A INFECÇÃO EXPERIMENTAL PELO Trypanosoma cruzi …‡ÃO... · Ás técnicas do laboratório Ana...
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Vívian Paulino Figueiredo A INFECÇÃO EXPERIMENTAL PELO Trypanosoma cruzi AGRAVA O DESENVOLVIMENTO DE LESÕES ATEROSCLERÓTICAS EM CAMUNDONGOS APOE -/- Ouro Preto Março de 2012
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Vívian Paulino Figueiredo
A INFECÇÃO EXPERIMENTAL PELO Trypanosoma cruzi AGRAVA O
DESENVOLVIMENTO DE LESÕES ATEROSCLERÓTICAS EM
CAMUNDONGOS APOE-/-
Ouro Preto
Março de 2012
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - NUPEB
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
A INFECÇÃO EXPERIMENTAL PELO Trypanosoma cruzi AGRAVA O
DESENVOLVIMENTO DE LESÕES ATEROSCLERÓTICAS EM
CAMUNDONGOS APOE-/-
Vívian Paulino Figueiredo
Orientador: Prof Dr. André Talvani
Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação
em Ciências Biológicas do núcleo de pesquisas em
Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro
Preto, como parte integrante dos requisitos para
obtenção do título de mestre em Ciências Biológicas,
área de concentração: Imunologia de protozoários.
Ouro Preto
Março de 2012
Catalogação: [email protected]
F475i Figueiredo, Vivian Paulino.
A infecção experimental pelo Trypanosoma cruzi agrava o desenvolvimento
de lesões ateroscleróticas em camundongos apoE-/- [manuscrito] / Vivian Paulino
Figueiredo – 2012.
70 f.: il., color; grafs.; tabs.
Orientador: Prof. Dr. André Talvani.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto
de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas.
Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas.
Área de concentração: Imunobiologia de Protozoários.
1. Trypanosoma cruzi - Teses. 2. Aterosclerose - Teses. 3. Doença de Chagas -
Teses. 4. Apolipoproteína E (ApoE) - Teses. I. Universidade Federal de Ouro
Preto. II. Título.
CDU: 616.937:616.13-004.6
“Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina.”
Cora Coralina
Dedicatória
IV
A minha mãe Altair e meus irmãos Anderson,
Alessandro e Leiliane pelo amor e doação.
Vocês são a razão do meu viver.
Dedicatória
V
Agradeço a Deus por estar ao meu lado.
Á minha mãe Altair, pelo amor, doação e sensibilidade. Aos meus irmãos Anderson,
Leiliane e Alessandro, pela amizade e apoio. Amo muito todos vocês!
Ao professor André Talvani, meu orientador, pelos ensinamentos, amizade, carinho,
gentileza, suporte e por estar sempre presente.
Aos professores Maria Terezinha Bahia, Maria do Carmo Gouveia Pelluzio e Wanderson
Geraldo de Lima pelos ensinamentos e colaboração neste trabalho.
As minhas amigas e amigos do laboratório de doença de Chagas e Patologia, em especial
Maíra, Tassiane, Magna, Guilherme, Isabel, Gleisiane e Kelvinson, pela amizade, ajuda e
bons momentos!
A Laís e Diógenes pela amizade e colaboração no trabalho.
Aos meus amigos de Ouro Preto, em especial, Mariana, Lívia, Victor, Francisco, Áurea,
Luciana e Carlinhos pela companhia e amizade.
Aos recentes professores Girley Francisco Machado de Assis e Ivo Santana Caldas, pelo
bom humor e apoio.
Aos professores Marta de Lana, Evandro Machado e aos demais professores do Nupeb
pelos conhecimentos transmitidos.
Ás técnicas do laboratório Ana Salomé, Daniela e Ludmilla, pela ajuda e disposição.
Aos amigos de Ouro Branco, muitas saudades.
Ao laboratório de Bioquímica Nutricional da UFV, pelo auxílio e colaboração neste
trabalho.
Aos laboratórios da UFOP, por disponibilizar reagentes e equipamentos quando
necessários.
Ao Tiago que mesmo distante, me apóia em tudo que eu faço.
A CAPES pela concessão da bolsa.
Enfim a todos que contribuíram direta e indiretamente para a realização deste trabalho.
Sumário
________________________________________________________________________________
VI
1.0. Introdução......................................................................................................................12
1.1. O Trypanosoma cruzi: aspectos biológicos e infecção......................................12
1.2. A doença de Chagas: epidemiologia e caracterização.......................................14
1.3. Resposta inflamatória na infecção pelo Trypanosoma cruzi.............................15
1.4. A aterosclerose: aspectos gerais e caracterização.............................................18
1.5. A aterosclerose na doença de Chagas.................................................................20
2.0. Objetivos.................................................................................................................. ......23
2.1. Objetivo geral.....................................................................................................23
2.1. Objetivos específicos..........................................................................................23
3.0. Material e Métodos........................................................................................................24
3.1. Animais..............................................................................................................24
3.2. Infecção e parasitemia........................................................................................24
3.3. Quantificação dos níveis de colesterol total, triglicerídeos e HDL
plasmáticos............................................................................................................................25
3.4. Quantificação dos níveis de lipídeos totais, colesterol total e triglicerídeos
hepáticos................................................................................................................................25
3.5. Quantificação dos níveis de lipídeos totais e colesterol total fecal....................26
3.6. Ensaio imunoenzimático – ELISA.....................................................................26
3.7. Histologia...........................................................................................................27
3.7.1. Análise histopatológica e morfométrica do coração............................27
3.7.2. Área de ninhos de amastigota..............................................................28
3.7.3. Análise histopatológica e morfométrica das lesões aórticas...............29
3.8. Análise estatística dos dados..............................................................................30
Sumário
________________________________________________________________________________
VII
4.0. Resultados.................................................................................................................31
4.1. Mortalidade e parasitemia.............................................................................31
4.2. Variação do peso corporal.............................................................................33
4.3. Relação entre o peso do fígado e o peso corporal.........................................34
4.4. Dosagem de colesterol total, HDL e triglicerídeos plasmáticos..................35
4.5. Dosagem de lipídeos totais, colesterol total e triglicerídeos hepáticos.......36
4.6. Dosagem de lipídeos totais e colesterol total fecal.......................................38
4.7. Dosagem plasmática de MCP1 (CCL2) e RANTES (CCL5).......................39
4.8. Análise morfométrica e morfológica do coração..........................................40
4.9. Análise do parasitismo cardíaco....................................................................43
4.10. Aspecto histológico da aorta.......................................................................44
4.11. Quantificação de colágeno nas lesões aórticas............................................46
5.0. Discussão..................................................................................................................49
6.0. Conclusão..................................................................................................................57
7.0. Referências bibliográficas.........................................................................................58
Lista de Figuras
VIII
Figura 1. Curva de parasitemia.........................................................................................31
Figura 2. Curva de sobrevivência.....................................................................................32
Figura 3. Avaliação do colesterol total, triglicerídeos e HDL plasmáticos.....................36
Figura 4. Avaliação de lipídeos totais, colesterol total e triglicerídeos hepáticos..........37
Figura 5. Avaliação de lipídios e colesterol total fecal.....................................................38
Figura 6. Síntese de MCP-1-CCL2 e RANTES-CCL5....................................................39
Figura 7. Análise histopatológica do coração...................................................................41
Figura 8. Análise morfométrica da celularidade cardíaca................................................42
Figura 9. Parasitismo cardíaco.........................................................................................43
Figura 10. Aspecto histopatológica da aorta....................................................................45
Figura 11. Área da lesão aterosclerótica na aorta............................................................46
Figura 12. Aspecto Histológico do conteúdo de colágeno...............................................47
Figura 13. Quantificação de colágeno das lesões na aorta...............................................48
Lista de Tabelas
IX
Tabela 1. Média de peso de animais da linhagem C57BL6 selvagem ou apoE -/-, não
infectados, infectados com as cepas Berenice 78 (Be 78) e Colombiana do Trypanosoma
cruzi durante quatro semanas ...............................................................................................33
Tabela 2. Média da relação entre o peso do fígado e o peso corporal dos animais da
linhagem C57BL6 selvagem ou apoE -/- não infectados, infectados com as cepas Berenice
78 (Be 78) e Colombiana do Trypanosoma cruzi durante quatro semanas...........................34
Tabela 3. Média dos níveis de colesterol total, colesterol HDL e triglicerídeos dos animais
da linhagem C57BL6 selvagem ou apoE -/- antes da infecção..........................................35
Resumo
X
A resposta inflamatória sistêmica desencadeada por alguns agentes infecciosos exercem
efeitos pró-aterogênicos via produção e ação de mediadores inflamatórios sobre a parede
vascular. Nesse contexto, a infecção desencadeada pelo protozoário Trypanosoma cruzi
apresenta um caráter inflamatório responsável pelo desenvolvimento de inúmeras
manifestações cardiovasculares enquanto a aterosclerose, doença crônico-degenerativa,
também é capaz de ocasionar obstrução de artérias pelo acúmulo de lipídeos em suas
paredes através de um evento inflamatório local. A saber, a apolipoproteína E (apoE) é a
principal glicoproteína responsável pelo transporte e metabolismo de colesterol e
triglicerideos, sendo uma constituinte das lipoproteínas VLDL, HDL e quilomícrons. Neste
estudo avaliamos a interferência da apoE no desenvolvimento das lesões cardiovasculares
em camundongos C57BL/6 (n=28) e apoE knockout/ -/-
(n=28) com 10 semanas, infectados
pelas cepas Berenice 78 (Be 78) e Colombiana do T. cruzi. Avaliou-se diariamente a
parasitemia e semanalmente o peso dos animais. Antes e após 30 dias de infecção, coletou-
se sangue para dosagens bioquímicas (colesterol total, colesterol HDL e triglicérideos) e
imunológicas (CCL2/MCP-1 e CCL5/RANTES). Após a eutanásia, o fígado e as fezes
foram utilizados para extração e quantificação dos lipídeos totais e o arco aórtico,
juntamente com o tecido muscular cardíaco, para avaliações morfométricas. Observou-se
um menor período pré-patente nos animais selvagens (dia 9) em relação aos apoE-/-
(dia
12), sendo que nestes últimos a parasitemia foi menor para ambas as cepas estudadas. Não
houve diferença no peso dos animais entre os grupos, mas o colesterol total e os
triglicerídeos plasmáticos mostraram-se elevados no grupo apoE-/-
. Em relação à genética
do parasito, a cepa Be 78 nos animais apoE-/-
mostrou-se associada ao aumento dos lipídeos
fecais, enquanto a cepa Colombiana neste mesmo grupo apresentou-se associada a níveis
elevados de triglicérideos plasmáticos. Na análise plasmática de quimiocinas, verificou-se
elevada produção de CCL2 e CCL5 em todos os animais infectados, porém apenas com a
cepa Be 78, avaliada em animais apoE-/-
, houve uma redução dos níveis séricos de CCL5.
Observou-se aumento de células inflamatórias no tecido cardíaco, bem como de parasitos
teciduais, no grupo infectado com a cepa Colombiana. Em relação à aterogênese, o grupo
apoE-/-
infectado por esta cepa, apresentou maiores áreas de lesão e alterações no conteúdo
de colágeno. Estes dados sugerem que a infecção experimental pelo T. cruzi interfere no
desenvolvimento de lesões ateroscleróticas em camundongos apoE-/-
, assim como na
produção de mediadores inflamatórios plasmáticos e de alguns tipos lipídicos. A análise e
compreensão da interferência da apoE na patogênese cardíaca da doença de Chagas
associado à variabilidade genética do parasito constituirão importantes elementos para
estudos futuros envolvendo a resposta inflamatória cardiovascular.
Palavras chave: Trypanosoma cruzi, aterosclerose, apolipoproteína E................................
Abstract
XI
Inflammatory effects induced by photogenic organisms may exert pro-atherogenic effects
thought inflammatory mediators in the vascular walls. In this context, the protozoan
Trypanosoma cruzi is responsible for the development of inflammatory cardiovascular
events while atherosclerosis, a chronic degenerative disease, leads to clogged arteries, by
the accumulation of lipids in their walls, also induced by inflammatory events.
Apolipoprotein E (apoE) is a major glycoprotein responsible for the transport and
metabolism of cholesterol and triglycerides, being a constituent of VLDL, HDL, and
chylomicrons. This study evaluated the interference of apoE in the development of
cardiovascular lesions in C57BL/6 (n = 28) and C57BL/6 Apo E-knockout/-/-
(n = 28) at 10
weeks, infected with the Berenice-78 strains (Be 78) and Colombian of T. cruzi. Daily
parasitemia and weekly weight of animals were performed and, before and after 30 days of
infection, blood was collected by biochemical (total cholesterol, HDL cholesterol and
triglycerides) and immune (CCL2/MCP-1 and CCL5/RANTES) assays. After euthanasia,
liver and feces were used for extraction and quantification of total lipids and aortic arch and
cardiac muscles collected to morphometric analysis. There was a lower pre-patent period in
the wild group (9 days) compared to the apoE-/-
(12 days). There was no difference in
weight between the groups of animals and total cholesterol and triglycerides were elevated
in the group apoE-/-
. Regarding the genetics of parasite strain Be-78 animals in apoE-/-
, it
was associated with increased fecal lipids, while the Colombian strain in this same group
showed elevated levels of plasma triglycerides. In the analysis of plasma chemokines, there
was high production of CCL2 and CCL5 in all infected animals, but only with the Be 78
strain, evaluated in apoE-/-
animals, it was detected a reduction in plasma levels of CCL5.
The inflammatory infiltration and parasites in the infected cardiac tissues was observed
mainly in the group infected with Colombian strain. In relation to atherogenesis, apoE-/-
group infected with Colombian strain had larger lesions and changes in the collagen
content. These data suggest that the experimental infection with T. cruzi interferes with the
development of atherosclerotic lesions in apoE-/-
mice as well as in plasma production of
inflammatory mediators and some types of lipid. The analysis and understanding of the
interference of apoE in the pathogenesis of Chagas heart disease, as well as possible links
with the genetic variability of the parasite, constitute important elements for future studies
involving cardiovascular inflammatory response.
Key words: Trypanosoma cruzi, atherosclerosis, apolipoprotein E.
Introdução
12
1.0. Introdução
1.1. O Trypanosoma cruzi: aspectos biológicos e infecção
O Trypanosoma cruzi é um protozoário intracelular flagelado da ordem
Kinetoplastidae, sendo assim classificado por apresentar em sua estrutura interna uma
organela conhecida por cinetoplasto rica em DNA. Este parasito está entre os mais bem
sucedidos protozoários patogênicos em termos de sua diversidade populacional, virulência
e capacidade de infectar vários tipos celulares (Ramirez et al, 1998).
Seu desenvolvimento pode ser observado no triatomíneo e em células do hospedeiro
vertebrado infectado. O processo de adesão e invasão da célula hospedeira envolve a
participação de diversas moléculas de superfície do parasito ancoradas na membrana por
moléculas de GPI - glicosilfosfatidilinositol (Previato et al, 1985; Yoshida et al, 1989).
A população do T. cruzi é muito heterogênea, o que pode ser observado pela
diversidade de características encontradas entre diferentes cepas deste parasito (Brener e
Chiari, 1963; Brener, 1965). O parasito se apresenta com a morfologia característica de
amastigota, epimastigota, formas de transição e tripomastigota. Tripomastigotas
metacíclicas são as formas infectantes para o hospedeiro vertebrado. A presença de
tripomastigotas sanguíneos com diferentes morfologias já havia sido assinalado por Chagas
em 1909, que atribuiu ao fenômeno o significado de dimorfismo sexual. Essas formas
podem ter influência no desenvolvimento da doença, visto que foi demonstrado que formas
delgadas penetram mais rapidamente nas células do hospedeiro e são mais susceptíveis aos
mecanismos imunes, enquanto que as formas largas persistem por mais tempo no sangue
periférico, sendo portanto mais resistentes aos fatores imunológicos do hospedeiro (Brener,
1969).
Muitos estudos de caracterização biológica demonstram que as cepas do T. cruzi
possuem diferentes comportamentos em animais de laboratório, como níveis de
parasitemia, histiotropismo e indução de variadas taxas de mortalidade (Taliaferro e Pizzi
Introdução
13
1955; Deane et al, 1963; Andrade e Magalhães 1997). A combinação de vários fatores
como possível seleção de cepas e clones, fatores ambientais e imunológicos poderiam
explicar o comportamento biológico do parasito (Andrade et al, 1970; Bice e Zeledón 1970;
Magalhães et al 1996).
O T. cruzi possui uma grande diversidade genética, sendo estudado por diversos
marcadores. Em 1999 especialistas chegaram a um consenso propondo a unificação das
várias classificações existentes, dividindo as cepas de T. cruzi em dois grandes grupos, T.
cruzi I e T. cruzi II, que coincidem com a dicotomia isoenzimática proposta desde o final
dos anos setenta (Anonymous, 1999). A interação do parasita com o hospedeiro, os
processos de invasão e o desenvolvimento intracelular são importantes na determinação da
colonização dos tecidos (Andrade et al, 2010). Em estudos com camundongos inoculados
com a cepa Berenice 78, isolada por xenodiagnóstico de uma paciente, observou-se
polimorfismo com predomínio de formas largas (Lana e Chiari, 1986), sendo atualmente
pertencente a DTU IIb- “DiscreteTypingUnits” (Brisse, 2000; Zingales, 2009), com
tropismo para células cardíacas e esqueléticas (Tafuri e Brener, 1966). Semelhantemente, a
cepa Colombiana em camundongos (Federici et al, 1964), isolada por meio de hemocultura
de um caso humano na fase crônica da infecção na Colômbia, apresenta predomínio de
formas largas ao longo da infecção, tropismo muscular cardíaco e esquelético; apresenta
também altos picos de parasitemia entre 20 e 30 dias de infecção, sendo atualmente
pertencente a DTU I (Brisse, 2000; Zingales, 2009).
A infecção pelo T. cruzi é naturalmente iniciada na camada dérmica ou mucosa
conjuntival por tripomastigostas metacíclicas depositadas junto às fezes ou urina de
triatomíneos durante o seu repasto sanguíneo. Nos hospedeiros vertebrados o curso da
infecção é extremamente variável, sendo influenciado pelas características da população de
parasitas, comportamento do hospedeiro e fatores ambientais (Brener, 1979). Entretanto, o
T. cruzi pode ser transmitido ao homem por mecanismo alternativo, normalmente,
transfusão sanguínea, transmissão congênita, infecção acidental de laboratório, transplante
de órgãos e transmissão oral (Dias e Brener, 1984; Brener 1984; Brener, 1989; Dias, 1992;
Introdução
14
Dias et al, 2008 e 2009; Nobrega et al, 2009), talvez esta última a forma mais primitiva de
transmissão, ocasionando assim a doença de Chagas.
1.2. A doença de Chagas: epidemiologia e caracterização
A doença de Chagas (DC) constitui ainda um sério problema de saúde na América
Latina, causando aproximadamente 10 mil mortes por ano. Estima-se que 10 milhões de
pessoas estejam infectadas em todo o mundo (WHO, 2010). A distribuição geográfica da
infecção chagásica, incluindo os seus reservatórios e seus vetores (triatomíneos
hematófagos – “barbeiros”), estende-se desde o sul dos Estados Unidos até o sul da
Argentina, onde cerca de 90 milhões de pessoas encontram-se expostas à infecção (Coura e
Dias, 2009).
A incidência da DC tem reduzido devido às campanhas de saúde pública para
erradicação do vetor e do melhor controle de qualidade das transfusões de sangue e
derivados (Moncayo, 2003 e 2009). Atualmente a questão prioritária está voltada para o
contingente de pessoas já infectadas pelo T. cruzi (Medei et al, 2008).
A doença de Chagas é dividida em duas fases, aguda e crônica, podendo ser
sintomática ou não. A fase aguda é marcada pela presença de tripomastigotas no sangue do
paciente e possui duração variável tanto na infecção humana quanto na experimental (Prata,
1994). As manifestações clínicas da fase aguda da doença em humanos iniciam 6 a 10 dias
após a inoculação, podendo permanecer por 6 a 8 semanas. Frequentemente, certas
manifestações de porta de entrada podem estar presentes na conjuntiva ocular e na pele. As
manifestações sistêmicas podem incluir febre, edema, linfadenopatia, alterações
eletrocardiográficas e aumento da área cardíaca (Brener, 1987). Após a fase aguda, a
maioria dos indivíduos infectados pelo T. cruzi é conduzida para uma fase latente da
doença, também conhecida como forma crônica indeterminada, permanecendo sem
manifestação clínica detectável por décadas ou pela vida toda. Por outro lado, outros
indivíduos podem, imediatamente após a fase aguda ou após a forma crônica
indeterminada, desenvolver sintomas e sinais clássicos (aproximadamente 35% dos
Introdução
15
indivíduos crônicos) como taquiarritmias, bradiarritmias, alterações no sistema nervoso
autonômico, alterações na motilidade esofágica e intestinal (quadro de megaesôfago e
megacólon) e eventos progressivos cardiovasculares levando ao quadro conhecido como
cardiopatia chagásica crônica (Rocha et al, 2007). Essa cardiopatia apresenta um caráter
inflamatório progressivo, fibrosante e debilitante, afetando o arcabouço estrutural e a
funcionalidade do coração.
O quadro inflamatório nos diversos órgãos de acometimento apresenta relação
direta com a presença de parasitos (ruptura dos ninhos de amastigotas) e com a
predominância de células mononucleares próximas das células parasitadas rompidas
(Andrade et al, 2000). A resposta inflamatória após a infecção pelo parasito é essencial para
a resistência do hospedeiro (eliminação do parasito), mas também torna-se primordial para
a geração dos eventos patológicos nos diferentes órgãos de acometimento, característica
observada durante o curso da doença.
1.3. Resposta inflamatória na infecção pelo Trypanosoma cruzi
A principal resposta do hospedeiro em relação a infecção pelo T. cruzi é de natureza
inflamatória. Em estudos utilizando modelos experimentais infectados por diferentes cepas
do T. cruzi, foi determinado o papel de inúmeros mediadores inflamatórios potencialmente
capazes de promover proteção contra o parasito, mas também desencadear uma resposta
inflamatória condutora do processo de remodelamento cardíaco nesses animais (Guedes et
al, 2010; Paula Costa et al, 2010; Melo et al, 2011). Basicamente, a resposta inflamatória
inicial à infecção pelo T. cruzi é coordenada por células do sistema mononuclear fagocitário
que respondem aos antígenos do parasito através de uma via dependente de receptores do
tipo Toll (TLR)-Myd88 (Campos et al, 2004). Essa ativação origina citocinas pró-
inflamatórias como IL-12 e TNF-alfa que, por sua vez, facilitam a polarização das células
TCD4+ e CD8
+ em produtoras de IFN-gama (Campos et al, 2004; Talvani e Teixeira 2011).
O IFN-gama produzido tanto por células da resposta imune inata (ex. Natural killer cells)
quanto por células T, em concomitância com o próprio TNF-alfa, induzem a produção de
Introdução
16
óxido nítrico por macrófagos, através da via da L-arginina atuando assim, no controle e na
morte direta desses parasitos (Silva et al, 2003). Durante a fase inicial da doença, a
participação direta das células TCD8+, bem como do repertório de imunoglobulinas anti-
moléculas do T. cruzi e das citocinas de perfil Th1, Th2 e Th17, parecem ser cruciais para o
início do processo inflamatório gerador da cardiopatia chagásica (Bilate et al, 2008). Por
outro lado, IL-4 e IL-10 apresentam aumento da expressão no tecido cardíaco durante a
fase crônica da infecção, sugerindo papéis reguladores para estas citocinas na imunidade
mediada por células. Mediante essa interação inicial entre parasito e hospedeiro, a resposta
inflamatória no sítio inflamatório cardíaco poderá gerar uma resposta moderada ou grave,
ocasionando em alguns casos falência funcional do órgão ou mesmo morte do hospedeiro.
As quimiocinas apresentam um papel importante nesse processo inflamatório sítio-
dependente por exercer função de recrutamento leucocitário. Recentemente, foi
demonstrado que o T. cruzi é capaz de induzir a produção de quimiocinas por macrófagos
via receptor Toll (TLR-2), tanto in vitro quanto in vivo (Coelho et al, 2002; Carrera-Silva et
al, 2008). De acordo com o perfil de quimiocinas produzidas durante a infecção haverá a
formação de um infiltrado inflamatório no miocárdio com fenótipos celulares específicos
(ex. macrófagos, células T CD8+), controlando dessa forma a replicação parasitária, mas
lesando também o tecido do miocárdio. Algumas quimiocinas já foram bem caracterizadas
para a doença de Chagas experimental, como MCP-1 (CCL2), RANTES (CCL5), MIP1-
alfa(CCL3); sendo parte dessas proteínas regulada pelo IFN-gama no sítio da resposta
inflamatória (Talvani et al, 2000; Roffe et al, 2010). Quimiocinas têm a habilidade de
ativar macrófagos e cardiomiócitos a produzir óxido nítrico para combater o T. cruzi.
Assim CCL5 e CCL3 quando bloqueadas prejudicariam temporariamente o controle da
replicação do T. cruzi (Roffê et al, 2010). CC-quimiocinas preferencialmente atraem
células mononucleares para locais de inflamação crônica e estas predominam em lesões de
pacientes com doença de Chagas. Em diferentes modelos murinos de infecção aguda e
crônica pelo T. cruzi, aumento dos níveis do mRNA de quimiocinas (CCL2/MCP-1,
CCL5/RANTES) foi observado no tecido cardíaco associado à formação do infiltrado
inflamatório (Talvani et al, 2000; Paula Costa et al, 2010). Petray et al 2002, utilizando
Introdução
17
anticorpos neutralizantes mostraram que a quimiocina CCL3/MIP1-alfa está envolvida no
recrutamento de macrófagos durante a infecção aguda. Contudo, são necessários mais
estudos para se compreender o papel das quimiocinas na migração diferencial das
populações celulares na infecção pelo T. cruzi. Múltiplos fatores contribuem para os
eventos cardiovasculares na doença de Chagas, mas a resposta imune do hospedeiro e o
padrão genético do parasito parecem contribuir para a definição do prognóstico clínico
tanto em humanos, quanto em modelo experimental (Henriksson et al, 1993;Talvani et al,
2000; Rocha et al, 2007).
Estudos em camundongos caracterizando o infiltrado celular e a associação da
produção de citocinas no coração na infecção experimental pelo T. cruzi, demonstraram
mudanças endoteliais aórticas como elevada expressão de ICAM-1, IL-6 e TNF-alfa, com
uma associada inflamação na adventícia consistindo principalmente de células CD4+ e
CD8+ e macrófagos (Sunnemark et al, 1996). Esta infecção provoca alterações na
circulação micro e macrovascular e severa cardiopatia e embora alguns estudos em
humanos demonstrem a incidência de aterosclerose em pacientes chagásicos, nenhuma
ligação ainda foi provada (De Morais et al, 1989; Bestetti et al, 1992; Reis et al, 1995;
Carvalho, 2011).
Efeitos pró-aterogênicos induzidos pela infecção experimental pelo T. cruzi, podem
estar relacionados com a inflamação sistêmica e efeitos diretos sobre a parede vascular
(Sunnemark et al, 2000). De acordo com uma importante hipótese, lipoproteínas de baixa
densidade oxidadas são fatores importantes no desenvolvimento da doença aterosclerótica
(Steinberget al, 1989). O papel da inflamação tem despertado bastante atenção no contexto
da doença aterosclerótica, desde que esta é uma inflamação da parede vascular, na qual
macrófagos /monócitos e células T são abundantes (Ross, 1993). A localização de ambos,
linfócitos e macrófagos, no ateroma humano sugere que a resposta imune possa contribuir
para a patogênese das lesões ateroscleróticas (Lichtman, 1996; Hansson, 1997; Libby,
2000). Uma detalhada caracterização do ateroma humano têm determinado que estas
células se localizam em lesões recentes durante a patogênese, sendo tardiamente associadas
Introdução
18
com lesões instáveis (Libby, 2000). Entretanto a aterosclerose é considerada uma doença
inflamatória crônica e infecções sistêmicas têm um importante papel na inicialização e
perpetuação da patologia nas lesões ateroscleróticas (Portugal et al, 2004).
1.4. A aterosclerose: aspectos gerais e caracterização
A aterosclerose é uma doença crônico-degenerativa que se caracteriza pela gradual
diminuição da luz vascular, seguida por uma obstrução das artérias devido ao acúmulo de
lipídeos em suas paredes, o que reduz ou impede o fluxo sanguíneo (Lefcovitz, 2001)
ocasionado hipóxia ou isquemia ao órgão.
Lipídeos são utilizados “in vivo” para diversos propósitos como fontes de energia e
moléculas biologicamente ativas, além de serem importantes constituintes das membranas e
outras estruturas celulares (Stryer, 1995). As espécies moleculares de lipídeos presentes no
plasma, essenciais do ponto de vista fisiológico e clínico, são os ácidos graxos, os
triglicerídeos, os fosfolipídeos e o colesterol (Weiss, 1993; Montgomery, 1996).
Os ácidos graxos podem ser saturados, mono ou poliinsaturados, os triglicerídeos
são as formas de armazenamento energético mais importantes no organismo, os
fosfolipídeos têm, entre outras funções, formar a bicamada lipídica que é a estrutura básica
das membranas celulares e o colesterol é precursor dos hormônios esteróides, dos ácidos
biliares e da vitamina D, além de ter importantes funções nas membranas celulares,
influenciando a sua fluidez e o estado de ativação de enzimas ligadas a membranas. As
lipoproteínas plasmáticas são moléculas formadas de lipídeos (principalmente
fosfolipídeos, colesterol livre, ésteres de colesterol e triglicerídeos) e proteínas específicas
denominadas de apolipoproteínas. Estas partículas estão em constante estado de síntese,
degradação e remoção no plasma, tendo uma grande importância biológica, não somente no
transporte de lipídeos, mas também no envolvimento em processos diversos como reações
imunes, coagulação sanguínea e reparo de tecidos (Ross, 1995). A apolipoproteína E
Introdução
19
(apoE) é a principal glicoproteína responsável pelo transporte de lípideos no organismo,
sendo uma constituinte das lipoproteínas VLDL, HDL e quilomícrons (Stryer, 1995).
O aumento das lipoproteínas (LDL, IDL, VLDL e quilomícrons remanescentes) no
plasma causa turbulências hemodinâmicas ocasionando uma disfunção endotelial com
aumento da permeabilidade da camada íntima às lipoproteínas plasmáticas favorecendo a
retenção destas no espaço subendotelial. Uma vez retidas, as partículas de LDL sofrem
oxidação causando a exposição de diversos neo-epítopos imunogênicos.
Assim, devido a uma ativação endotelial ocorre um recrutamento de leucócitos e,
conseqüentemente, a formação de um centro de desenvolvimento e progressão de placas
ateroscleróticas resultando em complicações clínicas (Petrovan et al, 2007). A ingestão
inadequada de nutrientes, com baixos níveis de colesterol HDL e altos de LDL dentre
outros fatores, são importantes fatores de risco para doenças cardiovasculares, onde a dieta
tem importante papel na determinação dos níveis lipidêmicos (Cervato et al, 1997).
Os eventos da aterosclerose tem sido muito esclarecidos por estudos em modelos
animais, incluindo coelhos, porcos, primatas não-humanos e roedores. Camundongos
deficientes em apoE ou ainda a lipoproteína de baixa densidade (LDL) podem desenvolver
lesões avançadas e são os modelos mais usados em estudos genéticos e fisiológicos
(Pelluzio et al, 2001; Daugherty et al, 2002; Resende et al, 2011; Ye et al, 2011; Rong et al,
2012) . A primeira mudança identificada na parede da artéria é o acúmulo de partículas de
lipoproteínas e seus agregados na íntima das artérias, em locais de predileção da lesão.
Neste processo, os monócitos podem se aderir à superfície do endotélio e então migrar
através da monocamada endotelial para a íntima, onde eles proliferam, se diferenciam em
macrófagos e fagocitam principalmente a LDL oxidada, formando células espumosas. A
morte dessas células pode levar a necrose e secreção de elementos fibrosos pelas células do
músculo liso, placas oclusivas fibrosas podem se desenvolver e aumentar de tamanho.
Inicialmente, as lesões crescem em direção à adventícia até que um ponto crítico é atingido,
depois disso começam a se expandir e invadir o lúmen. As lesões continuam a crescer pela
migração de novas células mononucleares do sangue, que é acompanhada por proliferação
Introdução
20
celular, produção de matriz extracelular e do acúmulo de lipídios extracelulares. A
aterogênese pode ser vista como uma "resposta à lesão", com lipoproteínas, células
inflamatórias e outros fatores de risco como agentes prejudiciais (Lusis, 2000).
A maioria dos fatores de risco clássicos para aterosclerose têm sido relacionados a
mudanças nas concentrações de diferentes biomarcadores de matriz extracelular e nos
critérios do escore de Framingham (tabela de avaliação de risco cardiovascular)
(Sundstrom et al (1 e 2), 2004). Apesar dos mecanismos causadores por esse processo não
estarem claros, os fatores de risco poderiam modular a estrutura vascular e a estabilidade de
placas, que por sua vez influenciariam as concentrações de MMP (matriz metaloproteinase)
e TIMP (inibidores de metaloproteinases), ou através de modificações na produção de
colágeno (Rodriguez et al, 2007). Defeitos na síntese e na separação da matriz extracelular
são processos chave no desenvolvimento da aterosclerose e complicações trombóticas.
Correlações têm sido observadas entre níveis circulantes de biomarcadores de matriz
extracelular, manifestações clínicas e fatores de risco para aterosclerose (Rodriguez et al,
2007).
1.5 A aterosclerose na doença de Chagas
As doenças cardiovasculares são as principais causas de morte no mundo ocidental,
sendo que no Brasil ocasionam 27,22% dos óbitos registrados na população. Dos pacientes
chagásicos, estudos mostram que aproximadamente 56% da população possuem algum
nível de lesão aterosclerótica, levando ao óbito 30 a 40% dos pacientes (Marin-Neto, 2007).
A maioria das doenças cardiovasculares é resultante de complicações da
aterosclerose, embora parte da população acabe não desenvolvendo a doença. Nos
sintomáticos ela pode ter sido iniciada nos primeiros anos de vida, desenvolvendo-se
lentamente e podendo culminar, posteriormente, em graves complicações clínicas, como
ulcerações e rupturas, que podem evoluir para oclusões agudas trombóticas, contribuindo
com alta morbidade e mortalidade. Embora o processo aterosclerótico seja característico da
camada íntima das grandes e médias artérias, inúmeras alterações ocorrem também na
Introdução
21
microcirculação, primariamente decorrentes de alterações na função endotelial (Witzum e
Steinberg, 1991; Shimokawa, 1999).
Além dos fatores já estabelecidos para a aterosclerose, como hiperlipidemia,
tabagismo, hipertensão, o estilo de vida e a genética do indivíduo (Strocker et al, 2004),
têm se demonstrado a importância de agravantes como infecções paralelas com
acometimento vascular (Portugal et al, 2004). Os eventos inflamatórios e as infecções
causadas por vírus, bactérias e/ou protozoários aparecem também como importantes fatores
de risco para doença aterosclerótica (Sunemark et al, 2000; Portugal et al, 2004 e 2006).
Um exemplo de doença inflamatória causada por protozoário é a doença de Chagas, que
afeta principalmente o sistema cardiovascular (Marin-Neto et al, 2007).
No entanto, é notável que nas últimas décadas o intenso processo de urbanização
progressivo mudou hábitos e costumes da população brasileira. Além dos riscos
ocasionadas pela infecção pelo T. cruzi ao organismo do hospedeiro, ocorreram ainda
profundas modificações de estilo de vida que levou a exposição dos pacientes chagásicos
aos mesmos fatores de risco para a aterosclerose que esta sujeita o restante da população.
Portanto, é plausível supor que a doença coronária aterosclerótica tenha tornado freqüente
em pacientes com doença de Chagas (Marin-Neto et al, 1995). Um estudo com 136
pacientes chagásicos que foram submetidos a cateterismo cardíaco por causa de uma
cardiopatia associada, encontrou obstruções coronárias hemodinamicamente significativas
em 51 destes (37%), o que reforça o conceito de que grande parte da população chagásica
frequentemente é afetada pela aterosclerose (Garzon, 1985).
A região apical do ventrículo esquerdo é uma região crítica no coração chagásico
onde aneurismas, trombos ou ambos ocorrem com freqüência (Albanesi-Filho et al, 1991;
Viotti et al, 2004). Na cardiopatia chagásica crônica descrita em indivíduos não idosos, as
alterações macroscópicas variam de um coração aparentemente normal com dilatação da
aurícula direita até aumento do peso, dilatação global do coração associada com hipertrofia,
fibrose endocárdica na ponta do ventrículo e músculos papilares, espessamento
endocárdico, lesão vorticilar com ou sem trombose intracardíaca, cardiomegalia extrema
Introdução
22
com peso acima de 1.000g e alterações na aorta, como dilatação supravalvar e formação de
aneurismas (Andrade Z e Andrade SG, 1955; Lopes, 1981).
Lesão vorticilar e trombose intracardíaca no ventrículo esquerdo associada à lesão
vorticilar foram encontradas somente em idosos com cardiopatia chagásica crônica. Esse
fato está de acordo com a literatura, que descreve a lesão vorticilar como típica da
cardiopatia chagásica, sendo considerada uma das alterações macroscópicas mais
importantes para o diagnóstico da cardiopatia, que, por sua vez, predispõe à formação de
trombose intracardíaca (Menezes e Koberle, 1965).
Estudos mostraram que aproximadamente 56% de ataques súbitos em chagásicos
são causados por cardioembolismo, portanto aneurisma apical, insuficiência cardíaca e
arritmia mostram ser importantes fatores de risco na gênesis do ataque isquêmico
relacionado com a DC (Landim et al, 2009). A presença de fatores de risco para doença
cardiovascular, principalmente no contexto da doença aterosclerótica, induz mudanças nos
aspectos tanto funcionais quanto morfológicos do endotélio, facilmente levando a
inflamação, trombose e vasoconstrição (Vita e Keaney, 2002; Carod-Artalet al, 2005). Um
endotélio disfuncional pode ser detectado por um desequilíbrio entre fatores de dilatação e
constrição, fatores pro-coagulantes e anticoagulantes, atividades estimulantes e inibitórias,
relacionadas com o desenvolvimento e proliferação celular (Landim et al, 2009; Rubanyi et
al, 1993).
Os paralelos entre a resposta inflamatória descrita durante a infecção peloT. cruzi e
a resposta inflamatória envolvida na patogênese da aterosclerose geraram questionamentos
sobre a interferência do parasito no desenvolvimento e progressão das lesões arteriais em
chagásicos. Assim, além de ampliar o entendimento de como a infecção pelo T. cruzi pode
interferir no perfil patológico da aterosclerose, este estudo permitirá também compreender a
interferência da variabilidade genética do parasito junto a seu hospedeiro, elementos
essenciais para estudos futuros envolvendo a resposta inflamatória cardiovascular.
Objetivos
23
2.0. Objetivos
2.1. Objetivo geral
O objetivo deste trabalho foi avaliar a interferência de diferentes cepas do
Trypanosoma cruzi no desenvolvimento das lesões ateroscleróticas em camundongos
selvagens e knockout(-/-
) para apolipoproteína E.
2.2. Objetivos específicos
Avaliar a interferência da apoE na infecção pelo T. cruzi (quantificação de parasitos
circulantes), mortalidade e a variação do peso dos animais;
Verificar os níveis hepáticos de lipídeos totais e de colesterol, após a infecção pelo
T. cruzi em animais apoE-/-
e selvagens.
Verificar os níveis de lipídeos totais e de colesterol presentes no conteúdo fecal dos
camundongos apoE-/-
e selvagens após a infecção pelo T. cruzi;
Determinar os níveis sanguíneos de colesterol total, triglicerídeos e colesterol HDL,
em camundongos apoE-/-
e selvagens por meio da dosagem enzimática;
Avaliar por ensaio imunoenzimático as quimiocinas CCL2 e CCL5 em associação
com a infecção pelo T. cruzi em camundongos apoE-/-
e selvagem;
Avaliar, por histologia, os parâmetros inflamatórios cardiovasculares (quantificação
do infiltrado celular e ninhos de amastigota) e avaliação do arco aórtico (presença
de ateromas e deposição de colágeno).
Material e Métodos
24
3.0. Material e métodos
3.1. Animais
Neste estudo foram utilizados 56 camundongos machos e fêmeas C57BL/6, com 10
semanas de idade, peso de aproximadamente 21g. Sendo, 28 animais apoE -/-
e 28
selvagens. Estes animais foram alocados em gaiolas coletivas de polipropileno, em salas
climatizadas e sem distinção de alimentação (ração comercial para camundongo), sendo a
oferta de água livre. Durante todo o período experimental os animais permaneceram em
condições controladas de luminosidade (12h claro-escuro) e temperatura (22,0±2 ºC). Os
animais foram pesados semanalmente.
Os animais foram fornecidos pelo Biotério Central da UFV, os quais foram
mantidos no biotério do Laboratório de Nutrição Experimental também da UFV. Todos os
procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação
Animal (CETEA) da Universidade Federal de Viçosa, protocolo número 08/2011.
3.2. Infecção e parasitemia
Foram inoculados, intraperitonealmente com 100 formas tripomastigotas os
seguintes grupos experimentais: (i) 20 animais com a cepa Berenice 78 (10 apoE-/-
e 10
selvagens) e (ii) 20 animais com a cepa Colombiana (10 apoE-/-
e 10 selvagens). Foram
utilizados 16 animais como controle não infectado (8 apoE-/-
e 8 selvagens). Após
confirmação da infecção destes animais foi realizada a parasitemia diariamente através da
coleta de 5µl de sangue pela secção de veias superficiais da cauda (Brener, 1962) e
contagem direta dos parasitos circulantes em lâmina/lamínula e a mortalidade entre os
animais observada.
Material e Métodos
25
3.3. Quantificação dos níveis de colesterol total, triglicérideos e HDL
plasmáticos
Foram dosados os níveis de colesterol total, triglicerídeos (TG) e HDL dos animais
antes e 30 dias após a infecção, no plasma, tecido hepático e fezes. As determinações de
colesterol total, TG e HDL foram realizadas baseando no método enzimático colorimétrico
utilizando os Kits enzimáticos colesterol total, TG e HDL (Liquiform, Labtest – Belo
Horizonte).
3.4.Quantificação dos níveis de lipídeos totais hepáticos, colesterol total e
triglicerídeos hepáticos
Os animais foram submetidos a eutanásia com 14 semanas de idade por inalação de
gás CO2. Durante a eutanásia o fígado dos animais foi removido, lavado em solução salina
fisiológica, seco em papel de filtro e pesado. Foi então colocado em papel alumínio e
mantido a –80 0C até a realização das dosagens.
Os lipídeos totais hepáticos foram extraídos de acordo com o método de Folch et al.
(1957). Em síntese, foram pesados 100 mg de fígado em tubos de plástico previamente
identificados e posteriormente triturados com 1900 µL de solução contendo
clorofórmio:metanol (2:1) homogeneizando por 3 minutos à uma velocidade 10000 rpm.
Após a adição de 400 µL de metanol, os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 3000
rpm e o sobrenadante transferido para novos tubos de vidro com peso conhecido.
Posteriormente foram acrescentados 800 µL de clorofórmio, 640 µL de solução de NaCl a
0,73% e as amostras foram novamente centrifugadas por 10 minutos a 3000 rpm, sendo
desprezada a fase superior. A parede interior de cada tubo foi lavada três vezes com 600 µl
Material e Métodos
26
de solução de Folch (solução de 3% de clorofórmio, 48% de metanol, 47% de água
destilada e 2% de NaCl a 0,29%) e os lipídeos assim extraídos foram secos em estufa
overnight a 370
C. Após verificar que os tubos estavam totalmente secos, eles foram
pesados e a quantidade de lipídeos extraída foi dada pela diferença dos tubos de vidro antes
e depois de secos. Posteriormente a pesagem dos tubos, os mesmos foram armazenados em
freezer – 80ºC para a dosagem do colesterol hepático. Para tal, as amostras foram
descongeladas e ressuspendidas em 500 µL de isopropanol e homogeneizadas até a
completa solubilização dos lipídeos. Os níveis de colesterol e derivados foram
determinados da mesma forma como descritos anteriormente para o plasma.
3.5.Quantificação dos níveis de lipídeos totais e colesterol total fecal
Após a eutanásia as fezes foram retiradas do ceco dos animais e foi armazenada em
freezer –80 0C até a realização das dosagens.
A quantificação dos lipídeos cecais foi realizada pelo método de Folch et al. (1957)
e os níveis de colesterol foram determinados da mesma forma como descritos
anteriormente.
3.6.Ensaio imunoenzimático – ELISA
Os ensaios imunenzimáticos foram realizados utilizando-se plasma dos
camundongos infectados ou não pelo T. cruzi. Para o ensaio foram utilizados kits para
detecção das quimiocinas CCL2 e CCL5 (R&D Systems Inc, Minneapolis, USA). Para a
sensibilização das microplacas de 96 poços foram adicionados 100µl/poço dos anticorpos
monoclonais contra a proteína a ser dosada, diluídos em PBS contendo 0.1% de albumina
de soro bovino - BSA (SIGMA), sendo estas placas incubadas overnight à temperatura
Material e Métodos
27
ambiente. Anticorpos não adsorvidos pelas placas foram descartados, por inversão e
sucessivas lavagens em PBS-Tween e as placas bloqueadas com 300µl/poço de uma
solução contendo PBS-BSA 1%, durante 1 hora a 37°C. A seguir as placas foram
novamente lavadas. Após o bloqueio foram adicionados 25µl das amostras de plasma e de
100µl dos padrões respectivos para CCL2 e CCL5 (R&D Systems Inc, Minneapolis, USA).
Após 2 horas de incubação realizou-se novamente o processo de lavagem e foram
adicionados 100µl dos anticorpos biotinilados de detecção, anti-CCL2 e anti- CCL5,
usando diferentes diluições em PBS, pH 7,4 com 1% de albumina bovina e incubadas duas
horas a temperatura ambiente, seguindo-se a lavagem. Em seguida forma adicionados
100µl/poço de estreptoavidina HRP (R&D Systems Inc., Minneapolis, USA) em diluição
de 1:200 em PBS com 1% de albumina bovina e posterior incubação a temperatura
ambiente durante 20 min. As placas foram novamente lavadas e adicionado 100µl da
solução substrato por poço (mistura diluída 1:1 de peróxido do hidrogênio e
tretrametilbenzidina), seguido de incubação por 20-30 min em temperatura ambiente. A
reação foi interrompida acrescentando-se 50µl de H2SO4 1M por poço. A densidade óptica
foi determinada utilizando leitor de microplacas com filtro de 450ɳm. A quantificação das
citocinas presentes nas amostras foi determinada utilizando a densidade óptica obtida com a
curva padrão de concentrações conhecidas das citocinas e analisadas pelo software
SOFTmax PRO 4.0.
3.7.Histologia
3.7.1. Análise histopatológica e morfométrica do coração
Durante a eutanásia, o coração e a seção proximal da aorta dos animais foram
removidos, lavados em solução salina fisiológica e secos em papel de filtro. Estes órgãos
foram preservados em formol tamponado 10%.
Material e Métodos
28
Para contagem dos parasitos teciduais (ninhos de amastigota) e para a mensuração
da inflamação, o tecido cardíaco foi processado e avaliado através de histologia
convencional. Secções com 4µm de espessura foram desparafinizados em dois banhos de
xilol, 30 minutos cada, hidratados em soluções alcoólicas de concentrações decrescentes de
álcool (100%, 90%, 80% e 70%) 5 minutos em cada e lavados em água corrente por 5
minutos. Em seguida, os cortes foram corados pela Hematoxilina por 1 minuto e 30
segundos, lavados em água corrente por 30 minutos e corados pela Eosina durante 40
segundos. Posteriormente foram mergulhados rapidamente 3 vezes em álcool absoluto e 3
vezes em água. Após o último processo as lâminas com os cortes, foram colocadas na
estufa à 56ºC para secagem. Ao final, as lâminas foram montadas com lamínulas e
Etellan® e submetidos à análise em microscopia óptica.
Posteriormente foi realizada a quantificação da inflamação na área cardíaca. Todos
os núcleos celulares presentes no fragmento cardíaco foram quantificados em 20 imagens
(campos) aleatórios (área total percorrida igual a 1,49 x 106µm
2). As imagens visualizadas
pela objetiva de 40X foram digitalizadas pela microcâmera Leica DM 5000 B (Leica
Application Suite, versão 2.4.0R1) e analisados por meio do programa analisador de
imagens Leica Qwin V3.
3.7.2. Área de ninhos de amastigota
O parasitismo cardíaco foi determinado pela quantificação da área dos ninhos de
amastigota. Assim, os ninhos presentes no fragmento cardíaco foram quantificados em 30
imagens (campos) aleatórias (área total percorrida igual a 1,49 x 106µm
2). As imagens
visualizadas pela objetiva de 40X foram digitalizadas através da microcâmera Leica DM
5000 B (Leica Application Suite, versão 2.4.0R1). As imagens assim capturadas foram
Material e Métodos
29
visualizadas e gravadas para posterior utilização com o programa de análise de imagem
“ImageJ” (ImageJ versão 1.44), onde foram obtidas as mensurações, cujos valores foram
expressos em µm2.
3.7.3 Análise histopatológica e morfométrica das lesões aórticas
Os corações já fixados foram cortados transversalmente sob visão estereoscópica,
ao nível da borda atrial inferior direita, de modo a separar a região dos átrios e dos
ventrículos. O fragmento contendo a porção proximal do coração e a raiz da aorta foi
separado em três partes denominadas de proximal, medial e distal, tomando-se como
referência a porção proximal do coração. Estas partes foram processadas para inclusão em
parafina, de forma orientada no mesmo bloco para obtenção de cortes histológicos de 5µm
de espessura. As lâminas foram enumeradas em série e coradas em Hematoxilina e Eosina.
O tamanho da lesão aterosclerótica foi avaliado em 30 cortes por animal;a cada
50µm, 2 cortes sequenciais eram selecionados para a medida num total de 6 cortes por
lâmina (contendo 2 cortes proximais, 2 mediais e 2 distais) segundo técnica modificada de
Paigen et al 1987 e Portugal et al 2004. As áreas foram medidas por meio da análise
morfométrica, pelo programa Image J. O cálculo do tamanho da lesão de cada animal foi
feito pela soma das áreas dos 30 cortes e valor médio por grupo foi utilizado para
comparações estatísticas.
O colágeno extracelular presente nas lesões ateroscleróticas foi visualizado
utilizando-se o corante Tricrômico de Gomori, o qual apresenta coloração esverdeada, e
contra-corados com Hematoxilina. Foram analisados 3 cortes não consecutivos em
intervalo aleatório por animal (Gupta et al., 1997; Daugherty e Rateri, 1994) e os resultados
foram expressos como porcentagem de colágeno/área de lesão.
Material e Métodos
30
3.8. Análise estatística dos dados:
Os parâmetros avaliados foram representados pela média de seus valores e
respectivo erro médio padrão. Utilizou-se o programa GraphPad Prism e os dados foram
analisados pelo teste OneWay ANOVA para múltiplas comparações (Turkey test). As
diferenças foram consideradas significativas se o P foi igual ou menor que 0,05.
Resultados
31
4.0. Resultados
4.1. Mortalidade e parasitemia
As cepas Colombiana e Be 78 apresentaram diferenças significativas nos
parâmetros biológicos quando inoculadas em camundongos C57BL6 selvagem e apoE -/-.
Foram observados perfis diferentes de curvas de parasitemia nos animais inoculados com
estas cepas do T. cruzi (Figura 1). Ao se avaliar a cepa Be 78 inoculada nos animais
selvagens e apoE -/-, estes apresentaram menores níveis de parasitemia em relação à cepa
Colombiana. No grupo apoE -/- infectado com a cepa Colombiana foi observada diferença
significativa nos dias 19, 25 e 26 pós infecção em relação aos demais grupos infectados. O
mesmo foi observado para o grupo selvagem inoculado por esta cepa. O período pré-
patente foi menor nos animais selvagens (9 dias), em relação aos animais infectados apoE -
/- (12 dias).
Figura 1. Curva de parasitemia. A contagem de tripomastigotas circulantes foi realizada diariamente
através da avaliação sanguínea (veia caudal). Be 78 apoE-/-
: Knockout para apolipoproteína E infectado com
Berenice 78; Col apoE-/-
Knockout para apolipoproteína E infectado com Colombiana; Be 78: tipo selvagem
infectado com Berenice 78; Col: tipo selvagem infectado com Colombiana. Os dados acima foram
apresentados como média+/- SEM e analisados por OneWay ANOVA (Tukeytest), sendo significativo o
p<0.05
10 13 16 19 22 25 280
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
Be 78 apoE -/-
Col apoE -/-
Be 78
Col
*
*
*
*
*
Dias após infecção
Para
sit
os p
or
5
l/san
gu
e (
x10
3)
Resultados
32
As taxas de mortalidade foram determinadas para cada grupo de animais (Figura 2).
A sobrevivência foi de 100% nos grupos não infectados selvagem e apoE -/-. Também nos
animais infectados pela cepa Be 78, tanto selvagens quanto apoE -/-, não houve
mortalidade. Detectou-se mortalidade apenas nos grupos infectados pela cepa Colombiana,
sendo que no grupo selvagem ocorreu no 9º dia de infecção e no grupo apoE -/- ocorreu no
25º dia.
Figura 2. Curva de sobrevivência. A sobrevivência foi acompanha em todos os grupos durante 25 dias de
infecção. CNI: Controle não infectado; CNI apoE -/-: Controle não infectado knockout para apolipoproteína
E; Be 78 apoE -/-: Knockout para apolipoproteína E infectado com Berenice 78; Col apoE -/-: Knockout para
apolipoproteína E infectado com Colombiana; Be 78: tipo selvagem infectado com Berenice 78; Col: tipo
selvagem infectado com Colombiana. Os dados acima foram apresentados como média+/- SEM e analisados
por OneWay ANOVA (Tukeytest), sendo significativo o p<0.05.
0 5 10 15 20 25 300
25
50
75
100
CNI
CNI apoE -/-
Be 78
Be 78 apoE -/-
Col
Col apoE -/-
Dias
So
bre
viv
ên
cia
/%
Resultados
33
4.2. Variação do peso corporal
Na tabela 1, encontra-se relatado a variação de peso dos animais. Não observou-se
diferenças entre os grupos.
Tabela 1. Média de peso de animais da linhagem C57BL6 selvagem ou apoE -/-, não infectados,
infectados com as cepas Berenice 78 (Be 78) e Colombiana do Trypanosoma cruzi durante quatro
semanas.
________________________________________________________________________________
Semanas (Média ± SEM)
1ª 2ª 3ª 4ª
CNI 24,5 ± 0,89 23,4 ± 0,41 23,7 ± 0,72 23,2 ± 0,40
Be78 24,2 ± 0,91 24,3 ± 0,93 23,9 ± 0,96 23,6 ± 0,89
Col 23,3 ± 0,95 24,1 ± 0,40 24,9 ± 0,46 21,7 ± 0,56
CNI apoE -/- 21,9 ± 0,81 23,8 ± 0,78 24,7 ± 0,74 25,0 ± 0,76
Be78 apoE -/- 21,1 ± 0,87 21,8 ± 0,87 22,9 ± 0,96 24,2 ± 0,96
Col apoE -/- 20,8 ± 0,56 21,9 ± 0,65 23,4 ± 0,76 22,6 ± 0,91
Os dados abaixo foram apresentados como média+/- SEM e analisados por OneWay ANOVA (Turkey test),
sendo significativo o p<0.05. CNI: Controle não infectado Col: cepa Colombiana Be78: cepa Berenice 78
CNI apoE -/-: controle não infectado knockout para apolipoproteína E
Be78 apoE -/-: infectado com Berenice 78 knockout para apolipoproteína E
Col apoE -/-: infectado com Colombiana knockout para apolipoproteína E
Resultados
34
4.3. Relação entre o peso do fígado e o peso corporal
Na tabela 2, encontra-se descrita a média da relação entre o peso do fígado e o peso
corporal dos animais na 4ª semana de experimento. No grupo de animais infectados com
cepa Colombiana foram observados valores estatisticamente mais elevados desta relação,
sendo que nos demais grupos essa relação foi similar.
Tabela 2. Média da relação entre o peso do fígado e o peso corporal dos animais da linhagem
C57BL6 selvagem ou apoE -/- não infectados, infectados com as cepas Berenice 78 (Be 78) e
Colombiana do Trypanosoma cruzi durante quatro semanas.
_______________________________________________________________________________
Valores (Média ± SEM) Valores (Média ± SEM)
Grupos Grupos
CNIa 0,048 ± 0,001 CNI ApoE-/-a 0,053 ± 0,001
Be78a,b 0,058 ± 0,002 ApoE-/- Be78a 0,044 ± 0,006
Colb 0,062 ± 0,003 ApoE-/- Colb 0,057 ± 0,004
Os dados abaixo foram apresentados como média+/- SEM e analisados por OneWay ANOVA (Turkey test),
sendo significativo o p<0.05. Letras diferentes significam diferença entre os grupos.CNI: Controle não
infectado; Col: cepa Colombiana; Be78: cepa Berenice 78; CNI apoE -/-: controle não infectado knockout
para apolipoproteína E; Be78 apoE -/-: infectado com Berenice 78 knockout para apolipoproteína E; Col apoE
-/-: infectado com Colombiana knockout para apolipoproteína E
Resultados
35
4.4. Dosagem de colesterol total, colesterol HDL e triglicerídeos plasmáticos.
Avaliamos os níveis de colesterol total, colesterol HDL e triglicerídeos plasmáticos
dos animais apoE -/- e selvagens, antes (tabela 3) e após 27 dias de infecção pelo T. cruzi
(figura 3). Ao se avaliar os níveis de colesterol total, observamos que quando a apoE esta
ausente estes valores estavam mais elevados (Figura 3A), tanto antes quanto após a
infecção. Ao contrário em relação aos níveis de colesterol HDL, na presença da apoE,
observamos valores menores em comparação aos animais selvagens (Figura 3B), sendo
menores antes da infecção. Já quando comparamos os níveis de triglicerídeos encontramos
diferença significativa apenas no grupo apoE -/- infectado pela Colombiana, quando
comparados aos demais grupos (Figura 3C).
Tabela 3. Média dos níveis de colesterol total, colesterol HDL e triglicerídeos dos animais da linhagem
C57BL6 selvagem ou apoE -/- antes da infecção.
________________________________________________________________________________
Resultados (Média ± SEM)
Grupo
___________________________________
Parâmetros apoE -/- Selvagem
Colesterol total inicial 276,50 ± 29,13 83,48 ± 6,04
Colesterol HDL inicial 13,71 ± 0,26 28,39 ± 2,96
Triglicérideos iniciais 71,51 ± 4,26 76,16 ± 4,06
apoE -/-: animais knockout para apolipoproteína E
Resultados
36
A) B)
CNI Be 78 Col CNI Be 78 Col 0
100
200
300
400
a
b
a
b
a
b
Selvagem
ApoE -/-
Cole
ste
rol
tota
l (m
g/d
l)
CNI Be 78 Col CNI Be 78 Col
0
10
20
30
40
50
60
a
b
a,b
a
Selvagem
ApoE -/-b
a
HD
L c
ole
ste
ro
l (m
g/d
l)
C)
CNI Be78 Col CNI Be78 Col
0
100
200
300 Selvagem
ApoE -/-
a
aa
a a
b
Tri
gli
céri
deo
s (
mg
/dl)
Figura 3. Avaliação do colesterol total, triglicérideos e HDL plasmáticos. Colesterol total (A), HDL (B) e
triglicerídeos (C) no soro dos animais Knockout para apoE e selvagem, na fase aguda da infecção pelo T.
cruzi. Os dados acima foram apresentados como média +/- SEM e analisados por OneWay ANOVA (Turkey
test), sendo significativo o p<0.05. Letras diferentes significam diferença entre os grupos. CNI: controle não
infectado; Be 78: infectado com Berenice 78; Col: infectado com Colombiana; apoE -/-: camundongo
knockout para apolipoproteína E.
4.5. Dosagem de lipídeos totais, colesterol total e triglicerídeos hepáticos.
Ao se avaliar os lipídeos hepáticos totais observou-se uma redução de sua
concentração nos animais apoE -/-
infectados com ambas as cepas do T. cruzi quando
comparados com o animais apoE -/-- não infectados (Figura 4A). Por outro lado, quando se
avaliou o colesterol total hepático nesses animais, observou-se que a presença da cepa Be78
Resultados
37
no grupo apoE -/- foi capaz de reduzir sua concentração plasmática (Figura 4B), sendo que
o grupo de apoE -/- infectados com a cepa Colombiana do T.cruzi permaneceu com seus
níveis similares aos animais apoE -/- não infectados. Finalmente, a presença de ambas as
cepas do parasito reduziram drasticamente os níveis de triglicérideos hepáticos nos animais
apoE -/-, sendo os valores menores encontrados associados à cepa Colombiana do T. cruzi
(Figura 4C).
A) B)
CNI Be 78 Col CNI Be 78 Col
0.0000
0.0025
0.0050
0.0075
0.0100
a
Selvagem
ApoE -/-
a
b
aa
aa
Lip
ídeo
s t
ota
ish
ep
áti
co
s (
g)
CNI Be 78 Col CNI Be 78 Col
0.00
0.05
0.10
0.15Selvagem
ApoE -/-
aa
bb
a,b a,b
Co
leste
rol
tota
l h
ep
áti
co
(m
g/d
l)
C)
CNI Be78 Col CNI Be78 Col 0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
Selvagem
ApoE -/-
a a
a,b b
c
d
Tri
gli
céri
deo
s h
ep
áti
co
s (
mg
/dl)
Figura 4. Avaliação de lipídeos totais, colesterol total e triglicerídeos hepáticos. Lipídeos totais (A),
colesterol total (B) e triglicerídeos (C) no fígado de animais C57BL6 selvagens e apoE -/- (knockout). Os
dados acima foram apresentados como média+/- SEM e analisados por OneWay ANOVA (Turkey test),
sendo significativo o p<0.05. Letras diferentes significam diferença entre os grupos. CNI: controle não
infectado; Be 78: infectado com Berenice 78; Col: infectado com Colombiana; ApoE -/-: camundongo
knockout para apolipoproteína E.
Resultados
38
4.6. Dosagem de lipídeos totais e colesterol total fecal.
Foi realizada a avaliação de lipídios e colesterol total fecal nos animais C57BL6
apoE -/- e selvagens não infectados e infectados pelas cepas Berenice 78 e Colombiana do
T. cruzi (Figura 5). Ao se avaliar os lipídeos totais fecais, nos animais não infectados
observou-se maiores valores no grupo apoE -/- em relação ao selvagem (Figura 5A). A
cepa Berenice 78 elevou os níveis de lipídeos totais fecais nos animais selvagens e a cepa
Colombiana nos animais apoE -/- (figura 5A). Em relação ao colesterol total fecal
observamos diferença significativa apenas no grupo apoE -/- infectado pela cepa
Colombiana do T. cruzi (Figura 5B).
A) B)
CNI Be 78 Col CNI Be 78 Col 0.000
0.001
0.002
0.003
a a
Selvagem
ApoE -/-
a
bb
c
a
b,c
Lip
ídeo
s f
ecais
(g)
CNI Be 78 Col CNI Be 78 Col 0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
0.125Selvagem
ApoE -/-
a
b
aaa a
Cole
ste
rol to
tal fe
cal(
mg/d
l)
Figura 5. Avaliação de lipídios e colesterol total fecal. Lipídeos totais (A) e colesterol total (B) nas fezes
dos animais Knockout para apolipoprotína E e selvagem, na fase aguda da infecção pelo T. cruzi. Os dados
acima foram apresentados como média+/- SEM e analisados por OneWay ANOVA (Tukeytest), sendo
significativo o p<0.05. Letras diferentes significam diferença entre os grupos.CNI: controle não infectado; Be
78: infectado com Berenice 78; Col: infectado com Colombiana; ApoE KO: camundongo knockout para
apolipoproteína E.
Resultados
39
4.7. Dosagem plasmática de MCP-1(CCL2) e RANTES(CCL5).
Ensaios imunoenzimáticos foram realizados no plasma dos animais C57BL6
selvagens e apoE -/- para as quimiocinas CCL2 e CCL5. Verificamos que a produção de
CCL2 foi elevada nos animais infectados para ambas as cepas ( Figura 6A). Do mesmo
modo, ao se avaliar a produção de CCL5, observamos maiores níveis nos grupos infectados
em comparação aos não infectados (Figura 6 B). Na ausência da apoE observamos menores
valores para o grupo infectado pela cepa Be 78 do T. cruzi, quando comparado ao infectado
pela cepa Colombiana nas dosagens tanto de CCL2 quanto CCL5.
A) B)
0
25
50
75
100
a a
c
b
b,c b,c
Selvagem
ApoE -/-
ColCNI Be 78
CC
L2 [
pg
/ml]
0
1000
2000
Be 78 Col
a a
c
b
c
cApoE -/-
Selvagem
CNI
CC
L5 [
pg
/ml]
Figura 6. Síntese de MCP-1-CCL2 e RANTES-CCL5. Ensaios imunoenzimáticos foram realizados no
plasma para CCL2 (A), e CCL5 (B) em animais C57BL6 knockout (-/-) para apolipoproteína E e selvagens.
Os dados acima foram apresentados como média+/- SEM e analisados por OneWay ANOVA (Turkey test),
sendo significativo o p<0.05 para letras diferentes. CNI: controle não infectado; Be 78: infectado com
Berenice 78; Col: infectado com Colombiana; ApoE -/-: camundongo knockout para apolipoproteína E.
Resultados
40
4.8. Análise morfométrica e morfológica do coração
A análise histopatológica dos tecidos cardíacos dos animais apoE -/- e selvagens foi
realizada para os grupos não infectados, infectados pelas cepas Berenice 78 e Colombiana
do T.cruzi (Figura 7). A fase aguda da infecção revelou um intenso infiltrado inflamatório,
sobretudo perivascular, com predomínio de células mononucleares e presença de ninhos de
amastigota. Ao se avaliar os animais infectados pela cepa Colombiana observamos que o
grupo selvagem apresentou maior número de núcleos celulares (Figura 7A), quando
comparados aos animais apoE -/- infectado pela mesma cepa (Figura 7B). No entanto o
grupo selvagem infectado pela cepa Be 78 apresentou menor predomínio de infiltrado
inflamatório (Figura 7C), assim como os animais apoE -/- com a mesma cepa (Figura 7D).
Tanto os animais apoE -/- (Figura 7E) quanto os selvagens (Figura 7F) não infectados
apresentaram tecido cardíaco preservado.
Resultados
41
Figura 7. Análise histopatológica do coração. Cortes histológicos de tecido cardíaco de camundongos
C57BL/6 selvagens e knockout para apolipoproteína E foram corados com hematoxilina e eosina. As amostras
foram obtidas de todos os grupos, infectados ou não pelo T. cruzi. Sendo os grupos infectados com a cepa
Colombiana: (A) grupo selvagem e (B) grupo apoE -/-(knockout), presença de ninho de amastigota (seta) e
miocardite difusa com infiltrado inflamatório mononuclear; grupos infectados com a cepa Berenice: (C) grupo
selvagem e (D) grupo apoE -/-, presença de ninho de amastigota (seta); e grupos não infectados: (E) grupo
selvagem e (F) grupo apoE -/-.
A B
C D
E F
Resultados
42
A presença de inflamação no tecido cardíaco de todos os grupos foi determinada
pela quantificação de núcleos celulares (Figura 8). O número de núcleos presentes no
coração dos animais infectados foi maior quando comparado a seus respectivos controles
não infectados, independentemente da genética do hospedeiro. O grupo selvagem infectado
com a cepa Colombiana apresentou diferença significativa de P<0,001, em relação aos
demais grupos, apresentando os maiores valores.
Figura 8. Análise morfométrica da celularidade cardíaca.O número de células inflamatórias foi avaliado
através da contagem de núcleos presentes no tecido cardíaco. As amostras foram obtidas dos grupos C57BL/6
selvagens (Selvagem) e knockout para apolipoproteína E (ApoE -/-), infectados ou não pelo T. cruzi. Os dados
acima foram apresentados como média+/- SEM e analisados por OneWay ANOVA (Turkey test), sendo
significativo o p<0.05. * o grupo selvagem infectado com a cepa Colombiana apresentou p<0.001. Letras
diferentes significam diferença entre os grupos. CNI: controle não infectado; Be 78: infectado com Berenice
78; Col: infectado com Colombiana;
CNI Be78 Col CNI Be78 Col 0
100
200
300
400
selvagem
ApoE -/-
ab
c c
ed
*
Nú
cle
os c
elu
lare
s/
74931
m2
Resultados
43
4.9. Análise do parasitismo cardíaco
O parasitismo tissular foi avaliado pela contagem da área dos ninhos de T. cruzi no
miocárdio nos grupo apoE -/- e selvagens, infectados pela cepa Berenice 78 e Colombiana,
em lâminas coradas com Hematoxilina e Eosina (Figura 9). No grupo selvagem infectado
com a cepa Be 78 foi observado um número estatisticamente menor de ninhos de
amastigotas em relação aos animais selvagens infectados com a cepa Colombiana. De
forma semelhante o grupo apoE -/- infectado cepa Be 78 apresentou valores mais baixos em
relação ao grupo apoE -/- infectado com a cepa Colombiana. Sendo que este último grupo
apresentou maiores valores sendo estatisticamente diferente de todos os outros grupos.
Figura 9. Parasitismo cardíaco. Ninhos de Trypanosoma cruzi no tecido cardíaco de camundongos
Knockout para apolipoproteína E (ApoE -/-) e selvagens (Selvagem), infectados pela cepa Berenice 78 (Be78)
e Colombiana (Col).Os dados acima foram apresentados como média+/- SEM e analisados por OneWay
ANOVA (Turkey test), sendo significativo o p<0.05. Letras diferentes significam diferença entre os grupos.
Resultados
44
4.10. Aspectos histológico da aorta
O aspecto histopatológico da aorta foi verificado para análise da presença de lesões
ateroscleróticas nos animais apoE -/- e selvagens, infectados ou não pelas cepas Be 78 e
Colombiana do T. cruzi (Figura 10). Ao se observar as aortas dos animais selvagens não
infectados (Figura 10A), selvagens infectados pelas cepas Be 78 (Figura 10C) e
Colombiana (Figura 10D), não foi encontrada presença deste tipo de lesão, embora os
grupos infectados apresentassem ninhos de amastigota e infiltrado inflamatório na camada
muscular e serosa da aorta. O grau de inflamação foi considerado leve no grupo infectado
pela cepa Be 78 e moderado no grupo infetado pela cepa Colombiana (Dados não
mostrados.
Na análise dos grupos apoE -/- não infectados (Figura 10B), três dos animais
analisados apresentaram lesão com presença de macrófagos espumosos, sendo que em um
animal foi observado a deposição de cristais de colesterol. No grupo infectado pela cepa Be
78 (Figura 10 D), cinco animais apresentaram lesão, sendo estas de área menor que os
infectados cepa Colombiana. Nestes animais observou-se presença de macrófagos
espumosos, sendo que três animais também possuíam deposição de cristais de colesterol;
todos possuíam inflamação leve da camada serosa e muscular da aorta, com pouca presença
de ninhos (Dados não mostrados). No grupo infectado pela cepa colombiana (Figura 10F),
as lesões foram estatisticamente significativas, sendo maiores que o grupo não infectado e o
infectado pela cepa Be 78. Macrófagos espumosos foram encontrados em quatro animais,
sendo que três apresentaram também deposição de cristais de colesterol. Neste grupo, todos
os animais apresentaram inflamação moderada da camada serosa e muscular da aorta
(Dados não mostrados).
Resultados
45
Figura 10. Aspecto histopatológica da aorta.Os cortes histológicos foram corados com Eosina e
hematoxilina, aumento de 200X. Sendo os grupos não infectados: (A) selvagem e (B) apoE -/- (knockout),
com presença de macrófagos espumosos (seta); grupos infectados com a cepa Berenice 78: (C) grupo
selvagem e (D) grupo apoE -/-, com presença de macrófagos espumosos e cristais de colesterol (seta); e
grupos infectados com a cepa Colombiana: (E) grupo apoE -/- e (F) grupo selvagem, com presença de
macrófagos espumosos e cristais de colesterol (seta).
Resultados
46
A área da lesão nos animais apoE -/- foi quantifica nos grupos não infectados e
infectados pelas cepas Be 78 e Colombiana do T. cruzi na aorta (Figura 11). A infecção
pelo T. cruzi foi capaz de aumentar a área das lesões ateroscleróticas, quando comparado ao
grupo não infectado. Sendo estas mais elevadas nos animais infectados pela cepa
Colombiana.
Figura 11 - Área da lesão aterosclerótica na aorta. A lesão aterosclerótica foi quantificada nos grupos
animais knockout para apolipoproteína E não infectado e infectados pelo Trypanosoma cruzi ao final de
quatro semanas de infecção. CNI: controle não infectado; Be78: animais infectados pela cepa Berenice 78;
Col: grupo infectado pela cepa colombiana. Os dados acima foram apresentados como média+/- SEM e
analisados por OneWay ANOVA (Turkey test), sendo significativo o p<0.05.Letras diferentes significam
diferença entre os grupos. * p<0,001.
4.11. Quantificação de colágeno nas lesões aórticas
O conteúdo de colágeno foi utilizado como parâmetro para avaliar a estabilidade das
lesões ateroscleróticas presentes aorta (Figura 12). Os animais selvagens não infectados
(Figura 12A), infectados pelas cepas Be 78 (Figura 12C) e Colombiana (Figura 12E)
apresentaram aspecto normal da estrutura da aorta. Do mesmo modo os animais apoE -/-
não infectados verificamos que a estrutura da aorta estava normal (Figura 12B). Em
contrapartida, os grupos apoE -/- infectados pelas cepas Be 78 (Figura 12D) e Colombiana
(Figura 12F) infectados, apresentaram diferença significativa em relação ao controle não
infectado apoE -/-, com maior área de deposição de colágeno.
CNI Be 78 Col0
10000
20000
30000
40000
50000
a
a
b
*
Áre
a d
a le
são
m2
Resultados
47
Figura 12 – Aspecto Histológico do conteúdo de colágeno.Os cortes histológicos foram corados com
Tricômico de Gomori, onde as fibras colágenas coram em verde, aumento de 400X. Sendo os grupos não
infectados: (A) selvagem e (B) apoE -/- (knockout); grupos infectados com a cepa Berenice 78: (C) grupo
selvagem e (D) grupo apoE -/-; e grupos infectados com a cepa Colombiana: (E) grupo apoE -/- e (F) grupo
selvagem.
Resultados
48
A deposição de colágeno na área da lesão foi quantificada nos grupo apoE -/-
infectados e não infectados (Figura 13). Observou-se diferença estatística entre os grupos
infectados pela Colombiana e Be 78, em comparação ao não infectado. O que mostra que a
infecção pelo T. cruzi é capaz de provocar maior dano no tecido aórtico. Os valores foram
similares entre os grupos infectados por ambas as cepas.
Figura 13. Quantificação de colágeno das lesões na aorta. Análise da quantidade de colágeno nas lesões
aórticas de animais knokcout para apolipoproteína E infectados e não infectados pelo Trypanosoma cruzi.
Resultados expressos como média da porcentagem de colágeno da área total da lesão aterosclerótica.CNI:
controle não infectado; Be78: animais infectados pela cepa Berenice 78; Col: grupo infectado pela cepa
colombiana. Os dados acima foram apresentados como média+/- SEM e analisados por OneWay ANOVA
(Tukeytest), sendo significativo o p<0.05.Letras diferentes significam diferença entre os grupos.
CNI Be78 Col 0
10
20
30
a
b b
% C
olá
gen
o /
Áre
a d
e l
esão
Discussão
49
5.0. Discussão
A aterosclerose é uma doença de caráter inflamatório, na qual a parede vascular é
infiltrada por células do sistema imune, com progressivo acúmulo de lipídeos (Ross, 1993).
Diversos estudos indicam que agentes infecciosos, como Chlamydia pneumoniae (Chen et
al, 2010), Cytomegalovirus (Burnett et al, 2004) e Toxoplasma gondii (Portugal et al, 2004)
apresentam envolvimento na doença e possivelmente induzem uma inflamação sistêmica
causando alterações locais no epitélio das artérias.
Dentre componentes importantes no processo aterosclerótico temos a
apolipoproteína E (apoE), que é a principal transportadora de alguns tipos lipídicos no
organismo (Stryer, 1995). A apoE, glicoproteína sintetizada principalmente no fígado e
cérebro é um importante componente estrutural de algumas lipoproteínas e desempenha
um papel funcional no clearence das lipoproteínas plasmáticas. Adicionalmente, ela afeta a
homeostase do colesterol e contribui para reações inflamatórias locais presentes no
processo da aterosclerose (Meir et al, 2004).
O camundongo apoE knockout (-/-) é um modelo animal muito utilizado nos estudos
de aterosclerose e hiperlipidemia (Portugal et al, 2004; Peluzio et al, 2003; Burnett, 2004).
Este animal apresenta uma disfunção endotelial inata, com propensão a aterosclerose,
apresentando altos níveis de colesterol circulante e formação de placa ateromatosa.
Algumas doenças crônicas e/ou infecções que predispõem lesões vasculares encontram
nesse modelo animal um potencial campo de estudo, a citar as alterações microvasculares
desencadeadas após a infecção pelo Trypanosoma cruzi, protozoário causador da doença de
Chagas.
Como alterações patológicas que caracterizaram o primeiro registro de
comprometimento microvascular na doença de Chagas, temos alterações na permeabilidade
dos capilares cardíacos, congestão, estase, infiltração por células mononucleares e
vasoconstrição. Pequenos e grandes vasos podem ser afetados e microscopicamente
associados a uma resposta inflamatória predominantemente mononuclear observa-se focos
Discussão
50
de necrose e degeneração miocárdica com concomitante fibrose intersticial (Rossi et al,
2010; Prado et al, 2011). Além disso, agregados plaquetários e trombos oclusivos são
encontrados em pequenos vasos (Rossi et al, 1985). Neste contexto torna-se importante
entender as alterações conseqüentes da doença de Chagas na patogênese das lesões
vasculares presentes na aterosclerose.
Em nosso trabalho, demonstrou-se pela primeira vez o estudo da relação entre a
infecção experimental pelo T. cruzi e o desenvolvimento de lesões vasculares
ateroscleróticas em camundongos apoE-/-. Verificamos que o T. cruzi não somente foi
capaz de agravar o desenvolvimento das lesões aórticas em camundongos apoE-/-, mas
também sua presença contribuiu para a uma elevada deposição de colágeno na íntima das
artérias nestes animais.
As alterações microvasculares associados ao T. cruzi são apenas representações da
capacidade imunopatogênica desse parasito no hospedeiro mamífero. De fato, seu exato
papel na patogenia da doença de Chagas humana ou experimental ainda não está bem
estabelecido, mas admite-se que a imunogenicidade de seus produtos (moléculas de
superfície, por exemplo) seja o grande responsável pela geração do processo inflamatório
associado à doença. Cepas de T. cruzi que induzem uma fase aguda com alta virulência
(alta parasitemia e alta mortalidade) em camundongos induzem também uma miocardite
mais grave com intensa inflamação e fibrose (Brener, 1985). A cepa Colombiana apresenta
cardiomiotropismo e é altamente virulenta, provocando este tipo de patologia no modelo
murino. De forma similar, a cepa Be 78, descrita por Lana e Chiari em 1986, apresenta
nítido tropismo para células cardíacas e muscular esquelética. Esta última é considerada de
baixa virulência, com parasitismo sempre escasso. Nos tecidos afetados o infiltrado
inflamatório é intenso e acompanhado de grande destruição de fibras. A parasitemia é
baixa, sendo o período pré-patente e patente longos. A mortalidade é ausente, mesmo após
um longo tempo de infecção. Esses dados corroboram nossos resultados onde observamos
um pequeno número de parasitos circulantes nos animais infetados pela cepa Be 78, seja
eles apoE -/- ou não. O período pré-patente foi maior nos animais apoE-/-, quando
Discussão
51
comparados aos animais selvagens, independentemente da cepa, o que nos ressalta a
importância do hospedeiro na infecção experimental pelo T. cruzi.
Existe uma forte relação entre os níveis plasmáticos de colesterol e mortalidade por
doença aterosclerótica, sendo que o risco para o desenvolvimento da aterosclerose aumenta
progressivamente em função de níveis mais elevados de colesterol na corrente sanguínea
(Lusis, 2000; Navarro, 2002). Devido a deficiência na produção de apoE, os camundongos
knockout para esta lipoproteína apresentam alterações no metabolismo lipídico. A análise
do colesterol total, colesterol HDL e triglicerídeos torna-se um importante instrumento para
a avaliação funcional de doenças como a aterosclerose. Souza et al, 2009, ao submeter ratos
a uma dieta hipercolesterolêmica observou que os animais apresentavam altos níveis de
colesterol total e baixos níveis de colesterol HDL, com reduzidos níveis de triglicerídeos.
Similar aos nossos animais predispostos à hipercolesterolemia devido à ausência do gene
apoE, observamos altos níveis de colesterol total com diminuição do colesterol HDL. No
entanto, podemos ressaltar que somente a infecção pela cepa Colombiana influenciou os
níveis lipídicos de triglicerídeos no plasma dos animais apoE-/-. Em relação aos demais
parâmetros a genética do hospedeiro foi predominante.
O comprometimento hepático na fase aguda da doença de chagas tem sido
apresentado tanto em humanos quanto em modelos animais. Na clínica coube ao próprio
Carlos Chagas em 1916 descrever a hepatomegalia como manifestação integrante do
quadro da tripanossomíase americana por ele descoberta. Assim os primeiros trabalhos
descrevendo esta patologia já chamavam a atenção para as principais alterações
histopatológicas decorrentes da agressão hepática pelo T. cruzi, como infiltração gordurosa,
hipertrofia das células de Kupfer, áreas de necrose, infiltração linfomonocitária dos
capilares intralobularares e periportais (Vianna, 1911; Pinheiro-Chagas, 1920). No modelo
experimental, camundongos com elevada parasitemia teriam uma redução na atividade da
citocromo-oxidase e elevação do cálcio no tecido hepático (Mercato, 1972) enquanto em
seres humanos (fase aguda) foram registrados hipoproteinemia com hipoalbuminemia e
hipocolesterolemia (Laranja et al 1948). Para verificar se a infecção pelo T. cruzi
Discussão
52
interferiria no metabolismo lipídico hepático em animais apoE -/- e selvagem avaliou-se os
lipídeos totais, colesterol total e triglicerídeos no fígado. Os animais apoE-/- apresentaram a
relação peso do fígado versus peso corporal maior, enquanto os lipídeos totais e
triglicérideos em animais infectados apresentaram menores valores. Bouzahzah et al, 2006,
ao fazer análises histopatológicas do fígado de camundongos infectados pelo T. cruzi na
fase aguda, observou danos no tecido conseqüentes a infecção pelo parasito como intensa
vasculite, células inflamatórias e microabcessos, apesar de no estagio crônico não se
observar fibrose. Ainda segundo este autor, a infecção pelo T. cruzi resultaria na ativação
de proteínas kinases extracelulares reguladoras de sinal e ciclinas que estão envolvidos na
proliferação celular e podem contribuir para os processos de reparação após lesão hepática,
observados na fase crônica. No entanto, os mecanismos envolvidos na regulação do ciclo
celular, reparo e remodelação após a infecção por T. cruzi nos hepatócitos ainda não foram
identificados.
Como falado anteriormente, na fase inicial da infecção chagásica ocorre uma
agressão hepática bem caracterizada, a qual se atenua na fase crônica, o que sugere que as
lesões de natureza inflamatória e degenerativa presentes na fase aguda, alterariam pouco as
principais funções hepáticas na fase tardia da doença de Chagas (Brener, 1979). Na
avaliação do colesterol total, os valores apresentaram-se maiores no grupo apoE-/-. É
conhecido que a concentração do colesterol hepático depende da absorção no fígado de
lipoproteínas (via receptores de LDL e LRP), da síntese de colesterol (via atividade da
enzima HMG CoA redutase) e da síntese de ácido biliar. Nossa hipótese é de que a infecção
pelo T. cruzi afetaria a estrutura celular hepática e consequentemente interferiria no
metabolismo e na liberação de lipoproteínas.
A maior parte do colesterol sintetizado endogenamente e oriundo da dieta é
convertido em ácidos biliares e excretado nas fezes. Em nosso experimento observamos
que a infecção pela cepa Be 78 nos animais selvagens, mostrou-se associada ao aumento
dos lipídeos fecais, assim como no grupo infectado pela cepa Colombiana no grupo apoE-/-
. Sendo que neste último grupo observou-se também níveis elevados de colesterol total.
Discussão
53
Diferentemente dos nossos resultados, Portugal et al 2004 e 2006, não encontraram
diferença nos níveis de colesterol fecal em camundongos apoE -/- infectados pelo T. gondii
e colonizados pela bactéria Lactobacillus delbrueckii, respectivamente. Uma elevação na
excreção fecal pode indicar uma menor absorção ou assimilação de colesterol no intestino
(Manzoni et al, 2008), mas mais estudos são necessários para se entender o envolvimento
do T. cruzi neste processo.
Uma vez mostrada que a infecção pelo T. cruzi pode interferir no metabolismo de
alguns tipos lipídicos importantes na aterosclerose, iniciaram-se as investigações sobre a
sua participação na resposta inflamatória em nossos modelos animais.
O aparecimento de células inflamatórias no epitélio vascular no local da lesão é um
dos primeiros fatores observados nos danos causados pela aterosclerose. A localização de
células T ativadas e macrófagos em lesões ateroscleróticas recentes e maduras sugerem que
a imunidade celular têm um papel importante na patogenia aterosclerótica (Hansson, 1997;
Lusis, 2000; Song, 2001). Em modelos animais de infecção pelo T. cruzi já foi descrita a
participação de algumas citocinas como IFN-gama, TNF-alfa, IL-10 e quimiocicinas como
CCL2/MCP1, CCL3/MIP1-alfa, CCL5/RANTES no plasma e coração de camundongos
infectados (Talvani et al, 2000; Roffe et al, 2010). Esses mediadores inflamatórios podem
contribuir para o intenso infiltrado inflamatório através do recrutamento de células TCD8+
e CD4+ e, portanto, para o estabelecimento da miocardite. Em nosso trabalho observamos
uma elevação nos níveis das quimiocinas CCL2 e CCL5 nos animais infectados pelas cepas
Be 78 e Colombiana do T. cruzi, tanto para os animais apoE-/- quanto selvagens. Dentre os
animais infectados, apenas os apoE-/- inoculados com a cepa Be 78 mostraram menores
níveis séricos desses mediadores. Corroborando os nossos resultados, Guedes 2010, ao
estudar cães infectados pelo T. cruzi, observou um aumento significativo de citocinas no
soro e tecido cardíaco destes animais, estas apresentando níveis variados para as diferentes
cepas estudadas. Em conjunto, estes dados reforçam uma estreita relação entre a população
de T. cruzi e a resposta imune do hospedeiro frente a infecção.
Discussão
54
O tropismo diferenciado em camundongos já foi assinalado na literatura para as
diferentes cepas do T. cruzi, determinando o parasitismo preferencial de determinados
órgãos, sendo um fator que influencia a manifestação da patologia da doença de Chagas
(Brener, 1965; Lana e Chiari, 1986). A produção de citocinas durante a fase aguda da
infecção é alterada tanto nos linfonodos cervicais quanto no coração, havendo um aumento
na síntese de algumas citocinas. Isto pode ser correlacionado com as manifestações clínicas
e os níveis de citocinas detectados no coração dos animais infectados (Guedes et al, 2010).
Em nosso estudo o grupo de animais infectados com a cepa colombiana apresentou maior
infiltrado inflamatório no tecido cardíaco que aqueles infectados pela cepa Be 78. Já é
sabido que a cepa Colombiana apresenta tropismo muscular cardíaco e esquelético, com
grande inflamação tecidual, levando a altas taxas de mortalidade (Talvani et al, 2000;
Paula-Costa et al, 2010). Em relação à cepa Be 78, Guedes et al 2010 observou que durante
a fase crônica, cães infectados por esta cepa que não possuíam fibrose e inflamação
apresentavam maiores níveis de IL-10, o que poderia contribuir para uma melhor regulação
entre a produção de citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias.
Em nosso estudo, as análises histopatológicas da aorta indicaram que as lesões dos
camundongos apoE-/- infectados pela cepa Colombiana apresentaram-se maiores e
continham inflamação mais intensa que em camundongos não infectados ou infectados pela
cepa Be 78. Portugal et al, 2004 ao infectar camundongos apoE-/- com o protozoário
Toxoplasma gondii observaram lesões ateroscleróticas maiores e com mais intenso
infiltrado inflamatório corroborando com nossos achados com a infecção pelo T. cruzi. Do
mesmo modo, Sunnemark et al, 2000, ao submeter camundongos CBA/J,
considerados resistentes à aterosclerose, a uma dieta hipercolesterolêmica
concomitantemente à infecção experimental pelo T. cruzi, observou vasculite em alguns
destes animais com presença evidente de células inflamatórias na camada adventícia ao
longo da aorta. Estes dados reforçam nossos achados onde também encontramos
inflamação mais intensa em animais infectados pelo T. cruzi. O dano vascular se mostrou
diferente entre os animais infectados pelas cepas Be 78 e Colombiana sendo mais
pronunciada nesta última. Nestes animais havia um predomínio de macrófagos espumosos
Discussão
55
na inflamação vascular e em alguns, havia ainda deposição de cristais de colesterol na
intima, caracterizando as lesões como recentes. Lesões iniciais da aterosclerose consistem
de acumulações subendoteliais de colesterol e macrófagos espumosos “foam cells” na
camada íntima vascular (Lusis, 2000). A longo prazo estas lesões são precursoras de lesões
mais avançadas caracterizadas pela acumulação de resíduos necróticos e células de músculo
liso. As placas podem se tornar cada vez mais complexas, com calcificação, ulceração na
superfície luminal, hemorragia e consequente formação de um coágulo ou trombo
sanguíneo, podendo resultar em infarto do miocárdio ou acidente vascular cerebral (Lusis,
2000; Ross, 1993). Já no modelo animal apoE-/-, que desenvolvem lesões semelhantes às
encontradas em humanos, estes com aproximadamente 10 semanas de idade, quando
alimentado com dieta comercial desenvolvem estrias gordurosas, lesões caracterizadas
fundamentalmente por macrófagos ricos em lipídeos. Estas lesões progridem para um
estágio intermediário com a adição de células musculares lisas podendo ser visualizadas em
animais com 15 semanas de idade. Nestes camundongos, após 20 semanas de idade, já é
possível visualizar lesões avançadas com presença de capa fibrosa e centro necrótico
(Meyer, 2004; Maeda, 2011). Nestes estágios, a progressão da placa esta associada a
produção de mediadores inflamatórios, estresse oxidativo, migração de macrófagos e
influxo de linfócitos (Binder et al, 2002).
O T. cruzi tem capacidade de invadir qualquer célula nucleada do hospedeiro
vertebrado e uma importante questão acerca do nosso estudo era avaliar se uma
interferência direta deste parasito na parede vascular, iniciaria um processo de injúria
tecidual, com recrutamento de células inflamatórias e desenvolvimento da aterosclerose em
animais apoE -/-. Em nossas análises foram encontrados ninhos no tecido cardíaco em áreas
próximas da aorta na maioria dos animais, mas em apenas um animal foi encontrado um
ninho de amastigota na camada muscular da aorta. A nossa hipótese é de que nos animais
apoE -/- infectados por ambas as cepas, a aceleração da aterosclerose não foi induzida pela
presença direta do parasita na parede vascular e sim indiretamente pela resposta
inflamatória em conseqüência da presença do parasito no organismo do hospedeiro.
Antígenos e DNA do T. cruzi já foram encontrados no infiltrado inflamatório do miocárdio
Discussão
56
(Higuchi et al, 1993; Jones et al, 1993), e estudos mostraram que este poderia liberar
ativadores policlonais, nos quais favoreceriam o desenvolvimento de autoimunidade (Gao
et al, 2003). Alternativamente, durante a infecção a semelhança entre componentes do
parasito e a miosina faria com a mesma não fosse reconhecida como própria pelos
linfócitos do hospedeiro (Cunha-neto et al, 1995). Por outro lado a interação entre
procariotos que atuam frequentemente como simbiontes e são encontrados frequentemente
em grandes quantidades em corações afetados por desordens crônicas, estariam envolvidos
na ruptura de placas ateroscleróticas (Higuchi et al, 2000).
Para avaliar se a infecção pelo T. cruzi seria suficiente para alterar a parede
vascular e interferir na estabilidade das placas ateroscleróticas (quando presentes),
analisamos a quantidade de células inflamatórias e o teor de colágeno na aorta. Observamos
maior inflamação nos animais infectados tanto selvagens quanto apoE-/- (dados não
mostrados), sendo determinada como leve nos animais infectados pela cepa Be-78 e
moderada nos grupos infectados pela Colombiana. Em relação as placas ateroscleróticas
que só foram observadas nos animais apoE-/-, a inflamação se deu de forma semelhante. Já
foram demonstrados que em infecções recentes existem infiltrados focais exsudativos em
torno de células parasitadas em desintegração e um componente difuso, mononuclear, ao
lado de intensa dilatação vascular, congestão e edema. Assim quando o processo
inflamatório se intensifica ocorre deposição de colágeno que pode levar a fibrose ou mesmo
processos degenerativos como necrose (Brener, 1979; Higuchi et al, 2000). Portanto em
relação ao colágeno, em nossos animais apoE-/- infectados pelo T. cruzi observamos maior
deposição na área aórtica lesionada, sendo mais pronunciada no grupo infectado pela cepa
Colombiana. Este fato correlaciona-se com a alta parasitemia sanguínea e maior presença
inflamatória tecidual cardíaca e vascular. A cepa Colombiana elevou dentre outros os
parâmetros já citados, os níveis de quimiocinas e o parasitismo cardíaco, levando a uma
resposta inflamatória mais exacerbada do sistema imune nesses animais (Talvani et al,
2000; Paula Costa et al, 2010). Isto ocorreu diferentemente da cepa Be 78, que nos remete
as diferenças genéticas existentes entre estas duas cepas, como tropismo, virulência e
patogenicidade já citadas neste trabalho........................................................................
Conclusão
57
6.0. Conclusão
Neste trabalho correlacionamos pela primeira vez a infecção experimental pelo T.
cruzi e a interferência do gene da apolipoproteína E (apoE) no desenvolvimento das lesões
ateroscleróticas, concluindo que:
Na ausência da apoE os animais infectados pelo T. cruzi têm diminuição da
parasitemia com aumento do período pré-patente.
Os níveis de colesterol total plasmático mostraram-se elevados nos animais apoE-/-
,
independentemente da cepa de T.cruzi; o que ocorre também com o colesterol HDL, que
mostram-se diminuído nestes animais.
A infecção pelo T.cruzi reduz os níveis hepáticos de lipídeos totais e triglicerídeos
em animais apoE-/-
.
A cepa Colombiana interferiu nos níveis de colesterol total fecal, elevando-os nos
animais apoE-/-
.
Verificamos que na ausência da apoE, a síntese de CCL5 e CCL2 é reduzida na
infecção com a cepa Be78, mas não com a cepa Colombiana.
A infecção pelo T. cruzi aumenta a deposição de colágeno em animais apoE-/-
.
A infecção pelo T. cruzi agrava as lesões ateroscleróticas em animais apoE-/-
,
agravando assim o processo aterogênico.
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