ACCION DE MELATONINA SOBRE LA PRODUCCION DE …
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Profesor Patrocinante Dr. Hans G. Richter Instituto de Histología y Patología Facultad de Medicina ACCION DE MELATONINA SOBRE LA PRODUCCION DE CORTICOSTERONA INDUCIDA POR ACTH EN LA GLANDULA ADRENAL DE RATA EN CULTIVO Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico JOCELYN NATALIA GARCIA SESNICH VALDIVIA – CHILE 2007
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Profesor Patrocinante Dr. Hans G. Richter Instituto de Histología y Patología Facultad de Medicina
ACCION DE MELATONINA SOBRE LA PRODUCCION DE CORTICOSTERONA INDUCIDA POR ACTH EN LA GLANDULA
ADRENAL DE RATA EN CULTIVO
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico
JOCELYN NATALIA GARCIA SESNICH
VALDIVIA – CHILE
2007
Esta Tesis fue realizada en el Instituto de Histología y Patología, Facultad de Medicina,
Universidad Austral de Chile, y fue financiada a través de subsidios otorgados por el Fondo
Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico, (proyecto FONDECYT 1050389) y DID-
UACh S-200433 al grupo de investigación.
AGRADECIMIENTOS:
Agradezco a quienes estuvieron presentes:
A mis profesores patrocinantes Dr Hans Richter y Dra Claudia Torres por los
conocimientos entregados durante el desarrollo de la Tesis, por mostrarme que en ciencia todo es
díficil , pero con perseverancia se obtiene lo deseado.
A mis queridísimos compañeros de laboratorio, Fernando Gaete y Lorena Abarzúa, por su
ayuda desinteresada durante todo el trabajo realizado, sin importar la hora ni las condiciones. Por
las largas horas de “filosofía, discusión y risas”.
A la Sra Auristela Rojas por su ayuda en la realización de los RIAs y por esas horas de
conversación interminables.
A Don Genaro Alvial por enseñarme generosamente las técnicas histológicas aquí
utilizadas.
A quienes en algunos momentos de dificultad me ayudaron a discutir y discernir; Dr José
Sarmiento, MgSc Federico Batiz y Dr César Gónzalez.
A la beca DAEL que me permitió terminar con éxito mis estudios.
A mi Madre.
A mi Padre.
A ambos.
Por forjarme con un corazón fuerte, por regalarme esta íncreible familia y por darme a
través de su amor todas las herramientas que he necesitado.
A mis “guachitos pelaos” Cristian y Felipe por estar siempre tan cerquita, regaloneándonos
sin importar la distancia.
A mi Nina y Tío Nico por apoyarme e incentivarme a seguir.
A Franco por la incondicionalidad, por la compañía, por la entrega, por el amor.
A Quena por mostrarme un nuevo camino, por enseñarme y guiarme en la danza,
por hacerme conciente, por acompañarme y quererme.
A mis amigotas más queridas, casi hermanas Yael y Marce, porque para ellas las
palabras sobran.
I
INDICE DE CONTENIDOS
Página 1 RESUMEN 1
1.1 Abstract 3
2 INTRODUCCION 5
3 RACIONAL DE LA PRESENTE INVESTIGACION 13
3.1 Objetivo General 14
3.2 Objetivos Específicos 14
4 MATERIALES Y METODOS 15
4.1 Animales 15
4.2 Western blot de los receptores de melatonina MT1 y MT2 15
4.2.1 Extracción de proteínas de membrana 15
4.2.2 Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (PAGE-SDS) 17
4.2.3 Electrotransferencia de proteínas a membranas de PVDF 19
4.2.4 Análisis inmunoquímico de las proteínas transferidas a membranas de PVDF 20
4.3 Tinción de los geles con Azul de Coomasie 21
4.4 Obtención de cortes de para análisis histológico 21
4.5 Inmunohistoquímica 23
4.6 Tinción con hematoxilina eosina y con azul de toluidina 24
4.7 RT-PCR semicuantitativo 25
4.7.1 Extracción de RNA total 25
4.7.2 Amplificación mediante RT-PCR 27
4.7.3 Diseño de partidores de PCR 28
4.7.4 Análisis semicuantitativo de los cDNAs mediante PCR 31
4.8 Cultivo de explantes de glándula adrenal de rata 32
4.9 Medición de la producción de corticosterona por explantes de adrenal de rata 36
4.10 Obtención de muestras de plasma de rata 39
II
4.11 Medición de la concentración plasmática corticosterona en rata. 39
4.12 Medición de la concentración plasmática de melatonina en rata. 40
4.13 Análisis de datos 43
5 RESULTADOS 44
5.1 Estandarización de la extracción de proteínas de membrana 44
5.2 Western blot de receptores de melatonina 46
5.3 Inmunohistoquímica de los receptores de melatonina 48
5.4 Evaluación de los extractos de RNA total de glándula adrenal mediante
espectrofotometría, electroforesis y amplificación de gen constitutivo 50
5.5 Amplificación de los mRNAs de los receptores de melatonina MT1 MT2
y RZRα mediante RT-PCR semi-cuantitativo 54
5.6 Análisis de viabilidad celular de glándula adrenal de rata en cultivo.
Tinción hematoxilina-eosina y azul de toluidina. 56
5.7 Concentraciones plasmáticas de melatonina y corticosterona 59
5.8 Efecto de melatonina sobre la producción de corticoesterona estimulada
por ACTH en cultivo de glándula adrenal de rata 61
6 DISCUSION 64
7 BIBLIOGRAFIA 75
8 ANEXOS 86
8.1 Vía de síntesis de corticosterona en la glándula adrenal de rata 86
8.2 Vías de señalización intracelular activadas por la isoforma 1 del receptor
de membrana de melatonina acoplado a proteína G (MT1) 87
8.3 Vías neuroendocrinas y neurales que sitúan a la glándula adrenal
en el contexto de integración de ritmos circadianos 88
III
INDICE DE TABLAS
Página
Tabla 1: Resumen de los partidores de PCR utilizados 30
Tabla 2: Tratamientos aplicados a los explantes de glándula adrenal de rata 35
Tabla 3: Protocolo de radioinmunoensayo para corticosterona 38
Tabla 4: Protocolo de radioinmunoensayo para melatonina. 42
Tabla 5: Muestras de RNA total de adrenal de rata luego de 12 horas de cultivo. 51
INDICE DE FIGURAS
Figura 1: Evaluación de los extractos de proteínas de membrana 45
Figura 2: Immunoblot del receptor MT1 en diversos tejidos de rata 47
Figura 3: Cortes de adrenal de rata inmunoteñidos con anticuerpo
policlonal anti-MT1 49
Figura 4: Análisis de cantidad relativa, posible degradación y
contaminación por DNA genómico de las muestras de adrenal de
rata cultivada por 12 h 52
Figura 5: Análisis de calidad de los cDNAs obtenidos a partir de RNA total
de adrenal de rata cultivada por 12 h 53
Figura 6: Expresión de receptores de melatonina MT1, MT2 y RZRα en
glándula adrenal de rata ex-vivo y luego de 12 h de cultivo 55
Figura 7: Preservación histológica de explantes de adrenal de rata cultivados
en DMEM-HAM F12 por 12 horas 57
Figura 8: Preservación histológica (tinción con HE) de explantes de
adrenal de rata cultivados por 0 a 48 horas 58
Figura 9: Concentraciones plasmáticas de melatonina y corticosterona
a diferentes horas del día 60
Figura 10: Efecto de ACTH y ACTH + melatonina sobre la producción
de corticosterona en explantes de adrenal de rata a 2 horas del día 63
IV
INDICE DE ABREVIATURAS
3β-HSD 3 beta hidroxiesteroide deshidrogenasa
ACTH Adrenocorticotrofina
AMPc Adenosina monofosfato cíclico
B máx Capacidad máxima de unión
BSA Albúmina de suero bovino
CRH Factor liberador de corticotrofina
DAB Diaminobencidina
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Acido desoxirribonucleico
dNTPs Desoxirribonucleótidos trifosfato
DTT Ditiotreitol
EGTA Ácido etilenglicoltetraacético
GnRH Factor liberador de gonadotrofina
HEPES Acido N-2 hidroxietilpiperazino-N´2 etanosulfónico
HPA Hipotálamo-hipófisis-adrenal
HRP Peroxidasa de rábano
IgG Inmunoglobulina G
Kd Constante de disociación
kDa kiloDalton
MT1 Isoforma 1 del receptor de melatonina
MT2 Isoforma 2 del receptor de melatonina
NSB Unión no específica (Non specific binding)
NSQ Núcleo Supraquiásmatico
P450scc P450 side-chain cleavage enzyme
pb Pares de bases
PBS Tampón fosfato salino
PCR Reacción de polimerasa en cadena
PKA Proteína quinasa A
V
PKC Proteína quinasa C
PLP Paraformaldehído-lisina-peryodato
PM Peso molecular
PMSF Fenilmetilsulfonilfluoruro
PVDF Polifluoruro de Vinilideno
RIA Radioinmunoensayo
RNA Acido ribonucleico
RNAm Acido ribonucleico mensajero
RT-PCR Transcripción reversa acoplada a reacción de polimerasa en cadena
RZR α Isoforma α del receptor nuclear de ácido retinoico
RZR β Isoforma β del receptor nuclear de ácido retinoico
SDS Dodecilsulfato de sodio
StAR Steroidogenic acute regulatory protein
TC Cuentas totales (Total counts)
TEMED N,N,N,N'-tetrametilnediamina
Tm Melting point
TRIS Tris-(hidroximetil)-aminometano
1
1 RESUMEN
La posibilidad que melatonina contribuya a la regulación de la producción de
glucocorticoides en adrenal ha sido extensamente debatida. Diversos autores han sometido ratas
a un amplio arreglo de condiciones experimentales ya sea in vivo o in vitro; algunos han
concluído que no existe un acoplamiento evidente entre melatonina y corticosterona plasmática,
mientras otros han aportado evidencia para inhibición de la producción y liberación de
glucocorticoides. Sorprendentemente, todas estas publicaciones no entregan evidencia de la
expresión de receptores funcionales de melatonina en la adrenal de rata. Recientemente, nuestro
laboratorio abordó exitosamente este problema usando varias metodologías, lo que nos permitió
investigar acciones directas de melatonina sobre la producción de corticosterona inducida por
ACTH en explantes (cuartos) de adrenal de rata en el presente trabajo. Por otra parte,
considerando que melatonina circulante es una fuerte señal circadiana exploramos diferencias
respecto de la hora del día en potenciales interacciones melatonina/ACTH para modular
producción de corticosterona en la adrenal de rata. Con esta finalidad, cuartos de adrenal de rata
colectados a las 08:00 am fueron sometidos a tratamiento durante la tarde sobreviniente, mientras
aquellos colectados a las 10:00 pm fueron tratados durante la mañana siguiente. Los tratamientos
incluyeron diferenters combinaciones de DMEM, ACTH, melatonina y luzindole, un antagonista
de receptores MT1/MT2 de melatonina. Los valores de corticosterona al final de las incubaciones
fueron determinados por radioinmunoensayo en 96 supernadantes. Por análisis estadístico de la
razón corticosterona (ng)/tejido (mg), demostramos que la producción de corticosterona
estimulada por ACTH en glándula adrenal de rata adulta bajo condiciones in vitro, es inhibida
por 1-100 nM melatonina, pero no por 100 nM más 1 µM luzindol. Además, se observó que esta
2
inhibición depende de la hora del día. Estos resultados sugieren que la inhibición directa de
melatonina sobre la producción de corticosterona estimulada por ACTH, depende de la hora del
día (i.e., solamente después de administrar melatonina durante la tarde). Queda por investigar qué
extensión de esta potencial nueva acción de melatonina plasmática en roedores nocturnos, resulta
enmascarada por señales reguladoras superpuestas, derivadas en su mayor parte del sistema
nervioso central.
3
1.1 ABSTRACT
The possibility of adrenal glucocorticoid production being under the influence of
melatonin has been long debated. Several authors have subjected rats to a wide arrange of either
in vivo or in vitro experimental conditions; some of them concluded that there is no evident
coupling between plasma melatonin and corticosterone, whereas others provided evidence for
melatonin inhibition of adrenal glucocorticoid production and release. Of note, all these reports
fail to provide evidence accounting for expression of functional melatonin receptors in the rat
adrenal. Recently, our laboratory successfully addressed this issue using several methods, so in
the present investigation we looked for direct actions of melatonin on ACTH-stimulated
corticosterone production by rat adrenal quarters. Besides, considering that circulating melatonin
is a strong circadian signal we also sought after time-of-the-day differences in potential
melatonin/ACTH interactions to modulate rat adrenal corticosterone production. To this end, rat
adrenal quarters collected at 08:00h were subjected to treatment during the ensuing evening,
whereas those collected at 2200 h were treated during the ensuing morning. The treatments
included different combinations of DMEM, ACTH, melatonin, and the MT1/MT2 melatonin
receptor antagonist luzindole. Endpoint corticosterone values were determined by
radioimmunoassay in 96 incubation media. By statistical analyses of the corticosterone
(ng)/tissue (mg) ratio, we demonstrate that the adult rat adrenal gland under in vitro conditions,
exhibits time-of-the-day-dependent inhibition of ACTH-stimulated corticosterone production by
1-100 nM melatonin but not by 100 nM melatonin plus 1 µM luzindole. These results suggest
that melatonin directly inhibits ACTH-stimulated (but not basal) corticosterone production in a
time-of-the-day-dependent manner (i.e., only after challenge during evening time). It remains to
4
be elucidated to what extent this potential novel action of plasma melatonin in nocturnal rodents
is masked by overlapping signals derived for the most part from the central nervous system.
5
2 INTRODUCCION
La glándula adrenal forma parte del sistema endocrino secretando hormonas esteroidales
y catecolaminas. Son de forma triangular aplanada y se encuentran en el polo superior de cada
riñón incluidas en el tejido adiposo que los rodea. Están cubiertas por una cápsula de tejido
conectivo desde donde nacen tabiques hacia el interior de la glándula donde van lo vasos
sanguíneos y nervios. El parénquima se organiza en dos regiones principales: médula y corteza.
En la médula se encuentran las células cromafines productoras de noradrenalina y adrenalina. La
corteza a su vez se subdivide en tres zonas: zona glomerular o externa que constituye
aproximadamente el 15% de la corteza y secreta mineralocorticoides principalmente aldosterona
cuya función es controlar la homeostasis electrolítica; zona fasciculada o media que constituye el
80% de la corteza y secreta glucocorticoides principalmente cortisol (humanos, oveja, etc) y
corticosterona (ratas y ratones), que regulan el metabolismo de glucosa y ácidos grasos, preparan
a los distintos sistemas para la respuesta lucha/huida propia de la respuesta al estrés y suprimen la
respuesta inflamatoria; zona reticular o interna que constituye sólo entre el 5-7% de la corteza y
secreta andrógenos débiles como dehidroepaindosterona y su sulfato, precursores de la síntesis de
estradiol y testosterona en la gónada (Ross et al 2005).
La producción y secreción de glucocorticoides por parte de la zona fasciculada está bajo
el retrocontrol del eje HPA (hipotálamo-hipófisis-adrenal). La hormona liberadora de
adrenocorticotropina (CRH) es un péptido de 41 aminoácidos secretado por el hipotálamo que
estimula la secreción de adrenocorticotropina (ACTH) por parte de la células corticotrófas del
lóbulo anterior de la hipófisis. La adrenocorticotropina es un polipéptido de 39 aminoácidos que
mantiene la morfología de la glándula adrenal y estimula la secreción de glucocorticoides
6
(cortisol en humanos y corticosterona en ratas; Ulrich-Lai et al, 2006) elevando los niveles
intracelulares de AMPc (Bucley y Ramachandran, 1981) lo que induce rápidamente un aumento
en la actividad de la enzima Steroidogenic Acute Regulatory (StAR) incrementando la entrada de
colesterol a la mitocondria. Por otro lado ACTH, incrementa la actividad de otras enzimas
involucradas en la síntesis de corticosterona contribuyendo a un aumento neto de la producción
de corticosterona.
Los niveles plasmáticos de glucocorticoides actúan directamente sobre la hipófisis o
sobre neuronas del hipotálamo ejerciendo una retroalimentación negativa sobre su secreción.
(Arlt y Stewart, 2005).
Los ritmos circadianos de glucocorticoides circulantes se caracterizan por un máximo al
comienzo del período de actividad siendo esto a primeras horas del día para los animales diurnos
incluido el hombre (Ross et al, 2005; Torres-Farfan et al 2003 y 2004) y al anochecer en
animales nocturnos (Ulrich-Lai et al, 2006). El ritmo de corticosterona circulante en ratas
presenta diferencias de 5 a 10 veces entre el máximo nocturno y el nivel mínimo diurno, mientras
el ritmo circadiano de secreción de ACTH sólo alcanza una diferencia de 2 veces (Orth y
Kovacs, 1998) y no presenta diferencias tan pronunciadas durante el día como el ritmo de
corticosterona (Dallman et al, 1978).
El ritmo secreción de ACTH depende de conexiones neurales entre el núcleo
supraquismático (NSQ) y el núcleo paraventricular que regulan la secreción del CRH y
vasopresina, sin embargo el modesto ritmo circadiano de ACTH no da cuenta completamente de
la fuerte oscilación circadiana de la producción de glucocorticoides en la rata, ya que en ratas
hipofisectomizadas sometidas a infusión continua de ACTH se mantiene un ritmo de secreción de
corticosterona (Meier, 1976). La secreción de corticosterona por la glándula adrenal de la rata
7
presenta una respuesta a ACTH que es mayor en la tarde que en la mañana, lo que indica una
diferencia de sensibilidad a esas horas del día (Dallman et al, 1978). Esta diferencia se mantiene
en ratas tratadas con dexametasona, tratamiento que inhibe la ACTH endógena, lo que indica que
los cambios en la sensibilidad de la glándula adrenal son independientes de ACTH. Tanto el
ritmo circadiano de corticosterona como la sensibilidad de la respuesta de la corteza adrenal a
ACTH dependen del NSQ, dado que mediciones del ritmo de corticosterona en ratas sometidas a
lesión del NSQ, demuestran que las diferencias mañana/tarde de sensibilidad a ACTH
desaparecen. Sin embargo, en estas ratas se observan diferencias en la magnitud de la respuesta a
ACTH cuando los animales se agrupan según la concentración basal de corticosterona, lo que
podría implicar que la glándula adrenal mantiene una capacidad intrínseca de responder
diferencialmente a ACTH (Sage et al, 2002). Según algunos autores (Dijkstra et al, 1996), pero
no todos (Ulrich-Lai et al, 2006) en ratas con el NSQ intacto, la diferencia mañana/tarde de
sensibilidad a ACTH desaparece cuando se denerva la glándula adrenal. En esta especie, se ha
descrito una vía de inervación que utiliza al sistema nervioso autónomo para conectar al NSQ con
la corteza adrenal. La funcionalidad de esta vía se demostró al aplicar un pulso de luz en la
noche; tratamiento que disminuyó la concentración plasmática de corticosterona en ratas con el
NSQ intacto pero no en ratas sometidas a lesión del NSQ (Buijs et al, 1999). Cabe hacer notar
que la administración de un pulso de luz durante la noche también disminuye la concentración
plasmática de melatonina (Ganguly et al, 2002). En hamsters, lesiones del NSQ suprimen el
ritmo circadiano de cortisol y corticosterona (ambos esteroides son sintetizados por la corteza
adrenal en esta especie), generando una alta dispersión de los valores plasmáticos de estos
esteroides. Los ritmos circadianos de estos esteroides no se recuperan a pesar de transplantar los
animales lesionados con NSQ de animales normales (Meyer-Berstein et al, 1999).
8
Este conjunto de resultados sugiere fuertemente que el ritmo circadiano de secreción de
glucocorticoides por la corteza adrenal está regulado no sólo por el control del NSQ sobre los
niveles plasmáticos de ACTH, sino también por una vía de inervación directa demostrada por
Buijs et al (1999). Sin embargo, estos resultados no excluyen una capacidad intrínseca de la
corteza adrenal para generar funciones rítmicas.
Una capacidad oscilatoria intrínseca de la función adrenal en cultivo (condición
experimental que implica ausencia de ACTH e inervación; i.e. influencia del NSQ), podría
explicarse por la presencia de un reloj periférico, con un cierto grado de autonomía, en este
tejido. Dentro de este contexto, es importante considerar que desde 1998 a la fecha se ha logrado
demostrar expresión oscilatoria de genes reloj en diversos tejidos de mamíferos, y que en los
últimos dos años estas investigaciones han incluido la glándula adrenal de primates diurnos y
roedores nocturnos (ver detalles en la discusión).
Sakamoto et al (1998) presentaron evidencia que una lesión del NSQ suprime la
oscilación pero no la expresión de genes reloj en diversos tejidos periféricos de rata, observación
que es consistente con el concepto que el sistema circadiano es un ordenamiento jerárquico de
relojes biológicos. Una señal humoral controlada por el NSQ es el ritmo circadiano de melatonina
plasmática que proviene de la glándula pineal (Lewy et al, 1980; Ganguly et al, 2002).
La glándula pineal es un órgano fotosensible y un importante regulador del ciclo
día/noche (ritmo circadiano), que obtiene información acerca de los ciclos de luz y oscuridad
desde los fotorreceptores de la retina a través del haz retinohipotalámico, que se comunica con el
NSQ, cuyos haces nerviosos simpáticos llegan hasta la pineal.(Ross et la 2005; Ganguly et al,
2002).
9
La melatonina es una hormona de tipo indolamina que es sintetizada en forma rítmica
principalmente por la glándula pineal (Reiter, 1991). En mamíferos su mayor concentración
plásmatica se alcanza durante las primeras horas de la noche y se mantiene en bajas
concentraciones durante las horas del día (luz) (Lewy et al, 1980; Ganguly et al, 2002). La
duración del alza de melatonina es proporcional a las horas de oscuridad, por lo que no sólo es
una señal que potencialmente indica la transición día/noche, sino también indica la estación del
año. El ritmo de melatonina como señal estacional está claramente establecido tanto en
mamíferos diurnos como nocturnos (Reiter, 1993). Entonces, según los antecedentes
mencionados en animales diurnos los picos de glucocorticoides y melatonina se encuentran en
antifase, mientras que en animales nocturnos estos se encuentran en fase.
La presencia o síntesis de melatonina se ha detectado también en otros tejidos periféricos
como retina (Zawilska et al, 1991), glándula de Harderian (Djeridane et al, 2001), tracto
intestinal (Bubenik et al, 2002), testículo (Tijmes et a,l 1996) y linfocitos humanos (Carrillo-Vico
et a,l 2004).
La biosíntesis de melatonina en la glándula pineal comienza con la hidroxilación de
triptófano por la 5-triptofanohidroxilasa, seguido de su descarboxilación (para producir
serotonina) por parte de la hidroxitriptófanodescarboxilasa para continuar con la acetilación de
serotonina por la enzima acetilserotonina dando a lugar a la N-acetilserotonina que finalmente es
metilada por Indol-O-metiltransferasa para formar melatonina (Klein et al, 1997).
Melatonina regula distintas funciones en una variedad de tejidos y especies a través de la
activación de receptores específicos para esta hormona. En mamíferos se han descrito
principalmente dos isoformas de alta afinidad denominados MT1 y MT2 (Dubocovich et al,
2003; Masana et al 2001) con una Kd del orden picomolar (Morgan et al, 1994), siendo MT1 de
10
350 amino ácidos y MT2 de 362 aminoácidos con un peso molecular entre 37-40 kDa (Song et al
1997, Rivera-Bermudez et al 2004). Estas isoformas corresponderían a receptores de siete
dominios transmembrana compuestos de 2 exones y un gran intrón de unos 13 kb (Reppert et al,
1994, 1995), y se están acoplados a proteínas heterotriméricas Gi , las que están formadas por las
subunidades α, β y γ (Dubocovich et al, 2003; Masana et al, 2001). La activación de estos
receptores por la unión de melatonina provocaría la disociación en subunidad α y el dímero βγ,
los que interactúan con las moléculas efectoras en la transmisión de señales intracelulares
(Gilman, 1995). Melatonina actúa a través de señales intracelulares que incluyen: inhibición de
la adenilato ciclasa (disminución de los niveles intracelulares de cAMP), fosfolipasa C y A2,
guanidil ciclasa y canales iónicos de sodio(Na+) y potasio (K+) (Dubocovich et al, 2003; Masana
et al 2001; Vanecek, 1998)
La secuencia peptídica de MT1 es altamente conservada en diferentes especies como
humano, rata, hamster y oveja (Song et al, 1997; Reppert et al, 1996) y contiene motivos
estructurales que se han observado en otros receptores acoplados a proteínas G como:
potenciales sitios de glicosilación en su extremo aminoterminal, sitios de fosforilación para PKC,
PKA y caseínas quinasas 1 y 2, los cuales participarían directamente en su regulación funcional.
A nivel de DNA posee un promotor sin caja TATA lo que es común en genes con múltiples sitios
de transcripción (Reppert et al, 1996), posee un zona rica en AT que podría dar inicio a la
transcripción y una zona con alto contenido de GC como en otros receptores acoplados a
proteínas G (Ikuyama et al, 1992).
A nivel nuclear se ha encontrado el complejo RZR:ROR el cual pertenece a una familia
de receptores huérfanos de ácido retinoico; a los cuales se le han atribuido potenciales sitios de
unión a melatonina (Calberg y Wiesenberg 1995; Vanecek, 1998).
11
Para la ubicación y caracterización de los receptores de melatonina se han utilizado
diferentes técnicas como: uso de 2-[I125]melatonina para autoradiografía en cortes y para
determinar parámetros farmacológicos en extractos de proteínas de membrana; RT-PCR
convencional y a tiempo real para identificar la presencia del RNAm en diversos tejidos y el uso
de anticuerpos específicos para identificar la proteína tanto por Western-blot como en
inmunohistoquímica en cortes.
En rata se ha observado unión de 2-[I125]melatonina en cerebro (Mc Artur et al, 1997),
arteria caudal, pars tuberalis, pars distalis, NSQ (Morgan et al, 1994), glándula de Harderian,
intestino (Lopez-Gonzalez et al, 1991) y ovario (Soares et al, 2003).
Por RT-PCR convencional Poirel et al (2003) detectaron RNAm de la isoforma MT1 en
37 de 39 tejidos periféricos estudiados donde se incluyen corazón, hígado, glándula de Harderian
y glándula adrenal; además Pozo et al 1997 lo encontró en timo y páncreas. RNAm de la
isoforma MT2 se ha descrito en: glándula de Harderian (Poirel et al, 2003) e hipotálamo (Sudgen
et al, 1999).
Utilizando PCR en tiempo real Sallinen et al (2005) encontraron RNAm de ambas
isoformas en hipotálamo, retina e intestino delgado y RNAm de la isoforma MT2 en corazón e
hígado. Por otra parte, mediante Western-blot se ha encontrado la isoforma MT1 en ovario
(Soares et al, 2003) y cerebro (Song et al, 1997).
Según los antecedentes entregados melatonina podría servir de nexo entre el NSQ y
osciladores periféricos como la glándula adrenal. En la glándula adrenal de mono capuchino, se
ha demostrado la expresión y caracterizado farmacológicamente receptores MT1 de melatonina
(Torres-Farfan et al, 2003b, 2004). En esta especie ha sido reportado que el mecanismo por el
cual melatonina inhibe directamente la producción de glucocorticoides involucraría al menos la
12
inhibición de una de las enzimas involucradas en la síntesis de cortisol, la enzima 3β-
hidroxiesteroide dehidrogenasa (3β-HSD; Torres-Farfan et al 2004). Además melatonina inhibe
la producción de cortisol estimulada por ACTH en la glándula adrenal de especímenes fetales y
adultos de mono capuchino, a través de activación del receptor de melatonina MT1 expresado en
la corteza de esta glándula (Torres-Farfan et al, 2003 y 2004). Esta fue la primera evidencia de
expresión de receptores funcionales de melatonina en la glándula adrenal de mamíferos.
13
3 RACIONAL DE LA PRESENTE INVESTIGACION
En rata, existe evidencia contradictoria respecto de si melatonina regula la producción de
corticosterona estimulada por ACTH. En base a las evidencias presentadas, melatonina es un
posible modulador neuroendocrino entre el NSQ y la glándula adrenal. Debido a que en rata no
existen evidencias sólidas de la presencia de receptores de melatonina en glándula adrenal, se
investigó la expresión de estos receptores mediante: caracterización farmacológica de receptores
de melatonina por estudios de unión -Bmax- y desplazamiento -Kd-, en preparaciones de
membrana y cortes utilizando 2-[I125] melatonina (tesis paralela), se determinó la presencia de
mRNA de las isoformas MT1 y MT2 y del receptor nuclear RZRα ex-vivo (tesis paralela) e in-
vitro por RT-PCR semi-cuantitativo utilizando partidores publicados por otros autores.
Se determinó la presencia del receptor MT1 ex-vivo utilizando anticuerpos comerciales
específicos mediante western-blot e inmunohistoquímica.
Teniendo como antecedente que la isoforma MT1 del receptor de melatonina se expresa
en glándula adrenal de rata, se cultivaron cuartos de adrenal por un período de 12 horas
(condición experimental que implica ausencia de ACTH e inervación; i.e. influencia del NSQ),
para determinar la interacción de melatonina con ACTH en la regulación de la producción de
corticosterona. Dado que en la rata los picos de corticosterona y melatonina son concurrentes en
las 24-h, se postula que a diferencia de lo observado en el mono capuchino, melatonina no afecte
o incluso sinergize con la respuesta a ACTH en la rata.
14
3.1 Objetivo General
“Investigar el efecto de melatonina sobre la producción de corticosterona inducida por
ACTH en la glándula adrenal de rata en cultivo”.
3.2 Objetivos Específicos
(1) Determinar la presencia de receptores de melatonina en glándula adrenal de rata in vivo
mediante RT-PCR semicuantitativo, Western-blot e inmunohistoquímica.
(2) Estandarizar condiciones de cultivo en explantes de glándula adrenal de rata mediante
tinciones histológicas básicas.
(3) Determinar si existe interacción de melatonina con ACTH en la regulación de la producción
de corticosterona en explantes de glándula adrenal de rata.
15
4 MATERIALES Y METODOS
4.1 Animales
Se utilizaron ratas macho de la cepa Sprague Dawley de 2 a 3 meses de edad, peso
promedio 250 gramos, mantenidas bajo un fotoperíodo de 14 horas luz-10 horas oscuridad, con
humedad y temperatura (18-20°C) controladas y un régimen de pellet y agua ad-libitum. Los
animales se obtuvieron del bioterio del Instituto de Histología y Patología de la Universidad
Austral de Chile y del bioterio de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Pontificia Universidad
Católica de Chile.
4.2 Western blot de receptores de melatonina MT1 y MT2
4.2.1 Extracción de proteínas de membrana:
Materiales
Centrífuga a 4°C, Hettich, Zentrifugen MIKRO 200R. Ultra-Turrax T25 (JANKE &
KUNKEL, IKA-Labortechnik).Sonicador Ultrasonic Homogenizer (Cole-Palmer Instrument
Corporation). Ultracentrífuga a 4°C Beckman Optima LE-80K con rotor 70 Ti. Espectrofotómetro
Meterterk SP830 (ARQUIMED). Lupa y lámpara Nikon. Vortex Genie 2 (Scientific Industries).
Cubeta de plástico de 1ml.Tubos de policarbonato de 5 ml (para uso con Ultra-Turrax). Puntas de
micropipetas. Microtubos de 1,5 ml. Placas Petri. Material quirúrgico estéril (Pinzas, hojas de
afeitar, tijeras).Lámpara de luz roja. (<0.2 lux).
Reactivos
NaCl 0.9% (Merck), Reactivo de Bradford 1X (Biorad), Albúmina de suero bovino BSA
(Sigma), Tampón de lisis pH =7.4 que contiene: Hepes 50 mM, NaCl 150mM, EGTA 1mM,
16
MgCl2 2mM, Glicerol 10%, Tritón X-100 1%, PMSF 1mM.Cóctel inhibidor de proteasas 10ul
por cada 1ml de tampón de lisis Todos los reactivos del tampón de lisis fueron adquiridos en
Sigma-Aldrich Corp.
Procedimiento
Los animales fueron sacrificados por decapitación e inmediatamente se obtuvieron las
glándulas adrenales, las cuales fueron desprovistas de tejido adiposo (con la ayuda de una lupa),
lavadas con suero fisiológico y cortadas en bloques (utilizando una hoja de afeitar estéril), encima
de una placa petri ubicada sobre una fuente con hielo. El procedimiento fue realizado con
material quirúrgico estéril. En las horas de oscuridad los animales fueron sacrificados bajo luz
roja.(< 0.2lux)
A continuación las piezas del tejido se traspasaron a tubos de policarbonato, se agregó
3ml de tampón de lisis y se homogenizó en Ultraturrax, 3 veces por 15 segundos con reposo en
hielo entre las rotaciones. Luego se sonicó 3 veces por 15 segundos con descanso en hielo entre
rondas. Se incubó por 10 min a 4°C, agitando en vortex cada 2 min. Se traspasó el homogenizado
a microtubos de 1,5 ml y se microcentrifugó a media potencia por 10 min a 4°C. El sobrenadante
se centrifugó a 45000 rpm (rotor 70TI) por 45 min a 4°C y luego el pellet fue resuspendido en
500µl de tampón de lisis.
Se construyó una curva de calibración para medir concentración de proteínas mediante el
método de Bradford (1976). Para ello se preparó una solución de 4 ug BSA/ul y se dispuso de 6
microtubos de 1,5 ml con 500ul de agua destilada cada uno. Se agregó sobre el primer tubo 500ul
de la solución 4 ug BSA/ul , se homogenizó por pipeteo obteniéndose una solución 2 ug BSA/ul,
se traspasó 500ul de esta solución al segundo tubo y se continúo en forma sucesiva hasta el tubo
17
seis. De esta forma la curva comprendió los puntos:4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625 ug BSA/ul.,
como blanco se utilizó tampón de lisis.
La medición de concentración proteica se realizó en duplicado tanto para las muestras
como para los puntos de la curva, para ello se agregó 1ml de reactivo de Bradford a microtubos
de 1,5 ml y 5ul de la muestra previamente diluida 10 veces en agua destilada, se agitó en vortex y
se incubó por 15 min a temperatura ambiente. Se midió absorbancia a 595nm. Se construyó
mediante regresión lineal la curva de calibración y se calculó la concentración proteica
interpolando en la curva y multiplicando por el factor de dilución de la muestras.
4.2.2 Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (PAGE-SDS)
Materiales
Centrífuga a 4°C Hettich, Zentrifugen MIKRO 200R. Ultra-Turrax T25 (JANKE &
KUNKEL, IKA-Labortechnik). Estufa termoregulada (Boekel Scientific). Fuente de poder
Consort E833 (Arquimed).Cámara de electroferesis Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad). pH meter
CG840 (Schott). 2 placas de vidrio para mini geles con espaciadores de 1,5mm de grosor. Peineta
de 10 pocillos
Reactivos
Tampón TRIS-HCl 1.5 mM pH = 8.8 para el gel espaciador, Tampón TRIS-HCl 0.5 mM
pH = 6,8 para el gel apilador, Acrilamida /bisacrilamida 30%T, 2,67%C (Ambas de Sigma-
Aldrich Corp.), SDS 10% (Sigma-Aldrich Corp.), Persulfato de amonio al 10 % (Sigma Aldrich
Corp.), TEMED 99% (Sigma-Aldrich Corp.), Tampón de muestra para electroforesis,
conteniendo Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8), glicerol 12,5 %, SDS 5 % y DTT 10% y azul de
bromofenol al 0,2 % para identificar el frente iónico. Tampón de corrida Tris-HCl 0,025 M (pH
18
8,3), Glicina 0,192 M y SDS 0,1 % (P/V) (Sigma-Aldrich Corp.) TRIS y Glicina de Biorad
Laborartories, Inc. Marcador de peso molecular Dual color prestained Precision Plus Protein
Standards (Biorad Laborartories, Inc.).
Procedimiento
El dodecil sulfato sódico (SDS) es un detergente aniónico que desnaturaliza las proteínas
mediante su unión alrededor de la cadena de aminoácidos, confiriéndole al polipéptido una carga
negativa proporcional a su longitud. En su presencia la migración de las proteínas está
determinada por su peso molecular
La electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS (PAGE-SDS) se realizó siguiendo el
procedimiento descrito por Laemmli (1970). Se utilizaron geles en placa (8 x 7,3 cm y 1,5 mm de
espesor) con un gel espaciador al 4 % y un gel separador al 10%. Se sembró por surco un
volumen total de 30 µl correspondiente a 200ug de proteínas de membrana, para ello el volumen
correspondiente a 200ug se microcentrifugó por 45 min a máxima potencia a 4°C, el
sobrenadante fue eliminado y el pellet se resuspendió en 30 µl de tampón de muestra. Las
muestras se calentaron en estufa a 37°C durante 1hora y posteriormente se sembraron sobre el gel
espaciador, en uno de los surcos se sembraron 10ul del marcador de peso molecular. La
electroforesis se realizó a 160V durante 1 h. Concluída la electroforesis el gel se tiñó con azul
brillante de Coomassie o se electrotransfirió a membranas de PDVF, como se describe
posteriormente.
19
4.2.3 Electrotransferencia de proteínas a membranas de PVDF
Materiales
Fuente de poder Consort E833 (Arquimed). Cámara Tranferencia Mini Trans-Blot
Electrophretic Transfer Cell (Biorad). Papel filtro Watman n° 8
Reactivos
Tampón de transferencia, conteniendo Tris-HCl 25 mM (pH 8,3), glicina 192 mM, y SDS
0,1 % (P/V). TRIS y Glicina fueron obtenidos de Biorad Laborartories, Inc; Membrana de
PVDF: Inmobilon-P Transfer Membrane PVDF (Millipore Corporation); Metanol absoluto
(Merck)
Procedimiento
Se cortó la membrana del tamaño necesario, se sumergió en metanol por 15 segundos y
luego se equilibró en tampón de transferencia por 20 min.
Finalizada la electroforesis los geles se equilibraron durante 5 min en el tampón de
transferencia. Posteriormente el gel se colocó sobre papel de filtro y sobre este se ubicó la
membrana del mismo tamaño del gel eliminando cuidadosamente todas las burbujas de aire entre
el gel y la membrana. Sobre la membrana se colocó nuevamente papel de filtro y el “sandwich”
resultante se aprisionó entre dos placas de acrílico cubiertas con esponjas en sus dos caras
interiores asegurándose que el gel quede hacia el catódo y la membrana hacia el anódo, de modo
que las proteínas cargadas negativamente se tranfieran a la membrana. La transferencia se realizó
a 75 mA durante 6 h . Para verificar la transferencia a las membranas, finalizado el periodo de
transferencia los geles de poliacrilamida-SDS se tiñeron con azul brillante de Coomassie R-250.
20
4.2.4 Análisis inmunoquímico de las proteínas transferidas a membranas de PVDF:
Materiales
Estufa termoregulada (Boekel Scientific), Transiluminador de luz blanca, Cámara digital
OLYMPUS Camedia C4000, Software DocIt (UVP, Inc. Upland, CA)
Reactivos
Metanol absoluto (Merk), PBS 1X pH =7,4 (Sambrok et al.,1999), Tampón dilución del
anticuerpo 0.05% Tween 20 (Sigma-Aldrich Corp.), 2% BSA (Sigma-Aldrich Corp.) en PBS
1X pH =7.4 , Anticuerpo anti MT1 dilución 1:100 MEL -1A-R(R-18) (Santa Cruz Biotecnology),
Anticuerpo anti MT2 dilución 1:100 MEL –1B-R(T-18) (Santa Cruz Biotecnology), Anticuerpo
anti IgG de cabra hecho en conejo diluido 1:50000 (Sigma-Aldrich Corp.), Anticuerpo anti IgG
de conejo hecho en cabra conjugado a peroxidasa de rábano (HRP) diluido 1:50000 (Pierce),
Luminol :SuperSignal West Pico chemiluminiscent substrate(Pierce), Película BioMax MR-1 8G
(Kodak), Solución reveladora D-72 (Kodak) Solución fijadora U3 (Kodak).
Procedimiento
Finalizada la transferencia la membrana fue retirada, sumergida en metanol absoluto por
15 segundos y se secó en estufa a 37°C. Luego se incubó por 18 horas a 37°C con el primer
anticuerpo (anti MT1 o MT2 según corresponda) Luego se lavó 4 veces por 5 min con PBS 1X
pH =7,4 y se dejó secar en estufa a 37°C. Se incubó con el segundo anticuerpo (anti IgG de
cabra), por 40 min a 37°C y nuevamente se lavó 4 veces por 5 min con PBS 1X pH 7,4, se dejó
secar en estufa a 37°C y finalmente se incubó con el tercer anticuerpo (anti IgG de conejo) por
30 min 37 °C. Se repitieron los lavados de igual manera. Se incubó con luminol por 10 min en
oscuridad (Luminol/solución intensificadora: solución de peroxidasa estable, 1:1). Posterior a la
incubación con el sustrato SuperSignal, las membranas se expusieron inmediatamente a película
21
BioMax durante períodos de tiempo variable (5 seg - 5 min). Las películas se revelaron con
solución D-72 y se fijaron con solución fijadora U3. El control de la inmunotinción se realizó sin
incubar la membrana con el primer anticuerpo. Las imágenes de la películas fueron capturadas
usando el software DocIt (UVP, Inc. Upland, CA) conectado a una cámara digital (Olympus
Camedia Master 4.1), la cual se utilizó a una velocidad de 1/400 segundos y se usó como fondo
un transiluminador de luz blanca.
4.3 Tinción de los geles con Azul de Coomasie
Para verificar la calidad de los extractos proteicos y la eficiencia de la
electrotransferencia, concluida la electroforesis y la transferencia según corresponda, los geles se
tiñeron con una solución de azul brillante de Coomasie R-250 0,1 % (P/V) (Merck), metanol 50
% (V/V) (Winkler Ltda.) y ácido acético 7,5 % (V/V) (Winkler Ltda.) durante30 min y luego se
lavaron en una solución de metanol 30 % (V/V) (Winkler Ltda.) y ácido acético 10 % (V/V)
(Winkler Ltda.) para eliminar el exceso de colorante.
4.4 Obtención de cortes de para análisis histológico
Materiales
Micrótomo R Jung A.G. Heidelberg. Portaobjetos y cubreobjetos. Cámara de extracción
para la batería de alcoholes. Estufa termoregulada Forma Scientific Inc..Moldes metálicos para
bloques de parafina. Lámpara de luz roja (<0.2 lux).
22
Reactivos
Fijadores: PLP (paraformaldheído lisisna peryodato), parafolmaldheído al 4% o bouin,
Parafina en pastillas Histosec (Merck), Xilol (Baker), Etanol (Winkler Ltda.), Butanol (Winkler
Ltda.).
Procedimiento
Los animales fueron sacrificados por decapitación, se obtuvieron las glándulas adrenales,
las cuales fueron desprovistas de tejido adiposo y cortadas en mitades utilizando una hoja de
afeitar estéril, encima de una placa petri ubicada sobre una fuente con hielo. El procedimiento fue
realizado con material quirúrgico estéril. En las horas de oscuridad los animales fueron
sacrificados bajo luz roja.
Las glándulas fueron procesadas ex-vivo o cultivadas por 12 a 48 horas y luego
procesadas (ver protocolo cultivo más adelante). A continuación fueron fijadas en el fijador
correspondiente a cada caso por 24 horas, luego se deshidrataron pasando sucesivamente por
alcohol 70%, alcohol 96%, alcohol 96%, alcohol 100%, alcohol 100%, solución alcohol: butanol
1:1, butanol, butanol dejando 40 min en cada uno de ellos La inclusión se realizó dejando
sucesivamente 1hora en solución butanol-histosec 1:1 ( 1 vez) e histosec (3 veces). El histosec
se aplica líquido calentando previamente hasta 60°C. Se dejó a temperatura ambiente para que
solidifique la parafina y se realizaron cortes en micrótomo con un grosor 6 micras, los cuales son
montados sobre porta objetos.
Los cortes fueron desparafinados pasando sucesivamente 10 min por xilol (2 veces),
alcohol 100%, alcohol 96%, alcohol 70%, agua. Posteriormente los cortes se utilizaron para el
análisis histológico de los mismos mediante inmunocitoquímica y tinción con hematoxilina-
eosina y azul de toluidina (ver más adelante).
23
4.5 Inmunohistoquímica
Materiales
Cortes desparafinados de glándula adrenal de rata de 6 micras fijados en PLP, Cámara
húmeda (Thelco Precision Scintific Corporation), Sistema digital de captación de imagen:
utilizando el software MR GRAB conectado cámara digital Axiocam MRc Zeiss, Cubreobjetos
Reactivos
Metanol (Winkler Ltda.), Peróxido de hidrógeno (Merck), Solución PBS 1X , 1% BSA
(para bloqueo y dilución del anticuerpo), Tampón Tris-HCl 0.01M pH= 7,8 (Biorad Ltda.),
Anticuerpo anti MT1 dilución 1:250: MEL -1A-R(R-18) (Santa Cruz Biotecnology), Anticuerpo
anti MT2 dilución 1:250: MEL –1B-R(T-18) (Santa Cruz Biotecnology), Kit DAKOCytomation,
Diaminobencidina (DAB) (Sigma) , Bálsamo de Cánada.
Procedimiento
Luego de desparafinar los cortes, se inactivaron las peroxidasas endógenas incubando 10
min con solución 1:1 de metanol: agua oxigenada a temperatura ambiente. Se bloqueó por 45
min con solución PBS 1X , 1% BSA a temperatura ambiente. Se lavó 3 veces con TRIS-HCl
0,01M pH= 7,8 por 5 min cada vez. Se incubó por toda la noche en cámara húmeda con el primer
anticuerpo 1:250 (anti-MT1 o anti-MT2 hecho en cabra). Los lavados fueron repetidos de igual
manera y se incubó por 20 min con reactivo 1 de kit DAKOCytomation (anti IgG cabra
biotinilado), se lavó nuevamente y se incubó por 20 min con reactivo 2 (estreptavidina-HRP), se
lavó por última vez y se reveló con DAB (sustrato cromogénico de HRP) incubando 15 min en
oscuridad.
Se deshidrataron los cortes dejando sucesivamente 5 min en agua, alcohol 70%, alcohol
96%, alcohol 100%. Luego los cortes fueron montados utilizando bálsamo de Cánada y
24
posteriormente fotografiados utilizando un sistema digital de captación de imagen usando el
software MR GRAB conectado a una cámara digital (Zeiss)
4.6 Tinción con hematoxilina eosina y con azul de toluidina
Materiales
Cortes desparafinados e hidratados de glándula adrenal de rata de 6 micras fijados en
PLP, parafolmaldheído o bouin, Cubreobjetos, Sistema digital de captación de imagen:
utilizando el software MR GRAB conectado cámara digital Axiocam MRc Zeiss.
Reactivos
Hematoxilina de Harris (Lerner Laboratorios), Solución acuosa de eosina al 1% (Merck),
Solución de borato de sodio al 1% (Merck), Solución de azul de toluidina (Merck) al 0,5% , 20%
de etanol (Winkler Ltda.) pH=4,6, previamente filtrada, Batería de alcoholes para desparafinar,
deshidratar e hidratar. (Detalladas en obtención de cortes de para análisis histológico), Bálsamo
de Cánada
Procedimiento
Para el caso de la tinción con azul de toluidina una vez desparafinados e hidratados los
cortes, estos se lavaron con agua y se trataron con la solución de tinción por 10 min, luego se
lavaron nuevamente con agua, se deshidrataron utilizando alcohol de 95º y alcohol absoluto,
ambos 2 veces por un minuto. Luego los cortes se deshidrataron y se montaron utilizando
bálsamo de Cánada.
Para el caso de la tinción con Hematoxilina-Eosina, luego de desparafinados, hidratados y
lavados con agua, los cortes se incubaron por 5 min con Hematoxilina de Harris, se lavaron con
agua por 10 min y con solución de borato de sodio al 1% por 2 min. Luego se incubó con
25
solución acuosa de eosina por 5 min. Se lavaron nuevamente con agua por 1 minuto, para luego
ser deshidratados y montados. Los cortes fueron fotografiados utilizando un sistema digital de
captación de imagen usando el software MR GRAB conectado a una cámara digital.
4.7 Análisis semicuantitativo de mRNAs usando Reverse Transcription - Polymerase
Chain Reaction (RT-PCR).
4.7.1 Extracción de RNA total
Materiales
Centrífuga a 4°C, Hettich, Zentrifugen MIKRO 200R. Ultra-Turrax T25 (JANKE &
KUNKEL, IKA-Labortechnik). Tubos de policarbonato de 5 ml (para uso con Ultra-Turrax).
Vortex. Puntas de micropipetas estériles con filtro y libres de nucleasas. Microtubos de 1,5 ml.
Termoblock (o baño termorregulado a 55-65°C, para resuspender el RNA). Material quirúrgico
estéril (Pinzas, hojas de bisturí, tijeras). Balanza analítica. Lámpara de luz roja(<0.2 lux).
Reactivos
Cloroformo (CHCl3) (Winkler Ltda.). Etanol absoluto (Merck). Iso-2-Propanol (alcohol
isopropílico) (Winkler Ltda.) Agua libre de nucleasas (Winkler Ltda.). Trizol (Invitrogen).
Procedimiento
Los animales fueron sacrificados por decapitación en horarios diferentes 10:00 am y
10:00pm (sacrificio bajo luz roja), se obtuvieron las glándulas adrenales las cuales fueron lavadas
3 veces en suero fisiológico estéril frío a 4°C y procesadas ex–vivo (tesis paralela) o luego de 12
horas de cultivo. Cada 4 glándulas (aproximadamente 100 mg de tejido) se utilizó 1 ml de
solución de extracción (Trizol ) en un tubo de policarbonato estéril de 5 ml.
26
Las muestras se homogenizaron en Ultraturrax, alternando rotaciones de 15 segundos con
reposo en hielo. Los homogenizados se dejaron 5-10 min a temperatura ambiente para la
inactivación de las RNAsas y destrucción de las membranas celulares. Por cada mL de Trizol se
agregaron 200 µL de cloroformo y se mezclaron en vortex a máxima potencia por 15 segundos.
Luego se incubaron a temperatura ambiente por 5 min, se traspasaron a microtubos de 1,5 mL y
se microcentrifugaron a 4°C, a máxima potencia, 15 min. La fase superior que contiene el RNA-
total se traspasó a un microtubo nuevo (máximo 600 µL por tubo). Las fases inferiores fueron
eliminadas (contienen las proteínas, lípidos y el DNA). Se agregaron 500 µL de alcohol
isopropílico por cada 500 µL de fase acuosa, mezclando los tubos varias veces por inversión y
posteriormente se incubaron 10 min a temperatura ambiente (precipitación del RNA). Se
microcentrifugó a: 4°C, máxima potencia, 10 min; los sobrenadantes fueron eliminados y los
pellet se lavaron con 500 µL de Etanol pro-análisis al 75%, seguido de agitación breve en vortex
y microcentrifugaron a 4 °C, máxima potencia, por 5 min, se repite el lavado un a vez más. Se
eliminó el sobrenadante y se dejó secar el pellet de RNA a 37°C por 10 min en Termoblock con la
tapa del microtubo abierta. Los pellets fueron resuspendidos cuidadosamente en H2O libre de
nucleasas (30 µL-50 µL-100 µL, según el tamaño del pellet), mediante pipeteo repetido. Las
resuspensiones de RNA total resultantes fueron incubadas a 55°C por 5 min en Termoblock para
disolver mejor el RNA. Finalmente para determinar concentración del RNA se midió
absorbancia, a 260 nm (ácidos nucleicos) y 280 nm (proteínas), considerando como óptima una
relación A260/280 en la lectura de las absorbancias de entre 1,8 a 2,0. Cada muestra se midió en dos
diluciones distintas (por ejemplo: 1:50 y 1:100). Luego se promedió y se obtuvo la concentración
final.
27
Para RNA existe la relación: 1 OD 260 = 40 µg/mL
Entonces para el cálculo de concentración se utiliza:
A260 de la muestra x 40 x factor de dilución de la muestra = µg/mL de RNA
Se hicieron diluciones en agua libre de nucleasas para llevar el RNA a una concentración
de trabajo de 1 µg/µL.
Se determinó la integridad del RNA por medio de un gel de agarosa no denaturante al
1,5% teñido con bromuro de etidio, en corrida de electroforesis lenta 45 Volts, 25 mA. (Ver
Figura 3) Este experimento permite un chequeo rápido y eficiente de la calidad de muestras de
RNA total, obviando el uso de paraformaldehído y temperatura. Los parámetros medidos en el
gel son: probable contaminación con DNA genómico, eventual degradación de la muestra y
cantidad de RNA total relativa entre las muestras existiendo correspondencia con las
concentraciones medidas espectrofotométricamente.
4.7.2 Amplificación mediante transcripción reversa acoplada a reacción de polimerasa en
cadena RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction)
Materiales
Termociclador Perlkin Elmer GeneAmp 2400 System; microtubos de pared delgada de
0,2 ml; micropipetas y puntas de micropipeta estériles, con filtro, certificadas como libres de
nucleasas, proteasas y pirógenos (AXYGEN).
Transcripción Reversa
Se sintetizó la primera hebra de cDNA por transcripción reversa a partir de muestras
seleccionadas de RNA glándula adrenal de rata luego de un cultivo de 12 horas.
28
Se usó transcriptasa reversa y reactivos para síntesis de primera hebra de cDNA
comprados a INVITROGEN (BiosChile). La transcripción reversa se realizó a partir de 5 µg de
RNA (5 µl de diluciones de trabajo a 1 µg/µl), utilizando 100 ng de partidores al azar
(hexámeros), tampón de síntesis de primera hebra 5X (1X), DTT 0,1 M (10 mM), dNTPs 10mM
cada uno (0.5mM) y SuperScript II RNase H- 10 U, en un volumen final de 20 µL. Las muestras
de RNA total fueron llevadas a 10 µl en DEPC-H2O y denaturadas a 70ºC durante 10 min.
Enseguida la reacción de transcripción reversa fue montada en hielo e incubada en el
termociclador con el siguiente programa: 25 ºC durante 10 min, 42ºC durante 60 min, 90ºC
durante 5 min y 4 ºC indefinidamente.
4.7.3 Diseño de partidores de PCR
En el presente trabajo, se usaron partidores (Tabla 1) publicados por otros investigadores
y modificados levemente, chequeados en cuanto a la calidad de bandas y parámetros
termodinámicos para ello se consideró el cumplimiento de las siguientes exigencias mínimas:
- tamaño óptimo del fragmento de PCR entre150-300 pb.
- tamaño mínimo de cada partidor 20 bases.
- rango de Tm 45 -60 ºC.
- estabilidad de extremos “internos” media-alta.
- formación teórica de dímeros y loops igual a 2 configuraciones como máximo.
- la secuencia de los partidores no debe aparear significativamente con otras secuencias
publicadas en GeneBank.
Por otra parte, se enviaron a sintetizar partidores para el gen constitutivo β-actina que se
expresa de forma estable en diferentes tipos celulares.
29
Por otra parte, se enviaron a sintetizar partidores para el gen constitutivo ß-actina que se expresa de forma estable en diferentes tipos celulares.
30
Tabla 1: Resumen de los partidores de PCR utilizados
Partidores
Gen Sentido /
Antisentido GenBank (gi)
Temperatua de anealing
ºC
Nº optimo
de ciclos
Producto de PCR
(pb)
β-ACTINA
5'-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC3'/ 5'-CAAACATGATCTGGGTCATCTT3'
Publicado en Focus (Invitrogen
Corp)
59 48
24 352
MT1 5'-CAACCTGCAAACCGGAACTC-3'/
GGAAAACCACCAGGGCAAT
10567523 Peschke et al
(2006)
52 51
42 101
MT2 5'-CTCACTCTGGTGGCCTTGGT-3'/ 5'-AACTGCGCAGGTCACTGGGTC
7672690 Kobayashi et al
(2005)
57 58
42 250
RZRα 5'-AGAACAACACCGTGTACTTT-3'/ 5'-CTTCTGAAGGACATGTTGAAG-3'
109483592 Kobayashi et al
(2005)
48 46
42 254
31
4.7.4 Análisis semicuantitativo de los cDNAs obtenidos usando reacción de DNA
polimerasa en cadena (PCR).
Se utilizaron muestras de cDNA obtenidas anteriormente por RT-PCR. Las mezclas de
reacción de PCR contuvieron 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 3,0 mM MgCl2, 0,2 mM de
cada deoxy-NTP, 0,2 µM de cada partidor de PCR, 1,25 U Taq DNA polimerasa y 2 µl (10%) del
producto de transcripción reversa en un volumen total de 25 µl. La reacción de PCR se realizó en
un termociclador PerkinElmer GeneAmp 2400 System (PerkinElmer Inc., MA, USA) y consistió
de un paso de denaturación inicial a 94 ºC por 1 min 45 seg, seguido por 42 ciclos, 94 ºC por 30
seg, 60 ºC por 1 min y 72 ºC por 1 min. Al término de los ciclos de PCR, las muestras fueron
sometidas a una extensión final a 72 ºC por 10 min y posterior mantención a 4 ºC.
Para el caso del gen constitutivo β-actina el programa consistió de un paso de
denaturación inicial a 94 ºC por 2 min 35 seg, seguido por 28 ciclos de 94 ºC por 35 seg, 60 ºC
por 1 min y 72 ºC por 1 min. Al término de los ciclos de PCR, las muestras fueron sometidas a
una extensión final a 72 ºC por 10 min y posterior mantención a 4 ºC
Alícuotas de 10 µl de los productos de PCR fueron analizadas mediante electroforesis en
geles de agarosa al 2 % preteñidos con bromuro de etidio. La imagen de cada gel fue capturada
usando el software DocIt (UVP, Inc. Upland, CA) conectado a una cámara digital (Olympus
Camedia Master 4.1). Cada muestra fue amplificada en al menos 3 ensayos separados para cada
gen de interés.
32
4.8 Cultivo de explantes de glándula adrenal de rata
Materiales
Material de cirugía estéril. Lupa conectada a sistema de luz fría (Nikon).Placas de cultivo de
24 pocillos (Nunclon).Filtro de 0,2 micras (Steritop Millipore Corporation).Cámara de flujo
laminar (Forma Scientific Inc.).Estufa de cultivo Water Jacketed Incubator (Forma Scientific
Inc.).Balanza analítica (BL 150S Sartorius AG Göttingen). Microtubos de 1,5 ml. Puntas para
micropipetas estériles.Centrífuga a 4°C, Hettich, Zentrifugen MIKRO 200R.Lámpara de luz roja.
(<0.2 lux).
Reactivos
Medio de cultivo DMEM-HAM F12, que contiene una combinación 1:1 de medio Dulbecco
modificado (DMEM) y la mezcla de nutrientes F12HAM. A este medio se le adicionó: 0.1% de
BSA, bicarbonato de sodio, glucosa, hepes, penicilina G sódica (100 mg/l), estreptomicina (50
mg/l), sulfato de kanamicina (25 mg/l) y anfotericina B (2.5 mg/l).Todos los reactivos fueron
adquiridos en Sigma-Aldrich Corp. El medio fue filtrado utilizando un filtro de 0.2 micras
(Steritop) antes de usar; Adrenocorticotropina 1-39 (ACTH) (Sigma A 0423); Melatonina (Sigma
M 5250); Luzindole (Sigma L 2407); Etanol (Merck); Dimetlsulfóxido (DMSO) (Merck).
Procedimiento Los animales fueron sacrificados por decapitación en dos horarios diferentes, una hora
después de encender la luz (8:00 am) y una hora después de apagarla (10:00 pm), se obtuvieron
las glándulas adrenales , las cuales fueron desprovistas de tejido adiposo y cortadas en cuartos
(utilizando hojas de afeitar estériles), encima una placa petri ubicada sobre una fuente con hielo.
El procedimiento fue realizado con material quirúrgico estéril. A las 10:00 pm los animales
fueron sacrificados bajo luz roja.
33
El cultivo se llevó a cabo utilizando el protocolo descrito por Torres-Farfan et al 2003a
modificado levemente.
Los cuartos de adrenal fueron lavados 2 veces por 15 min con suero fisiológico estéril y
frío. Se preincubó cada cuarto en 500ul medio de cultivo DMEM-HAM F12 0,1% BSA por 6
horas y luego el medio fue cambiado por uno con el tratamiento correspondiente según se indica
en la Tabla 2. Cada tratamiento se realizó en los dos horarios indicados, se utilizó un número de
animales igual a seis (n= 6) en cada punto horario y se realizó un seguimiento por animal, es
decir, un cuarto de adrenal de cada animal se sometió a uno de los ocho diferentes tratamientos.
Los cuartos de adrenal fueron cultivados por 12 horas a 37 °C , 100% humedad, 5% CO2, 95%
aire. Considerando el tiempo involucrado en los lavados y en el sacrificio de los animales
(aproximadamente 1 hora ) los tratamientos se extendieron desde las 3:00 pm hasta las 3:00 am
para los explantes correspondientes a ratas sacrificadas a las 8:00 am y desde las 5:00 am hasta
las 5:00 pm para el caso de los explantes provenientes de las ratas sacrificadas a las 10:00 pm.
Las soluciones de trabajo se prepararon por dilución seriada a partir de un stock
concentrado. Para el caso de melatonina se utilizó un stock 1mg/ml en etanol absoluto y se
realizaron diluciones sucesivas en medio DMEM-HAM F12 0,1% BSA de modo de alcanzar las
soluciones de trabajo (1nm -100nM); para luzindole el stock utilizado fue de 1mg/ml en DMSO
diluido en DMEM-HAM F12 0,1% BSA hasta una concentración final de trabajo 1 µM.; el stock
de ACTH usado fue de 1mg/ml en agua destilada , diluida posteriormente en DMEM-HAM F12
0,1% BSA hasta una concentración de uso 100nM.
Una vez finalizado el cultivo, los explantes fueron pesados individualmente en balanza
analítica, el medio fue centrifugado a 1200 g por 10 min a 4 ºC y guardado a -20ºC hasta la
medición de corticosterona por radioinminoensayo (RIA).
34
Los explantes sin estímulo se fijaron en bouin , PLP o paraformaldehído al 4% para
posterior Inmunohistoquímica, Tinción con Hematoxilina- Eosina o Azul de Toluidina
35
Tabla 2: Tratamientos aplicados a los explantes de glándula adrenal de rata.
Tratamiento 1 2 3 4 5 6 7 8 ACTH(nM) - 100 100 100 100 100 100 - Melatonina (nM) - - 1 10 100 10 100 10 Luzindol (µM ) - - - - - 1 1 -
Se indica la concentración final de cada fármaco en el volumen de cultivo utilizado por explante.
36
4.9 Medición de la producción de corticosterona por explantes de adrenal de rata
Materiales
Vortex Genie 2 (Scientific Industries).Baño termoregulado. Gradillas para tubos
Khan.Tubos Khan de policarbonato de 5ml. Repipeteador Eppendorf. Gradillas para tubos khan
con base magnetica. Contador de radiación gamma 1270 Rack Gamma II LKB Wallac.
Reactivos
Rat corticosterone (I125) Biotrak Assay with Amerlex-M tm magnetic separation RPA 548
(Amersham Biosciences)
Procedimiento
Como se indicó anteriormente luego de un cultivo por 12 horas los explantes fueron
pesados individualmente en balanza analítica y el medio fue centrifugado a 1200 g por 10 min a 4
ºC y guardado a –20ºC Luego se descongelaron y se homogenizaron en vortex. Los medios sin
tratamiento y los con tratamiento con melatonina 10nM se diluyeron 5 veces usando 60 µl de
medio y 240 µl de tampón borato; el resto de los medios se diluyeron 20 veces usando 15 µl de
medio y 285 µl de tampón . Una vez diluidos se calentaron a 60ºC por 30 min para desplazar la
corticosterona unida a globulina. El procedimimento del radioinmunoensayo se llevó a cabo
como indica el manual del kit utilizado: “Rat corticosterone (I125) Biotrak Assay with Amerlex-M
tm magnetic separation” RPA 548 (Amersham Biosciences).
En primer lugar se reconstituyen los reactivos liofilizados en tampón borato pH : 7,4
(incluido en el kit).A continuación se construye la curva de calibración por dilución seriada del
estándar de 400ng corticosterona/ml contenido en el kit. Esta curva incluye los puntos: 0,078;
0,156; 0,312; 0,625; 1,25; 2,5; 5; 10 y 20 ng corticosterona /tubo. A continuación se sigue el
37
protocolo indicado en la Tabla 3. El cálculo de la producción de corticosterona se describe en
resultados.
38
Tabla 3: Protocolo de radioinmunoensayo para corticosterona
Cuentas
Totales (TC)
Unión no
específica
(NSB)
Estándar
cero (B0)
Estandares Muestras
Tampón - 200 100 - -
Estándar - - - 100 -
Muestra - - - - 100
1erAnticuerpo - - 100 100 100
Trazador 100 100 100 100 100
Agitar en vortex, cubrir los tubos e incubar a temperatura ambiente (15-30ºC) por 2 horas
2do Anticuerpo - 400 400 400 400
Agitar en vortex. Incubar por 10 min a temperatura ambiente (15-30ºC). Dejar 15 min sobre las
gradillas con bases magnéticas para la separación del 2do anticuerpo (que viene recubriendo
partículas magnéticas). Voltear la gradilla y dejar decantar el sobrenadante por 5 min sobre papel
absorbente. Contar por 1 minuto en contador gamma. La medición de todos los puntos se realizó
en duplicado.
(Todos los volumenes indicados son en microlitros)
39
4.10 Obtención de muestras de plasma de rata
Materiales
Tubos de ensayo heparinizados. Centrífuga refrigerada Sorvall RT 6000 . Microtubos de
1,5 ml. Lámpara de luz roja. (<0.2 lux).
Procedimiento
Se sacrificaron por decapitación 3 ratas por punto horario con una frecuencia cada 4 horas
comenzando a las 10:00 am. En el momento de la decapitación se recolectó en tubos
heparinizados aproximadamente 1ml de sangre por animal, la cual fue centrifugada a 1200 g por
15 min a 4 ºC y guardada a –20ºC a hasta la medición de corticosterona y melatonina en plasma
mediante radioinminoensayo. Durante las horas de oscuridad los animales se sacrificaron
utilizando una lámpara de luz roja.
4.11 Medición de la concentración plasmática corticosterona en rata
Materiales
Baño termoregulado. Tubos Khan de policarbonato de 5ml.Gradillas para tubos
Khan.Vortex Genie 2 (Scientific Industries). Gradillas para tubos Khan con separador mágnetico.
Contador de radiación gamma 1270 Rack Gamma II LKB Wallac
Procedimiento
Las diferentes muestras fueron descongeladas y homogenizadas en vortex, se diluyeron 5
veces en tampón borato p H : 7,4 y se calentaron las muestras a 60ºC por 30 min para desplazar la
corticosterona unida a globulina. El procedimimento del radioinmunoensayo se llevó a cabo
como indica el manual del kit utilizado: “Rat corticosterone (I125) Biotrak Assay with Amerlex-M
tm magnetic separation” RPA 548 (Amersham Biosciences), como se describió anteriormente.
40
4.12 Medición de la concentración plasmática de melatonina en rata.
Materiales
Tubos Khan de 5ml de vidrio. Gradillas para tubos Khan. Vortex Genie 2 (Scientific
Industries); Baño termoregulado.Centrífuga refrigerada Sorvall RT 6000 Dupont.
Viales; Contador de radiación beta 1270 Rack Beta LKB Wallac.
Reactivos
Estándar de melatonina (Sigma) de 1mg/ml.Se prepara con 10 mg de melatonina, 0.5ml
de etanol (Merck) y 9,5 ml de agua destilada; Eter dietilico (Merck); Acetona (Merck)
Anticuerpo antimelatonina 1:5000 ( AB/S/02 Stockgrand Ltd., Guilford Surrey,UK); Trazador [O-
methyl-3H] melatonin 83 µCi/mmol Amersham Biosciences TRK 798, Sweden; Solución de
carbón activado; Líquido de centelleo preparado con 12,5 gr de PPO(Sigma), 0,25gr POPOP
(Sigma) y 2,5L de Tolueno (Merck) ; Tampón tricina pH= 5,5 que contiene 0,1M tricina 99%
tritiada (Sigma), 0,9% NaCl (Merck) y 0,1% de gelatina (Sigma) previamente disuelta a “baño
María”.
Procedimiento
El procedimimento del radioinmunoensayo para melatonina fue estandarizado por el
grupo de investigación liderado por la Dra. María Serón-Ferré de la Unidad de Reproducción y
Desarrollo, Departamento de Fisiología, Facultad de Ciencias Biológicas de la Pontificia
Universidad Católica de Chile (Ver Torres-Farfan et al 2003a y b)
Las diferentes muestras fueron descongeladas y homogenizadas en vortex, 200 µl de cada una se
extrajó con 2ml de éter dietílico, se agitó por un minuto en vortex, se dejó en reposo por 5 min a
temperatura ambiente, se deja en hielo seco con acetona por 3 min y luego se evapora en baño
termoregulado. A continuación se reconstituye en 500 µl de tampón tricina, para cada medición
41
por RIA se utilizan 500 µl (200 µl de muestra reconstituida + 300 µl de tampón tricina), lo que
corresponden a 80 µl de la muestra original.
La curva de calibración se construyó por dilución seriada del estándar de melatonina y
esta va desde los puntos 0,16 pg/ µl hasta 1 pg/µl. A continuación se sigue el protocolo indicado
en la Tabla 4.
42
Tabla 4: Protocolo de radioinmunoensayo para melatonina.
Cuentas
Totales (TC)
Unión no
específica
(NSB)
Estándar
cero (B0)
Estandares Muestras
Tampón - 700 500 - -
Estándar - - - 500 -
Muestra - - - - 500
1erAnticuerpo - - 200 200 200
Agitar en vortex, cubrir los tubos e incubar a 37ºC por 1 hora.
Trazador 100 100 100 100 100
Agitar en vortex, cubrir los tubos e incubar a 4ºC por 20 horas
Agregar 200ul de solución de carbón activado.
Agitar en vortex, cubrir los tubos e incubar a 4ºC por 15 min.
Centrifugar por 15 min a 1200 g, traspasar a viales. Agregar 8ml de líquido de centelleo.Agitar en
vortex e incubar
2do Anticuerpo - 400 400 400 400
Agitar en vortex. Incubar por 10 min a temperatura ambiente (15-30ºC). Dejar 15 min sobre las
gradillas con bases magnéticas para la separación del 2do anticuerpo (que viene recubriendo
partículas magnéticas). Voltear la gradilla y dejar decantar el sobrenadante por 5 min sobre papel
absorbente. Contar por 1 minuto en contador gamma. La medición de todos los puntos se realizó
en duplicado.
(Todos los volumenes indicados son en microlitros)
43
4.13 Análisis de datos
El análisis estadístico de los datos se llevó a cabo utilizando el programa computacional
GraphPad Prism versión 3.02 (GraphPad Software Inc, San Diego, CA). Los resultados fueron
considerados significativos cuando los valores de P<0.05.
Las concentraciones plasmáticas de melatonina a las diferentes horas del día se analizaron
con Test de Student. Las concentraciones de corticosterona fueron analizadas mediante análisis
de varianza (ANOVA) para muestras repetidas, usando Newman-Keuls como post-hoc.
El efecto de ACTH y ACTH más melatonina sobre la producción de corticosterona en
explantes de adrenal de rata se analizó mediante ANOVA para muestras repetidas, con Newman-
Keuls como post-hoc. Para el análisis de este efecto a los dos horarios estudiados se empleó
ANOVA de dos vías y Bonferroni como post-test.
44
5 RESULTADOS
5.1 Extracción de proteínas de membrana
La estandarización de la extracción de proteínas de membrana se realizó verificando la
calidad de los extractos proteícos mediante tinción de los geles con azul de Coomassie.
Los extractos proteícos de adrenal de rata y de los tejidos usados como control (datos no
mostrados), presentaron un patrón de bandas continuo y característico para cada tejido, que se
mantuvo entre los diferentes extractos obtenidos. Bandas bien definidas fueron aparentes en todo
el rango del gel (pesos moleculares altos, intermedios y bajos), lo cual es un buen indicador de
ausencia de degradación (Figura 1).
45
st kDaAdrenal stst kDaAdrenal
Figura 1: Evaluación de los extractos de proteínas de membrana.
Se observa un bandeo bien definido a lo largo de todo el gel, en los extractos de proteínas de
membrana de adrenal de rata, lo que indica ausencia de degradación.Estos extractos se utilizaron
posteriormente para Western-Blot. St: estándar de peso molecular kDa: kiloDalton
46
5.2 Western-blot de receptores de melatonina en extractos de proteínas de membrana de
animales sacrificados a las a las 10:00 am y 10:00 pm .
Se detectó la isoforma MT1 en extracto de proteínas de membranas de adrenal, hígado,
páncreas y testículo de rata cuando se utilizaron extractos de animales sacrificados a las 10:00
pm. (Figura 2).La proteína MT1 no se detectó en diafragma, tejido en el cual se ha descrito la
ausencia de receptores de melatonina. En los mismos tejidos, pero de animales sacrificados a las
10:00 am no se detectó la presencia del receptor MT1 (Figura 2). La isoforma MT2 del receptor
de melatonina no se detectó en ninguno de los tejidos estudiados a los dos horarios de
experimentación (resultados no mostrados).
47
kDa
10:00pm10:00am10:00am 10:00pm10:00pm
st
10:00pm10:00pm10:00am10:00am10:00am10:00am 10:00pm
Adrenal Hígado Páncreas Testículo Diafragma Adrenal Hígado Páncreas Testículo DiafragmaControl Control kDa
10:00pm10:00am10:00am 10:00pm10:00pm
st
10:00pm10:00pm10:00am10:00am10:00am10:00am 10:00pm
Adrenal Hígado Páncreas Testículo Diafragma Adrenal Hígado Páncreas Testículo DiafragmaControl Control
Figura 2: Immunoblot de varios tejidos de rata (obtenidos a las 10:00 am y 10:00 pm),
usando un anticuerpo policlonal anti-MT1 de Santa Cruz. Panel derecho: Una banda única
de 37 kDa fue detectada en tejidos recolectados a las 10:00 pm (adrenal, hígado, páncreas y
testículo), pero no en diafragma. Panel Izquierdo: Cuando estos tejidos fueron obtenidos a las
10:00 am, no se detectaron polipéptidos. En ambos casos, los carriles control corresponden a
extracto de proteínas de membrana de adrenal que se incubaron sin el primer anticuerpo.En el
extremo derecho se observa el estándar de peso molecular utilizado (st).
48
5.3 Inmunohistoquímica de los receptores de melatonina, in vivo e in vitro (cultivo de 12
horas) de glándulas extraídas a las 10:00 am y 10:00 pm
Aún cuando se utilizaron diferentes fijadores (bouin, paraformaldheído y PLP) y
protocolos de incubación y revelado, no se obtuvieron resultados reproducibles para el caso de la
inmunohistoquímica de lo receptores de melatonina tanto para glándulas recién extraídas como
para las cultivadas. Para el caso de la isoforma MT1 se obtuvo una observación única de buena
calidad en glándula procesada inmediatamente luego de su extracción (Figura 3), mientras que
para MT2 no fue posible lograr inmunotinción.
49
A B
C
*
N
N
N
GL
eFA
eFA
eFA GL
A B
C
*
N
N
N
GL
eFA
eFA
eFA GL
A B
C
A B
C
A B
C
*
N
N
N
GL
eFA
eFA
eFA GL
Figura 3: Cortes de adrenal de rata (obtenida a las 02:00 pm), inmunoteñidos con
anticuerpo policlonal anti-MT1. A: la marca se restringió a la corteza adrenal, en particular a
las células esteroidogénicas de la mitad externa de la capa fasciculada (eFA); a este bajo
aumento, también se aprecia marca en al citoplasma y membrana celular de adipocitos asociados
a la cápsula adrenal (asterisco) y a los vasos sanguíneos localizados mas profundamente en la
glándula (cabezas de flecha). B: aumento intermedio de la corteza adrenal, donde se indican la
mitad externa de la fasciculada (eFA) y glomerulosa -sin marca- (GL). C: mayor aumento de la
marca específica exhibida por columnas de células de la mitad externa de la capa fasciculada
(eFA); note que los núcleos celulares no presenta marca (3 de ellos están indicados por N). Los
cortes se fotografiaron utilizando un sistema digital de captación de imagen: MR GRAB Software
conectado a cámara digital Zeiss. Las barras indican 50 µm.
50
5.4 Evaluación de los extractos de RNA total de glándula adrenal de rata (cultivada por
12 h) mediante espectrofotometría, electroforesis y amplificación de gen constitutivo
Evaluación de las muestras de RNA total
Se determinó la integridad del RNA por medio de un gel de agarosa no denaturante, cada
uno de los surcos del gel de agarosa 1,5% (tinción: bromuro de etidio) fue cargado con 3 µg de
extractos de RNA total de adrenal de rata luego de 12 horas de cultivo (Figura 4). Ninguna
muestra presentó contaminación por DNA genómico, lo cual se determina por la ausencia de
tinción en los pocillos de carga. El DNA genómico, por su gran tamaño [kb] no penetra en los
geles de agarosa al 1,5%. Algunas de las muestras fueron desechadas por bajo rendimiento de la
extracción de RNA con respecto a muestras equivalentes (Tabla 5)
Evaluación de la calidad de los cDNAs
Se verificó la calidad de los cDNAs obtenidos a partir de los extractos de RNA total
realizando PCR del gen constitutivo β-actina, observándose en las muestras seleccionadas que la
cantidad expresada es similar entre las diferentes muestras al cargar cantidad igual de cDNA
(Figura 5).
51
Tabla 5: Muestras de RNA total de adrenal de rata luego de 12 horas de cultivo.
Muestra * Razón Abs
260/280
µg totales Concentración
(µg/µl)
1 1.4 46.08 1.536
2 1.7 43.20 1.440
3 1.6 50.88 1.696
* Cada muestra corresponde a RNA total de 3 adrenales. Se indican las razones de Absorbancia
260/280 nm y los rendimientos en µg de RNA total/100 mg de tejido (n=3 adrenales). El número
total de muestras procesadas fue de 9 (14 animales); sin embargo, en la tabla se presentan sólo las
muestras seleccionadas según el análisis de integridad del RNA.
52
---28S ---
---18S ---
k b - RNA adrenal de rata In vitro-
I II III IV
---28S ---
---18S ---
k b - RNA adrenal de rata In vitro-
I II III IV
Figura 4: Análisis de cantidad relativa, posible degradación y contaminación por DNA
genómico de las muestras de adrenal de rata cultivada por 12 h. Imagen digital
monocromática del gel de agarosa al 1.5 % teñido con bromuro de etidio. Surcos, I: Indicador de
tamaño de DNA de 100 pb, II: muestra 1, III: muestra 2, IV: muestra 3, kb: Indicador de tamaño,
28S subunidad mayor de RNA ribosomal, 18S subunidad menor de RNA ribosomal. Las
muestras provienen de ratas sacrificadas a las 10:00 pm, un resultado similar se obtuvo para las
muestras de las 10:00 am.
53
---352 pb
I II III IV
---352 pb
I II III IV
Figura 5: Análisis de calidad de los cDNAs obtenidos a partir de RNA total de adrenal de
rata cultivada por 12 h. Imagen digital monocromática del gel de agarosa al 1.5 % teñido con
bromuro de etidio. Surcos, I: Indicador de tamaño de DNA de 100 pb, II: c DNA de muestra 1,
III: c DNA de muestra 2, IV: cDNA de muestra 3. La banda que se observa en los 3 surcos
corresponde al fragmento de 352 pb esperado para β-actina. Las muestras provienen de ratas
sacrificadas a las 10:00 pm, un resultado similar se obtuvo para las muestras de las 10:00 am.
54
5.5 Amplificación de los mRNAs de los receptores de melatonina MT1, MT2 y RZRα
mediante RT-PCR semi-cuantitativo en muestras de adrenal de rata ex vivo (Tesis paralela)
e in vitro (presente Tesis).
En muestras mRNAs de adrenal de rata extraídas ex-vivo a las 10:00 pm , fue posible
observar la amplificación de las bandas esperadas de 101 pb , 250 pb y de 254 pb
correspondientes a MT1, MT2 y RZRα respectivamente (Figura 6A; resultados de Tesis
paralela), resultado que se repitió para el caso de mRNAs de adrenales cultivadas por 12 h
(Figura 6B).
55
A: ex-vivo B: in-vitro
MT1 MT2 RORα kb kb RORα MT2 MT1
I II III IV I II III IV
---250 pb
---101 pb
250 pb---
101 pb---
A: ex-vivo B: in-vitro
MT1 MT2 RORα kb kb RORα MT2 MT1
I II III IV I II III IV
A: ex-vivo B: in-vitro
MT1 MT2 RORα kb kb RORα MT2 MT1
I II III IV I II III IV
---250 pb
---101 pb
250 pb---
101 pb---
Figura 6: Expresión de receptores de melatonina MT1, MT2 y RZRα en glándula adrenal
de rata ex-vivo y luego de 12 h de cultivo. Imagen digital monocromática del gel de agarosa al
2,0 % teñido con bromuro de etidio. Panel A: Muestras ex-vivo, I: banda de 101 pb esperada para
MT1, II banda de 250 pb esperada para MT2; III: banda de 254 pb correspondiente a RZRα: IV:
Indicador de tamaño de DNA de 100 pb. Resultados de tesis paralela.
Panel B: muestras in-vitro I: Indicador de tamaño de DNA de 100 pb; II banda de 254 pb
correspondiente a RZRα; III: banda de 250 pb esperada para MT2; IV: banda de 101 pb esperada
para MT1. Las muestras provienen de ratas sacrificadas a las 10:00 pm. En las muestras de ratas
sacrificadas a las 10:00 am no fue posible detectar la expresión de ninguno de los receptores de
melatonina estudiados (datos no mostrados).
56
5.6 Análisis de viabilidad celular de glándula adrenal de rata cultivada durante 0 a 48
horas. Tinción hematoxilina-eosina y azul de toluidina.
La preservación histológica de los explantes utilizados se evalúo mediante tinción con
azul de toluidina (Figura 7) y mediante tinción con Hematoxilina-Eosina (Figura 8).
Observamos, en los diferentes explantes cultivados, que número de núcleos picnóticos no
aumentó significativamente en el tiempo, considerandose entonces viables para realizar los
ensayos posteriores.
57
Figura 7: Preservación histológica (tinción con azul de toluidina al 5%) de explantes de
adrenal de rata cultivados en DMEM-HAM F12 por 12 horas. Se observaron escasos núcleos
picnóticos en los diferentes explantes cultivados, lo que indicó que los explantes fueron viables;
por lo tanto las condiciones de cultivo fueron consideradas adecuadas para realizar ensayos
funcionales. Panel superior: 10X. Panel central: 20X. Panel inferior: 40X.
58
A B
C
G H
JI
D
E F
--sin cultivo--
--12 horas de cultivo--
--24 horas de cultivo--
--36 horas de cultivo--
--48 horas de cultivo--
A B
C
G H
JI
D
E F
--sin cultivo--A B
C
G H
JI
D
E F
--sin cultivo--
--12 horas de cultivo--
--24 horas de cultivo--
--36 horas de cultivo--
--48 horas de cultivo--
Figura 8: Preservación histológica (tinción con HE) de explantes de adrenal de rata
cultivados por 0 a 48 horas. Paneles: A-B: explantes sin cultivar, C-D: cultivo por 12 hrs, E-F
cultivo por 24 hrs, G- H cultivo por 36 hrs, I-J cultivo por 48 hrs. El aumento de todos los paneles
es 20X. Se observa mantención de las estructuras celulares y del tejido; a medida que aumentan
las horas de cultivo se produce disgregación del tejido, pero no se observa una alta mortalidad
celular (i.e., el número de núcleos picnóticos no aumenta significativamente en el tiempo).
59
5.7 Determinación de las concentraciones plasmáticas de melatonina y corticosterona.
Se observó un marcado ritmo en la concentración plasmática de melatonina (Figura 9A),
la cual se mantuvo baja durante el día y aumentó a partir del atardecer, lo que concuerda con lo
publicado por otros autores (Sallinen et al, 2005; Lewy et al, 1980).
La secreción de corticoesterona medida en el plasma de estos mismos animales aumentó
durante las primeras horas de la noche, alcanzando un máximo a las 02:00 am; sin embargo, se
observó una disminución en el punto horario de las 10:00 pm. (Figura 9B),
60
10 14 18 22 26 30 34 380
100
200
300
*
10 14 18 22 02 06 10 14Hora del día
Corticosterona (ng/ml de plasma)
10 14 18 22 26 30 34 380
20
40
60
80
10 14 18 22 02 06 10 14
&
Hora del día
Melatonina (pg/ml de plasma)
A
B
10 14 18 22 26 30 34 380
100
200
300
*
10 14 18 22 02 06 10 14Hora del día
Corticosterona (ng/ml de plasma)
10 14 18 22 26 30 34 380
20
40
60
80
10 14 18 22 02 06 10 14
&
Hora del día
Melatonina (pg/ml de plasma)
A
B
Figura 9: Concentraciones plasmáticas (promedio ± ES) de melatonina (A, n=3) y
corticosterona (B, n=3) a diferentes horas del día. &: distinto de las 18 hrs (P<0.05), Test de
Student; *: distinto de las 22, 06 y 14 hrs (P<0.05), ANOVA para muestras repetidas usando
Newman-Keuls como Post-hoc. La barra negra indica las horas de oscuridad.
61
5.8 Efecto de melatonina sobre la producción de corticosterona estimulada por ACTH
en cultivo de glándula adrenal de rata.
Considerando el tiempo involucrado en el sacrificio de los animales, en el desgrasamiento
y lavado de las adrenales (aproximadamente 1 hora), los tratamientos se extendieron desde las
03:00 pm hasta las 03:00 am (en adelante “estimulación en la tarde”) para los explantes
correspondientes a ratas sacrificadas a las 08:00 am y desde las 05:00 am hasta las 05:00 pm (en
adelante “estimulación en la mañana”) para el caso de los explantes provenientes de las ratas
sacrificadas a las 10:00 pm.
Los resultados presentados muestran que la producción de corticosterona por los explantes
sometidos a estimulación en la tarde fue significativamente mayor que en los explantes cultivados
cuya estimulación se realizó en la mañana. Además, se observó que la glándula adrenal de rata
presenta una sensibilidad a ACTH que varía con la hora del día, debido a que los explantes de
ratas sacrificadas en la mañana (08:00 am) que fueron tratadas con 100nM ACTH en la tarde,
presentaron una mayor producción de corticosterona respecto del basal (Figura 10).
También encontramos que bajas concentraciones melatonina (1-100nM) tuvieron un
efecto inhibitorio directo sobre la producción de corticosterona estimulada por ACTH en
glándula adrenal de rata in vitro, ya que se observó una disminución en la producción de
corticosterona en explantes tratados en la tarde. Este efecto fue casi completamente revertido por
luzindol, un antagonista de receptores MT1 y MT2 de melatonina. En contraste, en los explantes
tratados en la mañana, ninguna de las concentraciones de melatonina tuvo efecto sobre la
producción de corticosterona. Melatonina por si sola no tuvo efecto sobre la producción de
corticosterona en este modelo experimental (Figura 10).
62
Analizando ambos horarios en conjunto, encontramos diferencias significativas entre la
producción basal de corticosterona, versus los explantes sometidos a tratamiento con ACTH y
ACTH + melatonina + luzindol (Figura 10).
63
0
20
40
60 Estimulación en la tardeEstimulación en la mañana
*
* * * * * *
&
* &
* &
& &
Corticosterona (ng/mg tejido)
ACTH (100 nM) - + + + + + + -Melatonina (nM) - - 1 10 100 10 100 10Luzindol (1µM) - - - - - + + -
0
20
40
60 Estimulación en la tardeEstimulación en la mañana
*
* * * * * *
&
* &
* &
& &
Corticosterona (ng/mg tejido)
ACTH (100 nM) - + + + + + + -Melatonina (nM) - - 1 10 100 10 100 10Luzindol (1µM) - - - - - + + -
Figura 10: Efecto de ACTH y ACTH + melatonina sobre la producción (promedio ± ES) de
corticosterona en explantes de adrenal de rata (n=6 explantes por condición) a 2 horas del
día. Las ratas fueron eutanizadas a las 08:00 am (n= 6 estimulación en la tarde) y a las 10:00 pm
(n= 6 estimulación en la mañana). Una vez obtenidas, las adrenales fueron divididas en cuartos y
pre-incubadas por 6 horas, seguido por exposición a cada uno de los estímulos por 12 horas,
comenzando a las 15:00 h en tejido obtenido a las 08:00 h y a las 05:00 h en tejido obtenido a las
22:00 h. *, distinto de la producción basal (P<0,05; ANOVA y Newman-Keuls como post-test).
&, distinto de la producción con estimulación diurna (P<0,05; ANOVA de dos vías y Bonfferoni
como post-test).
64
6 DISCUSION
De acuerdo a los resultados presentados podemos concluir que la glándula adrenal de rata
expresa un receptor de melatonina cuya expresión cambia con las horas del día , a través del cual
melatonina ejerce un efecto inhibitorio directo sobre la producción de corticosterona estimulada
por ACTH in vitro. Además, una observación interesante que se desprende de nuestros resultados
es que la función adrenal in vitro cambia con la hora del día, tanto en condiciones basales como
en respuesta a ACTH.Resultados que son consistentes con la variación circadiana observada para
el receptor de melatonina y que podrían estar evidenciando una capacidad intrínseca de oscilación
de la glándula adrenal de rata.
En una investigación paralela de nuestro laboratorio, se realizaron ensayos de unión
específica de 2-[125I]iodomelatonina en extractos de proteínas de membrana y cortes de crióstato.
Se determinó unión de 2-[125I]iodomelatonina en muestras de adrenal de rata obtenidas a las
10:00 pm pero no a las 08:00 am; de manera saturable y reversible (constante de disociación =
14.22 ± 1.23 pM; capacidad máxima de unión = 0.88 ± 0.02 fmol/mg proteína). Previamente, se
había publicado la presencia de sitios de unión de melatonina de baja afinidad (Kd 541 pM), con
una capacidad total de unión de 3.23 fmol/mg proteína en adrenal de rata colectada entre las
09:30 y 11:00 am (Persengiev, 1992). El valor comparativamente elevado de la Kd obtenida por
este autor, puede ser explicado al menos en parte por la no saturación de la isoterma de unión
específica. Sin embargo, estos resultados no fueron confirmados por Pang et al (1994), quienes
encontraron una muy baja densidad de unión de 2-[125I]iodomelatonina con alta afinidad (< 0.2
fmol/mg proteína); no obstante, estos autores no informaron la hora de recolección de las
muestras.
65
La expresión de transcritos codificantes para las isoformas MT1 y MT2 de receptores de
melatonina, que pudieran dar cuenta de la expresión de las correspondientes proteínas, ha sido
estudiada por nuestro grupo y también otros autores. Poirel et al (2003) detectaron el mRNA del
receptor de melatonina MT1 en la adrenal de rata usando RT-PCR convencional. Los resultados
de nuestro grupo confirman que la adrenal de rata expresa este transcrito, pero también indica la
transcripción de la isoforma MT2, cuya identidad fue confirmada mediante secuenciación de
ambos cDNAs. Estos resultados fueron adicionalmente confirmados por análisis de expresión de
MT1 y MT2 usando PCR en tiempo real con partidores que flanquean un sitio de empalme para
el único intrón de gran tamaño (> 13 kb) de estos genes.
En el presente trabajo detectamos el polipéptido esperado para MT1 (37 kDa) en extractos
de proteínas de membrana de adrenal de rata, lo cual se correlaciona bien con los resultados
obtenidos en paralelo en nuestro laboratorio, que indican transcripción del RNAm codificante
para la isoforma MT1, así como también aquellos de unión de 2-[125I]iodomelatonina. Aún
cuando el PM calculado tanto para MT1 como MT2 es 39-40 kDa (Dubocovich y Markowska,
2005), diversos autores han encontrado una banda de 37 kDa en Western blot con diferentes
anticuerpos anti-MT1 (Chan et al, 1997; Song et al, 1997; Carrillo-Vico et al, 2003; Rivera-
Bermudez et al, 2004). Sin embargo, considerando el alto número de publicaciones sobre
receptores de melatonina que aparecen cada año, la evidencia de expresión de las
correspondientes proteínas en diferentes tejidos y especies es escasa. Esto podría explicarse por la
carencia de anticuerpos de alta calidad contra receptores de melatonina; es así como no fuimos
capaces de inmunodetectar la isoforma MT2 en adrenal de rata, a pesar de amplificar el mRNA
de MT2 por RT-PCR convencional y en tiempo real.
66
Además, detectamos un polipéptido de 37 kDa en extractos de proteínas de membrana de
otros tejidos periféricos, tales como hígado, páncreas y testículo, usados como controles
positivos; mientras que el diafragma -seleccionado como control negativo (ver Torres-Farfan et
al, 2003)- no presentó señal para la proteína MT1. Un hallazgo relevante de la Tesis, es que el
polipéptido MT1 fue consistentemente detectado a las 10:00 pm pero no a las 10:00 am en todos
los tejidos estudiados, a pesar de haber realizado este experimento varias veces usando diferentes
grupos de animales. Esta marcada variación a lo largo del día sugiere que se debe poner especial
atención a la hora del día, al estudiar efectos de melatonina en diversos tejidos periféricos.
Considerando que la adrenal de rata es de tamaño reducido (22± 2 mg cada una) y que, de
acuerdo a nuestras mediciones, el rendimiento de proteínas de membrana es bajo después de
varias horas de cultivo (en comparación a tejido ex vivo); no fue posible realizar detección
inmunoquímica del receptor MT1 in vitro, puesto que habría conllevado al sacrificio de un
número demasiado elevado de animales.
Resultó extremadamente díficil inmunoteñir cualquiera de las isoformas del receptor de
melatonina en cortes de adrenal de rata con anticuerpos comerciales. Aún cuando probamos
muestras recolectadas a diferentes horas del día, bajo diversas condiciones de fijación, inclusión,
corte, inmunotinción y revelado; no fuimos capaces de inmunodetectar la isoforma MT2 (notese
que por PCR convencional se detectó un bajo nivel de expresión para las glándulas cultivadas).
En cambio, el uso del anticuerpo anti-MT1 nos permitió observar una marca discreta
exclusivamente en muestras recolectadas a las 02:00 pm; resultado que sin embargo no fue
reproducible. La inmunotinción se restringió a la mitad externa de la zona fasciculada, con
células esteroidogénicas caracterizadas por una señal difusa y puntiforme a través del citoplasma,
sin marca en el núcleo. Este patrón homogéneo y puntiforme de inmunotinción para el
67
polipéptido MT1 también ha sido observado en células HEK-293 (Chan et al, 1997), membrana
basolateral del túbulo proximal de riñón de cobayo (Song et al, 1997), así como en distintos tipos
celulares de retina de cobayo y humano (Fujieda et al, 2000 y Savaskan et al, 2002;
respectivamente). La restricción de la marca a la zona fasciculada de la glándula adrenal, lugar
donde se sintetizan y secretan los glucorticoides (corticoesterona en la rata) es relevante para
nuestros estudios de efectos de melatonina in vitro. Además, el patrón restringido de la
inmunotinción se relaciona bien con los bajos niveles de expresión de receptores de melatonina
determinados por RT-PCR, Western blot y ensayos de unión específica de 2-[125I]iodomelatonina.
Es importante destacar que de acuerdo a los presentes resultados y aquellos obtenidos en
paralelo en nuestro laboratorio, la expresión de receptores de membrana de melatonina,
acoplados a proteína G (esto es, farmacológicamente activos), es diferencial respecto a las horas
del día. No fue posible detectar RNAm ni proteína de receptores de melatonina en muestras de
adrenal de rata de las 10:00 am, mientras que su expresión fue evidente a las 10:00 pm; lo que se
condice con el ritmo de secreción de melatonina, cuyo máximo se presenta durante la noche. Por
lo tanto, la disponibilidad de receptores en la membrana se encuentra en fase con el ritmo de
secreción de su ligando.
Una expresión diferencial del mRNA del receptor MT1 con respecto a las horas del día ha
sido descrita en páncreas de rata, donde se encontró que el nivel de expresión era mayor durante
la noche (Peschke et al, 2006). En hipotálamo de rata el mRNA es indetectable en la noche
(12:00 am), pero detectable a medio día (12:00 pm). En este caso, se ha propuesto que melatonina
puede reprimir la transcripción de su propio receptor, una vez alcanzado su máximo de secreción
(Gauer et al, 1993a y b).
68
La evidencia de acciones directas de melatonina sobre producción de glucocorticoides es
muy conflictiva, particularmente en roedores nocturnos como la rata (Hajak et al, 1997). Estos
autores sometieron ratas a varias condiciones experimentales semi-fisiológicas in vivo y
conluyeron que no existe acoplamiento evidente entre los niveles plasmáticos de melatonina y
corticosterona. Esta conclusión está en línea con aquella previamente enunciada después de
estudios in vivo (Gromova et al, 1967; Malendowicz, 1985) e in vitro (Persengiev et al, 1989).
Sin embargo, diversos autores han obtenido evidencia de inhibición de la producción y liberación
de glucocorticoides adrenales por melatonina, a través de un amplio espectro de enfoques
experimentales in vitro e in vivo (Dill, 1961; Kinson et al, 1968; Giordano et al, 1970; Nir et al,
1971; Vaughan et al, 1972; Ogle and Kitay, 1978; Oxenkrug et al, 1984; Rebuffat et al, 1987);
incluyendo el estudio de diferencias debidas al sexo y la hora del día (Lesniewska et al, 1990 y
Sanchez de la Pena et al, 1983a, 1983b; respectivamente). Una característica sorprendente,
común a todos estos trabajos, es la falta de evidencia incontrarrestable para acciones directas de
melatonina sobre la función adrenal en roedores nocturnos, tal como la demostración de la
expresión de receptores funcionales de melatonina en este tejido. Como se discutió
anteriormente, en el presente trabajo y en otros experimentos realizados en nuestro laboratorio,
abordamos exitosamente este problema usando varios métodos independientes, y sólo entonces
realizamos estudios funcionales in vitro buscando determinar acciones directas de melatonina
sobre la producción de corticosterona inducida por ACTH. Por otra parte, considerando que
melatonina circulante es una fuerte señal circadiana (Richter et al, 2004; Dubocovich y
Markowska, 2005), así como los resultados mostrados aquí, decidimos disecar diferencias
dependientes de la hora del día en potenciales interacciones melatonina/ACTH para modular la
producción de corticosterona en la adrenal de rata.
69
En primer término, realizamos determinaciones de la concentración de melatonina y
corticosterona en el plasma de animales, equivalentes a los usados para cultivo, a fin de confirmar
la homogenidad de la población a estudiar. Se observó un marcado ritmo en la concentración
plasmática de melatonina, la cual se mantuvo baja durante el día y aumentó a partir del atardecer,
lo que concuerda con lo publicado anteriormente por otros autores (Sallinen et al, 2005). Se ha
descrito que la secreción de corticosterona en animales nocturnos aumenta durante las primeras
horas de la noche (Ulrich-Lai et al, 2006), lo cual coincide con nuestra observación de un ritmo
en la concentración plasmática de corticosterona, con un máximo a las 02:00 am. Sin embargo,
observamos una caída en el punto horario de las 10:00 pm, lo que podría explicarse por muestras
provenientes de animales hipo-productores de glucocorticoides.
Varios autores han descrito la modulación positiva de ACTH sobre la producción de
corticosterona por adrenal de rata en cultivo (Malendowick et al, 2004; Macho et al, 1999; Tena-
Sempere et al, 2000; Andreis et al, 1992; Hung et al, 1988). Sin embargo, ninguno de ellos
menciona la hora del día en que los animales fueron sacrificados. De hecho, hasta donde
sabemos, no se han publicado estudios en cultivo para verificar la existencia de una respuesta de
corticosterona de distinta magnitud a lo largo del día.
Debido a la fuerte variación de la capacidad de unión de 2-[125I]iodomelatonina a
diferentes horas del día determinada en nuestro laboratorio, buscamos efectos in vitro de
melatonina sobre producción de corticosterona por cuartos de adrenal recolectada a las 08:00 am
y 10:00 pm; pero tratados durante la próxima tarde y mañana, respectivamente. Los resultados
obtenidos con los tratamientos de la tarde fueron profundamente diferentes de aquellos de la
mañana. La producción basal de corticosterona fue mayor en la tarde e incrementó hasta
alrededor de 3 veces después de la administración de ACTH. En la tarde, concentraciones bajas
70
de melatonina inhibieron la producción de corticosterona inducida por ACTH. Por el contrario,
ninguna de las dosis de melatonina administradas durante la mañana inhibieron la débil respuesta
de corticosterona a ACTH a este intervalo de tiempo. Melatonina sola no cambió la secreción
basal de corticosterona, indicando que modula la acción de ACTH en lugar de tener un efecto per
se; observación coincidente con lo publicado en mono capuchino fetal y adulto (Torres-Farfan et
al, 2003 y 2004). La reversión observada cuando melatonina fue coadministrada con luzindol, es
consistente con la presencia de receptores funcionales de membrana en las células
esteroidogénicas de la corteza adrenal. Es importante hacer notar que a la concentración utilizada,
luzindol no discrimina entre la isoformas MT1 y MT2 (Dubocovich et al, 1998). En conjunto,
estos resultados sugieren que dosis fisiológicas de melatonina son capaces de inhibir directa y
reversiblemente la producción de corticosterona inducida por ACTH en una manera tiempo-
dependiente. Estos resultados son consistentes con una capacidad intrínseca de oscilación de la
glándula adrenal de rata, evidenciada por cambios en la producción de corticosterona en
condiciones basales y en respuesta a ACTH y ACTH más melatonina (presente tesis); y que
además están en la línea con los resultados publicados por Andrews y Folk (1964), usando
explantes de adrenal de hamster en ausencia de ACTH. En adrenales bisectadas de ratón, Sanchez
de la Pena et al (1983b) encontraron que la producción de corticosterona inducida por ACTH fue
atenuada o bien amplificada por la adición de homogenizados acuosos de glándula pineal a 2 y 14
h después de encender las luces, respectivamente. De nuevo, una fuerte posibilidad dando cuenta
de la dependencia de la hora del día en la respuesta adrenal a melatonina en roedores nocturnos,
es la variación diurna discutida anteriormente para la capacidad de unión de melatonina.
Se ha demostrado que la activación del receptor de melatonina MT1 (acoplado a proteína
G), disminuye la producción de AMPc estimulada por GnRH en células de Leyding e
71
hipofisiarias de rata (Valenti et al, 1999 y Vanececk et al, 1998y; respectivamente). Lo mismo es
válido para la producción de AMPc estimulada por forskolin en células inmortalizadas de NSQ
de rata (River-Bermudez et al, 2004), sistema nervioso central de hamster Siberiano (Carlson et
al, 1991) y pars tuberalis de oveja (Morgan et al, 1994). Sin embargo, en células cultivadas de
adrenal de mono capuchino, el efecto inhibitorio de melatonina sobre la producción de cortisol se
mantiene en presencia de dibutiril-AMPc (análogo no-hidrolizable de AMPc), sugiriendo que la
acción de melatonina ocurriría en etapas posteriores a la producción de AMPc (Torres-Farfan et
al, 2003). Podemos sugerir que melatonina ejerce su efecto disminuyendo la actividad o
afectando la transcripción/traducción de enzimas involucradas en la esteroidogénesis. Esta
posibilidad podría estudiarse directamente, midiendo niveles de mRNA y/o proteína de enzimas
esteroidogénicas o, indirectamente, siguiendo la acumulación de algun(os) precursor(es) de
corticoesterona. Las acciones de melatonina sobre la expresión de enzimas esteroidogénicas han
sido demostradas en adrenal de mono capuchino donde melatonina inhibe la expresión de la
enzima 3β-HSD (Torres-Farfan et al, 2004), asi como también ha sido reportado en células de
Leydig de hamster, donde además se observó inhibición de StAR y P450scc (Frungieri et al
2005).
Nuestros estudios in vitro son limitados y no pueden ser extrapolados a la compleja
regulación de la función adrenal in vivo; no obstante, varias observaciones en animales
concuerdan con nuestros hallazgos: (1) la producción de corticosterona por la adrenal de rata
presenta una mayor respuesta a ACTH en la tarde (Dallman et al, 1978); (2) esta diferencia se
mantiene en ratas tratadas con dexametasona, indicando que los cambios en la respuesta son
independientes de ACTH; (3) el ritmo circadiano de ACTH no da cuenta completamente de la
oscilación de glucocorticoides, dado que ratas hipofisectomizadas sometidas a infusión de ACTH
72
mantienen una secreción rítmica de corticosterona (Meier, 1976); (4) tanto el ritmo circadiano
como la respuesta de la corteza adrenal a ACTH dependen del núcleo supraquiasmático (NSQ),
dado que depúes de lesión del NSQ las diferencias tarde/mañana de sensibilidad a ACTH
desparecen (Sage et al, 2002). En estas ratas, se observan diferencias en la magnitud de la
respuesta a ACTH cuando los animales son agrupados de acuerdo a la concentración basal de
corticosterona; lo cual podría implicar que la glándula adrenal mantiene una capacidad intrínseca
de responder diferencialmente a ACTH.
La contribución relativa del nervio esplácnico a las diferencias diurnas de la sensibilidad a
ACTH de la adrenal de rata es conflictiva (Dijkstra et al, 1996; Ulrich-Lai et al, 2006). Sin
embargo, en esta especie se ha descrito una vía autónoma funcional conectando el NSQ con la
corteza adrenal (Buijs et al, 1999). En hamsters, la lesión del NSQ suprimió los ritmos
circadianos de glucocorticoides, los cuales no fueron recuperados por transplante de NSQ normal
en los animales lesionados (Meyer-Berstein et al, 1999). Estos hallazgos sugieren que la
señalización por vía neural es un requerimiento para que el NSQ regule el ritmo circadiano de
glucocorticoides adrenales.
Se debe enfatizar que los hallazgos recién discutidos no excluyen una capacidad
intrínseca de la corteza adrenal para generar funciones rítmicas. Investigaciones pioneras
realizadas por Andrews y Folk (1964), dónde se midió consumo de oxígeno y producción de
glucocorticoides en explantes de adrenal de hamster en cultivo, demostraron que estas variables
fisiológicas mantienen un ritmo circadiano por varios días. Estos resultados están en línea con la
posibilidad que la adrenal sea un reloj biológico periférico. En este contexto, publicaciones
recientes muestran expresión circadian de genes reloj in vivo en adrenal de mono rhesus y ratón
(Ishida et al, 2005; Lemos et al, 2006; Oster et al, 2006; Torres-Farfan et al, 2006b; Watanabe
73
et al, 2006). Proteínas reloj son expresadas en la corteza y médula adrenal de ratón y oscilan con
la misma fase (Torres-Farfan et al, 2006b). Así mismo, mediante PCR en tiempo real, hemos
detectado transcripción oscilatoria de genes reloj en la adrenal de rata (Richter HG, Abarzua-
Catalan L y Rehren GE, resultados sin publicar). Mas aún, una publicación reciente mostró que
ratones mutantes (doble Per2/Cry1 knockout) son deficientes en genes reloj en la adrenal y
exhiben pérdida de la ritmicidad del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal. El transplante de adrenales
de ratones normales en mutantes, restableció el ritmo de corticosterona (Oster et al, 2006).
Claramente, factores intra-adrenales presentes al momento de recolección deben jugar un papel
crítico en las respuestas de corticosterona reportadas en la presente Tesis, y nosotros especulamos
que claves circadianas impuestas por la expresión de genes reloj no debieran ser descartadas. De
hecho, está bien establecido que células y órganos en cultivo mantienen expresión oscilatoria de
genes reloj durante varios ciclos (Richter et al, 2004); lo cual puede contribuír a explicar por qué
en la presente investigación detectamos diferencias significativas en la respuesta de
corticosterona a ACTH entre adrenales colectadas a diferentes horas del día.
En conjunto, nuestros hallazgos indican claramente no sólo expresión sino también
variación diaria de la isoforma 1 de receptores funcionales de melatonina en la glándula adrenal
de rata. Dado que el mRNA de MT2 no fue detectado en adrenal de mono capuchino y ratón
(Torres-Farfan et al, 2003 y 2006b; respectivamente) y que nosotros no inmunodetectamos la
proteína MT2 en adrenal de rata, es concebible que el efecto de melatonina sea mediado por la
activación de receptores MT1. Mas aún, nuestros resultados usando adrenal de rata in vitro,
sugieren que melatonina inhibe directamente la producción de corticosterona inducida por
ACTH, en una manera tiempo-dependiente. Queda por resolver en qué extensión esta potencial
74
nueva acción de melatonina plasmática en roedores nocturnos es enmascarada por la
superposición de señales derivadas en su mayor parte del sistema nervioso central.
Finalmente, se desconoce el mecanismo mediante el cual melatonina ejerce su efecto, por
lo que son necesarias nuevas investigaciones para determinar la secuencia de eventos
intracelulares desencadenada por melatonina al unirse a su receptor en la adrenal de rata, y cuales
serían las enzimas reguladas por melatonina en forma directa o indirecta.
75
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86
8 ANEXOS
CH3
C O
O
3β-HSD
CH3
C O
OHP450scc
Colesterol
CH3 CH3
CH3CH (CH2)3 CH
OH
Colesterol ProgesteronaPregnenolona
Colesterol
StAR
P450 c11B1
P450 c21A2CH2-OH
C O
O
11-Deoxicorticosterona
CH2-OH
C O
O
Corticosterona
HO
CH3
C O
O
CH3
C O
CH3
C O
OO
3β-HSD
CH3
C O
OH
CH3
C O
CH3
C O
OHP450scc
Colesterol
CH3 CH3
CH3CH (CH2)3 CH
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3CH (CH2)3 CH
OH
Colesterol ProgesteronaPregnenolona
Colesterol
StAR
P450 c11B1
P450 c21A2CH2-OH
C O
O
CH2-OH
C O
CH2-OH
C O
O O
11-Deoxicorticosterona
CH2-OH
C O
O
CH2-OH
C O
CH2-OH
C O
OO
Corticosterona
HO
8.1: Vía de síntesis de corticosterona en la glándula adrenal de rata. Se indican los precursores de la ruta de biosíntesis mediante su nombre y fórmula química, mientras que las enzimas esteroidogénicas están representadas por la sigla de uso mas común.
87
Melatonina
Prot GMT1
AC(-)
ATP
cAMP
mRNA enzimas de esteroidogénesis
GCGTP
cGMP
PKA PKG P-CREB
Expresión de genes reloj
Factores de trascripción de la esteroidogénesis(DAX, SP1, Jun, Mc2r)
∼
?
?
SNA
?
∼Corticosterona
Melatonina
Prot GMT1
ACAC(-)
ATP
cAMP
mRNA enzimas de esteroidogénesis
GCGTP
cGMP
PKA PKG P-CREB
Expresión de genes reloj
Factores de trascripción de la esteroidogénesis(DAX, SP1, Jun, Mc2r)
∼
?
?
SNA
?
∼Corticosterona
8.2: Vías de señalización intracelular activadas por la isoforma 1 del receptor de membrana de melatonina acoplado a proteína G (MT1). Prot G, proteína G; ATP, adenosina trifosfato; GC, guanilato ciclasa; GTP, guanosina trifosfato; AC, adenilato ciclasa; cGMP, guanosina monofosfato cíclico; cAMP, adenosina monofosfato cíclico; PKA, proteína quinasa A; PKG, proteína quinasa G; P-CREB, proteína fosforilada de unión del sitio de respuesta a cAMP; SNA, sistema nervioso autónomo.
88
12
9 3
6
12
9 3
6
NSQ
3β HSDX
PVN
Hipófisis
ACTH
Pineal
∼ Melatonina∼IML
ANS ?
Cortisol∼
12
9 3
6
12
9 3
6
NSQ
3β HSDX
PVN
Hipófisis
ACTH
Pineal
∼ Melatonina∼IML
ANS ?
Cortisol∼ 8.3: Vías neuroendocrinas y neurales que sitúan a la glándula adrenal en el contexto de integración de ritmos circadianos. NSQ, núcleo supraquiasmático del hipotálamo; PVN, núcleo paraventricular; IML, columna intermedio lateral de la médula espinal; ACTH, adrenocorticotropina; ANS, sistema nervioso autónomo.
