UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

INSTITUTO MULTIDISCIPLINAR EM SADE IMS

PROGRAMA MULTICNTRICO DE PS-GRADUAO EM CINCIAS FISIOLGICAS - SBFIS

SAMIRA ITANA DE SOUZA

ALTERAES RENAIS E METABLICAS INDUZIDAS PELA

DIETA HIPERLIPDICA E HIPERSDICA EM RATAS

OVARIECTOMIZADAS.

Vitria da Conquista

2012

SAMIRA ITANA DE SOUZA

ALTERAES RENAIS E METABLICAS INDUZIDAS PELA DIETA HIPERLIPDICA E HIPERSDICA EM RATAS

OVARIECTOMIZADAS.

Dissertao apresentada ao Programa Multicntrico de Ps-Graduao em Cincias Fisiolgicas/Sociedade Brasileira de Fisiologia, Universidade Federal da Bahia, como requisito para obteno do ttulo de Mestre em Cincias Fisiolgicas. Orientadora: Prof. Dr. Telma de Jesus Soares Universidade Federal da Bahia UFBA Co-orientadora: Prof. Dr. Terezila Machado Coimbra Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto FMRP/USP

Vitria da Conquista

2012

Biblioteca Universitria Campus Ansio Teixeira - UFBA

Souza, Samira Itana de

Alteraes renais e metablicas induzidas pela dieta hiperlipdica e hipersdica em

ratas ovariectomizadas / Samira Itana de Souza - 2012.

98 f. : il.

Orientadora: Prof. Dr. Telma de Jesus Soares; Prof. Dr. Terezila Machado

Coimbra.

Dissertao (mestrado) Universidade Federal da Bahia, Programa Multicntrico de

Ps-Graduao em Cincias Fisiolgicas, 2012.

1. Dieta Hiperlipdica. 2. Cloreto de Sdio na Dieta. 3. Ovariectomia. 4. Obesidade. I. Universidade Federal da Bahia. Programa Multicntrico de Ps-Graduao em Cincias Fisiolgicas. II. Ttulo. CDU 615.874.25

Deus, por sempre iluminar meus caminhos.

Aos meus pais pelo imenso amor, proteo, fora e carinho.

Aos meus queridos irmos Sanaia, Sanio e Maria Lcia pela cumplicidade, apoio e afeto.

Ao meu namorado pelo companheirismo, carinho e compreenso.

AGRADECIMENTOS

Deus, por conceder a mim a oportunidade de ingressar no mestrado e tambm pela imensa proteo e fora nos momentos difceis. Aos meus pais pelo amor, proteo e palavras de incentivo e afeto que me fortaleceram durante toda a jornada. Aos meus irmos Sanaia, Snio e Maria Lcia pelo companheirismo, carinho e momentos de alegria. Ao meu namorado e aos meus sogros pelo apoio e carinho. prof Telma de Jesus Soares, minha orientadora, que com muita tranquilidade e serenidade soube me conduzir e transmitir seus conhecimentos, contribuindo grandemente para meu amadurecimento profissional. Agradeo tambm pela confiana depositada em mim, pelos conselhos e pelo carinho com que me tratou durante os dois anos de mestrado. prof Terezila Machado Coimbra pela co-orientao do trabalho e pela contribuio para concretizao do mesmo, disponibilizando o seu laboratrio para realizao de alguns experimentos. Ao prof Jos Rodrigues Antunes pela idealizao do Programa Multicntrico em Cincias Fisiolgicas, descentralizando a pesquisa cientfica e possibilitando a difuso dos conhecimentos na rea de fisiologia. prof Amlia Cristina Mendes de Magalhes pela disponibilidade em ajudar, pelas sugestes e contribuio para a construo do trabalho. s professoras Najara de Oliveira Belo e Regiane Yatsuda pela contribuio para realizao do trabalho e pelo bom funcionamento do programa. Ao prof Cndido Celso Coimbra, do Laboratrio de Endocrinologia e Metabolismo do ICB na Universidade Federal de Minas Gerais, pela realizao do radioimunoensaio para insulina. prof Josmara Bartolomei Fregoneze pelo fornecimento dos ratos do Biotrio Setorial do Instituto de Cincias da Sade da Universidade Federal da Bahia ICS/UFBA. prof Cludia Macedo e a Ana Paula Silva Pereira pela realizao dos cortes histolgicos. Aos colegas de laboratrio Anna Carolina, Everaldo, Kelle, Leda, Liliany, Daniela, Raimundo, Thiago Henrique, Gleisy, Luciano, Grazielle e Jussara pela convivncia harmoniosa.

Aos colegas de iniciao cientfica, Thiago Trindade, Welber, Fernanda, Jssica, Roberta, Higor, Gabriela, Brbara, Cleidiani, Emanuele, Amanda Rocha, Amanda, Samuel, pela ajuda nos experimentos e dedicao ao projeto. Helosa e veling, alunas de ps-doutorado e doutorado respectivamente, do laboratrio de Fisiologia Renal da FMRP/USP, pelo carinho com que me receberam e tambm pela contribuio na realizao de alguns experimentos. tcnica do laboratrio de Fisiologia Renal da FMRP/USP, Cleonice Giovanni Alves da Silva, pelo auxlio na realizao de alguns experimentos. Ao tcnico do Departamento de Fisiologia da FMRP-USP, Rubens Fernando de Melo, pelos cortes histolgicos. tcnica do departamento de Farmacologia da FMRP/USP, Giuliana Bertozi Francisco pela realizao do ELISA. Aos professores e colegas das Universidades Nucleadoras da FMRP/USP e UFRJ pelo acolhimento. CAPES e FAPESB, pela concesso de bolsa e pelo auxlio financeiro para o projeto que possibilitaram a realizao deste trabalho.

Feliz o homem que acha sabedoria, e o homem que adquire conhecimento; porque melhor o lucro que

ela d do que o da prata, e melhor a sua renda do que o ouro mais fino. Mais preciosa do que

prolas, e tudo o que podes desejar no comparvel a ela

(Pv, 3.13-15)

SOUZA, Samira Itana de. Alteraes renais e metablicas induzidas pela dieta hiperlipdica e hipersdica em ratas ovariectomizadas. 97 f. il. 2012. Dissertao (Mestrado) Instituto Multidisciplinar de Sade, Universidade Federal da Bahia, Vitria da Conquista, 2012

RESUMO

O consumo de dieta hiperlipdica e hipersdica est associado ao aumento da presso arterial, do peso corporal e do tecido adiposo visceral. O excesso de peso e a sobrecarga de sal podem promover alteraes renais. Contudo, a influncia dessa dieta sobre a funo e estrutura renal durante a reduo dos hormnios ovarianos tem sido pouco documentada. O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos da dieta hiperlipdica e hipersdica sobre a presso arterial e os parmetros renais e bioqumicos em ratas ovariectomizadas. Vinte e quatro ratas Wistar foram ovariectomizadas (OV) e divididas nos seguintes grupos: DCO - ratas OV submetidas dieta padro contendo 12,39% do total de calorias advindas de gordura e 0,3% de cloreto de sdio (n=6); DLO - ratas OV submetidas dieta hiperlipdica contendo 51,1% do total de calorias advindas de gordura e 0,3% de cloreto de sdio (n=8); e DLSO - ratas OV submetidas dieta hiperlipdica contendo 56,1% do total de calorias advindas de gordura e 8% de cloreto de sdio (n=10). O peso e a presso sangunea foram determinados semanalmente. Amostras de sangue foram coletadas para anlise de funo renal e para determinao da glicose, colesterol total, triglicerdeos, insulina e da tolerncia a glicose. Amostras de urina de 24h foram utilizadas para anlise de funo renal. Os animais foram sacrificados aps 24 semanas de dieta e os rins removidos para a realizao dos estudos histolgicos, morfomtricos e imunoistoqumicos. O tecido adiposo visceral foi tambm removido. Os resultados demonstraram que o grupo DLO apresentou maior ganho de peso corporal e ingesto calrica quando comparado ao grupo DCO, enquanto o grupo DLSO no apresentou alteraes significativas desses parmetros. Os grupos DLO e DLSO demonstraram aumento do tecido adiposo abdominal e da presso arterial sistlica (PAS) quando comparado ao grupo DCO. O grupo DLSO apresentou ainda maior PAS em relao ao DLO. Esses animais no apresentaram diferenas nos nveis sricos de colesterol total, triglicerdeos e de glicose, porm, demostraram reduo da tolerncia a glicose quando comparado ao grupo controle. As ratas do grupo DLO apresentaram elevao dos nveis sricos de insulina, do ndice HOMA-IR, da proteinria e reduo da frao de excreo de sdio (FENa+) comparado ao controle. Contudo, a proteinria e a FENa+ foram mais elevados no grupo DLSO. No foram observadas alteraes significativas da creatinina plasmtica e da taxa de filtrao glomerular entre os grupos. O grupo DLO apresentou alteraes discretas no compartimento tbulo-intersticial do crtex renal, caracterizadas por infiltrado inflamatrio, fibrose intersticial e dilatao e atrofia tubular. Essas alteraes no foram observadas no grupo DLSO. O nmero de macrfagos/moncitos estava aumentado no crtex renal das ratas dos grupos DLO e DLSO em relao ao grupo DCO. Os nossos resultados demonstram que a adio de sal dieta hiperlipdica em ratas ovariectomizadas pode contribuir para elevao da PAS e do tecido adiposo visceral, reduo da tolerncia a glicose, proteinria e infiltrao de macrfagos/moncitos no tecido renal.

Palavras-chave: Dieta hiperlipdica; Cloreto de sdio na dieta; Ovariectomia; Obesidade.

SOUZA, Samira Itana de. Renal and metabolic alterations induced by high fat and

high salt diet in ovariectomized rats. 97 pp. ill. 2012. Mster Dissertation Instituto

Multidisciplinar de Sade, Universidade Federal da Bahia, Vitria da Conquista,

2012.

ABSTRACT

The consumption of high fat and high salt diet is associated with increased blood

pressure, body weight and visceral adipose tissue. Excess of weight and high salt

diet may promote renal alterations. However, the influence of this diet on renal

function and structure during the reduction of ovarian hormones has been less

documented. The aim of this study was to evaluate the effects of high fat plus high

salt diet on blood pressure and renal and biochemical parameters in ovariectomized

rats. Twenty-four Wistar rats were ovariectomized (OV) and divided into the following

groups: OSD OV rats submitted to the standard diet containing 12,39% of total

calories from fat and 0,3% of sodium chloride (n=6), OHFD OV rats submitted to

high-fat diet containing 51,1% of total calories from fat and 0,3% of sodium chloride

(n=8) and OHFSD - OV rats submitted to high-fat diet containing 56,1% of total

calories from fat and 8% of sodium chloride (n=10). Weight and blood pressure were

measured weekly. Blood samples were collected for analysis of renal function and to

determine serum glucose, total cholesterol, triglycerides, insulin and glucose

tolerance. Urine samples collected over a 24-hour period were used for analysis of

renal function. The animals were killed 24 weeks after the dietary treatment, at which

time the kidneys were removed for histological, morphometric, immunohistochemical

studies. The visceral adipose tissue was also removed. The results demonstrated

that OHFD group presented higher weight gain and caloric intake compared to the

OSD group, while OHFSD group didnt show any significant alterations of these

parameters. The OHFD and OHFSD group rats showed increased visceral adipose

tissue and systolic blood pressure (SBP) when compared to the OSD group. The

OHFSD group had a higher systolic arterial pressure than in the OHFD group. These

animals didnt show any difference in the total cholesterol, triglycerides and glucose

serum levels, but showed reduction of glucose tolerance compared to the control

group. The OHFD rats presented elevated insulin serum levels, HOMA-IR index,

proteinuria and reduced and fractional excretion of sodium (FENa+) compared to the

control. However, the proteinuria and FENa+ were higher in the OHFSD group. There

were not significant differences in plasma creatinine and glomerular filtration rate

between the groups. The OHFD group showed slight alterations in tubulointerstitial

compartment of the renal cortex, characterized by interstitial inflammatory infiltrates,

interstitial fibrosis, dilation and atrophy tubular. These changes were not observed in

OHFSD group. The number of macrophages/monocytes was increased in the renal

cortex of OHFD and OHFSD rats than in the OSD rats. Our results demonstrate that

high-fat plus high salt diet in ovariectomized rats may contribute to the increases in

systolic blood pressure and visceral adipose tissue, reduced glucose tolerance,

proteinuria and macrophage/monocytes infiltration in the renal cortex of these

animals.

Keywords: High fat diet; Sodium chloride in the diet; Ovariectomy; Obesity.

LISTA DE ABREVIATURAS

AII Angiotensina II

CTI Compartimento tbulo-intersticial

Dahl S Ratos sensveis ao sal

DCO Ratas submetidas dieta controle e ovariectomia

DLO Ratas submetidas dieta hiperlipdica e ovariectomia

DLSO Ratas submetidas dieta hiperlipdica e hipersdica e ovariectomia

ECA Enzima conversora da angiotensina

ELISA Enzime Linked Immunosorbent Assay

eNOS xido ntrico sintetase endotelial

ERO Espcies reativas de oxignio

ER- receptor de estrgeno alfa

FENa+ Frao de excreo de sdio

HOMA-IR Homeostatic model assessment

IL-6 Interleucina 6

LDL Lipoprotena de baixa densidade

LPL Lipoprotena lpase

LTI Leso tbulo-intersticial

MCP-1 protena quimiottica de moncitos

NF-B Fator de transcrio nuclear kappa B

NO xido ntrico

PA Presso arterial

PPAR Receptor ativado por proliferadores de peroxissoma Gama

PAS Presso arterial sistlica

PCR Protena C reativa

RIA Radioimunoensaio

RNAm cido ribonuclico mensageiro

SNS Sistema nervoso simptico

SRAA Sistema renina angiotensina aldosterona

TAM Tecido adiposo mesentrico

TAP Tecido adiposo peritoneal

TAR Tecido adiposo retroperitoneal

TAV Tecido adiposo visceral

TFG Taxa de filtrao glomerular

TGF- Transforming growth factor-

TNF- Fator de necrose tumoral alfa

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Ganho de peso corporal de ratas ovariectomizadas submetidas dieta

controle (DCO), ratas ovariectomizadas submetidas dieta hiperlipdica (DLO) e de

ratas ovariectomizadas submetidas dieta hiperlipdica e hipersdica (DLSO), 24

semanas aps o tratamento diettico. Dados so expressos como mdiaEPM.

*p

Figura 6. Concentrao srica de insulina de ratas ovariectomizadas submetidas

dieta controle (DCO), ratas ovariectomizadas submetidas dieta hiperlipdica (DLO)

e de ratas ovariectomizadas submetidas dieta hiperlipdica e hipersdica (DLSO),

24 semanas aps o tratamento diettico. Dados so expressos como mdiaEPM.

***p

dieta hiperlipdica e hipersdica (DLSO), 24 semanas aps o tratamento diettico.

Dados so expressos como mdiaEPM. *** p0,05 versus DCO...............................63

Figura 13. rea do tufo glomerular de glomrulos justamedulares de ratas

ovariectomizadas submetidas dieta controle (DCO), de ratas ovariectomizadas

submetida dieta hiperlipdica (DLO) e de ratas ovariectomizadas submetidas

dieta hiperlipdica e hipersdica (DLSO), 24 semanas aps o tratamento diettico.

Dados so expressos como mdiaEPM...................................................................63

Figura 14. Imunolocalizao de clulas ED-1 positivas (macrofgos/moncitos) no

CTI no crtex renal de ratas ovariectomizadas submetidas dieta controle (DCO)

(A), ratas ovariectomizadas submetidas dieta hiperlipdica (DLO) (B) e de ratas

ovariectomizadas submetidas dieta hiperlipdica e hipersdica (DLSO) (C), 24

semanas aps o tratamento diettico (40x)...............................................................64

Figura 15. Quantificao do nmero de clulas ED-1-positivas no CTI no crtex

renal de ratas ovariectomizadas submetidas dieta controle (DCO), ratas

ovariectomizadas submetidas dieta hiperlipdica (DLO) e de ratas

ovariectomizadas submetidas dieta hiperlipdica e hipersdica (DLSO), 24

semanas aps o tratamento diettico. Dados so expressos como mdiaEPM.

*p

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Propores dos ingredientes nas dietas experimentais controle (DC) e

hiperlipdica (DL) e hiperlipdica e hipersdica (DLS)................................................40

Tabela 2 Composio bromatolgica das dietas experimentais controle (DC) e

hiperlipdicas (DL) e hiperlipdica e hipersdica (DLS)...............................................41

Tabela 3 Contribuio das fraes de protenas, carboidratos e gorduras no total

da energia metabolizvel nas dietas experimentais e hiperlipdica e hipersdica

(DLS)..........................................................................................................................42

Tabela 4 Contribuio das fraes de amido de milho, farelo de soja, casena,

sacarose e maltodextrina na composio dos carboidratos totais nas dietas

experimentais e hiperlipdica e hipersdica (DLS).....................................................42

Tabela 5 ndice uterino dos grupos DCO, DLO e DLSO, aps 24 semanas de dieta..........................................................................................................................51

Tabela 6 P Peso corporal (g), pesos dos tecidos adiposos (mg/pc) e ingesto

alimentar (g/dia) e calrica (Kcal/dia) dos grupos DCO, DLO e DLSO, aps 24

semanas de dieta.....................................................................................................54

Tabela 7 Presso arterial sistlica, presso diastlica e presso mdia (mmHg) e

frequncia cardaca (bpm) dos grupos DCO, DLO e DLSO, aps 24 semanas de

dieta.........................................................................................................................55

Tabela 8 Parmetros bioqumicos dos grupos experimentais DCO, DLO e DLSO,

aps 24 semanas de dieta.......................................................................................56

Tabela 9 ndice de resistncia a insulina (HOMA-IR) dos grupos experimentais

DCO, DLO e DLSO, aps 24 semanas de dieta......................................................58

Tabela 10 Parmetros de funo renal dos grupos experimentais DCO, DLO e

DLSO, aps 24 semanas de dieta...........................................................................59

Tabela 11 Anlise histolgica, morfomtrica e imunoistoqumica de ratas DCO,

DLO e DLSO, aps 24 semanas de dieta................................................................65

SUMRIO

1 INTRODUO................................................................................................20

2 REVISO DE LITERATURA..........................................................................23

2.1 Obesidade e Injria Renal...............................................................................23

2.2 Obesidade, sal e hipertenso.........................................................................28

2.3 Sal, Hipertenso e Leso Renal.....................................................................30

2.4 Estrgenos, obesidade, sensibilidade ao sal e injria renal...........................32

3 OBJETIVOS....................................................................................................37

3.1 Objetivo Geral..................................................................................................37

3.2 Objetivos Especficos......................................................................................37

4 HIPTESES....................................................................................................38

5 MATERIAL E MTODOS................................................................................39

5.1 Animais............................................................................................................39

5.2 Procedimentos Experimentais.........................................................................39

5.3 Dietas ..............................................................................................................40

5.4 Procedimento cirrgico....................................................................................42

5.5 Determinao da Presso Arterial e do Peso Corporal...................................43

5.6 Avaliao da ingesto alimentar e calrica.....................................................43

5.7 Anlise do perfil bioqumico ............................................................................43

5.7.1 Dosagem de colesterol total............................................................................43

5.7.2 Dosagem de triglicerdeos..............................................................................44

5.7.3 Glicemia srica................................................................................................44

5.8 Teste de Tolerncia a glicose..........................................................................45

5.9 Dosagem de insulina srica (RIA)...................................................................45

5.10 Homeostatic model assessment of insulin resistance (HOMA-IR)..............45

5.11 Anlise da Funo Renal.................................................................................46

5.11.1 Quantificao de creatinina nas amostras de sangue e de urina....................46

5.11.2 Quantificao de Na+ e K+ nas amostras de sangue e de urina......................47

5.11.3 Quantificao da protena urinria...................................................................47

5.12 Anlise Histolgica Renal ..............................................................................48

5.12.1 Leses Tbulo-intersticiais..............................................................................48

5.13 Anlise Morfomtrica Glomerular ....................................................................48

5.14 Anlise Imunoistoqumica para macrfagos/moncitos..................................49

5.15 Dosagem de TNF srico/ENZIMAIMUNOENSAIO- ELISA...........................49

5.16 Anlise Estatstica...........................................................................................50

6 RESULTADOS................................................................................................51

6.1 ndice uterino...................................................................................................51

6.2 Ganho de peso e peso do tecido adiposo visceral..........................................51

6.3 Ingesto alimentar e calrica..........................................................................53

6.4 Presso Arterial e Frequncia Cardaca .........................................................54

6.5 Parmetros Bioqumicos.................................................................................55

6.6 Teste de tolerncia a glicose...........................................................................56

6.7 Insulina Srica/HOMA-IR................................................................................57

6.8 Parmetros de Funo Renal.........................................................................58

6.9 Anlise Histolgica e Morfomtrica do Rim....................................................61

6.10 Imunomarcao para macrfagos/moncitos................................................63

6.11 Dosagem srica de TNF-.............................................................................65

7 DISCUSSO..................................................................................................66

7.1 Limitaes......................................................................................................79

8 CONCLUSO................................................................................................80

REFERNCIAS........................................................................................................81

20

1. INTRODUO

Os estudos epidemiolgicos tm documentado um rpido crescimento na incidncia

de obesidade sendo a mesma considerada uma doena epidmica que atinge mais

de 400 milhes de pessoas globalmente. Igualmente, a incidncia de complicaes

associadas obesidade tambm tem crescido nas ltimas dcadas (YEPURU et al.,

2010; KOTSIS et al., 2010; HURT et al., 2010). A obesidade envolve vrios

distrbios no metabolismo energtico, como dislipidemia, resistncia a insulina,

aumento de citocinas pr-inflamatrias, caracterizando um estado de sndrome

metablica que aumenta o risco para o desenvolvimento de hipertenso arterial

(STEPPAN, LAZAR, 2004; OROURKE, 2009). Alm disso, estudos evidenciam que

a obesidade pode contribuir para o aumento da presso sangunea em resposta ao

excesso de sal, caracterizando elevada sensibilidade da presso arterial ao sal na

hipertenso induzida pela obesidade (NAGAE et al., 2009; SARTORI-VALINOTTI et

al., 2009). De fato, a hipertenso sensvel ao sal representa aproximadamente 50%

dos adultos hipertensos e est associada a fatores metablicos, hemodinmicos e

renais que podem aumentar os riscos de morbidades cardiovasculares e renais

(CAMPESE, 1994; CHAMARTHI et al., 2010).

A maior parte das complicaes atribudas obesidade est relacionada aos riscos

cardiovasculares associados secreo de citocinas derivadas do tecido adiposo,

vias neurohumorais e fatores metablicos capazes de provocar maior acometimento

sobre a microvasculatura e sobre os rgos-alvo (SOWERS, 1998; SHI, CLEGG,

2009; BROWN, CLEGG, 2010; KOTSIS et al, 2010). A obesidade constitui, ento,

um importante indicador de risco metablico e cardiovascular, estando

frequentemente associada sndrome metablica (SOWERS, 2003). Contudo, seus

efeitos sobre os rins tm sido menos documentados (HALL et al., 2002; DO CARMO

et al., 2009).

Os mecanismos pelos quais a obesidade promove leses renais no esto

completamente elucidados. As alteraes hemodinmicas, metablicas e

inflamatrias presentes na obesidade parecem desempenhar funo importante na

induo e progresso de leses renais (DO CARMO et al., 2009). O acmulo de

21

tecido adiposo, particularmente a adiposidade visceral, est associado a alteraes

da funo renal caracterizadas pelo aumento da reabsoro de sdio, promovendo

expanso de volume e elevao da presso sangunea durante o ganho excessivo

de peso. Por outro lado, a hipertenso e as anormalidades metablicas associadas

com a obesidade, podem contribuir para o desenvolvimento de doenas renais

(HALL et al., 2003). A reteno de sdio e o fluido extracelular esto aumentados na

obesidade induzida pela dieta em modelos experimentais e em humanos obesos

(HALL et al., 1997). Experimentos com animais obesos demonstram tambm

alteraes da estrutura renal, incluindo expanso da cpsula de Bowman,

proliferao celular no glomrulo e espessamento da membrana basal glomerular e

tubular. Esses achados foram associados a maior expresso glomerular do

Transforming Growth Factor- (TGF-) (HENEGAR et al., 2001). Em pacientes

obesos foi observado glomerulopatia relacionada a obesidade, incluindo

glomeruloesclerose segmental focal, glomerulomegalia e hiperplasia mesangial

(PAPAFRAGKAKI, TOLIS, 2005). O acmulo de lipdeos no glomrulo e na cpsula

de Bowman tambm so alteraes histolgicas associadas ao alto consumo de

gordura (DEJI et al., 2009; HALL et al., 2010).

A dieta hipersdica pode contribuir para o desenvolvimento da hipertenso, no

entanto, os mecanismos envolvidos ainda no esto totalmente esclarecidos. As

alteraes no volume sanguneo, na secreo de renina e aldosterona, nos nveis

plasmticos de angiotensina II (AII) e xido ntrico, a hiperatividade do sistema

nervoso simptico (SNS) e o estado redox parecem estar envolvidos nesse

processo. Alm disso, estudos sugerem que a resistncia a insulina com

hiperinsulinemia desempenhe funo importante na elevao da presso arterial

induzida pela dieta hipersdica (MUNTZEL, DRUEKE, 1992; VASDEV et al., 2007).

A hipertenso induzida pelo excesso de sal durante perodo prolongado est

associada com aumento da injria renal e mudanas importantes na expresso de

citocinas renais relacionadas com a resposta pr-inflamatria, deposio de matriz

extracelular no tecido renal e disfuno endotelial (GU et al., 2006;

DRENJANEVI-PERI et al., 2011).

A reduo dos hormnios ovarianos, no perodo da ps-menopausa ou em ratas

ovariectomizadas, est frequentemente associada a alteraes do perfil

22

hemodinmico e da funo endotelial, distrbios no metabolismo energtico, estado

redox, obesidade, dislipidemias e alteraes renais (WISE et al., 1999). A

menopausa pode ser acompanhada tambm por aumento na sensibilidade ao sal

(FUJITA, 2007). As mulheres na ps-menopausa apresentam maior risco de

desenvolver hipertenso sensvel ao sal, sugerindo que os hormnios sexuais

influenciam no balano de sdio e na regulao da presso sangunea. (HINOJOSA-

LABORDE et al., 2004; SARTORI-VALINOTTI et al., 2009). Os estrgenos modulam

a atividade e expresso do NO e AII, e a sua deficincia produz alteraes desses

dois fatores, resultando em disfunes no balano de sdio renal, estado redox e

hipertenso (HERNANDEZ, RAIJ, 2006; MAJID, KOPKAN, 2007). No modelo

experimental de ratas Dahl S-sensveis ao sal foi constatada hipertenso aps a

ovariectomia, indicando que os estrgenos podem promover proteo contra o

desenvolvimento de hipertenso (HINOJOSA-LABORDE et al., 2004).

Algumas formas de hipertenso, incluindo a hipertenso associada obesidade so

influenciadas pelo aumento da ingesto diria de sdio. Modelos experimentais de

obesidade e hipertenso sensvel ao sal tm sido desenvolvidos, contudo esses

modelos muitas vezes no representam as alteraes observadas em humanos,

pois utilizam animais geneticamente modificados como ratos Dahl S, DOCA-salt ou

ratos espontaneamente hipertensos (SHR). Alm disso, existem poucos estudos

analisando os efeitos de dietas ricas em gorduras e/ou sal sobre os rins,

principalmente em situao de diminuio dos hormnios ovarianos. Diante disso,

dentre os objetivos do nosso estudo destaca-se o desenvolvimento de um modelo

experimental de obesidade e hipertenso induzido por dieta hiperlipdica e

hipersdica, que possa ser utilizado para o estudo das alteraes hemodinmicas,

metablicas e dos parmetros de funo e estrutura renal em ratas

ovariectomizadas, mimetizando as alteraes encontradas em humanos.

23

2. REFERENCIAL TERICO

2.1 Obesidade e Injria Renal

A obesidade pode ser definida como uma condio caracterizada pelo acmulo

excessivo de gordura corporal, sendo consequncia de balano energtico positivo e

que acarreta repercusses sade (EKNOYAN, 2011). Existem evidncias de que

fatores genticos e ambientais esto relacionados ao desenvolvimento de

obesidade, porm, estudos tm demonstrado que os fatores ambientais como

alimentao hipercalrica e sedentarismo so os principais responsveis pelo

acmulo de tecido adiposo e ganho de peso (HURT et al., 2010; ANUBHUTI,

ARORA, 2008)

Vrias complicaes esto relacionadas a obesidade, incluindo doenas

cardiovasculares, por acometimento da microvasculatura e de rgos-alvo, e

distrbios metablicos (SOWERS, 1998; SHI, CLEGG, 2009; BROWN, CLEGG,

2010). Alm disso, a obesidade frequentemente acompanhada por inflamao

sistmica com elevadas concentraes plasmticas de marcadores inflamatrios

como interleucina 6 (IL-6), fator de necrose tumoral (TNF ) e protena C reativa

(PCR), citocinas associadas com risco aumentado para o desenvolvimento de

resistncia a insulina, diabetes mellitus tipo 2, hipertenso e dislipidemia (TILG,

MOSCHEN,2006; POU et al., 2007).

Embora a obesidade seja largamente reconhecida como um fator que contribui para

essa srie de alteraes fisiopatolgicas, sua funo na iniciao e progresso da

doena renal menos documentada (HALL et al., 2002; ABRASS, 2004; DO

CARMO et al., 2009). Atualmente, estudos experimentais e epidemiolgicos tm

demonstrado a relao entre obesidade e injria renal. A incidncia de doena renal

crnica aumenta paralelamente ao aumento da prevalncia da obesidade. Isso

porque a obesidade acarreta uma sobrecarga metablica e d incio a uma srie de

eventos, incluindo hipertenso arterial e diabetes mellitus, que so as principais

24

causas da doena renal crnica. Alm disso, a obesidade se apresenta como um

fator de risco independente para o desenvolvimento de injria renal, uma questo

pouco abordada. Os mecanismos fisiopatolgicos relacionados no so

completamente compreendidos, mas envolvem alteraes hemodinmicas,

metablicas e inflamatrias, como resistncia a insulina, hiperinsulinemia,

hiperleptinemia, ativao do SRAA e ainda alteraes no metabolismo lipdico, que

contribuem para o de leso renal (GUEDES, 2010; TESAURO et al., 2011).

- Mecanismos hemodinmicos

Com aumento das necessidades metablicas ocasionado pela obesidade, h

elevao do fluxo sanguneo para os tecidos, do dbito cardaco e da presso

arterial. Assim, o fluxo sanguneo renal, em menor extenso, e a taxa de filtrao

glomerular encontram-se elevados na obesidade (HALL et al., 2003). A hiperfiltrao

resulta em hipertrofia glomerular acompanhada por expanso mesangial e

albuminria. Estas alteraes foram observadas por Deji et al., (2009) em estudo

realizado com camundongos C57BL/6 submetidos a dieta hiperlipdica por um

perodo de 12 semanas, foi observado tambm acmulo de lipdios e de colgeno

tipo IV no tecido renal, alm de infiltrado inflamatrio. A restrio de gordura com

controle de peso foi eficaz em prevenir as alteraes renais.

Outros experimentos com animais obesos demonstram tambm expanso da

cpsula de Bowman, proliferao celular no glomrulo, espessamento da membrana

basal glomerular e tubular. Esses achados foram associados a maior expresso do

TGF- glomerular (HENEGAR et al., 2001). E ainda, estudos avaliando a estrutura

renal de pacientes obesos observaram glomerulopatia relacionada a obesidade,

incluindo glomeruloesclerose segmental focal, glomerulomegalia e hiperplasia

mesangial (PAPAFRAGKAKI, TOLIS, 2005). Desta forma, possvel que alteraes

hemodinmicas decorrentes da obesidade se correlacionem com iniciao e

evoluo da leso renal.

A hiperfiltrao glomerular associada elevao da frao de filtrao na obesidade

um importante fator contribuinte para a reteno de sdio o que, por sua vez,

contribui para elevao do volume do fluido extracelular e da presso arterial

(CHAGNAC et al., 2008). A hiperatividade simptica renal e os nveis elevados de

25

AII, caractersticos da obesidade, tambm esto relacionados ao aumento da

reabsoro de sdio no tbulo proximal (WAHBA, MAK, 2007). Combinada com a

hipertenso, a hiperfiltrao contribui potencialmente para o desenvolvimento de

injria renal (MARIC, HALL, 2011).

- Mecanismos metablicos

Alm das alteraes hemodinmicas, a fisiopatologia da obesidade envolve

alteraes metablicas que contribuem para o desenvolvimento e evoluo da

doena renal. As principais alteraes metablicas associadas ao dano renal

incluem a resistncia a insulina, hiperinsulinemia, hiperleptinemia, dislipidemias e

secreo e atividade aumentada de componentes do SRAA pelos adipcitos

(MADDOX et al., 2002; PAPAFRAGKAKI, TOLIS, 2005; WAHBA, MAK, 2007).

A sensibilidade reduzida a insulina constitui a alterao central na sndrome

metablica e a mais importante ligao entre obesidade e injria renal, pois a

hiperinsulinemia est associada com glomerulopatia renal por meio de mecanismos

indiretos e diretos. Em estudo com ratos Zucker obesos foi observado correlao

positiva entre hiperinsulinemia e elevao da presso arterial, possivelmente por

seus efeitos sobre o SNS, SRAA e reteno de sdio (MADDOX et al., 2002;

CHAGNAC, et al., 2000). Este aumento na presso arterial estaria envolvido com

injria renal a medida que maior presso sangunea sistmica gera maior presso

hidrulica a que os capilares glomerulares so expostos, submetendo o a

vasculatura glomerular a maior estresse (WAHBA, MAK, 2007).

Alm disso, aos efeitos pressricos, a hiperinsulinemia em ratos obesos tambm

possui aes diretas associadas injria glomerular, incluindo hipertrofia e

hiperplasia mesangial e aumento da produo celular dos componentes da matriz

mesangial (ABRASS et al., 1995). Alm disso, a insulina pode contribuir para a leso

renal potencializando a resposta vascular e das clulas mesangiais AII e

aldosterona, aumentando a presso arterial sistmica e a presso intraglomerular e

exacerbando a proteinria. A insulina tambm aumenta o estado redox intrarrenal

que aumenta a expresso de citocinas inflamatrias e fatores de crescimento

acelerando o processo aterosclertico no rim (BIDDINGER, KAHN, 2006; WAHBA,

MAK, 2007; SAVINO et al., 2010).

26

A hiperleptinemia relacionada obesidade tambm parece afetar a funo e

estrutura renal. Este hormnio, como a insulina, possui mecanismos de leso renal

indiretos e diretos. A ativao do SNS e reteno de sdio com resultante elevao

da presso arterial constituem em um mecanismo indireto pelo qual a

hiperleptinemia contribui para injria renal (PAPAFRAGKAKI, TOLIS, 2005). Os

mecanismos diretos so aqueles que no esto necessariamente ligados a

hipertenso. O tecido adiposo produz e secreta todos os componentes do SRAA, a

expresso de angiotensinognio no tecido adiposo visceral se aproxima da

expresso heptica, classicamente considerada a principal fonte de

angiotensinognio (GUERRE-MILLO, 2004; HUNLEY et al., 2010). Na obesidade a

hiperleptinemia, hiperinsulinemia, estimulao simptica e o nmero aumentado de

adipcitos so os mecanismos responsveis pela hiperatividade do SRAA

(BIDDINGER, KAHN, 2006; STIEFEL et al., 2011). Assim, o aumento nos nveis

circulantes de AII e a expresso renal de receptores do tipo 1 para AII promove uma

potente combinao para elevar a vasoconstrio arteriolar eferente, presso

glomerular e frao de filtrao, bem como a proliferao celular mesangial que

culmina em dano renal (MATSUSAKA et al., 1996).

As alteraes no metabolismo lipdico decorrentes da obesidade tambm podem

contribuir diretamente para o dano renal. Sob condies de alteraes da glicemia e

do metabolismo lipdico ocorre desequilbrio entre a lipognese e liplise no rim e em

outros tecidos, essas alteraes contribuem para o acmulo de lipdios no tecido

renal e lipotoxicidade, fatores associados injria renal (REDDY, RAO, 2006; KUME

et al., 2007). Estudos realizados com ratos obesos Zucker observaram que a

elevao nos nveis sricos de lipdios contribuiu para injria glomerular,

possivelmente relacionada a elevaes nas lipoprotenas de baixa densidade (LDL).

Isso se deve ao fato de que clulas mesangiais possuem receptores para LDL, em

nveis elevados o LDL aumenta a produo mesangial de molculas quimioatraentes

de moncitos, promovendo infiltrao de clulas inflamatrias no interstcio renal

(ROVIN, TAN, 1993). Hipercolesterolemia tambm estimula a produo de fatores

que atraem os macrfagos pelas clulas mesangiais bem como aumenta a

expresso de RNAm para TGF- nestas clulas (MADDOX et al., 2002). Alm disso,

estudos in vitro com clulas mesangiais humanas expostas a LDL, LDL oxidado e

LDL glicado em concentraes prximas aquelas encontradas na circulao

27

aumentam significativamente a sntese mesangial de componentes da matriz como

fibronectina e laminina (SANTINI et al., 2008).

- Mecanismos inflamatrios

A obesidade e hipertenso so caracterizadas pela presena de infiltrado intersticial

de macrfagos e moncitos e produo anormal de citocinas pr-inflamatrias no

tecido renal (OHTOMO et al., 2010; RODRGUEZ-ITURBE et al., 2004). Os

macrfagos so clulas potencialmente capazes de produzir vrios produtos

citotxicos, incluindo espcies reativas de oxignio (ERO) e de nitrognio,

quimiocinas, citocinas e AII que podem promover ou intensificar a leso tecidual

(RODRGUEZ-ITURBE et al., 2004; NAVA et al., 2003). As citocinas, por sua vez,

podem atuar induzindo proliferao celular e modificao de seus fentipos,

contribuindo para as alteraes da estrutura e funo renal (OHTOMO et al., 2010).

Alm disso, a prpria leso das clulas tubulares pode resultar em liberao de

quimiocinas e citocinas, recrutamento de macrfagos e consequente estimulao

dos fibroblastos, os quais podem iniciar e influenciar o curso da inflamao e da

fibrose intersticial (RIYUZO, 2002).

A presena de linfcitos no tecido renal parece estar relacionada tambm com a

modulao da resposta inflamatria e pode atuar intensificando a leso tecidual. Os

linfcitos T so capazes de sintetizar TGF-, citocina classicamente conhecida por

estimular a produo de colgeno pelos fibroblastos e inibir a produo de enzimas

responsveis pela degradao da matriz extracelular (PETERS et al., 2004;

STRUTZ, NEILSON, 1994). Foi tambm demonstrado que a infiltrao tbulo-

intersticial de linfcitos e macrfagos est associada com a gerao de ERO e AII

em alguns modelos experimentais de leso renal (RANGAN et al., 1999; NAVA et

al., 2003; SOARES et al., 2006). A utilizao de agentes anti-inflamatrios e

antioxidantes reduz o infiltrado inflamatrio e promove a melhora ou preveno da

hipertenso (MULLER et al., 2000; TIAN et al., 2005).

Estudos com modelos experimentais evidenciaram que a inflamao renal participa

da patognese da hipertenso devido reteno de sdio causada pelo acmulo de

clulas produtoras de AII no tecido renal (RODRGUEZ-ITURBE et al., 2002a). Tanto

a enzima conversora da angiotensina, quanto a prpria AII, so expressas por

28

linfcitos T e macrfagos nos tecidos renais em modelos experimentais de

hipertenso, e o acmulo dessas clulas parece ser a razo primria para a

reteno de sdio (COSTEROUSSE et al., 1993; RODRGUEZ-ITURBE et al.,

2002). O aumento da produo de AII renal promove diminuio da taxa de filtrao

glomerular (TFG), com consequente reduo da carga de filtrada de sdio; aumento

da reabsoro tubular de sdio; impedimento da natriurese pressrica; sinalizao

em cascata de fatores de transcrio inflamatrios e produo de superxido

mediada pela estimulao da NAD(P)H oxidase (RODRGUEZ-ITURBE et al., 2004).

2.2 Obesidade, sal e hipertenso

A obesidade um fator de risco que pode acentuar a resposta da presso arterial ao

sal. Em um estudo realizado com 60 adolescentes obesos e 18 no obesos foi

verificado a presena de sensibilidade ao sal induzida pela obesidade. Estes

adolescentes foram submetidos a uma semana de dieta hipersdica seguida de uma

semana com dieta hipossdica. Os adolescentes obesos que deixaram de receber

dieta hipersdica e passaram a consumir a dieta hipossdica apresentaram queda

significativa da presso arterial, enquanto que os adolescentes no-obesos no

apresentaram reduo da presso arterial aps reduo da carga de sal ingerida.

Este resultado sugere que a presso arterial de adolescentes obesos mais

dependente da ingesto de sdio que a presso arterial de adolescentes no-

obesos (ROCCHINI, 1990). Em outro estudo foi demonstrado que indivduos com

sndrome metablica apresentaram maior resposta depressora diante de uma dieta

hipossdica e uma maior resposta pressrica diante de dieta hipersdica comparada

aos indivduos do grupo controle sem sndrome metablica (CHEN, et al., 2009)

Os mecanismos subjacentes ao aumento da sensibilidade ao sal em indivduos

obesos com sndrome metablica ainda no esto completamente compreendidos,

mas parecem estar associados alterao da natriurese pressrica, comumente

observada na obesidade. A natriurese pressrica consiste no aumento ou diminuio

da excreo de sdio e gua devido elevao ou reduo da presso arterial,

respectivamente, agindo como um componente chave do sistema de feedback para

29

estabilizar a presso arterial e o volume do fluido corporal (KARPPANEN,

MERVAALA, 2006). Durante a obesidade, antes da perda de nfrons por injria

glomerular, ocorre primariamente aumento na reabsoro de sdio, esta mudana ,

ento, compensada com vasodilatao que provoca elevao da filtrao glomerular

aumentando a quantidade de gua e eletrlitos filtrados, porm essa compensao

no completa e o resultado final reteno de sdio e gua, com expanso de

volume e consequente hipertenso (KOTSIS et al., 2010).

As alteraes na natriurese pressrica induzidas pela obesidade podem ocorrer

devido s modificaes nas foras intrarrenais decorrentes de mudanas

histolgicas na medula renal que podem comprimir a ala de Henle e os vasos retos,

lentificando o fluxo tubular e aumentando a reabsoro de sdio (HALL, 1997). Outro

fator que pode alterar a natriurese pressrica e assim, aumentar a sensibilidade da

presso arterial ao sal, a ativao do SRAA que diretamente proporcional a

adiposidade (KOTSIS et al., 2010). Estudos demonstram que humanos obesos

apresentam aumento na atividade da renina plasmtica, nos nveis plasmticos de

angiotensinognio, AII e aldosterona (RUANO et al., 2005; HUNLEY et al., 2010;

STIEFEL et al., 2011). Ainda, em estudo experimental realizado por Deji et al.,

(2009), foi demonstrado que camundongos submetidos a dieta hiperlipdica

apresentaram retardo na excreo urinria de sdio e elevao da presso arterial

sistlica quando receberam sobrecarga aguda de sal. A expresso renal de RNAm

para renina, ECA e angiotensinognio deste animais estava aumentada quando

comparado com os animais com dieta hipolipdica, sugerindo que a ativao do

SRAA constitui um dos mecanismos de leso renal e hipertenso sensvel ao sal

induzidos pela obesidade.

A sensibilidade ao sal, observada em sujeitos obesos, est tambm correlacionada a

hiperinsulinemia resultante da resistncia a insulina, j que hiperinsulinemia

responsvel, pelo menos em parte, pela reteno de sdio (DOBRIAN et al., 2003).

A hiperinsulinemia crnica pode promover reteno de sdio devido ao estmulo

direto a reabsoro de sdio no tbulo proximal (FUJITA, 2008); e indiretamente

pelo aumento da responsividade adrenal a AII aumentando a secreo de

aldosterona; aumento da atividade simptica (NAGAE et al., 2009a), e portanto,

pode aumentar indiretamente a reteno de sdio (ROCCHINI, 1990).

30

2.3 Sal, Hipertenso e Leso Renal

O alto consumo de sal parece ser um dos principais fatores contribuintes para o

desenvolvimento de doenas cardiovasculares. Um estudo realizado em indivduos

de 32 pases constatou que o consumo mdio de sal de 9,9 g/dia (INTERSALT

COOPERATIVE RESEARCH GROUP, 1988), quando a ingesto diria de sdio

recomendada pela Organizao Mundial de Sade 5g/dia ou menos (HE,

MACGREGOR, 2003).

O excesso de sal na dieta relativamente recente em termos de evoluo, j que h

alguns milhes de anos atrs a quantidade ingerida era menor que 1g/dia. A adio

de sal na comida s passou a acontecer h 5.000 10.000 anos atrs com o incio

da agricultura (PIERRE et al., 2005). Antes da refrigerao, o sal era o mecanismo

mais utilizado para a conservao do alimento (MOHAN, CAMPBELL, 2009). Na

atualidade, a maior parte do sal consumido diariamente est presente nos alimentos

industrializados (HE, MACGREGOR, 2003).

A primeira associao entre a ingesto de sal e o desenvolvimento de hipertenso

foi constatada pelo pesquisador Louis Dahl em 1960. Os estudos demonstraram

relao linear entre a prevalncia de hipertenso e a mdia do consumo de sal em

cinco populaes. Desde ento, diversos experimentos com animais, estudos

epidemiolgicos e triagens clnicas tm expandido as observaes feitas por Dahl,

evidenciando os efeitos da dieta hipersdica sobre o sistema cardiovascular e

tambm sobre sistema renal (BROWN et al., 2009). Nas populaes onde o

consumo de sal excede 3g/dia, a proporo de indivduos com hipertenso aumenta

com a idade, sendo este fenmeno ainda mais pronunciado quanto maior for a

ingesto de sal (PIERRE et al., 2005). Em contrapartida, estudos com populaes

que consomem baixas quantidades de sal na dieta tm encontrado baixos nveis de

presso arterial (INTERSALT COOPERATIVE RESEARCH GROUP, 1988).

O balano do sdio e, consequentemente, da gua realizado pelos rins que

equilibram o consumo com a excreo deste ction. Uma dieta hipersdica pode

gerar acmulo de sdio no lquido extracelular, com reteno de gua e expanso

do volume sanguneo. O aumento da volemia, por sua vez, est associado

31

elevao da presso arterial que pode ser ainda mais evidente quando associada a

habilidade limitada dos rins de excretar completamente o excesso de sdio

consumido (MOHAN, CAMPBELL, 2009). Apesar de estudos demonstrarem que a

dieta hipersdica pode promover elevao da presso arterial, a intensidade com a

qual esta elevao ocorre diante da sobrecarga de sal varivel, correspondendo a

sensibilidade da presso arterial ao excesso de sal. Indivduos com presso arterial

sensveis ao sal respondem a sobrecarga aguda ou crnica de sal com aumento

exacerbado da presso arterial, enquanto em indivduos normais, a presso arterial

apresenta pouco ou nenhum aumento com incremento de sal na dieta

(DRENJANEVI-PERI et al., 2006; KOPKAN, ERVENKA, 2009).

Aproximadamente metade da populao com hipertenso essencial possui presso

arterial sensvel ao sal. Os mecanismos fisiopatolgicos que levam a sensibilidade

ao sal so complexos e apenas parcialmente entendidos. Alguns estudos tm

focado na ao patognica dos rins, j que respostas alteradas da hemodinmica

renal sobrecarga de sal na dieta e tambm manipulao anormal do sdio nos

segmentos tubulares tm sido sugeridos como os fatores causais da variao da

resposta da presso sangunea ao sal (CHAMARTHI et al., 2010).

Alm disso, grande nmero de estudos investiga a associao de dieta hipersdica

e presso arterial elevada. Os mecanismos pelos quais o aumento do sal na dieta

leva ao desenvolvimento de hipertenso dependente de sal no esto

completamente esclarecidos. Alm disso, a expanso de volume, altas

concentraes de sdio podem tambm ter outras aes hipertensivas como

alterao do funcionamento e regulao do SRAA, ativao de NF-B nas clulas

tubulares proximais desencadeando processo inflamatrio no tecido renal, induo

de estado redox alterando a biodisponibilidade do xido ntrico, hipertrofia de clulas

musculares lisas e ativao do sistema nervoso simptico (GU et al., 1998; GU et al.,

2006; DRENJANEVI-PERI et al., 2006; KOPKAN, ERVENKA, 2009).

Em estudo realizado por Gu et al., (2008), utilizando ratos Sprague-Dawley

normotensos submetidos a dieta hipersdica (8% de cloreto de sdio) por 8

semanas, foi verificado aumento significativo da presso arterial, excreo urinria

de albumina e inflamao renal. Neste caso, ratos normotensos desenvolveram

hipertenso arterial mais lentamente quando expostos a dieta hipersdica, havendo

32

elevao da presso arterial paralela a aumento ao estado redox e o dano renal.

Observaes experimentais demonstram que a dieta hipersdica, a longo prazo,

causa hipertenso e leso renal com alterao na expresso de citocinas

inflamatrias no tecido renal de ratos Sprague-Dawley, alm disso a sobrecarga de

sal tambm parece estimular a formao de matriz e disfuno endotelial (GU et al.,

2009). O tratamento com o antiinflamatrio micofenolato mofetil promoveu reduo

de NF-B renal, da infiltrao de macrfagos/moncitos e linfcitos e da albuminria,

melhorando assim, a funo e estrutura renal e reduzindo a presso arterial em

ratos Dahl S alimentados com dieta contendo 8% ou 4% de sal. Os efeitos benficos

da terapia com antiinflamatrio demonstram que o aumento da presso arterial e do

dano renal esto relacionadas a infiltrao de clulas inflamatrias no tecido renal

induzida pela dieta (TIAN et al., 2007a, DE MIGUEL et al., 2010).

A inflamao renal parece estar associada com os nveis elevados de AII intrarrenal,

j que ratos Dahl S submetidos a dieta hipersdica apresentam reduo de TNF e

MCP-1 no crtex renal quando tratados com candesartan, bloqueador do receptor de

AII. Foi verificado tambm que esse bloqueio reduziu a infiltrao de macrfagos no

tecido renal, atenuando a inflamao e excreo urinria de protenas (LIN et al.,

2009). Por outro lado, a elevao de citocina e quimiocinas renais, com infiltrao de

clulas inflamatrias no interstcio renal, implica em aumento da AII renal, isso se

deve ao fato de macrfagos e linfcitos secretarem AII (FRANCO et al., 2006). Desta

forma, instala-se um ciclo vicioso que perpetua a inflamao e a elevao dos nveis

de AII, resultando em leso renal severa.

2.4 Estrgenos, obesidade, sensibilidade ao sal e injria renal

A reduo da produo de estrgenos em mulheres no perodo da ps-menopausa,

em modelos experimentais de ovariectomia ou de envelhecimento caracterizada

pelo aumento do peso corporal total e maior acmulo de gordura abdominal (MARIC

et al., 2008; SARTORI-VALINOTTI et al., 2009). A transio menopausal promove

mudanas desfavorveis da distribuio de gordura corporal, aumentando o risco de

33

desenvolvimento de doenas cardiovasculares e renais, diabetes mellitus e outras

alteraes associadas sndrome metablica (WISE et al., 1999; HALL et al., 2002).

As mulheres na pr-menopausa apresentam menor ndice de doenas

cardiovasculares que homens na mesma idade. Observa-se tambm que os homens

possuem maior risco para desenvolver doenas renais em comparao as mulheres.

Porm, essas diferenas relacionadas ao gnero parecem diminuir aps a

menopausa, quando o risco de doenas cardiovasculares, a prevalncia de

hipertenso e o declnio da funo renal se elevam nas mulheres (COGGINS et al,

1998; YANES et al., 2010). Mulheres pr-menopusicas submetidas a ovariectomia

tambm apresentam maior risco para doenas cardiovasculares, entretanto, a

terapia de reposio hormonal parece promover proteo cardiovascular para estas

mulheres (ESQUEDA et al., 2007). Adicionalmente, estudos observacionais

demonstram que mulheres ps-menopusicas que recebem terapia de reposio

hormonal apresentam menor ndice de doenas cardiovasculares e falncia cardaca

que aquelas que no fazem reposio (THE ESHRE CAPRI WORKSHOP GROUP,

2006; ROSANO et al., 2009).

A reduo dos nveis circulantes de estrgenos e as mudanas no perfil de risco

cardiovascular aps a menopausa em mulheres ou em animais experimentais

ocorrem paralelamente ao desenvolvimento de alteraes metablicas como

obesidade visceral, aumento da lipognese e resultante dislipidemia, hiperglicemia e

resistncia a insulina (FIGUEIREDO et al., 2010). Estudos clnicos com mulheres

menopusicas ou experimentais com animais submetidos a ovariectomia

demonstram que a reduo dos estrgenos seguida por maior ganho de peso e

acmulo de gordura, principalmente gordura visceral que est relacionado a eventos

cardiovasculares observados na transio da menopausa (SUTTON-TYRRELL et

al., 2010; BUTERA, 2010). Estudo experimental realizado por 20 semanas com

camundongos machos, fmeas intactas e ovariectomizadas, constatou que

camundongos machos apresentam maior suscetibilidade para a obesidade e maior

acmulo de tecido adiposo que fmeas quando expostos a dieta hipercalrica, ratas

ovariectomizadas apresentaram parmetros similares aos machos (HONG et al.,

2009).

34

A adiposidade central relacionada menopausa com reduo dos hormnios

ovarianos pode ser explicada pela ao dos estrgenos sobre a regulao do

metabolismo e da distribuio de gordura, com tendncia a deposio mais

perifrica (YEPURU et al., 2010). As aes dos estrgenos sobre o tecido adiposo

so mediadas principalmente pelo receptor de estrgeno (ER ), que so

altamente expressos nos adipcitos, e incluem modulao na produo e secreo

de adipocinas com elevao nos nveis de adiponectina, reduo da secreo

citocinas inflamatrias pelos adipcitos e elevao na expresso de receptor ativado

por proliferadores de peroxissoma gama (PPAR) (AKOUM et al., 2011). Os

estrgenos regulam ainda a ingesto alimentar e os nveis circulantes de lipdios,

alm de aumentar a liplise por meio da ativao de enzima lpase hormnio

sensvel (PALIN et al., 2003; BUTERA, 2010).

Alm da maior suscetibilidade para o desenvolvimento de obesidade, mulheres na

ps-menopausa tm se mostrado mais sensveis ao sal que mulheres na pr-

menopausa, sugerindo que os hormnios sexuais influenciam o balano de sdio e a

regulao da presso sangunea. (HINOJOSA-LABORDE et., 2004; SARTORI-

VALINOTTI et al., 2009). Parece haver uma relao inversamente proporcional entre

os nveis circulantes de hormnios ovarianos e a sensibilidade ao sal aps a

menopausa independente do envelhecimento que pode ser importante para o

desenvolvimento de hipertenso (SCHULMAN et al., 2006).

Um dos fatores que contribuem para o desenvolvimento da hipertenso sensvel ao

sal com a reduo dos hormnios ovarianos o aumento da sensibilidade a AII e da

atividade do SRAA. A ovariectomia em ratas Dahl S ocasiona o aumento no nmero

de receptores do tipo 1 para AII nos glomrulos e no crtex da glndula adrenal com

consequente elevao da presso arterial, a reposio com estrgeno atenua estes

efeitos da ovariectomia (HINOJOSA-LABORDE et al., 2004). Em mulheres na ps-

menopausa tambm parece haver um bloqueio na supresso da renina pelo sal, o

que tambm pode contribuir para hipertenso sensvel ao sal (PECHRE-

BERTSCHI et al., 2002, apud HARRISON-BERNARD et al., 2003). A hipertenso

sensvel ao sal aps a ovariectomia est ligada tambm a diminuio da atividade

da enzima xido ntrico sintase endotelial (eNOS) com reduo do xido ntrico,

potente vasodilatador, a reposio do estrgeno preveniu esta alterao. Estes

35

achados suportam a importncia do balano entre AII e xido ntrico na

hemodinmica renal e na homeostase do sdio (SCHULMAN et al., 2006). Os

estrgenos modulam a atividade e expresso do NO, a atividade do SRAA e do

SNS, alm de reduzir a formao de espcies reativas de oxignio por diminuir a

expresso de enzimas oxidantes e aumentar a expresso de enzimas antioxidantes

(DUBEY et al., 2001; ROSANO et al., 2009; XUE et al., 2009). Sua deficincia

produz alteraes desses fatores, resultando em disfunes no balano de sdio

renal, estado redox e hipertenso (HERNANDEZ, RAIJ, 2006; MAJID, KOPKAN,

2007).

O ritmo de progresso da doena renal e hipertenso aumenta com a idade e

menor em mulheres na pr-menopausa quando comparado com homens na mesma

idade, isso se deve, pelo menos em parte, aos efeitos protetores cardiorrenais dos

estrgenos (BAYLIS, 2005). Consistente com achados em humanos, em ratas

fmeas Dahl S a severidade dos danos estruturais no tecido renal e o declnio da

funo renal associados ao envelhecimento so marcadamente elevados na

ausncia de hormnios ovarianos e esto correlacionadas ao ganho de peso. A

glomeruloesclerose e a fibrose tubulointersticial nestas ratas so mais pronunciadas

com a ovariectomia, enquanto a reposio com estrgeno atenuou estas alteraes

(ESQUEDA et al., 2007; MARIC et al., 2004).

A funo renoprotetora dos estrgenos est relacionada tambm a aes diretas no

tecido renal independentes da presso arterial que incluem a inibio da apoptose

das clulas mesangiais, aumento na expresso de enzimas metaloproteinases que

aumentam a degradao de matriz extracelular e reduo na sntese de colgeno

tipo I e IV e laminina induzida pelo fator de crescimento TGF- (DUBEY et al., 2002;

GUCCIONE et al., 2002; ELLIOT et al., 2003). Alm disso, os estrgenos melhoram

os nveis lipdicos, aumentam a vasodilatao dependente do endotlio e protegem

contra o desenvolvimento de aterosclerose e hipertenso, resguardando

indiretamente a funo e estrutura renal (MARIC et al., 2004). Estes achados

demonstram que os estrgenos exercem efeitos protetores sobre os sistemas

cardiovascular e renal (GILBERT et al., 2008).

A associao entre obesidade e dieta hipersdica est intimamente relacionada a

distrbios metablicos, hipertenso, doenas cardiovasculares e renais. Os

36

mecanismos associados a estas alteraes ainda no esto completamente

esclarecidos. Alm disso, tem sido pouco investigado os efeitos da dieta hiperlipdica

e hipersdica numa condio de reduo dos hormnios ovarianos, verificando os

seus efeitos sobre a presso arterial e funo e estrutura renal. Desta forma, o

presente estudo visa avaliar as alteraes na presso arterial, funo e estrutura

renal de ratas ovariectomizadas submetidas dieta hiperlipdica e hipersdica.

37

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

O objetivo do presente estudo avaliar os efeitos da adio de sal dieta

hiperlipdica sobre a funo e estrutura renal em ratas ovariectomizadas.

3.2 Objetivos Especficos

1. Avaliar o consumo alimentar, o ganho de peso corporal e peso do tecido

adiposo visceral de ratas ovariectomizadas tratadas com dieta hiperlipdica e

hipersdica.

2. Avaliar a presso arterial e frequncia cardaca destes animais.

3. Determinar os nveis sricos de glicose, colesterol total e triglicerdeo, bem

como a tolerncia a glicose e sensibilidade a insulina.

4. Determinar os nveis plasmticos e urinrios de creatinina e Na+, protena

urinria e fluxo urinrio.

5. Avaliar o comprometimento glomerular e tbulo-intersticial do tecido renal.

6. Analisar a infiltrao de macrfagos/moncitos no tecido renal.

7. Analisar os nveis sricos de TNF.

38

4. HIPTESE

- A associao da dieta hiperlipdica e hipersdica por um perodo de 24 semanas

contribui para elevao da presso arterial, alteraes metablicas e da funo e

estrutura renal em ratas ovariectomizadas.

39

5. MATERIAIS E MTODOS

5.1 Animais

Foram utilizadas 24 ratas Wistar de 10 semanas de idade com peso corporal

variando entre 150 a 250 gramas, provenientes do Biotrio Setorial do Instituto de

Cincias da Sade da Universidade Federal da Bahia ICS/UFBA. Os animais

foram mantidos no biotrio do Instituto Multidisciplinar em Sade - Campus Ansio

Teixeira/IMS/UFBA em ambiente com controle de luz (12 horas luz, das 7 s 19h) e

temperatura (233C) e livre acesso gua e rao. O protocolo experimental foi

aprovado pelo Comit de tica no Uso de Animal Experimental da Universidade

Estadual de Feira de Santana (Protocolo nmero 003/2011).

5.2 Procedimentos Experimentais

Os animais foram alimentados com rao padronizada controle (Pragsolues

Biocincias, SP) durante uma semana para adaptao. Aps o perodo de

aclimatao, os animais foram submetidos a trs diferentes dietas experimentais, por

um perodo de 24 semanas: 1) Dieta Controle (rao padronizada AIN 93 M

Pragsolues Biocincias, SP, (12,39% do total de calorias oriundas de gordura e

0,3% de cloreto de sdio; 2) Dieta Hiperlipdica (51,1% do total de calorias oriundas

de gordura e 0,3% de cloreto de sdio); 3) Dieta hiperlipdica e hipersdica (56,1%

do total de calorias oriundas de gordura e 8% de cloreto de sdio). As ratas foram

ovariectomizadas com 10 semanas de idade. Os animais foram randomicamente

divididos em 3 grupos distintos: DCO Ratas submetidas dieta controle e

ovariectomia (n=6); DLO Ratas submetidas dieta hiperlipdica e ovariectomia

(n=8); DLSO Ratas submetidas dieta hiperlipdica e hipersdica e ovariectomia

(n=10). O peso e a presso arterial (PA) foram determinados semanalmente, e as

amostras de sangue e urina foram coletadas a cada 3 meses para a anlise dos

parmetros de funo renal e parmetros bioqumicos. Ao trmino das 24 semanas,

os animais foram sacrificados por decapitao e os rins e os tecidos adiposos

40

removidos. O rim esquerdo foi fixado para os estudos histolgicos, morfomtricos e

imunoistoqumicos. Os depsitos de tecido adiposo mesentrico (TAM), parametrial

(TAP) e retroperitoneal (TAR) de cada animal tambm foram removidos e pesados

individualmente. Por fim, o sangue do tronco foi coletado em eppendorfs e

submetido centrifugao para separao do soro para anlise da funo renal e

dosagem do fator de necrose tumoral alfa (TNF-).

5.3 Dietas

As dietas experimentais foram calculadas com base na recomendao para dietas

de roedores de laboratrios, elaborada pelo American Institute of Nutrition e

reportada por Reeves et al. (1993). As propores dos ingredientes das dietas

experimentais, expressas na matria seca, encontram-se descrita na Tabela 1 a

seguir.

Tabela 1 Propores dos ingredientes nas dietas experimentais controle (DC),

hiperlipdica (DL) e dieta hiperlipdica e hipersdica (DLS).

Ingredientes DC DL DLS

--------% MS-------

Amido de milho 37,38 13,88 20,70

Farelo de soja 30,50 30,50 -

Casena - - 15,60

Sacarose 6,50 6,00 7,5

Sebo bovino 0,0 24,00 26,00

Maltodextrina 10,00 10,00 7,5

Gordura Protegida de soja 7,5 7,50 5

Celulose Microcristalizada 3,17 3,17 5

L-cistina 0,30 0,30 0,3

Cloreto de colina 0,15 0,15 0,15

Cloreto de sdio1 - - 7,74

Mistura mineral (AIN-93M-MX)2

3,50 3,50 3,50

Mistura Vitamnica (AIN-93-VX)3

1,00 1,00 1,00

41

Ingredientes DC DL DLS

--------% MS-------

Tert-butil-hidroquinona (BHT) 0,001 0,003 0,005

Total 100,00 100,00 100,00

1Cloreto de sdio: 0,3% de cloreto de sdio das dietas esto contidos na mistura mineral AIN-93G-MX, sendo

que na dieta hiperlipdica e hipersdica foi adicionado 7,74% de cloreto de sdio.

2Mistura mineral AIN-93G-MX: 35,7% de carbonato de clcio; 25% de fosfato monabsico de potssio; 7,4% de

cloreto de sdio, equivalente a 0,3% de cloreto de sdio na composio da dieta; 4,66% de sulfato de potssio; 2,8% de citrato de potssio; 2,4% de xido de magnsio; 0,606% de citrato frrico; 0,165% de carbonato de zinco; 0,063% carbonato de mangans; 0,03% de carbonato de cobre; 0,001% de iodato de potssio; 0,001% de selenito de sdio; 0,0008% de paramobdato de amnia; 0,145% de metasilicato de sdio; 0,0275% de sulfato de potssio e cromo; 0,0082% de cido brico; 0,00635% de fluoreto de sdio; 0,00318% de carbonato de nquel; 0,00174% de cloreto de ltio; 0,00066% vanadato de amnio; 20,98% de sacarose em p. 3

Mistura vitamnica AIN-93-VX- Composio de vitaminas por kg de dieta: 30mg de cido nicotnico; 15mg de cido pantotnico; 6mg de piridoxina; 5mg de tiamina; 6mg de riboflavina; 2mg de cido flico; 750g de vitamina K; 200g de D-biotina; 25g de vitamina B-12; 4000UI de vitamina A; 1000UI de vitamina D3; 75UI vitamina E.

A composio bromatolgica, calculada com base nos valores das anlises

laboratoriais dos alimentos e da proporo dos ingredientes, encontra-se descrita na

Tabela 2.

Tabela 2 Composio bromatolgica das dietas experimentais controle (DC),

hiperlipdica (DL) e dieta hiperlipdica e hipersdica (DLS).

Item Dietas Experimentais

DC DL DLS

Matria seca (g.kg -1

) 82,93 85,25 85,04

Cinzas (g.kg-1

) 2,78 2,74 8,91

Protena Bruta (g.kg-1

) 15,1 15,0 14,2

Extrato etreo (g.kg-1

) 6,97 30,85 30,16

Carboidratos totais (g.kg-1

) 66,76 42,97 36,55

Valores estimados de energia metabolizvel

Energia Metabolizvel (Mcal.kg-1

) 3,99 5,19

4,75

As contribuies das fraes de protenas, carboidratos e gorduras no total de

energia metabolizvel das dietas experimentais encontram-se descritas na Tabela 3.

42

Tabela 3 Contribuio das fraes de protenas, carboidratos e gorduras no total

da energia metabolizvel nas dietas experimentais.

Item Dietas experimentais

DC DL DLS

Energia Metabolizvel (Mcal/kg-1

) 3,99 5,19 4,75

% de contribuio das fraes dietticas na Energia Metabolizvel

Protena 32,36 24,89 16,51

Carboidratos 54,25 23,24 26,34

Gorduras 12,39 51,1 56,14

Vitaminas 1,00 0,77 0,88

Tabela 4 Contribuio das fraes de amido de milho, farelo de soja, sacarose e

maltodextrina na composio dos carboidratos totais nas dietas experimentais.

Item Dietas experimentais

DC DL DLS

Carboidratos totais (g.kg-1

) 66,76 42,97 36,55

Contribuio das fontes de carboidratos na dieta (g.kg-1

)

Amido de milho 37,06 13,76 20,52

Farelo de soja 13,42 13,42 -

Casena - - 1,08

Sacarose 6,49 5,99 7,48

Maltodextrina 9,8 9,8 7,46

5.4 Procedimento cirrgico

Para a realizao da ovariectomia, os animais foram anestesiados com Xilazina

(2mg/ml) e Ketamina (50mg/ml), em uma dose de 4mg/Kg e 40mg/Kg,

respectivamente. Foram feitas incises bilaterais de aproximadamente 1 cm nos

flancos dos animais, at a cavidade abdominal, para a remoo dos ovrios. Em

seguida, o msculo e a pele foram suturados. Como medida profiltica contra

43

infeco ps-operatria, os animais receberam a dose de 5mg/Kg de antibitico

enrofloxacino (Flotril 2,5%). Com a finalidade de confirmar a ovariectomia, o tero

dos animais foi pesado e o ndice uterino calculado (mg/100g pc).

5.5 Determinao da Presso Arterial e do Peso Corporal

As determinaes de peso, presso arterial sistlica, diastlica e mdia e frequncia

cardaca foram realizadas semanalmente, com as ratas conscientes, em ambiente

livre de rudos para evitar estresse do animal e interferncias nos resultados. Para

aferio da presso arterial, as ratas foram aquecidas a 35C por 5 minutos para

determinao da presso pelo mtodo de pletismografia de cauda (LE 5001 Electro-

Sphygmomanometer - Panlab, Spain). Para a pesagem dos animais, foi utilizada

balana digital Acculab.

5.6 Avaliao da ingesto alimentar e calrica

Durante o perodo experimental, os animais foram colocados em gaiolas metablicas

individuais por quatro dias, com livre acesso a gua e a rao. Assim, foi feita a

avaliao da ingesto alimentar (g/dia) por subtrao da quantidade de rao

fornecida pela quantidade remanescente aps 24 horas, obtendo-se a quantidade

ingerida pelo animal. Para encontrar o valor calrico ingerido (kcal/dia) em 24 horas,

multiplicou-se a quantidade ingerida em gramas pela densidade energtica da dieta.

5.7 Anlise do perfil bioqumico

O perfil bioqumico foi analisado por meio de dosagens de colesterol total,

triglicerdeos e glicemia de jejum.

5.7.1 Dosagem do colesterol total

44

O colesterol total foi determinado utilizando-se kit comercial colorimtrico (Bioclin).

Este se baseia na reao catalisada pela enzima lipoprotena lipase que degrada

steres de colesterol em colesterol e cidos graxos. Na seqncia colesterol

oxidase a enzima atuante que converte colesterol livre em colesterol-3-ona e

perxido de hidrognio (H2O2), na presena de O2, o H2O2 reage com a 4-

aminoantipirina e o Fenol, reao catalisada pela peroxidase que forma um

cromgeno vermelho. A intensidade da cor gerada nesta reao lida em

espectrofotmetro (SP-220-Biospectro) no comprimento de onda de 500nm. Os

resultados foram expressos em mg/dL.

5.7.2 Dosagem de triglicerdeos

Para determinao dos nveis sricos de triglicerdeos tambm foi utilizado o kit

comercial colorimtrico (Bioclin). A reao catalisada pela enzima lipoprotena

lipase degrada triglicerdeos em glicerol e cidos graxos livres na presena de H2O.

Em seguida, o glicerol convertido em glicerol-3-fosfato e ADP pelas enzimas

glicerol kinase Mg2+ em presena de ATP. Posteriormente, a enzima glicerol fosfato

oxidase converte glicerol-3-fosfato em presena de H2O em fosfato dihidroxiacetona

e perxido de hidrognio (H2O2). A reao catalisada pela peroxidase onde H2O2

reage com a 4-aminoantipirina e p-clorofenol resulta na formao do cromgeno

vermelho, cuja intensidade da cor tambm lida em espectrofotmetro (SP-220-

Biospectro) no comprimento de onda de 500nm. Os resultados foram expressos em

mg/dL.

5.7.3 Glicemia srica

A glicemia srica tambm foi determinada de kit comercial colorimtrico (Bioclin).

Neste mtodo, a glicose convertida em cido glicurnico e perxido de hidrognio

(H2O2) pela enzima glicose oxidase na presena de O2 e H2O. O H2O2 formado

interage com a 4-aminoantipirina e Fenol, reao catalisada pela peroxidase. Aps

estas reaes, realizada leitura desse parmetro bioqumico foi realizada em

espectrofotmetro (SP-220-Biospectro) no comprimento de onda de 505nm. Os

resultados foram expressos em mg/dL.

45

5.8 Teste de Tolerncia a Glicose

Ao final do perodo experimental foi realizado o teste de tolerncia a glicose com o

objetivo de avaliar a tolerncia a glicose. Aps 12 horas de jejum, foi determinada a

glicemia basal por meio de inciso na cauda do animal, correspondendo esta

primeira medida ao tempo 0 (zero). Subsequente a obteno da glicemia de jejum,

os animais foram submetidos a injeo intraperitoneal de glicose a 50% na dose de

1g/kg ou 0,2mL/100g de peso corporal. Com esta sobrecarga de glicose foi feita

glicemia dos animais nos tempos 30, 60 e 90 minutos posteriores a injeo. Para

dosagem da glicemia, foi utilizado glicosmetro digital (Accu-chek Performa)

5.9 Dosagem de insulina srica por radioimunoensaio (RIA)

A dosagem de insulina srica foi realizada por meio de radioimunoensaio (RIA) Linco

Research de fase slida marcado com iodo 125I, por meio de kits Coat a Count

(DPC - Diagnostic Products Corporation) no Instituto de Cincias Biolgicas da

Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).

As dosagens de insulina foram realizadas em 100L de plasma, em tampo TRIS

100 mM, pH 7,0, com BSA (Protena do Soro Bovino) a 0,25% incubados a 37C por

40 minutos com insulina marcada com iodo 125I e anticorpos especficos. A

separao do hormnio ligado pelo anticorpo foi conseguida com polietilenoglicol

(P.M. 6000) a 17% e a contagem realizada de imediato em curva padro preparada

na vspera.

5.10 Homeostatic model assessment of insulin resistance (HOMA-IR)

A resistncia a insulina foi avaliada por meio do clculo HOMA-IR, utilizando a

concentrao plasmtica de glicose (mmol/L) e insulina (UI/mL) obtidas aps

perodo de jejum (MATTHEWS et al., 1985; AKOUM et al., 2011), a frmula utilizada

foi a seguinte:

46

HOMA-IR (mmol/L x UI/mL) = Glicose de jejum (mmol/L) x Insulina de jejum

(UI/mL)/22.5.

Considerou-se os valores do HOMA-IR 2,7 como indicativos de resistncia a

insulina (GELONEZE et al., 2009).

5.11 Anlise da Funo Renal

A avaliao da funo renal foi determinada utilizando-se amostras de sangue e de

urina de 24 horas coletadas no tempo 0 (uma semana aps o incio do fornecimento

das dietas; tempo 1 (3 meses aps o fornecimento); e tempo 2 (6 meses aps o

fornecimento da dieta). Os animais foram colocados em gaiolas metablicas por um

perodo de 72 horas, sendo as primeiras 24 horas destinadas adaptao, nas

quais no foram coletadas amostras de urina. O fluxo urinrio foi ento determinado

a partir do volume urinrio de 24 horas. As amostras de sangue tambm foram

coletadas por meio de inciso na ponta da cauda dos animais aps aquecimento em

caixa trmica. O sangue foi coletado em eppendorfs e, em seguida, centrifugado

para separao do soro que foi armazenado para posteriores anlises da funo

renal.

5.11.1 Quantificao de creatinina nas amostras de sangue e de urina

A anlise da creatinina srica e urinria foi realizada por mtodo colorimtrico

enzimtico utilizando cido pcrico (Labtest) (HAYGEN, 1953). O mtodo se

fundamenta na reao entre a creatinina e outros cromgenos do soro com o cido

pcrico ou picrato do kit em meio alcalino formando o picrato de creatinina e os

cromgenos-picrato, respectivamente, a reao resulta em uma soluo com

colorao amarelada. Aps esta reao, foi realizada leitura absorbncia da soluo

por espectofotometria com absoro mxima de 510nm. Por conta da interferncia

dos outros cromgenos presentes na amostra, o mesmo foi acidificado para

quantificar a creatinina verdadeira contida no soro. A anlise da creatinina urinria

tambm foi realizada com o princpio da reao entre o cromgeno da amostra e o

47

cido pcrico do kit, porm, no houve a etapa de acidificao. A taxa de filtrao

glomerular (TFG1) foi determinada pelo Clearance de Creatinina.

5.11.2 Quantificao de Na+ e K+ nas amostras de sangue e de urina

A dosagem de sdio e potssio foi realizada por fotometria de chama (Mod. 910,

Analyser, So Paulo, Brazil), uma tcnica analtica baseada em espectroscopia

atmica. A amostra contendo ctions aspirada e inserida em uma chama

ocorrendo alguns fenmenos fsicos e qumicos, como evaporao e vaporizao,

que converte a amostra lquida em aerossol, e atomizao gerando radiao. A

radiao emitida quando os elementos liberam a energia recebida pela chama

proporcional a concentrao deste elemento na amostra. O comprimento de onda da

radiao caracterstico para cada elemento (OKUMURA, CAVALHEIRO, 2004).

Aps as determinaes das concentraes plasmticas e urinrias de sdio e

potssio, foram calculadas as cargas e as fraes de excreo (FE2) destes ons.

5.11.3 Quantificao da protena urinria

A quantificao da protena urinria foi realizada pelo mtodo colorimtrico,

utilizando o kit comercial Sensiprot (Labtest, MG, Brasil). A protena presente na

amostra de urina reage com o vermelho de pirogalol e molibdato de sdio do kit

originando um complexo de cor violcea. Aps a reao, feita quantificao da

intensidade da colorao em espectrofotmetro utilizando um comprimento de onda

de 600 nm, cuja absorbncia proporcional concentrao de protena da amostra.

1

Plasmtica Creatinina de oConcentra

UrinrioVolume UrinriaCreatinina de oConcentra =TFG

2 100 UrinriaCreatinina de oConcentra Plasmtico Na de oConcentra

Plasmtica Creatinina de oConcentra UrinrioNa de oConcentra = FENa

48

5.12 Anlise Histolgica Renal

Aps o sacrifcio, os animais tiveram seus rins removidos e fixados em soluo de

methacarn (metanol 60%, clorofrmio 30% e cido actico 10%) durante um perodo

de 24 horas e depois o fixador foi substitudo por lcool etlico hidratado 70 INPM. O

tecido renal foi ento parafinizado, cortado em seces de 4 m de espessura e

corado com Tricrmio de Masson que marca de azul as reas de fibrose para

estimar o grau de fibrose (YHEE et al., 2008) e avaliar o comprometimento

glomerular e tbulo-intersticial do crtex renal dos animais.

5.12.1 Leses Tbulo-intersticiais

Para avaliar as leses tbulo-intersticiais (LTI) foi realizada a leitura de 30 campos

do crtex renal, por meio de microscopia de luz no aumento de 40x, baseando-se na

presena de fibrose tbulo-intersticial, infiltrado inflamatrio, dilatao ou atrofia

tubular. Estas alteraes foram quantificadas seguindo o escore padronizado por

Shih et al. (1988): escore 0: nenhuma leso; escore 0,5: pequenas reas de leses

discretas e focais; escore 1: leso atingindo uma rea < 10% do crtex; escore 2:

leso atingindo uma rea de 10-25%; escore 3: leso atingindo uma rea de 25-75%

e escore 4: leso extensa e difusa atingindo uma rea > que 75% do crtex.

5.13 Anlise Morfomtrica Glomerular

A anlise morfomtrica dos glomrulos foi feita pela medida da rea do tufo de 30

glomrulos da regio cortical e 15 da regio corticomedular do corte renal de cada

animal dos diferentes grupos experimentais. As imagens obtidas pela microscopia

de luz, com aumento de 40x, foram captadas por meio de vdeo-cmera conectada a

um analisador de imagens (Kontron Electronic KS-300, Eching, Germany). A rea do

tufo glomerular foi delimitada manualmente e determinada por morfometria

computadorizada.

49

5.14 Anlise Imunoistoqumica para macrfagos/moncitos

Alm dos estudos histolgicos, o tecido renal foi submetido anlise

imunoistoqumica. As seces de 4 m de tecido renal foram desparafinizadas e

incubadas com o anticorpo anti-ED-1 (macrfagos/moncitos - 1/1000), monoclonal

(AbD serotec), durante 60 minutos em temperatura ambiente (SOARES et al.,

2007; DOMINGUEZ et al., 2007). O produto da reao foi detectado pelo complexo

avidina-biotina-peroxidase (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) e a cor

desenvolvida com 3,3-diaminobenzidina (DAB) (Easypath). A contracolorao foi

feita com Metil green.

Para anlise quantitativa da infiltrao de macrfagos/moncitos, as clulas ED-1

positivas foram contabilizadas em 30 campos (0,245 mm2) do compartimento tbulo

intersticial (CTI) do crtex renal, com aumento de 40x. Aps a quantificao foi

calculada o nmero mdio de clulas ED-1 positivas de cada animal. Foi realizado

um controle negativo para a reao de imunoistoqumica, o qual foi submetido s

mesmas condies da reao correspondente, omitindo-se o anticorpo primrio.

5.15 Dosagem do TNF srico/ ENZIMAIMUNOENSAIO - ELISA

A quantificao de TNF- nas amostras de soro foi realizada pelo mtodo

imunoenzimtico (ELISA) tipo sanduche na Faculdade de Medicina de Ribeiro

Preto - Universidade de So Paulo, no departamento de farmacologia. Os anticorpos

policlonais anti TNF- foram colocados numa placa de 96 canais e deixados durante

a noite, em seguida, as placas foram lavadas e bloqueadas com soluo de

albumina bovina 1%. As amostras experimentais foram colocadas na placa e

deixadas durante a noite. Aps a lavagem da placa, a quantidade de citocina fixada

foi detectada usando-se um anticorpo secundrio conjugado peroxidase e um

substrato cromognico. A intensidade da cor gerada nesta reao proporcional a

concentrao de TNF- da amostra.

50

5.16 Anlise Estatstica

Para a anlise dos dados de fluxo urinrio foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis, no

paramtrico, com comparaes mltiplas pelo teste de Dunn. Para a anlise

estatstica dos dados de proteinria, cada dado individual foi transformado para

escala de logaritmo em base 10 (Proteinria g/24h log 10). Esses dados de

proteinria, bem como os demais dados experimentais foram submetidos anlise

de varincia com comparaes mltiplas realizadas pelo teste de Newman-Keuls. O

nvel de significncia adotado foi de p< 0,05 como probabilidade mnima aceita.

51

6. RESULTADOS

6.1 ndice uterino

O ndice uterino foi o parmetro utilizado para avaliar a eficcia da ovariectomia. O

estrgeno responsvel por estimular o crescimento das clulas estromais e das

glndulas do endomtrio. Dessa forma, a deficincia desse hormnio no organismo

promove uma gradativa involuo do endomtrio e, consequentemente, reduo do

volume e peso do tero em comparao as ratas controle, cujo o ndice uterino em

torno de 180mg/100g de peso corporal. Todas as ratas do presente estudo

apresentaram reduo no peso uterino, indicando atrofia uterina devido a reduo

nos nveis circulantes de hormnios ovarianos (Tabela 5).

Tabela 5. ndice uterino dos grupos DCO, DLO e DLSO, aps 24 semanas de dieta.

Dados so expressos como mdiaEPM.

6.2 Ganho do peso corporal e peso do tecido adiposo visceral

No houve diferena significativa do peso corporal entre os grupos experimentais,

aps 24 semanas do fornecimento das dietas. Contudo, a anlise do ganho de peso

corporal ao longo das 24 semanas de dieta demonstrou maior ganho de peso nas

ratas ovariectomizadas submetidas dieta hiperlipdica (DLO), (p

52

pesos dos tecidos adiposos mesentrico, parametrial e retroperitoneal, assim como

a mdia do tecido adiposo visceral total e do peso corporal so apresentados na

Tabela 6.

DCO DLO DLSO0

50

100

150

200

250

300

***

*

Gan

ho

de p

eso

(g

)

Figura 1. Ganho de peso corporal de ratas ovariectomizadas submetidas dieta controle (DCO), ratas ovariectomizadas submetidas dieta hiperlipdica (DLO) e de ratas ovariectomizadas submetidas dieta hiperlipdica e hipersdica (DLSO), 24 semanas aps o tratamento diettico. Dados so expressos como mdiaEPM. *p

53

6.3 Ingesto alimentar e calrica

No houve alteraes significativas da ingesto alimentar (g) entre os grupos

experimentais. Apesar disso, a ingesto calrica diria foi maior nos animais do

grupo DLO quando comparado aos animais do grupo DCO (p

54

Tabela 6. Peso corporal (g), pesos dos tecidos adiposos (mg/pc) e ingesto

alimentar (g/dia) e calrica (Kcal/dia) dos grupos DCO, DLO e DLSO, aps 24

semanas de dieta.

Tecidos DCO DLO DLSO

Peso Corporal 416,35,22 442,411,38 433,915,95

TAM 0,910,14 1,450,08* 1,190,15

TAP 2,090,32 3,160,34* 3.490,22*

TAR 1,320,25 3,050,39* 3.100,6*

Gordura Visceral Total 4,320,63 7,660,64* 7,780,74*

Ingesto alimentar (g/dia) 14,970,31 14,90,37 14,060,42

Ingesto calrica (kcal/dia) 59,731,23 77,331,96*** 66,81,94

TAM=Tecido adiposo mesentrico; TAP=Tecido adiposo parametrial; TAR=Tecido adiposo

retroperitoneal; mg/pc=Miligramas por peso corporal. Dados so expressos como mdiaEPM. *p

55

DCO DLO DLSO0

25

50

75

100

125

150

***# # #

PA

S (

mm

Hg

)

Figura 4. Presso arterial sistlica (PAS) de ratas ovariectomizadas submetidas dieta controle (DCO), ratas ovariectomizadas submetidas dieta hiperlipdica (DLO) e de ratas ovariectomizadas submetidas dieta hiperlipdica e hipersdica (DLSO), 24 semanas aps o tratamento diettico. Dados so expressos como mdiaEPM. ***p

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Tabela 8. Parmetros bioqum