ADAMARES MARQUES DA SILVA - repositorio.ufpe.br Dra... · Profa.: Dra. Anabelle Camarotti de Lima...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROCESSO DE PRODUÇÃO E OTIMIZAÇÃO DE BIOMASSA E QUITOSANA POR RHIZOPUS ARRHIZUS E APLICAÇÃO BIOTECNOLÓGICA ADAMARES MARQUES DA SILVA Recife-PE 2015
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS BIOLGICAS
PROCESSO DE PRODUO E OTIMIZAO DE BIOMASSA
E QUITOSANA POR RHIZOPUS ARRHIZUS E APLICAO
BIOTECNOLGICA
ADAMARES MARQUES DA SILVA
Recife-PE
2015
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ADAMARES MARQUES DA SILVA
PROCESSO DE PRODUO E OTIMIZAO DE BIOMASSA E
QUITOSANA POR RHIZOPUS ARRHIZUS E APLICAO
BIOTECNOLGICA
Orientador: Profa.: Dra. Galba Maria de Campos-Takaki
Co-orientadoras: Profa.: Dra. Clarissa Daisy Costa Albuquerque
Profa.: Dra. Ana Lcia de Figueiredo Porto
Recife-PE
2015
Tese apresentada ao Programa de
Ps-Graduao em Cincias
Biolgicas, como parte das
exigncias para obteno do titulo
de Doutor em Cincias Biolgicas.
rea: Biotecnologia
iii
iv
ADAMARES MARQUES DA SILVA
PROCESSO DE PRODUO E OTIMIZAO DE BIOMASSA E QUITOSANA POR RHIZOPUS
ARRHIZUS E APLICAO BIOTECNOLGICA
Aprovado em 10/02/2015
Banca Examinadora
______________________________________________________
Profa.: Dra. Galba Maria de Campos-Takaki
Universidade Catlica de Pernambuco-UNICAP - Orientadora
______________________________________________________
Profa.: Dra. Hlvia Walewska Casullo de Arajo
Universidade Estadual de Campina Grande- UECG
______________________________________________________
Prof. Dr. Marcos Antnio Barbosa Lima
Universidade Federal Rural Pernambuco-UFRPE
______________________________________________________
Profa.: Dra. Luciana de Oliveira Franco
Universidade Federal Rural Pernambuco-UFRPE
______________________________________________________
Profa.: Dra. Anabelle Camarotti de Lima Batista
Universidade Federal Rural do Semi-rido-UFERSA
Tese apresentada ao Programa de
Ps-Graduao em Cincias
Biolgicas, como parte das
exigncias para obteno do titulo de
Doutor em Cincias Biolgicas.
rea: Biotecnologia
v
Dedico
Aos meus pais, minha mais profunda e eterna gratido.
vi
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter me proporcionado sade e fora para realizar essa conquista;
CAPES pelo suporte financeiro indispensvel para realizao deste trabalho;
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), em especial a Coordenao Geral de Ps-
Graduao e ao Reitor Professor Ansio Brasileiro de Freitas Dourado, pela realizao do curso;
Profa. Dra. Galba Maria de Campos Takaki, orientadora e Coordenadora do Ncleo de Pesquisa
em Cincias Ambientais (NPCIAMB/UNICAP) pela disponibilidade, orientao, pacincia e
confiana.
As minhas Co-orientadoras Profa. Dra. Clarissa Daisy da Costa Albuquerque por ter me auxiliado
de forma mpar na concretizao desse trabalho e Profa. Dra. Ana Lcia de Figueiredo pelas
fundamentais contribuies para realizao do doutorado;
Profa. Dra. Thayza Stamford e a Profa. Dra. Tnia Lcia Montegro, pelo acesso aos laboratrios
da UFPE, ensinamentos e ajuda nos experimentos;
Aos professores que participaram da qualificao e banca de defesa pelas contribuies;
A todos os meus amigos e amigas pelo apoio incondicional sempre;
doutoranda Jaceline Negreiros, Dra. Raquel Berger e Dra. Marcela Vieira pelo fundamental apoio
durante as pesquisas;
funcionria da UFPE, Adenilda Lima e aos funcionrios do NPCIAMB, Snia Souza, Humberto
Almeida, Andr Felipe e Hildes Alves pela convivncia e confiana;
Aos professores do doutorado pelos ensinamentos e convvio durante o perodo acadmico.
vii
LISTA DE FIGURAS
CAPTULO I
Figura 1 Esquema da parede celular fngica ...................................................................................... ..5
Figura 2 Classificao taxonmica dos Zygomycetes ...................................................................... ..7
Figura 3 Partes do gro de milho ....................................................................................................... ..9
Figura 4 Desacetilao parcial da quitina .......................................................................................... 13
Figura 5 Estrutura de quitina. Em (a) projeo ac; (b) projeo bc; (c) projeo ab. ................... 14
Figura 6 Estrutura de quitina. Em (a) projeo ac; (b) projeo bc; (c) projeo ab. .................... 14
CAPTULO II
Figura 1 Diagrama de Pareto para planejamento fatorial 22 tendo como variveis independentes
as concentraes de (1) glicerina (glycerin) e (2) milhocina (corn steep) e como varivel resposta
(dependent variable) a produo de biomassa por R. arrhizus .............................................................. 44
Figura 2 Perfil crescimento de R. arrhizus ........................................................................................ 45
Figura 3 Diagrama de Pareto para planejamento composto central tendo como variveis
independentes as concentraes de (1) glicerina e (2) milhocina e como varivel resposta a
concentrao de biomassa por R. arrhizus. A linha tracejada em vermelho indica o ponto (p=0,05) a
partir do qual os efeitos estimados so considerados estatisticamente significativos. ........................... 47
Figura 4 Superfcie de resposta da concentrao de biomassa mostrando a interao entre as
concentraes de glicerina e milhocina por R. arrhizus ........................................................................ 49
CAPTULO III
Figura 1 Diagrama de Pareto para planejamento fatorial 22 tendo como variveis independentes as
concentraes de (1) glicerina e (2) milhocina e como varivel resposta a concentrao de
biomassa. A linha tracejada em vermelho indica o ponto (p=0,05) a partir do qual os efeitos
estimados so considerados estatisticamente significativos .................................................................. 66
Figura 2 Espectro na regio do infravermelho da quitosana na condio 8 do Planejamento
Composto Central com dois fatores (Tabela 2) ..................................................................................... 69
Figura 3 Difratograma de raio-X da quitosana produzida por R. arrhizus da condio 8 do
Planejamento Composto Central com dois fatores (Tabela 2) ..................................................................... 70
viii
Figura 4 Diagrama de Pareto para planejamento composto central tendo como variveis independentes as
concentraes de (1) glicerina e (2) milhocina e como varivel resposta a concentrao de biomassa em
processo de produo de quitosana por R. arrhizus. A linha tracejada em vermelho indica o ponto (p=0,05) a
partir do qual os efeitos estimados so considerados estatisticamente significativos. ........................................ 71
Figura 5 Superfcie de resposta da concentrao de biomassa mostrando a interao entre as
concentraes de glicerina e milhocina em processo de produo de quitosana por R. arrhizus.. ......... 72
Figura 6 Diagrama de Pareto para planejamento composto central tendo como variveis
independentes as concentraes de (1) glicerina e (2) milhocina e como varivel resposta o grau de
desacetilao em processo de produo de quitosana por R. arrhizus. A linha tracejada em vermelho
indica o ponto (p=0,05) a partir do qual os efeitos estimados so considerados estatisticamente
significativos. ..................................................................................................................................................... 74
Figura 7 Superfcie de resposta do Grau de Desacetilao mostrando a interao entre as
concentraes de glicerina e milhocina em processo de produo de quitosana por R. arrhizus. ......... 76
Figura 8 Espectro na regio do infravermelho da quitosana obtida do planejamento estrela com
grau de desacetilao de 74%.. .............................................................................................................. 77
CAPTULO IV
Figura 1 Espectro na regio do infravermelho da quitosana fngica obtida de : R. arrhizus ............. 92
Figura 2 Microscopia eletrnica de varredura (MEV) quitosana (A) e (B) produzida por
R. arrhizus 93
ix
LISTA DE TABELAS
CAPTULO 1
Tabela 1 Efeitos de quitosana in vitro na inibio do crescimento de fungos ................................... 18
CAPTULO 2
Tabela 1 Matriz do Planejamento Fatorial Completo 22 descodificada e resultados de
concentrao de biomassa e C/N (carbono/nitrognio) ......................................................................... 43
Tabela 2 Matriz descodificada do Planejamento Composto Central com dois fatores e resultados
de concentrao de biomassa, C/N. ....................................................................................................... 46
Tabela 3 Anlise de Varincia para os resultados do Planejamento Composto Central. .................. 49
Tabela 4 Descolorao de vermelho congo 0,02% a 28C por biomassa inativada de R. arrhizus
aps 24h de contato ................................................................................................................................ 50
CAPTULO 3
Tabela 1 Nveis e valores dos fatores do planejamento fatorial completo 22 .................................... 63
Tabela 2 Nveis e valores dos fatores do planejamento composto central ......................................... 63
Tabela 3 Matriz do Planejamento Fatorial Completo 22 descodificada e resultados de
concentrao de biomassa referente ao processo de produo de quitosna por R. arrhizus. ................ 65
Tabela 4 Matriz descodificada do Planejamento Composto Central com dois fatores e resultados
de concentrao de biomassa, rendimento de quitosana e grau de desacetilao e relao C/N
(carbono: nitrognio) referentes ao processo de produo de quitosana por R. arrhizus ..................... 67
Tabela 5 Anlise de Varincia para os resultados do Planejamento Composto Central ................... 71
Tabela 6 Matriz descodificada do Planejamento Composto Central com dois fatores e resultados
de concentrao de biomassa, rendimento de quitosana e grau de desacetilao em processo de
produo de quitosana por R. arrhizus.................................................................................................. 73
Tabela 7 Anlise de Varincia para os resultados do Planejamento Composto Central ................... 76
x
ABSTRACT
Chitosan is a natural polysaccharide of biotechnological interest occurring in the cell walls of fungi
(Zygomycetes) and derived from chitin by deacetylation forming a higher proportion of polymer
chain units 1,4-2-amino-2- deoxy-D-glucose, and a smaller number of units 1,4-2-acetamido-2-
deoxy-D-glucose chitin. Due to structural versatility, chitosan is a polymer of great biotechnological
interest, considering its solubility properties, viscosity. Lack of toxicity were performed with
biocompatibility. Studies were done about Rhizopus arrhizus biomass and chitosan production and
optimization, through the use of the agro-industrial wastes as substrates, applying 2 factorial
design, having as independent variables corn steep liquor and glycerin derived from biodiesel
process, and as a response variable biomass and chitosan by R. arrhizus. The fungus was grown in
250ml Erlenmeyer flasks containing 100ml of medium containing industrial residues, according to
the planning, with the inoculum of 6 disks of 40 mm in diameter fungus grown on YMA (Yeast
Malt Agar), incubated at 28C under an orbital agitation of 150 rpm for 72 hours. The biomass was
obtained by centrifugation at 5,000 g for 15 min, followed by washing with water and subsequent
inactivation by autoclaving at 121C. The efficiency of biomass as a sorbent was evaluated in the
process of bleaching a textile dye congo red. The best results have demonstrated an optimized
production of biomass 22,5g/l, a bleaching ability to 80.85% of the textile dye. Chitosan was
obtained from biomass, characterized by Fourier transform infrared (FTIR) spectra and X-ray
diffraction to determine the crystallinity index (CI). The isolated chitosan showed a yield of 44.46
mg/g biomass degree of deacetylation (DD) of 74% and 44% crystallinity index, confirming the
amorphous nature of the polymer. Investigations were carried out with the chitosan characterized by
evaluating the efficiency of the polymer as an antifungal in tomatoes protection (Solanum
lycopersicum var. Cerasiforme) the attack of pathogen Botrytis cinerea. Cell viability study of
pathogen B. cinerea by light microscopy showed that 70% had germinated tubes 16h of incubation.
Microbiological chitosan showed an MIC of 100g/ml against pathogen B. cinerea. The processing
of tomatoes against B. cinerea with chitosan concentration in the MIC showed satisfactory results
until 19 days after inoculation, when compared to controls. Promising results demonstrate the
excellent biotechnological potential of R. arrhizus as an effluent sorbent from bleaching in the
textile, in the production of chitosan, as well as in inhibiting the pathogen B. cinerea, causing
degradation of fruits and vegetables, in particular postharvest, proved to be an important crop
protection.
Keywords: agro-industrial wastes, Rhizopus arrhizus, biomass, chitosan, sorbent, antifungal
activity.
xi
RESUMO
A quitosana um polissacardeo natural, de interesse biotecnolgico, ocorrendo nas paredes
celulares de fungos (zygomycetes), bem como pode ser obtido da quitina atravs da desacetilao,
formando uma maior proporo de cadeia polimrica com unidades de 1,4-2-amino-2-desoxi-D-
glicose, e um menor nmero, de unidades 1,4-2-acetamino-2-desoxi-D-glicose da quitina.
Considerando as suas propriedades fisco-qumicas e bibiocompatibilidade), a quitosana um
polmero de grande interesse biotecnlgico. Visando esse interesse estudos foram realizados para a
produo e otimizao da produo de biomassa e quitosana por Rhizopus arrhizus, atravs da
utilizao de resduos agroindustriais, como substratos, aplicando planejamento fatorial de 2, tendo
como variveis independentes milhocina (gua de macerao de milho) e glicerina, oriunda do
processamento do biodiesel, e como variveis respostas produo de biomassa e de quitosana por
R. arrhizus. Foi preparado um pr-inculo do fungo contendo 40 discos de 6mm de dimetro em
50mL de YMB (Yeast Malte Broth) durante 24h em Erlenmeyers de 250mL, aps esse pr-inculo
foram transferidos para frascos de Erlenmeyers de 250mL contendo 100mL do meio com resduos
agroindustriais, de acordo com planejamentos, incubados a 28 C, sob agitao orbital de 150 rpm,
durante 72h. A biomassa foi obtida por centrifugao a 5.000 g, por 15 min, seguido de lavagens
com gua, e posterior inativao por autoclavagem a 121C. A eficincia da biomassa como
sorbente foi avaliada no processo de descolorao do corante txtil vermelho congo. Os resultados
demonstraram uma produo otimizada da biomassa de 22,5g/L e uma habilidade de descolorao
de 80,85% do corante sinttico de vermelho congo. A quitosana obtida da biomassa foi
caracterizada por Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) e difrao de raio X para
determinar o ndice de cristalinidade (IC). A quitosana isolada apresentou um rendimento de 44,46
mg/g de biomassa, Grau de Desacetilao (DD) de 74% e ndice de cristalinidade 44%.
Investigaes foram realizadas com a quitosana caracterizada, avaliando a eficincia do polmero
como antifngico, na proteo de tomates (Solanum lycopersicum var. cerasiforme) pelo ataque do
fitopatgeno Botrytis cinerea. Estudos das condies de cultivo do fitopatgeno B. cinerea atravs
de microscopia de luz demonstraram que 70% apresentavam tubos germinativos com 16h de
incubao. A quitosana microbiolgica demonstrou um CMI (Concentrao mnima inibitria) de
100g/mL contra o fitopatgeno B. cinerea. O tratamento de tomates contra o B. cinerea com
quitosana na concentrao do CMI apresentou resultados satisfatrios at com 19 dias de
inoculao, quando comparado aos controles. Os resultados promissores obtidos demonstraram o
excelente potencial biotecnolgico de R. arrhizus como sorbente na descolorao de efluente txtil,
na produo de quitosana, bem como na inibio do crescimento do fitopatgeno B. cinerea,
causador da degradao de frutos e hortalias, em especial, ps-colheita, demonstrando ser um
importante bioproduto biotecnolgico para aplicao pela agroindstria.
Palavras-chave: Resduos agroindustriais, Rhizopus arrhizus, biomassa, quitosana, sorbente,
atividade antifngica.
0
Sumrio
CAPTULO 1
1. Introduo Geral 1
2. Objetivos 3
3. Reviso da Literatura 4
3.1. Fungos 4
3.2. Zigomicetos 5
3.3. Rhizopus arrhizus 6
3.4. Aplicao biotecnolgica de R. arrhizus 7
3.5. Viabilidade da produo de quitina e quitosana por fungos 8
4. Resduos industriais 8
4.1. Subprodutos agroindustriais 8
4.1.1 Processamento do milho 9
4.1.2 Resduos do processamento do milho 10
4.2. Glicerina 10
5. Tcnicas de Inteligncia artificial utilizadas na otimizao de processos 11
5.1. Metodologia de Superfcie de Resposta 11
6. Biopolmeros 12
6.1 Quitina 12
6.2 Quitosana 13
7. Potencial biotecnolgico da Quitosana 15
7.1. Biofilmes 15
7.2. Antifngico 17
7.3. Infeco de frutas por fitopatgenos 18
7.4 Mecanismo de atividade antimicrobiana da quitina e quitosana 19
8. Efluente e corante Txtil
8.1 Corantes Azicos
21
22
9. Referncias Bibliogrficas 23
CAPTULO 2 36
PRIMEIRO ARTIGO 37
CAPTULO 3 55
SEGUNDO ARTIGO 56
CAPTULO 4 84
TERCEIRO ARTIGO 85
ANEXOS
1
1. INTRODUO GERAL
O sculo XXI considerado a era da convergncia de tecnologias. Neste
contexto, investir em novas estratgias tecnolgicas normalmente implica em custos,
mas no implica em investimentos de valor mais elevado. Assim, a reduo do custo
global de bioprocessos depende normalmente de melhoramento gentico e do uso de
matria-prima de baixo-custo, como resduos agroindustriais, ampliao de escala de
processo e de uso de tcnicas computacionais avanadas para controle e otimizao
(HAMANO et al., 2006; KARIMI et al., 2013; ZANG et al.,2014).
A integrao entre as tecnologias, em especial, a engenharia e a biotecnologia,
tecnologia da informao e a nanotecnologia, como exemplos, alm de ressaltar os
pontos fortes de cada uma, tem ajudado a resolver problemas que isoladamente no
teriam solues. Assim, avanos recentes nestas reas tm conduzido ao
desenvolvimento de novas tcnicas de coletas de dados, modelagem, controle e
otimizao de processos biotecnolgicos baseados em Redes Neurais (modelo similar
do processamento do crebro humano). Desta forma, ferramentas computacionais como
algoritmos genticos, buscam imitar o processo evolucionrio pelo qual sistemas se
auto-organizam e se adaptam, enquanto que a Lgica Fuzzy, simula a habilidade do
crebro humano permitindo se obter concluses e respostas baseadas em informao
(POLLASTRI, PRZYBYLSKI et al., 2002CAVALHEIRO, 2007; MORAIS et al.,
2010).
A otimizao de processos empregando anlise univariada frequentemente usada
em biotecnologia para obteno de elevados rendimentos do produto uma estratgia
para minimizar o tempo e recursos, valorizando as interaes entre os parmetros fsico-
qumicos. Assim, a anlise de regresso multivariada quando associada a planejamentos
fatoriais e Metodologia de Superfcie de Resposta (MSR), no s reduz tempo e
recursos, como tambm permite a avaliao dos fatores efetivos, construindo modelos
de interaes, que alm de avaliar as condies timas das variveis dependentes,
avaliam tambm em relao s variveis respostas (JAYATI et al., 2004; PAREEK et
al., 2011).
Com a ampliao dos conhecimentos sobre a capacidade biossinttica dos
micro-organismos observou-se a necessidade de expanso da biotecnologia, na
aplicao de processos e produtos. Neste sentido, vm sendo geradas perspectivas
2
associadas aos produtos de elevado valor agregado, e de interesse industrial que
constituem as novas bases da biotecnologia. Contudo, um fator importante para
ampliao de escala minimizar o custo de produo. De forma que, as linhas industrais
com produo otimizada tem um efeito profundo sobre o investimento direto na sua
realizao (CAMPOSTAKAKI, 2005; BINUPRIYA et al., 2007; CONTI, 2012).
O polmero quitosana oriundo de crustceos atualmente produzido em volume
industrial; no entanto, devido sazonalidade no possvel produzir quantidadades
constantes desse produto e disponibiliz-lo ao mercado, alm do custo elevado do
processo e produtos qumicos recalcitrantes. Em contrapartida, a produo
microbiolgica de quitina e quitosana tem se mostrado vantajosa, considerando a
obteno dos co-biopolmeros, sendo um processo simples, econmico e de baixo custo.
Alm disso, a quitosana devido as propriedade de biocompatibilidade e
biodegradabilidade amplamente usada na agricultura, na medicina, na rea
farmacutica e alimento, entre outras (BECERRA-JIMENEZ et al., 2011; CARDOSO
et al., 2012; DHILLON et al., 2013; BERGER et al., 2014).
Desta forma, a literatura ressalta o uso de filmes de quitosana na conservao e
manuteno da qualidade de frutos frescos, congelados ou processados, devido sua
natureza biodegradvel e segura (SHAHIDI et al., 1999). A proteo de frutos ps-
colheita contra podrides tambm vem sendo investigada atravs de vrias tcnicas
alternativas de controle, garantindo segurana do produto e o perodo de conservao.
Quanto s uvas vem sendo observado perdas significativas durante o armazenamento e a
comercializao, especialmente, frente ocorrncia do Botrytis cinerea (CAMILI et al.,
2007; PANKAJ et al., 2014).
Considerando, a ampla aplicao biotecnolgica de quitosana em diversas reas
do conhecimento, como txtil, cosmticos, medicamentos, materiais compsitos,
nanomateriais, alimentos e produtos neutricuticos, investigaes extensivas devem ser
realizadas no sentido de encontrar respostas adequadas para o aumento da produo de
quitosana, quanto ao peso molecular, comprimento da cadeia e grau de desacetilao.
Por outro lado, torna-se preocupante o uso de quitosana por pessoas com alergia a
crustceos, surgindo assim uma demanda industrial por quitosana de origem
microbiolgica. Neste sentido, estudos foram realizados com o potencial de Rhizopus
arrhizus (ordem Mucorales, classe Zygomycetes) na produo de biomassa e quitosana
empregando mtodos quimiomtricos, e na avaliao das propriedades dos produtos
obtidos, gerando perspectivas futuras na reserva de direitos autorais.
3
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
Realizar estudos com a otimizao de processos de produo de biomassa e quitosana
por Rhizopus arrhizus, utilizando como meio de cultura substratos agroindustriais
(glicerina oriunda do excedente da produo do biodiesel) e milhocina (resduo do
beneficiamento do milho), empregando mtodos quimiomtricos (planejamentos
fatoriais e Metodologia de Superfcie de Resposta) e avaliar o potencial biotecnolgico
da biomassa na descolorao do azo corante vermelho congo em efluente txtil, bem
como, os efeitos da quitosana na aplicao de quitosana como revestimento contra o
fitopatgeno Botrytis cinerea.
2.2 Especficos
Avaliar o crescimento de R. arrhizus em diferenes concentraes substratos
agroindustriais (glicerina e milhocina), aplicando planejamentos fatoriais
completos e sequnciais;
Investigar estatisticamente a condio selecionada, a partir dos efeitos e
interaes das concentraes de glicerina e milhocina sobre a produo de
biomassa;
Realizar a cintica de crescimento de R. arrhizus na condio selecionada com
os substratos agroindustriais (glicerol e milhocina);
Realizar a produo de biomassa por R. arrhizus com a condio otimizada do
meio contendo glicerina e milhocina, a partir da condio selecionada pelos
planejamentos fatoriais e metodologia de superfcie de resposta;
Aplicar a biomassa obtida do processo fermentativo submerso por R. arrhizus na
descolorao do azo corante vermelho congo;
Extrair quitosana de biomassa obtida por R. arrhizus a partir das condies
selecionada pelos planejamentos fatoriais empregados;
Caracterizar atravs de mtodos fsico-qumicos a quitosana obtida;
Realizar a otimizao da produo de quitosana em relao ao grau de
desacetilao;
Avaliar o efeito direto e indireto da quitosana em diferentes concentraes na
proteo da tomate frente a fungos patgenos, em especial contra B. cinerea.
4
3. REVISO DA
LITERATURA
3.1 Fungos
A parede celular fngica ocupa aproximadamente 40% do volume da clula e
uma capa rugosa que rodeia o protoplasto. uma matriz extracelular de carboidrato
polimrico entrelaado com muitas protenas das quais tem carboidratos adicionados. A
composio da parede celular fngica dinmica e apresenta crescimento, morfologia e
alteraes originadas por fatores ambientais. A transmisso de micrografias eletrnicas
proporciona evidncia clara de que ela no homognea, sendo organizada em capas
(Figura 1), cada uma de diferente densidade eletrnica que geralmente corresponde
concentraes de monoprotenas sobre a superfcie de quitina e -glucano (LEVITZ Y
SPECHT, 2009).
O crescimento de qualquer organismo pode ser definido como o aumento
ordenado dos constituintes celulares que levam a um aumento da biomassa
(PROSSER, 1995). Nos fungos com morfologia filamentosa de crescimento e talo
cenoctico, no micelial, o crescimento se produz por aumento celular, diviso nuclear,
diviso celular e sntese de protoplasma. Finalmente, os fungos filamentosos com
miclio verdadeiro crescem por combinao de aumento e de divises celulares, mas se
diferenciam do que ocorrem nos leveduriformes porque esse crescimento no um
processo reprodutivo, j que implica no aumento do tamanho da populao
(GALVAGNO & FORCHIASSIN, 2010).
So poucos os polissacardeos presentes na parede celular dos fungos. O glucano se
encontra em 29%, o mananas 30 % e a quitina entre 25-30 %. A funo da quitina dar
uma delineada e espessa conformao clula, assim como conferir fora mecnica
parede celular (BARDALAYE Y NORDIN, 1976; ARBIA et al., 2013).
5
Figura 1- Esquema da parede celular fngica
A quitina est amplamente distribuda nos fungos Basidiomicetos, Ascomicetos,
Zigomicetos e Ficomicetos (POCHANAVANICH & SUNTORSUK, 2002). Ela se
encontra na parede celular do miclio, esporos e talo. Sua concentrao na parede
celular depende de sua fisiologia, meio ambiente e condies de fermentao, por tanto,
as caractersticas qumicas da parede celular fngica tm levado a estudar esta fonte
para produzir de derivado funcionais da quitina que a quitosana. Recentemente,
avanos na tecnologia das fermentaes sugerem a produo em grande escala de
cultivos de micro-organismos que contm quitosana e podem ser uma atrativa rota desse
biopolmero (KHALAF, 2004).
3.2 Zigomicetos
A maioria dos membros deste grupo de fungos so saprbios por excelncia em
matria orgnica em decomposio e em fezes de herbvoros, sendo conhecidas espcies
coprfilas obrigatrias e facultativas. Alguns poucos gneros so reconhecidos como
apresentando espcies parasitas de plantas superiores, outros podem atacar gros,
legumes e frutos estocados (ALEXOPOULOS et al., 1996; TRUFFEM, 2000). Os
Zygomycetes so representados por seis ordens, dentre elas encontra-se a Mucorales
(Figura 2) sendo tambm conhecidas como fungos do acar, uma vez que sua
capacidade de degradao limita-se s molculas de estruturas mais simples, como a
glicose e sacarose. Os representantes dessa ordem so os primeiros fungos a colonizar
um substrato, crescendo rapidamente com o miclio denso e conspcuo, chegando a
atingir 2 3 cm de altura (HESSELTINE & ELLIS, 1973).
6
3.3 Rhizopus arrhizus
Rhizopus so fungos filamentosos, cosmopolitas, sendo encontrados no solo ou
decompondo frutas, legumes, fezes de animais e alimentos. Algumas espcies deste
gnero so contaminantes comuns. Tambm so ocasionais causadores de srias, e
frequentemente fatais, infeces em humanos. Alm disso, outras espcies desse gnero
so consideradas fitopatgnicas (TRUFEM, 2000; MALLER, 2008).
No gnero Rhizopus so descritas vrias espcies, sendo as mais comuns
Rhizopus arrhizus, Rhizopus azygosporus, Rhizopus microsporus, Rhizopus schipperae
e Rhizopus stolonifer. Algumas caractersticas morfolgicas, como o comprimento dos
rizides e esporangioforos, o dimetro dos esporngios, a forma da columa, o tamanho,
a forma e a textura dos esporangiosporos auxiliam na diferenciao das espcies do
gnero. A temperatura de crescimento varivel entre elas (ALEXOPOULOS et al.,
1996).
A morfologia do gnero Rhizopus realizada em relao ao crescimento rpido
(quatro dias), a textura da colnia, a colorao inicialmente branca, passando para cinza
com a idade, hifas no septadas (cenocticas) e estruturas de reproduo, como
esporngio, esporangiosporos e os esporos (NASCIMENTO, 2006).
Estudos realizados por Pochanavanich e Suntornsuk (2002), descrevem a
significativa produo de quitosana por R. arrhizus evidenciando o potencial
biotecnolgico desse fungo na produo desse biopolmero ao comparar com os
resultados obtidos por fungos das espcies Aspergillus niger, Zygosacharomyces rouxii
e Candida albicans.
7
Figura 2 Classificao taxonmica dos Zygomycetes (HOLLMAN et al., 2008).
3.4 Aplicao Biotecnolgica do R. arrhizus
O R. arrhizus pertence a classe morfolgica dos Ficomicetos da subclasse
dos Zigomicetos (ATLAS, 1981; PELCZAR, 1980). So de interesse na
biotecnologia devido sua utilizao na indstria alimentcia na preparao de
alimentos fermentados (SOCCOL, 1986). tambm utilizado na produo de cidos
orgnicos, como o cido fumrico (RHODES et al., 1959) e o cido ltico (HANG et
al., 1989), assim como na produo de enzimas como as lipases (LABOUREUR
et al., 1966). Ele tem atuado em biotransformaes, como a hidroxilao da
progesterona (PETERSON et al., 1952) e do fenil-ciclohe.xano (FONKEN et al.,
1967) e em processos de biodegradao e biossoro de poluentes industriais
como a absoro do urnio (TSEZOS et al., 1981).
8
3.5 Viabilidade da produo de quitina e quitosana por fungos
Atualmente, as fontes de obteno da quitina e quitosana exploradas a nvel
comercial tm sido a carapaa de caranguejos e cascas de camaro, oriundas de resduos
da indstria pesqueira que processa estes crustceos (FAI et al., 2008;
GAVHANE et al., 2013). Entretanto, existem algumas limitaes utilizao desses
recursos, tais como: necessidade de ser bem triturado para obteno de um fino p; uso
de solues alcalinas fortes para realizar a desacetilao da quitina, que podem poluir o
meio ambiente; dificuldade de adaptao das espcies de crustceos a um determinado
ambiente e possibilidade de os resduos de protenas causarem reaes alrgicas
(FRANCO et al., 2000; AMORIM et al., 2001). A produo de quitina e quitosana, a
partir da biomassa micelial de fungos da ordem Mucorales, pode ser uma alternativa,
uma vez que um processo fcil e economicamente vivel, podendo-se efetuar a
extrao simultnea de quitina e quitosana. Alm disso, esses biopolmeros no
apresentam contaminao por protenas e o cultivo do fungo independente dos fatores
de sazonalidade, pode ser realizado em larga escala, com fcil controle do pH e da
concentrao de nutrientes no meio fermentativo (FRANCO et al.,2000; AMORIM et
al., 2006; STAMFORD et al., 2007).
4 Resduos industriais
4.1 Subprodutos Agroindustriais
A utilizao de subprodutos industriais vem se tornando importante para a
economia e o meio ambiente, uma vez que podem evitar possveis impactos ambientais.
Pesquisas foram realizadas utilizando resduos industriais para crescimento de micro-
organismos e recuperao de biomassa em diversas reas da biotecnologia, como sade,
agricultura, energia e meio ambiente (SANTOS, 2012; SILVA, 2012). Essas aplicaes
trouxeram consequncias de melhorias no saneamento e na implantao de indstrias
secundrias (SANTOS et al., 2006).
rgos governamentais e indstrias esto em constante preparo para aplicao
de uma poltica ambiental que possibilite diminuir os impactos ambientais negativos
natureza. Os resduos apresentam perda de matria-prima e energia, exigindo
investimentos significativos em tratamentos para posteriormente serem lanados em
9
corpos hdricos, podendo criar problemas ambientais caso no tratados. Alguns desses
resduos podem ser convertidos em outros produtos ou matrias primas para outros
processos aplicando-se uma tecnologia adequada (PELIZER, 2007).
4.1.1 Processamento do Milho
Quando cortado na vertical, o gro de milho revela alguns componentes bsicos,
como endosperma e que correspondente maior parte do gro, compe-se basicamente
de amido (61 %), glten (7 %), gua 16 % e pelcula. Esta ltima trata-se da parte que
recobre o gro pode ser utilizada para raes de animais. O grmen (11 %) e a parte
vegetativa do gro e fonte de leo de milho, sendo importante para indstrias de
alimentos. Outras substncias como vitaminas e fibras (5 %) so tambm importantes
devido a sua serventia nutritiva. A figura 3 representa os componentes do milho
(ABIMILHO, 2011).
Figura 3 Partes que contm o gro de milho (ABIMILHO, 2011)
Existem dois processos para industrializao de milho: a seco e a mido. No
processo a seco, o milho, aps limpeza e secagem, degerminado e separado em
endosperma e grmen, no qual o primeiro modo e classificado para a obteno de
produtos finais, e o segundo, passa por um processo de extrao para produo de leo e
farelo. No processamento via mida, o milho, aps limpeza e secagem, macerado e
separado em grmen, fibras e endosperma, e estes ainda podem ser separados em
10
amido e glten. Do amido obtm-se xaropes e outros tipos de amidos especiais. O
glten pode ser incorporado s fibras (ABIMILHO, 2011).
O estado do Paran o maior produtor de milho do Brasil, correspondendo a 24
% do total produzido no pas; a produo brasileira de milho em gros tem dois
destinos. O primeiro, o consumido no estabelecimento rural e, refere-se quela parcela
do milho que produzida e consumida no prprio estabelecimento, destinando-se ao
consumo animal. O segundo destina-se a oferta do produto no mercado consumidor,
onde se tem fluxos de comercializao direcionados para fbricas de raes, indstrias
alimentcias, mercado de consumo in natura e exportaes (EMBRAPA, 2010).
4.1.2 Resduo do Processamento do Milho
A milhocina um subproduto de beneficiamento de milho. Tambm chamado de
corn steep liquor (em ingls), ela contm grande quantidade de nitrognio, aminocidos
entre outros nutrientes, sendo utilizada principalmente como alimento, complementar na
fabricao de rao para aves e ruminantes (AMARTEY & LEUNG, 2000).
Algumas caractersticas fsico-qumicas do resduo: o valor de pH pode variar
de 3,5 a 4,1, a concentrao de nitrognio est entre 3,8 % a 4,5 % no efluente bruto, os
teores de acares (glicose) e cido ltico so bastante variados, normalmente os teores
de acares no ultrapassam de 5 % e os de cido ltico esto entre 5 15 % devido
j estarem em processo de fermentao nessa faixa de pH. A quantidade de matria
orgnica presente pode ser elevada, tornando-se um dos grandes problemas de
tratamento para as indstrias (LIGGETT & KOFFLER, 1998).
4.2 Glicerina
Com o aumento da produo de biodiesel ocorreu maior disponibilidade de
subprodutos oriundos dessa produo, destacando-se a glicerina bruta. Este resduo
utilizado na forma de glicerol aps passar por um processo de purificao nas indstrias
farmacuticas, nas indstrias de cosmticos, na sntese de resinas (steres), no uso
alimentcio e outros. O glicerol constitui-se em um composto orgnico de caracterstica
lquida-viscosa de sabor aucarado, tambm conhecido por 1,2,3- propanotriol, podendo
ser denominado de glicerina, trihidroxipropano, glicil lcool, gliceril e 1,2,3
11
trihidroxipropano; encontrado em vegetais oleaginosos, como a soja, mamona,
babau, girassol, palma, algodo, cco, dend, pinho manso e em tecidos animais
associados aos cidos graxos (RIVALDI et al., 2007).
A glicerina bruta vegetal originada da produo do biodiesel pode apresentar
diversos tipos de impurezas que podem ser residuais dos processos catalticos, de
transesterificao e/ou em funo da matria-prima utilizada. De fato, o leo de
mamona possui protenas que dificultam a purificao da glicerina bruta comparado ao
leo de soja (VILA FILHO et al., 2006).
Alguns autores (BENAZZI, 2005; MOREIRA & CARVALHO, 2009)
esclarecem que o termo glicerina utilizado para compostos com 95% ou mais de
glicerol em sua composio, mas a glicerina bruta obtida no processamento do biodiesel
composta de 80 a 95% de glicerol. Outros autores (RIVALDI et al., 2007) citam que
dependendo da tecnologia empregada na recuperao dos reagentes utilizados na reao
de transesterificao a glicerina bruta pode apresentar nveis de at 60% de glicerol em
sua composio. Este fato, aliado ao grande volume estocado, torna o seu valor
comercial baixo, entre R$ 0,20 a R$ 0,40 /kg.
Desde maio de 2008, de acordo com a Resoluo n 2/2009 do Conselho
Nacional de Poltica Energtica (CNPE), publicada no Dirio Oficial da Unio (DOU),
a adio de biodiesel ao diesel passou de 3% para 4%. Isso resultou na produo de
aproximadamente 120 mil toneladas de glicerina bruta, trazendo a preocupao a
respeito do seu destino.
Nesse trabalho a glicerina bruta, resduo industrial proveniente do
processamento do biodiesel foi utilizada como fonte de carbono para o meio de
produo da quitosana pelo fungo filamentoso Rhizopus arrhizus, pertencente a ordem
Mucolares.
5. Tcnica de Inteligncia artificial utilizada na otimizao de processos
5.1 Metodologia de Superfcie de Resposta
A Metodologia de Superfcie de Resposta um mtodo para otimizao de
processos, baseado em anlise de superfcies polinomiais, que produz um modelo, que
embora emprico, descreve matematicamente as relaes existentes entre as variveis
12
independentes e dependentes do processo em considerao. O modelo resultante pode
ser usado tanto para otimizao quanto para anlise de sensibilidade da varivel de sada
contra cada varivel de entrada (PANDA et al., 2007).
Segundo Myers et al. (1995), a Metodologia de Superficie de Resposta (RSM)
normalmente utilizada para refinar modelos obtidos por meio do planejamento de
experimentos fatoriais, especialmente se durante o processo de desenvolvimento da
experincia o pesquisador suspeitou que a resposta tem comportamento no linear. A
diferena entre uma equao que segue um modelo quadrtico do planejamento de
Superfcie de Resposta a que segue um modelo linear de um planejamento fatorial e a
adio de termos quadrticos que permitem ao pesquisador modelar tambm superfcies
que apresentam curvatura (LOURENCO, 2008).
Nos ltimos anos, a Metodologia de Superfcie de Resposta vem sendo aplicada
com sucesso na otimizao de diversos processos de produo de quitosana. Entretanto,
apesar da habilidade das Redes Neurais Artificiais em mapear relaes no lineares e de
seu grande uso na modelagem de outros bioprocessos (IMANDI et al., 2008).
6. Biopolmeros
6.1.Quitina
Os polmeros naturais apresentam ampla aplicabilidade em diversas reas de
estudo devido a sua fcil obteno e as suas propriedades, tais como biocompatibilidade
e biodegradabilidade. Entre estes polmeros destacam-se a quitina e a quitosana
(AZEVEDO et al.,2007). A quitina um biopolmero formado por unidades
monomricas repetidas de -1,4-N-acetilglucosamina e, aps a celulose, considerada o
biopolmero mais abundante e largamente distribudo na natureza, estando presente
como elemento estrutural em animais invertebrados, na maioria dos artrpodes e na
parede celular de fungos, principalmente os da classe Zygomycetes, ordem Mucorales
(FRANCO et al., 2000; LARANJEIRA et al., 2009; SILVA et al., 2010). Este
polissacardeo natural possui uma estrutura cristalina altamente organizada, comprovada
por difrao de raios-X. A quitina insolvel em meio aquoso e na maioria dos
solventes orgnicos, tem baixa reatividade qumica e no digervel por animais
vertebrados (LARANJEIRA et al., 2009).
13
6.2 Quitosana
A quitosana um polmero de D-glucosamina, derivada da desacetilizao da
quitina (Figura 4), sendo encontrada naturalmente na parede celular de fungos,
principalmente os da classe Zygomycetes (SATAMFORD et al., 2007; FAI et al.,2008;
BUETER et al., 2013; BERGER et al., 2014) que podem apresentar at 50% deste na
sua estrutura (ZAMANI et al., 2010).
Esse polissacardeo solvel em solues aquosas quando diludas de cidos
orgnicos e inorgnicos, devido a protonao dos grupos amino da posio C2 da
unidade repetitiva da glucosamina e o resultado uma carga positiva, sendo que a
solubilidade da quitosana depende da quantidade de grupos N-acetil presentes na cadeia
do polissacardeo (ALVARENGA et al., 2010). Alm disso, apresenta uma excelente
biocompatibilidade; quase nenhuma toxidade ao ser humano e animais; alta
bioatividade; biodegradabilidade; reatividade do grupo amino desacetilado;
permeabilidade seletiva; ao polieletroltica; atividade antimicrobiana; habilidade em
formar gel e filme; habilidade de quelao e capacidade adsortiva (NESIC, 2012;
SCHUEREN, 2012; THARANATHAN et al., 2003; SINGH et al., 2006; STAMFORD
et al., 2014).
Figura 4 - Desacetilao parcial da quitina
Dependendo da fonte, a quitina pode ser encontrada em duas formas
cristalogrficas diferentes: a ea as quais podem ser identificadas por ressonncia
magntica nuclear (RMN) e difrao de raio X. Existe uma terceira forma, a mas
depois de terem realizados estudos minuciosos, descobriu-se que ela tem sido
considerada como uma variedade da famlia RINAUDO, 2006).
A forma encontrada em crustceos, insetos e fungos possuindo um arranjo
de cadeias alternadas e antiparalelas, considerada a forma mais comum e mais estvel
frente a processos qumicos (Figura 5). A forma ocorre em organismos como algas
microscpicas e em lulas em que est associada protenas e possui um arranjo de
14
cadeias paralelas (Figura 6). Comparada com a quitina, a forma possui solubilidade
em um nmero maior de solventes, maior reatividade em reaes qumicas (WAHAB;
ABDOU, 2010).
Figura 5 - Estrutura de quitina. Em (a) projeo ac; (b) projeo bc; (c) projeo ab.
(RINAUDO, 2006)
Figura 6 - Estrutura de quitina. Em (a) projeo ac; (b) projeo bc; (c) projeo ab.
(RINAUDO, 2006)
15
7. Potencial biotecnolgico da Quitosana
7.1 Biofilmes
Produtos vegetais tm o tempo de armazenamento extendido quando revestidos
com quitosana. Esse biopolmero forma um filme semipermevel que regula as trocas
gasosas e reduz as perdas por transpirao, consequentemente o amadurecimento do
fruto retardado. Diferentes frutos revestidos com quitosana geralmente tm suas taxas
de respirao e perdas de gua reduzidas, dentre os quais tomates, morangos, mas,
mangas, bananas e pimentas (DU et al., 1997, 1998; EL GHAOUTH et al.,
1991a,1992c; KITTUR et al., 2001; JIANG & LI, 2001). A eficcia de quitosana na
reduo da produo de CO2 interno descrito em tomates e pras (EL GHAOUTH et
al., 1992c; DU et al., 1997).
Revestimentos de quitosana associados temperatura de armazenamento podem
estar diretamente ligados com a reduo da produo de CO2. Pepinos e pimentas
tiveram menores taxas de respirao a 13C do que a 20C (EL GHAOUTH et al.,
1991a). Alm da inibio de CO2 resultante do revestimento de quitosana, a produo
de etileno em frutos tambm reduzida. Ambos efeitos inibitrios foram observados em
pssegos e tomates revestidos com quitosana (EL GHAOUTH et al., 1992c; LI & YU,
2000). Frutos como morangos, framboesas, tomates, pssegos, mames e outros frutos
tiveram suas perdas de firmeza retardadas durante o armazenamento quando tratados
com quitosana (EL GHAOUTH et al., 1991b, 1992c; BAUTISTA-BAOS et al., 2003;
LI e YU, 2000).
Pulverizaes de quitosana nas pr-colheitas nas concentraes 2,4 e 6 g/L-1 em
plantas de morangos, no causaram fitotoxidade e os frutos tratados com o tempo e
temperatura de armazenamento se tornaram mais firmes que os no tratados
(BHASKARA REDDY et al., 2000). Em geral, a degradao de antocianinas em frutos
tratados com quitosanas retardada, de mesmo modo foi demonstrada em lichia,
morango e framboesa (LI e CHUNG, 1986; ZHANG e QUANTICK, 1997, 1998).
Porm outro estudo relatou um efeito oposto ao descrito anteriormente, no qual foi
mencionado haver sntese de antocianinas em morangos tratados com quitosana (EL
GHAOUTH et al., 1991b). Morangos, tomates e pssegos tratados com quitosana aps
armazenamento, apresentaram maior acidez titulvel comparada dos frutos controle,
enquanto outros frutos como mangas tiveram acidez titulvel reduzida lentamente (EL
16
GHAOUTH et al.,1992c; LI & YU, 2000; JIANG & LI, 2001; SRINIVASA et al.,
2002). Os teores de acar redutor de frutos so tambm afetados por revestimento de
quitosana: menores teores de acar redutor em bananas tratadas com quitosana foram
observados em comparao frutos no tratados no final do perodo de armazenamento
(DU et al., 1997; KITTUR et al., 2001; SRINIVASA et al., 2002; BAUTISTA-
BAOS et al., 2003).
Uma provvel explicao para isto poderia estar relacionada ao modo de
aplicao de quitosana na superfcie do fruto. No primeiro estudo, os frutos de manga
foram embalados em caixas de papelo e cobertos com filme de quitosana, neste caso os
teores de acares redutores foram maiores que os dos frutos controle, enquanto que no
segundo estudo, os frutos de manga foram imersos em uma soluo de quitosana, e
estes frutos tiveram menores teores de acares redutores o que os frutos controle
(KITTUR et al., 2001; SRINIVASA et al., 2002) indicando que os frutos imersos
tiveram reduo do metabolismo comparado aos frutos no tratados com quitosana.
O teor de cido ascrbico em mangas e pssegos tratados com quitosana tambm
foram avaliados (LI & YU, 2000; SRINIVASA et al., 2002). Nestes estudos, o teor
desta vitamina em mangas tratadas decresceu gradualmente durante o perodo de
armazenamento e foi menor que em frutos no tratados. Porm, em pssegos, os teores
de cido ascrbico foram maiores nos frutos tratados com quitosana do que os dos
frutos controle e tambm tratados com fungicida Prochloraz depois de doze dias de
armazenamento. Embora poucos estudos relatem o efeito de quitosana nos atributos
sensoriais dos produtos vegetais tratados, geralmente, o sabor e gosto permanecem
inalterados. Mangas e morangos tratados com quitosana obtiveram maiores pontuaes
nos atributos sensoriais comparados com os frutos no tratados armazenados por 21 e
15 dias, respectivamente (LI & CHUNG, 1986; KITTUR et al., 2001). Em outros
estudos morangos revestidos com quitosana e armazenados por 12 dias a 7C tiveram
um gosto levemente amargo somente no dia zero (DEVLIEGHERE et al., 2004).
17
7.2 Antifngico
Aps a descoberta da atividade antimicrobriana de quitosana e seus derivados
por Allan & Hadwiger (1979), Kendra & Hadwiger (1984) e Uchida et a (1989), muitos
pesquisadores tm feito estudos neste campo. Neste contexto a atividade antimicrobiana
de quitina, quitosana e seus derivados contra diferentes grupos de micro-organismos
como bactrias, leveduras e fungos receberam considervel ateno (TEZZOTO-
ULIANA et al., 2014; SAJOMSANG , 2012; YALPANI et al., 1992).
A deteriorao ps-colheita devido ao de fungos limita o valor econmico de
vegetais armazenados. Embora os fungicidas sejam extensivamente usados no controle
de doenas ps-colheita, h interesse pblico na reduo destes resduos em alimentos
bem como aos patgenos resistentes a fungicidas.
Mtodos no convencionais de controle de fitopatgenos ps-colheita tm sido
relatados na literatura. Alm dos estudos com controles de fungos fitopatognicos por
fungicidas (GRIFFIN, 1994), outros mtodos tm sido empregados, como por exemplo:
Controle biolgico (MELO, 2002), associao de controle biolgico a CaCl2
(WISNIEWSKI et al., 1995; TIAN et al., 2001; TIAN et al., 2002), associao de
controle biolgico atmosfera modificada (QIN et al., 2004), tratamento trmico ps-
colheita (COUEY, 1989; FALLIK et al., 1995), associao de tratamento trmico e
etanol (KARABULUT et al., 2004) e de quitosana (SHAHIDI et al., 1999;
BAUTISTA-BAOS et al., 2006;).
H uma forte evidncia que o crescimento miceliano fngico pode ser inibido
completamente ou retardado quando quitosana adicionada ao meio de cultura de
fungos. Ao se aumentar concentrao de quitosana de 0,75 a 6,0 mg/mL. El Ghaouth
et al (1992a) observaram diminuio do crescimento radial dos fungos Alternaria
alternata, Botrytis cinerea, Colletrotichum gloeosporioides e Rhizopus stolonifer. O
mesmo efeito foi observado contra Sclerotinia sclerotiorum ao se aumentar a
concentrao de quitosana de 1 a 4% (m/v) (CHEAH & PAGE, 1997). Na Tabela 1 so
listados alguns estudos nos quais foram avaliados os efeitos de quitosanas in vitro no
crescimento de fungos fitopatognicos.
18
TABELA 1 Efeitos de quitosana in vitro na inibio do crescimento de fungos
Allan & Hadwiger (1979) observaram que a quitosana possui forte atividade
antifngica contra um grande nmero de fitopatgenos. Porm, os resultados de Roller
& Covill (1999) mostraram que o fungo Mucor racemosus, cujas paredes celulares so
constitudas de quitosana, teve inibio do seu crescimento a uma concentrao de
quitosana de 1 g/L, contrariando a proposio de Allan & Hadwiger (1979) que inclua
cepas de Mucor spp.
7.3 Infeco de frutas por fitopatgenos
O desenvolvimento de fungos durante o armazenamento e transporte de uvas de
mesa a maior causa de perdas ps-colheita, sendo Botrytis cinerea, agente causal
dessa infeco (BULIT et al., 1990). B. cinerea causa perdas de importncia
econmica, no apenas na pr-colheita, mas tambm durante o transporte e
armazenamento, portanto, por mais eficiente que seja o tratamento fitossanitrio
efetuado no campo, o mesmo no suficiente para dispens-lo na ps-colheita. Nessa
situao, importantes medidas de controle incluem manuseio cuidadoso, resfriamento
rpido e uso de SO2, aliados ao armazenamento refrigerado, sob temperaturas prximas
a 0C. Porm, alternativas ao SO2 so necessrias, principalmente devido ao sulfito ser
alrgico para algumas pessoas (LICHTER et al., 2002), e o mesmo estar sendo banido
ou restrito para uso em certos produtos de origem vegetal. A nfase em proteo de
frutos ps-colheita contra podrides tem sido desviada do uso de produtos qumicos
para vrias tcnicas alternativas de controle, que garantam a segurana do produto e que
no coloque em risco a sade dos consumidores, minimizando ou substituindo o uso de
fungicidas e, prolongando o perodo de conservao dos frutos.
19
Os frutos, devido ao seu baixo pH, elevado teor de umidade e composio de
nutrientes, so muito susceptveis ao de patgenos fngicos, os quais em adio a
sua ao deteriorante, podem tornar os produtos imprprios para o consumo devido
produo de micotoxinas (MOSS et al., 2002; LIU et al., 2007). A presena de fungos e
seus metablitos est entre as principais causas biolgicas primrias de perdas de
produtos perecveis de origem vegetal. Eckert & Ratnayake (1994) estimaram que, de
aproximadamente cem mil espcies fngicas reconhecidas, menos de 10% so
fitopatgenos, enquanto que em torno de cem espcies so responsveis pela maioria
das doenas ps-colheita. Agncias internacionais de monitoramento dos recursos
alimentares no mundo reconhecem que a opo mais vivel para alcanar a futura
necessidade de alimentos seria a reduo de perdas ps-colheita (TRIPATHI et al.,
2004). Penicillium digitatum, Botrytis cinerea, Alternaria alternata, A. solani,
Rhizopus stolonifer, Aspergillus niger e Colletotrichum gloeosporioides destacam-se
como fungos patgenos em frutos ps-colheita (DAFERERA et al., 2003;
TZORTZAKIS et al., 2007).
A atividade antimicrobiana de substncias naturais bioativas como a quitina,
quitosana e seus derivados contra diferentes grupos de micro-organismos, tais como,
bactrias, leveduras e fungos tem recebido ateno nos ltimos anos (SHAHIDI et al.,
1999; MOUSSA et al., 2013). O tratamento de frutos com quitosana, um polissacardeo
catinico de alto peso molecular, solvel em cidos orgnicos, tem se mostrado
promissor no controle de doenas em ps-colheita de frutos (EL GHAOUTH et al.,
1997; JIANG et al., 2001), por apresentar atividade antifngica contra vrios patgenos,
inclusive B. cinerea (EL GHAOUTH et al., 1991; REDDY et al., 2000; ROMANAZZI
et al., 2002, 2003; BAUTISTA-BAOS et al., 2003).
7.4 Mecanismo de atividade antimicrobiana da quitina e quitosana
O mecanismo de ao da atividade antimicrobiana de quitina, quitosana e seus
derivados no ainda bem esclarecido, entretanto diferentes mecanismos tm sido
propostos. Acredita-se que a quitosana interfira nos grupos carregados negativamente
das macromolculas expostas na superfcie da parede celular fngica e, desta maneira,
h modificao da permeabilidade da membrana plasmtica (BENHAMOU, 1996) o
que conduz a liberao de protenas e outros constituintes intracelulares (HADWIGER
20
et al., 1986; SEO et al., 1992; FANG et al., 1994; CHEN et al., 1998; JUNG et al.,
1999). A interao eletrosttica entre as molculas de quitosana e os grupos
negativamente carregados encontrados na membrana celular ocorre devido carga
positiva no carbono dois (C-2) dos monmeros de glicosamina a pH abaixo de 6, que
torna o polmero quitosana mais solvel e com melhor atividade antimicrobiana
comparado a quitina (CHEN et al., 1998). Esta importante propriedade do polmero
quitosana, a capacidade de se protonar em solues cidas, devido presena de
aminas na molcula que se ligam a prtons como mostrado na equao (1) abaixo:
O valor de pKa de quitosana de aproximadamente 6,3. A quitosana se
solubiliza quando mais que 50% dos grupos amino est protonado (RINAUDO et al.,
1999); desta maneira, a solubilidade de quitosana diminui agudamente quando o pH
aumenta acima de 6,0 a 6,5 (VRUM et al., 1994).
Sudarshan et al (1992) e Papineau et al (1991) observaram aglutinao
bacteriana ao se usar baixas concentraes de quitosana menores que 0,2 mg/mL devido
provavelmente ligao do polmero policatinico superfcie bacteriana carregada
negativamente; todavia em altas concentraes, a aglutinao no foi observada, o que,
segundo os autores, podem estar relacionadas ao nmero elevado de cargas positivas
que podem ter formado uma rede de carga positiva na superfcie bacteriana, mantendo-
as em suspenso.
A interao entre quitosana e a clula tambm pode alterar a permeabilidade da
membrana celular. Por exemplo, a fermentao de leveduras usadas em panificao
inibida por certos ctions que agem em sua superfcie e previnem a entrada de glicose
(RABEA et al., 2003). A interao entre quitosana e clulas de Pythium oaroecandrum
foi estudada por Leuba & Stossel (1985), os quais usaram a tcnica de UV e observaram
que houve considervel liberao de material protico das clulas a pH 5,8. Quitosana
age tambm como agente quelante que seletivamente se liga a traos de metais e desta
forma inibe a produo de toxinas e crescimento microbiano (CUERO et al., 1991).
Liu et al. (2004) avaliaram a atividade antibacteriana de soluo de acetato de
quitosana contra Escherichia coli e Staphylococcus aureus. A integridade da membrana
21
celular de ambas espcies foi investigada por determinao da liberao de materiais
intercelulares que absorvem na faixa de 260 nm. Foi observado aumento gradativo de
material intercelular das suspenses de bactrias tratadas com acetato de quitosana (0,5
e 0,25% m/v) durante duas horas de monitoramento. Os autores tambm observaram
que de acordo com os resultados dos espectros de infravermelho e dos perfis de
termogravimetria e termogravimetria diferencial, houve formao de ligao inica
entre o grupo NH3+ do acetato de quitosana e o grupo fosforila da fosfatidilcolina. Este
resultado parece confirmar a interao eletrosttica entre acetato de quitosana e
fosfatidilcolina que um dos componentes da membrana celular bacteriana.
8. Efluente e corante Txtil
A indstria txtil um dos maiores segmentos produtores de efluentes lquidos,
sendo necessrios cerca de 150 litros de gua por cada quilo de tecido acabado, do quais
80% desse volume so descartados como efluente, e apenas 12% do total compem as
perdas por evaporao. Sendo assim, o alto consumo de gua demandado por esse
segmento industrial devido s operaes de lavagem, tingimento e preparao dos
tecidos, sem qualquer recuperao deste lquido aps cada operao (IMMICH, 2006;
ASGHER & BHATTI, 2012; OLIVEIRA et al., 2014).
Por sua vez os efluentes txteis contm inmeras substncias contaminantes,
devido a intensa utilizao de produtos qumicos, os quais podem causar danos ao meio
ambiente se no forem adequadamente removidas ou tratados (SIDDIQUE et al., 2011).
Dependendo da origem, os efluentes apresentam normalmente vazes, cargas orgnicas,
condutividade, cor, pH normalmente alcalino, com contaminao na forma solvel
(RAMOS, 2002).
A composio de um efluente misto da indstria txtil contm cor intensa, alta
temperatura, alta concentrao de matria orgnica, grande quantidade de DQO e altas
concentraes de AOX (Organo Halogenados Adsorvveis) (BITENCOURT, 2002; JOE
et al., 2011).
Portanto, os efluentes txteis se caracterizam por serem altamente coloridos
devido a presena de corantes que no se fixam nas fibras durante o processo de
tingimento. Os corantes so molculas normalmente orgnicas, altamente estruturadas e
de difcil degradao biolgica. Sua concentrao muitas vezes menor do que de
22
outros produtos qumicos encontrados nos despejos, mas sua cor visvel, mesmo em
baixas concentraes (SARASA et al., 2005; SOUZA, 2009).
Contudo, descarte dos corantes para o ambiente depende do tipo do corante, do
tipo de fibra e do grau de fixao (RAMOS, 2002). A poluio de corpo de gua
juntamente com outros compostos, como produtos auxiliares e o amido provocam alm
da poluio visual, alteraes em ciclos biolgicos afetando, principalmente, o
fenmeno da fotossntese. Alm deste fato, as pesquisas tm mostrado que algumas
classes de corantes, principalmente azo corantes, e seus subprodutos, podem ser
carcinognicos e mutagnicos (BARCELLOS et al., 2009). Novos estudos vem sendo
realizados a fim de minimizar o impacto que esses compostos causam ao meio
ambiente.
8.1 Corantes Azicos
So compostos insolveis em gua, que so sintetizados sobre a fibra durante o
processo de tingimento. Nesse processo a fibra impregnada com um composto solvel
em gua, naftol, que apresenta alta afinidade por celulose. A adio de um sal de
diaznio provoca uma reao com o agente de acoplamento j fixado na fibra e produz
um corante insolvel em gua. A insolubilidade do corante formado determina alta
solidez do tingimento, principalmente na resistncia luz e umidade. O fato de usar
um sistema de produo do corante diretamente sobre a fibra, atravs da combinao de
um corante precursor sem grupos sulfnicos e a formao de um composto solvel,
permite um mtodo de tingimento de fibras celulsicas com alto padro de fixao
(GUARATINI & ZANONI, 2000; ALMEIDA, 2006; GULNAZ et al., 2011; NEVES et
al., 2014).
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36
CAPTULO 2
PRIMEIRO ARTIGO
Otimizao da Produo de Biomassa por
Rhizopus arrhizus e Aplicao na Descolorao do Azo
Corante Vermelho Congo em Efluente Txtil
38
Otimizao da Produo de Biomassa por
Rhizopus arrhizus e Aplicao na Descolorao do Azo
Corante Vermelho Congo em Efluente Txtil
Trabalho submetido como artigo : Molecules
Fator de impacto: 2,095
39
Otimizao da Produo de Biomassa por
Rhizopus arrhizus e Aplicao na Descolorao do
Efluente Sinttico de Vermelho Congo
SILVA , A.M. 1,3, J.M.N. ,LIMA 1,3, SANTOS, YMF2,3, PORTO, A.L. F4, C.D.C,
ALBUQUERQUE3, G.M. CAMPOS-TAKAKI3*
1Doutorado em Cincias Biolgicas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife,
Pernambuco, Brasil, 2Mestrado em Cincias Biolgicas, Universidade Federal de Pernambuco,
Recife, Pernambuco, Brasil 3Ncleo de Pesquisas em Cincias Ambientais, Universidade
Catlica de Pernambuco4 Departamento de Moforlogia e Fisiologia animal, Universidade
Federal Rural de Pernambuco, Recife-Pernambuco, Brasil.
RESUMO
O setor txtil tem uma enorme responsabilidade na contaminao ambiental devido ao
lanamento de efluentes em corpos hdricos, sem o tratamento adequado, o que causa graves
danos ao meio ambiente. Esse problema, que envolve grandes quantidades de corantes nos
lanamentos de efluentes, tem se agravado nos ltimos anos atraindo cada vez mais a ateno de
especialistas na rea. Diante do contexto, investigaes foram realizadas utilizando
planejamentos fatoriais sequenciais, em fermentao submersa por Rhizopus arrhizus, atravs
da qual foi obtida biomassa, aplicando-se como variveis independentes resduos agroindustriais
(milhocina proviniente do beneficiamento do milho e glicerina oriunda do processamento do
biodiesel), tendo como varivel resposta a produo de biomassa para posterior aplicao como
biossorvente na descolorao do vermelho congo solvel em gua. O fungo filamentoso foi
cultivado a 28C em meio YMA (Yeast Malt Agar) e utilizado como inculo para fermentao
de acordo com o planejamento fatorial. As amostras foram dispostas em 100mL em
Erlenmeyers de 250mL e incubadas num agitador orbital a 150 rpm durante 72h. A biomassa
produzida foi inativada em autoclave a 121C e aplicada na descolorao do vermelho congo a
2% obtendo-se um grau de descolorao de 80,85%. Face do que foi exposto, R. arrhizus
apresenta alto potencial biotecnolgico na obteno de biomassa e quitosana em substratos
agroindustriais do mesmo modo que a biomassa inativada de R. arrhizus mostra-se um
promissor adsorvente para aplicao na descolorao de efluentes constitudo de azocorantes.
Palavras-chave: Resduos industriais, R. arrhizus, biomassa, corante txtil, adsoro.
40
1. INTRODUCO
Estudos biotecnolgicos sugerem que fungos da classe Zygomicetes sob
condies de cultivo selecionadas, so excelentes produtores de biomassa e contm
quitosana como componente da parede celular. Esses microrganismos podem ser
facilmente cultivados usando nutrientes de baixo custo e o material da parede celular
pode ser obtido por procedimentos qumicos simples [1,2,3].
Vale ressaltar que experimentos promissores comprovam que a biomassa obtida
do processo de fermentao submersa pode ser empregada no processo de descolorao
de efluentes industriais atravs da adsoro. Os processos que utilizam ou produzem
corantes em alguma de suas etapas requerem um grande volume de gua; a gerao
desses produtos txicos atualmente um dos mais importantes assuntos em controle de
