Artigo Original

A V ALIAÇÃO DE UM ENXERTO BIOLÓ­GICO COMO "BY -P ASS" AORTO­AÓRTICO EM UM MODELO ANIMAL

José Dalmo de Araújo, * Domingo Marcolino Braile, ** Marco Antonio Rossi, ***

. Sueli Suzigan, **** Doroteia Rossi Silva Souza, ***** Maria Inês Martins, ******

Os autores apresentam os resultados de estudo ex­perimentai com enxerto biológico de artéria "mamária" bovina com seguimento de até 6 meses e estudo histo­lógico completo até 3 meses (microscopia eletrônica).

Relatam 100% de permeabilidade nos 18 cães ope­rados, utilizando enxertos de 6 cm de comprimento, 4 mm de diâmetro em posição aorto-aórtica. Descrevem a evolução dinâmica da pseudo-mtima, que se espessa até o 14g dia, a partir de quando sofre uma espécie de "limpeza". Esses fenômenos estariam relacionados com a variação da resistência periférica, e teriam como objetivo a diminuição ou aumento do diâmetro do en­xerto, para aumentar ou diminuir a velocidade de fluxo, respectivamente.

Discutem outras causas que podem influir na per­meabilidade dos enxertos longos de pequeno calibre, principalmente aquelas relacionadas com a Lei de Poi­seuílle (raio, comprimento e viscosidade), a influência da carga elétrica da íntima e das técnicas de semeadura de endotélio.

Unitermo: Enxerto vascular

Trabalho Realizado no Depto. de Cirurgia Experimental da IM C-Biomédica de São José do Rio Preto - SP e no labora­tório de Microscopia Eletrônica do Depto. de Patologia da Fa­culdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP.

* Cirurgião Vascular do Instituto de Moléstias Cardio­vasculares de São José do Rio PReto.

** Chefe do Serviço de Cirurgia Cardíaca do Instituto de Moléstias Cardiovasculares de São José do Rio Preto.

*** ProL Titular de Patologia, Depto. de Patologia da Fa­culdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP, Ribei­rão Preto.

**** Chefe do Laboratório de Anatomia Patológica e Cito­patologia S/C Ltda (LARP AC), São José do Rio Pre­to.

***** Bióloga, responsável pela Divisão de Pesquisas e Pu­blicações (DPP) da IMC Biomédica, São José do Rio Preto.

****** Assessora da Divisão de Pesquisas e Publicações da IMC Biomédica, São José do Rio Preto.

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INTRODUÇÃO

A veia safena interna permanece ainda hoje co­mo o material preferido na reconstrução vascular periférica. Nos últimos anos tem sido intensa a in­vestigação sobre enxertos arteriais ou venosos que substituam satisfatoriamente os vasos naturais. Os pesquisadores nessa área concordam em reconhe­cer a dificuldade de se obter um enXerto ideal.

Em face dos vários pontos a serem esclarecidos a nível de enxertos biológicos, na tentativa de se chegar o mais próximo possível do ideal, o presen­te estudo tem como objetivo a avaliação do enxer­to de artéria torácica posterior bovina ou a artéria "mamária" bovina em um modelo experimental animal como "by-pass" aorto-aórtico. A palavra "mamária" é usada entre aspas porque esta artéria corresponde anatomicamente à artéria mamária do homem; a artéria mamária nos bovinos tem outra localização.

MATERIAIS E MÉTODOS'

Para este estudo, foi avaliado um grupo de 18 cães mestiços, pesando de 12 a 15 kg, divididos em 9 grupos, 2 a 2, os quais foram sacrificados após 24 e 48 h. e 7, 14, 21 e 28 dias após o implante e, a médio prazo, após 3 meses e 2 animais para con­trole (28 dias) . (TABELA 1) Nestes últimos, foi feito implante da carótida do cão em posição idên­tica á dos enxertos.

Os enxertos biológicos bovinos em avaliação· são processados como segue. As artérias são obti­das de animais em frigorífico, logo após o abate. A coleta é feita com técnicas especiais para que o ma­terial não seja danificado. Posteriormente, as arté-

TABELA 1: Evolução da amostra estudada.

LOTE Nt DE CÃES EVOLUÇÃO

2 24 horas

2 2 48 horas

3 2 7 dias

4 2 14 dias

5 2 21 dias

6 2 28 dias

7 2 3 meses

8 2 6 meses

9 2 controle (28 d )

TABELA 1: Evoluçio da amostra estudada.

• Enxerto de Artéria Mamária Bovina IMC-BIO - fabricado por IMC Biomédica Indústria Comércio e Representações SI A - São José do Rio Preto - SP

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José Dalmo de Araújo e cals.

rias passam por um processo de tanagem em solu­ção de glutaraldeído (GDA) a 0,5070. Durante essa fase são realizadas duas dissecções para a retirada do material em excesso e feita ligadura dos ramos.

Em uma etapa seguinte, são feitos os testes de controle de qualidade para a avaliação da elastici­dade e conservação da parede da bioprótese, entre eles o teste de encolhimento, que permite qualificar a ação do GDA conferindo a preservação do teci­do, o teste de tensão superficial crítica (CST), o teste de resistência máxima à pressão (RMP) e o teste de resistência máxima à sutura. Para uma se­leção mais segura, são realizados estudos histológi­co e histoquímico em cada uma delas. Ao término da curtição em GDA, as artérias passam pelo teste de liberação final; se aceita, terá seu processamen­to concluído com preservação em solução de eta­nol a 50%. Periodicamente, é feita, por amostra­gem, uma bateria de testes em ratos para estudo de biocompatibilidade. Finalmente, são realizados testes bacteriológicos; a seguir a embalagem é feita em tubos de vidro vedados com tampas de silicone galvanizado, mantendo sempre a condição estéril.

Assim processados, os bioenxertos foram im­plantados na posição já citada ("by-pass" aorto­aórtico). Utilizaram-se enxertos de 6 cm de com­primento e 4 mm de diâmetro. Os animais foram adequadamente preparados para esse tipo de cirur­gia. A anestesia foi feita com thionembutal (2 mg/kg de peso), curarizado, intubado e mantido sob anestésico com fluothane por inalação. Aberto o abdome longitudinalmente, a aorta abdominal foi dissecada abaixo das artérias renais. Para o im­plante do enxerto foram realizadas anastomoses término-laterais em chuleio contínuo com prolene 5-0, seguido de ligadura da aorta entre as anasto­moses (Fig. 1). Utilizou-se heparinização sistêmica com 2 mg/kg. O fechamento da cavidade foi feita por planos. Após o implante o animal permaneceu no biotério com antibiótico (peRicilina 1.200.000 U .1.) por 2 dias. Posteriormente, foi transportado para o seu alojamento natural com acompanha­mento até o prazo previsto para a recuperação de cada enxerto.

As biopróteses resgatadas foram estudadas macro e microscopicamente ao nível de microsco­pia óptica e eletrônica de transmissão e de varre­dura. Para o estudo microscópico, amostras da porção média de cada enxerto e das anastomoses foram obtidas e fixadas por imersão em glutaral­deído a 2,5% em tampão fosfato de sódio pH 7,3 durante 4 horas. Para microscopia eletrônica de transmissão as amostras foram pós-fixadas com te­tróxido de ósmio a 1 % durante 2 horas, desidrata­das em concentrações ascendentes de acetona e in­cluídas em araldite. Secções semifinas de cada fragmento foram obtidas em ultramicrótomo Sor-

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Enxerto biológico

FIG. 1: Esquematlzação do "by-pass" aorto-aórtlco realizado com a artéria mamária bovina no grupo de cães estudados (em cima). Implante da artéria ma­mária bovina com anastomoses término-laterais com chulelos contlnuos e liga­dura da aorta entre as anastomoses (em baixo). L = Ligadura aórtlca; M = ar­téria mamária bovina.

vali IC-4A, coradas com azul de toluidina e exami­nadas em microscópio óptico. Secções ultra finas foram obtidas em ultramicrótomo Sorvall MT-5000 com navalha de diamante, duplamente cora­dos com acetato de uranila e citrato de chumbo e examinadas em um microscópio eletrônico Zerss EM 109. Para microscopia eletrônica de varredu­ra, completada a fixação com glutaraldeído, os fragmentos eram desidratados em concentrações ascendentes de acetona, aderidos a um suporte de cobre com pasta à base de prata, levados ao evapo­rador a vácuo Jeol JEE 4IS, vaporizados com car­vão e recobertos com ouro. As preparações reco­bertas eram examinadas no Scanning Device JEM 100 C/ ASID-4D em aumento padronizado de 2000x.

RESULTADOS

O estudo das amostras resgatadas 48 horas e 7 dias após o implante demonstrou claramente uma pseudo-íntima revestindo a superfície do enxerto. Esse revestimento, total ou parcial, era composto de células mononucleares, caracterizáveis como macrófagos, superpostas a depósitos de proteína. No 142 dia demonstrou-se deposição de plaquetas,

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FlG.:!: Microscopia eletrônica de transmlssio da porçio média do enxerto (3500 X). Artéria "mamária" bovina nio Implantada (a); Implante de 48 horas (b) e de 7 dias (c). Células mononucJeares (macrófaaos) revestem a superflcle lumlual do enxerto; Implante de 14 dias (d). Flbrlnas e erltrócltos são observados revestindo a superflcle lu­minai do enxerto. Implante de 18 dias (e) e de 3 meses (f). A superflcle lumlnal do enxerto apresenta-se "lavada". Os clrculos abertos Indicam a luz vascular.

fibrinas e eritrócitos na superfície vascular. Aos 28 dias e 3 meses após o implante, observou-se uma "lavagem" da superfície do enxerto (Figuras 2 e 3). Nos enxertos recuperados após 3 meses de im­plante, o estudo de microscopia eletrônica de transmissão mostrou parede em boas condições,

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presença de fibras elásticas, colágenas e muscula­res lisas e ausência de endotélio. Na zona limítrofe aorta-implante, após 3 meses, notou-se além de pa­rede em boas condições, tecido cicatricial, fibro­blastos, fibras musculares lisas e elásticas, peque­nas calcificações e ausência de endotélio completo.

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José Dalmo de Araújo e cols.

FIG. 3: Microscopia eletrllnlc de varredura da porçAo média do enxerto (2500 X). (a) 48 após Implante. SuperIlcle lumlnal do enxerto revestido por células com caracterlstlca padrio de cristas e valres; (b) 7 dias após o Implante. PadrAo de cristas e valres parcial e áreas com ausência de revestimento celular de aspecto flbrllar. (c) 28 dias após o Implante. SuperIlcle lumlnal de aspecto flbrllar, sem revestimento de células.

Foram observadas células endoteliais iniciando seu crescimento sobre o tecido cicatricial a partir do vaso receptor (Figura 4). Não pudemos, por razões técnicas, obter o estudo histológico de 6 meses, embora o enxerto estivesse clinicamente não obs­truído.

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FlG. 4: Microscopia eletrllnlca de transmlssio da zona IImltrofe aorta enxerto de amostras 3 meses após o Implante (3500 X). (a) Notar parede do Implante em boas condições e a presença de fibras musculares lisa e elástica; (b) tecido cleatrl· clal com pequenas calcificações; (c) na zona de anastomose células endotellals crescem sobre o tecido clcatrlclaI. O circulo aberto Indica aluz vascular.

DISCUSSÃO

O mecanismo de formação da pseudo-íntima é dinâmico. No início do processo, tanto pelo manu­seio, quanto pelas anastomoses, há um certo grau de espasmo arterial e o fluxo pelo enxerto é mais

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difícil, havendo um maior depósito de proteínas, de modo a diminuir o calibre, e assim aumentar a velocidade do fluxo através do enxerto. Trata-se de um mecanismo de defesa contra a obstrução preco­ce do enxerto, pois num diâmetro menor, o mesmo volume de sangue necessita de uma velocidade maior para passar no mesmo tempo. Assim sendo, o organismo tenta estreitar o conduto para aumen­tar a velocidade do fluxo (8). Por outro lado, a cap­tação de proteínas pelo subendotélio do enxerto ocorre para que o mesmo se torne menos hostil às hemácias e demais células sangüíneas.

Infelizmente, a diminuição do calibre, depen­dendo da causa, ocorre sem freios, atingindo o nível crítico de estenose e obstrução. Portanto, permanecerão desobstruídos os enxertos que tive­rem preservados os seus desagües (sem extensão da doença arteriosclerótica para a periferia) (1), e tam­bém os que não desenvolverem estenoses das anas­tomoses (por hiperplasia fibromuscular da íntima) (3).

É evidente que há outros fatores influindo na permeabilidade dos enxertos dependentes de leis hemodinâmicas, principalmente a Lei de Poiseuille(7). De acordo com essa lei, o fluxo é di­retamente proporcional à quarta potência do raio, e inversamente proporcional ao comprimento do enxerto e a viscosidade do sangue (F =~). Na experi-

LV ência em animais, o resultado foi ótimo, devido ao pequeno comprimento do enxerto, a baixa vis­cosidade, a baixa resistência periférica (Fluxo ~ e pelo estado saudável do animal. reSiStenc ..

Entretanto, nas revascularizações distais dos membros inferiores com enxertos de pequeno cali­bre, os resultados são esperadamente insatis:ató­rios, principalmente se analisarmos que além de o enxerto ser de pequeno diâmetro e longo, a resis­tência periférica geralmente é aumentada, e a vis­cosidade sangüínea do paciente idoso e arteroscle­rótico, geralmente é alta. O~ resultados clínicos com esses enxertos bovinos serão comunicados em trabalho à parte.

Alguns autores têm ressaltado a importância da carga elétrica das mesmas (4,5,6,9,11,12) no senti-do de torná-las o mais semelhante possível à íntima das artérias naturais. Isto nos parece importante quanto às fases iniciais, pois no processo de manu­fatura há destruição do endotélio com alteração de sua dupla camada elétrica. Entretanto, segun­dos após o implante, já há depósito de células e proteínas, o que supostamente torna a íntima no­vamente carregada negativamente; tenta-se alcan­çar o mesmo objetivo com a técnica de semeadura de endotélio em enxertos sintéticos e biológicos (2,10), que parece ser, no momento, a pesquisa mais promissora nesse campo.

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CONCLUSÕES

a. Taxa de permeabilidade de 100070 em cães até 6 meses de implante, em posição aorto-aórtica para enxertos de comprimento curto (+ ou - 6 cm) e diâmetro de 4 mm.

b. Ausência de reações histológicas adversas. c. A evolução da pseudo-íntima é um fenômeno

dinâmico relacionado com a variação da resis­tência ao fluxo.

d. Testes toxicológicos e de biocompatibilidade ne­gativos (ratos).

e. Esse tipo de bioenxerto é satisfatório para im­plantes de pequena extensão, particularmente nos de alto fluxo, como no aorto-aórtico desta experiência.

EXPERIMENTAL STUOY DF BIDGRAFTS AS "BY-PASS" ADRTO-ADRT/C

SUMMARY

The authors present experimental results with a bovine "mammary" artery grafts with a 6 months follow-up and hystological study up to 3 months (transmission electron microscopy). They report a 100% patency in the 16 dogs operated on (there were 2 contro/s) . Grafts used were 6 cm long, had a diameter of 4mm and were implanted as aorto­aortic by-passes. Dinamic evolution of the pseudo-intimais described as thickening up to the 14th day, when it is "cleaned". This can be related with variation in the peripheral resis­tence and due to the narrowing or widening of the graft in order to accelerate or slow the flow velocity. Factors related to Poiseuille's law (diameter, lengt, vis­cosity) are mentioned as important elements for the pa­tency rate of long small diameter grafts. Also, the elec­trical charge of the intima and the endothelial seeding are discussed.

Uniterms: Vascular grafts

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