Aminoácidos, peptídeos e proteínas

Características químicas dos aminoácidos

Os aminoácidos

• Os aminoácidos presentes nas proteínas são isômeros L – A biologia é canhota

• Glicina não tem isomeria óptica

Carbono alfa

Grupo R apolar e alifáticos

• Aminoácidos apolares e hidrofóbicos

• Ligações de Van der Waals

• Ala, Val, Leu, Iso – Interações hidrofóbicas

• Gly; menor aminoácido

• Met – Possui átomo de enxofre

• Pro – Iminoácido, menor flexibilidade estrutural

Grupo R aromáticos

• Aminoácidos hidrofóbicos

• Tirosina pode formar pontes de hidrogênio com a água

• Modificações pós- traducionais – Fosforilação do OH

da tirosina

• Fenilalanina – Mais apolar

Grupos R polares, não carregados

• Solubilidade intermediária em água

• Serina e treonina

– Grupos hidroxil

• Asparagina e glutamina

– Grupo amida

• Cisteína

– Grupo sulfidril

– Ligações dissulfeto

Grupos R carregados

• Aminoácidos básicos – Carga positiva

– Lisina, segundo grupo amino

– Arginina, grupo guanidina

– Histidina, grupo aromático imidazol

• Aminoácidos ácidos – Carga negativa

– Possuem segundo grupo ácido carboxílico

Aminoácidos incomuns

• Modificações pós-traducionais – 4-hidroxiprolina

– 5-hidroxilisina

– 6-N-metil-lisina

– Gama-carboxiglutamato

– Fosforilação de resíduos

• Selenocisteína – Selênio ao invés de enxofre na Cys

– É adicionado durante a tradução por mecanismo específico e regulado

pH e pKa

• Constantes de dissociação dependem do pH do meio e são diferentes para diferentes moléculas

• Ionização

• < pH; > [H]+ estado não-ionizado

Aminoácidos são ionizáveis

• Substâncias anfóteras: possuem natureza dual

• Podem funcionar assim como ácidos ou bases – Doam ou recebem

prótons

Titulação de um aminoácidos

• pKa: tendência de um grupo fornecer um próton ao meio

• Aminoácidos podem perder até 2 prótons para o meio

• Conclusão: a função das proteínas depende do pH ao qual estão submetidas

Curvas de titulação predizem a carga elétrica dos aminoácidos

• Alguns aminoácidos podem ter átomos ionizáveis também em sua cadeia lateral

Peptídeos e proteínas

Polipeptídeo

>Insulina [Homo sapiens]

MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVN

QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT

RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLA

LEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENY

CN

Peptídeos tbm são ionizáveis

• Ou seja, possuem curva de titulação característica

• Funcionam em faixas de pH ótimas

Número de resíduos por proteína

Uso de aminoácidos

• Varia bastante entre as proteínas

• Não permite predizer com precisão o comportamento molecular da molécula

Proteínas com outros grupos químicos

• Adicionados pós-traducionalmente

Trabalhando com proteínas

Proteínas podem ser separadas e purificadas

• Sabendo que a célula possui milhares de proteínas, como purificar uma única delas? – Basta selecionar por propriedade

• Tamanho, carga e propriedades de ligação

• Obter o extrato bruto – “correr” em cromatografia de coluna

• Fase estável (matriz)

• Fase móvel (solução com tampão)

– Coluna maior permite maior resolução na separação

Cromatografia por troca iônica

• Polímero carregado negativamente

– Proteínas positivas ligam ao polímero e demoram mais a ser eluídas da coluna

• Afinidade da proteína é definido também pelo pH

Cromatografia por exclusão de tamanho

• Grânulos porosos na matriz seguram as moléculas menores

• Moléculas grandes não entram nos poros e são eluídas primeiro

Cromatografia de afinidade

• Adiciona-se à matriz da coluna algum tipo de molécula ligante da molécula de interesse

• Molécula ligadora de ATP; adiciona-se ATP à matriz

• Elui-se com solução de ATP

Eletroforese -- Histórico

• 1952, Markham and Smith – Ao estudarem hidrólise de RNA percebem que

moléculas de diferentes estruturas têm sua mobilidade diferenciada quando aplicadas num papel e submetidas a um campo elétrico

• 1955, Smithies – Géis de amido funcionam bem para separar

proteínas do soro humano

• 1967, Loening – Géis de acrilamida com maior resolução e permitem

separar ainda moléculas grandes de DNA

• 1980, Schwartz and Cantor – Eletroforese em campo pulsado separa fragmentos

enormes

• É hoje impossível imaginar um laboratório de biomol sem eletroforese acontecendo a todo instante...

Vou ali correr um gelzinho e

já volto

Tenho que ir senão vou perder meu gel

Eletroforese

• Movimento de partículas dispersas num fluído sob influência de um campo elétrico uniforme

• DNA, carga negativa – Tem tendência a se dirigir ao polo

positivo quando sujeito a um campo elétrico

• Serve para separar moléculas por tamanho/carga elétrica – Proteína deve ser desnaturada com

detergente (SDS)

• Técnica utilizada à exaustão em trabalhos de biologia molecular

Eletroforese, etapas

1.Preparação do gel

2.Aplicação das amostras

3.Eletroforese

4.Coloração

5. Análise dos resultados

Preparação do gel

Horizontal X Vertical

Agarose X Poliacrilamida

Aplicação das amostras

Definição do mapa das amostras por canaleta

Corrida do gel

• Aplicação do campo elétrico

• Fonte elétrica gera fluxo de íons através da solução tampão

• Terminais positivo e negativo

• Tempo adequado, senão o DNA sai do gel

Coloração das moléculas

• Prata

– Gel SDS-PAGE • PoliAcrilamide Gel Electrophoresis

– Melhor resolução

• Coomassie blue, etc

• Brometo de etídio

– Agente intercalante do DNA • Cancerígeno!

– Composto fluorescente à luz UV

– Gel de agarose

Eletroforese de um resultado de cromatografia

O marcador de peso molecular

• Comprado de uma empresa – Possui proteínas de peso molecular bem conhecido

• Permite saber o peso molecular da(s) proteína(s) presente(s) numa amostra

Geis bidimensionais

• Corre-se o gel normalmente em uma dimensão... E depois vira-se-o e corre-se em outra dimensão

• Cada ponto representa aproximadamente uma proteína original presente na amostra – Maiores géis dão maiores

resolução

Proteínas não separadas podem ser quantificadas

• Deve-se saber qual o substrato que a enzima usa

• Deve-se poder medir o produto da ação enzimática

• Uma unidade de enzima digere 1μmol de substrato por minuto a 25ºC

Estrutura primária das proteínas

Níveis estruturais das proteínas

As estruturas primárias das proteínas são conhecidas

• Para todos os genomas sequenciados, conhece-se a estrutura primária de todas as proteínas para este organismo

• As pontes dissulfeto podem se formar entre diferentes cadeias protéicas – E principalmente dentro da

mesma

Sequenciamento de peptídeos

• Degradação de Edman – Marca e remove apenas o

resíduo N-terminal

• Método ineficiente, permite sequenciamento de pequenas porções das moléculas

• Sequenciamento do RNAm é muito mais simples e preciso; permite sequenciar proteínas enormes – como a titina

Produção de peptídeos

• Purificação a partir de tecidos

• Engenharia genética

• Síntese química direta

Alinhamento de sequências

• Os organismos possuem, em grande medida, as mesmas proteínas (ortólogas) – Derivam do ancestral

comum entre os organismos

• O alinhamento permite que identifiquemos as porções mais importantes (conservadas) da proteína

Evolução molecular

• Quanto mais similares as sequências das proteínas dos organismos, mais próximos eles são evolutivamente

Árvore molecular da vida

Conclusões

• Diferentes características químicas das cadeias laterais dos aminoácidos definem características de peptídeos e proteínas

• Os resíduos de aminoácidos são ligados às centenas ou milhares para formar peptídeos e proteínas

• As proteínas podem ser modificadas pós-traducionalmente

• As proteínas podem ser separadas por carga, tamanho e afinidade e assim estudadas isoladamente – cromatografia e eletroforese

• As proteínas podem ser sequenciadas e sua estrutura primária (seq. de aminoácidos é conhecida)

• As sequências das proteínas são excelentes marcadores da evolução da vida na terra