Alterações Funcionais e Estruturais em Artérias de...
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Alterações Funcionais e Estruturais em Artérias de Resistência de Ratos com Hipertensão Induzida por Ouabaína: Efeito do tratamento anti-hipertensivo com losartan. Fabiano Elias Xavier Tese de Doutorado em Ciências Fisiológicas (Fisiologia Cardiovascular) Universidade Federal do Espírito Santo Vitória, março de 2005.
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Alterações Funcionais e Estruturais em Artérias de Resistência de Ratos com Hipertensão Induzida por
Ouabaína: Efeito do tratamento anti-hipertensivo com losartan.
Fabiano Elias Xavier
Tese de Doutorado em Ciências Fisiológicas
(Fisiologia Cardiovascular)
Universidade Federal do Espírito Santo
Vitória, março de 2005.
Alterações Funcionais e Estruturais em Artérias de Resistência de Ratos com Hipertensão Induzida por
Ouabaína: Efeito do tratamento anti-hipertensivo com losartan.
Fabiano Elias Xavier
Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal do Espírito Santo como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Ciências Fisiológicas – Fisiologia Cardiovascular.
Aprovada em 24/03/2005 por
________________________________ Profa Dra. Luciana Venturini Rossoni – USP
(Orientadora)
________________________________ Prof. Dr. Dalton Valentim Vassallo - UFES
(Co-Orientador)
________________________________ Profa Dra Ivanita Stefanon - UFES
________________________________
Prof Dr. José Geraldo Mill - UFES
________________________________ Profa Dra Rita Tostes Passaglia - USP
________________________________
Profa Dra Sandra Lia do Amaral – UNESP
Coordenador do PPGCF: _____________________________
UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO Vitória, março de 2005
.
Este trabalho também foi orientado pela Profa Dra Mercedes Salaices, Catedrática de
Farmacología da Facultad de Medicina da Universidad Autónoma de Madrid,
Espanha.
UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO Vitória, março de 2005
Xavier, Fabiano Elias, 1976
Alterações Funcionais e Estruturais em Artérias de Resistência de Ratos com Hipertensão Induzida por Ouabaína: Efeito do tratamento anti-hipertensivo com losartan.
xix, 185 p. 29,7 cm (UFES, D. Sc., Ciências Fisiológicas, 2005)
Tese, Universidade Federal do Espírito Santo, PPGCF
I. Fisiologia Cardiovascular
Foi final de novembro... Dia quente que veio prenunciando chuva, característico de início de verão nestas bandas do equador, mas fazia um tempo bonito.
Em um canto, um sofá verde, bem desgastado pelo tempo e por suores, espremido,
quase sufocado por confissões e lágrimas...
A posição estratégica convidava a um reclinar momentâneo ou de horas. Nada dizia, tudo escutava, tudo sabia...
Esparramando-se, acoitavam nele duas criaturas estranhas. Talvez não fossem da
terra, mas, pelo menos fisicamente, terráqueos aparentavam ser...
Depois de horas, dias, meses a fio, planos traçados, mundo conquistado. Apesar de mal terem começado a faculdade, foram categóricos: Não mais monotonia ou monitoria, precisavam mudar o mundo e para tanto, despiram-se das camisas
pretas, lavaram as caras pintadas... Pesquisa!
Era até lúdico. Coisa d’outro mundo e para aqueles, a felicidade.
“Você vai primeiro... não é você que tem que ir...” Não houve vencedores em mais essa “teima”, foram juntos. Riram muito, brigaram mais um tanto, pegaram ônibus
diferentes... Tinham que dormir, o dia seguinte seria laborioso.
Conseguiram... A primeira vitória foi comemorada com água de côco, risos, mar, mais sonhos e um tanto de discussão.
Anos passados. Seguiram, ninguém sabe para d’onde e nem como estão. Notícias num dão...
Motivos? Talvez tenham, quiçá não.
Mares revoltosos e obstáculos quase ulissinianos não impediram brigas com o destino e divórcios momentâneos com a ciência (Penélopes? quem saberá?).
Contudo, deram coice nas adversidades e por fim, quase doutores, mas não como Fausto.
Felizes? Realização, não! Apenas começo!
Novos planos, estratégias quase bélicas para o porvir.
A munição? Ainda sonhos…
Quase indo, penso no que escreveu John Donne: “Nenhum homem é uma ilha, sozinho em si mesmo; cada homem é parte do continente, parte do todo; se um seixo for levado pelo mar, a Europa fica menor, como se fosse um promontório,
assim como se fosse uma parte de seus amigos ou mesmo sua; a morte de qualquer homem me diminui, porque eu sou parte da humanidade; e por isso, nunca procure
saber por quem os sinos dobram, eles dobram por ti”.
Luíza A. Rabelo, primavera de 2004.
A todos os meus Mestres
Agradecimentos
Elaborar uma tese de doutorado é uma tarefa individual, porém não solitária.
Durante este período surgem pessoas especiais, sem as quais não emergiriam
resultados, conceitos, teorias ou inferências sobre fatos e reflexões que certamente
tornam o trabalho mais intenso. Eu tive a sorte de encontrar muita destas pessoas
especiais, que só pelo fato de conviver com elas já teria valido muito a pena. A estas
pessoas especiais quero expressar o meu agradecimento.
- Quero inicialmente fazer um agradecimento especial a minha família, pelo
incentivo, dedicação, carinho, compreensão, enfim, por ter me proporcionado tudo.
- À Luciana Rossoni pela orientação e pela presença constante durante estes quatro
anos de doutorado, mesmo havendo, durante algum tempo, um enorme oceano nos
separando. Sua dedicação, seu incentivo e suas idéias foram imprescindíveis para
que este estudo fosse realizado.
- A Dalton Vassallo, pelo apoio que me deu todas as vezes que necessitei e por
todos seus ensinamentos que certamente me conduziram neste caminho, muitas
vezes árduo, e fizeram com chegasse até aqui.
- A Mercedes Salaices, por haberme acogido en su laboratorio y por el apoyo
incondicional (precisamente en aquellos momentos en que eran más necesarios).
Mercedes ha jugado un papel determinante en la realización de este trabajo.
Además de sus comentarios y sugerencias, su confianza y sobre todo su amistad
han hecho mucho más fácil la realización de este estudio.
- A María Jesús Alonso, por el apoyo también imprescindible que me dio durante ese
más de un año en Madrid y por haberme conducido junto con Mercedes en el
desarrollo de este trabajo.
- A Gloria Balfagón, por la invalorable experiencia que resultó compartir con ella
muchos momentos que para mí fueron de mucho aprendizaje y por que no decir de
diversión, pues su buen humor hizo mucho más fácil llevar a cabo un trabajo que a
simple vista no tiene nada de divertido.
- A Ana Briones, por todo lo que ha contribuido para la realización de los
experimentos de estructura vascular. Le agradezco enormemente la paciencia, la
dedicación y la amabilidad que tuvo para enseñarme tantas cosas sobre el tema. Su
participación aquí ha sido de gran importancia.
- A los demás compañeros y amigos del L4: Ana, Elena, Gema, María, Patricia,
Raquel, Vicente y en especial Amada e Yolanda. Hemos compartido muchas horas
de trabajo juntos, y algunas de ocio, y os aseguro que es un placer teneros como
compañeros y amigos. No hace falta que os diga que vuestros continuos
ofrecimientos de ayuda y sobre todo vuestra amistad me han ayudado mucho en la
realización de este trabajo.
- A los amigos del laboratorio C13 del Departamento de Fisiología: Carmen, Iván,
Javier, Mercedes y en especial a Rocío (la Roci), también por los buenos momentos
que pasamos juntos.
- Aos professores Ivanita Stefanon, José Geraldo Mill, Rita Tostes e Sandra Lia do
Amaral, por terem gentilmente aceito o convite para participar da avaliação deste
trabalho.
- A Luíza, pela amizade cada vez mais sólida que nos mantém unidos durante estes
dez anos. Durante este tempo, temos compartilhado muitos sonhos, e espero que
daqui em diante, além de sonhos, possamos compartilhar muitas realizações.
- A Ana Rosa, pelo apoio na fase final desta tese.
- Aos amigos do LEMC, muitos deles hoje ex-LEMC, em especial a Alessandra, Ana
Paula, Carlos, Carmen, Cleci, Ivanita, Karina, Leonardo, Patricia e Silvio, pelos bons
e maus momentos que passamos juntos e pela amizade durante todos estes anos.
- Aos novos companheiros do Laboratório de Fisiologia Vascular do ICB/ USP.
- A Carmen González y a Silvia Arribas por haberme abierto las puertas de su
laboratorio para la realización de los experimentos con arterias presurizadas.
- A todos los miembros del Departamento de Farmacología y Terapéutica de la
Facultad de Medicina de la UAM.
- A los funcionarios del animalario de la Facultad de Medicina de la UAM, por la
ayuda y atención que me siempre dieron: Carmina, David, Manolo, Miguel, Pilar y
Santiago.
- A Diego, del Servicio de Microscopia Confocal de la Facultad de Medicina de la
UAM, por su colaboración en la toma de las imágenes.
- Aos professores, funcionarios e colegas do Programa de Pós-Graduação em
Ciências Fisiológicas da Universidade Federal do Espírito Santo.
- Meu muito obrigado também à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (CAPES) e à Universidad Autónoma de Madrid (UAM) pelo apoio
financeiro que me deram.
“Gracias a la vida que me ha dado tanto” (Violeta Parra).
Índice Resumo.....................................................................................................................21
Abstract.....................................................................................................................24 1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................27
1.1. Estrutura dos vasos de resistência e sua contribuição para a
resistência vascular periférica................................................................................28
1.1.1. Camada íntima............................................................................28
1.1.2. Camada média............................................................................28
1.1.3. Camada adventícia.....................................................................29
1.1.4. Matriz extracelular.......................................................................29
1.1.4.1. Colágeno.......................................................................30
1.1.4.2. Elastina..........................................................................30
1.2. Alterações estruturais, mecânicas e funcionais da parede arterial na
hipertensão...............................................................................................................32
1.3. Sistema renina-angiotensina.................................................................38
1.4. A Na+K+-ATPase.....................................................................................43
1.5. Substância endógena inibidora da Na+K+-ATPase e sua importância
para o processo hipertensivo.................................................................................45
1.6. Modelo de hipertensão induzido pelo tratamento crônico com
ouabaína....................................................................................................................51
2. OBJETIVOS...........................................................................................................58
2.1. Objetivo geral..........................................................................................58
2.2. Objetivos específicos.............................................................................58
3. MATERIAIS E MÉTODOS.....................................................................................61
3.1. Animais experimentais...........................................................................61
3.2. Medida da pressão arterial.....................................................................61
3.3. Metodologia empregada para estudo de reatividade vascular em
artérias mesentéricas de resistência......................................................................61
3.3.1. Normalização das artérias de resistência e protocolos
experimentais.............................................................................................................63
3.3.2. Avaliação da resposta de relaxamento dependente do endotélio
e da resposta vasoconstritora à noradrenalina..........................................................63
3.3.3. Modulação do endotélio sobre a resposta vasoconstritora à
noradrenalina..............................................................................................................63
3.3.4. Influência do bloqueio da síntese de óxido nítrico, de
prostanóides e de canais para o potássio sobre a resposta vasoconstritora induzida
por noradrenalina.......................................................................................................64
3.3.5. Influência da atividade da Na+, K+-ATPase sobre a resposta
vasoconstritora induzida por noradrenalina................................................................65
3.3.6. Efeito do tratamento crônico com ouabaína sobre a atividade da
Na+, K+-ATPase sensível à ouabaína em artérias mesentéricas de resistência........65
3.4. Western Blot............................................................................................66
3.4.1. Expressão protéica da isoforma endotelial da sintase de óxido
nítrico..........................................................................................................................66
3.4.1.1. Eletroforese e transferência das amostras....................66
3.4.1.2. Incubação com os anticorpos e detecção das
subunidades...............................................................................................................66
3.5. Metodologia utilizada para o estudo das propriedades mecânicas e
estruturais de artérias mesentéricas de resistência de rato ...............................67
3.5.1. Miógrafo de pressão...................................................................67
3.5.1.1. Cálculos das propriedades mecânicas e estruturais das
artérias mesentéricas de resistência..........................................................................68
3.5.2. Microscopia confocal...................................................................71
3.5.2.1. Análise morfométrica dos componentes celulares da
parede vascular..........................................................................................................71
3.5.2.2. Estudo do conteúdo e organização da elastina.............75
3.6. Determinação de colágeno na parede arterial.....................................76
3.7. Expressão dos resultados e análises estatísticas..............................77
3.8. Fármacos e reagentes a utilizados.......................................................78
4. RESULTADOS.......................................................................................................82
4.1. Valores de pressão arterial sistólica e massa corporal......................82
4.2. Respostas vasculares ao KCl, a acetilcolina e à noradrenalina em artérias mesentéricas de resistência......................................................................82
4.2.1. Modulação do endotélio sobre a resposta vasoconstritora à
noradrenalina..............................................................................................................85
4.2.2. Efeito do bloqueio da síntese de óxido nítrico e de prostanóides
sobre a resposta vasoconstritora induzida por noradrenalina....................................90
4.2.3. Efeito do bloqueio dos canais para o potássio dependentes de
cálcio sobre a resposta vasoconstritora induzida por noradrenalina..........................98
4.2.4. Efeito da inibição da atividade da Na+, K+-ATPase sobre a
resposta vasoconstritora induzida por noradrenalina...............................................102
4.2.5. Efeito temporal da resposta vasoconstritora induzida por
noradrenalina............................................................................................................102
4.3. Efeito do tratamento crônico com ouabaína sobre a atividade
funcional da Na+, K+-ATPase sensível à ouabaína..............................................106
4.4. Expressão protéica da isoforma endotelial da sintase de óxido nítrico.......................................................................................................................108
4.5. Estudo das propriedades estruturais de artérias mesentéricas de
resistência de rato realizado com miógrafo de pressão....................................109
4.6. Propriedades mecânicas de artérias mesentéricas de resistência de
rato avaliadas através de miógrafo de pressão..................................................114
4.7. Análise estrutural da parede vascular através de microscopia
confocal...................................................................................................................117
4.8. Conteúdo e organização da elastina...................................................119
4.9. Quantificação do conteúdo de colágeno............................................123
5. DISCUSSÃO........................................................................................................126
5.1. Resumo dos resultados.......................................................................126
5.2. Efeito do tratamento crônico com ouabaína sobre resposta contrátil
à noradrenalina e atividade funcional da Na+K+-ATPase em artérias
mesentéricas de resistência de rato.....................................................................126
5.3. Efeito do tratamento crônico com ouabaína sobre as propriedades
mecânicas e estruturais de artérias mesentéricas de resistência de rato.......139
6. CONCLUSÕES....................................................................................................149
7. REFERÊNCIAS....................................................................................................152
Lista de Tabelas
Tabela 1: Valores de contração induzida por 120 mM de KCl em
artérias mesentéricas de resistência com e sem endotélio de ratos
Controle, Ouabaína, Losartan e Ouabaína + Losartan.
84
Tabela 2: Valores de pD2 e resposta máxima obtidos através de
curvas concentração-resposta à noradrenalina, na presença e
ausência do endotélio, e a acetilcolina em artérias mesentéricas de
resistência de ratos Controle, Ouabaína, Losartan e Ouabaína +
Losartan.
89
Tabela 3: Valores de pD2 e resposta máxima obtidos através de
curvas concentração-resposta à noradrenalina em artérias
mesentéricas de resistência de ratos Controle, Ouabaína, Losartan e
Ouabaína + Losartan, antes e após tratamento com L-NAME, NPLA
ou indometacina.
95
Tabela 4: Efeito da incubação com tetraetilamônio sobre os valores
de pD2 e resposta máxima à noradrenalina em artérias mesentéricas
de resistência com endotélio intacto e previamente incubadas com L-
NAME + indometacina.
99
Tabela 5: Efeito da incubação com tetraetilamônio sobre os valores
de pD2 e resposta máxima à noradrenalina em artérias mesentéricas
de resistência sem endotélio.
101
Tabela 6: Efeito da incubação com ouabaína sobre os valores de
pD2 e resposta máxima à noradrenalina em artérias mesentéricas de
resistência de ratos Controle e Ouabaína.
103
Tabela 7: Valores de resposta máxima e pD2 à noradrenalina uma e
duas horas após realização da primeira curva concentração-resposta
105
a este agonista alfa-adrenérgico em artérias mesentéricas de
resistência dos diferentes grupos estudados.
Tabela 8: Morfologia da parede vascular de artérias mesentéricas de
resistência de ratos Controle e Ouabaína obtida através de
microscopia confocal.
118
Tabela 9: Estudo morfométrico de células musculares lisas e
endoteliais de artérias mesentéricas de terceira ordem isoladas de
ratos Controle e Ouabaína.
119
Tabela 10: Características da lâmina elástica interna de segmentos
de artéria mesentérica de terceira ordem de ratos Controle e
Ouabaína.
121
Lista de Figuras
Figura 1: Esquema representativo de uma artéria de resistência
mostrando os diferentes constituintes que formam a parede arterial.
29
Figura 2: Modelos de remodelamento vascular, através dos quais,
podem ocorrer alterações da área de secção transversal dos vasos
sanguíneos.
33
Figura 3: Ações da angiotensina II sobre a parede vascular que
resultam em aumento da contração do músculo liso vascular,
crescimento, disfunção endotelial e inflamação.
41
Figura 4: Envolvimento dos mecanismos miogênico e neurogênico na
contração do músculo liso vascular resultante da inibição da Na+K+-
ATPase.
48
Figura 5: Modelo do plasmerosoma e do mecanismo envolvido no
aumento da mobilização de cálcio induzido por baixas doses de
ouabaína em células musculares lisas.
51
Figura 6: Esquema mostrando os principais componentes da
preparação para estudo com vasos de resistência isolados,
desenvolvido por Mulvany & Halpern (1977).
62
Figura 7: Foto representativa de uma artéria mesentérica de
resistência pressurizada a 70 mm Hg.
68
Figura 8: Secções ópticas obtidas através de microscopia confocal dos
diferentes componentes celulares da parede vascular.
73
Figura 9: Reconstrução tridimensional das secções ópticas obtidas 76
através de microscopia confocal da lâmina elástica interna da parede
vascular.
Figura 10: Evolução temporal dos valores de pressão arterial sistólica
medidos através de pletismografia de cauda dos diferentes grupos
experimentais durante cinco semanas
83
Figura 11: Relaxamento dependente do endotélio induzido por
acetilcolina em artérias mesentéricas de resistência.
86
Figura 12: Respostas contráteis induzida por noradrenalina, em
artérias mesentéricas de resistência de ratos Controle, Ouabaína,
Losartan e Ouabaína + Losartan.
87
Figura 13: Efeito da remoção mecânica do endotélio sobre a resposta
contrátil induzida por noradrenalina, em artérias mesentéricas de
resistência de ratos Controle, Ouabaína, Losartan e Ouabaína +
Losartan.
88
Figura 14: Efeito do bloqueio da síntese de óxido nítrico com L-NAME
sobre a resposta contrátil induzida por noradrenalina em artérias
mesentéricas de ratos Controle, Ouabaína, Losartan e Ouabaína +
Losartan.
92
Figura 15: Efeito do bloqueio da isoforma neuronal da sintase de óxido
nítrico, NPLA, sobre a curva concentração resposta à noradrenalina
em segmentos de ratos Controle e Ouabaína.
93
Figura 16: Efeito do bloqueio da ciclooxigenase com indometacina
sobre a resposta contrátil induzida por noradrenalina em artérias
mesentéricas de ratos Controle, Ouabaína, Losartan e Ouabaína +
Losartan.
94
Figura 17: Efeito da pré-incubação com indometacina + L-NAME e L-
NAME + Indo + tetraetilamônio sobre a curva concentração-resposta à
noradrenalina em segmentos de artérias mesentéricas de resistência
de ratos Controle e Ouabaína.
96
Figura 18: Efeito da pré-incubação com indometacina + L-NAME e L-
NAME + Indo + tetraetilamônio sobre a curva concentração-resposta à
noradrenalina em segmentos de artérias mesentéricas de resistência
de ratos Losartan e Ouabaína + Losartan.
98
Figura 19: Efeito da inibição dos canais para o potássio ativados por
cálcio (tetraetilamônio) sobre a curva concentração-resposta à
noradrenalina em segmentos sem endotélio de artérias mesentéricas
dos diferentes grupos experimentais.
100
Figura 20: Efeito da incubação com ouabaína sobre a curva
concentração-resposta à noradrenalina artérias mesentéricas de
resistência de ratos Controle e Ouabaína.
102
Figura 21: Controle temporal das curvas concentração-resposta à
noradrenalina artérias mesentéricas de resistência de ratos Controle,
Ouabaína, Losartan e Ouabaína + Losartan.
104
Figura 22: Curva de relaxamento ao KCl na ausência e na presença de
ouabaína em artérias mesentéricas de resistência isoladas de ratos
Controle, Ouabaína, Losartan e Ouabaína + Losartan.
107
Figura 23: Expressão protéica da isoforma endotelial da sintase de
óxido nítrico em artérias mesentéricas de resistência de ratos Controle,
Ouabaína, Losartan e Ouabaína + losartan.
108
Figura 24: Relação pressão-diâmetro em artérias mesentéricas de
resistência de ratos Controle e Ouabaína em condições ativas e
111
passivas.
Figura 25: Comparação dos parâmetros estruturais de artérias
mesentérica de resistência de ratos Controle e Ouabaína.
112
Figura 26: Comparação dos parâmetros estruturais de artérias
mesentérica de resistência de ratos Losartan e Ouabaína + Losartan.
113
Figura 27: Stress de parede, distensibilidade arterial e relação stress-
strain frente a aumentos de pressão intraluminar em artérias
mesentéricas de resistência pressurizadas de ratos Controle e
Ouabaína.
115
Figura 28. Stress de parede, distensibilidade arterial e relação stress-
strain frente a aumentos de pressão intraluminar em artérias
mesentéricas de resistência pressurizadas de ratos Losartan e
Ouabaína + Losartan.
116
Figura 29: Secções ópticas obtidas através de microscopia confocal
dos núcleos das células musculares e endoteliais de ratos Ouabaína e
Controle.
120
Figura 30: Reconstrução tridimensional das secções ópticas obtidas
através de microscopia confocal da lâmina elástica interna da parede
vascular de artérias mesentéricas de resistência de rato.
122
Figura 31: Imagens representativas do conteúdo total de colágeno
corado com picro sirius em artérias mesentéricas de resistência de
ratos Controle, Ouabaína, Losartan e Ouabaína + Losartan.
124
RESUMO
21
Resumo
A administração crônica de ouabaína induz hipertensão em ratos, através da
ativação de vias simpatoexcitatórias centrais. Entretanto, em vasos de condutância,
os efeitos deste tratamento parecem ser compensatórios. Sabendo-se da
importância dos vasos de resistência no controle da pressão arterial, avaliaram-se
possíveis alterações sobre a resposta à noradrenalina (NA) e sobre as propriedades
mecânicas e estruturais de artérias mesentéricas de resistência (MRA) de ratos
tratados durante cinco semanas com ouabaína e o papel do sistema renina-
angiotensina sobre estes parâmetros.
A pressão arterial dos ratos Ouabaína aumentou progressivamente a partir da
primeira semana de tratamento, enquanto que nos ratos Controle permaneceu
estável. A resposta à NA em MRA com endotélio foi similar entre os grupos Controle
e Ouabaína. A retirada do endotélio ou a inibição da síntese de óxido nítrico (NO) (L-
NAME) induziu aumento desta resposta. O aumento induzido pela remoção do
endotélio foi similar em ambos os grupos, porém, o efeito do L-NAME foi maior no
grupo Ouabaína. O papel do EDHF sobre a contração à NA foi avaliado com o
tetraetilamônio (TEA) em MRA pré-incubadas com L-NAME + Indometacina. A
administração de TEA induziu aumento da resposta à NA somente em MRA de ratos
Controle. O tratamento com losartan reduziu a pressão arterial nos animais Controle
e Ouabaína, impedindo nestes últimos o desenvolvimento de hipertensão, porém as
alterações vasculares até aqui descritas ainda foram observadas.
Comparadas às artérias do grupo Controle, MRA de ratos Ouabaína
apresentaram diâmetro interno e externo e área de secção transversal reduzidos,
sem alteração da espessura da parede vascular, e aumento da rigidez da parede
vascular. Contudo, não foi observada nenhuma diferença significativa na espessura
das camadas adventícia e média, na densidade de células adventiciais e
musculares, na morfologia dos núcleos destas células ou na estrutura da elastina em
MRA de ratos Controle e Ouabaína. Entretanto, um aumento significativo do
conteúdo total de colágeno em MRA de ratos Ouabaína foi observado. O tratamento
com losartan, embora não tenha prevenido as alterações sobre a reatividade
vascular, foi capaz de prevenir as alterações estruturais e mecânicas em MRA de
ratos tratados com ouabaína.
22
Os resultados demonstram que a hipertensão induzida por ouabaína cursa
com alterações funcionais e estruturais em MRA de rato. Enquanto as alterações
funcionais não parecem mecanismos contribuintes para o aumento da pressão
arterial, o remodelamento vascular, observado nas MRA de ratos Ouabaína pode
contribuir para o aumento da resistência vascular periférica e conseqüentemente
para a manutenção da pressão arterial elevada após tratamento com ouabaína. Este
remodelamento foi prevenido pelo tratamento antihipertensivo com losartan, o que
sugere a participação da angiotensina II como um provável mediador das alterações
vasculares estruturais decorrentes da hipertensão induzida por ouabaína.
ABSTRACT
24
Abstract
Several reports have demonstrated that chronic administration of ouabain can
induce hypertension, which are related to activation of central sympathoexcitatory
pathways. Vascular studies demonstrated that in conductance vessels effects of
ouabain treatment seem to be a compensatory mechanism to elevated arterial
pressure. Based on the role of resistance vessels in the regulation of blood pressure,
the purpose of this work was to study the effect of hypertension induced by five
weeks ouabain treatment on the vascular responses induced by noradrenaline (NA)
and on the vascular structure and mechanical properties of rat mesenteric resistance
arteries (MRA) and the role of angiotensin II (AT1) receptors in these responses.
In ouabain-treated rats a progressive increase of the arterial pressure was
observed from the first week of treatment. In the Control group, arterial pressure
remained unaltered. In both Ouabain and Control rats, treatment with losartan
reduced the arterial pressure to a similar level. Contractile responses to NA were
similar in MRA from Ouabain and Control rats and remained unmodified after
losartan treatment. Endothelium removal or the nitric oxide synthase inhibitor (L-
NAME) increased the responses to NA in MRA from both groups. Endothelial
modulation was similar in MRA from Ouabain and Control groups. However, L-NAME
effect was higher in MRA from Ouabain group. In MRA treated with L-NAME plus
indomethacin; tetraethylammonium (2 mM) shifted the NA curves leftward only in
segments from Control rats. Losartan treatment prevents the development of
hypertension but not vascular changes of endothelial modulation on the NA
contractile response observed after ouabain treatment.
Ouabain treatment reduced lumen and vessel diameter and cross-sectional
area were diminished in arteries from ouabain-treated rats compared with Control.
Vessels from ouabain-treated rats were also stiffer There was no difference in
adventitia or media thickness, adventitial or smooth muscle cells density, nuclei
morphology or elastin structure in arteries from Control and Ouabain rats. However,
ouabain treatment increased total collagen content in the vascular wall. Losartan
treatment prevented the increase in blood pressure, reversed the structural and
mechanical differences observed between Control and Ouabain rats and normalized
collagen content.
25
Results presented in the current study suggest that hypertension induced by
ouabain is accompanied by functional and structural alterations in resistance vessels.
Although functional alterations do not seem to contribute to maintenance of elevated
arterial pressure, through an activation of the renin angiotensin system, ouabain
treatment induced changes in the structure and mechanical properties of rat MRA,
which in turn, would be participating in the development and maintenance of
hypertension in this model.
INTRODUÇÃO
Introdução 27
1. Introdução
A hipertensão arterial é sem dúvida, a doença de maior prevalência entre
todas as enfermidades cardiovasculares; trata-se de uma doença de etiologia
multifatorial, caracterizada por uma elevação crônica da pressão arterial. Em
indivíduos adultos, consideram-se valores normais de pressão sistólica abaixo de
120 mm Hg e a diastólica abaixo de 80 mm Hg (Joint National Commitee on
Prevention, Detection, Evaluation and Treatment of High Blood Pressure, JNC 7). A
hipertensão arterial é uma doença silenciosa que não apresenta sintomas durante
muito tempo e caso sua evolução ocorra sem tratamento, pode gerar como primeiro
sintoma uma complicação severa como infarto do miocárdio, hemorragia ou acidente
vascular cerebral. Apesar do considerável avanço no seu diagnóstico e tratamento, a
hipertensão continua sendo um dos mais importantes fatores de risco para outras
doenças cardiovasculares como: infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca,
insuficiência renal, acidentes vasculares cerebrais, etc, (Kaplan, 1998). Em países
desenvolvidos, mais 20 % da população apresenta pressão arterial elevada e
acredita-se que em todo o mundo pelo menos 500 milhões de pessoas têm ou terá
pressão arterial elevada. Embora o conhecimento relacionado com a fisiopatologia
da elevação da pressão arterial tenha crescido substancialmente nos últimos anos,
sua etiologia ainda permanece desconhecida na grande maioria dos casos.
A resistência periférica total elevada é uma das principais características da
hipertensão arterial (Lund-Johansen, 1983). Esta resistência periférica aumentada
resulta primariamente do aumento da dissipação de energia que ocorre quando o
sangue flui através das pequenas artérias de resistência com o lúmen reduzido. As
artérias de resistência podem ser definidas como vasos pré-arteriolares que
contribuem passivamente e ativamente para a manutenção da resistência basal e
para o controle do fluxo sangüíneo durante alterações hemodinâmicas (Mulvany,
2003). Em muitas situações patológicas, em particular na hipertensão, as artérias de
resistência representam um importante papel na etiologia desta enfermidade (Folkow
et al. 1957; Folkow, 1990; Mulvany, 1987; Korner & Angus, 1997) e alguns autores
têm mesmo sugerido que o desenvolvimento de anormalidades nestes vasos
poderia ser causa primária em tais processos (Korner & Angus, 1997). Os principais
fatores que contribuem para o aumento da resistência periférica na hipertensão são:
Introdução 28
o remodelamento vascular, as alterações mecânicas da parede arterial e as
alterações das respostas vasoconstritora e vasodilatadora. Além disso, essas
alterações são importantes contribuintes para o aparecimento das complicações
cardiovasculares associadas à hipertensão (Schiffrin, 1997) como a isquemia
miocárdica (Brush et al., 1988; Hasdai et al., 1997), o acidente vascular cerebral
(Collins et al., 1990) e a insuficiência renal (Klahr & Morrissey, 2003).
1.1. Estrutura dos vasos de resistência e sua contribuição para a
resistência vascular periférica
Em comparação com as artérias de condutância, as artérias de resistência
(com diâmetro luminar entre 100 e 500 µm) possuem uma parede arterial muito mais
fina em proporção com o diâmetro luminar, maior proporção de células musculares
lisas e menor proporção de material elástico (Mulvany & Aalkjaer, 1990; Christensen
& Mulvany, 2001). Entretanto, assim como os vasos de condutância, as artérias de
resistência são classicamente constituídas de três camadas: íntima, média e
adventícia (Figura 1).
1.1.1. Camada íntima. Consiste de uma camada de células endoteliais
diferenciadas e longitudinalmente arranjadas ao longo do eixo axial do vaso e na
direção do fluxo sanguíneo, uma camada subendotelial contendo tecido conjuntivo e
de uma membrana basal. A membrana basal é constituída de colágeno, elastina,
fibronectina, laminina e proteoglicanos, os quais compõem a matriz extracelular.
Esta membrana basal está em íntimo contato com a lâmina elástica interna, a qual é
formada por uma malha compacta de elastina.
1.1.2. Camada média. Em vasos de resistência a camada média constitui
aproximadamente 70 a 80 % do volume total da parede arterial (Lee et al., 1983;
Walmsley et al., 1983; Miller et al., 1987). É constituída de células musculares lisas,
as quais se encontram circunferencialmente arranjadas ao longo do eixo arterial, e
de uma matriz extracelular que inclui lâminas de fibras elásticas, fibras colágenas e
proteoglicanos. Esta camada está limitada exteriormente pela lâmina elástica
externa e internamente pela lâmina elástica interna. O número de camadas de
células musculares lisas é diretamente proporcional ao diâmetro do vaso (Lee et al.,
1983). Assim, artérias com diâmetro ao redor de 300 µm possuem aproximadamente
seis camadas de células musculares lisas na camada média, enquanto aquelas com
Introdução 29
diâmetro entre 30 - 50 µm possuem apenas uma única camada (Gattone et al.,
1986; Miller et al., 1987).
1.1.3. Camada adventícia. Esta camada é formada por tecido conjuntivo,
contendo basicamente fibras de colágeno, fibras elásticas e componentes celulares
como fibroblastos e mastócitos. Este tecido conjuntivo se prolonga gradualmente
relacionando-se com estruturas vizinhas. Neste tecido conjuntivo perivascular
encontra-se uma rede de vasos de calibre muito pequeno conhecido como vasa
vasorum, cuja função está relacionada com o metabolismo da parede vascular. Na
camada adventícia também pode ser encontrada uma rede de fibras nervosas
relacionadas com a inervação simpática.
Figura 1. Esquema representativo de uma artéria de resistência mostrando os diferentes constituintes
que formam a parede arterial (Ross, 1976).
1.1.4. Matriz extracelular. A matriz extracelular é o principal constituinte da
parede dos vasos sangüíneos e prover uma estrutura na qual os vários tipos
celulares da parede vascular se encontram distribuídos. Esta estrutura é constituída
de fibras colágenas e fibras elásticas em meio a um material constituído de outras
moléculas como: glicoprotéinas, proteoglicanos, água, etc. Estes componentes
representam fatores determinantes para as características mecânicas da parede
vascular e, além disso, juntamente com os componentes celulares de cada camada
Introdução 30
participam da regulação de processos celulares como: adesão, migração e
proliferação celular, influenciando dessa maneira na estrutura da parede vascular.
1.1.4.1. Colágeno. O colágeno é uma proteína formada por uma tripla hélice
de cadeias polipeptídicas, que de acordo com a composição dos aminoácidos e a
proporção de moléculas que interferem na sua conformação estrutural, classifica-o
em pelo menos 25 tipos geneticamente diferenciados. No sistema vascular tem sido
identificado pelo menos 13 tipos de colágeno, os quais contribuem para a
manutenção da estrutura e integridade da parede vascular e representa importante
papel em vários eventos celulares incluindo adesão, migração e proliferação celular
(Plenz et al. 2003).
Na parede vascular de artérias normais, os colágenos do tipo I e III são
predominantes e estão organizados como estruturas fibrilares principalmente nas
camadas íntima, média e adventícia (Walker-Caprioglio et al., 1992), enquanto os
tipos IV e VIII estão localizados na membrana basal e ao redor das células
musculares lisas (Yurchenco, 1990). Em menor proporção também se encontra o
colágeno do tipo V, o qual participa na formação de heteropolímeros e seu papel
parece estar relacionado com a regulação do diâmetro das fibras colágenas
(Yurchenco, 1990). O colágeno tipo VI tem também um papel minoritário em vasos
sangüíneos e aparece nas artérias entre o colágeno do tipo I e III associado a
proteoglicanos, sua função parece estar relacionada com processos de adesão a
células vasculares (Bidanset et al., 1992).
O colágeno é uma proteína de sustentação por excelência. Em linhas gerais
pode-se afirmar que as fibras colágenas não se estiram, constituindo esta a principal
diferença em relação às fibras elásticas.
1.1.4.2. Elastina. A proteína fibrosa elastina é um componente importante da
matriz extracelular de artérias de resistência, embora nestes vasos sua proporção
em relação ao colágeno seja bastante menor comparada a vasos de condutância.
As fibras elásticas são estruturas complexas formadas por elastina associada
a glicoprotéinas hidrofílicas e enzimas responsáveis pelo entrecruzamento dos
peptídeos de elastina. Estas fibras estão organizadas como “lâminas” concêntricas
fenestradas ou lamelas que separam as diferentes camadas da parede vascular.
Uma fina lâmina de tecido elástico separa a camada íntima da camada média
(lâmina elástica interna) e outra a camada média da camada adventícia (lâmina
elástica externa). A lâmina elástica interna é uma estrutura organizada, formada por
Introdução 31
fenestrações regularmente distribuídas, as quais permitem a passagem de nutrientes
e outras substâncias do sangue para a parede vascular, e em sentido inverso. Já a
lâmina elástica externa, ao contrário da interna, encontra-se fragmentada ou em
alguns casos ausente em pequenas artérias de resistência (Walker-Caprioglio et al.,
1992).
A principal fonte de elastina são as células musculares lisas (Martin et al.,
1992). Esta proteína é sintetizada a partir de uma molécula precursora chamada
tropoelastina (Parks & Deak, 1990) junto com uma proteína de 67 kDa associada à
superfície celular através de uma proteína de membrana específica (Hinek et al.,
1992). Esta proteína de 67 kDa possui sítios de ligação à lecitina que interage com
proteínas microfibrilares e ainda um domínio hidrofóbico que une seqüências
hidrofóbicas dentro do peptídeo de elastina.
Juntamente com o colágeno, a elastina constitui um fator importante para a
determinação das propriedades mecânicas e estruturais da parede vascular de
artérias de resistência, como demonstrado recentemente por Briones et al. (2003).
De acordo com a Lei de Poiseuille, a resistência vascular periférica varia
inversamente com a quarta potência do raio arterial. Dessa maneira, pequenas
mudanças do diâmetro luminar podem influenciar marcadamente a resistência
vascular periférica. O diâmetro luminar, por sua vez, é determinado pelas
propriedades passivas e ativas da parede arterial. As propriedades passivas podem
ser descritas pela relação pressão: diâmetro sob condições onde as células
musculares lisas estão completamente relaxadas. Já as propriedades ativas dos
vasos sangüíneos são determinadas pelo estado contrátil das células musculares
lisas, pelo seu número e organização. Assumindo um determinado grau de ativação
de uma célula muscular lisa, e que este produz um dado nível de força por área de
secção transversal, a pressão contra a qual um vaso pode contrair será (de acordo
com a Lei de Laplace) proporcional à relação parede: lúmen (ou mais corretamente à
relação média: lúmen) (Mulvany, 1984). A característica estrutural primária dos
vasos é dessa maneira determinada pelo diâmetro interno e pela espessura da
parede (ou da camada média), medidas sob condições de completo relaxamento das
células musculares lisas e sob uma dada pressão intravascular. De acordo com o
diâmetro e a espessura da parede, um outro parâmetro que pode ser medido é a
área de secção transversal; a medida deste parâmetro é importante uma vez que
Introdução 32
indica a quantidade de material que compõe a parede vascular e dessa maneira
fornece informação sobre processos biológicos os quais determinam a estrutura
vascular, como crescimento ou regressão celular.
1.2. Alterações estruturais, mecânicas e funcionais da parede arterial na
hipertensão.
Está bem documentado na literatura que a hipertensão crônica cursa com
alterações da estrutura dos vasos de resistência (Schiffrin, 1992; Mulvany, 2002;
Mulvany, 2003), as quais têm sido denominadas de remodelamento vascular. Este
processo refere-se à capacidade da parede vascular reorganizar seus componentes
celulares e extracelulares em resposta a um estímulo crônico, como por exemplo, ao
aumento de fluxo sangüíneo ou ao aumento da pressão intraluminar (Gibbons &
Dzau, 1994). De acordo com Mulvany (1999) o remodelamento vascular pode ser
classificado como hipertrófico (quando há um aumento da quantidade de material da
parede arterial), hipotrófico (quando ocorre redução da quantidade de material) ou
eutrófico (quando há somente um rearranjo dos constituintes da parede vascular)
(ver Figura 2). Esse remodelamento pode ainda ser classificado como “para dentro”,
quando ocorre redução do diâmetro luminar, ou “para fora”, quando o diâmetro
luminar aumenta (Figura 2).
Na maioria dos modelos experimentais de hipertensão, assim como em
pacientes hipertensos, o diâmetro interno de pequenas artérias de resistência está
reduzido e a relação parede: lúmen está aumentada quando comparados ao seu
controle normotenso sob condições isobáricas (Schiffrin, 1992; Intengan et al.
1999a; Mulvany, 2002; Briones et al., 2003; Schiffrin & Touyz, 2004). Essas
alterações podem ser conseqüência de um dos seguintes eventos: estreitamento do
lúmen em decorrência de um prejuízo do processo de remodelamento; aumento da
camada média muscular sem alterações do diâmetro luminar ou diminuição do
diâmetro externo do vaso, levando a um redução do lúmen (Heagerty et al., 1993).
Introdução 33
RemodelamentoHipertrófico
Area Sec. Transv.
RemodelamentoEutrófico
= Area Sec. Transv.
RemodelamentoHipotrófico
Area Sec. Transv.
Fora DentroRemodelamento
HipertróficoArea Sec. Transv.
RemodelamentoEutrófico
= Area Sec. Transv.
RemodelamentoHipotrófico
Area Sec. Transv.
Fora Dentro
Figura 2. A figura mostra a forma pela qual o remodelamento pode modificar a área de secção
transversal dos vasos sanguíneos. O vaso considerado como normal está representado no centro da
figura. O remodelamento pode ser hipertrófico (i.e. com aumento da área de secção transversal,
vasos representados na parte de cima da figura, direita e esquerda), hipotrófico (com redução da área
de secção transversal, vasos representados na parte central da figura, direita e esquerda) ou eutrófico
(sem mudanças na área de secção transversal, vasos representados na parte inferior da figura, direita
e esquerda). Essa forma de remodelamento pode ser para dentro (com redução do diâmetro luminar,
à direita na figura) ou para fora (com aumento do diâmetro luminar, à esquerda na figura). Modificado
de Mulvany, 1999.
Em artérias de resistência de pacientes com hipertensão essencial, assim
como de alguns modelos animais de hipertensão arterial, não tem sido evidenciado
sinais de hipertrofia ou hiperplasia da camada média muscular (Korsgard et al.,
1993; Intengan et al. 1999a; Briones et al., 2003). As células musculares lisas
parecem rearranjar-se em volta de um lúmen arterial reduzido, e isso é
acompanhado por uma deposição aumentada de matriz extracelular (Intengan et al.
1999a,b; Intengan & Schiffrin, 2000; Briones et al., 2003). Essa forma de
remodelamento é conhecida como remodelamento eutrófico para dentro, ou seja,
sem mudanças na quantidade de material da parede vascular (Mulvany, 1999).
Algumas hipóteses têm sido propostas para explicar este processo. Uma delas
postula que a não-alteração do volume da camada média pode envolver uma
combinação de dois processos celulares: a apoptose e o crescimento. O primeiro
Introdução 34
teria lugar na parte externa da artéria, com redução do diâmetro externo, enquanto
que processos de crescimento se localizariam na parte interna diminuindo assim o
diâmetro luminar (Intengan & Schiffrin, 2000).
O remodelamento eutrófico predomina em artérias de resistência de modelos
experimentais, nos quais o sistema renina-angiotensina parece está mais ativado,
como: os ratos espontaneamente hipertensos (SHR) (Mulvany & Halpern, 1977;
Mulvany et al., 1978; Mulvany & Korsgaard, 1983) e Dois Rins Um Clipe (Li et al.,
1996). Em humanos o remodelamento eutrófico é encontrado na maioria dos
pacientes hipertensos (Aalkjaer et al, 1987; Schiffrin et al., 1993; Rosei et al., 1995).
Já o remodelamento hipertrófico predomina em modelos animais com hipertensão
severa, nos quais o sistema endotelina está mais ativado, como: o modelo DOCA-
Sal (Deng & Schiffrin, 1992), o modelo Um-Rim Um-Clipe (Korsgaard & Mulvany,
1988; Deng & Schiffrin, 1991.) e o modelo Dahl-Sal sensível (D’Uscio et al., 1997).
Crescimento, apoptose, inflamação e fibrose são eventos que parecem contribuir
para o remodelamento vascular na hipertensão, onde vários fatores, como o sistema
renina-angiotensina e a endotelina-1 parecem exercer um importante papel
(Gibbons, 1998; Integan & Schiffrin, 2001).
Tem sido proposto que na hipertensão arterial, a reestruturação da parede
vascular deve-se a alterações sobre os componentes da matriz extracelular e seus
correspondentes receptores de adesão. As interações entre as células musculares
lisas e as proteínas da matriz extracelular se modificam quantitativa ou
topograficamente ocasionando uma redistribuição dos componentes da parede
vascular. Intengan et al. (1999) demonstraram, em artérias mesentéricas de ratos
espontaneamente hipertensos, que a expressão das integrinas αvβ3 e α5β1 junto
com o conteúdo de colágeno estavam aumentados e que ambos os parâmetros se
normalizavam com inibidores do sistema renina-angiotensina. Por outro lado, em
grandes artérias também tem sido descritas alterações no conteúdo (Keeley &
Alatawi, 1991) e organização (Boumaza et al., 2002) da elastina, as quais parecem
contribuir para as alterações da estrutura vascular em artérias de condutância
durante a hipertensão arterial.
Até pouco tempo atrás havia pouco enfoque sobre o papel desempenhado
pela elastina na determinação das propriedades estruturais e mecânicas de vasos
de resistência, assim como a sua contribuição para as alterações estruturais
decorrentes da hipertensão arterial. Entretanto, recentemente Briones et al. (2003)
Introdução 35
descreveram que em artérias mesentéricas de resistência de ratos, a elastina
desempenha um papel crucial sobre as propriedades mecânicas e estruturais destas
artérias. Estes autores demonstraram que a elastina é um elemento importante na
determinação do diâmetro luminar, da relação parede: lúmen e das propriedades
mecânicas de artérias mesentéricas de rato, e que as alterações destes parâmetros
durante a hipertensão arterial parecem resultar, de maneira significativa, em
mudanças na organização da elastina na parede arterial (Briones et al., 2003). Nas
artérias de resistência de ratos espontaneamente hipertensos Briones et al. (2003)
demonstraram um aumento da quantidade relativa de elastina na lâmina elástica
interna da parede vascular associado a uma diminuição do tamanho das fenestras.
O remodelamento vascular na hipertensão também está associado com
alterações das propriedades mecânicas das artérias de resistência, as quais também
podem influenciar a relação pressão: diâmetro e assim a resistência ao fluxo
sangüíneo (Hadju et al., 1994). Rigidez, distensibilidade e complacência são termos
que têm sido utilizados para quantificar as propriedades elásticas das artérias (O’
Rourke, 1995). A complacência é a capacidade de o vaso distender-se frente a
aumentos da pressão intraluminar; depende da geometria e da rigidez dos
componentes da parede arterial. Uma diminuição do diâmetro luminar resultante
principalmente do remodelamento vascular pode reduzir a complacência vascular.
Entretanto, esta complacência pode ser normalizada pela redução da rigidez dos
componentes da parede arterial (Intengan et al., 1999b). Já o módulo elástico é
independente da geometria e depende basicamente da rigidez dos componentes da
parede vascular. Assim, a elasticidade arterial é determinada pela combinação do
módulo elástico dos componentes da parede vascular como: tecido conectivo,
elastina, fibras colágenas, células musculares lisas e endoteliais.
Muitos estudos utilizando artérias isoladas de animais hipertensos assim
como de pacientes com hipertensão essencial demonstraram que a distensibilidade
arterial apresenta-se reduzida quando comparada ao seu controle normotenso
(Laurant et al., 1997; Intengan et al. 1999; Intengan & Schiffrin, 2000; Briones et al.,
2003). De acordo com evidências experimentais, essa maior rigidez arterial tem sido
atribuída principalmente a alterações do conteúdo e/ ou organização dos
componentes da matriz extracelular. Na hipertensão, aumentos do conteúdo de
elementos fibrosos da matriz extracelular, como colágeno e elastina (Intengan et al.,
1999a; Intengan & Schiffrin, 2001; Briones et al. 2003), além de aumento na
Introdução 36
expressão de moléculas de adesão (Intengan et al., 1999a; Intengan & Schiffrin,
2000) têm sido demonstrados. Entretanto, é importante mencionar que nem sempre
as alterações vasculares estruturais decorrentes da hipertensão arterial podem ser
explicadas por alterações das propriedades mecânicas da parede arterial (Gribbin et
al., 1979). Em pequenas artérias cerebrais de animais hipertensos, Baumbach &
Hadju (1993) demonstraram que as propriedades mecânicas destas artérias não
estão alteradas em mesma magnitude quando comparadas a outros leitos
vasculares de animais hipertensos. Além disso, também tem sido demonstrado que
a rigidez arterial apresenta-se reduzida em alguns leitos vasculares de animais e de
pacientes com hipertensão arterial, apesar de nestas artérias terem sido observados
redução do lúmen arterial, aumento na espessura da parede vascular e da relação
parede: lúmen ou aumento da relação colágeno: elastina (Hadju & Baumbach, 1994;
Intengan et al., 1999b; Bund et al., 2001).
Além das alterações estruturais e mecânicas da parede arterial, as alterações
funcionais também contribuem para o aumento da resistência vascular periférica na
hipertensão. Basicamente estas alterações consistem em uma vasoconstrição
aumentada, onde o endotélio vascular desempenha um papel fundamental.
Atualmente é bem conhecido o papel principal que representam as células
endoteliais na regulação de muitas funções vasculares (Rubanyi, 1993, Hailler,
1997). O endotélio regula o tônus, o crescimento e a apoptose das células
musculares lisas, a agregação plaquetária e a adesão de leucócitos à parede
vascular (Kubes et al., 1991; Moncada et al., 1991; Rubanyi, 1993; Hailler, 1997).
Estas funções são realizadas graças às ações combinadas de fatores liberados por
estas células como, o óxido nítrico (NO) (Furchgott & Zawadzki, 1980; Palmer et al.,
1987), a prostaciclina (PGI2) (Moncada et al., 1977), o fator hiperpolarizante derivado
do endotélio (EDHF) (Félétou & Vanhoutte, 1988; Taylor & Weston, 1988), a
endotelina-1 (ET-1) (Yanagisawa et al., 1988), o tromboxano A2 (TxA2) (Vanhoutte,
1993), os diversos fatores de crescimento (PDGF, fator de crescimento derivado de
plaquetas; VEGF, fator de crescimento endotelial VEGF; fatores transformadores do
crescimento, TGF, etc.), as moléculas de adesão leucocitária (VCAM-1, molécula de
adesão de células vasculares; ICAM-1, molécula de adesão intercelular e selectinas
E e P), dentre outros. Na presença de fatores de risco cardiovascular como o
diabetes, a hiperlipidemia, o tabagismo e a hipertensão arterial, o equilíbrio
hemodinâmico e/ ou humoral do endotélio se modifica, alterando o padrão fisiológico
Introdução 37
de produção dos diversos fatores endoteliais. Sob estas circunstâncias se produz um
desequilíbrio entre os diferentes fatores endoteliais e estas células deixam de
exercer um papel homeostático e passam a contribuir para as alterações
cardiovasculares associadas a doenças com fatores de risco cardiovascular, como a
diabetes mellitus, a aterosclerose e a hipertensão arterial. Este processo, chamado
de disfunção endotelial, se caracteriza pela redução de fatores vasodilatadores e
predominância da liberação de fatores vasoconstritores, fatores de crescimento,
tendência à agregação plaquetária, maior adesão de leucócitos e desenvolvimento
de trombose (Mombouli & Vanhoutte, 1999).
Inúmeros estudos, tanto em humanos com em animais experimentais, têm
demonstrado a existência de disfunção endotelial na hipertensão, a qual tem sido
evidenciada habitualmente através de alterações no relaxamento dependente do
endotélio induzido por agonistas como a acetilcolina e a bradicinina (Lüscher et al.,
1987; Angus & Cocks, 1989; Panza et al. 1995; Taddei et al., 1997; Briones et al.,
1999). Entretanto, a disfunção endotelial não se resume apenas a um prejuízo da
resposta vasodilatadora dependente do endotélio que sugere uma menor produção
e/ ou biodisponibilidade do óxido nítrico, da prostaciclina ou do fator hiperpolarizante
derivado do endotélio. Vários estudos têm demonstrado que na hipertensão, o
endotélio com disfunção produz maiores quantidades de angiotensina II (Leite &
Salgado, 1992; Shiota et al., 1992), prostaglandina H2 (PGH2), tromboxano A2
(Lüscher & Vanhoutte, 1986; Taddei et al., 1997) e também de endotelina-1 (Schiffrin
& Thibault,1991). Estes fatores não possuem apenas ação vasoconstritora, mas
também participam de processos de crescimento e proliferação celular e da
agregação plaquetária. Além disso, a hipertensão também cursa com aumento dos
fatores de crescimento para as células musculares lisas, aumento da síntese de
proteínas da matriz extracelular, sendo em grande extensão responsável pelo
remodelamento vascular em portadores de hipertensão (Intengan et al., 1999;
Intengan & Schiffrin, 2000, 2001). Tanto na hipertensão arterial como em outras
doenças cardiovasculares, há aumento do estresse oxidativo, caracterizado por
aumento de espécies reativas de oxigênio como os ânions superóxido (·O2-), os
radicais hidroxil (OH·), o peroxinitrito (ONOO-), dentre outros, associado com
redução das defesas antioxidantes (Suzuki et al., 1995; Hamilton et al., 2001; Wu et
Introdução 38
al., 2001). O ânion superóxido reage com o óxido nítrico formando o peroxinitrito que
tem alta capacidade oxidativa (Beckman et al., 1990; Goldstein & Czapski, 1995).
As espécies reativas de oxigênio, a angiotensina II, a endotelina-1, o estresse
de cisalhamento ativam vários fatores de transcrição, como o Nf-κB e o AP-1, que
por sua vez promovem a expressão de moléculas proinflamatórias pelo endotélio
(MCP-1, molécula quimiotática para monócitos; VCAM; ICAM e citocinas). Estas são
responsáveis por processos inflamatórios, lesão celular e adesão de monócitos e
granulócitos às células endoteliais, facilitando sua migração para o espaço
subintimal. Diante disso, considera-se atualmente que a disfunção endotelial medeia
o processo de aceleração aterosclerótica que pode se manifestar durante a
hipertensão. Diante do exposto até aqui, considera-se que a disfunção endotelial é
um dos principais responsáveis pelos processos de lesão cardiovasculares presente
na hipertensão. Na maioria destes processos, o sistema renina-angiotensina, através
de seu principal constituinte, a angiotensina II, parece exercer um importante papel,
uma vez que esta além de ser um potente vasoconstritor, possui ação proliferativa,
indutora do crescimento celular, pro-fibrótica, pró-oxidativa e pró-inflamatória. Além
disso, na hipertensão arterial seus níveis de produção parecem estar aumentados
em muitos tecidos.
1.3. Sistema renina-angiotensina
A angiotensina II constitui o principal peptídeo do sistema renina-angiotensina.
Sua ação local e sistêmica como agente vasoconstritor tem sido amplamente
estudada. Entretanto, nos últimos anos, tem-se descoberto outras ações deste
peptídeo, que o conduzem a um posto de protagonista nos processos de lesão
cardiovascular (Figura 3).
A síntese da angiotensina II foi inicialmente descrita como fazendo parte de
uma seqüência de reações bioquímicas envolvendo diversos órgãos (Kifor & Dzau,
1987). O angiotensinogênio hepático, seu precursor, sob a ação enzimática da
renina produzida pelos rins é convertido em angiotensina I, que por sua vez origina a
angiotensina II, sob a ação da enzima conversora de angiotensina (ECA). O sistema
renina-angiotensina foi originalmente descrito como um sistema circulatório,
entretanto, a maioria de seus componentes está localizada em vários tecidos do
organismo, indicando a existência de um sistema renina-angiotensina local ou
tecidual (Dzau, 1989; Danser, 1996). A ECA pode ser encontrada no plasma, no
Introdução 39
interstício e no interior das células. A ECA tecidual está presente na maioria dos
órgãos como, coração, cérebro, vasos sanguíneos, rins, fígado, etc. (Hollenberg,
1998).
Todos os componentes do sistema renina-angiotensina, exceto a renina,
foram identificados no sistema vascular. A ECA pode ser encontrada na adventícia,
assim como nas células musculares lisas e endoteliais (Dzau, 1989). A expressão do
angiotensinogênio foi detectada em células musculares lisas, no endotélio e na
gordura perivascular (Naftilan et al., 1991; Morgan et al., 1996). Desde que a renina
não é produzida na parede vascular, a formação local de angiotensina II no
interstício é regulada pela ECA tecidual, a qual provavelmente dependente da
atividade da renina circulante.
Os efeitos celulares da angiotensina II se dão através da sua interação com
receptores específicos da membrana, principalmente o AT1 e o AT2 (De Gasparo et
al., 1995). Os receptores AT1 pertencem à família de receptores acoplados a
proteína G, que apresentam sete domínios transmenbranais, localizando-se a região
C-terminal na fase citoplasmática e a região N-terminal glicosilado na face
extracelular. Estes são encontrados em praticamente todos os tecidos e órgãos do
organismo. Dentre aqueles envolvidos em funções regulatórias do sistema
cardiovascular podem-se citar as glândulas supra-renais, o cérebro, os rins, o
músculo liso vascular e o coração (De Gasparo et al., 1995; Touyz & Schiffrin, 2000).
Os receptores AT2 também apresentam sete domínios transmembranais, mas não
são acoplados a proteínas G. Estes receptores predominam em tecidos fetais
exercendo um papel importante no crescimento e desenvolvimento; em adultos se
localizam nas glândulas adrenais, cérebro, útero e células endoteliais (Iwai &
Inagami, 1992; Dzau, 2001a, b). A ativação dos receptores vasculares para a
angiotensina II produz respostas diferenciadas, em função do tipo de receptor.
Via receptor AT1 a angiotensina II promove vasoconstrição, aumento da
resistência vascular periférica e da pressão arterial. Esta ação hipertensora da
angiotensina II se deve ao seu efeito contrátil sobre a musculatura lisa vascular,
assim como ao seu efeito estimulatório sobre a liberação de aldosterona, de
endotelina-1 e de vasopressina ou ainda devido ao aumento da atividade do sistema
nervoso simpático. Através dos receptores AT1 a angiotensina ainda é capaz de
promover aumento da produção de radicais livres, crescimento e migração celular,
produção de proteínas da matriz extracelular e inflamação (Allen et al., 2000).
Introdução 40
Estudos recentes têm demonstrado que a angiotensina II é um potente agente
pró-inflamatório, uma vez que é capaz de modular algumas respostas do sistema
imunológico, tais como: a quimiotaxia, a proliferação e adesão celular e a
diferenciação de monócitos em macrófagos (Ruiz-Ortega et al. 2001; Suematzu et
al., 2002). Ultimamente têm crescido o inúmero de evidências experimentais
apontando a participação de mecanismos inflamatórios na patogênese de doenças
cardiovasculares como a aterosclerose e a hipertensão arterial (Ross, 1999; Vila &
Salaices, 2005). A angiotensina II está envolvida nestes processos através do seu
papel estimulatório sobre a liberação de vários mediadores inflamatórios, como,
moléculas de adesão celular, quimiocinas e citocinas inflamatórias. A angiotensina II
induz a adesão e migração de monócitos e neutrófilos na parede vascular através da
produção de moléculas de adesão celular como: selectinas, ICAM-1 e VCAM-1
(Intengan et al., 1999a; Pueyo et al., 2000) e de moléculas quimiotáticas como MCP-
1 (Chen et al. 1998).
A angiotensina II é considerada também um potente indutor de stress
oxidativo, o qual é considerado um dos mais importantes fatores envolvidos nos
processos de lesão cardiovascular. Esta ação pró-oxidante da angiotensina II se
deve a sua ação estimulatória sobre a produção de espécies reativas de oxigênio,
principalmente ânions superóxido, mediada através da indução da enzima NADPH
oxidase, a qual representa uma das principais fontes produtoras de radicais livres no
sistema cardiovascular (Griedling et al. 1994; Touyz & Schinffrin, 1999, 2000). Os
ânions superóxido produzem degradação do óxido nítrico e inibem a vasodilatação
dependente do endotélio, facilitando o aparecimento de disfunção endotelial.
Tem sido ainda demonstrado que o sistema renina-angiotensina, através de
seu principal componente, a angiotensina II, participa do processo de
remodelamento cardiovascular presente em doenças como a hipertensão arterial, a
insuficiência cardíaca e a aterosclerose (Touyz & Schinffrin, 2000; Schiffrin & Touyz,
2004). Sobre o sistema vascular a angiotensina II estimula a síntese de proteínas e
de DNA, promove hipertrofia e hiperplasia de células musculares lisas e de
fibroblastos, aumenta a espessura da parede vascular e diminui o diâmetro interno
vascular (Touyz et al., 1999). Fazem parte desses efeitos tróficos da angiotensina II,
a ativação da tirosina quinase e a ativação de uma série de protoncogenes (c-fos, c-
myc, myb, jun, jun-β, egr-1) envolvidos no controle do crescimento celular
(Timmermans et al. 1993; Touyz & Schinffrin, 2000). Várias ações da Angiotensina II
Introdução 41
são também mediadas por fatores de crescimento. O Fator de crescimento do
fibroblasto (FGF), o fator transformante do crescimento β-1 (TGF β-1), o fator de
crescimento derivado de plaqueta (PGF), o fator de crescimento endotelial (VEGF) e
o fator de crescimento semelhante à insulina (IGF) têm sua atividade aumentada
pela angiotensina II (Naftilan et al., 1989; Fukuda et al., 1995; Touyz & Schiffrin,
2000; Zhao et al. 2004). Estes fatores têm importantes repercussões sobre
crescimento celular e dessa maneira o aumento de sua atividade representa um
importante mecanismo envolvido no processo de remodelamento vascular. Além de
seu efeito estimulatório sobre fatores de crescimento, a angiotensina II estimula
ainda a produção de matriz extracelular com aumento da deposição de colágeno,
fibronectina e laminina (Intengan et al., 1999a; Varo et al., 2000).
Angiotensina II
ICAM-1VCAM-1MCP-1
NADH/NADPHOxidase
O2- NO ONOO-
Angiotensina II +
+
+ET-1
+
+ET-1
++
ContraçãoCrescimento
ETAAT1
Monócito
Migração ++
+
MatrizExtracelular
Endotélio
CélulasMusculares
Lisas
Angiotensina II
ICAM-1VCAM-1MCP-1
NADH/NADPHOxidase
O2- NO ONOO-
Angiotensina II ++
++
++ET-1
++
++ET-1
++++
ContraçãoCrescimento
ETAAT1
Monócito
Migração ++++
++
MatrizExtracelular
Endotélio
CélulasMusculares
Lisas
Figura 3. Ações da angiotensina II sobre a parede vascular levando ao aumento da produção de
espécies reativas de oxigênio (anions superóxido, O2-, e peroxinitrito, ONOO-), liberação de
endotelina-1 (ET-1) crescimento e migração das células musculares lisas, aumento da expressão de
moléculas de adesão, aumento da contração, disfunção endotelial e inflamação. MCP-1, molécula
quimiotática para monócitos; AT1, receptor a angiotensina II; ETA, receptor para a ET-1; NO, óxido
nítrico. Modificado de Touyz & Schiffrin, 2000.
Introdução 42
A ação da angiotensina II sobre os receptores AT2 induz vasodilatação,
inibição do crescimento e da proliferação celular (Siragy, 2000). Os efeitos
vasodilatador e antiproliferativo induzidos pela ativação de receptores AT2 parecem
ser mediados pela estimulação da liberação endotelial de bradicinina, de óxido
nítrico e de prostaglandinas (PGI2 e PGE2), os quais apresentam propriedades
vasodilatadoras e antiproliferativas (Siragy, 2000).
Além da angiotensina II ser indiscutivelmente a substância ativa mais
importante do sistema renina-angiotensina, seus metabólitos, tais como a
angiotensina 1-7, a angiotensina III e a angiotensina IV, também possuem atividade
biológica. A angiotensina 1-7 apresenta efeitos opostos aos da angiotensina II,
atuando com um agente vasodilatador e inibidor do crescimento celular (Ardaillou &
Chansel, 1997). Dentre estes peptídeos, a angiotensina III parece ser um dos mais
importantes, porque compartilha muita das funções fisiológicas com a angiotensina II
sobre o sistema cardiovascular e sobre o sistema nervoso central, incluindo
respostas pressoras, liberação de vasopressina, potencialização da atividade
simpática e indução da secreção de aldosterona, além do efeito vasoconstritor
similar ao da angiotensina II (Ardaillou & Chansel, 1997). A angiotensina III também
apresenta propriedades pró-inflamatórias. Em células mononucleadas, a
angiotensina III regula a produção de MCP-1 e ativa a transcrição do fator nuclear
κB (NF-κB) e do gene AP-1, os quais parecem comportar como mediares dos efeitos
pró-inflamatórios deste peptídeo (Ruiz-Ortega et al., 2000). Em algumas situações
patológicas, como hipertensão arterial e diabetes mellitus, a aminopeptidase A renal,
a enzima que degrada a angiotensina II em angiotensina III está aumentada (Ruiz-
Ortega et al., 2001b). Em células mesangiais, a angiotensina III induz a expressão
de genes relacionados com crescimento celular, fibrose e respostas inflamatórias
(Ruiz-Ortega et al. 1998), o que sugere que este peptídeo pode contribuir para a
progressão de doenças associadas a estes eventos, como por exemplo, as doenças
cardiovasculares. A angiotensina IV é outro importante peptídeo originado a partir da
angiotensina II com potencial papel sobre a fisiopatologia vascular. Em placas
ateroscleróticas, a expressão do receptor AT4, encontra-se aumentada (Moeller et
al., 1999) e a angiotensina IV aumenta a proliferação celular (Pawlikowski & Kunert-
Radek, 1997); além disso, em células musculares lisas vasculares, a angiotensina IV
ativa a expressão do NF-κB (Esteban, et al., 2005).
Introdução 43
Na hipertensão arterial, além do processo de remodelamento vascular e da
disfunção endotelial, outras alterações vasculares parecem contribuir para o
aumento na resistência vascular periférica como: o aumento da contração do
músculo liso vascular e da sensibilidade a agentes vasoconstritores, o aumento do
tônus miogênico, o aumento da permeabilidade da membrana aos íons sódio e
cálcio, as modificações na atividade da Ca2+-ATPase da membrana plasmática e do
retículo sarcoplasmático, as modificações de atividade do trocador Na+/Ca2+, assim
como as modificações na atividade e expressão da Na+K+-ATPase (Folkow, 1982;
Konishi & Su, 1983; Bohr & Webb, 1984; Lüscher & Vanhoutte, 1986; Blaustein,
1993; Marín, 1993). Esta última é um componente importante para a manutenção do
tônus vascular, e o comprometimento de sua atividade com a hipertensão pode estar
associada a alterações vasculares do processo hipertensivo (Webb & Bhor, 1979;
Blaustein, 1993; Marín & Redondo, 1999).
1.4. A Na+K+-ATPase A Na+K+-ATPase ou bomba de sódio é uma proteína integral de membrana,
encontrada na maioria das células eucarióticas, inclusive nas células musculares
lisas vasculares. A bomba de sódio é formada por três subunidades distintas assim
denominadas: α , com 113 kDa; β, com 55 kDa; e γ, com aproximadamente 14kDa
(Sweadner, 1989; Blanco & Mercer, 1998). A subunidade α é responsável pela
atividade catalítica e possui sítios de ligação para o ATP e para os compostos
digitálicos, dentre eles a ouabaína e a digoxina (Herrera et al., 1988; Horisberger et
al., 1991; Jewell et al., 1992; Gick et al., 1993). Esta subunidade é composta de 6-7
domínios transmembranais e pode ser encontrada sob quatro isoformas distintas: α1,
α2 α3, e α4, cuja localização varia de tecido para tecido. Estas isoformas diferem
pouco quanto ao seu peso molecular, mas são significativamente diferentes em
relação à sensibilidade pelos compostos digitálicos (Blanco & Mercer, 1998). No
músculo liso vascular, foram identificadas as três primeiras isoformas, α1, α2 e α3
(Sahin-Erdemli et al., 1994). Destas três isoformas, a que apresenta maior
sensibilidade aos compostos digitálicos é a α3, seguida pela α2 e por último a menos
sensível, a isoforma α1 (Blanco & Mercer, 1998). A subunidade β é formada por
apenas um domínio transmembranal, é altamente glicosilada, podendo ser
encontrada nas células sob três isoformas distintas: β1, β2 e β3. A função exercida
Introdução 44
por essa subunidade não é completamente conhecida, mas acredita-se que ela
participa do processo de maturação da enzima, assim como da sua fixação na
membrana. Já a subunidade γ foi a última a ser descoberta e não se sabe ao certo
qual a sua importância para a atividade da bomba de sódio (Mercer et al., 1993;
Blanco & Mercer, 1998).
A Na+K+-ATPase tem como função principal a manutenção do equilíbrio iônico
transmembranal e dessa maneira participa da regulação do potencial de membrana
da célula (Kaplan, 1985; Vassalle, 1987; Allen et al., 1989; Apell, 1989). Esta enzima
transporta 2 íons potássio (K+) extracelulares em troca de 3 íons sódio (Na+)
intracelulares a partir da energia liberada da hidrólise de 1 mol de ATP. Dessa forma,
a Na+K+-ATPase participa da manutenção da diferença de potencial
transmembranal, sendo assim, eletrogênica. A Na+K+-ATPase está envolvida ainda
em outros processos celulares, como crescimento, diferenciação, bem como na
contração do músculo liso e cardíaco (Marín, 1993).
No músculo liso vascular, a Na+K+-ATPase possui papel essencial na
manutenção do tônus (Webb & Bohr, 1978; Van Breemen et al., 1979; Haddy, 1983;
Vassalle, 1987). A inibição dessa enzima, seja por glicosídeos digitálicos, como a
ouabaína, ou por solução livre de K+, produz aumento do tônus em vários leitos
vasculares (Toda, 1980; Wallick et al., 1982; Marín et al., 1988; Sato & Aoki, 1988).
Os mecanismos envolvidos nesta resposta incluem: 1) despolarização e abertura de
canais para Ca2+ dependentes de voltagem (Fleming, 1980; Vassalle, 1987) e
acúmulo intracelular de Ca2+ através da redução da atividade do trocador Na+-Ca2+
(Ozaki et al., 1978; Casteels et al., 1985; Marín et al., 1991; Fernández-Alfonso et
al., 1992; Blaustein, 1993); 2) liberação de noradrenalina das terminações nervosas,
decorrente da inibição da Na+K+-ATPase (Karaki & Urakawa, 1977; Rodríguez-
Mañas et al., 1994). A existência e/ ou a predominância desses dois mecanismos
sobre tônus vascular depende tanto da espécie animal como do leito vascular
estudado.
A atividade da Na+K+-ATPase no músculo liso vascular é significativamente
modulada por substâncias vasoativas derivadas do endotélio (Marín & Redondo,
1999), dentre elas o óxido nítrico que é um estimulante da sua atividade. Além do
mais, já é sabido que parte dos efeitos do óxido nítrico sobre a musculatura lisa
vascular são atribuídos à estimulação desta enzima (Gupta et al., 1994; Gupta et al.,
1996). O endotélio é capaz ainda de liberar outras substâncias que estimulam a
Introdução 45
atividade da Na+K+-ATPase, como angiotensina II, endotelina-1 e prostaciclina
(Marín & Redondo, 1999). Outros fatores capazes de modular a atividade da bomba
de sódio incluem: a concentração de sódio intracelular, o estiramento (Liu et al.,
1998; Liu & Songu-Mize, 1998), a fosforilação por proteínas cinases e a insulina
(Gupta et al., 1996).
Sabendo-se que a homeostasia celular do Na+ e do potencial de membrana
são fatores essenciais para o controle do tônus vascular e da pressão arterial, e que
estas duas variáveis são por sua vez controladas pela atividade da Na+K+-ATPase,
alguns trabalhos têm sugerido que alterações na atividade e/ ou expressão bomba
de sódio podem ser fatores envolvidos na gênese e/ ou manutenção da hipertensão
arterial (Pamnani et al., 1981; Songu-Mize et al., 1984; Blaustein, 1993; Marín &
Redondo, 1999).
1.5. Substância endógena inibidora da Na+K+-ATPase e sua importância
para o processo hipertensivo Desde o inicio da década de sessenta quando de Wardener et al. (1961)
demonstraram a presença de um hormônio natriurético circulante após a expansão
aguda de volume, que participaria da regulação da excreção renal de sódio, muito foi
feito com o intuito de identificar este fator e de investigar a sua importância
fisiológica. Oito anos depois, Kramer et al. (1969) sugeriram que este hormônio era
um inibidor da Na+K+-ATPase e mais tarde em 1980, Gruber et al. demonstraram
que este hormônio possuía reação cruzada com anticorpos anti-digoxina, razão pela
qual passou a ser chamado de fator digitalis-like. Antes em 1976 Haddy & Overbeck
já sugeriam que esta substância inibidora da Na+K+-ATPase participava da gênese
de modelos de hipertensão dependente de volume. Entretanto, foi em 1981 que
Poston et al. e depois Hamlyn et al. em 1982, demonstraram a existência deste fator
digitalis-like no plasma de pacientes com hipertensão essencial, começando desde
então a ser demonstrada uma correlação entre os níveis plasmáticos desta
substância com a ingestão de sódio e os níveis pressóricos destes pacientes
(Hamlyn et al., 1982; Hasegawa et al., 1987). Porém a natureza química deste fator
até então era desconhecida. Foi em 1991 que Ludens et al. purificaram no plasma
de humanos o fator digitalis-like e, nesse mesmo ano, trabalhos do grupo liderado
pelo Dr. Hamlyn demonstraram que a ouabaína e o fator digitalis-like purificado
possuíam características bioquímicas, físico-químicas, imunológicas e fisiológicas
Introdução 46
muito semelhantes, razão pela qual passou a ser conhecido como fator ouabain-like
(Mathews et al. 1991; Bova et al., 1991).
Em mamíferos, a ouabaína está presente em concentrações nanomolares,
cuja produção concentra-se no córtex da glândula supra-renal (Lundens et al., 1992;
Laredo et al., 1994), no hipotálamo (de Wardener & Clarson, 1985) e na região
anteroventral do terceiro ventrículo (AV3V) (Pamnani et al., 1981; Songu-Mize et al.,
1982). Sua produção pode ser estimulada pelo aumento da concentração plasmática
de sódio e pela expansão de volume extracelular (de Wardener et al., 1961;
Blaustein, 1993; Yamada et al., 1997). Entretanto, outros estímulos como o ACTH e
a angiotensina II também têm sido identificados como indutores da liberação deste
composto digitálico (Laredo et al., 1997).
Em humanos, algumas doenças cursam com um aumento dos níveis
plasmáticos de ouabaína como: a hipertensão essencial (Hamlyn et al., 1982), a
insuficiência cardíaca congestiva (Gottlieb et al., 1992), a insuficiência renal crônica
(Hamlyn et al., 1996), o infarto agudo do miocárdio (Bagrov et al., 1994), entre
outras. Existem trabalhos demonstrando que a ouabaína pode aumentar o tônus
simpático (Huang, et al., 1994; Huang & Leenen, 1999), aumentar a resistência
vascular periférica (D´Amico et al. 2003), ou ainda sensibilizar o leito vascular
aumentando sua responsividade às substâncias vasopressoras (Songu-Mize et al.,
1995; Vassallo et al., 1997; Rossoni et al. 1999, 2001). Diante disso, a ouabaína
pode contribuir para a patogênese da hipertensão arterial. Estes efeitos da ouabaína
são explicados pela sua capacidade de se ligar na subunidade α da Na+K+-ATPase
inibindo a atividade desta enzima (Skou & Esmann, 1992; Lingrel, 1992).
Assim como em humanos com hipertensão essencial, alguns modelos
animais de hipertensão arterial também apresentam níveis elevados de ouabaína
endógena como: o Ligadura em 8, o Dahl-sal sensível e o modelo Doca-Sal (Kojima,
1984; Leenen et al., 1994, Yamada et al., 1997; Yuan et al., 2000). Uma possível
explicação para a contribuição da ouabaína na gênese e/ ou manutenção do
processo hipertensivo nestes modelos deve-se à sua ação sobre o sistema nervoso
central. Essa hipótese tem sido comprovada através de algumas evidências
experimentais, como por exemplo: a de que a lesão da região AV3V em ratos Doca-
sal reduz a pressão arterial e melhora a atividade da bomba de sódio (Songu-Mize et
al., 1982). Ainda, em outros modelos, como o Um-Rim Um-Clipe e os ratos
espontaneamente hipertensos, a administração intracerebroventricular de anticorpos
Introdução 47
antiouabaína também reduz a pressão arterial (Huang & Leenen, 1996; Yuan et al.,
2000). Huang et al. (1992) e Huang & Leenen (1994, 1996a) demonstraram que o
sódio é capaz de induzir liberação da ouabaína no sistema nervoso central. Um vez
liberada, a ouabaína ativa o sistema renina-angiotensina cerebral, e este, por sua
vez, é responsável pela diminuição do componente simpático inibitório e pelo
aumento do simpático excitatório, o que acarreta uma exacerbação da hipertensão
em animais espontaneamente hipertensos e Dahl-Sal sensíveis, submetidos a uma
alta ingestão de sódio (Huang & Leenen, 1996a,b)
Sabendo-se que a ouabaína é um inibidor da Na+K+-ATPase, e que esta por
sua vez modula significativamente o tônus vascular, uma outra hipótese para as
ações hipertensoras da ouabaína foi formulada. Esta hipótese baseia-se nos efeitos
vasculares deste composto digitálico, que poderiam contribuir para o aumento da
resistência vascular periférica e dessa forma para o processo hipertensivo. Esta
ação da ouabaína foi caracterizada de acordo com as evidências experimentais que
se seguem.
A administração de doses terapêuticas de ouabaína no antebraço de
pacientes normotensos e em cães anestesiados aumenta a resistência vascular e a
pressão arterial por uma ação direta no músculo liso vascular sem alteração da
freqüência ou do débito cardíaco (Ross Jr et al., 1960). Em 1988, Marín et al.
demonstraram que a ouabaína induz contração em artérias cerebrais de rato e que
esta resposta devia-se a uma ação direta desta substância no músculo liso vascular
(mecanismo miogênico); já em artérias femorais, o efeito contrátil devia-se à
liberação de noradrenalina dos terminais adrenérgicos (mecanismo neurogênico)
(Figura 4). Dessa forma, evidenciou-se que o efeito vascular da ouabaína também
dependia do leito vascular estudado.
Em seguida, trabalhos deste mesmo grupo procuraram elucidar melhor o
mecanismo de ação vascular da ouabaína e o envolvimento do endotélio sobre esta
resposta. Em 1992, trabalhos de Sánchez-Ferrer et al. e Rodríguez-Mañas et al.
demonstraram que a contração induzida pela ouabaína em anéis de vasos
placentários humanos e artérias carótidas de rato era negativamente modulada pelo
endotélio. Ou seja, a ouabaína, concomitante à contração muscular, promovia a
liberação de um fator vasodilatador de origem endotelial. Sobre o componente
neurogênico da contração induzida por ouabaína, Rodríguez-Mañas et al. (1994)
demonstraram que o endotélio vascular também era capaz de modular esta resposta
Introdução 48
induzida pela ouabaína através da liberação de um fator vasodilatador de natureza
desconhecida. Entretanto, sabia-se que este fator não era nem o óxido nítrico nem
um derivado da via ácido araquidônico-ciclooxigenase.
2K+
[Na ]+i
[Ca ]2+i
+
vasoconstrição
VOCCs
+
Ouabaína Fatores digitalis-like
CML
Efeito direto: componente miogênico
NA
NA
+2K
α-receptor
Recaptação de NA
Terminaçãosimpática
CML3Na
+
Ca2+
3Na+
Ouabaína
VOOCs[Ca ]i2+
Vasoconstrição
OuabaínaFatores digitalis-like
(-)
Liberação de NA: componente neurogênico
Ca2+
Ca2+
3Na+
3Na+
3Na+
Ca2+
2K+
[Na ]+i
[Ca ]2+i
+
vasoconstrição
VOCCs
+
Ouabaína Fatores digitalis-like
CML
Efeito direto: componente miogênico
NA
NA
+2K
α-receptor
Recaptação de NA
Terminaçãosimpática
CML3Na
+
Ca2+
3Na+
Ouabaína
VOOCs[Ca ]i2+
Vasoconstrição
OuabaínaFatores digitalis-like
(-)
Liberação de NA: componente neurogênico
Ca2+
Ca2+
3Na+
3Na+
3Na+
Ca2+
2K+
[Na ]+i[Na ]+i
[Ca ]2+i[Ca ]2+i
+
vasoconstrição
VOCCs
+
Ouabaína Fatores digitalis-like
CML
Efeito direto: componente miogênico
NA
NA
+2K
α-receptor
Recaptação de NA
Terminaçãosimpática
CML3Na
+
Ca2+
3Na+
Ouabaína
VOOCs[Ca ]i2+
Vasoconstrição
OuabaínaFatores digitalis-like
(-)
Liberação de NA: componente neurogênico
Ca2+
Ca2+
3Na+
3Na+
3Na+
Ca2+
Figura 4. Envolvimento dos mecanismos miogênico e neurogênico na contração do músculo liso
vascular resultante da inibição da Na+K+-ATPase. A inibição desta enzima nas células musculares
lisas (CML) induz despolarização e abertura de canais de Ca2+ dependentes de voltagem (VOCCs) e
acúmulo intracelular de Ca2+ através da redução ou reversão da atividade da troca Na+-Ca2+, além
disso, a inibição da Na+K+-ATPase das terminações nervosas promove liberação de noradrenalina
(NA) que por sua vez se liga aos receptores alfa-1 adrenérgicos (α1-R) na membrana das células
musculares, induzindo contração. Modificado de Marin & Redondo, 1999.
Sobre a contração miogênica da ouabaína, Ponte et al. (1996a; b), utilizando
aorta de animais normotensos Wistar-Kyoto e espontaneamente hipertensos (SHR),
também demonstraram que o endotélio modula a resposta da ouabaína. Entretanto
o fator liberado era distinto no animal hipertenso comparado ao seu controle
normotenso. Na aorta de ratos Wistar-Kyoto o fator liberado era vasodilatador, pois
modulava negativamente a contração induzida pela ouabaína. Já nas aortas dos
ratos espontaneamente hipertensos era um fator vasoconstritor, uma vez que na
ausência do endotélio a resposta contrátil induzida pela ouabaína era de menor
magnitude. De maneira similar aos trabalhos publicados por Rodríguez-Mañas et al.
(1992) e Sánchez-Ferrer et al. (1992), Ponte et al. (1996a,b) também demonstraram
que este fator não era nem o óxido nítrico nem um prostanóide da via ácido
Introdução 49
araquidônico-ciclooxigenase. Enquanto isso, a natureza química desses fatores
ainda era desconhecida. Outros pesquisadores também demonstraram a capacidade
da ouabaína induzir a liberação fatores endoteliais em cultura de células. Em 1987
Nakagawa et al. demonstraram que a ouabaína promovia a liberação de
prostaciclina; em 1990 Yamada et al. demonstraram a liberação de endotelina-1
pelas células endoteliais expostas à ouabaína e em 1993 Xie et al. demonstraram
que as células endoteliais liberavam óxido nítrico quando expostas à ouabaína.
Nos estudos de reatividade vascular acima citados as concentrações
utilizadas de ouabaína eram altas (da ordem de mM), muito mais elevadas que
aquelas encontradas no plasma e/ ou nos tecidos de pacientes ou animais
hipertensos. Entretanto, trabalhos do grupo liderado pelo Dr. Dalton Vassallo e pela
Dra. Luciana Rossoni, demonstraram que concentrações nanomolares de ouabaína
são capazes de aumentar a pressão arterial de animais hipertensos anestesiados, e
de potencializar a resposta vasoconstritora à fenilefrina no leito vascular caudal
isolado destes animais (Songu-Mize et al., 1995; Vassallo et al., 1997; Rossoni et al.,
2001, Padilha et al., 2004). Além disso, a ouabaína foi capaz aumentar a pressão
arterial diastólica em animais normotensos anestesiados e com os reflexos
cardiovasculares bloqueados. Este efeito era mediado através de dois mecanismos
distintos, um sensível e outro resistente à fentolamina (Barker et al., 2001). Estes
resultados em conjunto sugerem, portanto, que a ouabaína em concentrações
nanomolares, semelhantes àquelas encontradas no plasma de pacientes e animais
hipertensos, pode aumentar a resistência vascular por sua capacidade de
sensibilizar o músculo liso vascular a agentes vasopressores, podendo dessa
maneira, contribuir para o aumento do tônus vascular na hipertensão. Semelhante
ao efeito observado com altas concentrações (em mM) de ouabaína, o efeito de
concentrações nanomolares sobre a vasoconstrição induzida por fenilefrina também
sofre influência do endotélio vascular. Rossoni et al. (1999) demonstraram que no
leito vascular caudal de ratos normotensos, 10 nM de ouabaína induz liberação de
uma substância de origem endotelial com características de um ativador de canais
para potássio, e que esta substância modula negativamente o efeito da ouabaína
sobre a resposta pressora à fenilefrina. Assim como nos estudos utilizando
concentrações elevadas de ouabaína (Ponte et al., 1996a, b), estes últimos
utilizando concentrações nanomolares deste digitálico demonstraram que ao
contrário do observado em animais normotensos, no leito vascular caudal de ratos
Introdução 50
espontaneamente hipertensos a ouabaína promove a liberação de um fator
vasoconstritor, que modula positivamente o efeito sensibilizador da ouabaína sobre
a contração à fenilefrina (Padilha et al. 2004).
O mecanismo pelo qual a ouabaína pode sensibilizar o músculo liso vascular
ao efeito de agentes vasoconstritores pode ser resumido de acordo com a figura a
seguir (Figura 5). Esse mecanismo foi proposto por Blaustein et al., (1998). Esses
autores identificaram uma microrregião celular entre a membrana plasmática e a
membrana do retículo sarcoplasmático, denominada por eles de plasmerosome.
Nessa região estão localizados o trocador Na+-Ca2+ e as isoformas α2 e α3 da
Na+K+-ATPase, que possuem maior afinidade pela ouabaína. Essa microrregião
parece ter importante função sobre a mobilização do cálcio intracelular e contribui
para o efeito dos compostos digitálicos, como a ouabaína. Assim, a inibição das
subunidades α2 e α3 da Na+K+-ATPase aumenta a concentração de sódio
intracelular, o que resulta em redução da atividade do trocador Na+-Ca2+ e
conseqüente aumento local de íons Ca2+. Esse Ca2+ é captado pela Ca2+-ATPase do
retículo sarcoplasmático e estocado no interior dessa organela citoplasmática.
Assim, após estímulo de um agonista vasoconstritor como a fenilefrina,
noradrenalina ou serotonina, a resposta contrátil resultante seria amplificada em
conseqüência de uma maior liberação de Ca2+ pelo retículo sarcoplasmático (Figura
5). Esse mecanismo explica como concentrações nanomolares de ouabaína podem
amplificar a resposta a um agente vasoconstritor e representa um mecanismo
adicional através do qual o fator ouabain-like endógeno pode contribuir para o
processo hipertensivo.
Introdução 51
Ca2+
Ca2+
Na+
Na+
Na+
Na+
K+ Ca2+
Ca2+ATP
ATP
Ca2+
SERCA
ATP
Ca2+IP3
Ca2+
Ca2+
Ca2+ RSCML
α1-Rα2 /α3 NKA NCE
Ca2+
Ca2+
Na+
Na+
Na+
Na+
K+ Ca2+
Ca2+ATP
ATP
Ca2+
SERCA
ATP
Ca2+IP3
Ca2+
Ca2+
Ca2+ RSCML
α1-Rα2 /α3 NKA NCEOuabaína
Ca2+Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
SOC SOC
IP3-R
Ri-R
A B
Ca2+
Ca2+
Na+
Na+
Na+
Na+
K+ Ca2+
Ca2+ATP
ATP
Ca2+
SERCA
ATP
Ca2+IP3
Ca2+
Ca2+
Ca2+ RSCML
α1-Rα2 /α3 NKA NCE
Ca2+
Ca2+
Na+
Na+
Na+
Na+
K+ Ca2+
Ca2+ATP
ATP
Ca2+
SERCA
ATP
Ca2+IP3
Ca2+
Ca2+
Ca2+ RSCML
α1-Rα2 /α3 NKA NCEOuabaína
Ca2+Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
SOC SOC
IP3-R
Ri-R
A B
Figura 5. Modelo do plasmerosoma e do mecanismo envolvido no aumento da mobilização de cálcio
(Ca2+) induzido por baixas doses de ouabaína em células musculares lisas (CML). O esquema mostra
o retículo sarcoplasmático (RS) juncional com suas Ca2+-ATPases na membrana (SERCA), o
microdomínio entre a membrana do RS e a membrana plasmática adjacente contendo: canais de
cálcio operados por estoques intracelulares (SOC), as isoformas α2 e α3 da Na+K+-ATPase (NKA) e o
trocador Na+/Ca2+ (NCE). A. Sob condições normais, B. Após administração de baixas doses de
ouabaína. α1-R; receptor alfa-adrenérgico; IP3, trifosfato de inositol; IP3-R, receptor de IP3; Ri-R,
receptor de rianodina. Modificado de Arnon et al. (2000).
Todos estes resultados obtidos com a ouabaína serviram de suporte para
uma nova hipótese: a de que a ouabaína é capaz de induzir hipertensão quando
cronicamente administrada em animais normotensos.
1.6. Modelo de hipertensão induzido pelo tratamento crônico com
ouabaína
Até o início dos anos 90, havia muitas hipóteses sobre a contribuição da
ouabaína endógena para o processo hipertensivo, mas até então nenhum trabalho
havia demonstrado a capacidade deste digitálico desenvolver hipertensão quando
cronicamente administrado. Antes, em 1986, Yasujima et al. demonstraram que a
administração crônica de ouabaína não era capaz de induzir hipertensão em ratos,
similar a outros trabalhos publicados alguns anos mais tarde utilizando ratos (Li et
al., 1995) e ovinos (Pidgeon et al., 1996). Entretanto, um fator importante para o não
desenvolvimento de hipertensão nestes animais era a concentração de ouabaína
Introdução 52
utilizada. Nestes trabalhos foram utilizadas altas concentrações de ouabaína, o que
podia levar a quadros de intoxicação digitálica e o não desenvolvimento de
hipertensão arterial.
Em 1993 Yuan et al. foram os primeiros autores a demonstrar que a
administração crônica de ouabaína induzia hipertensão em ratos, porém, diferente
dos trabalhos de Yasujima et al. (1986), Li et al. (1995) e Pidgeon et al. (1996), estes
autores utilizaram doses baixas de ouabaína, 17 µg/ Kg/ dia. Trabalhos publicados
por outros grupos também confirmaram que a administração de doses baixas de
ouabaína induzia hipertensão em ratos (Huang et al., 1994; Manunta et al., 1994;
Ferrari et al., 1998).
Manunta et al. (1994) foram os primeiros pesquisadores a iniciar a
caracterização deste novo modelo de hipertensão e demonstraram que esta cursa
com aumento dos níveis de ouabaína no plasma (1 a 10 nM), nos rins, no
hipotálamo e na glândula pituitária anterior. Neste mesmo ano, Huang et al. (1994)
publicaram um estudo demonstrando que a administração intravenosa,
intracerebroventricular ou subcutânea de 10 µg/ Kg/ dia de ouabaína durante 10 a 14
dias aumentava a pressão arterial em ratos normotensos, a qual parecia ser
mediada por uma ação da ouabaína sobre o sistema nervoso central. Mais tarde
este mesmo grupo, liderado pelo Dr. Frans Leenen, confirmou este efeito central da
ouabaína, demonstrando que neurônios da região anteroventral do terceiro
ventrículo (AV3V) eram essenciais para a hipertensão induzida por injeção
intracerebroventricular de ouabaína, possivelmente por um aumento da atividade
simpática (Veerasingham & Leenen, 1999). Ainda neste mesmo ano, Huang &
Leenen, (1999) demonstraram que a hipertensão induzida pela administração
subcutânea de ouabaína cursava com aumento da atividade simpática e prejuízo da
atividade barorreflexa e que este efeito devia-se ao aumento da atividade do sistema
renina-angiotensina cerebral. A participação do sistema renina-angiotensina cerebral
no efeito hipertensinogênico da ouabaína foi posteriormente comprovado. O mesmo
grupo do Dr. Leenen demonstrou que a administração de antagonistas do receptor
AT1 para a angiotensina II (losartan e embusartan) ou a utilização de ratos
transgênicos com deficiência para o angiotensinogênio cerebral impedia o aumento
da atividade simpática e a hipertensão induzida pelo tratamento crônico com
ouabaína (Huang et al., 2001; Zhang & Leenen, 2001).
Introdução 53
Recentemente foi caracterizada uma segunda via do sistema nervoso central
envolvida no efeito hipertensinogênico da ouabaína. Di Filippo et al. (2003)
demonstraram que o tratamento crônico com este digitálico (14 µg/ Kg/ dia) durante
quatro semanas cursa com aumento do conteúdo cerebral de endotelina-1 e que
esta contribui para alguns efeitos hemodinâmicos observados após o tratamento.
Estes autores confirmaram o efeito hipertensor da ouabaína e demonstraram que
esta hipertensão está associada com aumento da resistência vascular renal e
redução do fluxo sanguíneo renal. Tanto a hipertensão como as alterações sobre a
hemodinâmica renal foram bloqueadas pela administração na área cinzenta
periaqueductal de antagonistas de receptores ETA para a endotelina-1, sugerindo
que a administração crônica de ouabaína também parece ativar vias cerebrais
envolvendo a endotelina-1, levando à hiperreatividade simpática e ao aumento da
pressão arterial. Resultados similares foram observados quando a ouabaína foi
administrada agudamente na área cinzenta periaquedutal; um aumento da pressão
arterial e da resistência vascular em órgãos como rins, intestino, músculo, pele e
baço foram observados, sendo ambos os parâmetros bloqueados por antagonistas
para o receptor ETA da endotelina-1 (D´Amico et al., 2003). Estes resultados
sugerem que na área cinzenta periaquedutal a ouabaína parece estimular a
liberação de endotelina-1, que através da ativação de receptores ETA contribui para
os efeitos hemodinâmicos observados após sua administração aguda ou crônica
(D´Amico et al., 2003; Di Filippo et al., 2003).
Sabendo-se que a administração aguda de ouabaína é capaz de induzir
vasoconstrição, alterar a reatividade vascular a agentes vasoconstritores e contribuir
assim para a elevação da pressão arterial em animais anestesiados, o grupo do Dr.
Vassallo e da Dra. Rossoni em conjunto com o grupo liderado pela Dra. Mercedes
Salaices, ambos dedicados aos efeitos vasculares da ouabaína, tem investigado se
a hipertensão induzida por ouabaína é acompanhada por mecanismos vasculares
periféricos.
Rossoni et al. (2002a), demonstraram que a hipertensão induzida pelo
tratamento com ouabaína por cinco semanas cursa com alterações na reatividade
vascular à fenilefrina e na atividade e expressão da bomba de sódio em aorta,
artéria mesentérica superior e artéria caudal de ratos. Em aorta e artéria mesentérica
superior de ratos hipertensos pelo tratamento com ouabaína foi observado uma
redução da resposta vasoconstritora à fenilefrina, enquanto em anéis de artéria
Introdução 54
caudal, nenhuma alteração foi encontrada (Rossoni et al., 2002a). Antes em 2000,
Cargnelli et al. já haviam demonstrado que o tratamento crônico com ouabaína
durante quatro semanas era acompanhando por uma redução da resposta contrátil
induzida por fenilefrina em aorta de ratos, embora estes autores não tenham
detectado mudanças na pressão arterial após tratamento com este digitálico. Já em
anéis de artéria renal, Kimura et al. (2000) demonstraram um aumento da resposta
contrátil à fenilefrina e ao cloreto de potássio seguido do tratamento crônico com
ouabaína. Em conjunto estes resultados sugerem que diferentes leitos vasculares
podem ser afetados de maneira distinta pelo tratamento crônico com ouabaína,
podendo ser este um mecanismo coadjuvante na gênese deste modelo de
hipertensão arterial.
As alterações de reatividade vascular seguidas do tratamento crônico com
ouabaína, observadas por Rossoni et al. (2002a), estavam associadas com aumento
da modulação negativa do endotélio sobre a resposta contrátil induzida por
estimulação alfa-adrenérgica. Este resultado baseia-se na observação de que, tanto
em aortas como em artérias mesentéricas superiores, a remoção do endotélio
igualou a resposta contrátil dos animais tratados com ouabaína àquela obtida nos
animais controles. Essa maior modulação endotelial parece resultar de uma maior
liberação de óxido nítrico, uma vez que a inibição da sintase de óxido nítrico
produziu os mesmo efeitos da remoção do endotélio sobre a resposta contrátil à
fenilefrina em ambos os grupos (Rossoni et al., 2002b). Reforçando estes últimos
resultados, foram encontrados aumentos da expressão protéica da isoforma
endotelial (eNOS) e neuronal da sintase de óxido nítrico (nNOS), nas artérias dos
animais tratados com ouabaína, nas quais a modulação do óxido nítrico sobre a
resposta da fenilefrina estava aumentada. Estes resultados, portanto, sugerem que o
tratamento crônico com ouabaína é capaz de alterar a reatividade vascular de
maneira distinta dependendo do leito arterial estudado.
Além das modificações da resposta contrátil em artérias de animais tratados
com ouabaína, Rossoni et al. (2002a) demonstraram alterações sobre a atividade e
expressão da Na+K+-ATPase vascular. Estas alterações eram distintas conforme o
leito vascular estudado: aumento da atividade e expressão da Na+K+-ATPase na
aorta, não alteração na artéria mesentérica e redução na artéria caudal. Estas
alterações sobre a Na+K+-ATPase poderiam estar colaborando para a redução da
resposta contrátil à fenilefrina, observada nos animais tratados com ouabaína, uma
Introdução 55
vez que uma maior atividade desta enzima poderia gerar hiperpolarização das
células musculares lisas e dessa maneira uma redução da contração em resposta a
agonistas vasoconstritores como a fenilefrina.
Recentemente, também se demonstrou que o tratamento crônico com
ouabaína altera a via do óxido nítrico derivado das terminações nitrérgicas
vasculares. Foi demonstrado que a vasoconstrição induzida por estímulos elétricos
apresenta-se reduzida em artérias mesentéricas superiores de ratos tratados com
ouabaína comparada ao seu controle normotenso. Este efeito parece resultar de
uma maior liberação de óxido nítrico das terminações nitrérgicas vasculares, uma
vez que esta redução da resposta contrátil foi abolida após tratamento com inibidor
não especifico da sintase de óxido nítrico, o L-NAME, ou com um inibidor seletivo
para a isoforma neuronal da sintase de óxido nítrico, o 7-NI. Reforçando a hipótese
de maior liberação de óxido nítrico neuronal nos animais tratados com ouabaína, foi
observado aumento da expressão da nNOS nas artérias mesentéricas superiores
destes animais (Xavier et al., 2004a).
Os estudos realizados até então (Rossoni et al., 2002a,b; Xavier et al.,
2004a), demonstravam, portanto, que a gênese da hipertensão induzida pelo
tratamento crônico com ouabaína, provavelmente não estava associada a
mecanismos vasculares periféricos. Pelo contrário, o tratamento com ouabaína
estava associado a mecanismos vasculares provavelmente compensatórios que
pareciam ser de contraposição ao quadro hipertensivo gerado pelo tratamento com
este digitálico.
Existem atualmente evidências que os glicosídeos cardiotônicos, dentre eles a
ouabaína, são capazes de promover o crescimento de miócitos cardíacos e
vasculares, e ainda que esse efeito pode ser alcançado com concentrações
semelhantes àquelas encontradas no plasma de mamíferos (Kometiani et al., 1998;
Aydemir-Koksoy et al., 2001). Aydemir-Koksoy et al. (2001) demonstraram em
células musculares lisas vasculares que concentrações nanomolares de ouabaína
são capazes de ativar a proteína cinase ativada por mitógenos 42/ 44 (MAPK 42/
44), a síntese de DNA e a proliferação de células musculares lisas vasculares. Além
disso, um aumento de moléculas de adesão do tipo VCAM-1 induzido por ouabaína
em células endoteliais de camundongos tem sido reportado, um efeito mediado pela
estimulação do fator nuclear κB (NF-κB) (Bereta et al., 1995). Os efeitos da
Introdução 56
ouabaína sobre vias intracelulares que regulam o crescimento celular e que
poderiam contribuir para o processo de remodelamento vascular na hipertensão
arterial têm sido investigados principalmente em cultivos celulares. Até o presente
não havia nenhum trabalho voltado para o estudo de possíveis alterações estruturais
da parede vascular seguidas da hipertensão induzida pelo tratamento crônico com
ouabaína.
É importante ressaltar que os estudos que têm se dedicado aos efeitos
vasculares da hipertensão induzida pela administração crônica de ouabaína, até
então publicados, utilizaram apenas vasos de condutância (Cargnelli et al., 2000;
Kimura et al., 2000; Rossoni et al., 2002a, b; Xavier et al., 2004a, c), onde os efeitos
desta hipertensão parecem comportar-se como mecanismos de contraposição ao
processo hipertensivo. Entretanto, isso não descartava a possibilidade de alterações
em vasos de resistência. Assim, sabendo-se da importância destes vasos no
controle da resistência vascular periférica, tanto através das propriedades funcionais
quanto estruturais, e ainda que a ouabaína, além de induzir hipertensão arterial,
pode influenciar ambos os parâmetros vasculares, foram utilizadas no presente
estudo abordagens experimentais para a elucidação dos mecanismos decorrentes
da hipertensão induzida por ouabaína em pequenas artérias de resistência.
OBJETIVOS
Objetivos 58
2. Objetivos 2.1. Objetivo geral
Diante do exposto anteriormente, o primeiro objetivo deste trabalho foi estudar
possíveis alterações na reatividade vascular induzida por estimulação alfa-
adrenérgica em pequenas artérias mesentéricas de resistência de ratos
cronicamente tratados com ouabaína e a participação dos diferentes fatores
endoteliais nesta resposta. O objetivo seguinte foi avaliar se a hipertensão induzida
pelo tratamento crônico com ouabaína cursa com alterações das propriedades
mecânicas e estruturais de artérias mesentéricas de resistência de rato.
O efeito do tratamento anti-hipertensivo sobre as alterações funcionais e
estruturais em artérias mesentéricas de resistência de ratos tratados com ouabaína,
foi analisado com o uso de um antagonista de receptores AT1 para a angiotensina II,
o losartan.
2.2. Objetivos específicos
- Avaliar se o tratamento com ouabaína altera a reatividade vascular de
pequenas artérias mesentéricas de resistência à noradrenalina;
- Averiguar uma possível modulação, por parte do endotélio, sobre os efeitos
crônicos da ouabaína nestas artérias, bem como estudar que possíveis fatores
endoteliais poderiam estar envolvidos;
- Avaliar se o tratamento crônico com a ouabaína altera a expressão protéica
da isoforma endotelial da sintase de óxido nítrico nas artérias acima citadas;
- Avaliar se o tratamento crônico com a ouabaína altera a atividade da Na+K+-
ATPase sensível à ouabaína nas artérias mesentéricas de resistência
- Investigar possíveis alterações nas propriedades mecânicas de artérias
mesentéricas de resistência de rato após o tratamento crônico com ouabaína;
- Avaliar possíveis alterações estruturais induzidas pelo tratamento crônico
com ouabaína sobre as diferentes células que compõem a parede vascular (células
adventiciais, células musculares e células endoteliais), assim como sobre a lâmina
elástica interna;
- Analisar se o tratamento crônico anti-hipertensivo com um antagonista de
receptores AT1 para a angiotensina II, o losartan, é capaz de prevenir as prováveis
Objetivos 59
alterações funcionais e/ ou estruturais seguidas da hipertensão induzida pelo
tratamento crônico com ouabaína.
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais e métodos 61
3. Materiais e Métodos
3.1. Animais experimentais
Neste estudo foram utilizados ratos Wistar machos, inicialmente com quarenta
e cinco dias de vida, fornecidos pelo biotério da Facultad de Medicina da
Universidad Autónoma de Madrid, Espanha. Pellets de liberação controlada de
ouabaína (0,5 mg/ pellet) ou placebo (Innovative Research of America, U.S.A.),
foram implantados subcutaneamente (Huang et al., 1994). Os pellets possuíam
capacidade de liberação constante de ouabaína (aproximadamente 8 µg/ dia) ou
placebo durante sessenta dias. Um segundo grupo de animais, além de receberem
pellets de liberação controlada de ouabaína ou placebo, recebeu tratamento oral
com um antagonista de receptores AT1 para a angiotensina II, o losartan (15 mg/ Kg/
dia) (Bravo et al., 2001). O losartan foi dissolvido na água de beber numa
concentração final calculada em função do peso corporal dos animais e do volume
diário de água consumido. O tratamento foi iniciado no mesmo período da
implantação dos pellets de ouabaína ou placebo. Sendo assim, os animais foram
divididos em quatro grupos experimentais: Controle, Ouabaína, Losartan e Ouabaína
+ Losartan.
3.2. Medida da pressão arterial
Com o intuito de avaliar a evolução dos níveis de pressão arterial nos
diferentes grupos experimentais, os valores de pressão arterial foram determinados,
semanalmente, durante as cinco semanas de tratamento. A pressão arterial sistólica
foi determinada, de maneira indireta, pela pletismografia de cauda (Letica, Digital
Pressure Meter, LE 5000, Barcelona, Espanha) (Buñag, 1973). As medidas de peso
corporal também foram realizadas semanalmente durante todo o período de
tratamento.
3.3. Metodologia empregada para estudo de reatividade vascular em artérias
mesentéricas de resistência
Para estudar a reatividade vascular em artérias mesentéricas de resistência,
foi utilizado o método descrito por Mulvany & Halpern (1977). Para isso, o leito
mesentérico foi removido, posto em uma placa de petri contendo solução de Krebs-
Materiais e métodos 62
Henseleit a 4º C (composição em mM: NaCl 118; KCl 4,7; NaHCO3 25; CaCl2.2H2O
2,5; KH2PO4 1,2; MgSO4.7H2O 1,2; EDTA 0,01 e glicose 11) e os quartos ramos da
artéria mesentérica superior foram dissecados e cortados em segmentos de 1,5 - 2,0
mm de comprimento com o auxílio de um microscópio de dissecção. Dois fios de
tungstênio (40 µm de diâmetro) foram inseridos no lúmen das artérias e montados
em um miógrafo para vasos resistência (Danish Myo Tech, Modelo 410A e 610M,
JP-Trading I/S, Aarhus, Dinamarca) para estudos de tensão isométrica. Um dos fios
estava acoplado a um transdutor de tensão e o outro a um micrômetro que permitia
o estiramento das artérias (Figura 6). Esse miógrafo estava conectado um sistema
para aquisição de dados (Powerlab/800 ADInstruments Pty Ltd, Castle Hill, Austrália)
e este a um computador (Macintosh).
Figura 6. Esquema mostrando os principais componentes da preparação para estudo com vasos de
resistência isolados, desenvolvido por Mulvany & Halpern (1977). A figura mostra duas placas de aço,
entre as quais um segmentos de até 2 mm de comprimento pode ser montado. Uma das placas está
conectada a um transdutor de força de alta sensibilidade e a segunda está conectada a um
micrômetro. A figura ampliada representa um vaso de resistência de aproximadamente 2 mm de
comprimento montada entre dois fios de 40 µm de diâmetro cada. Modificado de Angus & Wright,
(2000).
Materiais e métodos 63
3.3.1. Normalização das artérias de resistência e protocolos
experimentais
Após um período de estabilização de 30 minutos em solução de Krebs-
Henseleit, gaseificada com mistura carbogênica (95% de O2 e 5% de CO2, pH 7,4) e
mantida à temperatura de 37° C, as artérias foram estiradas a uma tensão de
repouso considerada ótima em relação ao seu diâmetro interno. Para isso, em cada
segmento arterial a relação tensão: diâmetro interno foi calculada e a circunferência
interna correspondente a uma pressão transmural de 100 mm Hg para um vaso
relaxado in situ (L100) foi determinada (Mulvany & Halpern, 1977). Para a realização
dos experimentos, as artérias foram mantidas com uma circunferência interna L1,
calculado como L1 = 0,90 x L100, circunferência na qual o desenvolvimento de força é
máximo (Mulvany & Halpern, 1977). O diâmetro luminar efetivo (l1) foi determinado
de acordo com a equação l1 = L1/π.
Depois do processo de normalização, as artérias foram submetidas a um
período de estabilização de 30 minutos e em seguida contraídas com cloreto de
potássio (KCl, 120 mM), para avaliar sua integridade funcional.
3.3.2. Avaliação da resposta de relaxamento dependente do endotélio e
da resposta vasoconstritora à noradrenalina Após um período de 30 minutos, seguido da contração induzida pelo KCl, as
artérias foram pré-contraídas com U46619 (um mimético do TxA2), até
aproximadamente 50 % da contração máxima produzida por 120 mM de KCl, e
curvas concentração-resposta à acetilcolina (0,01 nM - 30 µM) foram realizadas.
Uma hora depois, curvas concentração-resposta à noradrenalina (10 nM - 30 µM)
foram realizadas.
3.3.3. Modulação do endotélio sobre a resposta vasoconstritora à
noradrenalina
Com a finalidade de avaliar a capacidade de o endotélio modular a resposta
vasoconstritora à noradrenalina, em alguns experimentos o endotélio foi removido de
acordo com a metodologia descrita por Osol et al. (1989). Para isso, um fio de
cabelo humano era lavado com etanol e posteriormente em solução de Krebs. Antes
do processo de normalização da tensão de repouso de cada segmento arterial, o fio
Materiais e métodos 64
de cabelo era inserido no lúmen das artérias e movimentos de fricção contra a
parede arterial eram realizados. Após período de estabilização, 120 mM de KCl eram
administrados às preparações com a finalidade de avaliar a viabilidade arterial e
analisar uma possível lesão muscular após a remoção mecânica do endotélio.
Após 30 min da contração ao KCl, as preparações foram pré-contraídas com
U46619 (em uma concentração capaz de induzir aproximadamente 50 % da
contração máxima ao KCl 120 mM) e a ausência do endotélio foi comprovada pela
incapacidade da acetilcolina (30 µM) induzir relaxamento. Após a confirmação da
ausência do endotélio, as preparações eram lavadas e 60 minutos após o retorno à
tensão basal, curvas concentração-resposta à noradrenalina (10 nM - 30 µM) foram
realizadas.
3.3.4. Influência do bloqueio da síntese de óxido nítrico, de prostanóides
e de canais para potássio sobre a resposta vasoconstritora induzida por
noradrenalina.
A influência do óxido nítrico, de prostanóides derivados da via do ácido-
araquidônico-ciclooxigenase e do fator hiperpolarizante derivado do endotélio sobre
a resposta contrátil induzida por noradrenalina em artérias mesentéricas dos
diferentes grupos experimentais foi avaliada.
O efeito do óxido nítrico sobre a contração induzida por noradrenalina foi
avaliada através da utilização do Nω-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME, 100 µM),
um inibidor não seletivo da sintase de óxido nítrico. O Nω-Propil-L-arginina (NPLA, 10
nM), um inibidor seletivo para a isoforma neuronal da sintase de óxido nítrico (Zhang
et al., 1997), foi utilizado para avaliar o papel do óxido nítrico de origem neuronal
sobre a resposta contrátil induzida por noradrenalina.
Para estudar a influência de prostanóides da via do ácido-araquidônico-
ciclooxigenase na vasoconstrição induzida por noradrenalina, os segmentos arteriais
foram pré-incubados com um inibidor da ciclooxigenase, a indometacina (10 µM).
Em um outro grupo de experimentos, foi avaliada a influência do fator
hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) sobre a resposta contrátil induzida
por noradrenalina. Para isso, o efeito do tetraetilamônio (TEA, 2 mM), um bloqueador
de canais para potássio ativados por cálcio, foi avaliado em artérias mesentéricas de
resistência previamente incubadas com L-NAME (100 µM) mais indometacina (10
Materiais e métodos 65
µM). Para avaliar a dependência do endotélio sobre o efeito do TEA, a resposta à
noradrenalina foi analisada em segmentos sem endotélio e previamente incubados
com este bloqueador de canais para o potássio ativados por cálcio. A resposta à
noradrenalina em presença destes inibidores era realizada num mesmo segmento
arterial, uma hora depois da curva à noradrenalina na ausência destes fármacos.
3.3.5. Influência da atividade da Na+, K+-ATPase sobre a resposta
vasoconstritora induzida por noradrenalina.
A influência da atividade da Na+K+-ATPase sobre a resposta contrátil induzida
por noradrenalina em artérias mesentéricas de animais Controle e Ouabaína foi
analisada em segmentos incubados com ouabaína (100 µM).
Cada um dos fármacos citados acima era administrado 30 minutos antes do
início da segunda ou terceira (no caso do estudo da influência do EDHF) curva
concentração-resposta à noradrenalina. Curvas concentração-resposta à
noradrenalina na ausência desses fármacos também foram realizadas em paralelo
com o intuito de avaliar a estabilidade das preparações.
3.3.6. Efeito do tratamento crônico com ouabaína sobre a atividade da
Na+K+-ATPase sensível à ouabaína em artérias mesentéricas de resistência
Para este estudo foi utilizada a técnica de relaxamento induzido por potássio,
inicialmente descrita por Webb & Bohr (1978). Após 30 minutos de estabilização em
solução normal de Krebs-Henseileit, as preparações foram incubadas com solução
sem potássio durante 30 minutos. Em seguida os segmentos arteriais foram pré-
contraídos com noradrenalina, e, após atingir um platô, KCl (1, 2, 5 e 10 mM) foi
adicionado de maneira cumulativa em intervalos de 2 minutos e 30 segundos (Ponte
et al., 1999a; Rossoni et al., 2002a). Após esse procedimento, as preparações foram
incubadas com ouabaína (100 µM) durante 30 minutos, e a curva de relaxamento ao
potássio foi repetida.
Materiais e métodos 66
3.4. Western Blot
3.4.1. Expressão protéica da isoforma endotelial da sintase de óxido
nítrico
A expressão da isoforma endotelial da sintase de óxido nítrico (eNOS) foi
determinada através da técnica de Western Blot. Para isso, as artérias foram
homogeneizadas em solução tampão composta de: Tris (10 mM, pH=7,4), Lauril
sulfato de sódio (SDS, 1%) e Metavanadato de sódio (1 mM). Os homogeneizados
foram centrifugados a 500g por 10 minutos e a concentração de proteína foi medida
no sobrenadante pelo método de Bradford (1976).
3.4.1.1. Eletroforese e transferência das amostras
Alíquotas do homogeneizado (30 µg de proteína) foram diluídas em solução
de Laemmli (Uréia 0,5 mM; SDS 0,17 mM; DTT 39 µM; Tris-HCl pH=8 0,01 M e Azul
de bromofenol 0,5 %), mantidas à temperatura de 99° C durante 5 minutos e, em
seguida, aplicada no gel com SDS a 3% (Lauril Sulfato Sódico-poliacrilamida - SDS-
PAGE). As amostras foram submetidas a uma eletroforese com 7,5 % SDS-PAGE
em um sistema Mini-Protean II (BioRad) durante 2 horas, aplicando uma corrente
constante de 80 V (Power Pac 200, BioRad). O gel era composto de dois níveis,
Gel1 (7,5% de acrilamida) e Gel 2 (3% de acrilamida). Em um mesmo gel foram
aplicadas amostras de células endoteliais como controle positivo para a eNOS
(Transduction Laboratories, KY).
Após a eletroforese, as proteínas foram transferidas para uma membrana de
polivinil difluorida (PVDF, Transfer Membrane, Hybond P, Amersham Life Science),
previamente ativada com metanol. Para a transferência, o gel, a membrana e papel
Whatman foram colocados em um sistema de sanduíche e imersos em uma cuba
(Mini-Protean II, Módulo de Transferência, BioRad) contendo a solução de
transferência (Tris 25 mM; Glicina 190 mM; SDS 0,05 % e Metanol 20 %). O sistema
foi submetido a uma corrente de 230 mA durante 18 horas.
3.4.1.2. Incubação com os anticorpos e detecção das subunidades As membranas foram incubadas durante 60 minutos, à temperatura ambiente,
com uma solução bloqueante (leite desnatado 5 %, soroalbumina bovina 5 %, Tris-
25 mM, NaCl 137 mM e Tween 20 0,2 %) para evitar a união não específica com
reativos não imunológicos. Em seguida estas mesmas membranas foram incubadas
Materiais e métodos 67
durante 90 min, sob agitação com solução bloqueante contendo o anticorpo primário
para a eNOS, com diluição de 1:2500. O anticorpo primário era monoclonal contra a
isoforma eNOS (Transduction Laboratories, KY). Depois disto, as membranas foram
lavadas com solução de TBS-T (Tris 10 mM, NaCl 100 mM e Tween 20 0,1 %) por
30 minutos, sob agitação. Posteriormente, foram incubadas com anticorpo
secundário (Transduction Laboratories, UK), Imunoglobulina IgG Anti-camundongo
unida a peroxidase de coelho para a eNOS, em solução bloqueante (diluição
1:2000), por 90 minutos, à temperatura ambiente e sob agitação. A proteína
correspondente a eNOS foi detectada por uma reação de quimiluminescência,
utilizando um sistema de detecção (ECL Plus, Amersham Life Science) incubando as
membranas por 5 minutos. As membranas foram colocadas em contato com um
filme fotográfico (Hyperfilm, Amersham Life Science), e as bandas impregnadas
posteriormente reveladas. As bandas das proteínas foram quantificadas mediante
análise densitométrica. Para tal, os filmes com as bandas protéicas impregnadas
foram gravados por um scanner conectado a um computador. Para análise das
bandas, foi utilizado o programa FotoLook 2.05 e a quantificação da área e da
densidade das bandas foi feita através de um programa de análise de imagens (NIH
Image 1.61).
3.5. Metodologia utilizada para o estudo das propriedades mecânicas e
estruturais de artérias mesentéricas de resistência de rato.
Para esse estudo o leito mesentérico foi removido e colocado em uma placa
de Petri contendo solução de Krebs Henseleit a 4º C e o terceiro ramo da artéria
mesentérica superior foi dessecado e limpo de tecido de adiposo.
3.5.1. Miógrafo de pressão
As propriedades mecânicas e estruturais das artérias mesentéricas de
resistência foram estudadas pela técnica de artérias pressurizadas, de acordo com o
método descrito inicialmente por Halpern et al., (1978). Segmentos de
aproximadamente 2 mm do terceiro ramo da artéria mesentérica superior foram
montados em um miógrafo de pressão (Danish Myo Tech, Modelo P100, J.P.
Trading I/S, Aarhus, Dinamarca). As duas extremidades das artérias foram
canuladas com micropipetas de vidro e amarradas com fio de sutura de nylon. Em
seguida o comprimento da artéria foi ajustado aumentando a pressão intraluminar
Materiais e métodos 68
até aproximadamente 140 mm Hg, de maneira que as paredes arteriais estivessem
paralelas e sem estiramento (Figura 7). Com esse procedimento era possível
verificar também se a artéria estava adequadamente pressurizada. A pressão foi
ajustada para 70 mm Hg e sob este valor de pressão foi aguardado um período de
estabilização de 60 minutos, em solução de Krebs-Henseleit, gaseificada com
mistura carbogênica e mantida a temperatura de 37º C.
100 µm100 µm Figura 7. Foto representativa de uma artéria mesentérica de resistência (Terceiro ramo da artéria
mesentérica superior) pressurizada a 70 mm Hg.
Após o período de estabilização, a pressão intraluminar foi reduzida a 3 mm
Hg; uma curva de pressão foi realizada aumentando a pressão intraluminar de 3 a
140 mm Hg, em aumentos de 20 mm Hg e intervalos de 5 minutos. Esta curva foi
realizada em solução de Krebs-Henseleit na presença e na ausência de cálcio
(Ca2+). A solução de Krebs-Henseleit sem Ca2+ foi preparada omitindo o CaCl2 e
adicionando EGTA 10 mM. Para cada valor de pressão intraluminar, ao final dos 5
minutos, o diâmetro interno (Di) e externo (De) foram medidos. Ao final de cada
experimento, a pressão intraluminar era reduzida a 70 mm Hg em solução sem
cálcio e a artéria era fixada com solução de paraformaldeído 4 % (PFA, em 0,2 M de
tampão fosfato, pH=7,4) a 37° C durante 60 min. As artérias eram mantidas em
solução de paraformaldeído (4 %) e guardadas na geladeira até a realização dos
estudos de microscopia confocal.
3.5.1.1. Cálculos das propriedades mecânicas e estruturais das artérias
mesentéricas de resistência
As medidas de diâmetro interno e externo (Di e De) utilizadas para o cálculo
dos parâmetros estruturais e mecânicos arteriais foram realizadas em condições
Materiais e métodos 69
passivas (em solução de Krebs sem cálcio, 0Ca). Os seguintes parâmetros
estruturais e mecânicos foram calculados:
1. Espessura da Parede (EP)
2. Área de Secção Transversal (AST)
3. Relação Parede/ Lúmen (P/ L)
As propriedades mecânicas das artérias foram calculadas de acordo o
método inicialmente descrito por Baumbach & Heistad (1989).
4. Distensibilidade arterial
A distensibilidade representa a porcentagem de mudança do diâmetro arterial
interno para cada valor de pressão intraluminar.
5. Strain (ε). Representa a variação nas dimensões da artéria (deformação, ε) em
conseqüência de uma dada tensão aplicada.
EP = (De0Ca – Di0Ca)
2
AST = x (De0Ca – Di0Ca) 4
π
P/ L = (De0Ca – Di0Ca)
(2 x Di0Ca)
(∆ Di0Ca) x 100
(∆ Di0Ca x ∆P)
Materiais e métodos 70
Onde: D00Ca é o diâmetro a 3 mm Hg e Di0Ca é o diâmetro interno observado para um
dado valor de pressão intraluminar sob condições de completo relaxamento. O valor
de D00Ca foi medido a 3 mm Hg porque é difícil determinar o diâmetro interno a
valores inferiores de pressão intraluminar.
6. Stress de parede (σ) – Tensão (medida por unidade de área) produzida na parede
arterial frente a alterações da pressão intraluminar, do diâmetro interno e da
espessura da parede.
Onde: P é a pressão intraluminar (1 mm Hg = 133,4 N/ m2) e EP é a espessura da
parede arterial para cada valor de pressão intraluminar em solução de Krebs sem
Ca2+.
7. A rigidez arterial independente da geometria é determinada pelo módulo elástico
de Young, o qual pode ser expresso pela relação entre tensão e deformação (E =
Stress/ Strain). No caso de vasos sanguíneos esta relação stress-strain exibe um
comportamento curvilíneo. Assim, torna-se mais apropriado o cálculo da relação
tangencial ou incremental elastic modulus (EInc), o qual pode ser determinado pela
inclinação (β) da curva stress-strain (Dobrin, 1978).
EInc = δσ/δε
O EInc foi calculado plotando os dados obtidos de stress e de strain para cada
experimento utilizando a equação exponencial abaixo (SigmaPlot, SPSS Inc):
σ = σorig eβε
(Di0Ca – D00Ca ) ε =
D00Ca
σ = (P x Di0Ca)
(2EP)
Materiais e métodos 71
Onde: σorig representa o stress de parede para o valor inicial de diâmetro (diâmetro a
3 mmHg). De acordo com a derivação das equações acima é possível obter-se que
EInc = βσ. Para um dado valor de σ, EInc é diretamente proporcional a β. Um aumento
de β implica um aumento de EInc, o qual representa um aumento da rigidez (Dobrin,
1978).
3.5.2. Microscopia confocal
A análise morfométrica dos componentes da parede vascular através de
microscopia confocal foi realizada de acordo com o método descrito por Briones et
al. (2003).
Os segmentos arteriais previamente fixados com paraformaldeído (4 %) a 70
mm Hg foram incubadas durante 15 min, ao abrigo da luz, com um corante nuclear,
o Hoechst 33342 (0,01 mg/ ml). As artérias foram colocadas em lâminas e cobertas
com uma lamínula. As artérias eram montadas em um meio de imersão Fluoroguard
(Glycerol:antifade, Biorad) em uma pequena câmara feita com fita adesiva de
maneira a evitar a compressão da artéria, e conseqüentemente a alteração da forma
da mesma. A artéria foi visualizada através de um microscópio confocal Leica TCS
SP2 adaptado a um microscópio invertido e uma fonte de laser (Argon e Helio-Neon
Laser Sources).
3.5.2.1. Análise morfométrica dos componentes celulares da parede
vascular
Secções ópticas seriadas (stacks de imagens) da camada adventícia ao
lúmen do vaso (z step = 0,5 µm) foram capturadas com uma objetiva de imersão em
óleo (NA 1,3), aumento de 63x. A coloração dos núcleos (Hoechst) foi visualizada
usando um comprimento de onda do microscópio confocal: 351 e 364 nm para
excitação e detecção a 400 - 500 nm. Um mínimo de duas séries de imagens das
diferentes regiões da artéria foram capturadas em cada segmento arterial analisado.
Todas as imagens foram capturadas sob as mesmas condições de intensidade do
laser, brilho e contraste.
Cada camada que compõem a parede vascular: a adventícia, a média e a
íntima, puderam ser identificadas e quantificadas de acordo com a forma e
orientação que possui os núcleos celulares destas diferentes camadas, os quais são
claramente identificados através da microscopia confocal. (Figura 8).
Materiais e métodos 72
O início e/ ou término de cada camada foi baseado na medida da intensidade
de fluorescência dos núcleos celulares realizada com um software para análise de
imagens (MetaMorph Image Analysis Software, Universal Imaging Corporation).
Assim, a primeira imagem da adventícia em uma série foi considerada como sendo o
primeiro núcleo adventicial na sua máxima intensidade de fluorescência. De maneira
similar, o primeiro núcleo da camada média foi determinado. O último plano da
camada íntima foi considerado como sendo o último núcleo endotelial na sua
máxima intensidade de fluorescência. Em cada segmento arterial, o número de
núcleos das diferentes camadas da parede vascular foi determinado (MetaMorph
Image Analysis Software, Universal Imaging Corporation). Para cada série de
imagens obtida, um mínimo de duas medidas, para os diferentes parâmetros
analisados, foram realizadas.
Materiais e métodos 73
A B
C
Figura 8. Secções ópticas obtidas através de microscopia confocal dos diferentes componentes
celulares da parede vascular de artérias mesentéricas de resistência pressurizadas a 70 mm Hg e
fixadas com paraformaldeído 4 %. A foto mostra os núcleos (ver setas) das células adventiciais (A),
musculares lisas (B) e endoteliais (C) coradas em azul com o corante Hoechst 33342. As imagens
foram capturadas com uma objetiva de 63x. Dimensões da imagen 238 x 238 µm.
Materiais e métodos 74
Para permitir uma comparação entre os segmentos arteriais dos diferentes
grupos experimentais e assim avaliar possíveis alterações estruturais nestas
artérias, os seguintes cálculos foram realizados com base em segmentos de 1 mm
de comprimento:
1. Volume da parede arterial (em mm3), da camada média e adventícia.
Volume = ASTP x 1 mm
Onde: ASTP corresponde à área de secção transversal da parede vascular (em
mm2), calculada seguindo a equação:
ASTP = ASTexterna - ASTinterna
Onde:
e
Para o cálculo do volume da camada média e adventícia, foi utilizada a
equação acima, utilizando a área de secção transversal (AST), correspondente de
camada.
2. Superfície luminar calculada a partir do diâmetro da artéria em mm2.
3. Número total de células (adventiciais, musculares e endoteliais) calculadas com
base na superfície luminar de um vaso de 1 mm de comprimento.
x 2 2
ASTexterna = (Di0Ca + EP)
π
x 2 2
ASTinterna = Di0Ca
π
2
Di0Ca 2π Superfície luminar =
Materiais e métodos 75
No de células = No de células/ área (mm2) x Superfície luminar
As análises morfométricas dos núcleos das células musculares lisas e
endoteliais foram analisados com uso do MetaMorph Image Analysis Software
(Universal Imaging Corporation). Os parâmetros analisados destes dois tipos
celulares foram: Área total (µm2), Comprimento (µm), Largura (µm), Shape factor e
Eliptical shape factor. Como as células adventiciais possuem uma forma bastante
variável mesmo em condições fisiológicas, a análise morfométrica destas células
não foi realizada.
3.5.2.2. Estudo do conteúdo e organização da elastina
A elastina possui propriedades de auto-fluorescência; quando excitada a 488
nm, emite fluorescência que pode ser detectada a um comprimento de onda de 500 -
560 nm (Wong & Langille, 1996; Boumaza et al., 2001).
Secções ópticas seriadas (stacks de imagens) da camada adventícia ao
lúmen do vaso (z step = 0,5 µm) foram capturadas com uma objetiva de imersão em
óleo (NA 1,3), aumento de 63x usando um comprimento de onda de 488 nm do
microscópio confocal. Um mínimo de duas séries de imagens de diferentes regiões
da artéria foram capturadas em cada segmento arterial analisado. Todas as imagens
foram capturadas sob as mesmas condições de intensidade do laser, brilho e
contraste.
Para cada grupo de imagens seriadas, projeções individuais da adventícia,
lâmina elástica externa (LEE) e interna (LEI) foram obtidas e a espessura da LEI foi
medida. Uma análise quantitativa da intensidade de fluorescência (média da
intensidade de fluorescência por pixel) e tamanho das fenestras da lâmina elástica
interna foi realizada com o MetaMorph Image Analysis Software (Universal Imaging
Corporation). Para isso, foi feita uma reconstrução tridimensional da LEI com o uso
do programa MetaMorph (Figura 9). Para cada série de imagens obtida, um mínimo
de cinco medidas foram realizadas para cada um dos parâmetros avaliados.
Sabendo-se que a concentração de elastina tem uma relação linear com a
intensidade de fluorescência (Blomfield & Farrar, 1969), foi assumido que o sinal de
fluorescência em uma determinada projeção era diretamente proporcional à
concentração de elastina em um dado pixel. A quantidade de elastina na LEI,
considerando a média da intensidade de fluorescência por pixel, a espessura da LEI
Materiais e métodos 76
e a superfície luminar ocupada pela LEI foram estimadas considerando um
segmento arterial de 1 mm de comprimento.
As projeções tridimensionalmente reconstruídas da LEI foram segmentadas e
imagens binárias foram obtidas. Nessas imagens, a área relativa ocupada pela
elastina versus às fenestrações, assim como o número e o tamanho das fenestras
foram medidos. O volume ocupado pela LEI (incluindo elastina e fenestras) foi
calculado em cada artéria considerando a superfície luminar de um segmento de 1
mm de comprimento e a espessura da LEI.
Figura 9. Reconstrução tridimensional das secções ópticas obtidas através de microscopia confocal
da lâmina elástica interna (LEI) da parede vascular de artérias mesentéricas de resistência
pressurizadas a 70 mm Hg e fixadas com paraformaldeído 4 %. A imagem mostra a elastina
representada em verde e suas diversas fenestrações (setas).
3.6. Determinação de colágeno na parede arterial O conteúdo de colágeno na parede arterial foi determinado de acordo com o
método previamente descrito por Izzard et al. (2003). Os terceiros ramos da artéria
mesentérica superior foram dissecados, limpos de tecido adiposo, fixados em
paraformaldeído 4 % e lavados em tampão fosfato (pH 7,4). Após lavagem, os
segmentos foram incubados durante 1 hora em tampão fosfato contendo sacarose
30%. Em seguida os segmentos foram colocados em um molde para criostato
contendo meio para congelamento (Tissue-Tek OCT, Bayer, Química Farmacéutica;
Barcelona, Espanha). As artérias foram congeladas em nitrogênio líquido e foram
20 µm
Materiais e métodos 77
mantidas congeladas a –70° C até o dia dos experimentos. Os segmentos arteriais
congelados foram cortados em secções transversais de 10 µm de espessura, postos
em uma lâmina revestida com gelatina (Gelatina 3%; Cromo alumbre de potássio 0,3
%) e secos a temperatura ambiente durante 1 hora. Depois de retirada do meio de
congelamento (Tissue-Tek OCT) com água destilada, o colágeno foi corado sob
agitação com picro sirius (0,1 % em água) (Picro Sirius F3B em solução saturada de
ácido pícrico) (Aldrich Chemical Company, Inc., Espanha). As imagens foram
captadas através de um microscópio de fluorescência (Nikon Eclipse TE 2000-S,
objetiva de 40x) usando uma câmera digital (Nikon DXM 1200F). A análise da área
total da parede vascular e daquela ocupada pelo colágeno foi realizada com o uso
do software Image-Pro Plus 4.0 para análise de imagens.
3.7. Expressão dos resultados e análises estatísticas
Os resultados estão apresentados como média ± erro padrão da média. Os
valores de “n” representam o número de animais utilizados em cada protocolo
experimental.
A resposta vasoconstritora induzida por noradrenalina foi normalizada em
função da resposta máxima de contração induzida por 120 mM de KCl, que foi
considerada como 100% da resposta contrátil do músculo. A partir deste valor, as
respostas contráteis à noradrenalina foram normalizadas. Os resultados das
respostas de relaxamento induzido pela acetilcolina estão expressos como
porcentagem de relaxamento. A resposta de relaxamento ao potássio foi expressa
como a porcentagem de contração residual à noradrenalina. Para cada curva-
concentração-resposta a acetilcolina e noradrenalina foram calculados os valores de
pD2 (-log. EC50) e resposta máxima (Rmax). Para isso, foi realizada uma análise de
regressão não-linear, obtida através da análise das curvas concentração-resposta a
esses agonistas, utilizando o GraphPad Prism Software (San Diego, CA, U.S.A.).
Com a finalidade de comparar a magnitude de efeito dos fármacos ou da
remoção do endotélio sobre a resposta contrátil à noradrenalina em artérias dos
diferentes grupos estudados, alguns resultados estão expressos como diferença da
área abaixo da curva (dAUC) de concentração-resposta à noradrenalina em situação
controle (sem fármacos) e experimental (com inibidores ou em segmentos sem
endotélio). A AUC foi calculada para cada curva concentração-resposta e a diferença
está expressa como porcentagem da diferença da AUC (dAUC) da curva controle
Materiais e métodos 78
correspondente (GraphPad Prism Software, San Diego, CA, E.U.A). Resultados da
expressão da eNOS estão expressos como a relação entre a densidade óptica para
eNOS em relação à α-actina.
A determinação da quantidade de colágeno na parede vascular está
representada pela relação entre área ocupada pelo colágeno e a área total da
parede arterial.
A análise estatística dos resultados foi realizada por teste t, pareado e/ ou não
pareado, e análise de variância (ANOVA), duas vias, medidas repetidas ou
completamente randomizada. Quando a ANOVA apresentava significância
estatística o teste post-hoc de Bonferroni era realizado (GraphPad Prism Software,
San Diego, CA, E.U.A). Os resultados foram considerados estatisticamente
significantes para valores de P<0,05.
3.8. Fármacos e reagentes a utilizados
-2-Hidroxietilmercaptano (β-mercaptoetanol) (Sigma)
-3`, 3”, 5`, 5”-Tetrabromofenolsulfoneftaleína, sal sódico (Azul de Bromofenol)
(Sigma)
-Acetilcolina, cloridrato (Sigma)
-Ácido acético glacial (Probus)
-Ácido aminoacético (Glicina) (Sigma)
-Ácido Etilenodiaminotetracético (EDTA) (Sigma)
-Ácido hidroxietilpiperazina etanosulfônico (HEPES) (Sigma)
-Albumina bovina (Sigma)
-Anticorpo de camundongo anti-eNOS (Anti-eNOS) (Transduction Laboratories)
-Anti-imunoglobulina G de camundongo (Transduction Laboratories)
-Azul brilhante de Coomassie G (BioRad)
-Azul brilhante de Coomassie R (Sigma)
-Bicarbonato de sódio (Pancreac)
-Cloreto de cálcio (Pancreac)
-Cloreto de potássio (Pancreac)
-Cloreto de sódio (Pancreac)
-Controle positivo para eNOS (Células endoteliais) (Transduction Laboratories)
-Controle, pellets (Innovative Research of America)
Materiais e métodos 79
-Corante nuclear Hoechst 33342 (Hoescht)
-Cromo alumbre de potássio
-DL-Ditiotreitol (DTT) (Sigma)
-Etanol absoluto (Probus)
-Éter sulfúrico (Pancreac)
-Fosfato de potássio (Pancreac)
-Fosfato de sódio (Merck)
-Gelatina
-Glicerol (Sigma)
-Glicose (Merck)
-Lauril sulfato sódico (SDS) (BioRad)
-Leite desnatado (Asturiana)
-l-Fenilefrina, hidrocloridrato (Sigma)
-Losartan (Merck)
-Metanol (Merck)
-Meio de congelamento de tecidos para criostomia Tissue-Tek OCT (Bayer)
-Meio de imersão Fluoroguard, Glycerol: antifade (Biorad)
-N, N, N`, N`-Tetrametil-etilenodiamina (Temed) (Sigma)
-N, N`-Metilenbisacrilamida 40% Solução 37, 5:1 (Acrilamida) (BioRad)
-N(W)-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), dicloridrato (Sigma)
-Ouabaína, octahidrato (Sigma)
-Ouabaína, pellets (Innovative Research of America)
-Paraformaldeído (Merck)
-Persulfato Amônico (APS) (Sigma)
-Picro Sirius F3B em solução saturada de ácido pícrico (Aldrich Chemical Company)
-Polioxietileno sorbitam monolaurato (Tween 20) (BioRad)
-Reagente para detecção de Western Blot (ECL plus) (Amersham Life Science,
Pharmacia biotech)
-Sacarose (Merck)
-Sulfato de magnésio heptahidratado (Merck)
-Tetraetilamônio, cloridrato (Sigma)
-Tris (hidroximetil)-aminometano (Tris) (BioRad)
-Uréia (Sigma)
Materiais e métodos 80
Todas as soluções concentradas (10-1 e 10-2 M) foram dissolvidas em água
deionizada e mantidas no congelador a –20° C. Somente a indometacina foi
dissolvida em uma solução de bicarbonato de sódio 1,5 mM.
RESULTADOS
Resultados 82
4. Resultados 4.1. Valores de pressão arterial sistólica e massa corporal
A partir da primeira semana após a implantação do pellet contendo ouabaína,
os animais apresentaram um aumento significativo da pressão arterial sistólica
comparado com aqueles que receberam o pellet contendo placebo (Figura 10). Ao
longo do tratamento a pressão arterial dos animais tratados com ouabaína aumentou
progressivamente até a quinta semana de tratamento, enquanto que a pressão
arterial dos animais controle permaneceu estável ao longo destas cinco semanas
(Figura 10).
A administração de losartan (15 mg/ Kg/ dia, v.o.) já a partir da primeira
semana de tratamento reduziu a pressão arterial sistólica nos animais Controle e
Ouabaína, impedindo nestes últimos o desenvolvimento de hipertensão (Figura 10).
Nestes animais, a partir da segunda semana de tratamento os valores de pressão
arterial se mantiveram estáveis até a quinta semana de tratamento, porém reduzidos
em relação à pressão arterial dos animais Controle, não havendo diferenças
significativas entre os grupos Losartan e Ouabaína + Losartan (Figura 10).
Os valores de massa corporal dos quatro grupos experimentais foram
semelhantes ao final das cinco semanas de tratamento (Controle: 324 ± 12 g;
Ouabaína: 335 ± 15 g; Losartan: 343 ± 29 g e Ouabaína + Losartan: 326 ± 28 g,
ANOVA: P>0,05).
4.2. Respostas vasculares ao KCl, a acetilcolina e à noradrenalina em artérias
mesentéricas de resistência
O diâmetro luminar efetivo das artérias mesentéricas de quarta ordem de
ratos Ouabaína apresentou-se significativamente reduzido quando comparado ao
grupo Controle. O tratamento com losartan não modificou significativamente o
diâmetro luminar nas artérias de animais que receberam pellets placebo, porém
normalizou este parâmetro nos animais tratados com ouabaína (Controle: 217 ± 2,58
µm vs. Ouabaína: 205 ± 2,33 µm, ANOVA (uma via), P<0,05; Losartan: 224 ± 3,37
µm vs. Ouabaína + Losartan: 221 ± 3,28 µm, ANOVA (uma via), P>0,05).
Resultados 83
0 1 2 3 4 5
90
110
130
150
170
190
**# *# *# *#
ControleOuabaínaLosartanOuabaína + Losartan
*+*+ *+
*+ *+
Tempo (semanas)
PAS
(mm
Hg)
Figura 10. Evolução temporal dos valores de pressão arterial sistólica (PAS) medidos através de
pletismografia de cauda em ratos Controle (n = 17), Ouabaína (n = 23), Losartan (n = 8) e Ouabaína +
Losartan (n = 8) durante cinco semanas. Os resultados estão expressos como média ± erro padrão
da média.
ANOVA: *P<0,05 vs. semana 0.
ANOVA: +P<0,05 Ouabaína vs. Controle; #P<0,05 Losartan ou Ouabaína + Losartan vs. Controle.
Resultados 84
Na Tabela 1 estão representados os valores de contração induzida por 120
mM de KCl. Como é possível observar, o KCl induziu contração de similar magnitude
nos segmentos arteriais dos quatro grupos experimentais utilizados neste estudo.
A retirada mecânica do endotélio não modificou significativamente a resposta
contrátil induzida pelo KCl (Tabela 1). Da mesma forma que para os segmentos com
endotélio intacto, a resposta ao KCl nos anéis sem endotélio foi semelhante entre os
diferentes grupos experimentais (Tabela 1).
Tabela 1. Valores de contração (mN/ mm) induzida por 120 mM de KCl em artérias
mesentéricas de resistência com (E+) e sem (E-) endotélio de ratos Controle (n =
15), Ouabaína (n = 14), Losartan (n = 8) e Ouabaína + Losartan (n = 8).
Controle
Ouabaína
Losartan
Ouabaína + Losartan
E+ 3,25 ± 0,18 3,23 ± 0,14 3,39 ± 0,07 3,31 ± 0,09
E- 3,19 ± 0,17 3,00 ± 0,47 3,84 ± 0,46 3,39 ± 0,11
Os resultados estão expressos como média ± erro padrão da média. ANOVA:
P>0,05
Como mostrado na Figura 11 a administração de acetilcolina induziu
relaxamento concentração-dependente nas artérias mesentéricas de resistência pré-
contraídas com U46619. Como é possível observar na Figura 11A e Tabela 2, a
resposta máxima e a sensibilidade a acetilcolina foram de similar magnitude nas
artérias do grupo Ouabaína comparados ao grupo Controle. A resposta de
relaxamento dependente do endotélio induzida por acetilcolina não foi modificada
pelo tratamento crônico com losartan (Figura 11B e Tabela 2).
A administração de noradrenalina aumentou, de maneira concentração-
dependente, o tônus basal dos anéis de artérias mesentéricas isolados de animais
Controle e Ouabaína (Figura 12A). Nestes grupos, tanto a resposta máxima como a
sensibilidade a este agonista alfa 1-adrenérgico foram de similar magnitude (Figura
12A e Tabela 2). Esta resposta permaneceu inalterada nas artérias mesentéricas de
Resultados 85
resistência dos animais submetidos ao tratamento crônico com Losartan ou
Ouabaína + Losartan (Figura 12B e Tabela 2).
4.2.1. Modulação do endotélio sobre a resposta vasoconstritora à
noradrenalina
A remoção mecânica do endotélio induziu um significativo aumento da
sensibilidade à noradrenalina, sem alteração da resposta máxima, em artérias de
ratos Controles e Ouabaína, tratados ou não com Losartan (Figura 13 e Tabela 2).
Como evidenciado através dos valores de dAUC (Figura 13E), esse aumento foi de
similar magnitude nos quatro grupos experimentais estudados (Controle, Ouabaína,
Losartan e Ouabaína + Losartan).
Resultados 86
A
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
25
50
75
100
ControleOuabaína
Acetilcolina, log M
Rel
axam
ento
(%)
B
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
25
50
75
100
LosartanOuabaína+ Losartan
Acetilcolina, log M
Rel
axam
ento
(%)
Figura 11. Relaxamento dependente do endotélio induzido por acetilcolina em artérias mesentéricas
de resistência (4o ramo da artéria mesentérica superior) pré-contraídas com U46619. A. Grupos
Controle (n = 15) e Ouabaína (n = 14); B. Grupos Losartan e Ouabaína + Losartan, n = 8 em cada
grupo. Os resultados estão expressos como média ± erro padrão da média. ANOVA: P>0,05.
Resultados 87
A
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 ControleOuabaína
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
B
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 LosartanOuabaína + Losartan
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
Figura 12. Respostas contráteis induzida por noradrenalina, em artérias mesentéricas de resistência
de ratos Controle (n = 7), Ouabaína (n = 7) (A), Losartan (n = 8) e Ouabaína + Losartan (n = 8) (B).
Os resultados (média ± erro padrão da média) estão expressos como porcentagem da contração
induzida por 120 mM de KCl. ANOVA: P>0,05.
Resultados 88
A B
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 Conrole (E+)Controle (E-)
P<0,05
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 Ouabaína (E+)Ouabaína (E-)
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
P<0,05
E
C D
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 Losartan (E+)Losartan (E-)
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
P<0,05
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 Ouabaína + Losartan (E+)Ouabaína + Losartan (E-)
P<0,05
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
Figura 13. Efeito da remoção mecânica do endotélio sobre a resposta contrátil induzida por
noradrenalina, em artérias mesentéricas de resistência de ratos Controle (A, n = 7), Ouabaína (B, n =
7), Losartan (C, n = 8) e Ouabaína + Losartan (D, n = 8). E. Diferença percentual da área abaixo da
curva de concentração-resposta à noradrenalina (dAUC) em artérias mesentéricas dos quatro grupos
experimentais. Os resultados (média ± erro padrão da média) estão expressos como porcentagem da
contração induzida por 120 mM de KCl. Os valores de P indicam a significância estatística entre as
duas situações experimentais (Com (E+) e sem (E-) endotélio) pela ANOVA.
0
25
50
75
100 ControleOuabaínaLosartanOuabaína + Losartan
dAUC
(%)
Resultados 89
Tabela 2. Valores de pD2 e resposta máxima (Rmax, % de contração ou de
relaxamento) obtidos através de curvas concentração-resposta à noradrenalina, na
presença (E+) e ausência (E-) do endotélio, e a acetilcolina em artérias mesentéricas
de resistência de ratos Controle (n = 7), Ouabaína (n = 7), Losartan (n = 8) e
Ouabaína + Losartan (n = 8).
pD2 Rmax (%)
Acetilcolina Controle 7,40 ± 0,03 96,3 ± 1,38
Ouabaína 7,39 ± 0,04 94,7 ± 1,38
Losartan 7,60 ± 0,06 97,0 ± 2,12
Ouabaína + Losartan 7,51 ± 0,06 97,4 ± 2,37
Noradrenalina
E+
Controle 5,93 ± 0,04 121 ± 2,00
Ouabaína 5,98 ± 0,03 128 ± 3,00
Losartan 6,07 ± 0,02 114 ± 1,00
Ouabaína + Losartan 6,00 ± 0,02 114 ± 2,00
E- Controle 6,58 ± 0,08 * 122 ± 3,00
Ouabaína 6,42 ± 0,08 * 129 ± 7,00
Losartan 6,60 ± 0,03 * 115 ± 2,00
Ouabaína + Losartan 6,56 ± 0,10 * 117 ± 3,00
Os valores estão expressos como média ± erro padrão da média. ANOVA: *P<0,05
vs. E+
Resultados 90
4.2.2. Efeito do bloqueio da síntese de óxido nítrico e de prostanóides
sobre a resposta vasoconstritora induzida por noradrenalina
Para analisar o papel do óxido nítrico sobre a resposta vasoconstritora à
noradrenalina em artérias mesentéricas de resistência dos diferentes grupos
experimentais, segmentos arteriais com endotélio intacto foram pré-incubados com
um inibidor não-seletivo da sintase de óxido nítrico, o L-NAME (100 µM). O L-NAME
induziu um aumento da sensibilidade e da resposta máxima à noradrenalina nas
artérias mesentéricas isoladas de animais Ouabaína e um aumento somente de
sensibilidade nas artérias de animais Controle (Tabela 3; Figuras 14A e 14B). Como
evidenciado pelos valores de dAUC o efeito da inibição da síntese de óxido nítrico
com L-NAME foi maior no grupo Ouabaína comparado ao grupo Controle (Figura
14E). No grupo de animais tratados com losartan, a preincubação dos segmentos
arteriais com L-NAME (100 µM) induziu uma resposta similar àquela observada nos
animais não-tratados com esse antagonista dos receptores AT1 (Figura 14C e D), ou
seja o efeito potencializador do L-NAME sobre curva concentração-resposta à
noradrenalina foi de maior magnitude nos animais que receberam ouabaína (ver
dAUC, Figura 14E).
Em artérias mesentéricas de resistência de ratos Controle, a análise de dAUC
mostrou que o aumento da resposta contrátil à noradrenalina foi maior após remoção
do endotélio (46,7 ± 6,5 %) quando comparada àquela obtida após incubação com L-
NAME (25,2 ± 4,2 %, P<0,05). Entretanto, em segmentos de ratos Ouabaína a
potencialização da resposta à noradrenalina após remoção endotelial (37,3 ± 3,7 %)
ou tratamento com L-NAME (46,6 ± 6,1 %, P>0,05) foi similar. Com relação ao
aumento da dAUC após remoção do endotélio e após incubação com L-NAME, o
mesmo padrão de resposta comparado aos animais não-tratados com losartan, foi
observado, ou seja, nos animais Losartan o aumento da dAUC induzido pela
remoção do endotélio (37,5 ± 4,50 %) foi maior que a observada após tratamento
com L-NAME (19,2 ± 3,46 %, P<0,05). No grupo Ouabaína + Losartan, o aumento
da dAUC foi similar em ambos os casos (Remoção do endotélio: 42,6 ± 10 vs. L-
NAME: 42,9 ± 2,26 %, P>0,05).
Para estudar uma provável participação do óxido nítrico de origem neuronal,
as artérias mesentéricas de ratos Ouabaína e Controle foram incubadas com um
inibidor seletivo da isoforma neuronal da sintase de óxido nítrico, o NPLA (10 nM).
Resultados 91
Como é possível observar na Figuras 15 e na Tabela 3, em nenhum dos grupos, o
NPLA modificou significativamente a resposta contrátil induzida por noradrenalina.
De maneira similar nos animais Controle e Ouabaína, a inibição da via do
ácido araquidônico-ciclooxigenase induzida pela indometacina (10 µM) reduziu
significativamente a sensibilidade à noradrenalina, sem mudanças na resposta
máxima, quando comparado com a condição controle, ou seja, antes do tratamento
com indometacina (Figura 16A, B e E, Tabela 3). No grupo de animais tratados
cronicamente com losartan, o mesmo padrão de resposta foi obtido (Figura 16 C, D
e E, Tabela 3).
Resultados 92
A B
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 ControleControle (L-NAME)
P<0,05
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 OuabaínaOuabaína(L-NAME)
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
P<0,05
E
C D
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 LosartanLosartan (L-NAME)
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
P<0,05
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 Ouabaína + LosartanOuabaína + Losartan(L-NAME)
P<0,05
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
Figura 14. Efeito do bloqueio da síntese de óxido nítrico com L-NAME (100 µM) sobre a resposta
contrátil induzida por noradrenalina em artérias mesentéricas de ratos Controle (A, n = 7), Ouabaína
(B, n = 7), Losartan (C, n = 8) e Ouabaína + Losartan (D, n = 8). E. Diferenças percentual da área
abaixo da curva de concentração-resposta à noradrenalina (dAUC) em artérias mesentéricas de
ambos os grupos. Os resultados (média ± erro padrão da média) estão expressos como porcentagem
da contração induzida por 120 mM de KCl. ANOVA (duas vias): Os valores de P indicam a
significância estatística entre as duas situações experimentais (antes e depois do L-NAME) pela
ANOVA. +P<0,05 vs. Controle ou Losartan.
0
25
50
75
100
+
ControleOuabaína
+
LosartanOuabaína + Losartan
dAUC
(%)
Resultados 93
A B
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 ControleControle (NPLA)
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 OuabaínaOuabaína (NPLA)
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
Figura 15. Efeito do bloqueio da isoforma neuronal da sintase de óxido nítrico, NPLA (10 nM), sobre a
curva concentração resposta à noradrenalina em segmentos de ratos Controle (A, n = 3) e Ouabaína
(B, n = 4). Os resultados (média ± erro padrão da média) estão expressos como porcentagem da
contração induzida por 120 mM de KCl. ANOVA: P>0,05.
Resultados 94
A B
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 ControleControle (Indo)
P<0,05
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 OuabaínaOuabaína (Indo)
P<0,05
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
E
C D
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 LosartanLosartan (Indo)
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
P<0,05
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 Ouabaína + LosartanOuabaína + Losartan (Indo)
P<0,05
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
Figura 16. Efeito do bloqueio da ciclooxigenase com indometacina (Indo, 10 µM) sobre a resposta
contrátil induzida por noradrenalina em artérias mesentéricas de ratos Controle (A, n = 7), Ouabaína
(B, n = 7), Losartan (C, n = 8) e Ouabaína + Losartan (D, n = 8). E. Diferenças percentual da área
abaixo da curva de concentração-resposta à noradrenalina (dAUC) em artérias mesentéricas dos
quatro grupos experimentais. Os resultados (média ± erro padrão da média) estão expressos como
porcentagem da contração induzida por 120 mM de KCl. Os valores de P indicam a significância
estatística entre as duas situações experimentais (antes e depois da indometacina) pela ANOVA.
0
25
50
75
100 ControleOuabaína
dAUC
(%) Losartan
Ouabaína+Losartan
Resultados 95
Tabela 3. Valores de pD2 e resposta máxima (Rmax, % de contração) obtidos através
de curvas concentração-resposta à noradrenalina em artérias mesentéricas de
resistência de ratos Controle (n = 7), Ouabaína (n = 7), Losartan (n = 8) e Ouabaína
+ Losartan (n = 8) antes e após tratamento com L-NAME (100 µM), NPLA (10 nM)
ou indometacina (10 µM).
pD2 Rmax (%)
Antes Depois Antes Depois
L-NAME Controle 5,91 ± 0,07 6,17 ± 0,06* 119 ± 2,33 127 ± 4,70
Ouabaína 5,90 ± 0,06 6,38 ± 0,05* 125 ± 4,80 145 ± 5,02*+
Losartan 6,08 ± 0,02 6,34 ± 0,05* 115 ± 1,96 120 ± 1,92
Ouabaína + Losartan 5,94 ± 0,05 6,32 ± 0,05* 115 ± 3,55 132 ± 4,82*+
NPLA
Controle 5,95 ± 0,03 5,90 ± 0,03 129 ± 5,90 122 ± 4,85
Ouabaína 6,01 ± 0,03 6,01 ± 0,02 122 ± 6,84 112 ± 6,40
Indometacina
Controle 5,87 ± 0,05 5,66 ± 0,06* 120 ± 1,96 113 ± 3,78
Ouabaína 5,86 ± 0,06 5,63 ± 0,03* 129 ± 3,15 125 ± 5,62
Losartan 6,07 ± 0,04 5,90 ± 0,05* 104 ± 1,72 107 ± 2,82
Ouabaína + Losartan 6,01 ± 0,03 5,85 ± 0,06* 126 ± 4,06 120 ± 3,53
Os valores estão expressos como média ± erro padrão da média. ANOVA: *P<0,05
Antes vs. Depois da incubação com L-NAME ou Indometacina; +P<0,05 Ouabaína
ou Ouabaína + Losartan vs. Controle ou Losartan
Resultados 96
4.2.3. Efeito do bloqueio dos canais para potássio dependentes de cálcio
sobre a resposta vasoconstritora induzida por noradrenalina.
Com o objetivo de avaliar o papel modulatório do EDHF sobre a resposta
contrátil mediada por noradrenalina em artérias mesentéricas de resistência de ratos
Controle e Ouabaína, o efeito do TEA foi avaliado em segmentos onde a síntese de
óxido nítrico e de prostanóides foi previamente inibida pelo tratamento com L-NAME
e indometacina, respectivamente.
A pré-incubação com L-NAME + indometacina aumentou a sensibilidade à
noradrenalina em segmentos arteriais de ambos os grupos Controle e Ouabaína
(Figura 17, Tabela 4). Entretanto essa resposta foi de maior magnitude em artérias
de ratos tratados com ouabaína (ver dAUC, Figura 17C). O subseqüente bloqueio
dos canais para o potássio ativados por cálcio com TEA induziu um aumento
adicional na sensibilidade à noradrenalina em segmentos isolados de ratos Controle
(Figura 17A e C, Tabela 4). Entretanto, em segmentos isolados de ratos ouabaína, o
TEA, em presença de L-NAME + indometacina, não produziu nenhum efeito
adicional sobre a curva concentração-resposta à noradrenalina (Figura 17B e C,
Tabela 4).
Nas artérias dos grupos cronicamente tratados com losartan (Losartan e
Ouabaína + Losartan) esse mesmo padrão de resposta foi observado, ou seja, nos
animais que receberam ouabaína a preincubação com TEA foi incapaz de deslocar a
curva concentração-resposta à noradrenalina em artérias previamente tratadas com
L-NAME + indometacina (Figura 18A e C, Tabela 4).
Nas artérias mesentéricas de resistência sem endotélio de ratos Controle e
Ouabaína, tratados ou não com losartan, a resposta contrátil à noradrenalina na
presença de TEA, não foi diferente daquela observada na ausência deste
bloqueador de canais para potássio ativados por cálcio (Figura 19, Tabela 5).
Resultados 97
A B
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 ControleL-NAME + IndoL-NAME + Indo+TEA
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
P<0,05
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 OuabaínaL-NAME + IndoL-NAME +Indo+TEA
Noradrenalina, log MC
ontr
ação
(%)
P<0,05
C
0
25
50
75
100 Controle (LNAME+Indo)Controle (LNAME+Indo+TEA)Ouabaína (LNAME+Indo)Ouabaína (LNAME+Indo+TEA)
*+
dAUC
(%)
Figura 17. Efeito da pré-incubação com indometacina (Indo, 10 µM) + L-NAME (100 µM) e L-NAME +
Indo + tetraetilamônio (TEA, 2 mM) sobre a curva concentração-resposta à noradrenalina em
segmentos de artérias mesentéricas de resistência (4o ramo) de ratos Controle (A, n=8) e Ouabaína
(B, n=8). C. Diferença percentual da área abaixo da curva de concentração-resposta à noradrenalina
(dAUC) em artérias mesentéricas após tratamento com L-NAME + Indo e L-NAME + Indo + TEA. Os
resultados (média ± erro padrão da média) estão expressos como porcentagem da contração
induzida por 120 mM de KCl
ANOVA:
- Grupo Controle: P<0,05 Controle vs. L-NAME + Indo; P<0,05 L-NAME + Indo vs. L-NAME + Indo +
TEA.
- Grupo Ouabaína: P<0,05 Controle vs. L-NAME + Indo.
- *P<0,05 Controle (L-NAME+Indo+TEA) vs. Controle (L-NAME+Indo)
- +P<0,05 Ouabaína (L-NAME+Indo) vs. Controle (L-NAME+Indo).
Resultados 98
A B
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 LosartanL-NAME + IndoL-NAME + Indo+ TEA
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
P<0,05
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 Ouabaína + Losartan
L-NAME + IndoL-NAME + Indo+TEA
P<0,05
Noradrenalina, log MC
ontr
ação
(%)
C
0
25
50
75
100 Losartan (LNAME+Indo)Losartan (LNAME+Indo+TEA)Oua + Los (LNAME+Indo)Oua + Los (LNAME+Indo+TEA)
* +
dAUC
(%)
Figura 18. Efeito da pré-incubação com indometacina (Indo, 10 µM) + L-NAME (100 µM) e L-NAME +
Indo + tetraetilamônio (TEA, 2 mM) sobre a curva concentração-resposta à noradrenalina em
segmentos de artérias mesentéricas de resistência (4o ramo) de ratos Losartan (A, n=8) e Ouabaína +
Losartan (B, n=8). C. Diferença percentual da área abaixo da curva de concentração-resposta à
noradrenalina (dAUC) em artérias mesentéricas após tratamento com L-NAME + Indo e L-NAME +
Indo + TEA. Os resultados (média ± erro padrão da média) estão expressos como porcentagem da
contração induzida por 120 mM de KCl.
ANOVA (duas vias) com medidas repetidas:
- Grupo Losartan: P<0,05 Controle vs. L-NAME + Indo; P<0,05 L-NAME + Indo vs. L-NAME + Indo +
TEA.
- Grupo Ouabaína + Losartan: P<0,05 Controle vs. L-NAME + Indo
Teste t pareado: *P<0,05 Losartan (L-NAME+Indo+TEA) vs. Losartan (L-NAME+Indo)
Teste t não-pareado: +P<0,05 Ouabaína+Losartan (L-NAME+Indo) vs. Losartan (L-NAME+Indo).
Resultados 99
Tabela 4. Efeito da incubação com tetraetilamônio (TEA, 2 mM) sobre os valores de pD2 e Rmax à noradrenalina em artérias
mesentéricas de resistência com endotélio intacto, previamente incubadas com L-NAME (100 µM) + indometacina (Indo, 10 µM).
Controle L-NAME + Indo L-NAME+Indo+TEA
Rmax pD2 Rmax pD2 Rmax pD2 Controle 124 ± 3,53 5,93 ± 0,04 132 ± 3,37 6,11 ± 0,06* 135 ± 4,06 6,43 ± 0,09*#
Ouabaína 125 ± 4,20 5,98 ± 0,03 134 ± 5,25 6,30 ± 0,04* 129 ± 5,02 6,39 ± 0,08*
Losartan 109 ± 3,86 6,04 ± 0,05 114 ± 3,50 6,31 ± 0,04* 122 ± 2,70 6,57 ± 0,09*#
Ouabaína + Losartan 113 ± 3,42 6,00 ± 0,03 131 ± 4,44* 6,26 ± 0,07* 130 ± 3,84* 6,29 ± 0,09*
Valores representam média ± erro padrão da média. ANOVA: *P<0,05 vs. Controle; #P<0,05 vs. L-NAME + Indo. n = 8 em cada
grupo.
Resultados 100
A B
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 Controle (E-)Controle (E-) + TEA
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 Ouabaína (E-)Ouabaína (E-) + TEA
Noradrenalina, log MC
ontr
ação
(%)
C D
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 Losartan (E-)Losartan (E-) + TEA
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 Ouabaína + Losartan (E-)Ouabaína + Losartan (E-) + TEA
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
Figura 19. Efeito da inibição dos canais para o potássio ativados por cálcio (tetraetilamônio, TEA, 2
mM) sobre a curva concentração-resposta à noradrenalina em segmentos sem endotélio de artérias
mesentéricas de resistência (4o ramo) de ratos Controle (A, n = 5), Ouabaína (B, n = 4), Losartan (C,
n = 8) e Ouabaína + Losartan (D, n = 8). Os resultados (média ± erro padrão da média) estão
expressos como porcentagem da contração induzida por 120 mM de KCl.
ANOVA: P>0,05
Resultados 101
Tabela 5. Efeito da incubação com tetraetilamônio (TEA, 2mM) sobre os valores de
pD2 e Rmax à noradrenalina em artérias mesentéricas de resistência sem endotélio.
pD2 Rmax (%)
Antes Depois Antes Depois
TEA Controle 6,62 ± 0,03 6,71 ± 0,02 122 ± 1,84 117 ± 2,40
Ouabaína 6,44 ± 0,03 6,45 ± 0,05 122 ± 1,92 122 ± 3,43
Losartan 6,60 ± 0,03 6,58 ± 0,02 115 ± 2,00 117 ± 1,57
Ouabaína + Losartan 6,56 ± 0,10 6,56 ± 0,06 117 ± 3,00 125 ± 4,00
Os valores representam média ± erro padrão da média. ANOVA: P>0,05
Resultados 102
4.2.4. Efeito da inibição da atividade da Na+, K+-ATPase sobre a resposta
vasoconstritora induzida por noradrenalina
Em segmentos arteriais com endotélio de ratos Controle e Ouabaína, a
resposta contrátil à noradrenalina na presença de 100 µM de ouabaína, não foi
diferente daquela observada na ausência deste inibidor da Na+K+-ATPase (Figura
20, Tabela 6).
4.2.5. Efeito temporal da resposta vasoconstritora induzida por
noradrenalina
A Figura 21 mostra o controle temporal das curvas concentração-resposta à
noradrenalina em artérias mesentéricas de resistência de ratos Controle, Ouabaína,
Losartan e Ouabaína + Losartan, uma e duas horas após realização da primeira
curva à noradrenalina (0h). Como é possível observar em ambos os grupos
experimentais, tanto a sensibilidade quanto a resposta máxima a este agonista alfa-
adrenérgico não foram alteradas no decorrer do protocolo experimental,
demonstrando a estabilidade das preparações (Figura 21 e Tabela 7).
Resultados 103
A B
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 ControleControle(Ouabaína)
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 OuabaínaOuabaína(Ouabaína)
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
Figura 20. Efeito da incubação com ouabaína (100 µM) sobre a curva concentração-resposta à
noradrenalina artérias mesentéricas de resistência (4o ramo) de ratos Controle (A, n = 7) e Ouabaína
(B, n = 8). Os resultados (média ± erro padrão da média) estão expressos como porcentagem da
contração induzida por 120 mM de KCl.
ANOVA: P>0,05
Tabela 6. Efeito da incubação com ouabaína (100 µM) sobre os valores de pD2 e
Rmax à noradrenalina em artérias mesentéricas de resistência de ratos Controle e
Ouabaína.
pD2 Rmax (%)
Antes Depois Antes Depois
Ouabaína Controle 5,95 ± 0,03 5,95 ± 0,05 129 ± 3,00 129 ± 4,30
Ouabaína 5,97 ± 0,02 5,96 ± 0,03 125 ± 2,06 118 ± 2,36
Os valores representam média ± erro padrão da média. ANOVA: P>0.05
Resultados 104
A B
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175
Controle (2h)
Controle (0h)Controle (1h)
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175
Ouabaína (2h)
Ouabaína (0h)Ouabaína (1h)
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
C D
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 Losartan (0h)Losartan (1h)Losartan (2h)
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
-8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
125
150
175 Ouabaina + Losartan (0h)Ouabaina + Losartan (1h)Ouabaina + Losartan (2h)
Noradrenalina, log M
Con
traç
ão (%
)
Figura 21. Controle temporal das curvas concentração-resposta à noradrenalina artérias
mesentéricas de resistência de ratos Controle (A, n = 6) e Ouabaína (B, n = 6), Losartan (C, n = 8) e
Ouabaína + Losartan (D, n = 8). Os resultados (média ± erro padrão da média) estão expressos como
porcentagem da contração induzida por 120 mM de KCl.
ANOVA: P>0,05.
Resultados 105
Tabela 7. Valores de resposta máxima (Rmax) e sensibilidade (pD2) à noradrenalina uma e duas horas após realização da primeira
curva concentração-resposta a este agonista alfa-adrenérgico em artérias mesentéricas de resistência de ratos Controle,
Ouabaína, Losartan e Ouabaína + Losartan.
0 Hora 1 Hora 2 Horas
Rmax pD2 Rmax pD2 Rmax pD2 Controle 121 ± 2,5º 5,97 ± 0,03 126 ± 3,82 5,91 ± 0,04 128 ± 2,86 6,00 ± 0,03
Ouabaína 129 ± 2,45 5,99 ± 0,03 127 ± 1,43 5,99 ± 0,02 127 ± 3,24 5,98 ± 0,04
Losartan 103 ± 1,18 6,12 ± 0,02 106 ± 1,68 6,13 ± 0,02 103 ± 1,16 6,10 ± 0,02
Ouabaína + Losartan 109 ± 3,02 6,06 ± 0,04 109 ± 3,30 6,07 ± 0,05 109 ± 3,30 6,08 ± 0,04
Valores representam média ± erro padrão da média. ANOVA: P>0,05.
Resultados 106
4.3. Efeito do tratamento crônico com ouabaína sobre a atividade funcional da
Na+, K+-ATPase sensível à ouabaína
A atividade funcional da Na+K+-ATPase foi estudada através da técnica de
relaxamento induzido pelo potássio (Webb & Bohr, 1978). Como é possível observar
na figura 22, o potássio administrado às preparações foi capaz de reduzir de
maneira concentração-dependente, e de similar magnitude, a contração induzida por
noradrenalina nos segmentos arteriais de ratos Controle e Ouabaína. A
administração de ouabaína 100 µM reduziu substancialmente o relaxamento
induzido pelo potássio, e essa inibição foi maior nas artérias dos animais ouabaína
(Figura 22A). Comparando a dAUC da curva de relaxamento ao KCl na presença e
na ausência de ouabaína (100 µM) (Figura 22B), é possível observar que essa
diferença foi maior no grupo ouabaína, o que sugere uma maior atividade funcional
da Na+K+-ATPase sensível à ouabaína em artérias mesentéricas de resistência
desses animais.
No grupo de animais tratados com losartan, a atividade funcional da Na+K+-
ATPase sensível à ouabaína também foi de maior magnitude naqueles animais que
foram tratados com ouabaína, como é possível observar na maior capacidade de
inibição do relaxamento ao KCl induzido pela ouabaína e pelo valores de dAUC no
grupo Ouabaína Losartan (Figura 22C, e D).
Resultados 107
A
B
0 2 4 6 8 100
25
50
75
100
125 Controle LosartanControle Losartan (Ouab)
Ouabaína LosartanOuabaína Losartan (Ouab)
+
KCl, mM
Con
traç
ão (%
)
Figura 22. A. Curva de relaxamento ao KCl na ausência e na presença de ouabaína (Ouab 100 µM)
em artérias mesentéricas de resistência isoladas de ratos Controle (n = 8), Ouabaína (n = 8) (A),
Losartan (n = 8) e Ouabaína + Losartan (n = 8) (C). Figuras B e C representam a diferença de área
abaixo da curva (dAUC) de relaxamento ao KCl na ausência e presença de ouabaína (P<0,05
ouabaína vs. controle).
ANOVA: +P<0,05 Controle (Ouab) ou Losartan (Ouab) vs. Ouabaína (Ouab) ou Ouabaína Losartan
(Ouab)
Teste t: +P<0,05 Ouabaína ou Ouabaína Losartan vs. Controle ou Losartan
D
0 2 4 6 8 100
25
50
75
100
125 ControleControle(Ouab 100µM)
OuabaínaOuabaína(Ouab 100µM)
+
KCl, mM
Con
traç
ão (%
)
0
100
200
300
400
500
600 ControleOuabaína
dAUC
(%)
+
0
250
500
750
1000
1250
1500 Controle losartanOuabaína losartan
dAU
C (%
) +
C
Resultados 108
4.4. Expressão protéica da isoforma endotelial da sintase de óxido nítrico A Figura 23A mostra a expressão da isoforma endotelial (eNOS) sintase de
óxido nítrico, detectada através da utilização da técnica de Western blot em artérias
mesentéricas de resistência de ratos Controle e Ouabaína. Nestas artérias, o
tratamento durante cinco semanas com ouabaína não alterou a expressão protéica
da eNOS (Figura 23A). Em segmentos de ratos tratados com losartan, similar ao
grupo não tratado, não foram observados diferenças estatisticamente significativas
na expressão da eNOS (Figura 23B).
A B
0.0
0.5
1.0
1.5 ControleOuabaína
eNO
S/α
-act
ina
0.0
0.5
1.0
1.5 ControleOuabaína
eNO
S/α
-act
ina
Figura 23. A. Análise densitométrica de Western blot para expressão protéica da isoforma endotelial
da sintase de óxido nítrico (eNOS) em artérias mesentéricas de resistência de ratos Controle (Com) e
Ouabaína (Oua) (A) e Losartan (Los) e Ouabaína + losartan (Oua+Los) (B). Painel superior mostra as
bandas de Western blots representativas da expressão da eNOS e da α-actina em artérias
mesentéricas de ratos controles em ambos os grupos. C+. controle positivo para eNOS (células
endoteliais humanas). Os resultados (média ± erro padrão da média) estão expressos como
expressão da eNOS em relação a α-actina.
C+ Oua Con C+ Oua+Los Los
eNOS
α-actina
eNOS
α-actina
Resultados 109
4.5. Estudo das propriedades estruturais de artérias mesentéricas de
resistência de rato realizado com miógrafo de pressão
A Figura 24 mostra a relação pressão: diâmetro em artérias mesentéricas de
resistência de ratos Controle (Figura 24A) e Ouabaína (Figura 24B), em condições
ativas (na presença de 2,5 mM de Cálcio) e passivas (ausência de cálcio no meio).
Como é possível observar nas artérias mesentéricas de ambos os grupos, tanto na
presença como na ausência de cálcio, o aumento da pressão intraluminar induziu
um aumento progressivo do diâmetro interno arterial. Essa resposta foi similar em
ambas as situações experimentais, ou seja, na presença e na ausência de cálcio
(Figura 24). Esse comportamento de resposta foi semelhante nas artérias
mesentéricas de resistência dos grupos tratados com losartan (resultados não-
mostrados).
A Figura 25 mostra os parâmetros morfológicos obtidos em artérias
mesentéricas de resistência pressurizadas de ratos Controle e Ouabaína em
condições de máximo relaxamento (0 Ca2+). Para todos os valores de pressão
intraluminar avaliados, ambos os diâmetros interno (Figura 25A) e externo
(resultados não mostrados) e a área de secção transversal (Figura 25B) das artérias
mesentéricas de resistência de ratos Ouabaína apresentaram-se significativamente
reduzidos quando comparado ao grupo Controle. Embora estes parâmetros
estivessem reduzidos nas artérias de ratos Ouabaína comparada ao grupo Controle,
a espessara da parede vascular permaneceu inalterada após o tratamento crônico
com este digitálico (Figura 25C). Já a relação parede: lúmen em todos os valores de
pressão estudados apresentou-se significativamente maior nas artérias
mesentéricas de resistência de ratos submetidos ao tratamento crônico com
ouabaína (Figura 25D).
O tratamento com losartan, embora não tenha prevenido as alterações sobre
a reatividade vascular à noradrenalina e a atividade da Na+K+-ATPase induzidas
pelo tratamento com ouabaína, foi capaz de prevenir as alterações observadas
sobre estes parâmetros estruturais em artérias mesentéricas de resistência de ratos
cronicamente tratados com ouabaína. Dessa forma os valores de diâmetro interno
(Figura 26A) e externo (resultados não mostrados), da área de secção transversal
(Figura 26B), da espessura da parede vascular (Figura 26C) e da relação parede:
Resultados 110
lúmen (Figura 26D) foram similares nos animais Ouabaína + Losartan comparados
ao grupo tratado somente com losartan em todos os valores de pressão intraluminar
estudados. Nos animais que receberam pellets placebo, o tratamento com losartan
não alterou os parâmetros estruturais avaliados.
Resultados 111
A
0 20 40 60 80 100 120 140
150
225
300
375
450
Controle (0 Ca2+)
Controle (2,5 mM Ca2+)
Diâ
met
ro in
tern
o( µ
m)
B
0 20 40 60 80 100 120 140
150
225
300
375
450Ouabaína (2,5 mM Ca2+)
Ouabaína (0 Ca2+)
Diâ
met
ro in
tern
o( µ
m)
Pressão (mm Hg)
Figura 24. Relação pressão-diâmetro em artérias mesentéricas de resistência de ratos Controle (A, n
= 8) e Ouabaína (B, n = 9) em condições ativas e passivas (Cálcio zero, 0 Ca2+). Os resultados estão
expressos como média ± erro padrão da média dos valores de diâmetro (µm) interno frente às
alterações de pressão intravascular.
ANOVA: P>0,05.
Resultados 112
A B
0 20 40 60 80 100 120 140
150
225
300
375
450
ControleOuabaína
P<0,05
Pressão (mm Hg)
Diâ
met
ro in
tern
o ( µ
m)
0 20 40 60 80 100 120 14010000
20000
30000
40000
ControleOuabaínaP<0,05
Pressão (mm Hg)A
ST ( µ
m2 )
C D
0 20 40 60 80 100 120 14020
30
40
50 ControleOuabaína
Pressão (mm Hg)
Espe
ssur
a da
Par
ede
( µm
)
0 20 40 60 80 100 120 1407
14
21
28
35
OuabaínaControle
P<0,05
Pressão (mm Hg)
Pare
de/ L
úmen
(%)
Figura 25. Comparação dos parâmetros estruturais de artérias mesentérica de resistência de ratos
Controle (n = 8) e Ouabaína (n = 9). A. Relação pressão: diâmetro interno, B. Área de secção
transversal, C. Espessura da parede arterial, D. Relação parede: lúmen (D) obtida sob condições de
relaxamento máximo em artérias mesentéricas de ratos Controle e Ouabaína. Os resultados estão
expressos como média ± erro padrão da média. Os valores de P indicam a significância estatística
entre os dois grupos experimentais pela ANOVA.
Resultados 113
A B
0 20 40 60 80 100 120 140
150
225
300
375
450
LosartanOuabaína + Losartan
Pressão (mm Hg)
Diâ
met
ro in
tern
o ( µ
m)
0 20 40 60 80 100 120 1400
10000
20000
30000
40000
LosartanOuabaína + Losartan
Pressão (mmHg)A
ST ( µ
m2 )
C D
0 20 40 60 80 100 120 14020
30
40
50 LosartanOuabaina + Losartan
Pressão (mm Hg)
Espe
ssur
a da
Par
ede
( µm
)
0 20 40 60 80 100 120 1407
14
21
28
35 LosartanOuabaína + Losartan
Pressão (mm Hg)
Pare
de/L
umen
(%)
Figura 26. Comparação dos parâmetros estruturais de artérias mesentérica de resistência de ratos
Losartan (n = 7) e Ouabaína + Losartan (n = 8). A. Relação pressão: diâmetro interno, B. Área de
secção transversal, C. Espessura da parede arterial, D. Relação parede: lúmen (D) obtidas sob
condições de relaxamento máximo em artérias mesentéricas de ratos Losartan e Ouabaína +
Losartan. Os resultados estão expressos como média ± erro padrão da média. ANOVA: P>0,05.
Resultados 114
4.6. Propriedades mecânicas de artérias mesentéricas de resistência de rato
avaliadas através de miógrafo de pressão
A Figura 27 mostra as propriedades mecânicas das artérias mesentéricas de
resistência de ratos Controle e Ouabaína em condições de máximo relaxamento (0
Ca2+). O aumento da pressão intraluminar induziu aumento do stress de parede, o
qual se apresentou significativamente reduzido nas artérias mesentéricas de animais
Ouabaína (Figura 27A). A distensibilidade arterial foi maior nos valores de pressão
intraluminar de 20 e 40 mm Hg, a qual se reduziu progressivamente frente ao
aumento da pressão intraluminar (Figura 27B); o padrão desta resposta foi similar
em ambos os grupos estudados (Figura 27B). Como mostrado pelo deslocamento
para esquerda da relação stress-strain (Figura 27C) e pelo maior valor de β (Valores
médios de β: Controle: 4,17 ± 0,07 vs. Ouabaína: 4,67 ± 0,14, P<0,05), as artérias
mesentéricas de ratos ouabaína apresentaram uma maior rigidez arterial quando
comparadas com aquelas do grupo Controle.
Sobre as alterações das propriedades mecânicas das artérias mesentéricas
de resistência em ratos tratados com ouabaína, o tratamento anti-hipertensivo com
losartan também foi capaz de preveni-las. Nas artérias de animais que receberam
pellets placebo estas propriedades mecânicas não foram modificadas pelo
tratamento com losartan. Dessa maneira, tanto o stress de parede (Figura 28A),
como a distensibilidade arterial (28B) e ainda a relação stress-strain (Figura 28C)
foram semelhantes entre os grupos Losartan e Ouabaína + Losartan. A similaridade
da relação stress-strain nestes animais pode ser comprovada pela similaridade entre
os valores de β de ambos os grupos (Losartan: 4,14 ± 0,14 vs. Ouabaína + Losartan:
4,05 ± 0,12, P>0,05).
Resultados 115
A B
0 20 40 60 80 100 120 1400.0
0.5
1.0
1.5
OuabaínaControle
P<0,05
Pressão (mm Hg)
Stre
ss(x
106
dina
s/ c
m2 )
0 20 40 60 80 100 120 1400.0
0.5
1.0
1.5
2.0 ControleOuabaína
Pressão (mm Hg)D
iste
nsib
ilida
de(%
/ mm
Hg)
C
Strain (Di/Do)0,0 0,5 1,0 1,5
0,5
1,0
1,5
2,0
Stre
ss(x
106
dina
s/ c
m2 )
Controle
Ouabaína
Strain (Di/Do)0,0 0,5 1,0 1,5
0,5
1,0
1,5
2,0
Stre
ss(x
106
dina
s/ c
m2 )
Controle
Ouabaína
Figura 27. Stress de parede (A), distensibilidade arterial (B) e relação stress-strain (C) frente a
aumentos de pressão intraluminar em artérias mesentéricas de resistência pressurizadas de ratos
Controle (n = 8) e Ouabaína (n = 9). Os resultados estão expressos como média ± erro padrão da
média. Os valores de P indicam a significância estatística entre os dois grupos experimentais pela
ANOVA.
Resultados 116
A B
0 20 40 60 80 100 120 1400.0
0.5
1.0
1.5 LosartanOuabaína + Losartan
Pressão (mm Hg)
Stre
ss(x
106
dina
s/ c
m2 )
0 20 40 60 80 100 120 1400.0
0.5
1.0
1.5
2.0 LosartanOuabaína + Losartan
Pressão (mm Hg)
Dis
tens
ibili
dade
(%/ m
m H
g)
C
Strain (Di/Do)0,0 0,5 1,0 1,5
0,5
1,0
1,5
2,0
Stre
ss(x
106
dina
s/ c
m2 )
LosartanOuabaína + Losartan
Strain (Di/Do)0,0 0,5 1,0 1,5
0,5
1,0
1,5
2,0
Stre
ss(x
106
dina
s/ c
m2 )
LosartanOuabaína + Losartan
Figura 28. Stress de parede (A), distensibilidade arterial (B) e relação stress-strain (C) frente a
aumentos de pressão intraluminar em artérias mesentéricas de resistência pressurizadas de ratos
Losartan (n = 7) e Ouabaína + Losartan (n = 8). Os resultados estão expressos como média ± erro
padrão da média. ANOVA: P>0,05.
Resultados 117
4.7. Análise estrutural da parede vascular através de microscopia confocal Com o uso da microscopia confocal, os valores médios de diâmetro interno e
externo, área de secção transversal e relação parede: lúmen das artérias dos
animais Controle e Ouabaína foram semelhantes àqueles obtidos através do
miógrafo de pressão. Com relação a estes parâmetros estruturais, as mesmas
diferenças foram observadas entre os grupos Controle e Ouabaína, quando as
artérias foram analisadas através da microscopia confocal (Tabela 8). A espessura
da camada adventícia e média também foi similar entre os grupos Controle e
Ouabaína (Tabela 8) e um aumento da relação média: lúmen foi encontrado no
grupo Ouabaína comparado ao grupo Controle (Tabela 8).
Como esperado, as artérias mesentéricas de terceira ordem do leito
mesentérico de ratos tratados com ouabaína apresentaram superfície luminar e
volume da parede vascular significativamente reduzidos quando comparados ao
grupo Controle (Tabela 8). O número total de células da parede vascular (células
adventiciais, musculares e endoteliais) apresentou-se diminuído nos ratos Ouabaína
comparados ao grupo Controle (Tabela 8), porém esta redução não alcançou
significância estatística (P=0,058). A densidade de células adventiciais e musculares
lisas, em suas respectivas camadas, permaneceram inalteradas após tratamento
crônico com ouabaína (Tabela 8). De maneira similar, o número total de células
endoteliais também foi semelhante no grupo Ouabaína comparado ao grupo
Controle (Tabela 8).
A análise morfológica dos núcleos das células musculares lisas da camada
média e das células endoteliais das artérias de ratos Controle e Ouabaína, não
revelou nenhuma alteração estatisticamente significativa após tratamento crônico
com ouabaína (Figura 29, Tabela 9).
Resultados 118
Tabela 8. Morfologia da parede vascular de artérias mesentéricas de resistência de
ratos Controle (n = 8) e Ouabaína (n = 9) obtida através de microscopia confocal.
Controle Ouabaína
Diâmetro interno (µm) 330 ± 8,60 288 ± 8,10 +
Espessura da parede (µm) 30,5 ± 0,90 28,8 ± 1,00
Espessura da adventícia (µm) 6,46 ± 0,30 6,20 ± 0,50
Espessura da média (µm) 11,5 ± 0,60 11,8 ± 0,80
Relação parede: lúmen (%) 8,90 ± 0,25 10,2 ± 0,44 +
Relação média: lúmen (%) 3,39 ± 0,18 4,07 ± 0,23 +
Superfície luminar (mm2) 1,04 ± 0,03 0,90 ± 0,03 +
Volume da parede (mm3) 0,035 ± 0,001 0,029 ± 0,001 +
Número total de células da
parede vascular
7580 ± 311 6606 ± 363
Densidade CAD/ volume da
adventícia
113125 ± 8437 157789 ± 27560
Densidade CML/ volume da média374754 ± 19772 352456 ± 25763
CE/ mm2 1412 ± 16,8 1480 ± 120
Número total de EC 1475 ± 31,1 1334 ± 112
Os valores representam média ± erro padrão da média. Teste t: +P<0,05 vs.
Controle. CAD - células adventiciais, CML - células musculares lisas, CE – células
endoteliais.
Resultados 119
Tabela 9. Estudo morfométrico dos núcleos das células musculares lisas e
endoteliais de artérias mesentéricas de terceira ordem isoladas de ratos Controle (n
= 8) e Ouabaína (n = 9).
Células musculares Células endoteliais
Controle Ouabaína Controle Ouabaína Área (µm2) 77,8 ± 3,51 81,7 ± 3,47 109 ± 4,43 115 ± 4,82
Comprimento (µm) 22,4 ± 0,37 22,8 ± 0,56 15,7 ± 0,51 16,35 ± 0,44
Largura (µm) 5,8 ± 0,13 5,9 ± 0,09 10,8 ± 0,15 10,7 ± 0,17
Os resultados estão expressos com média ± erro padrão da média.
4.8. Conteúdo e organização da elastina
Os segmentos de artéria mesentérica de resistência apresentaram
autofluorescência na adventícia e lâmina elástica interna (LEI). Análises detalhadas
das projeções de diferentes partes da parede arterial revelaram que em segmentos
de ambos os grupos, a autofluorescência na adventícia compreendia uma distinta
lâmina elástica externa (LEE) composta de fibras formando uma clara rede
separando a camada média mais uma série de fibras isoladas fora desta rede
(resultados não mostrados). Nenhuma fluorescência foi observada na camada média
muscular (Resultados não-mostrados). A LEI nas artérias de ambos os grupos
possuía uma estrutura claramente organizada de uma rede elástica compacta e
fenestrada (Figura 30).
A espessura da LEI não foi modificada pelo tratamento crônico com ouabaína
comparada ao grupo controle (Tabela 10). O número total de fenestras, o número de
fenestras por área, assim como o tamanho médio das fenestras foram similares nas
artérias mesentéricas de ratos tratados com ouabaína comparados com o grupo
Controle (Figura 30, Tabela 10). Entretanto, o volume ocupado pela LEI por artéria
apresentou-se significativamente menor nos segmentos isolados de ratos Ouabaína
(Tabela 10). A média da intensidade de fluorescência por pixel não apresentou
nenhuma diferença estatisticamente significativa nos animais tratados com ouabaína
comparados ao grupo controle (Tabela 10).
Resultados 120
CML A B
CE C D
Figura 29. Secções ópticas obtidas através de microscopia confocal dos núcleos das células
musculares lisas (CML) e endoteliais (CE) da parede vascular de artérias mesentéricas de resistência
de ratos Controle (A e C) e Ouabaína (B e D). As artérias foram pressurizadas a 70 mm Hg e fixadas
com paraformaldeído 4 %. A foto mostra os núcleos (ver setas) celulares coradas com o corante
Hoechst 33342. A linha traçada nas fotos C e D representa o eixo longitudinal da artéria. As imagens
foram capturadas com uma objetiva de 63x. Dimensões de cada imagem 238 x 238 µm.
Resultados 121
Tabela 10. Características da lâmina elástica interna (LEI) de segmentos de artéria
mesentérica de terceira ordem de ratos Controle (n = 8) e Ouabaína (n = 9).
Controle Ouabaína
Espessura (µm) 3,50 ± 0,10 3,50 ± 0,10
No total de fenestras 3437 ± 409 3265 ± 428
Área das fenestras (µm2) 13,8 ± 1,30 12,7 ± 0,90
Área relativa elastina/ imagem 0,80 ± 0,01 0,79 ± 0,01
Volume LEI/ artéria (mm3) 0,0036 ± 0,0001 0,0031 ± 0,0001 +
Intensidade de fluorescência/
pixel
114 ± 1,32 117 ± 1,50
Fluorescência total (x106)
(intensidade por pixel e por
artéria)
4085 ± 195 3658 ± 131
Os resultados estão expressos como média ± EPM .Teste t: + P<0,05 vs. Controle
Resultados 122
A
B
Figura 30. Reconstrução tridimensional das secções ópticas obtidas através de microscopia confocal
da lâmina elástica interna (LEI) da parede vascular de artérias mesentéricas de resistência de rato
pressurizadas a 70 mm Hg e fixadas com paraformaldeído 4 %. A imagem mostra a elastina
representada em verde e suas diversas fenestrações (setas). A. Controle, B. Ouabaína. As imagens
foram capturadas com uma objetiva de 63x.
20 µm
20 µm
Resultados 123
4.9. Quantificação do conteúdo de colágeno Como demonstrado na Figura 31A, em artérias de resistência de ratos o
colágeno total estava distribuído principalmente nas camadas adventícia e média. O
tratamento crônico com ouabaína aumentou significativamente o conteúdo total de
colágeno comparado aos animais não tratados com ouabaína (Figura 31A e B). Esse
aumento ocorreu principalmente na camada média (Figura 31A) e foi completamente
normalizado com o tratamento crônico com losartan (Figura 31A e B). Nas artérias
de animais que receberam pellets placebo o conteúdo total de colágeno não foi
alterado pelo tratamento crônico com losartan (Figura 31B).
Resultados 124
A
B
0.00
0.25
0.50
0.75
ControleOuabaínaLosartanOuabaína + Losartan
+
Áre
a de
Col
ágen
o/Á
rea
tota
l
Figura 31. A. Imagens representativas do conteúdo total de colágeno corado com picro sirius em
artérias mesentéricas de resistência de ratos Controle, Ouabaína, Losartan e Ouabaína + Losartan.
B. Gráfico com valores médios da área ocupada pelo colágeno em função da área total da parede
vascular de artérias mesentéricas de ratos Controle, Ouabaína, Losartan e Ouabaína + Losartan. Os
resultados estão expressos com média ± erro padrão da média. ANOVA: +P<0,05 vs. Controle.
Controle Ouabaína
Losartan Ouabaína + Losartan
DISCUSSÃO E CONCLUSÕES
Discussão 126
5. Discussão 5.1. Resumo dos resultados
Em concordância com trabalhos previamente publicados (Huang et al., 1994;
Manunta et al., 1994; Kimura et al., 2000; Manunta et al., 2001; Rossoni et al.,
2002a,b; Di Filippo et al., 2003; Xavier et al., 2004a,c), o presente estudo
demonstrou que o tratamento crônico com ouabaína (≈ 8 µg/ dia) durante cinco
semanas foi eficaz no desenvolvimento de hipertensão em ratos. Pela primeira vez
na literatura, os resultados obtidos aqui demonstraram que esta hipertensão cursa
com alterações da modulação endotelial sobre a resposta contrátil à noradrenalina,
da atividade da Na+, K+-ATPase e das propriedades mecânicas e estruturais de
pequenas artérias mesentéricas de resistência de rato. Os resultados sugerem que,
embora não houvesse mudanças da resposta contrátil à noradrenalina em artérias
mesentéricas de quarta ordem de ratos tratados com ouabaína, um maior efeito
modulatório do óxido nítrico e um prejuízo do efeito do fator hiperpolarizante
derivado do endotélio (EDHF) sobre esta resposta foram observados. Nestas
mesmas artérias, foi observado aumento da atividade da Na+, K+-ATPase sensível à
ouabaína. Em conjunto com estas alterações funcionais, as artérias mesentéricas de
resistência de ratos hipertensos pelo tratamento crônico com ouabaína
apresentaram diâmetro interno e área de secção transversal reduzidos, associados a
uma maior rigidez da parede vascular. Esta maior rigidez parece estar associada a
maior deposição do conteúdo total de colágeno na parede vascular. Embora não
tenha sido eficaz na prevenção das alterações funcionais, o tratamento crônico anti-
hipertensivo com losartan preveniu as alterações sobre a estrutura da parede
vascular decorrentes do tratamento crônico com ouabaína, sugerindo o envolvimento
do sistema renina-angiotensina no remodelamento vascular presente neste modelo
de hipertensão.
5.2. Efeito do tratamento crônico com ouabaína sobre resposta contrátil à
noradrenalina e atividade funcional da Na+K+-ATPase em artérias mesentéricas
de resistência de rato
O papel do fator ouabain-like ou ouabaína endógena no desenvolvimento e/
ou manutenção da hipertensão arterial tem sido sugerido baseado em trabalhos que
demonstram que os níveis plasmáticos dessa substância encontram-se elevados em
Discussão 127
pacientes hipertensos e em alguns modelos experimentais de hipertensão arterial,
existindo nestes casos uma correlação entre a concentração plasmática deste
composto e os níveis de pressão arterial (Overbeck et al., 1976; Hamlyn et al., 1982,
Pamnani et al., 1987; Hamlyn et al., 1996). Além disso, uma outra forte evidência de
que esta ouabaína endógena pode ter implicações na gênese e/ ou manutenção da
hipertensão reside no fato de que a administração crônica de doses baixas de
ouabaína (similares àquelas encontradas no plasma de pacientes e animais
hipertensos) ou compostos isômeros relacionados induz hipertensão em ratos
(Huang et al., 1994; Manunta et al., 1994; Kimura et al., 2000; Manunta et al., 2001;
Rossoni et al., 2002a,b; Di Filippo et al., 2003; Xavier et al., 2004a). Esta hipertensão
tem sido atribuída à ativação de vias oriundas do sistema nervoso central envolvidas
na regulação cardiovascular, resultando em aumento da atividade simpática e
prejuízo da atividade barorreflexa (Huang et al., 1994; Huang & Leenen, 1999;
Zhang & Leenen, 2001; Di Filippo et al., 2003). Os sistemas renina-angiotensina
(Huang & Leenen, 1999; Zhang & Leenen, 2001) e endotelina (Di Filippo et al. 2003)
são exemplos de vias simpatoexcitatórias envolvidas no efeito hipertensinogênico da
ouabaína, uma vez que, tanto a hiperatividade simpática como a hipertensão
decorrentes do tratamento crônico com esse digitálico são prevenidas pelo
tratamento com antagonistas do receptor AT1 para a angiotensina II (Zhang &
Leenen, 2001) ou com antagonistas do receptor ETA para a endotelina-1 (Di Filippo
et al. 2003).
O modelo de hipertensão induzida por ouabaína também cursa com
mecanismos vasculares periféricos, entretanto, ao contrário dos mecanismos
centrais, as alterações vasculares parecem ser compensatórias e não contribuintes
para o processo hipertensivo (Rossoni et al. 2002a,b; Xavier et al., 2004a). Rossoni
et al. (2002a,b) demonstraram que o tratamento crônico com ouabaína induz
alterações na resposta contrátil a fenilefrina dependendo do leito vascular estudado.
Assim, na aorta e na artéria mesentérica superior de ratos tratados com ouabaína foi
observado uma redução da resposta a fenilefrina enquanto na artéria caudal
nenhuma alteração foi observada. Já, na artéria renal de ratos tratados com
ouabaína, Kimura et al. (2000) demonstraram aumento da resposta contrátil à
fenilefrina e ao KCl quando comparada aos animais normotensos (Kimura et al.,
2000). Corroborando estes últimos resultados, Di Filippo et al. (2003) demonstraram
que na hipertensão induzida por ouabaína existe aumento da resistência vascular
Discussão 128
renal acompanhado de redução do fluxo sanguíneo renal, o que sugere uma
contribuição importante deste leito vascular no desenvolvimento e/ ou manutenção
da hipertensão arterial neste modelo experimental. A razão para estas diferenças
regionais na reatividade vascular em ratos hipertensos pelo tratamento crônico com
ouabaína não está clara, mas provavelmente possa estar relacionado com o
diferente papel que pode exercer cada um destes leitos vasculares no
desenvolvimento e/ ou manutenção da hipertensão induzida por ouabaína.
A resistência vascular aumentada é um dos mecanismos fundamentais da
gênese e/ ou manutenção da hipertensão arterial. Os vasos de resistência são os
que controlam a maior parte da resistência vascular ao fluxo sanguíneo e está claro
que durante a hipertensão anormalidades da função destas artérias contribuem de
maneira crucial para a elevação da pressão arterial. É importante ressaltar que as
alterações vasculares do modelo de hipertensão induzida por ouabaína foram
observadas somente em artérias de condutância, o que não descartaria a
possibilidade de que em vasos de resistência, estas alterações pudessem ser
contribuintes para a gênese e/ ou manutenção dos níveis elevados de pressão
arterial. Sendo assim, um dos objetivos do presente trabalho foi avaliar esta
possibilidade, estudando a reatividade vascular induzida por estimulação alfa-
adrenérgica em vasos de resistência de animais tratados com ouabaína, assim como
os prováveis mecanismos envolvidos.
Os resultados obtidos no presente estudo demonstram que a resposta
contrátil induzida por noradrenalina em artérias mesentéricas de resistência de ratos
hipertensos pelo tratamento crônico com ouabaína não foi diferente daquela
observada em artérias de animais Controle, sugerindo, em conjunto com aqueles
resultados previamente mencionados, que existem diferenças regionais de
reatividade vascular após tratamento crônico com ouabaína.
Em artérias de ratos Ouabaína, a preincubação com L-NAME, um inibidor
não-seletivo da sintase de óxido nítrico, induziu um aumento de maior magnitude da
resposta à noradrenalina comparada ao grupo Controle, sugerindo, neste caso, uma
maior modulação negativa do óxido nítrico sobre a resposta alfa-adrenérgica em
vasos de resistência de ratos Ouabaína. Este resultado é semelhante aquele
previamente demonstrado em artérias de condutância de animais tratados com
ouabaína (Rossoni et al., 2002b). Entretanto, diferente do efeito do L-NAME, o
aumento da resposta contrátil à noradrenalina observado após remoção do endotélio
Discussão 129
foi de similar magnitude em segmentos de ambos os grupos. Estes últimos
resultados sugerem que, embora pareça existir uma maior liberação de óxido nítrico
em resposta à noradrenalina nas artérias de ratos Ouabaína, o efeito modulatório
total do endotélio sobre a resposta contrátil a este agonista alfa-adrenérgico não
sofre alterações após tratamento crônico com ouabaína. Em contrapartida, os
resultados aqui obtidos sugerem que em artérias mesentéricas de resistência de
rato, o tratamento com ouabaína altera o balanço entre os fatores vasodilatadores
liberados pelo endotélio em resposta à noradrenalina. Esta afirmação está baseada
nas seguintes evidências experimentais. Ao comparar a magnitude de efeito do L-
NAME com aquela observada após remoção do endotélio (através dos valores de
dAUC) em artérias de ratos Controle, foi observado que a potencialização da
resposta à noradrenalina foi maior após a remoção do endotélio quando comparada
aquela após incubação com L-NAME. Este resultado sugere que nas artérias de
ratos Controle, além do óxido nítrico, outros fatores vasodilatadores de origem
endotelial parecem exercer um efeito modulatório negativo sobre a resposta contrátil
à noradrenalina. Já nos segmentos arteriais de ratos Ouabaína, os valores de dAUC
após remoção do endotélio ou após pré-incubação com L-NAME foram semelhantes,
sugerindo que apenas o óxido nítrico contribui para a modulação negativa do
endotélio sobre a resposta à noradrenalina nas artérias mesentéricas de resistência
destes animais.
O tratamento crônico com ouabaína não alterou a expressão protéica da
isoforma endotelial da sintase de óxido nítrico (eNOS) em artérias mesentéricas de
resistência de rato, descartando o envolvimento de um possível aumento de
expressão da eNOS como sendo responsável pelo aumento da produção de óxido
nítrico em artérias de ratos Ouabaína. Este resultado contrasta com resultados
previamente obtidos em aorta de ratos tratados com ouabaína, na qual um aumento
da expressão da eNOS foi demonstrado (Rossoni et al., 2002b). Tem sido
demonstrado que a hipertensão induzida por ouabaína também cursa com aumento
da expressão da isoforma neuronal da sintase de óxido nítrico (nNOS) (Rossoni et
al., 2002b; Xavier et al., 2004a). Por isso, para investigar uma possível participação
desta isoforma sobre a resposta contrátil à noradrenalina, segmentos de artérias
mesentéricas de resistência de ratos Controle e Ouabaína foram incubados com um
inibidor seletivo da nNOS, o NPLA. Ao contrário do L-NAME, o NPLA não alterou
nem a sensibilidade, nem a resposta máxima à noradrenalina em segmentos de
Discussão 130
ratos Controle e Ouabaína, descartando, portanto, a participação do óxido nítrico
oriundo da atividade da nNOS sobre a resposta contrátil induzida por ativação alfa-
adrenérgica em artérias mesentéricas de resistência de rato. Não obstante, um
aumento da atividade da eNOS não pode ser descartado uma vez que em alguns
modelos de hipertensão arterial tem sido demonstrado que a atividade desta
isoforma da sintase de óxido nítrico encontra-se aumentada (Nava et al., 1995;
Hayakawa & Raij, 1997; Vaziri et al., 1998). Além disso, tem sido demonstrado que a
ouabaína em concentrações nanomolares induz aumento de cálcio e conseqüente
liberação de óxido nítrico em cultura de células endoteliais (Dong et al., 2004).
Embora a liberação de óxido nítrico em resposta à noradrenalina pareça estar
aumentada em artérias mesentéricas de resistência de ratos Ouabaína, o
relaxamento induzido por acetilcolina nestes vasos não foi alterado pelo tratamento
com ouabaína. Estes resultados estão de acordo com trabalhos previamente
publicados em outros leitos vasculares, onde a resposta vasodilatadora à acetilcolina
não foi alterada pelo tratamento crônico com ouabaína (Kimura et al., 2000; Rossoni
et al., 2002a). O mecanismo pelo qual a ouabaína altera a liberação de óxido nítrico
endotelial induzida por estimulação alfa-adrenérgica, mas não por ativação de
receptores muscarínicos não é conhecido. Outros autores também tem demonstrado
que, após sua administração aguda, a ouabaína aumenta a liberação basal de óxido
nítrico mas não afeta a liberação deste fator vasodilatador em resposta à bradicinina
em artérias carótidas de rato (Xie et al., 1993).
Estudos prévios demonstraram que a ouabaína induz liberação de
prostaciclina em células endoteliais bovinas (Nakagawa et al.,1987) e aumenta a
produção desta prostaglandina em células endoteliais aórticas estimuladas por ATP
ou bradicinina (Boeynaems & Ramboer, 1989). Além disso, tem sido demonstrado
que a hipertensão arterial cursa com alteração da síntese e liberação vascular de
alguns prostanóides (Vanhoutte, 1996; Taddei et al., 1997). No presente trabalho, o
papel modulatório de prostanóides derivados da via do ácido araquidônico-
ciclooxigenase sobre a resposta contrátil induzida por noradrenalina foi investigado.
A pré-incubação com indometacina reduziu significativamente a sensibilidade à
noradrenalina sem alterar a resposta máxima a este agonista alfa-adrenérgico em
artérias mesentéricas de resistência de ratos Controle e Ouabaína. Este efeito
sugere a participação de prostanoides vasoconstritores, em vez de vasodilatadores,
sobre a resposta contrátil induzida por estimulação alfa-adrenérgica em artérias
Discussão 131
mesentéricas de resistência de rato. O efeito do bloqueio da ciclooxigenase foi
similar em ambos os grupos experimentais, sugerindo que a hipertensão induzida
por ouabaína não é acompanhada de alterações da síntese e/ ou liberação de
prostanóides vasoconstritores em artérias mesentéricas de resistência de ratos.
Estes resultados são opostos àqueles observados em artérias de resistência de
ratos espontaneamente hipertensos, onde a participação de prostanóides
vasoconstritores na resposta contrátil induzia por estimulação alfa-adrenérgica está
reduzida (Briones et al., 2002). Os resultados aqui apresentados são diferentes
também dos resultados previamente publicados em artéria mesentérica superior de
rato, onde o tratamento crônico com ouabaína induziu uma perda da participação de
prostanóides contráteis sobre a contração induzida por fenilefrina (Xavier et al.,
2004b), porém são similares aos encontrados em anéis de aorta e artéria caudal
(Rossoni et al., 2002b). A razão para esta discordância entre os resultados não é
clara, porém pode estar relacionada com diferenças no papel exercido por estes
prostanóides em cada um destes leitos vasculares ou ainda com o modelo de
hipertensão estudado. Aumento (da Cunha et al., 2002; dos Santos et al., 2003) ou
não alteração (Fortes et al. 1992) da participação de prostanoides sobre a
vasoconstrição induzida por estimulação alfa-adrenérgica tem sido reportados na
hipertensão arterial.
Além do óxido nítrico e das prostaglandinas derivadas da via do ácido-
araquidônico-ciclooxigenase, um outro fator capaz de modular a resposta
vasoconstritora induzida por estimulação alfa-adrenérgica, é o fator hiperpolarizante
derivado do endotélio (EDHF) (Dora et al., 2000). Sabe-se que a administração
aguda de ouabaína (10 nM) no leito vascular caudal de ratos normotensos e
hipertensos pelo tratamento com L-NAME induz liberação de um EDHF (Rossoni et
al., 1999, 2003), assim como, a hipertensão induzida por ouabaína cursa com
aumento da liberação deste fator endotelial em resposta a fenilefrina em artéria
caudal de rato (Rossoni et al., 2002b).
Assim, para avaliar um possível efeito do tratamento crônico com ouabaína
sobre o efeito modulatório do EDHF na resposta contrátil induzida por noradrenalina
em artérias mesentéricas de resistência, o efeito do tetraetilamônio, um bloqueador
de canais para potássio ativados por cálcio, foi avaliado em segmentos previamente
incubados com L-NAME + indometacina. Após estimulo contrátil decorrente da
adição de concentrações crescentes de noradrenalina, os efeitos atribuíveis ao óxido
Discussão 132
nítrico e à ativação de canais para potássio, este último consistente com a liberação
do EDHF, tornaram-se aparentes. O L-NAME, na presença de indometacina,
aumentou significativamente a contração à noradrenalina, sugerindo que
normalmente o óxido nítrico liberado suprime esta contração. Esta resposta foi de
maior magnitude nas artérias dos animais Ouabaína, confirmando o efeito
anteriormente observado apenas com L-NAME. Nas artérias mesentéricas de ratos
Controle incubadas com L-NAME + indometacina, o tetraetilamônio induziu um
aumento adicional na resposta contrátil à noradrenalina. Este efeito foi dependente
do endotélio, uma vez que, em segmentos onde as células endoteliais foram
removidas, o tetraetilamônio não alterou significativamente a resposta contrátil à
noradrenalina. Ao contrário da resposta observada em artérias de ratos Controle, em
artérias mesentéricas de resistência com endotélio de ratos Ouabaína, o efeito
potencializador do tetraetilamônio sobre a resposta contrátil à noradrenalina, estava
ausente. Esses resultados são consistentes com a hipótese de que em artérias
mesentéricas de resistência de ratos Controle a resposta contrátil mediada por
estimulação alfa-adrenérgica é negativamente modulada pela liberação de fatores
vasodilatadores endoteliais como o óxido nítrico e o EDHF, como previamente
demonstrado (Dora et al., 2000). Porém, em artérias de ratos com hipertensão
induzida por ouabaína, parece haver uma perda do papel modulatório exercido pelo
EDHF e, quase que totalmente, a modulação endotelial negativa sobre a resposta
contrátil à noradrenalina se deve à liberação de óxido nítrico.
O EDHF está descrito como um fator vasodilatador, independente do óxido
nítrico e da prostaciclina, que medeia a hiperpolarização do músculo liso vascular
através da abertura de canais para o potássio ativados por cálcio (Feletou &
Vanhoutte, 1996). Atualmente existe uma considerável variabilidade quanto ao papel
do EDHF na vasodilatação dependente do endotélio dependendo do leito vascular e
das espécies animais estudadas. Baseado em evidências experimentais, existem
prováveis candidatos para o EDHF incluindo: os produtos do ácido araquidônico pela
via da citocromo P450, o íon potássio, o óxido nítrico de estoques intracelulares, o
peróxido de hidrogênio ou mesmo o acoplamento elétrico entre as células
endoteliais e musculares lisas através de junções comunicantes (gap junctions)
(Hecker et al., 1994; Chaytor et al., 1998; Edwards et al., 1998, Matoba et al., 2002;
Chauham et al., 2003; Rabelo et al., 2003). Em alguns vasos sanguíneos o óxido
nítrico parece ser o mediador primário da vasodilatação dependente do endotélio,
Discussão 133
enquanto que o EDHF pode também contribuir em menor extensão. Entretanto em
algumas artérias de resistência, incluindo artérias mesentéricas, coronárias,
hepáticas, cerebrais e renais, o EDHF parece representar o principal componente da
vasodilatação dependente do endotélio (Parkington et al., 1995; Edwards et al.,
1998; Brandes et al., 2000; McNeish et al., 2002).
Embora o óxido nítrico e o EDHF atuem através de diferentes sistemas
efetores ou de segundos mensageiros, existem evidências de interações entre estes
dois fatores vasodilatadores derivados do endotélio. Alguns estudos tem mostrado
que o óxido nítrico e o monofosfato cíclico de guanosina (GMPc) são capazes de
inibir a vasodilatação mediada pelo EDHF (Kessler et al., 1999; Nishikawa et al.,
2000). Em alguns vasos, o óxido nítrico pode também inibir a síntese do EDHF por
inibir a citocromo P450 (Bauersachs et al., 1997). Além disso, a vasodilatação
mediada pelo EDHF encontra-se aumentada em resposta ao bloqueio de óxido
nítrico, assim como em camundongos que sofreram deleção para o gene que
codifica a isoforma endotelial da sintase de óxido nítrico (Brandes et al., 2000). Estes
resultados sugerem que em alguns casos o EDHF pode funcionar como um sistema
reserva, o qual parece estar mais ativado quando a síntese de óxido nítrico está
reduzida. Entretanto, existem também evidências que o óxido nítrico e o EDHF
podem agir de maneira sinérgica no controle do tônus vascular (Freitas et al., 2003)
ou ainda de maneira independente, em alguns leitos vasculares (Cohen et al., 1997,
Matoba et al., 2000).
Na hipertensão humana e em alguns modelos experimentais de hipertensão,
onde a vasodilatação dependente do endotélio mediada pelo óxido nítrico encontra-
se prejudicada, existem evidências de que o EDHF, através do seu efeito
vasodilatador, apresenta-se como um mecanismo compensatório para a liberação
diminuída de óxido nítrico (Maeso et al., 1999; Taddei et al., 1999). No modelo de
hipertensão induzido por ouabaína utilizado no presente trabalho foi observado
exatamente o contrário: um prejuízo da participação do EDHF e um aumento do
efeito modulatório do óxido nítrico sobre a vasoconstrição induzida por
noradrenalina. Diante do que foi mencionado até aqui, surgem duas questões: O
aumento de óxido nítrico representa um mecanismo compensatório devido ao
prejuízo na síntese e/ ou liberação do EDHF induzido pelo tratamento crônico com
ouabaína? Ou a participação do EDHF está diminuída devido a um maior efeito
Discussão 134
inibitório do óxido nítrico? Estas são questões difíceis de responder, porém alguns
outros aspectos devem ser considerados.
Existem algumas evidências experimentais de que a hiperpolarização e o
relaxamento das células musculares lisas induzidos pelo EDHF se dá, em alguns
leitos vasculares, através do acoplamento elétrico entre as células endoteliais e as
musculares lisas através de junções comunicantes (Chaytor et al., 1998; 2001; Dora
et al., 1999; Xu et al., 2001). Estas junções comunicantes (gap junctions) são
formadas pela junção de dois hemi-canais, chamados conexons, no ponto de
contato entre duas células, no qual, cada hemi-canal está composto de seis
conexinas. Estas, por sua vez, são proteínas com quatro domínios transmembranais
e duas cadeias peptídicas expostas como alças para o meio extracelular (Kumar &
Gilula, 1996). Tem sido demonstrado que a ouabaína pode prejudicar a
funcionalidade da comunicação celular através destas junções e é capaz de diminuir
a expressão protéica de conexinas (Schirrmarcher et al., 1996; Harris et al., 2000;
Martin et al., 2003). Esta ação da ouabaína se correlaciona com a afinidade de
ligação deste digitálico à subunidade α da Na+, K+-ATPase, embora não se tenha
conhecimento se isto se reflete devido à alteração da homeostasia de sódio e
potássio, decorrente da inibição da bomba de sódio, ou se devido a ativação de vias
de sinalização intracelular. Em fibroblastos (COS) e células epiteliais (HeLa), baixas
concentrações de ouabaína (0,1 - 10 µM) atenuaram a transferência de corante
dentro de aproximadamente uma hora, enquanto altas concentrações (100 µM - 1
mM) foram requeridas para induzir efeito equivalente em células musculares lisas
(A7r5) de aorta de rato. Uma exposição mais prolongada das células musculares
lisas (A7r5) com estas concentrações de ouabaína resultou em inibição da
expressão protéica de conexinas Cx40 e Cx43, evidente após 90 minutos e quase
completa após quatro horas de incubação (Martin et al., 2003). Tem sido proposto
que estes efeitos da ouabaína sobre as junções comunicantes podem contribuir para
inibição do dos efeitos do EDHF no sistema vascular (Martin et al., 2003). Além
disso, este efeito tempo dependente da ouabaína sobre a expressão de conexinas
poderia também explicar seus efeitos, observados por Nelli et al. (2003), sobre o
relaxamento dependente do endotélio em artérias coronárias bovinas. Estes autores
demonstraram que trinta minutos de incubação com ouabaína foram insuficientes
para alterar o relaxamento dependente do endotélio induzido por bradicinina,
enquanto esta resposta foi abolida após noventa minutos de exposição à ouabaína
Discussão 135
(Nelli et al., 2003). Portanto, no modelo de hipertensão induzida por administração
crônica de ouabaína este poderia ser um dos mecanismos responsáveis pela perda
da participação do EDHF sobre a resposta contrátil induzida por noradrenalina em
artérias mesentéricas de resistência de rato e, dessa maneira, o aumento de óxido
nítrico observado poderia representar um mecanismo compensatório para esta
perda da participação do EDHF.
Os efeitos da ouabaína são usualmente explicados pela sua capacidade que
de inibir a Na+, K+-ATPase, embora ainda não esteja muito claro se a hipertensão e
os efeitos secundários do tratamento crônico com este digitálico se devam realmente
à inibição desta enzima. Em um trabalho prévio, Rossoni et al. (2002a)
demonstraram que, assim como a resposta à estimulação alfa-adrenérgica, a
atividade e expressão da Na+, K+-ATPase sofria alterações pelo tratamento crônico
com ouabaína dependendo do leito arterial estudado. Assim, em ratos tratados com
ouabaína, foi observado: aumento da expressão das isoformas α1 e α2 e da
atividade funcional da Na+, K+-ATPase na aorta, não alteração na artéria
mesentérica superior e diminuição na artéria caudal (Rossoni et al., 2002a).
Resultados similares de aumento da expressão da isoforma α da Na+, K+-ATPase,
variando de acordo com o tecido estudado, também tem sido reportado por outros
autores (Wang et al., 2000). Em outros modelos experimentais de hipertensão,
aumento (Herrera et al., 1985; Sahim-Edermli et al., 1995), não alteração (Redondo
et al., 1995) ou diminuição (Overbeck et al., 1976; Ponte et al., 1996) da expressão
e/ ou atividade da Na+, K+-ATPase vascular também têm sido demonstrados,
podendo, dessa maneira, comportar-se como um mecanismo compensatório ou
contribuinte para o processo hipertensivo. Na hipertensão induzida por ouabaína, as
alterações da atividade e/ ou expressão da Na+, K+-ATPase vascular têm sido
associadas com as alterações da resposta contrátil mediada por estimulação alfa-
adrenérgica (Rossoni et al., 2002a).
No presente estudo, a atividade funcional da Na+, K+-ATPase foi avaliada pela
técnica de relaxamento induzido pelo potássio sensível à ouabaína de acordo com o
método inicialmente descrito por Webb & Bohr (1978). A adição de potássio em
segmentos previamente contraídos com noradrenalina induziu relaxamento, o qual
não foi diferente entre os grupos Controle e Ouabaína. Após incubação com
ouabaína, o relaxamento induzido por potássio nas artérias de ambos os grupos foi
significativamente reduzido. Entretanto, esta redução foi de maior magnitude nas
Discussão 136
artérias do grupo Ouabaína, sugerindo, portanto, uma maior atividade da Na+, K+-
ATPase sensível à ouabaína nas artérias deste grupo. Essa maior capacidade de
inibição do relaxamento induzido por potássio em artérias de animais tratados com
ouabaína tem sido atribuído a uma maior quantidade de sítios de ligação
(subunidade α) para este digitálico (Rossoni et al., 2002a). Este aumento da
atividade sensível à ouabaína e/ ou expressão de subunidades α da Na+, K+-ATPase
pode estar associado com uma maior hiperpolarização das células musculares lisas
vasculares e, dessa maneira, à alterações da resposta vasoconstritora induzida por
estimulação alfa-adrenérgica (Rossoni et al 2002a). Sendo assim, no presente
estudo, a resposta contrátil induzida por noradrenalina foi avaliada após incubação
dos segmentos arteriais com ouabaína. Em nenhum dos grupos estudados a
incubação de segmentos com ouabaína foi capaz de alterar a resposta contrátil
induzida por noradrenalina, sugerindo que, embora possa estar envolvida em outros
processos celulares, a atividade da Na+, K+-ATPase não parece contribuir de
maneira aparente para a contração induzida por estimulação alfa-adrenérgica em
artérias mesentéricas de resistência de rato. Além disso, o aumento da atividade
desta enzima observada em artérias de animais Ouabaína tampouco parece ter
influencia sobre a capacidade contrátil induzida por noradrenalina. Estes resultados
contrastam com outros previamente publicados, demonstrando que, mesmo em
concentrações muito baixas, a ouabaína aumenta a resposta contrátil induzida por
fenilefrina no leito vascular caudal perfundido de ratos normotensos e hipertensos
(Songu-Mize et al., 1995; Vassallo et al., 1997; Rossoni et al., 1999, 2001, 2003;
Padilha et al., 2004). A razão para esta diferença não é clara, mas pode ser devido
ao tipo de preparação (artéria isolada e leito perfundido) ou mesmo das
características intrínsecas de cada leito vascular.
Tem sido reportado que a hipertensão induzida pelo tratamento crônico com
ouabaína pode resultar do aumento da atividade do sistema nervoso simpático,
como indiretamente evidenciado pelo bloqueio ganglionar (Huang & Leenen, 1999),
o que acarretaria aumento da resistência vascular periférica (Di Filippo et al., 2003).
A ouabaína cronicamente administrada nas concentrações utilizadas no presente
estudo acumula em áreas dos sistema nervoso central envolvidas na regulação de
funções cardiovasculares (Huang et al., 1994). Esse acúmulo parece mediar o
aumento da pressão arterial, uma vez que este efeito induzido por ouabaína pode
ser prevenido pela administração intracerebroventricular de anticorpos anti-ouabaína
Discussão 137
(Huang & Leenen, 1999; Veerasinghan & Leenen, 1999). O aumento da atividade
simpática e conseqüentemente da pressão arterial decorrentes da administração
central ou periférica de ouabaína tem sido atribuída à ativação do sistema renina-
angiotensina cerebral. Este efeito é sugerido pela observação de que a
administração central ou periférica de antagonistas do receptor AT1 para a
angiotensina II são capazes de prevenir o aumento da atividade simpática e da
hipertensão induzidos por ouabaína (Huang & Leenen 1996; Zhang & Leenen,
2001).
As alterações vasculares observadas em ratos hipertensos pelo tratamento
crônico com ouabaína têm sido apontadas como possíveis mecanismos
compensatórios ao aumento da pressão arterial (Rossoni et al., 2002a,b; Xavier et
al., 2004a) ou ainda podem ser conseqüência da hiperreatividade simpática sobre o
sistema vascular. Em outros modelos de hipertensão foi demonstrado aumento do
efeito modulatório do óxido sobre a resposta vasoconstritora mediada por
estimulação alfa-adrenérgica, onde se sugere que esse efeito possa ser
conseqüência da estimulação simpática continuada sobre as células endoteliais
(White et al., 1996). Estes dados podem ser reforçados pelos resultados de Boric et
al. (1999), que demonstraram que a estimulação de nervos perivasculares
simpáticos da circulação mesentérica induz contração e, paralelamente, estimular a
liberação de óxido nítrico nestas artérias e que a estimulação alfa-adrenérgica
endotelial libera óxido nítrico (Tuttle & Falcone, 2001). Sendo assim, o aumento da
atividade simpática induzida pela ouabaína, como previamente demonstrado (Huang
& Leenen, 1999; Veerasinghan & Leenen, 1999), poderia atuar sobre o sistema
vascular e estimular a liberação de óxido nítrico derivado do endotélio. Diante desta
possibilidade, a reatividade vascular à noradrenalina em artérias mesentéricas de
resistência foi avaliada em animais Controle e Ouabaína, ambos tratados com
losartan, um fármaco que já é sabido ser efetivo na prevenção da hiperreatividade
simpática e da hipertensão induzida pelo tratamento crônico com ouabaína.
Como previamente publicado (Zhang & Leenen, 2001), o tratamento com
losartan reduziu significativamente a pressão arterial em ambos os grupos (Controle
e Ouabaína) abolindo a diferença entre eles. Apesar disto, o bloqueio crônico dos
receptores AT1 para a angiotensina II não foi capaz de modificar os efeitos
vasculares seguidos do tratamento crônico com ouabaína. Dessa maneira, um
aumento da participação do óxido nítrico e redução do EDHF em resposta à
Discussão 138
estimulação alfa-adrenérgica foram observados nos animais que receberam
ouabaína. Além disso, o aumento da atividade funcional da Na+, K+-ATPase induzido
pelo tratamento crônico com ouabaína também não foi prevenido pelo tratamento
anti-hipertensivo com losartan. Estes resultados portanto sugerem que as alterações
vasculares em artérias mesentéricas de resistência de rato observadas após
tratamento crônico com ouabaína, não parecem ser conseqüência da pressão
arterial elevada, nem tampouco da ativação do sistema renina-angiotensina, mas
possivelmente são decorrentes dos níveis circulantes elevados deste digitálico.
Resultados semelhantes também foram obtidos em aorta e artéria mesentérica
superior de ratos Ouabaína, onde o tratamento com losartan também não foi capaz
de prevenir o aumento da modulação do óxido nítrico e a conseqüente redução da
resposta contrátil induzida por fenilefrina (Xavier et al. 2004b,c). Além disso,
Cargnelli et al. (2000) demonstraram que o tratamento crônico com ouabaína reduz
a resposta contrátil mediada por estimulação alfa-adrenérgica em aorta de rato, um
efeito que foi independente da pressão arterial elevada.
Existem evidências na literatura de que outros compostos digitálicos como a
digoxina e a digitoxina, ao contrário da ouabaína e seus isômeros, quando
administrados cronicamente são ineficazes no desenvolvimento de hipertensão em
ratos (Manunta et al., 2000). Comparando o efeito hipertensivo da ouabaína e de
alguns de seus isômeros, como a iso-ouabaína e a dihidro-ouabaína, com seu efeito
sobre a atividade Na+K+-ATPase, Manunta et al. (2001) demonstraram que o efeito
hipertensivo destes isômeros é independente da sua capacidade inibitória sobre a
atividade da Na+K+-ATPase. A ouabaína é um inibidor mais potente da atividade da
Na+K+-ATPase comparada à iso-ouabaína e à dihidro-ouabaína, porém estes últimos
possuem uma atividade hipertensora mais pronunciada (Manunta et al., 2001). Em
ratos tratados com digoxina, ao contrário daqueles tratados com ouabaína, não
foram observadas alterações sobre reatividade vascular a fenilefrina em artérias
renais de rato (Kimura et al., 2000). Em conjunto estes resultados demonstram que a
indução da hipertensão pela ouabaína em ratos parece ser independente da inibição
da Na+, K+-ATPase. Assim, novos sítios de ligação para a ouabaína em células
adrenocorticais têm sido descritos (Ward et al., 2002), os quais poderiam estar
envolvidos nos efeitos da administração crônica de ouabaína sobre a pressão
arterial e a função vascular.
Discussão 139
5.3. Efeito do tratamento crônico com ouabaína sobre as propriedades
mecânicas e estruturais de artérias mesentéricas de resistência de rato
Em muitas enfermidades cardiovasculares ou situações que cursam com
alterações do sistema cardiocirculatório, o fenômeno do remodelamento vascular é
uma das características marcantes. Este remodelamento compreende as diferentes
maneiras de alterações estruturais da parede dos vasos sanguíneos que resulta, na
maioria das vezes, em aumento da relação parede: lúmen. Estas alterações podem
ou não estarem relacionadas com crescimento celular, senão com um processo de
reorganização do material que constitui a parede vascular, especialmente das
células musculares lisas da camada média. O remodelamento vascular pode ser de
tipos distintos, conforme as alterações quantitativas do material que compõe a
parede vascular (hipertrófico, eutrófico ou hipotrófico), ou conforme reduza (para
dentro) ou aumente (para fora) o diâmetro interno (Mulvany, 2000).
Tem sido evidenciado em pacientes e em alguns modelos experimentais que
no caso da hipertensão arterial, as mudanças na estrutura das artérias de resistência
envolve a combinação de basicamente dois processos: remodelamento eutrófico e
remodelamento hipertrófico. Ambos os tipos de remodelamento vascular
compartilham as características de diminuição do diâmetro luminar com aumento da
relação parede: lúmen, porém o remodelamento eutrófico diminui o diâmetro sem
alteração da área de secção transversal, enquanto que o remodelamento hipertrófico
aumenta a espessura da parede com aumento da área de secção transversal. Na
hipertensão o remodelamento reflete um processo adaptativo de pequenas artérias à
pressão arterial elevada e finalmente previne o aumento do stress de parede.
Apesar disso, a diminuição do diâmetro luminar e o aumento da relação parede:
lúmen contribuem para agravar o quadro hipertensivo porque aumentam a
resistência ao fluxo sanguíneo e podem ser causa para o aumento da resposta às
substâncias vasoconstritoras.
Na literatura não existia até então nenhuma evidência experimental de que a
hipertensão induzida por ouabaína pudesse estar associada a alterações estruturais
de vasos de resistência. Porém, existiam evidências de que a ouabaína, em
concentrações próximas daquelas encontradas no plasma de pacientes hipertensos,
promove a proliferação de miócitos vasculares (Kometiani et al., 1998; Aydemir-
Koksoy et al., 2001) e aumento de moléculas de adesão do tipo VCAM-1 em células
endoteliais de camundongos (Bereta et al., 1995), o que a torna um contribuinte em
Discussão 140
potencial para o remodelamento vascular na hipertensão arterial. Assim, em vasos
de resistência de animais hipertensos pela administração crônica de ouabaína,
apesar de não terem sido observadas alterações sobre os processos de contração e
relaxamento, possíveis alterações da estrutura da parede vascular poderiam estar
presentes, contribuindo ou não para o aumento da resistência vascular periférica e
da pressão arterial.
O presente estudo foi o primeiro a demonstrar que a hipertensão induzida por
ouabaína cursa com remodelamento vascular de pequenas artérias de resistência de
rato. Neste estudo foram avaliadas as propriedades estruturais e mecânicas de
artérias mesentéricas de terceira ordem de ratos Controle e Ouabaína, em um
sistema para artérias pressurizadas, o qual representa um dos métodos atuais mais
apropriados para esse tipo de estudo por sua aproximação com as condições in vivo
(Schiffrin & Hayoz, 1997). Foi observado que artérias mesentéricas de resistência de
ratos Ouabaína apresentaram o diâmetro interno e externo reduzidos e aumento da
relação parede: lúmen e média: lúmen quando comparadas com as artérias de
mesma ordem do grupo Controle. Além disso, a área de secção transversal das
artérias de ratos hipertensos apresentou-se reduzida comparada a do grupo
normotenso. Em conjunto estes resultados sugerem que a hipertensão induzida por
ouabaína cursa com remodelamento vascular do tipo hipotrófico para dentro em
artérias mesentéricas de resistência de rato. Esse tipo de remodelamento não é
comum na hipertensão arterial, onde tem sido mostrado que em ambos, pacientes e
animais experimentais, o remodelamento eutrófico predomina na maioria dos casos
(Deng & Schiffrin, 1992a; Korsgaard et al., 1993; Li et al., 1996; Intengam et al.,
1999a,b; Briones et al., 2003; Porteri et al., 2003), embora exemplos de
remodelamento hipertrófico também tenham sido descritos (Deng & Schiffrin, 1992b,
Korsgard & Mulvany, 1998; Bund, 2000; Rizzoni et al., 2000).
Arteríolas renais aferentes de ratos espontaneamente pré-hipertensos
(Norrelund et al., 1994) e artérias de resistência isoladas de pacientes com isquemia
de membros inferiores (Coats et al., 2003), um modelo de hipotensão/ baixa
perfusão, também apresentaram remodelamento hipotrófico. O mecanismo deste
remodelamento não está totalmente claro, porem, atrofia de uma ou mais camadas
da parede vascular, devido à diminuição da densidade celular ou aumento da rigidez
de vaso poderiam ser responsáveis pela alteração da estrutura vascular. Coats et al.
(2003) demonstraram hipotrofia das camadas adventícia e média vasculares devido
Discussão 141
à hipoplasia em artérias isquêmicas dos leitos subcutâneo e muscular esquelético.
No presente estudo, foi observada uma redução, embora não estatisticamente
significativa, no número total de células das artérias de ratos Ouabaína. Assim,
alguns sinais de hipoplasia nas artérias de ratos Ouabaína poderiam contribuir, pelo
menos em parte, para o remodelamento hipotrófico observado. Entretanto, desde
que o número de células e o volume da parede foram menores nas artérias de ratos
tratados com ouabaína, a densidade celular permaneceu inalterada após tratamento
com este digitálico. Corroborando estes resultados, Orlov et al. (2004) demonstraram
que em células endoteliais aórticas de suínos, a exposição a longo prazo com
ouabaína promove necrose, cujo efeito parece ser independente da alteração do
gradiente de Na+ e K+ decorrente da inibição da Na+,K+-ATPase. Por outro lado, em
artérias de resistência de ratos espontaneamente hipertensos (SHR-SP) e em
artérias basilares de ratos com hipertensão induzida pela inibição crônica do óxido
nítrico, uma redução do tamanho dos núcleos das células endoteliais foi observado
(Arribas et al., 1997a,b). No presente estudo, a morfologia dos núcleos das células
musculares lisas e endoteliais das artérias de ratos Controle e Ouabaína foi
analisada; nenhuma diferença sobre este parâmetro foi observada entre os grupos.
O remodelamento hipotrófico também pode ser produzido por alterações do
fluxo sanguíneo (Langille et al., 1989), o qual pode ser produzido por alterações
funcionais. Assim, tanto o aumento da resposta vasoconstritora como a diminuição
da produção de fatores vasodilatadores endoteliais podem reduzir o fluxo sangüíneo
nestes vasos. Entretanto, os resultados aqui obtidos demonstram que tanto a
resposta à noradrenalina, quanto o relaxamento induzido por acetilcolina não foram
alterados pelo tratamento com ouabaína. Em conjunto estes resultados excluem as
alterações funcionais como sendo causa do remodelamento observado em artérias
de ratos hipertensos pelo tratamento com ouabaína.
O remodelamento vascular observado em artérias de ratos Ouabaína parece
representar, assim como em outros modelos de hipertensão, um mecanismo
contribuinte para o processo hipertensivo, uma vez que, resultou em diminuição do
diâmetro luminar. Na hipertensão, o remodelamento vascular para dentro, ou seja,
com redução do diâmetro luminar, é apontado como causa fundamental para o
aumento da resistência vascular periférica. De acordo com a Equação de Poiseuille
a resistência vascular varia inversamente proporcional a quarta potência do raio;
sendo este uma função das propriedades mecânicas vasculares ativas e passivas.
Discussão 142
As propriedades passivas podem ser descritas pela relação pressão: diâmetro em
condições de completo relaxamento vascular, enquanto as propriedades ativas
correspondem a uma função do nível de ativação das células musculares lisas, da
quantidade e da organização destas células na parede vascular. Considerando um
dado nível de ativação das células musculares lisas e que este produz uma
determinada força por área de secção transversal, a pressão contra a qual o vaso irá
contrair, de acordo com a Lei de Laplace, é proporcional a relação parede: lúmen, ou
mais corretamente à relação média: lúmen (Mulvany, 1984). Assim, o aumento da
relação parede: lúmen em artérias de resistência pode ser considerado como um
dos mecanismos contribuintes para o aumento da resistência vascular periférica e
dessa forma para a manutenção da pressão arterial elevada. No presente trabalho,
as propriedades ativas da parede vascular não foram aparentes, de maneira que a
relação pressão: diâmetro em artérias mesentéricas de resistência de ambos os
grupos foi similar na presença e na ausência de cálcio, como previamente descrito
por Briones et al. (2003). Por isso, não fica claro no presente estudo que
conseqüências poderiam ter o aumento da relação parede/ média: lúmen sobre as
propriedades ativas da parede arterial de artérias mesentéricas de resistência de
animais tratados com ouabaína. Por outro lado, em vasos de resistência de animais
espontaneamente hipertensos, a relação parede: lúmen aumentada não parece
estar associada com alterações das propriedades ativas da parede vascular (Izzard
et al., 1996a,b; Bund, 2000).
Como descrito acima, o diâmetro interno vascular depende das propriedades
ativas da parede arterial em resposta à pressão transmural e da complacência desta.
A complacência, que é a capacidade do vaso distender-se em resposta a aumentos
de pressão intraluminar, depende, por sua vez, da geometria e da rigidez dos
elementos que constituem a parede vascular. Esta complacência pode ser reduzida
em conseqüência de um diâmetro interno reduzido, como por exemplo na
hipertensão arterial, sendo este um exemplo típico de efeito dependente da
geometria, ou pode sofrer alterações em conseqüência de mudanças do módulo
elástico. O módulo elástico (Incremental elastic modulus) depende da rigidez dos
constituintes da parede vascular, colágeno, elastina, células musculares lisas, etc., e
é independente da geometria.
Diversos estudos previamente publicados têm demonstrado que o
remodelamento vascular na hipertensão cursa com alterações das propriedades
Discussão 143
mecânicas da parede arterial (Baumbach et al., 1988; Hadju & Baumbach 1994;
Intengan et al., 1999a; Bund, 2000; Briones et al., 2003; Izzard et al., 2003). No
presente trabalho, foi observado que artérias mesentéricas de resistência de ratos
hipertensos pelo tratamento com Ouabaína apresentaram aumento da rigidez
arterial, como evidenciado pelo maior valor de β (Incremental elastic modulus)
nestas artérias comparadas ao grupo Controle. Estes resultados são semelhantes a
muitos outros previamente publicados com outros modelos de hipertensão, onde
também é descrito aumento da rigidez da parede arterial (Hadju & Baumbach, 1994;
Intengan et al., 1999a; Briones et al., 2003). Esse aumento da rigidez pode ser um
dos mecanismos responsáveis pela redução do diâmetro observado nas artérias dos
animais tratados com ouabaína. Por outro lado, evidências de não alteração (Dunn &
Gardiner; Intengan & Schiffrin, 1998) ou mesmo redução (Hadju & Baumbach, 1994;
Intengan et al., 1999b) da rigidez arterial também têm sido descritos na hipertensão.
Baseado em evidencias previamente descritas para outros tipos de hipertensão, é
provável que em vasos de resistência de animais Ouabaína, apesar da maior rigidez
dos componentes da parede vascular, a alteração da geometria arterial observada
representa um mecanismo para redução do stress de parede in vivo, o qual
protegeria a parede vascular dos danos ocasionados pelo aumento da pressão
arterial. Concordando com esta hipótese, o stress de parede das artérias de animais
tratados com ouabaína foi significativamente menor que aquele observado em
artérias de animais Controle.
A matriz extracelular vascular é um dos principais responsáveis pelas
propriedades mecânicas da parede arterial e também está envolvida em processos
biológicos como adesão, proliferação e migração celular (Tuñón et al., 2000). As
interações funcionais e estruturais entre as proteínas da matriz extracelular e as
células musculares lisas, através de moléculas de adesão, por exemplo, podem ser
importantes na manutenção da integridade vascular, e alterações nestas ações
poderiam contribuir para alterações na rigidez da parede arterial. Na hipertensão tem
sido demonstrado que devido às alterações dos componentes da matriz extracelular
e das correspondentes moléculas de adesão, as interações entre as células
musculares lisas e as proteínas da matriz se modificam quantitativamente e/ ou
topograficamente, produzindo reorganização das células musculares lisas e uma
reestruturação da parede vascular (Intengan et al., 1999a). Está descrito também
que o colágeno acumula em maior proporção em artérias mesentéricas de
Discussão 144
resistência de ratos hipertensos (Intengan et al., 1999a), em conseqüência, por
exemplo, do estímulo por fatores humorais que estão aumentados na hipertensão,
como a angiotensina II (Mifune et al., 2000). Por outro lado, na parede vascular
existem enzimas proteolíticas que são responsáveis pela digestão das proteínas que
compõem a matriz extracelular, como a colagenase, cuja atividade pode estar
reduzida na hipertensão (Intengan & Schiffrin, 1999 abstract).
O colágeno representa uma das principais proteínas da matriz extracelular,
podendo ser encontrado na parede vascular em diferentes tipos. Nas camadas
íntima, média e adventícia o principal constituinte é o colágeno tipo I e III, enquanto
o colágeno do tipo IV e V pode ser encontrado na membrana basal das células
endoteliais e musculares lisas juntamente com os tipos I e III. Esta proteína
comporta-se como um dos principais determinantes do módulo elástico (Bank et al.,
1996), e na hipertensão o aumento de sua deposição de colágeno é apontado como
uma das principais causas para o aumento da rigidez arterial (Laurant et al., 1997;
Intengan et al., 1999a). Com relação ao comportamento da curva de relação stress-
strain, está descrito que a parte inicial (correspondente à relação stress-strain em
valores mais baixos de pressão) reflete o grau de estiramento das fibras elásticas,
enquanto que a parte superior da curva (correspondente à relação stress-strain em
valores mais altos de pressão) reflete a rigidez das fibras elásticas em seu grau
máximo de estiramento, assim como o grau de estiramento das fibras colágenas
(Dobrin, 1978). Comparando a relação stress-strain entre os grupos experimentais, é
possível observar que em todos os pontos superiores da curva, a qual representa a
contribuição do colágeno para a rigidez da parede arterial, existe um desvio para a
esquerda no grupo Ouabaína. Este desvio representa uma maior rigidez arterial e
aponta uma provável participação do colágeno neste efeito. Baseado nesta
possibilidade, o conteúdo total de colágeno em artérias mesentéricas de resistência
de ratos Controle e Ouabaína foi avaliado através da coloração com Picro sirius e,
apoiando a hipótese anteriormente citada, os resultados obtidos demonstraram que
a hipertensão induzida por ouabaína em ratos cursa com aumento do conteúdo total
de colágeno em artérias mesentéricas de resistência. O mecanismo responsável por
essa maior deposição de colágeno nas artérias de animais Ouabaína não é certa,
mas pode ser conseqüência de um aumento na síntese e/ ou redução da sua
degradação, como demonstrado em outros modelos de hipertensão.
Discussão 145
Outro componente da matriz extracelular envolvida no processo de
remodelamento vascular na hipertensão é a elastina. Até pouco tempo atrás, a
contribuição desta proteína para as propriedades estruturais e mecânicas de vasos
de resistência de animais hipertensos era pouco estudada. Entretanto, alterações do
seu conteúdo e organização em vasos de condutância de animais hipertensos têm
sido previamente bem documentado (Keeley & Alatawi, 1991; Keeley et al., 1991;
Boumaza et al., 2001). Provavelmente isto se devesse ao fato de que as artérias de
resistência contêm uma pequena proporção de elastina comparada a vasos de
condutância. Entretanto, Briones et al. (2003), utilizando artérias mesentéricas de
resistência de rato, demonstraram que a elastina possui um papel fundamental na
manutenção da geometria vascular e participa de maneira importante como um
contribuinte para as alterações estruturais e mecânicas da parede arterial na
hipertensão.
No presente trabalho, é possível observar, que a relação stress-strain, nos
pontos inferiores da curva, a qual representa principalmente a participação da
elastina para a rigidez da parede arterial, existe um pequeno desvio para a esquerda
no grupo Ouabaína, o que sugere a contribuição da elastina neste efeito. Através de
microscopia confocal, foram investigadas possíveis alterações no conteúdo e
organização da elastina em artérias mesentéricas de resistência de ratos
hipertensos, as quais poderiam participar do processo de remodelamento observado
após tratamento crônico com ouabaína. A elastina possui propriedades de
autofluorescência; excitada a 488 nm emite fluorescência que pode ser detectada a
um comprimento de onda de 500-560 nm (Wong & Langille, 1996; Boumaza et al.
2001). A fluorescência detectada através de microscopia confocal corresponde a
elastina e não ao colágeno uma vez que artérias incubadas com NaOH 0,1 M a 75°
C (método usado para digestão do conteúdo de colágeno) apresentavam igual
fluorescência quando comparado aqueles segmentos na ausência de NaOH e
temperatura ambiente (Briones et al., 2003). Além disso, como previamente
demonstrado por Briones et al. (2003) o tratamento de segmentos arteriais com
elastase é capaz de remover completamente esta fluorescência, comprovando que
realmente corresponde a elastina.
Estimada pela intensidade de fluorescência na lâmina elástica interna, não foi
encontrado nenhuma diferença na quantidade de elastina entre os segmentos
arteriais de ratos Controle e Ouabaína. De maneira semelhante, a organização da
Discussão 146
elastina na lâmina elástica interna não mostrou sinais de alterações nas artérias dos
animais Ouabaína comparados ao grupo Controle. Nestas artérias, a área e o
número das fenestrações da lâmina elástica interna foram similares entre os grupos
experimentais estudados. Entretanto o volume ocupado pela lâmina elástica interna
na parede arterial foi menor no grupo Ouabaína, comparado ao grupo Controle. Este
menor volume da lâmina elástica interna em artérias de ratos tratados com ouabaína
provavelmente deva-se ao menor tamanho que estas artérias apresentam
comparadas aquelas dos animais Controle. Os resultados apresentados aqui
sugerem, portanto, que, se a elastina comporta-se como um fator contribuinte para
as alterações mecânicas e estruturais de vasos de resistência de animais Ouabaína,
esse efeito não parece ser conseqüência de alterações na sua quantidade e/ ou
organização na parede arterial. Estes resultados são diferentes daqueles obtidos por
Briones et al. (2003) demonstrando que alterações na organização da elastina
contribui de maneira significativa para as alterações mecânicas e estruturais de
vasos de resistência de animais espontaneamente hipertensos. Estes autores
demonstraram que, embora não houvesse mudanças na quantidade total de
elastina, artérias de animais espontaneamente hipertensos apresentavam redução
do tamanho das fenestrações da lâmina elástica interna, o que, por sua vez, tornaria
a lâmina elástica interna mais rígida e menos distensível (Briones et al. 2003).
Corroborando estes resultados, esses mesmos autores demonstraram que após
digestão da elastina com elastase, as diferenças estruturais (redução do diâmetro
interno, aumento da relação parede:lúmen) e mecânicas (redução do stress de
parede, aumento da rigidez arterial), antes observadas nas artérias de ratos
hipertensos, foram abolidas (Briones et al. 2003).
Em conjunto, os resultados apresentados no presente trabalho sugerem que
alterações no conteúdo total de colágeno em artérias mesentéricas de ratos tratados
com ouabaína podem contribuir de maneira significativa para o aumento da rigidez
observado nestas artérias. Entretanto, outras possíveis alterações decorrentes do
tratamento crônico com ouabaína sobre outros componentes da parede arterial não
podem ser descartadas.
Como demonstrado anteriormente, as alterações funcionais induzidas pelo
tratamento crônico com ouabaína sobre a resposta vasoconstritora à noradrenalina e
atividade da Na+, K+-ATPase em vasos de resistência e de condutância (Xavier et
Discussão 147
al., 2004b,c) não foram prevenidas pelo tratamento anti-hipertensivo com losartan,
descartando o efeito da pressão elevada ou do sistema renina-angiotensina sobre
estas alterações. Um questionamento que surgia era se o mesmo poderia ocorrer
com as alterações estruturais e mecânicas, ou seja, se o tratamento anti-
hipertensivo com losartan seria incapaz de modificar as propriedades estruturais e/
ou mecânicas em vasos de resistência de animais ouabaína. Embora tenha sido
descrito que uma das principais causas para o remodelamento vascular na
hipertensão seja a própria pressão arterial elevada (Mulvany, 2002), inúmeros
trabalhos têm demonstrado que o tratamento anti-hipertensivo por si só não é
condição única para reverter estas alterações estruturais (Thybo et al., 1995; Park &
Schiffrin, 2000; Schiffrin & Touyz, 2004), o que sugere que a manutenção destas
alterações envolve outros processos.
Os estudos experimentais revelam que a angiotensina II é um dos principais
fatores envolvidos no processo de remodelamento vascular na hipertensão. A
angiotensina II promove crescimento e proliferação de células musculares lisas
(Touyz et al., 1999, Touyz & Schinffrin, 2000), aumenta a síntese e reduz a
degradação de colágeno na parede vascular (Intengan et al., 1999a; Varo et al.,
2000), aumenta a expressão de moléculas de adesão (Intengan et al., 1999a; Pueyo
et al., 2000), além de possuir importante ação pró-inflamatória induzindo a produção
de espécies reativas de oxigênio, citocinas, moléculas quimiotáticas, etc. (Suematzu
et al., 2002). Além disso, está amplamente demonstrado que o tratamento com
antagonistas dos receptores AT1 para a angiotensina é capaz de melhorar
significativamente as alterações estruturais e mecânicas presentes na hipertensão
(Schiffrin et al., 1994; Schiffrin et al., 1995; Thybo et al., 1995; Rizzoni et al., 1998;
Intengan et al., 1999a). Esta melhora parece ser independente do efeito anti-
hipertensivo dos antagonistas do receptor AT1, uma vez que os beta-bloqueadores
produzem igual redução na pressão arterial, mas não foram capazes de reverter as
alterações estruturais em pacientes hipertensos (Schiffrin et al., 1994; Schiffrin &
Deng, 1995). No presente estudo, o efeito do tratamento crônico com losartan sobre
as alterações estruturais e mecânicas das artérias mesentéricas de resistência de
ratos Ouabaína foi avaliado.
Os resultados obtidos demonstraram que, além do seu efeito preventivo no
desenvolvimento de hipertensão, o tratamento crônico com losartan preveniu as
alterações estruturais e mecânicas em artérias de resistência de ratos submetidos
Discussão 148
ao tratamento crônico com ouabaína. O tratamento com losartan preveniu a redução
do diâmetro interno e externo e o aumento da relação parede:lúmen, além do
aumento da rigidez em artérias mesentéricas de ratos tratados com ouabaína. Estes
resultados são corroborados pela observação de que o tratamento crônico com
losartan preveniu o aumento da deposição de colágeno em artérias de ratos
Ouabaína, reforçando a importante contribuição deste componente da matriz
extracelular sobre as alterações mecânicas das artérias de ratos hipertensos pelo
tratamento crônico com ouabaína. Estes resultados em conjunto sugerem que,
embora a angiotensina II não participe das alterações vasculares funcionais
decorrentes do tratamento crônico com ouabaína, ela parece ser responsável pelo
remodelamento vascular presente neste modelo de hipertensão. Seus efeitos sobre
a parede arterial de vasos de resistência de animais Ouabaína resultam de um
aumento do conteúdo total de colágeno que provocam aumento da rigidez arterial e
diminuição do diâmetro interno. Além disso, estes resultados descartam uma
provável contribuição direta da ouabaína, cujos níveis plasmáticos encontram-se
elevados neste modelo, sobre as alterações estruturais observadas. É importante
ressaltar que o tratamento crônico com losartan não afetou a estrutura ou as
propriedades mecânicas em artérias de ratos que receberam pellets contendo
placebo. Com os resultados obtidos aqui, não se pode afirmar se essa maior
participação do sistema renina-angiotensina sobre a estrutura e a mecânica das
artérias de animais Ouabaína, se deva a uma ativação direta da ouabaína sobre
este sistema ou se decorre de um aumento secundário à pressão arterial elevada,
ou mesmo da hiperatividade simpática, uma vez que o sistema renina-angiotensina
se encontra mais ativado em outros modelos de hipertensão. Entretanto,
recentemente Padilha et al., (2004) demonstraram que a ouabaína, utilizada em
concentrações nanomolares, promove a liberação de angiotensina II no leito
vascular caudal de ratos espontaneamente hipertensos, o que sugere a hipótese de
que a ouabaína administrada cronicamente pode diretamente no sistema vascular
ativar o sistema renina-angiotensina local. Porém, no sistema nervoso central este
efeito da ouabaína sobre o sistema renina-angiotensina já está bem descrito (Huang
& Leenen, 1999).
Conclusões 149
6. Conclusões Os resultados experimentais obtidos no presente estudo demonstraram pela
primeira vez que a hipertensão induzida pelo tratamento crônico com ouabaína cursa
com alterações funcionais e estruturais das artérias mesentéricas de resistência de
rato.
- Ao contrário do observado em vasos de condutância (Rossoni et al., 2002a,b;
Xavier et al., 2004b,c) o aumento do efeito modulatório do óxido nítrico em artérias
mesentéricas de resistência de animais Ouabaína não foi capaz de alterar a
resposta a noradrenalina. Isso provavelmente deva-se a um contrabalanço
decorrente do prejuízo da resposta do fator hiperpolarizante derivado do endotélio
em artérias de resistência de animais Ouabaína.
- Apesar de ter sido observado aumento da atividade funcional da Na+K+ATPase em
artérias de resistência de ratos Ouabaína, esta resposta, que provavelmente
produziria maior hiperpolarização das células musculares lisas, não parece ter
qualquer influência sobre a resposta contrátil induzida por noradrenalina.
- Estas alterações funcionais não parecerem mecanismos contribuintes para o
aumento da resistência vascular periférica, entretanto, o remodelamento vascular
observado nas artérias mesentéricas de resistência de ratos Ouabaína parecem,
assim como em outros modelos de hipertensão, contribuírem para a resistência
vascular periférica aumentada e conseqüentemente para a manutenção da pressão
arterial elevada após tratamento crônico com ouabaína. As artérias dos animais
tratados com este digitálico apresentaram diâmetro luminar reduzido associado
provavelmente a maior rigidez da parede arterial.
- Embora não tenha sido capaz de prevenir as alterações sobre a participação dos
fatores endoteliais na resposta à noradrenalina ou o aumento da atividade da
Na+,K+-ATPase, o tratamento crônico com losartan preveniu o remodelamento
vascular presente nos animais Ouabaína e impediu o desenvolvimento de
hipertensão nestes animais. Estes resultados sugerem, portanto, a participação do
sistema renina angiotensina como um provável mediador das alterações vasculares
Conclusões 150
estruturais decorrentes da hipertensão induzida por ouabaína. Em conjunto com os
resultados previamente publicados por Zhang & Leenen (2001) e Huang et al.,
(2001), os resultados aqui obtidos apresentam mecanismos adicionais que sugerem
a participação do sistema renina-angiotensina na hipertensão induzida pela
administração crônica de ouabaína.
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