Alvos possíveis de transformação genética:Núcleo (N)Plastos (P) (resistência a herbicidas do tipo triazina)Mitocôndrias (M) (cms - "cytoplasmic male sterility")

N

M

P

- Célula vegetal -

Situação que ocorre na natureza:

Bactéria com o Ti -plasmídio

Ti -plasmídio (responsável pela virulência)

Infecção de plantas feridas e transferência do DNA para as células

Planta com agrobactérias vivendo em "crown gall"

Colonização genética das plantas por infecção por Agrobacterium tumefaciens

Indução pelo T-DNA de: 1 - crescimento independente de hormonas, 2 - síntese de opinas (compostos de carbono e azoto

dos quais a bactéria se alimenta

Utilização laboratorial do Agrobacterium:

Cultura in vitro do material vegetal (plântulas micropro-pagadas e germinantes)

A. rhizogenes

Agrobacterium

desarmado

Agrobacterium

Ferimento do materialvegetal (seccionamento)

Infecção dos explantes coma suspensão bacteriana

Leitura da absorvência a 600 nm

Aplicação sobre azona de ferida(24-48h)

Incubação numa solução diluída debactérias (durante alguns segundosa alguns minutos) e transferência dos explantes para meio fresco paracocultura com as bactériasCultura em meio

líquido com agitação(adição ou não deacetosseringona)

Após a cocultura:- transferência dos explantes para meio de cultura fresco (com ou sem prévia lavagem em água ou meio cultura, ou secagem sobre papel de filtro estéril)- o meio fresco deve conter antibióti- cos para eliminar o Agrobacterium

Indução de rebentos transformadosem meio de cultura selectivo (por ex. com antibióticos de selecção) e na presença dos fitorreguladoresadequados

Formação de raízes no materialinfectado. As raízes excisadas crescem e ramificam em meio de cultura sem hormonas

COMO SE MODIFICA GENETICAMENTE UMA PLANTA

As estratégias mais utilizadas detransferência de DNA para plantas:

O DNA entra através

Vector não biológico: Bombardeamentocom micropartículas, de ouro ou tungsténio

(com cerca de 1 m de diâmetro)

Transferência directa:da membrana celular permeabilizada porchoques eléctricos ou agentes permeabili-zantes (como o polietilenoglicol)

Vector biológico: Agrobacterium(uma bactéria do solo com duas espécies

importantes: A. tumefaciens e A. rhizogenes)

Plantas micropropagadas (amendoeira)utilizadas como fonte de material pararegeneração adventícia e transformação genética

Diferenciação de rebentos adventíciosa partir de folhas em meio de cultura

Plantas regeneradas de folhas transfor-madas, à esquerda uma plântula resis-tente ao antibiótico de selecção (canami-cina) e à direita uma planta sensível (nãotransformada)

Monitorização da presença de um genede referência introduzido por transfor-mação. Por incubação num substractoadequado, a enzima codificada pelo ge-ne dá origem a um produto de cor azulque permite identificar as células/plantastransformadas (à esquerda duas plantastransformadas e à direita 3 plantas controlo)

1. Estratégia global: Identificar o objectivo de

melhoramento

Identificar e isolar o(s) gene(s) deinteresse

Clonar o(s) gene(s) num vectorapropriado

Transferir o(s) gene(s) deinteresse à planta

Avaliar a integração e ocomportamento do(s) gene(s) naplanta

Avaliar o comportamento daplanta transgénica no terreno

COMO SE MODIFICA GENETICAMENTE UMA PLANTA

Representação esquemáticado processo de infecção:

OHH CO3

OCH 3

COCH 3

OHH CO3

OCH 3

COCH 3

OHH CO3

OCH 3

COCH 3

A vir

A vir

A vir

vir G vir G*

F A B G C D E

T-DNA

DD

Plasmídio Ti

chv A chv B

(genes ligação ao hospedeiro)

Cromossomabacteriano

Plasmídio Ti Região de virulência

(Acetosseringona - ou outros compostos produzidos pelas células vegetais feridas)

Região excisada etransferida à planta, por informa-ção vinda da região de virulência

Receptor membranar

(Molécula que vai activar a região de virulência)

– 1/3 da produção de trigo perde-se devido a:Ervas daninhasPragasDoenças (resistência a herbicidas, pragas, doenças?...)

– As quantidades de arroz que se perdem anualmente devido a infecçõescom o vírus Tungro davam para alimentar 15.000.000 de pessoas

(introdução de resistência à virose?)

–Anualmente 2.000.000 de crianças ficam cegas por falta de pró-vit. A(melhoramento do potencial nutritivo do arroz comenriquecimento em pró-vitamina A por introdução degenes da via biossintética dos carotenos, ß-caroteno?)

EXEMPLOS DE ALGUNS PROBLEMAS ACTUAIS SOLUCIONÁVEIS POR ENGENHARIA GENÉTICA

– 900 milhões de pessoas passam fome (este número cresce

anualmente em 95 milhões)

– Os oceanos e os terrenos de cultura são explorados aos seus

limites– A quantidade de terra arável por pessoa diminui

continuamente– As perdas de culturas por pestes, doenças e ervas daninhas

atinge os 40-60%– As perdas anuais de arroz são superiores a 200 milhões de

metros cúbicos, o equivalente a alimento para 1000 milhões de pessoas

ESTRATÉGIAS E PROBLEMAS DA ENGENHARIA GENÉTICA DE PLANTAS

Identificação, isolamento e manipulaçãoin vitro dos genes

Transferência dos genes manipulados para as células vegetais

Cultura das células para obter plantas trans-génicas ou linhas de células transgénicas, man-tidas in vitro como callus, suspensões ou raízes

OBJECTIVOS DAENGENHARIA GENÉTICA DE PLANTAS

Resistência a insectos

Resistência a herbicidas

Resistência a doenças (vírus, fungos, bactérias)Expressão de proteínas importantes do ponto de vista farmacológico (i.e.: antigéneos)

Inibição do amadurecimento de frutos

Criação de esterilidade masculina

Manipulação do metabolismo do carbono ou fósforo

Melhoramento da absorção de ferro

……