UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS

GENOTIPAGEM DE Cryptococcus neoformans E Cryptococcus gattii ISOLADOS DE AMOSTRAS AMBIENTAIS COLETADAS EM FLORESTA

NATIVA, RIOS E IGARAPÉSDA CIDADE DE MANAUS-BRASIL

AMAURY DOS SANTOS BENTES

Manaus

2014

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AMAURY DOS SANTOS BENTES

GENOTIPAGEM DE Cryptococcus neoformans E Cryptococcus gattii ISOLADOS DE AMOSTRAS AMBIENTAIS COLETADAS EM FLORESTA

NATIVA, RIOS E IGARAPÉS DA CIDADE DE MANAUS-BRASIL

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.

Orientador:Prof°. PhD. João Vicente Braga de Souza

Co-orientadora:Profª. Dra. Ani Beatriz Jackisch Matsuura

Manaus

2014

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Ficha Catalográfica

Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária Maria Eliana N Silva,lotada na

Escola Superior de Ciências da Saúde - UEA

B475g Bentes, Amaury dos Santos.

Genotipagem de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii isolados de amostras ambientais coletadas em floresta nativa, rios e igarapés da cidade de Manaus - Brasil. /Amaury dos Santos Bentes-- Manaus : Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical, 2014.

Xi 63 f. : il.

Dissertação (Mestrado) apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas – UEA/FMT, 2014.

Orientador: Prof. PhD. João Vicente Braga de Souza Co-orientadora: Profª. Dra. Ani Beatriz Jackisch Matsuura

1. Isolamento ambiental2. Genotipagem 3.Cryptococcus gattii 4. Cryptococcus neoformans I. Título.

CDU: 614.4

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FOLHA DE JULGAMENTO

GENOTIPAGEM DE Cryptococcus neoformans E Cryptococcus gattii ISOLADOS DE AMOSTRAS AMBIENTAIS COLETADAS EM FLORESTA

NATIVA, RIOS E IGARAPÉS DA CIDADE DE MANAUS-BRASIL

AMAURY DOS SANTOS BENTES

Banca Julgadora:

______________________________________

Presidente

______________________________________

Membro

______________________________________

Membro

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AGRADECIMENTOS

A Deus por ter me dado vida e por me fazer entender seus propósitos.

A minha preciosa mãe Meri Lobato e meu querido pai Antônio Bentes por todo apoio e paciência. Agradeço pelo exemplo de luta, por terem acreditado em mim e por todo investimento em minha formação.

Ao meu grande orientador, PhD João Vicente Braga de Souza, pela oportunidade, conhecimento, paciência e por ser um grande pai científico.

A minha co-orientadora, Dra. Ani Beatriz Jackisch Matsuura do Instituto Leônidas e Maria Deane FIOCRUZ Amazônia, por todo apoio, incentivo e por ser alguém que eu pude contar na realização desse projeto e por muitas vezes sem menos saber, ser uma pessoa que conseguia me acalmar.

Á minha grande amiga Ana Karla Lima Freire Cabral, pela ajuda e orientação que me levou a amar a pesquisa, por ser uma excelente parceira de trabalho, pela companhia e me alegrar nos bons e maus momentos, pelos conselhos, por todo ensino de genotipagem e por sempre torcer pelo meu sucesso.

Ao meu “braço direito e esquerdo” na realização deste trabalho, os alunos de iniciação científica Silviane Bezerra Pinheiro e Diego Fernando Silva Rocha por todo apoio técnico.

Aos meus familiares e amigos que sempre me ajudaram: minha vó Dulcina Lobato, tia Lande, tio Ney, tia Rocy, Raphael Valle, Osmar, Nádia, Desiree, Renan Cezar e Aline Moreira.

A toda equipe do laboratório de Micologia Médica Dra. Ana Claúdia. Aos técnicos dona Lili, Rosalvo, Raimundo, Francisco, estagiários, mestrandos e doutorandos pela ajuda nos experimentos. Ao Laboratório de Micobacteriologia na pessoa do Dr. Mauricio Ogusku e Dra. Aya Sadahiro pelo auxilio sempre presente no uso do termociclador e ao Dek do Laboratório de Limnologia pela análise de água.

Ao Dr. Bodo Wanke e Dra. Marcia Lazéra do Instituto de Nacional de Infectologia IPEC/FIOCRUZ-RJ pelos ensinamentos e pela parceria na realização deste trabalho.

A Universidade do Estado do Amazonas que em parceria com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas foram excelentes no ensino e qualificação profissional através do Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical -PPGMT.

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Aos meus amigos do mestrado e doutorado do PPGMT pela convivência e pela troca de conhecimento: Joyce Matsuda, Camila Boto, Andrea Souza, Anne Almeida, Edson Fidelis, Efrem D’Avila, Ione Pinto, Karolina Sabino, Keillen Campos, Larissa Brasil, Loren Anselmo, Luciane Souza, Priscila Bentes e Sandra Rufino.

Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia por ceder o espaço do Laboratório de Micologia Médica para a realização dos ensaios de genotipagem. Agradeço pela autorização na entrada da Reserva Florestal Adolpho Ducke e por ceder o transporte para a realização das coletas.

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DECLARAÇÃO AS AGÊNCIAS FINANCIADORAS

Agradeço as agências que tornaram possível a realização desse trabalho. O meu muito obrigado,

À Superintendência da Zona Franca de Manaus-Suframa e Fundação de Apoio Institucional Muraki-FMuraki pelo apoio na estrutura deste Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical.

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio - Capes pela concessão de bolsa de pesquisa.

À Fundação de Amparo à pesquisa do Estado do Amazonas - FAPEAM pelo financiamento desta pesquisa através do edital PPP 2010.

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RESUMO

A Criptococose é endêmica na Região Amazônica, sendo causada em sua maioria por Cryptococcusneoformans (genótipo VNI) e Cryptococcus gattii (genótipo VGII). No entanto, a literatura apresenta poucas informações sobre a distribuição dos agentes causadores dessa doença no ambiente amazônico. O objetivo do presente estudo foi isolar e genotipar as linhagens de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii presentes em amostras ambientais de rios e floresta nativa da cidade de Manaus, Brasil.Foram coletadas 600 amostras ambientais da Reserva Florestal Adopho Ducke, sendo 290 amostras de solo, 290 amostras de material vegetal em decomposição e 20 amostras de água; Nos Portos Fluviais, foram coletadas 100 amostras de água do rio negro; e 105 amostras de água e 27 amostras de solo da margem de sete (07) igarapés da cidade de Manaus selecionados para este estudo. As amostras foram enviadas e processadas no laboratório de Micologia. Foi realizado teste de produção de melanina, sensibilidade a cicloheximida, teste de urease e teste de CGB para identificação fenotípica das amostras positivas, e posteriormente foi realizado a identificação genotípica com o uso das técncas de PCR-RFLP URA5 e PCR-Fingerprinting.De um total de 826 amostras ambientais coletadas, na zona urbana e rural de Manaus, sete (7) foram positivas quanto à presença das leveduras fenoloxidase positivo. Sendo três (3) provenientes da Reserva Florestal Adolpho Ducke (RFAD), três (3) das águas do Rio Negro (PSR20, PSR 22, RN2) e uma da margem de um igarapé dentro da região metropolitana (SJ03). Os isolados obtidos das 3 amostras da Reserva Ducke (n=60) e das 3 amostras de água do Rio Negro (n=60) eram todos da espécie C. gattii do genótipo VGII, já os isolados obtidos da única amostra de solo da margem do igarapé do Tancredo (n=20) foram identificados como da espécie C. neoformans e do genótipo VNI, totalizando 140 isolados. Com relação ao “tipos sexuais” ou mating-types (Mat α e Mat a), todos os clones eram MAT α. O presente trabalho demonstrou a prevalência da espécie C. gattii do genótipo VGII Mat α nas amostras ambientais investigadas e por apresentar o Rio Negro como local de fácil isolamento dessa levedura.

Palavras chaves: Isolamento ambiental, Genotipagem, Cryptococcusgattii, Cryptococcus neoformans, PCR-Fingerprinting M13, PCR-RFLP URA5

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ABSTRACT

The Cryptococcosis is endemic in the Amazonian Region and it has being caused in majority by Cryptococcusneoformans (VNI genotype) and Cryptococcus gattii (VGII genotype). However, studies showed lower informations about the distribution of these causative agents of Cryptococcosis in amazon environment. The purpose of this present study was isolate and genotype the frequency of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii encountered in samples from rivers and native forest in Manaus city, AM, Brazil. 600 environmental samples were collected from the Reserva Florestal Adolpho Ducke, and 290 soil samples, 290 samples of plant material decaying and 20 water samples; In Inland Seaport were collected 100 water samples of black river; and 105 water samples and 27 soil samples from the grace of seven (07) Manaus city streams selected for this study. Samples were sent to and processed in the laboratory Mycology. Melanin production was performed test, sensitivity to cycloheximide, urease test and CGB test for phenotypic identification of positive samples and was subsequently carried out with the use of genotypic identification of técncas PCR-RFLP and PCR-fingerprinting URA5.A total of 837 environment samples collected, in the metropolitan region of Manaus, seven were positives to presence of phenoloxidase yeast. Being three samples from Forest Reserve Adolpho Ducke (FRAD), three from Negro river’s freshwater (PSR20, PSR 22, RN2) and one from stream margin within metropolitan region (SJ03). The isolates were acquired of three samples from Ducke Reserve (n=60) and three from Negro river’s freshwater (n=60). As a result, they were all belonging to C. gattii specie of VGII genotype; therefore, isolates obtained from Negro river’s freshwater (n=60) were all from a unique soil sample from Tancredo stream margin (n=20). They were identified as C. neoformans specie and VNI genotype, totalizing 140 clones. Thus, in relation to “sexual types” or mating- types (Mat α e Mat a), all of these clones were MAT α. The currently study was important because it showed the prevalence of C. gattii specie with VGII genotype Mat αin environment samples investigated, and it presented Negro river as a place of easy isolation of this yeast.

Key words: Isolation, Genotyping, Cryptococcusgattii, Cryptococcus neoformans, PCR-Fingerprinting M13, PCR-RFLP URA5.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Fluxograma de Infecção por Leveduras patogênicas do gênero Cryptococcus .................................................................................................... 11

Figura 2(2A – G) – Imagem das árvores com presença de C. neoformans no Brasil descritos na literatura. ............................................................................ 16

Figura 3. Local de coleta das amostras ambientais na cidade de Manaus. ..... 22

Figura 4. A) Garrafa de Rutnner para coleta de água; b) Coleta de água dos igarapés. Fonte: Amaury Bentes ...................................................................... 25

Figura 5. Meio de cultivo Niger Seed Agar – NSA. ........................................... 26

Figura 6. Meio ágar Mycosel. ........................................................................... 27

Figura 7. Meio urease. ..................................................................................... 27

Figura 8. Meio Canavanina-Glicina-Azul de Bromatimol. ................................. 28

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LISTA DE ABREVIATURAS

AIDS - Sindrome da Imunodeficiência Adquirida AFLP - Amplified Fragment Lengh Polymorphism AFLP6, 7 - Amplified Fragment Lengh Polymorphism tipo 6 e 7 BACTEC - Instrumented Blood Culture Systems C3 - Complement Type 3 DNA - Desoxirribonucleic Acidic dNDP - Desoxirribonucleosídeo Trifosfato ELISA - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz g - Gramas Galxm - Galactoxilomanana GXM - Glicuronoxilomanana HAART - Terapia Anti-retroviral Ativa HCl - Ácido Clorídrico HIV - Human Immunodefiency virus IgG - Imunoglobulina G INPA - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia KCl - Cloreto de Potássio L - Litros LCR - Líquido céfaloraquidiano Kg - Quilogramas mEq - Miliequivalente Mg - Miligramas MgCl2 - Cloreto de Magnésio mL - Mililitro mM - Milimol MP - Manoproteína ng - Nanogramas NTSYS - Numerical Taxonomic and Multivariate Analisys System OMS - Organização Mundial de Saúde PCR - Polymerase Chain Reaction pH - Potencial Hidrogeniônico RAPD-Random Amplified Polymorphic DNA RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism RNA - Ribonucleic Acidic SNC - Sistema Nervoso Central TCD4 - Citotoxic CD4 T Cells Tris -2-amino-2-hidroximetilpropano-1,3-diol UFC - Unidade Formadora de Colônia U- Unidade URA5 - Urotidina Monofosfato Pirofosforilase 5 V - Volts VG I, VG II, VG III, VG IV - Variedade gatti tipo I, II, III e IV. VN I, VN II, VN III, VN IV -Variedade neoformans tipo I, II, II e IV µL- Microlitros

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 1

1.1 Criptococose: Aspectos Gerais ................................................................................. 1

1.2 Histórico e agente etiológico ...................................................................................... 2

1.3 Epidemiologia ................................................................................................................. 5

1.4 Infecção e formas clínicas .......................................................................................... 9

1.5 Diagnóstico e Tratamento ......................................................................................... 11

1.6 Isolamento de Cryptococcus sp. em amostras ambientais ............................. 12

1.7 Genotipagem de Cryptococcus spp ....................................................................... 17

2 OBJETIVOS ..................................................................................................................... 20

2.1 Geral:............................................................................................................................... 20

2.2 Específicos: ................................................................................................................... 20

3 METODOLOGIA ............................................................................................................... 21

3.1 Modelo de estudo ........................................................................................................ 21

3.2 Universo de estudo ..................................................................................................... 21

3.3 Pontos de coleta .......................................................................................................... 21

3.4.1 Coleta das amostras ambientais e isolamento de Cryptococcus sp. .... 23

3.4.2 Identificação Fenotípica ..................................................................................... 25

3.4.3 Produção de melanina ........................................................................................ 26

3.4.4 Sensibilidade a ciclohexamida ......................................................................... 26

3.4.5 Teste de Urease .................................................................................................... 27

3.4.6 Auxanograma ........................................................................................................ 27

3.4.7 Teste de CGB (Canavanina-Glicina-Azul de Bromatimol) ......................... 28

3.4.8 Genotipagem dos isolados: .............................................................................. 28

4 RESULTADOS ................................................................................................................. 31

5 CONCLUSÃO ................................................................................................................... 49

6 REFERÊNCIAS DISSERTAÇÃO ..................................................................................... 50

7.1 Anexo 1 ........................................................................................................................... 57

7.2 Anexo 2 ........................................................................................................................... 58

7.3 Anexo 3 ........................................................................................................................... 62

1

1 INTRODUÇÃO

1.1 Criptococose: Aspectos Gerais

A prevalência de infecções fúngicas invasivas aumentou nas últimas

décadas. Com o avanço tecnológico das ferramentas diagnósticas e com

aumento do número de pacientes com imunocomprometimento, pesquisadores

começaram a buscar a compreensão sobre os mecanismos das doenças e sua

relação com as populações susceptíveis(1-3).

A Criptococose é uma micose sistêmica, de carácter oportunistas,

conhecida também como Torulose, Blastomicose européia ou Doença de

Busse-Buschke, é uma doença causada por duas espécies patogênicasque se

diferenciam sob aspectos antigênicos, bioquímicos e genéticos: Cryptococcus

neoformans e Cryptococcus gattii.

Esta doença acomete primariamente os pulmões, disseminando-se pela

corrente sanguínea, e é caracterizada por tropismo pelo Sistema Nervoso

Central (SNC). Os agentes etiológicos da Criptococose estão presentes na

natureza como decompositores de matéria orgânica, apresentando inúmeras

diferenças na sua distribuição geográfica, nichos ecológicos, epidemiologia e

características moleculares. A infecção por estes fungos, ocorre por meio da

inalação de propágulos infectantes presentes no meio ambiente. A doença

pode se apresentar sob a forma aguda, crônica e neurocriptococose, sendo

essa última frequente nos pacientes com a Síndrome da Imunodeficiência

Adquirida (Aids)(4-6).

As espécies C. neoformans e C. gattiitem sido encontradas em

diferentes amostras ambientais e em distintas regiões geográficas. No Brasil,

isoladosforam encontrados em algumas regiões. Os locais das fontes de

infeções da Criptococose no Estado do Amazonas ainda não foram estudadas

e isso pode possibilitar o aumento do contato humano ou animal com esses

nichos desconhecidos e, consequentemente, pode propiciar o surgimento ou

aumentar a incidência de uma infecção fúngica, principalmente em indivíduos

com algum imunocomprometimento(7-9).

2

O uso de técnicas baseadas na Reação em Cadeia da Polimerase

(PCR), vem se tornando uma ferramenta alternativa para diferenciar as

espécies de Cryptococcus entre os diferentes isolados, tanto clínicos quanto

ambientais, fornecendo informações relevantes para entender a distribuição

desses organismos no mundo. A Criptococose éa sexta doença mais frequente

dos óbitos em pacientes com Aids, tendo uma média de 20 casos ao ano no

Estado do Amazonas, a Criptococose e os nichos das espécies patogênicas

reponsáveis pela infecção precisam ser estudados (10, 11).

1.2 Histórico e agente etiológico

O Cryptococcus spfoi primariamente isolado por Francisco Sanfelice na

Itália em 1894, o qual isolou uma levedura capsulada de suco de pêssego e o

nomeou como Saccharomyces neoformans, identificando como patogênica

para animal experimental(4, 6, 12).

Neste mesmo ano na Alemanha, Otto Busse e Abraham Buschke,

obtiveram o agente em cultivo. Identificaram a forma disseminada da

Criptococose em uma paciente do sexo feminino, observaram a forma

arredondada da levedura em tecido ósseo denominando-o Saccharomyces

homines e a doença de Saccharomycosis hominis(12).

Vuilleman, em 1901 reviu os isolados de Sanfelice e o de Busse e

Buschke e transferiu-os para o gênero Cryptococcus e a nível de espécies C.

neoformans e C. hominis, respectivamente, devido ao fato do gênero

Saccharomyces ter característica de fermentar açúcar e produzir

ascósporos(13).

Surgiram inúmeros relatos de casos da Criptococose acometendo

humanos e também em animais a partir de 1900, com progressivo

reconhecimento do patógeno relacionado ao SNC(12).

Em 1914, a meningite foi relatada por Verse, em um indivíduo do sexo

feminino, sendo causada pelo gênero Cryptococcus.Torula histolytica foi o

nome dado, por Stoddard e Cutler em 1916, ao agente da doença quando

3

estavam diante de mais dois casos de meningite. Benham reviu estes outros

isolados, inclusive os de Busse, e por meio das características morfológicas,

patológicas e sorológicas, a autora concluiu que todos os isolados humanos

eram, provavelmente, de uma espécie, C. hominis. Em 1950, Benham propôs o

termo Criptococose como a única designação para a micose e C. neoformans

para seu agente etiológico(6, 12).

Desde então, foram realizadas diversas revisões taxonômicas devido à

diversidade e heterogeneidade deste agente da Criptococose que ocorrem até

hoje. (18) Em 1949, Evans com base em diferentes reatividades capsulares

frente aos soros hiperimunes, identificou os sorotipos A, B, C, e D (14, 15).

Em 1963, Staib contribuiu para descrição da característica fenotípica de

C. neoformans,ao observar e descrever a produção de melanina desta

levedura quando cultivada em meio com extrato de Guizotia abyssinica,

semente conhecida como níger. Atualmente meios de cultivo contendo este

substrato, vem sendo utilizados em estudos ambientais, clínicos e na rotina dos

laboratórios de Micologia em todo o mundo(12).

Em 1970, Gattii e Eeckels isolaram Cryptococcus gattii, no antigo Zaire,

centro da África, de um menino de sete anos. Vanbreuseghem e Takashio

(1970), nomearam este atípico isolado de C. neoformansvar.gattii(12).

O conhecimento do ciclo biológico do gênero Cryptococccus foi

elucidado por Kwon-Chung(16). Esse reproduziu in vitro a sua forma sexuada

de C. neoformans, o Filobasidiela neoformans (sorotipos A e D). Esse último

pertencente a classe dos basidiomicetos, conhecido decompositor vegetal e

fitopatógeno. Após a revisão taxonômica e epidemiológica, do que inicialmente

considerou duas espécies sexuada distintas, Filobasidiela neoformans e

Filobasidiela bacillispora (sorotipos B e C), propôs uma espécie e duas

variedades: C. neoformans var. neoformans (Sorotipo A e D), correspondente

ao F. neoformans var. neoformans; e C. neofomans var. gattii (sorotipo B e C)

correspondente a F. neoformans var. bacillispora(12, 16).

No estado teleomórfico, o complexo C. neoformans e C. gattii é

classificado em Reino fungi; Filo Basidiomycota; Ordem Tremellales; Família

4

Tremellaceae e Gênero Filobasidiella. As espécies são: Filobasidiella

neoformans (sorotipos A e D) e Filobasidiella neoformansvariedade bacillispora

(sorotipo B e C)(6).

Já no estado anamórfico, C. neoformans e C. gattii são classificados

como: Reino Fungi, pertencentes à divisão Eumycota; Filo Basidomycota;

Ordem Filobasidiales; Família Filobasidiella e Gênero Cryptococcus. As

espécies Cryptococcus neoformans (A e D) e Cryptococcus gattii (B e C)(6).

C. neoformans e C. gattii revelam-se como leveduras ovaladas ou

globosas, com brotamento único ou múltiplo.(17) A membrana plasmática é

formada por uma bicamada fosfolipídica que contém ergosterol, glicolípideos e

glicoproteínas envolvida por uma cápsula mucopalissacáride. A parede celular

é constituída basicamente por polissacarídeos e peptido-polissacárideos. Além

da parede celular possuir uma cápsula polissacarídica formada por

exopolissacarídeos (EPSs): o glucuronoxilomanana (GXM) e o

galactoxilomanana (GalXM) sendo o GXM o principal compente na cápsula,

determinates dos sorotipos A, B, C, D e AD(17, 18).

O C. neoformans possui distribuição geográfica universal e é encontrado

com frequência em habitat de aves, principalmente de pombos (Columba spp),

enquanto que o C. gattii é encontrado com maior frequência em regiões

tropicais e subtropicais, originalmente localizado em restos vegetais de

Eucalyptus camaldulensis(17).

Devido ao surto de Criptococose em Vancouver no Canadá, houve a

necessidade de uma caracterização mais detalhada que o sistema de

sorotipagem usualmente utilizado.(19) Utilizando-se técnicas baseadas na

PCR, as espécies foram classificadas de acordo com estudos de Meyer et al.

em 8 genótipos sendo o C. neorfomans sorotipo A genótipo VNI e VNII,

sorotipo D genótipo VNIV e sorotipo AD genótipo VNIII e o C. gattii sorotipo B

genótipoVGI, VGII e VGIII e sorotipo C genótipo VGIV(4, 20).

As leveduras patogênicas do gênero Cryptococcus spp são

consideradas bioquimicamente como não fermentadoras, assimiladoras de

5

inositol, produtoras de urease e reativas ao azul diazônico B, hidrolizam amido,

são sensíveis cicloheximida e termotolerantes a 37°C(17, 21).

Essas leveduras apresentam como fatores de virulência:

termotolerância, produção fenoloxidase, proteases, fosfolipases e a cápsula(4,

22). A termotolerância Cryptococcus spp explica a prevalência dessa espécie

na Criptococose aviária (23, 24). A enzima fenoloxidase quando sintetizada,

contribui para a virulência, por meio da produção de melanina(25). As

proteases produzidas por essa levedura, apesar da baixa produção proteolítica,

contribuem para a sua virulência, degradando tecidos dos hospedeiros ou

destruindo proteínas imunologicamentes importantes(26). As fosfolipases são

importantes na infecção pulmonar, pois indiretamente facilitam a aderência da

levedura ao epitélio pulmonar. Atuam nas membranas da célula

desestabilizando-as e lisando-as (27). Já a urease promove o sequestro do

fungo nos microcapilares antes da disseminação no cérebro.(28-30)A cápsula é

um importante fator de proteção para o gênero Cryptococcus(18).Entre os

mecanismos imunossupressores induzidos pela presença da cápsula incluem-

se: inibição da fagocitose, inibição da ligação do IgG, bloqueio da fixação do C3

e da via de ativação do complemento pela via clássica, supressão da

proliferação da expressão das moléculas de adesão(4, 17, 30-32).

1.3 Epidemiologia

A pandemia da Aids, uso de drogas imunossupressoras e a sobrevida de

pacientes imunocomprometidos, aumentaram a incidência de indivíduos com

Criptococose(2, 33).

A Meningite Criptocócicaé considerada ainfecção fúngica mais comum

do SNC ea terceira complicação neurológica mais frenquenteem pacientes com

Aids.(4, 33, 34) De acordo com o Centro de Controlee Prevenção de Doenças,

CDC, Atlanta, EUA, a Meningite por Cryptococcus spp tem uma estimativa de

um milhão de casos poranoentre pessoas com HIV/ AIDS, resultando emcerca

de625 milmortes no mundo(35, 36).

6

Os casos clínicos mais frequentes da Criptococcose ocorrem no

Continente Africano e na América. Na África Subsaariana a mortalidade é

estimada em cerca de 50% a 70%(36, 37).

Nos Estados Unidos e em outros países desenvolvidos, a Criptococose

é decrescente entre pessoas com HIV/AIDS, devido à disponibilidade de

medicamentos para aterapia anti-retroviral, tendo uma mortalidade em torno de

12%(35, 36).

A Criptococose é uma doença que acomete o homem e animais, sendo

endêmicana Áustrália, Nova Zelândia,Papua Nova Guiné,partes da

África,região do Mediterrâneo, Índia, SudesteAsiático, partes da europa como

Áustria, Alemanha, França, Grécia, Itália, Espanha, Oeste do Canáda, Sul da

Califórnia, México, Havaí e partes da América Latina como Argentina, Brasil,

Colômbia, Cuba, Paraguai, Peru e Venezuela(7, 38).

Um estudo prospectivo de base populacional realizado na Austrália e

Nova Zelândia, entre 1994 e 1997, serviu para elucidar a epidemiologia da

Criptococose, segundo os autores dos 312 episódios analisados, 265 deles

(85%; 312) foram causados por C. neoformans e destes 265 casos, 98%

ocorreram em indivíduos imunocomprometidos. Já os outros 47 casos (15%;

312) foram identificados tendo como agente etiológico, C. gattii e 44% destes

47 casos foram diagnosticados em indivíduos

imunocompetentes.Identificandoque as manifestações clínicas da doença são

influenciadas fortemente pelo estado imunológico do hospedeiro(39).

A Austrália tem alta incidência de casos de Criptococose,isso se deve ao

que foi postulado sobre a doença, quea exposição às àrvores de eucalipto

pode explicar aalta incidência(40, 41).

O aparecimento da epidemia de Criptococose causada por C. gattii que

ocorreu em Vancouver, British Columbia(BC), no Canadá, em 1999, causando

doença em humanos e animais, mostrou que este fungo não se restringe aos

trópicos, mas também em locais de clima temperado e que o agente

frequentemente acomete tanto individuos residentes como turistas(20, 42).

7

A incidência de casos clínicos desta epidemia foi 37 vezes maior do que

a observada na Austrália, espalhando-se para Noroeste dos Estados Unidos,

sendo o tipo molecular VGII correspondente ao C. gattii, o mais isolado de

individuos infectados. Em regiões do Noroeste do Pacífico, especificamente

nos Estados Unidos, tais como Califórnia, Idaho, Oregon e Washington, casos

foram diagnosticados e alguns foram sugeridos como importados da Ilha de

Vancouver(42-44).

Em Atlanta e Houstonforam diagnosticados 880 e 611 casos de

Criptococose, respectivamente, sugeridos como autóctones; contudo a

etiologia dos casos não foi contemplada(45).

Em um estudo sobre a epidemiologia da Criptococose, foramanalisados

129 isolados clínicos na Áustria, Alemanha e Suíça, relataram que a

prevalência de Cryptococcus neoformans (VNI e VNII) foi maior na Alemanha e

Áustria, enquanto que na Suíça é prevalente a presença de Cryptococcus

neoformans (VNIII e VNIV). Já a existência de duas infecções autóctones por

C. gattii (VGIV) indicaram que esse genótipo pode ser endêmico na

Europa(46).

Em cinco regiões da Colômbia foram analisados 178 isolados clínicos e

ambientais obtidos a partir de 247 coletas, demonstrando o perfil dos isolados

clínicos, sorotipos A (91,1% dos isolados), B (8,4%), e C (0,5%) e um perfil de

isolamento ambiental dos sorotipos, tendo como resultado os sorotipos A

(44,2%), B (42,6%) e C (13,2%)(47).

Na Espanha, foram estudadas a diversidade genética de Cryptococcus

spp, de amostras de origem clínica, animal e ambiental da Espanha.

Observaram a frequência elevada de C. neoformans grupo molecular VNI e a

presença do genótipo VNIII, sendo estes genótipos responsáveis pelas

características específicas da epidemiologia molecular desta região(48).

Estudos realizados na China, mostram que pacientes com Criptococose

são em sua maioria imunocompetentes, aumentando a probalidade de que a

população chinesa possa ser mais susceptível do que outros grupos

étnicos(49).

8

A prevalência de Meningite Criptocócica no México tem sido cerca de

7% a 11% em pacientes com HIV. Foi relatado o primeiro caso de infecção

disseminada fatal causada por C. gattii (VGIII) em um indivíduo

imunocompetente, do sexo masculino sem histórico de viagem recente a áreas

endêmicas de Criptococose causadas por C. gattii, informando a existência de

C. gattii no México(50).

Em um estudo com dados retrospectivos realizado nos Estados Unidos,

foi possível analisar a proporção da infecção por C. gattii com a infecção pelo

vírus da imunodeficiência adquirida –HIV,sendo observado que em todos os

casos foi substancialmente acima da média da população. Este estudo sugere

que, embora seja raro como fator de risco, o HIV pode aumentar o risco do

desenvolvimento da infecção clínica por esta espécie, contradizendo o fato de

a infecção por C. gattii ser exclusiva de indivíduos não HIV(51).

Em um estudo retrospectivo sobre a Criptococose realizada em

Bangalore, Karnataka e na Índia, foram indentificados quatro linhagens de C.

gattii a partir de um paciente HIV-positivo e três de pacientes HIV-negativos. A

sorotipagem e a genotipagem mostraram que os isolados eram C. gattii

correspondente ao sorotipo Ce genótipo VGI e de Mating-type a(52).

O Brasil tem uma alta frequência de casos de Criptococose,

principalmente nas regiões Norte, Nordeste e Sudeste.(53, 54)A distribuição

dos tipos moleculares foi verificada através da genotipagem de 443 isolados de

11 Estados da Federação. Os genótipos mais comuns foram VNI(64%),

seguido por VGII(21%), VNII (5%), VGIII(4%), VNIV eVGI(3%de

cada),eVNIII(<1%). Neste estudo, foi possível verificar a prevalência do tipo

molecular VGII em individuos imunocompetentes nas Regiões Norte e

Nordeste(8).

O Norte e Nordeste do Brasil, apresentam casos de Criptococose

principalmente em indivíduos sem evidência de imunocomprometimento, com

uma número elevado de Criptococose em crianças com idade inferior a 12

anos, comportando-se como endemia regional(55, 56).

9

No Amazonas, em um estudo retrospectivo de 2000 à 2010, realizado

na Fundação de Medicina Tropical Dr. Vieira Dourado, analisou 29 prontuários

de pacientes com Criptococose não associados a Aids e observou-se que a

maioria dos individuos acometidos pela Criptococose eram procedentes de

área rural (55,2%), predominio do sexo masculino (58,6%), não tinham doença

de base (41,38%), tendo como o principal agente etiológico á espécieC. gattii.

Caracterizando um aspecto epidemiológico marcadamente insigne das várias

regiões brasileiras(57).

Recentemente no Amazonas, foram investigadosos tiposmoleculares

de57 isoladosclínicoscriptocócicos deindivíduos na Fundação de Medicina

Tropical Dr. Vieira Dourado no Amazonas.A maioria dosisolados de

C.neoformansforam caracterizados como membros dogrupomolecular VNI, um

únicoisolado foi caracterizadocomo VNIIenquanto quetodos os isolados

deC.gattiieram membros do genótipoVGII.Com relação ao mating Types, 55

isoladoseram do Mat alfa e apenas dois eram Mat a(58).

1.4 Infecção e formas clínicas

A infecção primária no homem é quase sempre pulmonar, devido à

inalação de propágulos infectantes do fungo da Natureza nos alvéolos

pulmonares(5).Nos pacientes imuncompetentes a Criptococose pode ser

assintomática com predominiode massas e nódulos pulmonares. A infecção

pulmonar é quase sempre subclínica e transitória, podendo imergir ao lado de

outras doenças que debilitam o indivíduo, tornando-se rapidamente sistêmica e

fatal(4, 17).

Nos pacientes com Aids e doença criptocócica, os pulmões estão

envolvidos em aproximadamente 30% dos casos. Raramente a Criptococose

pulmonar se desenvolvecomo um processoagudo.A única forma dedistinguir

esta doençade outras infecçõespulmonaresé a falta deresposta a fármacosanti-

bacterianose antivirais(5).

As formas crônicas da doençagerammanifestações clínicas

que parecem com sintomas da tuberculose oucâncer de pulmão, tais como

10

perda de peso,febre prolongada, anorexia, fadiga, tosse, expectoraçãomucosa

ou mucopurulentae hemoptise.Sintomas menos frenquentes são dispnéia e

dorpleural(15). O envolvimento pulmonar na criptococose predomina

infiltrado intersticial e a opacidade intersticial difusa. Grandes Lesões de

massano pulmão e/ou no cérebro(criptococomas) são característicosea

morbidade dadoença neurológicaé alta(33).

Depois de inalado o fungo, é desencadeada uma resposta imune,

elemento que determina o curso da infecção. Se a contagem de linfócitos

TCD4 for baixa produz-se disseminação da doença com especial predileção

pelo SNC(4).

A Neurocriptococose é a apresentação clínica mais frequente da

Criptococose(4, 5). O tempo de aparecimento dos sintomas até ao diagnóstico

varia entre dias e meses. Em pacientes imunocomprometidos, particularmente

aqueles com Aids, meningoencefalite está presente em mais de 90% de

casos com um curso mais agudo. Os sintomas mais comuns incluem febre, dor

de cabeça, às vezes, vômitos, convulsões, fotofobia e alterações da

consciência(15, 17).

A doença é sistêmica na maioria das vezes, podendo se instalar em

locais como o coração, fígado, próstata, seios nasais, medula óssea, gânglios

linfáticos, supra-renais, rins, ossos e em raros casos na região ocular(17).

* Modificado por Amaury Bentes de Lin e Heitman (2006).(1)

11

Figura 1– Fluxograma da Infecção por Leveduras patogênicas do gênero Cryptococcus

Infecções cutâneassecundáriasocorrem em até15% dos pacientes com

Criptococose disseminadae, muitas vezesindicamum mau prognóstico.As

lesões geralmentecomeçam comopequenas pápulasque,

posteriormente,ulceram, mas também pode apresentar-se comoabscessos,

nódulos eritematosos,ou celulite(59-61).

1.5 Diagnóstico e Tratamento

O diagnóstico baseia-se na observação de leveduras capsuladas por

exame microscópico direto com o uso da tinta da China, o isolamento de C.

neoformans ou C. gattii em cultura,pela detecção do antígeno capsular no

sobrenadante de diversos fluidos, incluindo soro e líquido céfaloraquidiano

(LCR) por aglutinação em látex ou ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent

Assay) (4, 6, 62).

A levedura pode ser visualizada por microscopia no escarro, lavado

brônquico, LCR, pus de abscesso, urina, aspirados de medula óssea e de

gânglios, fragmentos de tecidos, com grande sensibilidade. O exame

microscópico direto é realizado com tinta nanquim ou contraste de fase

microscópica, solução de 0,1% de branco de cálcofluor (microscópio de

imunoflorecência. Exame do sedimento de LCR é geralmente positivo em

aproximadamente 40% em pacientes sem Aids e em 80% dos pacientes com

imunossupressão grave(12, 63).

O cultivo é o exame comprobátório da doença, podendo ser isolado em

meios de cultura que contenham uma fonte de carbono, nitrogênio e oxigênio,

produzindo colônias brancas mucóides, usualmente após 48 e 72 h. Meios de

cultura como o ágar níger, são utilizados para o isolamento de Cryptococcus

spp devido à presença de compostos fenólicos que propiciam a produção de

fenoloxidase levando à formação de melanina, que pode ser observada pelo

aparecimento de coloração marrom nas colônias(5, 15).

12

Culturas de sangue devem ser obtidas rotineiramente em pacientes com

Aids, porque elas são muitas vezes positivas. As espécies C. neoformans e C.

gattii podem ser diferenciadas no meio de cultivo CGB (Canavania-glicina-Azul

de Bromatimol), no qual o C. neoformans é sensível a L-canavanina presente

no meio, apenas o C. gattii cresce nesse meio, utilizando a glicina como fonte

de carbono e nitrogênio provocando a alcalinização do meio mudando-o para

coloração azul cobalto(17).

Quanto ao tratamento, a Organização Mundial da Saúde (OMS)

recomenda o tratamento com anfotericina B em regimes para otimizar a

sobrevivência. Formas leves de Criptococose sem envolvimento do SNC

geralmente podem ser tratadas com fluconazol oral a 400 mg por dia durante 6

a 12 meses, ou com a mesma dose e duração da tratamento com cápsulas de

itraconazol. O último é mais eficaz no controle da infecção do pulmão e

osso(64, 65).

1.6Isolamento de Cryptococcussp. em amostras ambientais

Os agentes da Criptococosepodem ser encontrados em uma variedade

de nichos, incluindo substratos orgânicos e habitats relacionados a construções

antigas, além de excretas de aves, fezes de morcegos e baratas, ninhos de

vespa, frutas, suco de fruta fermentado, microbiota intestinal de cavalo, leite,

cavidade nasal e pele de cães, gatos e coalas, recintos de coelhos, buracos de

tatus, solo, vegetais em decomposição e ocos de várias espécies de

árvores(66-72).

A infecção por C. neoformans e C. gattii ocorre pela exposição do

indivíduo com as fontes ecológicas onde esses fungos são encontrados.

Investigar o local das fontes de infecção é importante para evitar o

aparecimento de novos surtos(9, 19).

Já foi provado que o C. gattii está presente também em árvores, solo,

poeira domiciliar, água, pneus de carros, principalmente de áreas

endêmicas(19).

13

Em 1990, Ellis ePfeifer relataram o primeiro isolamento de C. gattii na

Austrália na madeira, casca, folhas e restos vegetais de eucaliptos. Embora o

eucalipto esteja presente em muitas das áreas conhecidas com casos de

Criptococose, raros são os isolamentos de C. gattii em eucaliptos fora da

Australia.(41) A presença deste fungo em várias espécies de árvores tem

provado que há variação de nichos(9).

Devido ao aparecimento de novos casos da Criptococose ocorridos pelo

mundo, e os surtos ocorridos na Austrália e da Ilha de Vancouver,(10)

causados em indivíduos imunocompetentes e imunocomprometidos, é

necessário que se faça a pesquisa das fontes de infecções, detectando os

novos nichos do agente da Criptococose, para que assim possa ocorrer a

intervenção da infecção humana em locais onde a prevalência da doença é

alta, e em regiões com possíveis probabilidade de surtos desta doença(73, 74).

O C. neoformans é encontrado em várias fontes ambientais, presente

principalmente no continente europeu, apesar de apresentar uma distribuição

mundial. Está relacionado, na maioria das vezes, com excretas acumuladas de

aves, principalmente pombos, os quais são ricos em compostos

nitrogenados.(75, 76)Evidentemente, C. gattiié ecologicamente estabelecidoem

árvores, não mais restrito aos eucaliptos(47, 51, 77-79).

C.gattiifoi isolado emBritish Columbia(BC), devegetação nativa, solo, ar

e águano sul e nocentro-leste dacostada ilha de Vancouvere, mais

recentemente, nas Ilhas do Golfo, oLower Mainland, e nos estados

deWashingtone Oregon(42, 73, 80-82).

Em umlevantamento sistemático de C. neoformans e C. gattiino

sudoeste dePorto Rico, foi realizado umlevantamento ambientalpara as

espécies patogênicas de Cryptococcus, identificando 16isolados pertencentes

aogenótipoVGIIenquantoum isoladofoium genótipoVGIV, demonstrando que

genotipo VGII é semelhante aotipo molecularcaracterizados emsurtos

recentesde criptococose no Pacific Northweste British Columbia, no

Canadá(83).

14

Em Cúcuta na Colômbia, foi obtido o primeiro isolamento de C. gattii.

Nesse estudo, um total de 4389 amostras foram processadas e um isolado de

C. gattii sorotipo B (VGI / a), dois isolados de C. gattii sorotipo C (VGIII / α) e

três isolados de Cryptococcus neoformans sorotipo A (VNI / α), foram

identificadas. A densidade dos isolados recuperados variaram 50-350 ufc / g de

solo(84).

No Iran, foi demonstrado que não somente excretas de pombos podem

conter Cryptococcussp, mas os excrementos de outras aves como a andorinha

(Hirundo rustica)(85).

Nas regiões de ReggioCalabriae Messina na Itália,foram estudados 121

isolados de Cryptococcus neoformans sorotipo A (VNI) Mating type α e 1

isolado de C. gattii sorotipo B (VGI) Mating type α de um totalde 495amostras

defezes de pássaros, solo, Ceratonia siliqua(alfarrobeira), Eucalyptus

camaldulensis e Prunusdulcisdetritos (amendoeira) que foram coletados a partir

de uma variedade delocais públicos e privados(86).

Na China, apesar dos relatos recentes sobre a epidemiologia molecular

de isolados clínicos,foi investigado o perfil ecológico do C. neoformans e C.

gattii, dasseiscentose vinteamostrasde fezes de pombosde10 cidadese

819amostras de árvores deE.camaldulensis, 101 isolados de fezes de pombos

foram identificados como C. neoformans (sorotipo A)(87).

Em Havana, Cuba, foram isolados 182 Cryptococcussp de um total

de662amostras que foram coletadas de331árvorese cactos. Nesse estudo, por

meio de análise molecular, apenas um isolado foi indentificado como

Cryptococcus neoformans (Sorotipo A), a espécie mais prevalente foi de

C.heveanensis(88).

C.gattii tem sido relatadoa partir de54espécies de árvores, a maioria são

angiospermas (77%); gimnospermasresponsáveis por23% das espécies

positivos como apresentado na Tabela 1 Gimnospermase angiospermaspodem

desenvolver cavidadescariados,que diferem emcomposição bioquímica, e a

presença de nutrientes disponíveis.

15

Fontes ambientais de C. neoformans foram progressivamente descritos

no Brasil, relacionados a decomposição de madeira em árvores tropicais no Rio

de Janeiro (RJ), em Teresina (PI), em Boa Vista e ilha de Maracá (RR), no

interior do Amazonas e na cidade de São Paulo (SP).Estes achados

caracterizaram o novo habitat natural de C. neoformans relacionado a madeira

em decomposição em diferentes árvores tropicais, nativas ou introduzidas no

Brasil,(69, 89, 90)

Quadro 1.Descrição de espécies de árvoresonde foram isoladosCryptococcusgattii

Local de isolamento

Espécies (Nome comum) Locais de onde foram exportadas

Argentina Acacia visco (arca), Cedrus deodara* (deodar cedar), Cupressus empervirens* (Mediterranean cypress), Eucalyptus microcorys (tallowwood), Tipuana tipu (rosewood), Ulmus campestris (English elm)

Australia, Africa, Asia, Britain, Canada, Central America, England, Europe, Japan, South America, United States

Australia Angophora costata (smooth bark apple), E. blakelyi (Blakely's red gum), E. camaldulensis (red river gum), E. gomphocephala (tuart tree),E. grandis (rose gum), E. microcorys (tallowwood), E. rudis (flood gum),Eucalyptus spp., E. tereticornis (forest red gum), E. tetrodonta (Darwin stringybark), Syncarpia glomulifera (turpentine)

Australia, Africa, Asia, aribbean, Hawaii, Indonesia, New Zealand, Papua New Guinea, United States, South America, US Virgin Islands, British Virgin Islands

Brasil Adenanthera pavonina (circassian seed), Cassia grandis (carao), Erythrinia velutina (coral tree), E. camaldulensis (red river gum), E. microcorys (tallowwood), Eucalyptus spp., Ficus spp., Guettarda acrena, Moquilea tomentosa (pottery tree)

Australia, Africa, Asia, aribbean, Central America, Fiji, New Zealand, South America, United States, US Virgin Islands, British Virgin Islands

Canada Abies grandis* (grand fir), Abies spp.* (fir), Acer spp.(maple), Alnus rubra (red alder), Aluns spp. (alder), Arbutus menziesii* (Pacific madrone),Cedrus spp.* (cedar), Picea spp.* (spruce), Pinus spp.* (pine), Prunusemarginata (bitter cherry), Pseudotsuga menziesii* (coastal Douglas fir), Quercus garryana (Garry oak), Thuja plicata* (western red cedar)

Australia, Europe, New Zealand, North America, South America

Colômbia Acacia decurrens (black wattle), Coussapoa sp, Croton bogotanus, C. funckians (C. gossypiifolius), Cupressus lusitanica* (Mexican cypress), E. camaldulensis (red river gum), E. globulus (Tasmanian blue gum), Ficus soatensis (rubber Savanna), Pinus radiata* (Monterey pine), Terminalia catappa (almond)

Africa, Asia, Australia, British Isles, Canada, Caribbean, Costa Rica, Europe, Costa Rica, Hawaii, Indonesia, Mediterranean region, Mexico, New Zealand, Pacific Islands, Papua New Guinea, Japan, United States, South America, US Virgin Islands, British Virgin Islands

Índia Acacia nilotica (thorn tree), zadirachta indica (neem tree), Cassia fistula (golden shower tree), Cassia marginata, E. camaldulensis (red river gum), E. citriodora (lemon-scented gum), Eucalyptus spp., Mangifera indica (mango), Manilkara hexandra (margosa), Mimusops elengi (bullet wood or Indian madlar tree), Pithecolobium dulce (Manila tamarind), Polyalthia longifolia (Indian mast tree), Syzygium cumini (java plum), Tamarindus indica (tamarind), Terminalia arjuna (arjuna)

Africa, Asia, Australia, aribbean, Central America, Hawaii, Indonesia, Malaysia, Pacific Islands, Philippines, Portugal, South. America, New Zealand, United States, US Virgin Islands, British Virgin Islands

Egypt, Italy, Mexico, United States

E. camaldulensis(red river gum) Africa, Australia, Caribbean, New Zealand, United States, South America, South Asia, US Virgin Islands, British Virgin Islands

16

Emerging Infectious Diseases • www.cdc.gov/eid • Vol. 16, No. 1, January 2010 Fonte: Deborah J. Springer and Vishnu Chaturvedi(38)

Figura 2(2A – G) – Imagem das árvores com presença de C. neoformans no Brasil descritos na literatura.

O primeiro isolamento de Cryptococcus gattii em amostra ambiental na

região amazônica foi a partir de madeira em decomposição em um oco de uma

árvore nativa da selva acreana Guettarda em uma área selvagem da

floresta.(90) Com relação aos isolamentos de C. gattii no Brasil, foi verificado a

ocorrência desta levedura em árvores tropicais de diferentes gêneros (cassia,

oiti, ficus, mulungu, "guettarda") nas regiões Nordeste (semi-árido) e Norte

(Amazônia úmida) do Brasil, bem como na Colômbia, em algodoeiro-da-

praia.(69, 90)

17

Estudos de isolamento de amostras ambientais são escassos na região

norte, sendo importantes para propor as fontes de infecção por

Cryptococcusspp, descrever a prevalência dos tipos dessa levedura na região

e para avaliar a correlação entre os achados ambientais e clínicos.(69)

1.7 Genotipagem de Cryptococcus spp

As técnicas de biologia molecular vêm sendo empregadas e

desenvolvidas na tentativa de compreender a função do material genético e

seus produtos de expressão, as proteínas e apresentando sua importância na

identificação de agentes causadores de doenças, bem como na prevenção e

profilaxia de doenças hereditárias e auto-imunes, possibilita informações

referentes aos aspectos epidemiológicos, caracterização de surtos. Além de

identificar de forma direta e rápida os padrões genéticos de mutações de

determinados micro-organismos que lhe conferem a resistência biológica aos

tratamentos disponíveis, podendo dessa forma ajudar na melhor escolha da

terapêutica.(91-93)

Nesse contexto a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR),

que visa à amplificação do DNA ou RNA, tem sido muito utilizada para analisar

o genótipo de vários microrganismos, obtendo de forma rápida e segura o

diagnóstico do agente etiológico de uma determinada doença.(94) Estas

técnicas incluem análise por DNA (ácido desoxirribonucleico) polimórfico

amplificado ao acaso (RAPD), análises de fragmentos de DNA gerados por

enzimas de restrição (RFLP) e polimorfismo de tamanho de fragmentos

amplificados (AFLP).(2, 95-97)

A técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) fingerprinting,

combina a especificidade da hibridização clássica de DNA com a rapidez da

PCR. Os primers do minissatélite específico da sequência do core (fago M13) e

da sequência repetitiva simples (Microssartélites GACA4 ou GTG5 são

utilizados para a amplificação do DNA.(10)

A PCR fingerprinting foi primariamente utilizada por Meyer e cols(1993)

para tipagem do gênero Cryptococcus, o qualpropuseram a tipagem molecular

de Cryptococcus spp. permitindo assim, a separação dos isolados de C.

18

neoformans e C. gattii em oito genótipos. Os grupos correspondentes ao C.

neoformans são: VNI e VNII representando o sorotipo A, VNIII representando o

sorotipo AD e VNIV representando o sorotipo D. Já o C. gattii é em subdividido

em VGI, VGII e VGIII para o sorotipo B e VGIV para o sorotipo C.(10)

Um grande número de técnicas moleculares estão sendo usadas na

diferenciação de cepas de uma mesma espécie.(93) Dentre essas várias

técnicas se destaca a RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorfism) que

consegue determinar o genótipo de Cryptococcus spp. Associada a PCR visa

identificar diferenças na sequência DNA. Com o uso de primers específicos é

possível amplificar um determinado fragmento gênico e posteriormente

colocadar à ação de enzimas de restrição que cortam esse gene em sítios

determinados, produzindo fragmentos de DNA com sequências específicas.(98,

99)

Kwon-Chung e Varma (2006), reportam que para determinar

características específicas, tais como subgrupo de Cryptococcus spp, deve ser

feito a caracterização molecular por meio de técnicas padronizadas. Não

apenas fundamentado nos sorotipos, pois estes tem a particularidade

antigênica não estável e a presença de subgrupos dentro de cada

sorotipo.(100)

O método de Tipagem por Sequência de Múltiplos (Multilocus sequence

typing – MLST) é um método de escolha para o futuro da tipagem criptocócica.

É uma nova ferramenta utilizada na investigação epidemiológica de

microrganismo. O MLST diferenciou genótipos específicos, um deles associado

com grande virulência, entre os isolados de C. gattii relacionados à epidemia

de Vancouver, denominado VGIIa e VGIIb. Esses isolados foram obtidos de

amostras clínicas, veterinárias e ambientais na ilha de Vancouver (MacDougall

et al 2007).(101) A sociedade Internacional de Micoses Humanas e Animais

(Isham) propõem os seguintes conjunto de loci genéticos como padrão

internacional para tipagem de C. neoformans e C. gattii.

Litvintseva e cols (2006), em Botswana, África, utilizando está técnica

que usa tipagem de múltiplos locis, e a técnica de Presença-Ausência

Polimorfismos (AFLP), mostrou que dos 102 C. neoformans sorotipo A

19

estudados,incluindo 34 cepas de Botswana, as linhagens isoladas de Botswana

eram únicas para aquela região sendo então caracterizadas como VNB. No

entanto,o genótipo VNB isolado na África do Sul, Congo e Ruanda demonstra

que esse genótipo se restringe apenas no Continente Africano.(102)

Como demonstrado na anexo A, Cogliati (2012), reportou a

epidemiologia molecular global das espécies patogênica do gênero

Cryptococcus, destacando as principais técnicas de genotipagem e os atuais

tipos moleculares reconhecidos: VNI, VNII, VNB, VNIII, e VNIV entre os

isolados de C. neoformans e VGI, VGII, VGIII, eVGIVentre os isolados de

C.gattii.(7)

Em um estudo realizado no Estado do Amazonas aplicando a técnica de

PCR-RFLP, utilizando a região de amplificação ITS5-NL4 e enzima de

restrinção Ddel, conseguiram um padrão de RFLP para os principais agentes

de micoses sistêmicas: Candida albicans, Candida parapsiloses, Candida

glabrata, Candida tropicalis, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii e

Histoplasma capsulatum. Para os agentes da Criptococcose, foi possível

identificar os genótipos VNI e VGII (104).

20

2 OBJETIVOS

2.1 Geral:

Isolare genotipar Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattiiobtidos

de amostras ambientais coletados daszonas urbanas e rurais da cidade de

Manaus-Brasil.

2.2 Específicos:

a) Estimar a frequência das espécies de C. neoformans e C. gattii entre os

isolados obtidos de amostras ambientais da zona urbana e rural cidade

de Manaus.

b) Descrever a distribuição e a concentração (UFC/g) de formas

infectantes de Cryptococcussp.isolados das amostras ambientais.

c) Identificara frequência genotípica dos isolados obtidos através a técnica

de PCR-Fingerprinting e PCR/RFLP do gene URA 5.

d) Verificar a presença de genes sexuais específicos, com locus mating

type (MATα e MATa) das espécies por PCR.

21

3 METODOLOGIA

3.1 Modelo de estudo

Estudo descritivo transversal.

3.2 Universo de estudo

Local: Região metropolitana de Manaus, zona urbana e zona

rural. Manaus é uma cidade portuária, com presença de muitos igarapés e

localizada no centro da maior floresta tropical do mundo (Amazônia Brasileira),

no norte do Brasil. Sua geografia destaca-se com uma área de 11.401,058 km²

e uma densidade de 152,50 hab./km². Situa-se na confluência

dos rios Negro e Solimões. O clima é considerado tropical úmido, com

temperatura média anual de 26,7 °C e umidade do ar relativamente elevada

durante o ano, com médias mensais entre 79 % e 88 %. O índice pluviométrico

é elevado, em torno de 2300 milímetros anuais, sendo março o mês mais

chuvoso (335 mm) e agosto mais seco (47 mm). Este estudo foi realizado

mensalmente no período de abril de 2013 a julho de 2014.

3.3 Pontos de coleta

Os locais de coleta selecionados para estudo podem ser visualizados na

figura 9. Os locais de coletas receberam a seguintes siglas: “A” para as coletas

realizadas na zona rural de Manaus(Reserva Florestal Adolpho Ducke); B1

(Zona Zul), B2 (Zona Oeste) e B3 (Zona Leste) para as coletas realizadas nas

proximidades dos Portos de Manaus, e C1 (Zona Sul), C2 (Zona Sul), C3 (Zona

Sul), C4 (Centro Sul), C5 ( Zona Centro Oeste), C6 (Zona Oeste), C7 (Zona

Leste) para coletas realizadas nos 7 igarapés selecionados para este estudo.

Para este estudo, mesmo que de forma aleatória, buscamos coletar diversas

22

amostras de ocos de árvores, material vegetal em decomposição (madeira em

decomposição), solo e água.

Figura 3. Local de coleta das amostras ambientais na cidade de Manaus.

Fonte: https://www.google.com.br/maps

Os locais específicos de coleta foram:

a) Reserva Florestal Adolpho Ducke (RFAD):Esta reserva florestal

pertence ao Instituto de Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA). É uma

área de 100 Km2, hoje cercada pela cidade de Manaus, masainda

praticamente intocada. Trata-se de uma das áreas mais bem estudadasda

Amazônia brasileira.(103)A partir do ponto georeferenciado latitude sul 2º91’97”

e longitude leste 59º97’98” foi delimitada uma área de 10.000 m2 na trilha

principal da RFAD. Nessa área foram coletadas 605 amostras ambientais,

sendo essas: 290 amostras de solo (1g), 290 amostras de material vegetal em

decomposição (1g), 20 amostras de água (15mL de água próximo das

nascentes do igarapé do Ácara, igarapé Bolívia e poças de água);

b) No Porto da Manaus Moderna (B1) e no Porto do São Raimundo (B2)

foram coletadas 30 amostras de água(foram coletados15mL de cada amostra),

23

respectivamente, e mais 40 amostras de água no porto do Ceasa (B3), total de

100 amostras de água do rio negro na região portuária de Manaus; (Fig.9)

c) Dos sete igarapés selecionados para este estudo: Igarapé de

Petrópolis (C1), Igarapé do 40 (C2), Igarapé da Cachoeirinha (C3), Igarapé do

Mindú (C4), Igarapé do Sambódromo (C5), Igarapé do Tarumã (C6) e Igarapé

do Tancredo Neves (C7), foram coletados (15ml de água de cada igarapé) um

total de 105 amostras; (Fig.9)

d) Três amostras de solo (1g) foram coletados da margem de cada um

dos 7 igarapés, totalizando 21 amostras. A etapa laboratorial foi realizada no

Laboratório de Micologia Médica do Instituto Nacional de pesquisas da

Amazônia.

3.4 Procedimentos

O fluxograma de procedimentos pode ser visualizado no anexo 3.

3.4.1 Coleta das amostras ambientais e isolamento de Cryptococcussp. 3.4.1.1 Coleta e Isolamento de Cryptococcussp da Reserva Florestal Adolpho Ducke

As amostras de solo foram obtidas de pontos de coleta afastados uns

dos outros. O excesso de material vegetal em decomposição sobre o solo foi

retirado e as amostras foram obtidas da profundidade de 0-1 cm. As amostras

de solo foram enviadas ao laboratório de Micologia em caixa de isopor. Por

semana foram coletados aproximadamente 5 a 10 amostras.

Das amostras de solo, foram repassados 1g de solo para tubo contendo

9ml de solução salina 9% com Tween 80%, 0,2 de Cloranfenicol e Amicacina, a

partir desse tubo com concentração 10-1 g/mL, foram realizadas quatro

diluições sucessivas, partindo de 10-2 a 10-5 g/mL, e 0,1 mL de cada tubo foram

inoculados nas placas de Petri contendo o meio de cultivo ágar Niger Seed

Agar – NSA (Anexo 2) sendo espalhados sobre o meio com alça Drigalsky. O

experimento foi realizado em duplicata. As placas foram incubadas à

temperatura ambiente (±28°C)

24

Quanto às amostras de oco de árvores e material vegetal em

decomposição, esses foram obtidas sobre o solo, nas dobras de árvores e ocos

de árvores. As amostragens foram realizadas em pontos de coleta afastados

uns dos outros.(104). 1g do material foi macerado e suspenso em provetas

contendo 49ml de solução salina a 9% com Tween 80%, 0,2 de Cloranfenicol e

Amicacina, seguiu-se agitação manual por 5 minutos e após 30 minutos em

processo de decantação, 100ml foram transferidos para placa de Petri

contendo ágar NSA.

Nos locais que apresentaram positividade para Cryptococcussp, foram

realizadas coletas de formigas, o qual foram encaminhadas para o

Labororatório de Micologia onde foram processadas e analisadas. Cada

formiga foi colocada em tudo contendo 9ml de solução salina a 9% com tween

80%, depois foi realizada uma diluição 1:10. 0,1ml de cada diluição foi

transferido para placas de Petri contendo o meio de cultivo ágar NSA. Em

locais com presença de Cryptococcussp são realizadas coletas de insetos,

para saber se eles transportam para outros locais os agente da Criptococose.

Esse é um procedimento realizado após isolamento ambiental de espécies

patogênica de Cryptococcus de acordo com o Laboratório de Micologia do

Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas – FIOCRUZ, RJ.

3.4.1.2 Coleta e isolamento de Cryptococcus spp. doPorto da Moderna, Porto do São Raimundo e Porto do Ceasa e igarapés em estudo.

As amostras de água dos igarapés foram coletadas em pelo menos três

pontos: próximo a nascente, zona de transição jusante (logo após o

lançamento da fonte poluidora, onde ocorre contaminação predominantemente

química, provenientes das indústrias e esgotos domésticos) para verificar se

qualidade da água influência na presença ou ausência de Cryptococcussp e

próximo da desembocadura.

Foi realizada a analise físico-química da água, onde foram analisados os

paramentos de temperatura, potencial hidrogeniônico (pH), condutividade

elétrica, concentração de oxigênio e potencial de saturação. Essas variáveis

25

foram mensuradas pelo aparelho Profline sonda multiparamétrica 197i WTW

(Welheim-Alemanha). A análise da água foi realizada no laboratório de

Limnologia do INPA.

As amostras de água coletadas sob a superfície do Rio negro (zona

portuária de Manaus) e igarapés foram repassadas para tubo falcon de 15mL.

Essas amostras foram centrifugados em 6.000rp a 10 min. O sobrenadante foi

desprezado e 1ml do líquido/sedimento foi repassado para o meio de cultivo

NSA.

Figura 4. A) Garrafa de Rutnner paracoleta de água; b)Coleta deágua dos igarapés. Fonte: Amaury Bentes

3.4.2 Identificação Fenotípica

Todas as amostras em meio de cultivo NSA estavam na temperatura

ambiente e a leitura diária até o quinto dia foi realizada. As amostras positivas

foram purificadas através da técnica de estrias de desgaste e em seguida

foram conservadas pela técnica de preservação em óleo mineral e

criopreservação a -70°C. Das amostras positivas, foram obtidos 20 isolados de

Cryptococcussp para verificar se aquele local tinha a presença das espécies C.

neoformans e C. gattii compartilhando o mesmo hábitat. 75

26

3.4.3 Produção de melanina

O Cryptococcussp. sintetiza melanina por polimerização oxidativa de

compostos fenólicos. Os meios de cultivo que apresentaram colônias de cor

marrom (fenoloxidase positiva) foram analisados e re-isoladas em meio NSA

sendo considerado como isolado distinto.

Figura 5. Meio de cultivo Niger Seed Agar – NSA. Fonte: Amaury Bentes

3.4.4 Sensibilidade a ciclohexamida

Cada isolado que sintetizou melanina foi semeado para em meio

Mycosel (Anexo 2) por 48 horas a temperatura ambiente. A maioria dos

isolados de C. neoformans e C. gattiisão sensíveis a ≤ 12µg/ml de

cicloheximida.

27

Figura 6. Meio ágar Mycosel. Fonte: Amaury Bentes

3.4.5 Teste de Urease

Todas as amostras do estudo foram semeadas em Agar uréia de

Christensen (Anexo2). Neste teste, as amostras positivas produzem amônia

pela ação da urease, tornando o meio de cultivo alcalino e mudando a cor do

indicador de pH para rosa.

Figura 7. Meio urease.Fonte: Amaury Bentes

3.4.6 Auxanograma

O auxanograma, que é a prova de assimilação de carboidratos, foi

realizada como descrito por Larone (1995)(105), onde em uma placa de Petri

estéril foram misturados 20mL do meio Yeast Nitrogen Base (YNB) fundido e

resfriado a 45°C a 1mL de uma suspensão aquosa de levedura ajustada à

escala 5,0 McFarland. Após a solidificação do meio, pequenas quantidades dos

carboitrados (dextrose, sacarose, lactose, galactose, rafinose, inositol, xilose,

celobiose, trealose, maltose e dulcitol) foram adicionados em posições

previamente marcadas. As placas foram incubadas a temperatura ambiente por

48 horas.

A técnica de assimilação de nitrogênio que demonstra a capacidade da

levedura em assimilar nitrato de potássio e peptona como fontes de nitrogênio.

28

Esse procedimento foi realizado pela mesma técnica de assimilação de

carboitrados, mas como o meio base utilizado foi Yeast Carbon Base (YCB), e

como fontes de nitrogênio foram utilizados a peptona e o nitrato de potássio.

(105)

3.4.7 Teste de CGB (Canavanina-Glicina-Azul de Bromatimol)

Todas as amostras foram biotipadas pela teste de CGB (Anexo 2) que é

um teste fisiológico usado para diferenciar C. gatti de C. neoformans. Essa

diferenciação se dá através da coloração do meio. Onde C. neoformans é

sensível a L-canavanina e é incapaz de assimilar a glicina como única fonte de

carbono e nitrogênio deixando o meio na sua cor normal amarelo claro. C. gattii

consegue crescer e utilizar a glicina, produzindo amônia e fazendo com que a

substancia azul de bromatimol, indicadora de pH, torne o meio para cor azul

cobalto.

Figura 8. Meio Canavanina-Glicina-Azul de Bromatimol. Fonte: Amaury Bentes

3.4.8 Genotipagem dos isolados: 3.4.8.1 Extração de DNA

Foi realizada a extração química de DNA de acordo com Ferrer e col.

(2001) No primeiro dia, as amostras ja identificadas fenotipicamente foram

semeadas em meio de cultura sabouraud e após dois dias foi retirada uma

alçada cheia para tubo de microcentrifiga estéril. Todos as amostras foram

colocadas a -20°C overnight. No segundo dia, foi adicionado 500µ de tampão

de lise (SDS 0,5%, NaCl 1,4%, EDTA 0,73% e Tris-HCl 1M) e 5µ de β-

29

mercaptoetanol e agitou-se vigorosamente no vórtex por cerca de um minuto. A

amostra foi incubada à 65°C por 1 hora (foi agitada a cada meia hora). Logo

em seguida foi adicionado 500µ de fenol (clorofórmio: álcool isoamílico).

Agitou-se a fim de obter uma suspensão homogênea (no vórtex), e em seguida

foi centrifugado a 14.000rpm por 15 minutos. Foi retirada a fase líquida com a

micropipeta. O precipitdado foi lavado com etanol 70% (500µL) e

posteriormente centrifugado a 14.000rpm por 15 minutos. Toda fase líquida foi

retirada com a ajuda da micropipeta, o precipitado foi obtido e ressuspenso em

100µL de água miliquê.

3.4.8.2 PCR-Fingerprintig

Foi realizada como descrito por Meyer et al (1999): Utilizando a

sequência específica do minissatélite M13 (5’-GAGGGTGGCGGTTCT-3’). A

reação de amplificaçãofoi realizada em um volume final de 25 μL contendo 10

ng/µL de DNA molde, solução tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM,

MgCl2 1,5 mM), 0,2 mM de cada 33 dNTP, 30 ng de oligonucleotídeo iniciador

e 2,5 U de Taq DNA polimerase (Recombinante-Invitrogen). A PCR foirealizada

em um termociclador Verite 96, Applied Biosystens, a reação consistiu em 6

min de desnaturação (94oC); 40 ciclos de 1 min desnaturação à 94ºC, 1 min de

anelamento à 50ºC e 2 min de extensão à 72ºC; por fim foi realizada uma

extensão final de 6 min à 72ºC. Os produtos da amplificação foram separados

por eletroforese em gel de agarose 1,4%, por 6 h a 60 V.(24)

3.4.7.3 PCR-RFLP URA 5

A PCR-RFLP do gene URA5 foi realizado como descrito por Meyer et al

(1999). A reação de amplificação foi realizada em um volume final de 50 μL.

Cada reação continha 10 ng/µL de DNA molde (método de extração

clorofórmio), solução tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5

mM), 0,2 mM de cada dNTP, 1,5 U de Taq DNA polimerase (Recombinante

Invitrogen) e 50 ng de cada primer, URA5 (5´-

ATGTCCTCCCAAGCCCTCGACTCCG´-3) e SJ01 (5´-

30

TTAAGACCTCTGAACACC GTACTC´-3). A PCR foi realizada em

termociclador Verite 96, Applied Biosystens, essa foi iniciada com 2 min de

desnaturação (94ºC) e 40 ciclos de 30 s de desnaturação à 94ºC, 30 s de

anelamento à 61 ºC e 1 min de extensão à 72ºC, por fim foi realizado uma

etapa de extensão final de 10 min à 72ºC. 8 µL dos produtos de PCR foram

misturados a 1 µL de tampão da enzima Hha I]’ e digeridos duplamente com

Sau96I (10U/ µL) e Hha I (20U/ µL) por 3 horas ou overnight e separados por

eletroforese em gel-agarose 3% a 100 V por 5 horas. Os padrões de RFLP

foram visualizados comparando-os com os padrões obtidos das cepas de

referência que representaram cada um dos tipos moleculares patogênicos

existentes: WM 148 (sorotipo A, VNI), WM 626 (sorotipo A, VNII), WM 628

(sorotipo AD, VNIII), WM 629 (sorotipo D, VNIV), WM 179 (sorotipo B, VGI),

WM 178 (sorotipo B, VGII), WM 161 (sorotipo B, VGIII) e WM 779 (sorotipo C,

VGIV).

Quadro 2. Lista das cepas de referências utilizadas, incluindo informações gerais, sorotipos, mating type (MAT), tipo molecular (TM)

N° do isolado País Fonte Sorotipo MAT TM

WM148 Austrália Clínica A Alfa VNI

WM626 Austrália Clínica A Alfa VNII

WM628 Austrália Clínica AD Alfa VNIII

WM629 Austrália Clínica D Alfa VNIV

WM179 Austrália Clínica B Alfa VGI

WM178 Austrália Clínica B Alfa VGII

WM161 Austrália Clínica B Alfa VGIII

WM779 África do Sul Veterinária C Alfa VGIV

3.4.8.4 Identificações dos genes sexuais (Mating type)

A determinação do Mating a e Mating α (tipo sexuado) foi realizado por

PCR do gene de feromônio como descrito por Chatuverdi et al (2000)

31

modificado. Á técnica foi conduzida para um volume final de 25 μL. Os primers

do tipo α-específicos foram Mat-αF (5'- CTTCACTGC CATCTTCACCA-3') e

Mat-αR (5'-GACACAAAGGGTC ATGCCA-3') e os primers do tipo a-específicos

foram Mat-aF (5’-CGCCTTCACTGCTAC CTTCT-3’) e Mat-aR (5’-

AACGCAAGAGTAAGTCGGGC-3’). As amplificações foram realizadas em um

volume final de 50ng de DNA, solução tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50

mM, MgCl2 1,5 mM), 0,2 mM de cada dNTP e 20 ng cada primer, e 1,5 U de

Taq DNA polimerase (Recombinante Invitrogen). A amplificação foi realizada

em termociclador Verite 96, Applied Biosystens, primeiramente foi realizada

desnaturação inicial a 94 °C por 3 min, em seguida foram realizados 35 ciclos

de 30 s de desnaturação à 94 ºC, 30 s de anelamento a 58 ºC e 1 min de

extensão à 72 ºC, seguidos por um ciclo de extensão final de 7 min 21 à 72 ºC.

O tamanho e a pureza dos produtos de PCR foram visualizados por

eletroforese em gel de agarose 1,5% por 40min a 100 V, corado com

SybrGreene iluminado com luz ultravioleta.

4RESULTADOS

Os resultados deste estudo serão apresentados na forma de artigo, o qual será submetido a revista Mycoses (Alemanha) (B1).

32

ARTIGO ORIGINAL

Genotyping of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii isolated from environmental samples collected of native forest, rivers and stream in Manaus City – Brazil

Amaury dos Santos Bentes1, Ana Karla Lima Freire1, Bodo Wanke2, Márcia Lazerá2,Silviane Bezerra Pinheiro3, Diego Fernando Silva Rocha3, Ani Beatriz Jackisch Matsuura4, João Vicente Braga de Souza3.

1 Laboratório de Micologia Médica da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado/Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, Brasil. 2 Laboratório de Micologia Médico do Instituto de Pesquisas Clínicas Evandro Chagas/Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil. 3 Laboratório de Micologia Médica do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus, Estado do Amazonas-Brasil. 4 Instituto Leônidas e Maria Deane - Fiocruz Amazônia, Manaus-Brasil.

SUMMARY The Cryptococcosis is endemic in the Amazonian Region and it has being caused in majority by Cryptococcusneoformans (VNI genotype) and Cryptococcus gattii (VGII genotype). However, studies showed lower informations about the distribution of these causative agents of Cryptococcosis in amazon environment. The purpose of this present study was isolate and genotype the frequency of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii encountered in samples from rivers and native forest in Manaus city, AM, Brazil. A total of 837 environment samples collected, in the metropolitan region of Manaus, seven were positives to presence of phenoloxidase yeast. Being three samples from Forest Reserve Adolpho Ducke (FRAD), three from Negro river’s freshwater (PSR20, PSR 22, RN2) and one from stream margin within metropolitan region (SJ03). The isolates were acquired of three samples from Ducke Reserve (n=60) and three from Negro river’s freshwater (n=60). As a result, they were all belonging to C. gattii specie of VGII genotype; therefore, isolates obtained from Negro river’s freshwater (n=60) were all from a unique soil sample from Tancredo stream margin (n=20). They were identified as C. neoformans specie and VNI genotype, totalizing 140 clones. Thus, in relation to “sexual types” or mating- types (Mat α e Mat a), all of these clones were MAT α.The present study showed the prevalence of C. gattii specie with VGII genotype Mat α in environment samples investigated, and it presented Negro river as a place of easy isolation of this yeast.

33

Key words: Isolation, Genotyping, Cryptococcusgattii, Cryptococcus neoformans, PCR-Fingerprinting M13, PCR-RFLP URA5.

Introdução

A Criptococose é uma micose sistêmica de caráter oportunista que acomete

primariamente os pulmões, disseminando-se pela corrente sanguínea, e é

caracterizada por tropismo pelo sistema nervoso central. Esta se apresenta de forma

subaguda ou crônica, sendo causada por Cryptococcus neoformans e Cryptococcus

gattii 1,2,3,4.

Atualmente os dois agentes etiológicos formam um complexo de espécies5, estes

agentes causadores da doença são diferenciados sob aspectos antigênicos,

bioquímicos e genéticos: C. neoformans e C. gatti. C. neoformans, sorotipos A, D e

AD, 6,7,8 (genótipos VNI, VNB, VNII,VNIII e VNIV) possui distribuição geográfica

mundial e é encontrado com maior facilidade em habitat e excretas de aves como de

pombos (Columbia spp.), enquanto que o C. gattii, sorotipos B e C (genótipo VGI,

VGII, VGIII e VGIV) 9,10 é encontrado com maior frequência em ocos de árvores, solo

e material vegetal em decomposição.11

A infecção primária no homem por essas leveduras é pulmonar, devido à inalação de

propágulos infectantes presentes na natureza. Nos pacientes imuncompetentes, a

Criptococose pode ser assintomática com predominiode massas e nódulos

pulmonares (criptococoma). A infecção pulmonar é quase sempre subclínica e

transitória, podendo imergir ao lado de outras doenças que debilitam o indivíduo,

tornando-se rapidamente sistêmica e fatal.1,11

Os diversos surtos ocorridos pelo mundo, como os ocorridos na Austrália e da Ilha de

Vancouver, mostraram a necessidade da investigação das fontes de infecções, pois

detectando os novos nichos dos agentes da Criptococose, possibilita a intervenção da

infecção humana e animal em locais onde a prevalência da doença é alta, e em

regiões com possíveis probabilidade de novos surtos. 12,13

De acordo com o Centro de Controlee Prevenção de Doenças, CDC, Atlanta, EUA, a

Meningite por Cryptococcus spp tem uma estimativa de um milhão de casos

poranoentre pessoas com HIV/ Aids, resultando emcerca de625 milmortes no

34

mundo.14A cidade de Manaus localizada na região norte do Brasil, está dentro da

região amazônica e apresenta uma característica preocupante da doença, com um

alto índice de casos de Criptococose em pacientes sem a Síndrome da

Imunodeficiência Adquirida (Aids) causados principalmente por C. gattii.15

Os agentes da Criptococosepodem ser encontrados em uma variedade de nichos,

incluindo substratos orgânicos e habitats relacionados a construções antigas, além de

excretas de aves, fezes de morcegos e baratas, ninhos de vespa, frutas, suco de fruta

fermentado, microbiota intestinal de cavalo, leite, cavidade nasal e pele de cães, gatos

e coalas, recintos de coelhos, buracos de tatus, solo, vegetais em decomposição e

ocos de várias espécies de árvores e em água.12,16,17,18,19,20

Na região norte e nordeste do Brasil, como na região metropolitana de Manaus,

existem poucos estudos sobre a distribuição dessas fontes de infeções. Sendo que

estas, são regiões que apresentam alta prevalência de Criptococose infantil e em

pacientes imunocompetentes, com uma elevada letalidade sob a forma de

meningoencefalite e formação de lesões pseudo-tumorais. Investigar os novos nichos

ecológicos dessas espécies patogênicas de Cryptococcus é importante para evitar o

aparecimento de novos surtos nessa região.15,21,22

A cidade de Manaus é uma área cercada por floresta nativa, intenso desmatamento e

com grande presença de Rios e seus afluentes chamados de igarapés. O

desconhecimento da presença das leveduras patogênicas de Cryptococcus aumenta a

possibilidade do contato humano nessas áreas e consequentemente infeção e doença.

O objetivo deste estudo foi isolar e genotipar as linhagens de Cryptococcus

neoformans e Cryptococcus gattii presentes em amostras ambientais de rios e floresta

nativa da cidade de Manaus, AM, Brasil.

Materiais e métodos

Local de estudo

Local: Região Metropolitana de Manaus.Esta é uma cidade portuária, com presença

de muitos igarapés e localizada no centro da maior floresta tropical do mundo

(Amazônia Brasileira), no Norte do Brasil. Sua geografia destaca-se com uma área de

11.401,058 km² e uma densidade de 152,50 hab./km². É a cidade mais populosa do

Amazonas e da Amazônia. Situa-se na confluência dos rios Negro e Solimões.

O clima é considerado tropical úmido de monções, com temperatura média anual

de 26,7 °C e umidade do ar relativamente elevada durante o ano, com médias

35

mensais entre 79 % e 88 %, já na floresta a umidade pode chegar a 100%. O índice

pluviométrico é elevado, em torno de 2300 milímetros anuais, sendo março o mês

mais chuvoso (335 mm) e agosto mais seco (47 mm). As coletas foram realizadas

mensalmente no período de abril de 2013 a junho de 2014.

Os locais de coleta selecionados para estudo podem ser visualizados na figura

9, sendo que os locais de coletas receberam a seguintes siglas: “A” para as

coletas realizadas na Reserva Florestal Adolpho Ducke; B1, B2 e B3 para as

coletas realizadas nas proximidades nos Portos de Manaus, e C1-C7 para

coletas realizadas nos 7 igarapés selecionados. Para este estudo, mesmo que

de forma aleatória, buscamos coletar diversas amostras de ocos de árvores,

material vegetal em decomposição (madeira em decomposição), solo e água.

Os locais específicos de coleta foram:

a) Reserva Florestal Adolphe Ducke (RFAD):Esta reserva florestal pertence ao

Instituto de Nacional de Pesquisas da Amazônia. É uma área de 100 Km2, hoje

cercada pela cidade de Manaus, mas ainda praticamente intocada. Trata-se de

uma das áreas mais bem estudadas da Amazônia brasileira. 23A partir do ponto

georeferenciado latitude sul 2º91’97” e longitude leste 59º97’98” foi delimitada uma

área de 10.000 m2 na trilha principal da Reserva Florestal. Nessa área foram coletadas

605 amostras ambientais, sendo essas: 290 amostras de solo (1g) próximo de árvores

e da serapilheira (folhas e galhos pequenos), 290 amostras de material vegetal em

decomposição (1g) e ocos de árvores, 20 amostras de água (15mL de água

próximo das nascentes do igarapé do Ácara, igarapé Bolívia e poças de água) e 5

amostras de formigas da espécie Paraponera sp que estavam sobre madeira em

decomposição. Todas as amostras foram colocadas em sacos plásticos estéreis

(Nasco/WHIRL-PARK®);

b) Nas proximidades do Porto da Manaus Moderna (georeferenciadas como B1, B2,

B3) (B1) e no Porto do São Raimundo (B2) foram coletados 30 amostras de água do

Rio Negro em cada locale 40 amostras de água no porto do Ceasa (B3), totalizando

100 amostras de água;

c) Nos sete igarapés selecionados: Igarapé de Petrópolis (C1), Igarapé do Quarenta

(C2), Igarapé da Cachoeirinha (C3), Igarapé do Mindú (C4), Igarapé do Sambódromo

(C5), Igarapé do Tarumã (C6) e Igarapé do Tancredo Neves (C7) foram coletadas 15

amostras de água de cada um, totalizando 105 coletas. Em adição, foram coletadas 27

36

amostras de solo da margem de cada um dos sete igarapés foram selecionados para

este estudo. A etapa laboratorial foi realizada no Laboratório de Micologia Médica do

Instituto Nacional de pesquisas da Amazônia.

Isolamento de Cryptococcussp

Amostras de oco de árvores e material vegetal em decomposição: essas foram

obtidas sobre o solo, sobre as dobras de árvores e ocos de árvores. O processamento

das amostras foi realizado de acordo com protocolo descrito por Lazéra et al, 24e

Passoni et al, 25 com algumas modificações. 1g do material foi macerado em almofariz

de pistilo, previamente esterelizados e suspenso em 49ml de solução salina a 9% com

Tween 80%, 0,2 de Cloranfenicol e Amicacina, seguiu-se agitação manual por 5

minutos e após 30 minutos em processo de decantação, 100ml foram transferidos

para placa de Petri contendo Niger Seed Agar – NSA (40g de ágar, 100 g de sementes

de Guizotia abissínia, 0,2 Cloranfenicol e 0,2 Amicacina.

Solo da margem dos igarapés: O isolamento foi realizado através da técnica de

diluição em placas descrita por Clark25, onde 1g de solo foram transferidos para tubo

contendo 9ml de solução salina a 9% com tween 80%, depois foi realizada uma

diluição 1:10, sendo 0,1 mL transferido para placas de Petri contendo o meio de cultivo

NSA.

Amostras de água: As amostras foram coletadas em tubo falcon 15mL sob a

superfície do Rio Negro (zona portuária de Manaus) e igarapés. Essas amostras foram

centrifugados em 6.000 rpm a 10 min. O sobrenadante foi desprezado e 0,1 mL do

líquido/sedimento foi repassado para o meio de cultivo NSA.

Todos os meios de cultivo foram colocados em temperatura ambiente. As colônias que

apresentaram cor escura (marrom) compatíveis com Cryptococcussp foram

analisadas, sendo posteriormente realizado o processo de purificação (estrias de

desgate) e identificação fenotípica: Síntese de melanina, Mycosel, Urease, testes de

assimilação de carbono (dextrose, sacarose, lactose, galactose, rafinose, inositol,

xilose, celobiose, trealose, maltose e dulcitol) e nitrogênio (peptona e nitrato de

potássio) e Canavanina-Glicina-Azul de Bromotimol - CGB). Os isolados foram

preservados em óleo mineral e na criopreservação à -70°C, sendo depositados na

coleção de cultura do laboratório de Micologia do Instituto Nacional de Pesquisas da

Amazônia.

37

Genotipagem:

PCR-Fingerprinting

Foi realizada como descrito por Meyer et al, 27: Utilizando a sequência específica do

minissatélite M13 (5’-GAGGGTGGCGGTTCT-3’). A reação de amplificação foi

realizada em um volume final de 25 μL contendo 10 ng/µL de DNA molde, solução

tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM), 0,2 mM de cada 33

dNTP, 30 ng de oligonucleotídeo iniciador e 2,5 U de Taq DNA polimerase

(Recombinante-Invitrogen). A PCR foi realizada em um termociclador Verite 96,

Applied Biosystens, a reação consistiu em 6 min de desnaturação (94oC); 40 ciclos de

1 min desnaturação à 94ºC, 1 min de anelamento à 50ºC e 2 min de extensão à 72ºC;

por fim foi realizada uma extensão final de 6 min à 72ºC. Os produtos da amplificação

foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,4%, por 6 h a 60 V.

PCR-RFLP do gene URA5 Após a extração de DNA (Fenol Clorofórmio) dos isolados, foi realizada a PCR-RFLP

do gene URA5 como descrito por Meyer et al,27. A reação de amplificação foi realizada

em um volume final de 50 μL. Cada reação continha10 ng/µL de DNA molde (método

de extração clorofórmio), solução tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2

1,5 mM), 0,2 mM de cada dNTP, 1,5 U de Taq DNA polimerase (Recombinante

Invitrogen) e 50 ng de cada primer, URA5 (5´-ATGTCCTCCCAAGCCCTCGACTCCG´-

3) e SJ01 (5´-TTAAGACCTCTGAACACC GTACTC´-3). A PCR foi realizada em

termociclador Verite 96, Applied Biosystens, essa foi iniciada com 2 min de

desnaturação (94ºC) e 40 ciclos de 30 s de desnaturação à 94ºC, 30 s de anelamento

à 61ºC e 1 min de extensão à 72ºC, por fim foi realizado uma etapa de extensão final

de 10 min à 72ºC. 8 µL dos produtos de PCR foram misturados a 1 µL de tampão da

enzima Hha I e digeridos duplamente com Sau96I (10U/ µL) e Hha I (20U/ µL) por 3

horas ou overnight e separados por eletroforese em gel-agarose 3% a 100 V por 5

horas. Os padrões de RFLP foram visualizados comparando-os com os padrões

obtidos das cepas de referência que representaram cada um dos tipos moleculares

patogênicos existentes: WM 148 (sorotipo A, VNI), WM 626 (sorotipo A, VNII), WM 628

(sorotipo AD, VNIII), WM 629 (sorotipo D, VNIV), WM 179 (sorotipo B, VGI), WM 178

(sorotipo B, VGII), WM 161 (sorotipo B, VGIII) e WM 779 (sorotipo C, VGIV).

38

Fig. 1. Local de coleta e Distribuição dos isolados de Cryptococcus spna cidade de Manaus

RF50, RF63, RN2, PSR20 e PSR22). Fonte: https://www.google.com.br/maps

Locais de coleta Locais de coleta positivo

Resultados

Distribuição dos isolados e concentração (UFC/g)

De um total de 837 amostras ambientais coletadas, da região metropolitana de Manaus, sete foram positivas quanto a presença das leveduras produtoras de fenoloxidase. Sendo três provenientes da RFAD, três das águas do Rio Negro (PSR20, PSR 22, RN2) e uma da margem de um igarapé dentro da cidade de Manaus (SJ03).

Quanto as amostras coletadas na mata nativa da RFAD, duas amostras de material vegetal em decomposição (RF50 e RF63) e uma amostra de inseto (FORM63) foram positivas. Razões de isolamento (amostra positiva/amostra coletada) de 1/145 e 1/5 para o material vegetal em decomposição e insetos, respectivamente. O solo apesar de ter sido extensivamente investigado (290 amostras) não apresentou amostras positivas (Tabela 1).

Duas amostras de água coletadas próximo ao Porto do São Raimundo (PSR20 e PSR 22) e uma próxima ao Porto da Manaus Moderna (RN2) foram positivas. Razões de isolamento entre 1/15 - 1/30. Todas as 40 amostras de água do Rio Negro coletadas próximas ao Porto do Ceasa foram negativas.

Todas 105 amostras de água coletadas de igarapés da zona metropolitana foram negativas e uma amostra de solo coletadas da margem de um desses igarapés (SJ03) foi positiva, razão de isolamento 1/27.

Com relação a concentração das unidades formadoras de colônia (UFC/g), a amostra de material vegetal em decomposição da RFAD (RF50) foi a que apresentou a maior concentração (750.000 UFC/g).

39

Genotipagem e frequência dos isolados de C. neoformans e C. gattii

Experimentos de identificação de espécie e de genotipagem foram realizados com a finalidade de investigar a prevalência das espécies/genótipos nas sete diferentes amostras positivas e também para verificar a existência de variabilidade espécies/genótipos dentre os isolados de uma mesma amostra positiva. Para tanto, 20 culturas (sub-culturas de UFC presentes na placa de Petri contendo NSA originalmente utilizada no isolamento) foram selecionadas para serem investigadas quanto a seu gênero/espécie (meios Urease, Mycosel, CGB) e genótipo (PCR-Fingerprinting M13 e PCR-RFLP URA5). Portanto, as 7 amostras positivas resultaram 140 investigações de espécies e genótipos (Tabela 1).

Os isolados obtidos das 3 amostras da Reserva Ducke (n=60) e das 3 amostras de água do Rio Negro (n=60) eram todos da espécie C. gatti e do genótipo VGII. Enquanto que, os isolados obtidos, da única amostra de solo da margem do igarapé (n=20), foram identificados como pertencendo a espécie C. neoformans e ao genótipo VNI.

Mating Type

Com relação aos “tipos sexuais” ou mating-types (Mat α e Mat a), do total de 140 clones genotipados, todos apresentaram banda de 101 pb, referente a MAT α.

40

Distribuição das espécies patogênicas de Cryptococcus isolados da cidade de Manaus.

41

DISCUSSÃO

Os agentes causadores da Criptococose (leveduras do Complexo C. neoformans/C.

gattii) vêm sendo isolados de diferentes fontes ambientais, sendo essas fontes de

infecção para homens e animais12,28,29. Na Região Norte do Brasil a Criptococose é

endêmica, sendo causada pela espécie C. neoformans genótipo VNI e C. gattii

genótipo VGII, 30,31,32,33. No presente estudo, ambos micro-organimos foram isolados

nas amostras ambientais investigadas e demonstrou que o Rio Negro é um local de

fácil isolamento de C. gattii (genótipo VGII).

No mundo inteiro, as pesquisas realizadas em áreas distintas demonstraram que os

agentes da Criptococose isolados de fontes ambientais são os mesmos encontrados

nos portadores da doença daquela localidade. 34,35 Ferreira et al 36ao avaliar a

diversidade genotípica de isolados ambientais no Norte de Portugal, verificou que a

espécie C. neoformans genótipo VNI era frequente entre os isolados ambientais e

clínicos. Os resultados obtidos por Frases, et al 36 na Espanha, mostrou a prevalência

de VNIII dentre os isolados a partir de fezes de pombos e a grande presença desse

genótipo dentre os isolados clínicos. Na Australia e na Ilha de Vancouver, locais este

que a prevalência da Criptococose é alta, o isolamento das espécies em fontes

ambientais são frequentes e os genótipos idênticos aos isolados clínicos. 5,38

As amostras de material vegetal em decomposição coletadas de floresta nativa

(RFAD) apresentaram isolados de C. gattii de genótipo VGII. O número de isolados

obtidos por amostragem realizada foi similar aos observados em outros estudos

realizados em outras florestas tropicais.39,40,41 Apesar da baixa frequência dos isolados

obtidos de material vegetal em decomposição, estas amostras apresentaram altas

concentrações de unidades formadoras de colônias. As fontes ambientais de C. gattii,

até na década de 90, estavam restritas ao clima tropical e subtropical e relacionada

com árvores das espécies de Eucalyptus camaldulensis e E. teriticornis, sendo estas

espécies de árvores descritas como os únicos nichos ecológicos para este fungo. 42 A

partir de então, foi verificado, o isolamento C. gatti em outras espécies de árvores pelo

mundo, sendo associado a material vegetal em decomposição, além da presença

desta levedura em outros ambientes como solo e água em locais de clima

temperado.43

No presente estudo, as amostras de solo de floresta nativa (RFAD) não foram

positivas.A floresta da região de estudo, apesar da grande exuberância, como a

42

grande biodiversidade de árvores, os solos nos quais está fixada não possuem grande

riqueza em nutrientes.44. Kidd et al, 12 analisou 87 amostras de solo e detritos de

árvores de British Columbia no Canadá, e verificou que apenas uma amostra foi

positiva para C. gattii. No estudo de Yamamura et al 45, foi observado também uma

baixa taxa de isolamento, das 120 amostras de solo com matéria vegetal analisadas

em Londrina-Brasil, apenas um isolado foi positivo, sendo identificado como C. gattii.

Com relação aoisolamento de C. gattii (genótipo VGII) nas águas do Rio Negro,a

razão de isolamento de C. gattii por amostragem de água foi similar a razão observada

em trabalhos que investigaram C. neoformans em amostras de fezes de pombo 46,47,48,49. O Rio Negro, é o mais extenso rio de água negra do mundo, faz parte da

Bacia Amazônia, cercado por árvores da floresta amazônica apresentando um pH

entre 4,5 a 5,5, devido à grande quantidade de ácidos orgânicos provenientes da

decomposição de matéria orgânica vegetal.50,51 Ambas condições podem ser

responsáveis pela presença de leveduras fenoloxidase em suas águas. Poucos

estudos investigaram a presença de leveduras em amostras de água, sendo que, esse

é o primeiro estudo a demonstrar o isolamento de leveduras do complexo C.

neoformans/C. gattii emágua doce do Brasil. No mundo, o primeiro relato de

isolamento de C. gattii na água, foi descrito por Kidd et al 12, conferindo uma alta

frequência de isolados, sendo que de 132 amostras de água doce 27 (20%)

apresentaram positividade e das 19 amostras de água do mar, 4 (21%) foram

positivas.

Amostras de água do Rio Negro coletadas na altura do Porto do Ceasa não

apresentaram as leveduras do complexo C.neoformans/C.gattii. As águas do Rio

Negro, nas proximidades desse porto, recebem influências do Rio Solimões e do

acúmulo de esgotos domésticos (em baixa proporção) que ocorre durante o contato do

rio com a cidade, maior quantidade de sedimentos, pH (5,9 – 7,2), menor oxigenação

(3,8 mg/L) são características dessas águas.52 De forma semelhante, não foi possível

isolar as leveduras do Complexo C. neoformans/C. gattii nos sete igarapés que cortam

a Cidade de Manaus. Esses igarapés possuem alta carga orgânica (esgotos

domésticos), baixa oxigenação, turbidez, pH alcalino e alta concentração de

bactérias.53 Acreditamos que alguma(s) dessas condições influencia na existência de

leveduras do Complexo C. neoformans/C. gattii nesses ambientes.

Uma amostra de solo coletada na margem do Igarapé do Tancredo apresentou

isolados da espécie C. neoformans do genótipo VNI. Fezes de aves, incluindo

Columba livia, foram observadas nesse local. A literatura é clara em demonstrar o

43

isolamento de C. neoformans em amostras de solo contaminadas com excretas de

aves.45,54,55,56. Segundo Granados e Castañeda57C. gatti possui dificuldade de

desenvolver-se no pH alcalino dos excrementos de aves.

No presente estudo, metodologias de genotipagem foram utilizadas para

caracterização dos isolados oriundos das amostras que apresentaram leveduras do

complexo C.neoformans/C.gattii. Os genótipos VNI e VGII foram isolados, sendo que,

o genótipo VGII foi isolado com maior frequência. O isolamento desses genótipos do

ambiente corrobora com os trabalhos de Freire et al.,22 e Silva et al.,32 que

demonstraram a prevalência desses genótipos causando a Criptococose. Em um

estudo recentemente realizado em Santa Izabel do Rio Negro-Amazonas, Brasil (alto

Rio Negro), Santos58 analisou 51 amostras de poeira domiciliar e isolou leveduras do

complexo C.neoformans/C.gattii em três dessas amostras. Esse observou uma

relevante diversidade genética de C. gatti VGII, com identificação por MLST de 8

subtipos: VGIIa, VGIIb, ST5, e novos subtipos, ainda não descritos STs 264, 265, 266,

267 e 268.

Quanto ao tipo sexuado (Mating type), todos os 140 isolados analisados eram do tipo

sexual Mat α. Os organismos desse tipo sexuado são prevalentetanto em amostras

ambientais e clínicas59, demonstrando serem mais resistentes às condições

ambientais e apresentando mais fatores de virulência.60 Especificamente em nossas

Região, esse resultado corrobora com os achados clínicos de Freire et al.,22 que

investigou o tipo sexual de leveduras causadoras de Criptococose.

O presente estudo apresentou como limitações a utilização de amostragens

numericamente desiguais e a não utilização da metodologia de genotipagem MLST.

Novos estudos deverão avaliar um mesmo número de amostras de diferentes fontes

ambientais com a finalidade trazer mais informações sobre as razões de isolamento

(amostra positivas/amostras estudadas) com a finalidade analítica de demonstrar

quais locais são possíveis fontes de infecção. Trabalhos vindouros devem realizar a

genotipagem MLST com a finalidade de comprovar (com essa ferramenta mais

informativa) se os agentes isolados no presente trabalho são similares aos causadores

das infecções. Nosso laboratório está trabalhando nesse sentido.

De acordo com os resultados alcançados, o presente estudo é o primeiro a demonstrar

que os genótipos causadores de Criptococose na cidade de Manaus (VNI e VGII)

podem ser isolados de amostras ambientais como material vegetal em decomposição,

solo e água do Rio Negro coletadas dentro/próximo dessa cidade. Deve-se chamar

atenção que o Rio Negro demonstrou ser um local de fácil isolamento de C.

44

gattii(genótipo VGII). O presente estudo permitiu conhecer melhor a distribuição dos

agentes dessa doença em amostras ambientais coletadas em nossa Região.

Agradecimentos

À Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de

Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado pelo suporte, ao Instituto Nacional

de Pesquisas da Amazônia (INPA) pela permissão e cedência do espaço para

a realização dos experimentos, aos funcionários do Laboratório de Micologia do

INPA por toda ajuda, ao Laboratório de Micologia do Centro de Pesquisas

Lêonidas e Maria Deane (Fiocruz Amazônia)e do Laboratório de Micologia

Médica Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas – INI, FIOCRUZ RJ

pela parceria e doação de alguns insumos para que essa pesquisa fosse

realizada, à CAPES pelo apoio financeiro e à FAPEAM pelo financiamento

desta pesquisa através do edital PPP 2010.

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60 Kozel TR. Virulence factors of Cryptococcus neoformans.Trends Microbiol 1995; 3: 295-299.

49

5 CONCLUSÃO

• Quanto a frequência dos isolados,C. gattii foi a espécie mais prevalente

dentre os isolados. Sendo que este, predominou em amostras de água.

• Foi possível determinar a distribuição das leveduras do Complexo

Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii, onde a maior parte

desses isolados foram obtidos de amostras de água.

• Com relação a concentração de unidades formadoras de colônias, a

amostra de material vegetal em decomposição RF50 da Reserva

Florestal Adolpho Ducke foi a maior.

• As técnicas de PCR-Figerprinting e PCR-RFLP URA5 mostraram-se

como excelentes técnicas na genotipagem de isolados ambientais, onde

foi possível demonstrar que os genótipos causadores de Criptococose

na cidade de Manaus são C. neoformans VNI e C. gatttii VGII, estes são

idênticos aos isolados clínicos.

• Os genótipos VNI e VGII podem ser isolados de amostras ambientais

como material vegetal em decomposição, solo e água do Rio Negro

coletadas dentro/próximo da cidade de Manaus.

• Foi verificado, quanto ao tipo sexuado (Mating type), que todos os 140

isolados analisados eram do tipo sexual Mat α.

50

6 REFERÊNCIAS DISSERTAÇÃO

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57

7 ANEXOS

7.1 Anexo 1

Tabela 1. Nomenclatura e genotipagem em áreas adaptadas pelas principais técnicas

de tipagem molecular.

Espécie/Variedade

Nomenclatura padrão

PCR-Fingerprinting

M13

PCR-Fingerprinting

(GACA)4 AFLP MLST Cepas de

Referência

C. neoformans

var. grubil

VNI VNI VN6 AFLP1 VNI ATCC MYA-4564

(20)

VNII VNII VN6 AFLP1A

ou AFLP1B

VNII ATCC MYA-4565

(20)

VNB VNI ou VNII VN6 AFLP1A

ou AFLP1B

VNB bt1, bt131, bt100

(102)

C. neoformans

var. neoformans VNIV VNIV VN1 AFLP2 ˗

ATCC MYA-4567 (24)

Inter-varietal

AD hybrids VNIII VNIII VN3 ou VN4 AFLP3 ˗

ATCC 31045 (106)

C. gattii

VGI VGI ˗ AFLP4 VGI ATCC MYA-4560

(107)

VGII VGII ˗ AFLP6 VGII ATCC MYA-4561

(109)

VGIII VGIII ˗ AFLP5 VGIII ATCC MYA-4562 (109)

VGIV VGIV ˗ AFLP7 VGIV ATCC MYA-4563

(109)

Inter-species

hybrids

VNI/VGI VNI/VGI ˗ AFLP9 ˗ CBS 10496

(108)

VNIV/VGI VNIV/VGI ˗ AFLP8 ˗ CBS 10488

(110)

VNI/VGII VNI/VGII ˗ ˗ ˗ WN 05-272

(109)

ATCC: American Type Culture Collection (http://www.atcc.org/); CBS: Centraalbureau voor Schimmelcultures

(http://www.cbs.knaw.nl/); WM: Westmead Millennium Institute, Sydney, Australia; bt: isolate from Botswana

Fonte: Cogliati (2012)(7)

58

7.2Anexo 2

MEIOS DE CULTIVO

Niger Seed Agar – NSA

Guizotia abyssinica: 50 g

Glicose:1 g

Ágar: 20 g

Água destilada: 1000 ml

Aditivos: para cada 500 ml:

Cloranfenicol (500 mg/ml): 0.2 ml

Amicacina

Princípios: Adicionar as sementes de Guizotia abyssinica moídas a 1000 ml de água destilada. Ferver por 30 minutos. Passar por papel filtro e completar o volume com água destilada para 1000 ml. Adicionar os ingredientes remanescentes (exceto pelo Agar e os antibióticos) e filtrar.

Ágar uréia de Christenesen

Peptona de carne 1 g

Glicose 1 g

Cloreto de sódio 5 g

Fosfato dissódico 1,2 g

Fosfato de potássio 0,8 g

Vermelho de fenol 0,012 g

Ágar ágar 15 g

Água destilada 1000 mL

pH final = 6,8

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Princípios: Meio na fórmula comercial de pó desidratado, não havendo necessidade de ser formulado. Meio utilizado Ágar Base Uréia (Christensen). Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante, adicionar em balão, já contendo a metade da água, homogeneizar, acrescentar o restante da água e aquecer levemente até fundir o meio, sob agitação constante. Em seguida, tamponar o balão com rolha de algodão hidrófobo, embalar, rotular e autoclavar a 120° C por 15 minutos. Após autoclavar, resfriar até 50° C e adicionar assepticamente 10ml da solução base de uréia a 40% (esterilizada por filtração), para cada 100ml de base. Homogeneizar e distribuir assepticamente 3ml em tubos 12 mm x 75 mm, já estéril . Deixar solidificar a temperatura ambiente inclinando cada tubo em ângulo de 45°. Após completa solidificação do meio, armazenar na geladeira em recipiente fechado para que o meio não desidrate. Após preparo o meio apresenta coloração âmbar ou amarelo-pálido. Observação: Existem no mercado diversas marcas de meios, onde se torna indispensável à leitura das instruções de preparo, pois alguns já contêm uréia em sua fórmula, e não contêm ágar. Meio de cultura Canavanina, Glicina e Azul de Bromatimol (CGB)

Produção da solução A (para um volume final de 100mL)

L-canavanina – 30 mg

Glicina -10 g

KH2PO4 – 1g

7H2O MgSO4 – 1 g

Tiamina HCl ou Tiamina – 1mg

Princípios:

Completar ate o volume final de 100mL com água Mili Q

Verificar o pH da Solução e corrigir, se necessário, com NaOH 1M ou HCL

fumegante (37%)

O pH final deverá ser 5,8 sendo aceitável variação de ate aproximadamente 0,1

Esterilizar por filtração utilizando membrana 0,22µm

60

Fazer alíquotas de 25mL

Armazenar em freezer -20°C

Produção de solução B (Para volume final de 100mL) – Solução azul de

bromatimol sódico 0,4%

Azul de bromatimol sódico – 0,4g

Completar ate o volume final de 100mL com água Mili Q

Homogeinizar

Verificar o ph da soluçãoe corrigir se ncessario com NaOH 1M ou HCL

fumegante (37%)

O pH final deverá ser de 5,8 sendo aceitável varição de ate aproximadamente

0,1

Colocar esta solução em frasco âmbar

Armazenar em geladeira (+2 a +8°C)

Produção final do meio CGB

Retirar do freezer a solução A e deixar em temperatura ambiente

5g de ágar

5mL da solução B

Completar o volume ate 220mL com Mili q

Autoclavar 121°C

Resfriar 55°C

Acrescentar ao meio resfriado 25mL da solução A lentamente, homogeinazar

bem.

61

Distribuir 2,3 ml no tubos de ensaio estéreis 13x100mm com tampa.

Agar Mycosel

Composição

Peptona de soja 10,0 g/L

Glicose 10,0 g/L

Ágar 15,5 g/L

Cloranfenicol 0,05g/L

Cicloheximida 0,4g/L

Água destilada q.s.p.

pH final 6,9 ± 0,2

Princípios: Dissolver 36 g em 1 litro de água destilada ou deionizada. Hidratar por 10 a 15 minutos. aquecer agitando frequentemente e ferver por no máximo1 minuto. Esterilizar a 121ºC a uma pressão de 1 atm por 15 minutos. Não superaquecer, pois o ágar perderá sua capacidade de solidificar-se podendo também escurecer o meio. Esfriar até 45-50ºC. Distribuir 10-15 mL por tubo estéril. Se não for usado no mesmo dia, armazenar entre 2 e 8ºC em recipiente fechado.

62

7.3Anexo 3

Fluxo de Procedimentos

COLETA DAS AMOSTRAS AMBIENTAIS

SOLO MATERIAL VEGETAL EM DECOMPOSIÇÃO

ÁGUA

PROCESSAMENTO DAS AMOSTRA

ISOLAMENTO

PURIFICAÇÃO

(Estrias por esgotamento)

IDENTIFICAÇÃO

FENOTÍPICA E GENOTÍPICA