A inabilidade de células TCD4 + Stat3 -/- de acumular em condições linfopênicas e homeostática...

A inabilidade de células TCD4+ Stat3-/- de acumular em condições linfopênicas e homeostática pode ser devido a

menor proliferação, aumento da apoptose ou ambos?

Rag2-/-

Controle: Stat3fl/fl

(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl

TCD4+ naïve marcadas

CFSE

5, 7, 9 e 14d• Linfonodos Mesentéricos• Baço

FACS CFSE+

86,4

39,281,7

98,11

STAT3 influencia, portanto, no potencial de proliferação de TCD4+.

Já a ausência de Stat3 atrasa mas não impede a proliferação celular.

anti-CD3, anti-CD28IL-6 ou IL-21

72h

FACSAnnexin-V/PI



TCD4+ naïve

STAT3 além de influenciar na proliferação de TCD4+, regula também a sobrevivência de células T.

A inabilidade de células TCD4+ Stat3-/- de acumular em condições linfopênicas e homeostática pode ser devido a

menor proliferação, aumento da apoptose ou ambos?

STAT3 regula então quais genes envolvidos no controle de sobrevivência e proliferação?



TCD4+

Baço e linfonodosTCD4+ naïve

CD4+CD44-CD62L+

anti-CD3, anti-CD28IL-6, TGF-β,

anti-IL-2, anti-IL-4 e anti-IFN-γ

72h

IL-6

1h

ChIP-Seqanti-pSTAT3anti-H3K4Me

Regulação gênica



TCD4+

Baço e linfonodosTCD4+ naïve

CD4+CD44-CD62L+

anti-CD3, anti-CD28IL-6 e/ou TGF-β,

anti-IL-2, anti-IL-4 e anti-IFN-γ

72h

IL-6

1h

MicroarrayPCR em Tempo Real

STAT3 é importante para na regulação de genes envolvidos no controle de sobrevivência e proliferação, mas não é o único

fator.

Expressão gênica

STAT3 regula então quais genes envolvidos no controle de sobrevivência e proliferação?

Conclusões

STAT3 é essencial para é essencial para a diferenciação de células Th17, in vivo, no modelo de colite e, na sua ausência as células T tendem

a diferenciarem-se em Treg;

Na diferenciação para Th17, STAT3 é tanto fator de transcrição, quanto regulador transcricional;

STAT3 tem papel importante na proliferação de células TCD4+ durante respostas inflamatórias;

Entretanto STAT3 é não essencial para expansão homeostática de células TCD4+, devendo, portanto, atuar em comunhão com outros

fatores de transcrição.

ObjetivoObjetivo

Determinar a participação de STAT3 no desenvolvimento de Th2, através da avaliação da produção de citocinas e expressão de fatores de transcrição.

Determinar a participação de STAT3 no desenvolvimento de Th2, através da avaliação da produção de citocinas e expressão de fatores de transcrição.

STAT3 é ativado durante diferenciação de Th2?


WT Stat3CD4-/-

Anti-CD3 eAnti-CD28 +

IL-4 anti-INF-γ

Citometria

TCD4 naive

Anti-Phospho-STAT3

e STAT6

Céls. T TCR transgênicas

Anti-CD3 ou OVA+APCAnti-

Phospho-STAT3 e STAT6

Citometria

STAT3 é fosforilado durante diferenciação de células Th2.STAT3 é fosforilado durante diferenciação de células Th2.



DO11.10

Quais citocinas participam da ativação de STAT3 durante diferenciação de Th2?

Quais citocinas participam da ativação de STAT3 durante diferenciação de Th2?

WT

Anti-CD3 e anti-CD28 AcsBloqueio+ 5 dias ELISA

4 dias FACs

IL-2, IL-6 e IL-21 participam na ativação de STAT3 durante diferenciação de células Th2 (uma vez que o bloqueio das

mesmas prejudica a expressão de citocinas Th2)

IL-2, IL-6 e IL-21 participam na ativação de STAT3 durante diferenciação de células Th2 (uma vez que o bloqueio das

mesmas prejudica a expressão de citocinas Th2)

TCD4 naive

WT Stat3CD4-/-

Anti-CD3 e Anti-CD28 + IL-4 e anti-INF-γ

5 dias1x106

céls

reestimuladas

Anti-CD3/24h

ELISA

TCD4 naive

STAT3 é requerido na diferenciação de Th2?STAT3 é requerido na diferenciação de Th2?

STAT3 é importante na diferenciação de Th2STAT3 é importante na diferenciação de Th2

WT Stat3CD4-/-

TCD4 naive

Anti-CD3 RNAqPCR

STAT3 é requerido na diferenciação de Th2?STAT3 é requerido na diferenciação de Th2?

STAT3 é requerido para expressão de fatores de transcrição?

STAT3 é requerido para expressão de fatores de transcrição?

WT Stat3CD4-/-

Diferenciação céls RNA

qPCR

Isolamento célsDiferentes dias

Expressãogênica

STAT3 é requerido para a expressão de fatores de transcrição.

STAT3 é requerido para a expressão de fatores de transcrição.

TCD4 naive

WT Stat3CD4-/-

Diferenciação ou não de céls

ImunoprecipitaçãoCromatina (ChIP)

STAT3 é requerido para expressão de fatores de transcrição (está envolvido nas modificações do

DNA)?

STAT3 é requerido para expressão de fatores de transcrição (está envolvido nas modificações do

DNA)?

H3K4me3H3K36me3 Ativação gênica

H3K17me3-Inibição gênica

TCD4 naive

qPCR

Este resultado sugere que Stat3 tem um papel na prevenção destas modificações

Este resultado sugere que Stat3 tem um papel na prevenção destas modificações

WTChIP

TCD4 naive

Anticorpo controle

Anticorpos STAT3

qPCR

STAT3 é requerido para expressão de fatores de transcrição (interage com o

DNA)?

STAT3 é requerido para expressão de fatores de transcrição (interage com o

DNA)?

WT Stat3CD4-/-

Diferenciação5 dias

Isola núcleo Digestão c nuclease

10 min*

qPCR

STAT3 é requerido para expressão de fatores de transcrição (afeta acessibilidade

com a cromatina)?

STAT3 é requerido para expressão de fatores de transcrição (afeta acessibilidade

com a cromatina)?

* Nuclease cliva o DNA em pontos acessíveis que tem modificações ativas na transcrição.

TCD4 naive

Stat3 interage com o DNA e a acessibilidade com a cromatina é diminuída.

Stat3 interage com o DNA e a acessibilidade com a cromatina é diminuída.

WT Stat3CD4-/-

Diferenciação

2 diasTrandução c

CT, Batf ou Maf c expressão de retrovírus

Reestimulação

Anti-CD3 por 24h

ELISA

Maf e Batf provavelmente representam alvos de STAT3 durante desenvolvimento de Th2,

e os defeitos na produção de citocinas Th2 na ausência de STAT3 são resultados de efeitos downstream dos fatores de transcrição.

Maf e Batf provavelmente representam alvos de STAT3 durante desenvolvimento de Th2,

e os defeitos na produção de citocinas Th2 na ausência de STAT3 são resultados de efeitos downstream dos fatores de transcrição.

A transdução de alguns fatores de transcrição para o Stat3CD4-/- resulta na “recuperação”da produção de citocinas?

A transdução de alguns fatores de transcrição para o Stat3CD4-/- resulta na “recuperação”da produção de citocinas?

TCD4 naive

STAT3 ativado é capaz de restaurar a produção de citocinas de padrão Th2?STAT3 ativado é capaz de restaurar a produção de citocinas de padrão Th2?

TCD4 naive 48hAtivadas

TransduçãoCom C ou STAT3C

5 diasReestimuladasAnti-CD3/24h ELISA

Mutantes para STAT constitutivamente ativos

STAT3 e STAT6 cooperam na produção de citocinas de padrão Th2?

STAT3 e STAT6 cooperam na produção de citocinas de padrão Th2?

48h sob condições Th1

Transdução com C,

STAT6VT, STAT3C ou

ambos

5 diasReestimuladas

Anti-CD3/24h ELISATCD4 naive

Mutantes para STAT constitutivamente ativos

WT STAT6VT STAT6VTStat3Cd4-/-

TCD4 isoladas do baço de:

Anti-CD3 por 24h

ELISA

Estes resultados demonstraram que STAT3 e STAT6 cooperam na produção de citocinas de padrão Th2

Estes resultados demonstraram que STAT3 e STAT6 cooperam na produção de citocinas de padrão Th2

STAT3 e STAT6 cooperam na produção de citocinas de padrão Th2 in vivo?

STAT3 e STAT6 cooperam na produção de citocinas de padrão Th2 in vivo?

WT Stat3CD4-/-

TCD4 naive

Anti-CD3 e anti-CD283 dias

Sob condiçõesTh2

qPCR

STAT3 atua sobre os genes alvo de STAT6?STAT3 atua sobre os genes alvo de STAT6?

ChIP-anti-STAT6


TCD4 isoladas de:

reestimuladasAnti-CD3 6 h

Estes resultados sugerem que STAT3 facilita a habilidade de STAT6 ligar aos genes alvo e na indução da expressão de fatores de

transcrição.

Estes resultados sugerem que STAT3 facilita a habilidade de STAT6 ligar aos genes alvo e na indução da expressão de fatores de

transcrição.

STAT6 foi capaz de induzir expressão de fatores de transcrição na ausência de

STAT3?

STAT6 foi capaz de induzir expressão de fatores de transcrição na ausência de

STAT3?

RNA

qPCR

WT Stat3CD4-/-

Imunização

OVA e Alum BAL

Desafios intranasaisContagem

FACs

STAT3 é requerido in vivo para diferenciação de Th2 na inflamação

alérgica?


alérgica?

2 semanas após2seg imunização

BAL eSobrenadante de cultura

Esplenócitos

OVA por 72h

ELISAWT Stat3CD4-/-


alérgica?


alérgica?


Blefarite e dermatite alérgica

Eosinófilos do BAL

STAT3 é requerido na inflamação alérgica in vivo?



Pulmão

Hematoxilina-eosina

Estes resultados demonstraram que a perda de STAT3 em células T protege o camundongo do desenvolvimento de doenças

inflamatórias mediadas por Th2.

Estes resultados demonstraram que a perda de STAT3 em células T protege o camundongo do desenvolvimento de doenças

inflamatórias mediadas por Th2.



Conclusão

STAT3 STAT6

IL-2

IL-4

IL-6/IL-21/IL-2

STAT5

STAT6

STAT3

Th2

Proteção contra doenças inflamatórias

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