e o número de elétrons, N, e consequentemente,

o Hamiltoniano do sistema. No esquema abaixo está representada a interdependência

das variáveis básicas do teorema de HK.

Como a energia do sistema é calculada mediante a resolução da equação de

Schrodinger, HBOѱ = Eѱ, a energia de um sistema eletrônico é determinada pela

densidade eletrônica ρ(r), ou seja:

38

E = Ev*ρ+. (1)

O índice v é colocado para explicitar a dependência com o potencial externo

.

O segundo teorema estabelece que havendo qualquer aproximação da

densidade eletrônica ~

(r), de modo que ~

(r) ≥ 0 e ~

(r)dr = N, a energia total

será sempre maior ou igual a energia exata do sistema, ou seja:

E[ ~

+ ≥ E*ρ+ = E0, (2)

sendo E0 a energia fundamental do sistema.

Pode-se então definir um funcional universal

F = eVˆ , (3)

pois T e Ve aplicam-se universalmente a todos os sistemas eletrônicos.

Os dois teoremas de HK mostram como se pode determinar o estado

fundamental de um sistema com um dado potencial externo, usando-se a densidade

eletrônica tridimensional como variável básica, em vez de se utilizar a função de onda

de N-elétrons, que é muito mais complexa (DUARTE; ROCHA, 2007).

Para a maioria dos problemas químicos em que o cálculo da estrutura

eletrônica é requerido, o potencial externo é facilmente determinado, ou então, uma

aproximação razoável pode ser proposta a partir do conhecimento do sistema

químico.

O que se objetiva é a densidade eletrônica e as propriedades eletrônicas que

podem ser calculadas a partir dela. O segundo teorema de HK, fornece a estratégia

para se resolver esse problema: procura-se a densidade eletrônica de um determinado

sistema eletrônico com um dado potencial externo , utilizando-se o princípio

vibracional.

39

2.1.2 Equações de Kohn-Sham

Os teoremas de Hohenberg-Kohn possibilitam a abordagem de um sistema

usando a densidade eletrônica como variável básica. Contudo, esses teoremas não

estabelecem um procedimento para o cálculo de energias.

Para resolver o problema, em 1965, W. Kohn e L. J. Sham, propuseram um

conjunto de equações, denominadas, equações de Kohn-sham, através das quais

demostraram que existe uma equivalência entre as densidades eletrônicas do sistema

real e de um sistema modelo de elétrons não-interagentes (independentes)

submetidos ao potencial efetivo,Vef, que reproduz as condições do sistema interagente.

Dessa forma, obtém-se a densidade eletrônica desse sistema não-interagente e

a correlacionamos com o sistema real. A densidade pode ser expressa em termos dos

orbitais Ψi(r) para um elétron, que são conhecidos como os orbitais de Kohn-Sham.

, (4)

em que a soma é realizada para todos os N elétrons. Como não sabe-se a densidade

exata, de acordo com o segundo teorema de Hohenberg e Kohn, a energia será dada

pela equação abaixo:

. (5)

No esquema Kohn-Sham, a densidade eletrônica exata do estado fundamental

de um sistema de elétrons que interagem é gerada a partir da solução de um problema

40

auxiliar do sistema de elétrons que não interagem, definido para fornecer a mesma

densidade do estado fundamental.

As equações KS, assim como as equações Hartree-Fock, geram equações de um

elétron que descrevem sistemas de muitos elétrons. Além disso, as equações KS, em

princípio são exatas, uma vez que incorporam totalmente os efeitos da correlação

eletrônica – troca e correlação - e as soluções delas equivalem, formalmente, à

resolução exata do problema variacional da DFT.

2.2 APROXIMAÇÕES PARA ENERGIA DE TROCA E CORRELAÇÃO

Embora a Teoria do Funcional da Densidade, composta pelos teoremas de

Hohenberg-Kohn e pelas equações de Kohn-Sham, ser exata, essa teoria ainda não

consegue determinar com exatidão a Energia de troca e correlação (Exc), requerendo

uma aproximação para o tratamento das interações de troca e correlação eletrônicas

(DUARTE; ROCHA, 2007).

A energia de troca e correlação (Exc) contribui com uma pequena fração para a

energia total do sistema, mas, para uma descrição precisa de ligação entre átomos,

isso se torna crucial (PERDEW; BURKE; ERNZERHOF, 1996).

Ao longo dos anos têm sido desenvolvidas várias aproximações, com

complexidade crescente, que conferem cada vez mais precisão aos dados encontrados.

A primeira aproximação para energia de troca e correlação e com menor

complexidade é a aproximação da densidade local (LDA), do inglês, density local

approximation, proposta por Kohn e Sham em 1965 no mesmo artigo em que são

descritas as equações auto-consistentes.

A LDA está baseada no paradigma mais utilizado em Física do Estado Sólido, o

gás homogêneo de elétrons. Dessa forma, considera a energia de troca e correlação

para um sistema de densidade como sendo a energia de troca e correlação para um

gás de elétrons uniforme com a mesma densidade que é conhecida de forma precisa.

Além disso, nessa aproximação, a energia de troca e correlação de um elétron em um

dado ponto depende da densidade eletrônica nesse ponto, ao invés de depender da

41

densidade eletrônica em todos os pontos do espaço (DUARTE; ROCHA, 2007; LEACH,

2001).

A LDA é muito utilizada no estado de sólidos metálicos, pois além de eficiente,

possui um baixo custo computacional. Contudo, para átomos e moléculas com

distribuição eletrônica é altamente não-homogênea, torna-se uma péssima

aproximação.

Na tentativa de corrigir os erros proveniente da não-homogeneidade da

densidade eletrônica no espaço, principalmente em sistemas biológicos, nos quais não

se verifica a homogeneidade necessária para a utilização do LDA, outras aproximações

foram propostas.

Um avanço foi introduzir a dependência com o gradiente da densidade na

expressão do funcional levando a origem da aproximação do gradiente generalizado

(GGA), do inglês, Generalized Gradient Approximation.

Embora o uso do GGA melhore consideravelmente a descrição das ligações, em

especial as ligações de hidrogênio, sem que haja um aumento proibitivo do custo

computacional, a descrição de ligações fracas, a exemplo das interações de van der

Waals ainda permanece problemática (MORGON; CUSTODIO, 1995).

Existem também os funcionais híbridos assim denominados por

corresponderem a uma mistura do termo de troca de Hartree-Fock no funcional de

troca da DFT, a partir de dados experimentais para sistemas moleculares conhecidos,

contendo parâmetros ajustáveis. Os funcionais híbridos mais conhecidos são: PBE,

BLYP, BP86, B3LYP e PW91.

Como se pode perceber a grande vantagem do DFT é a implementação

computacional eficiente da correlação eletrônica, que possibilita serem os sistemas

complexos razoavelmente bem descritos. Além disso, com o DFT é possível calcular

propriedades elétricas, magnéticas, estruturais e químicas, como potencial químico,

eletronegatividade, geometria molecular no equilíbrio, ligações químicas, gradientes

de energia, espectros vibracionais entre outros, a partir da sua densidade eletrônica

(DUARTE, 2001).

42

REFERÊNCIAS

DUARTE, H. A. D. Índices De Reatividade Química A Partir Da Teoria Do Funcional De

Densidade: Formalismo e Perspectivas. Química Nova, v. 24, p. 501-508, 2001.

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PERDEW, J. P.; BURKE, K.; ERNZERHOF, M. Generalized Gradient Approximation Made

Simple. Physical Review Letters, v. 77, 3865-3868, 1996.

43

3 MATERIAL E MÉTODO

Esse capítulo abordará os aspectos metodológicos utilizados nesse trabalho e

sempre que necessário uma breve fundamentação teórica do método.

3.1 TIPOLOGIA DO ESTUDO

O estudo caracteriza-se como in silico, uma vez que todo o ambiente e

as moléculas foram analisados por simulações computacionais e interpretados com

base em cálculos quânticos.

3.2 OBTENÇÕES DAS ESTRUTURAS CRISTALOGRÁFICAS

O primeiro passo para o estudo in silico, consiste na obtenção de estruturas

cristalográficas, que serão utilizadas como inputs para a realização dos cálculos, e

estão disponíveis, gratuitamente, no site do Research Collaboratory for Structural

Bioinformatics – Protein Data Bank (PDB).

Atualmente no banco de dados da RCSB/PDB estão disponíveis sessenta e seis

imagens cristalográficas da albumina de soro humano, que pode ser encontrada em

sua forma livre, sem ligantes, (PDB Nº 1AO6, 1BMO, 1E78) ou complexada a diferentes

ligantes. Para esse estudo foi utilizado o PDB de n° 2BXG por corresponder à única

estrutura cristalográfica da ASH com o ibuprofeno (GHUMAN et al., 2005).

Para a elaboração da imagem cristalográfica Ghuman et al. (2005) utilizaram a

técnica de difração de raios-X, na qual um feixe de ondas eletromagnéticas incide no

cristal e interage com os elétrons dos átomos do cristais, estes entram em ressonância

com a radiação gerando ondas com a mesma energia da onda incidente e se

espalhando isotropicamente. As propriedades cristalográficas obtidas para a albumina

de soro humano estão apresentadas na tabela 1.

44

O PDB escolhido apresenta uma resolução de 2.70 Å e é formado por um

dímero de duas cadeias idênticas, nomeadas A e B. Nesse trabalho optou-se por

utilizar a cadeia A.

Tabela 1: Estatísticas de refinamento cristalográfico para diferentes ligantes associados

a Albumina de Soro Humano, com destaque para as propriedades do cristal que

contem o Ibuprofeno.

Fonte: Ghuman et al., 2005.

3.3 ESTADO DE PROTONAÇÃO DO LIGANTE

Levando-se em consideração que a interação do Ibuprofeno com a Albumina de

Soro Humano ocorre no sangue humano, fluído com pH fisiológico variando de 7,35 a

7,45, foi necessário realizar estudo sobre o estado de protonação do ibuprofeno para

confrontá-lo com o do cristal de Ghuman et al. (2005).

Para tal estudo foi utilizado o software Marvin Sketch 5.3.2, utilizando como

parâmetros a temperatura ambiente (306 K), adotando um padrão de duas casas

decimais para os valores da fração molar e o solvente simulado pela constante

dielétrica da água.

http://en.wikipedia.org/wiki/%C3%85

45

3.4 OTIMIZAÇÃO DOS HIDROGÊNIOS

Apenas cristais de alta resolução (menor do que 1,20 Å) oferecem suporte para

visualização dos átomos de hidrogênio, isso porque, os átomos de hidrogênio

apresentam grande mobilidade na cadeia proteica e por isso muitas vezes não são

identificados ou identificados de modo incorreto nos arquivos de coordenadas

cristalográficas. A fim de resolver tal situação, à estrutura inicial (PDB) foram

adicionados os hidrogênios em suas devidas posições, e todas as ligações foram

mantidas em ressonância, utilizando o software Materials Studio®.

Após a adição dos hidrogênios, os átomos não-hidrogênio, incluindo os do

ligante, são mantidos fixos, enquanto os átomos de hidrogênio serão otimizados

utilizando o módulo “forcite” do Materials Studio®.

Essa primeira otimização foi realizada utilizando-se mecânica clássica baseada

no campo de força COMPASS, do inglês Condensed-phase Optimized Molecular

Potentials for Atomistic Simulation Studies, tendo como tolerâncias de convergência

2,0 x 10-5 Kcal/mol para a variação total da energia, 1,0x10-3 Kcal Å-1 mol -1 para a força

máxima por átomo e 1,0 x 10-5 Å para o deslocamento atômico máximo.

A otimização de geometria de maneira clássica visa encontrar o estado de

equilíbrio o sistema, utilizando para isso a minimização da energia potencial do

sistema, a partir do ajuste das coordenadas atômicas.

O COMPASS consiste no primeiro campo de força ab initio de alta qualidade,

capaz de predizer com precisão e simultaneamente as propriedades de fase gasosa, a

exemplo das estruturais e vibracionais, e da fase condensada, como equações de

estado e energias de coesão, para uma variedade de moléculas covalentes, incluindo

produtos orgânicos e moléculas inorgânicas pequenas e polímeros (ACCELRYS, 2008).

A parametrização para essa técnica foi completamente validada usando vários

métodos de cálculo, incluindo métodos experimentais e dinâmicas moleculares

extensas de líquidos, cristais e polímeros (SUN, 1998; SUN et al., 1998; RIGBY et al.,

1998).

http://en.wikipedia.org/wiki/%C3%85

46

Para o cálculo da otimização foi utilizada a versão mais recente dessa técnica,

que superou o COMPASS 26 e COMPASS27, pela inclusão dos parâmetros para grupos

sulfatos e sulfonatos (ACCELRYS, 2008).

Figura 7: Imagens da Interface do software Materials Studio® com os parâmetros selecionados para o processo de otimização de geometria.

Fonte: Dados da Pesquisa

3.5 ESTABELECENDO OS LIMITES DO SÍTIO DE LIGAÇÃO

Após a determinação do centroide (centro de massa) do ibuprofeno, foram

traçados raios crescentes em direção ao interior da proteína. O primeiro raio com

47

resíduo presente corresponde a 3,0 Å para o primeiro sítio de ligação, aqui

denominado de I-FA3 e de 4,0 Å para o segundo sítio, denominado I-FA6. A partir

desses raios continuou-se avaliando a energia de ligação dos resíduos presentes em

raios crescentes até os 12,0 Å, no qual se observou a convergência da energia do

sistema para os dois sítios de ligação. A convergência energética do sistema foi

observada quando o valor da energia total de um raio variou menos de dez por cento

quando comparada a energia total do raio anterior.

Dessa forma, para os dois sistemas foi necessário varrer 12,0 Å do centro de

massa do ibuprofeno, o que resultou em 65 aminoácidos para o sítio I-FA3 e 48

aminoácidos para I-FA6.

3.6 DETERMINANDO A ENERGIA DE INTERAÇÃO

Para o cálculo da energia de interação foi utilizado o método de fragmentação

molecular com capas conjugadas (MFCC) que consiste na decomposição dos

aminoácidos em fragmentos, onde a esses são adicionados capas para manter a

valência do fragmento estudado (ZHANG; ZHANG, 2003).

Este método tem sido aplicado para a obtenção das energias de interação de

proteínas com água (ZHANG; CHEN; ZHANG, 2003), drogas (ZHANG et al., 2004; XIANG;

ZHANG; ZHANG, 2004) e DNA com ligantes (CHEN; ZHANG, 2004).

Usando essa abordagem, a energia de interação de uma proteína e uma dada

estrutura pode ser obtida por cálculo de mecânica quântica das energias de interação

entre a molécula e fragmentos de proteínas individuais e seus capas conjugadas (HE;

ZANG, 2005; CHEN; ZHANG, 2007).

A energia de interação E(Li−Ri) entre a molécula do ligante (Li) e o resíduo de

aminoácido (Ri), é dada por:

E (L − Ri) = [E1 - E2] - [E3 - E4] (6)

E (L − Ri) = [E (Li − CiRiCi*) − E(CiRiCi*)] – [E(Li − CiCi*) - E(CiCi*)]

48

Onde: Ci corresponde às capas conjugadas que estão acopladas ao resíduo pelo

grupamento amina e Ci* pelo carboxil.

Dessa forma, em um primeiro momento são realizados cálculos levando em

consideração cada aminoácido e em seguida é feito o somatório das energias dos

aminoácidos presentes em um mesmo raio. Como forma de manter a valência de cada

aminoácido tornando os cálculos mais fidedignos, para cada aminoácido foi utilizada

como blindagem os aminoácidos vizinhos ao resíduo de interesse e esses representam

as capas.

Na literatura não há um número rígido para a quantidade de resíduos que

devem funcionar como capas. Após vários testes, observou-se que para a proteína em

estudo, em virtude do grande número de aminoácidos carregados, foram necessários

cinco resíduos compondo a capa para normalizar os valores encontrados. Sendo assim,

para cada aminoácido analisado, também incluimos nas simulações os seus cinco

vizinhos à direita e os cinco resíduos vizinhos à esquerda.

No lado direito da Eq. (1), o termo E(Li − CiRiCi*) corresponde a energia total do

sistema formado pelo ligante e pelo resíduo com as capas do lado carboxil (Ci*) e do

lado amino terminal (Ci) do aminoácido; o termo E(CiRiCi*) refere-se a energia do

resíduo com as capas conjugadas; o terceiro termo E(Li − CiCi*) é a energia total do

sistema sem a energia do resíduo e por fim, por fim o quarto termo corresponde a

energia formada pelo conjunto de capas. A figura 8 apresenta um esquema das etapas

necessárias para o cálculo da energia.

A energia total de cada ligante é obtida somando as energias de ligação de cada

um dos resíduos de aminoácidos levados em consideração na definição do sítio ativo.

Após o cálculo da energia individual, também foi calculado a distância de cada resíduo

(Ri) ao ibuprofeno, a fim de se conhecer os grupos atômicos envolvidos nas interações

moleculares.

49

Figura 8: Representação gráfica para as equações envolvidas no cálculo da energia de

interação entre o resíduo (Ri), em vermelho, e o fármaco ou ligante (Li), em laranja,

através da utilização das capas, constituídas de cinco aminoácidos à direita, em verde,

Ci*, e à esquerda, em azul Ci.


3.7 SIMULAÇÃO COMPUTACIONAL

Após a otimização da estrutura inicial, e preparação das estruturas com base no

método do MFCC, a segunda otimização foi realizada utilizando-se o módulo Dmol3 do

software Materials Studio®, que utiliza parâmetros da Teoria do Funcional da

Densidade (DFT).

Todos os cálculos de otimização com Dmol3, foram realizados com script

desenvolvido especificamente para esse fim, permitindo a definição de diferentes

parâmetros conforme mostrado na figura 9.

O DFT foi escolhido, tendo em vista sua melhor acurácia para descrição de

estruturas eletrônicas de sólidos e moléculas, com número de átomos superior a vinte,

com precisão química aceitável e custo computacional, muitas vezes, equivalente a

50

uma fração do que era obtido com outros métodos tradicionais a exemplo do Hartree-

Fock e pós Hartree-Fock (DUARTE; ROCHA, 2007).

Figura 9: Imagem da tela do script, mostrando a configuração dos parâmetros e as categorias escolhidas, vermelho e azul respectivamente. Os parâmetros antecedidos pelo símbolo #, em verde, não foram selecionados para as otimizações.

Fonte: Dados da Pesquisa

Para maior exatidão na descrição energética do sistema, foi utilizada a

aproximação de gradiente generalizado (GGA). Porém, a forma exata da Exc não é

conhecida e pode nunca ser, em uma fórmula matemática fechada. Portanto, desde o

aparecimento da DFT, tipos de aproximações para Exc têm sido utilizados. Existem

muitos funcionais de aproximação com níveis de complexidade variáveis.

51

O módulo do Dmol3 permite a utilização de duas formas de aproximação para

esses cálculos, contudo foi utilizado a aproximação do gradiente generalizado (GGA)

com o funcional PBE, em detrimento da aproximação de densidade local (LDA), pelo

fato de em sistemas com densidade eletrônica (ρ) heterogênica, a exemplo dos

sistemas biológicos, os cálculos baseados no LDA não oferecerem precisão, levando a

erros de forma não-sistemática, nos comprimentos e energias de ligação e o GGA, em

contrapartida, oferece um avanço nos cálculos por introduzir a dependência com o

gradiente da densidade ρ(r) na expressão do funcional (PERDEW; BURKE; ERNZERHOF,

1996; DUARTE; ROCHA, 2007).

Para garantir a qualidade da descrição das energias atômicas, o programa foi

configurado na precisão Fine durante a integração numérica da Hamiltoniana do

sistema. Além disso, não foi considerada a simetria nos cálculos e utilizada a carga

formal do sistema e com multiplicidade automática.

Forças não covalentes, tais como ligações de hidrogênio e interações de van der

Waals, são cruciais para a formação, a estabilidade e função das biomoléculas e

materiais, contudo, atualmente a sua exata contabilização só é realizada mediante

funções de alto nível quântico ou pelo método de Monte Carlo. Como forma de

resolver as forças de dispersão para DFT, existem correções semi-empíricas a serem

empregadas durante os cálculos e que estão disponíveis no módulo Dmol3 (ACCELRYS,

2008). Das possibilidades apresentadas pelo programa, utilizou-se a correção Grimme,

por suportar um maior número de dispersão de átomos de maneira diferente

(GRIMME, 2006).

Para a expansão dos orbitais eletrônicos de Kohn-Sham foi utilizado o conjunto

de bases DNP, do inglês Doble Numerical Plus Polarization, levando em consideração

todos os elétrons explícitos e spin restritos. O DNP é muito preciso e comparável ao

conjunto de base gaussiano 6-311+G(3df,2pd), que apresenta funções de polarização,

difusão e eficaz correlação eletrônica (INADA; ORITA, 2008). E o número de interações

máximas por ciclos foi estabelecido em 1000.

A fim de tentar mimetizar o ambiente eletrostático no qual se encontra a

proteína in vivo, e estimar os efeitos energéticos, a exemplo da polarização

52

eletrostática, promovida pelo solvente não incluídos na estrutura cristalográfica, a

constante dielétrica foi levada em consideração nos cálculos (SCHUTZ; WARSHEL,

2001).

A constante dielétrica (ε) é implementada através do funcional COSMO, do

inglês Conductor-like Screening Model, o qual calcula a energia eletrostática e efeito de

polarização dos constituintes do sistema, por simular um meio contínuo, uniforme e

polarizável e que para o cálculo com proteínas deve-se estabelecer um valor

intermediário por volta de 40 (SCHUTZ; WARSHEL, 2001; WARSHEL et al., 2006).

Contudo, para efeito comparativo, empregamos constantes dielétricas de zero,

representando um meio não polarizável, e a constante dielétrica de quarenta,

representando um meio parcialmente polarizável.

53

REFERÊNCIAS

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Phys. V. 119, n.7, 2003.

55

Aminoácidos polares

ácidos

4 BIOQUÂNTICA DA INTERAÇÃO DO IBUPROFENO COM A ALBUMINA DE SORO

HUMANO

As proteínas correspondem a um polímero de aminoácidos formados por meio

de ligações peptídicas entre o grupamento carboxil de um aminoácidos e o

grupamento amina do aminoácido subsequente, com a liberação de uma molécula de

água. Na natureza, existe uma diversidade de vinte aminoácidos, subdivididos em

hidrofóbicos, polares neutros e polares carregados, que se combinam em diferentes

proporções para formar as diferentes moléculas proteicas existentes (DAVID;

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