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Anlise da actividade da catalase de Leveduras em gel nativo

Introduo:

A levedura Saccharomyces cerevisiae capaz de crescer em meios de cultura contendo uma

fonte de carbono fermentvel (ex. glucose) ou no fermentvel (ex. etanol, glicerol). Em meio

de cultura com glucose, as clulas esto sob represso catablica pelo que a expresso de

protenas mitocondriais inibida. Nessas condies, a energia produzida na via glicoltica,

sendo o piruvato formado convertido em acetaldedo pela piruvato descarboxilase e este em

etanol pela lcool desidrogenase 1 (fermentao alcolica). No fim da fase exponencial de

crescimento, medida que a concentrao de glucose diminui, as clulas tornam-se

gradualmente desreprimidas e induzem a sntese de enzimas mitocondriais (fase de transio

diauxica). O etanol ento utilizado para produo de energia por metabolismo respiratrio

(fase ps-diauxica): a lcool desidrogenase 2 converte etanol em acetaldedo, e a aldedo

desidrogenase converte o acetaldedo em acetato, o qual entra no ciclo de Krebs. Como

subprodutos da respirao mitocondrial, formam-se radicais superxido, pelo que as clulas

induzem concomitantemente a expresso de defesas antioxidantes, tais como superxido

dismutases, que convertem radicais superxido em perxido de hidrognio, e catalase e

peroxidases, que reduzem o perxido de hidrognio a gua.

Material equipamento e reagentes

Clulas de Saccharomyces cerevisiae BY4741

Meio de cultura YPD: 1% extracto de levedura 2% bactopeptona 2% glucose

Tampo 50 mM NaK Fosfato 0.1 mM EDTA pH 7.0

50 mM K2HPO4 0.1 mM EDTA

K2HPO4 (174.18 g/mol) 8.709 g

EDTA.2H2O (372.24 g/mol) 0.0372 g

H2O 1000 ml

50 mM KH2PO4 0.1 mM EDTA

KH2PO4 (136.09 g/mol) 6.805 g

EDTA.2H2O (372.24 g/mol) 0.0372 g

H2O 1000 ml

Tampo fosfato de potssio 50 mM, pH 7,0

cocktail inibidores de proteases 30X

prolas de zircnio

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Incubadora orbital

centrifuga de bancada

microcentrfuga

tubos eppendorf

micropipetas

Pontas azuis e amarelas

Tanque de electroforese

Alimentador de corrente

Gel nativo

Tampo de electroforese (25 mM Tris-HCl pH 8.3, 192 mM Glicina)

Soluo corante-sacarose de aplicao da amostra (50% sacarose, 0,1%azul bromofenol)

Peroxidase (HSP) em 50 mM KPi pH 6,7

Diaminobenzidine (DAB) em 50 mM KPi pH 6,7

30 % H2O2

Crecimento das clulas

Mtodo

1.Crescer clulas de levedura em meio YPD a 26C at OD600 = 0.5-0.6 (fase exponencial;

amostra 1: 30 ml/grupo) ou at OD600 = 8-10 (fase estacionria; amostra 2: 30 ml/grupo).

NOTA: manter as amostras a 4C a partir deste ponto.

2.Centrifugar as clulas (5 ml/grupo) a 4000 rpm, 5 min.

3.Ressuspender o pellet em 1 ml tampo fosfato e transferir para tubo eppendorf.

4.Centrifugar a 13000 rpm, 1 min, e rejeitar o sobrenadante.

5.Congelar as clulas a -70C.

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Catalase - Lise das clulas

1.Deixar descongelar as clulas lentamente.

2.Ressuspender o pellet em 100 l tampo fosfato + 3.4 l cocktail inibidores de proteases

30X.

3.Adicionar prolas de zircnio (2 colheres peq) e agitar num vortex 5 x 1 min.

4.Centrifugar a 14000 rpm, 15 min.

5.Guardar o sobrenadante num tubo eppendorf.

Anlise da actividade da catalase em gel nativo

1. Preparar um running gel a 7,5 % acrilamida (Mighty-small; 0.75 mm) segundo o seguinteesquema:

Acrilamida 30% 3,75 ml

2 M Tris-HCl pH 8.85 2,81 ml

H2O 8,27 ml

Persulfato de Amnio 10% 150 l

TEMED 15 l

2.Cobrir o gel com H2O e deixar a polimerizar durante 30 minutos.

3. Remover a camada de H2O, colocar o pente e preparar um stacking gel segundo o

seguinte esquema:

Acrilamida 30% 0,534 ml

1 M Tris-HCl pH 6.8 0,5 ml

H2O 2,92 ml

Persulfato de Amnio 10% 40 l

TEMED 4 l

4. Aps polimerizao encher o tanque com tampo de electroforese.

5. Prepare a amostra da seguinte forma:

a) Pipete para um tubo eppendorf 15 l de sobrenadante obtido aps a lise. Junte 5 l da

soluo corante-sacarose.

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6. Aplicar 15 l de amostra no gel.

7. Corra o gel numa cmara fria. Proceder electroforese V max = 100 V.

8. Retirar o gel e incuba-lo 30-45 min em HSP (0.9 mg /18 ml de 50 mM KPi pH 6,7)

9. Adicionar 9,2 l de 30 % H2O2 (concentrao final de 5 mM) e agitar continuamente

durante 10 min.

10. Lavar o gel rapidamente com dH2O e adicionar a sol. DAB (10 mg / 20 ml de 50 mM KPi pH

6,7).

Incubar com agitao suave at aparecimento das bandas.