AMOSTRAGEM PARA ANÁLISE E DETERMINAÇÃO DE … · 2013-03-25 · Aflatoxinas Ocratoxina...

AMOSTRAGEM PARA ANÁLISE E DETERMINAÇÃO DE MICOTOXINAS EM PRODUTOS DE ORIGEM

VEGETAL

Segurança alimentar e alimentos seguros

ElieneElieneElieneEliene Alves dos SantosAlves dos SantosAlves dos SantosAlves dos SantosFiscal Agropecuário (IMA) - MASP 969101-5

Acordo de Cooperação Técnica 21000.002461/2006-91Lacqsa/Lanagro-MGOutubro - 2009

SeguranSegurançça como Fator de Qualidadea como Fator de Qualidade

QUALIDADE

Controle de perigosquímicos, físicos

e biológicos

SEGURANÇAcorsaborconsistênciatamanhoaspecto

nutrição

SEGURANÇA :Controle de perigosquímicos, físicos

e biológicos

Substâncias químicas produzidas naturalmente por fungos.

Ocorrem em alimentos sob certas condições de umidade e temperatura.

Podem ocorrer no campo, durante o transporte e armazenamento (Soliman etal., 2002).

Causam sérios problemas a saúde humana e de animais (Micco et al., 1989).

MicotoxinasMicotoxinas


e biológicosMicotoxinasMicotoxinas

Aflatoxinas

Ocratoxina

Zearalenona

Fumonisinas

Desoxinivalenol

Patulina ...


e biológicos

PaPaííses com e sem regulamentos ses com e sem regulamentos

para para micotoxinasmicotoxinas

6

FAO

2003


e biológicos

7

Exemplos: Exemplos:

EU: 2 µg/kg para B1 e 4 µg/kg de total

Brasil: Limite máximo de 30µµµµg/kg para aflatoxinas B1 + G1

em produtos para consumo humano, segundo Resolução nº34/76, MS/CNNPA, publicada no Diário Oficial da União em 19/01/77, Seção 1, Parte V.

Limite máximo de 50 µµµµg/kg para aflatoxina total (B1, B2, G1

e G2) em produtos para consumo animal, segundo Portaria MA/SNAD/SFA, nº 07, de 09/11/88, publicada no Diário Oficial da União em 14/11/88.

Mercosul (25/02): 20 µµµµg/kg para aflatoxina total (B1, B2, G1

e G2) em amendoim, milho e derivados.

Limites para Limites para micotoxinasmicotoxinas

O estabelecimento de limites

pressupõe a disponibilidade

de planos de amostragemplanos de amostragem e de

mméétodos analtodos analííticosticos

DistribuiDistribuiçção das ão das micotoxinasmicotoxinas


não homogênea homogênea

DistribuiDistribuiçção das ão das micotoxinasmicotoxinasEvento raroEvento raro

Lote = 10 ppbProporção = 3/10.000 = 0.03%


Alimentos não processados – heterogênea (FAO, 1993; Whitaker, 1996)

� Distribuição binomial (milho, amendoim, nozes de árvores)

� Binomial Negativa (castanha-do-brasil)

� Weibel� Lognormal (café)� Gamma

Depende de fatores como composição do produto, tamanho, safra, condições climáticas e outros.


Amostra(? kg)

� Lote (µg/kg)(ppb) = amostra ppb ?

� Amostra ppb ≤≤≤≤ Limite ?

Avaliação da contaminação do lote

(25 000 kg)(µg/kg) =? (µg/kg)

Lote


Amostra(? kg)

� Lote (ng/g)(ppb) = 10-9g de toxina em 1g de amostra

Avaliação da contaminação do lote

(25 000 kg)(µg/kg) =?

25kg (µg/kg)

Lote 1000 100000 250g

(µg/kg)

1g (µg/kg)

250


Aflatoxinas

Contaminações determinadas (µg/kg)

• Amostras (5 kg)• Moinho do USDA• 275 g sub-amostra• análises por TLC

0 0 0 0 3 13 19 41 43 69

Apresentação realizada por Thomas Whitaker USDA/ARS em Belo Horizonte em 16-06-2004, workshop de amostragem em café: Sampling Agricultural Commodities for Mycotoxins

Variabilidade dos resultados


Aflatoxinas

16


0,11

0,52

0,55

0,76

1,06

1,23

1,251,74

2,06 4,33 5,9617,17

39,26

38,11

21,55

19,33

40,38

30,93

35,21

100,93

Amostra: 200kg

Média (µg/kg) =18,12Mediana (µg/kg) = 5,15

CV (%) = 124,4Valor mínimo (µg/kg) = 0,11Valor máximo (µg/kg) =

100,93Variância observada = 612,59


Lote : 4000kg

17

AflatoxinasAflatoxinas –– distribuidistribuiçção Afla totalão Afla total

Amostra: 200kg

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,000,00

0,00 0,00 0,00 0,00

0,62

0,02

0,00

0,00

0,81

0,00

0,00

88,23


Média (µg/kg) = 4,48

Mediana (µg/kg) = 0,00

CV (%) = 868,4

Valor mínimo (µg/kg) = 0,00

Valor máximo (µg/kg) = 88,23

Variância observada = 388.60

Lote 25: 4000kg


18

MicotoxinasMicotoxinas -- DISTRIBUIDISTRIBUIÇÇÃOÃO

Variabilidade entre os resultados dos testes

�Grande

�Aumenta com a contaminação do lote

DON (trigo), afla (milho e amendoim), FB (milho) e OTA (café)

�Mais resultados abaixo da contaminação

esperada para o lote - mediana < media

(Risco do comprador)

19

AFLATOXINAS AFLATOXINAS -- DISTRIBUIDISTRIBUIÇÇÃOÃO

19

Contaminações determinadas (µg/kg)Média = 18,8µg/kg mediana = 8 µk/kg

• Amostras (5 kg)• Moinho do USDA• 275 g sub-amostra• análises por TLC

0 0 0 0 3 13 19 41 43 69

AflatoxinasAflatoxinas –– distribuidistribuiçção Afla totalão Afla total

É impossível determinar a verdadeira contaminação

do lote devido àvariabilidade associada com a amostragem,

preparo das amostras e amostragem

21

Limite µg/kg0

Bons Ruins

Lotes aceitos

Lotes bons rejeitados x

x

(Risco do vendedor)

(Risco do comprador)Lotes aceitos

Lotes ruins rejeitados

ConseqConseqüüência da variabilidade ência da variabilidade dos resultadosdos resultados

22

Erros na determinaErros na determinaçção de ão de micotoxinasmicotoxinas

ERRO TOTAL

Lote AmostraSub-

Análise

Amostragem

Erro de Sub-

Análise

90% 10%

Erro total

LoteSub-

Análise

Amostragem

Erro de Sub-

Análise

90% 10%

Lote amostra Sub amostragem

Análise

Erro de amostragem

Erro Preparode amostra

Erro Analítico

90% 10%

amostragem - 90% métodos analíticos - 10%

(Whitaker e Park, 1994) (Whitaker e Park, 1994) (Whitaker e Park, 1994) (Whitaker e Park, 1994)

23

Fontes da variabilidadeFontes da variabilidade

Lote Amostra Preparação Análises

Variância Total

VariânciaAmostragem

VariânciaPreparo de amostras

Variância analítico

ppb(µg/kg)

24

Plano de amostragemPlano de amostragem

O plano de amostragem projetado O plano de amostragem projetado deve definirdeve definir

� os critérios de aceitação do lote em relação a uma probabilidade determinada (normalmente 95%)

�característica estatística de desempenho ou de uma curva operação característica

25

Plano de amostragemPlano de amostragem

Conjunto de procedimentos planejados

�amostragem

�preparo de amostra

� método analítico

Procedimento teste para micotoxinas

Limites de aceitação e rejeição de lotes

26

Procedimentos planejadosProcedimentos planejados

26

a- seleção do lote

b- Retirada da amostra

c- Preparo: moagem/ pasta (~20 mesh) d - Análises e

quantificação

e - Avaliação estatística

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 10 20 30 40 50 60

Aflatoxin Concentration (C) - ppb

Accep

tan

ce P

rob

ab

ilit

y

False Positives

False Negatives

C > C g = Unacceptable

Lots C ≤ C g = Acceptable

Lots

C a = C g

Composto de 5 estComposto de 5 estáágiosgios

27

Lote 1 Lote i Lote n

Amostras 1,3,5,…,x-1 Amostras 2,4,6,…,x

Moagem

Subamostra 2Subamostra 1

ExtratoExtrato

Aliq 2Aliq 1 Aliq 1

Moagem

Subamostra 1

Extrato

Aliq 1

“Design” de Nested, desbalanceado, para amostragem

28

Medida da variância relativa ao processo de amostragem

Medida de variância relativo ao preparo

Medida da variância relativa a análise

Variância total do processo

Dados de análises

29

Teoria estatística

Avaliação do modelo

30

Castanha-do-brasil sem casca

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 1 2 3 4 5 6 7

Sample Aflatoxin Concentration - x (ppb)

Pro

babili

ty o

f O

bta

inin

g x

or Less

Observed

Cg025Pred

Ln2Pred

NbPred

Lot 10 Shelled Brazil Nuts

N=20, Mean = 1.01

Obs Variance = 2.893

Sample: 10 kg (ns = 1,850)

31

Castanha-do-brasil sem casca

Distribuição de aflatoxina total em castanha-do-brasilsem casca

Gama Composta

Binomial Negativa

Lognormal

3232

s s2 = 4,8616C

1,889

R = 0,80

0,1

1

10

100

1000

10000

0,1 1 10 100

Afla total µg/kg

Va

riâ

ncia

da

am

ostr

a -

ss2

Aflatoxina T otal

Lots > 0,39 µg/kg

F itted by GLM, log

Variância da amostracastanha-do-brasil

33

s s s2 = 0,0306C

0,632

R = 0,24

0,001

0,01

0,1

1

10

0,1 1 10 100

Aflatoxina total (µg/kg)

Va

riâ

ncia

do

pre

pa

ro d

a a

mo

str

a s

ss2

Aflatoxina T otal

Lotes > 0,39 µg/kg

F itted by GLM, log

Variância do preparo da amostra castanha-do-brasil

3434

sa2 = 0,0164C

1,117

R = 0,43

0.0001

0.001

0.01

0.1

1

10

0.1 1 10 100

Vari

anci

a A

nal

itica

-sa

2

Aflatoxina total (µg/kg)

Aflatoxina Total

Lotes > 0.39 µg/kg

Fitted by GLM, log

Variância do preparo da amostra castanha-do-brasil

3535

Plano de amostragemCurva operacional para aflatoxinas em milho

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0 10 20 30 40 50 60

Concentração de aflatoxina no lote (µg/kg)

Probabilidade de aceite

1 kg 5 kg 20 kg Limite

Risco do vendedorLotes bons rejeitados

Lotes ruins aceitos -Risco do Comprador

3636

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 20 40 60 80 100 120 140

Lot Aflatoxin Concentration (Total ug/kg)

Accept P

robabili

ty (

%)

DFP - Shelled Brazil Nuts

BN (0.39) Laboratory Sample Size Noted

Slurry Grind 100 g, 50 g Test Portion

Analysis, 1 Aliquot, 22% Reproducibility RSD

Maximum Level = 20 Total Aflatoxin (ug/kg)

Accept/Reject Limit = 20 (ug/kg)

Maxim

um

Lim

it

1

2

3

6

4

1 - 1x20 kg < 20 ug/kg

2 - 1x30 kg < 20 ug/kg

3 - 1x40 kg < 20 ug/kg

4 - 2x20 kg < 20 ug/kg

5 - 2x10 kg < 20 ug/kg

6 - 3x10 kg < 20 ug/kg

5

Plano de amostragemCurva operacional para aflatoxinas em castanha-do-brasil sem casca

3737

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100


Accept

Pro

babili

ty (

%)

DFP - Shelled Brazil Nuts




Maximum Level = 15 Total Aflatoxin (ug/kg)

Accept/Reject Limit = 15 (ug/kg)

Maxim

um

Lim

it

1

23

5

4

1 - 1x20 kg < 15 ug/kg

2 - 1x30 kg < 15 ug/kg

3 - 1x40 kg < 15 ug/kg

4 - 2x20 kg < 15 ug/kg

5 - 3x10 kg < 15 ug/kg


3838

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80


Accept P

robabili

ty (%

)

Export




Maximum Level = 10 ng/g Total Aflatoxin

Accept/Reject Limit = 10 ug/kgM

axim

um

Lim

it

1x10 kg

2 x10 kg

3x10 kg

4x10 kg


39

ReduReduçção dos riscosão dos riscosProcedimento Variância

5 kg 521,4

Subamostra 250g – M1 59,2

TLC 1 alíquota 50,1

Total 630,7

2o kg 130,4

Subamostra 100g – M2 25,5

HPLC 1 alíquota 20,1

Total 176,0

4040

Método de amostragem

Conjunto de procedimentos planejados que permitem fazer a tomada de amostras REPRESENTATIVAS de um determinado lote ou sublote;Indica o número, a massa e a frequênciados incrementos a serem retirados em cada amostragem

4141

LOTE (t)

Incrementos (g)

Amostra global(kg)

Amostragem

Quantidade de produto retirada em um só ponto do lote ou sublotepara formar a amostra global

Formada pela totalidade dos incrementos colhidos em um lote ou sublote

Formada a partir da amostra global, podendo ser igual a estaLaboratório

Quantidade de produto com características definidas sob

condições essencialmente iguais

Amostra de trabalho (kg)

4242

•Representativa

�Aleatória

�Chance igual

�Não tendenciosa

Amostragem

Retirada da amostra

43

• Lote apresentar as condições necessárias;

• Incrementos devem ser retirados de vários pontos cobrindo completamente o lote;

• Equipamentos apropriados

Amostragem

4444

Armazenamento e amostragem de café para análise de ocratoxina A

4646

Amostragem em big bag

4747

Os caladores ou coletores de incrementos deverão ser definidos de acordo com o local da coleta, o tipo de grão e deverão ser adequados para coletar incrementos (g).

Atingir o máximo de profundidade.

Amostragem

4848

Cálculo da frequênciade amostragem

Verificar

� Massa do lote

� Massa da amostra global

� Massa do incremento

Amostragem

4949

Lotes: sacas, caixas, big bags, etc.

Calcular a freqüência da amostragem:

Freqüência da amostragem

(F)=Massa do lote (kg) X massa do incremento(kg)

Amostra global(kg) X capacidade da embalagem(kg)

Em que:

F = freqüência de amostragem: indica a frequência ou

intervalos regulares de amostragem ou o número de

embalagens individuais das quais será colhido um

incremento.

As casas decimais serão arredondadas para o número

inteiro mais próximo.

Calcular o número de incrementos a serem retirados;

5050

Exemplo: Lote = 25 toneladas de amendoimMassa do incremento = 200gMassa da amostra global = 20kgCapacidade da embalagem = 60kg

F=Massa do lote (kg) X massa do incremento(kg)Amostra global(kg)Xcapacidade da embalagem(kg)

F= 25.000 kg x 0,200kg = 4,16 ~= 520kg x 60 kg

a cada 5 sacos será retirado um incremento de 200g

No final: 25.000 kg divididos por 60 kg = 416 sacosDos quais 100 serão amostrados: 20 kg

Coleta das amostras de amendoim - IN 03

�Mercado Interno e países do MERCOSUL – anexo II

�Mercado Interno (varejo) – anexo III

�Mercado Internacional (exceto MERCOSUL e União Européia)

– anexo IV

�União Européia – anexo V

52

ANEXO IICritérios para amostragem de Lotes de Amendoim

Destinados ao Mercado Interno e países do MERCOSUL

Massa do loteMassa ou nºde sub-lotes

Nº de incrementos

Massa do increment

o

Massa da amostra global

Massa mínima da amostra de trabalho

Descascado Em casca

≥≥≥≥ 500 t 100 t

100 200 g 20 kg

5 kg 7 kg

> 100 e < 500 t 5 sub-lotes

≥≥≥≥ 25 e ≤ 100 t 25 t

> 15 e ≤ 25 t 1 sub-lote

> 10 e ≤ 15 t - 80 16 kg

> 5 e ≤ 10 t - 60 12 kg

> 1 e ≤ 5 t - 40 8 kg

53

ANEXO IIICritérios para amostragem de Lotes de Amendoim

Destinados ao Mercado Interno (varejo)

Massa do lote

Nº de incrementos

Massa do incremento


Massa da amostra de trabalho

sem casca

com casca

sem casca

com casca

sem casca

com casca

> 0,5 e < 1 t

30

200 g 270 g

6 8,1 5 7

> 0,2 e < 0,5 t

20 4 5,4 4 5

> 0,1 e <0,2 t

15

3 4,0 3 4

< 0,1 102 2,7 2 2,7

54

ANEXO IVCritérios para amostragem de Lotes de Amendoim

Destinados ao Mercado Internacional(exceto MERCOSUL e União Européia)

Massa do loteMassa ou nº de

sub-lotesNº de

incrementos

Massa do incremento

(descascado)


Massa da amostra de

trabalho

≥≥≥≥ 500 t 100 t

100

200 g

20 kg 20 kg

> 100 e < 500 t 5 sub-lotes

≥≥≥≥ 25 e ≤ 100 t 25 t

> 15 e ≤ 25 t 1 sub-lote

> 10 e ≤ 15 t - 80 16 kg 16 kg

> 5 e ≤ 10 t - 60 12 kg 12 kg

> 1 e ≤ 5 t - 40 8 kg 8 kg

≤ 1 t - 10 2 kg 2 kg

55

ANEXO VCritérios para amostragem de Lotes de Amendoim

Destinados à União Européia

Massa do loteMassa ou nºde sub-lotes

Nº de incrementos

Massa do incremento

Massa da amostra global 2

Massa da amostra de trabalho

≥≥≥≥ 500 t 100 t

100

300 g

30 kg 30 kg

> 100 e < 500 t 5 sub-lotes

≥≥≥≥ 25 e ≤ 100 t 25 t

> 15 e ≤ 25 t 1 sub-lote

> 10 e ≤ 15 t -

> 5 e ≤ 10 t - 80 24 kg 24 kg

> 2 e ≤ 5 t - 60 18 kg 18 kg

> 1 e ≤ 2 t - 40 12 kg 12 kg

> 0,5 e ≤ 1 t - 30 9 kg 9 kg

> 0,2 e ≤ 0,5 - 20 6 kg 6 kg

> 0,1 e ≤ 0,2 - 15 4,5 kg 4,5 kg

≤ 0,1 - 10 3 kg 3 kg

1 Adaptada do Regulamento CE nº 401/2006 da Comissão Européia de 23/02/2006.2 Nos casos de lotes vendidos a varejo, a massa da amostra global pode ser diferente.

Amostragem

Coleta de incrementos

Amostra global

Mercado interno e MERCOSUL Homogeneização

e fracionamento

Amostra de

trabalho

Mercado externo

(exceto MERCOSUL)

Amostra global = amostra de trabalho

Laboratório

57

Lote em movimento (por exemplo em

esteira) pode ser considerado estático se

a amostragem for realizada no saco

imediatamente após o ensacamento

senão calcular mediante a vazão da

esteira ou da quantidade que é ensacada

ou processada por dia.

Amostragem de lotes em movimento

58

Preparo da amostra

Preparo: moagem/pasta(~20 mesh)

MoagemPastaamendoim: água (1:1,5 v/v)

59

Preparo da amostra – Moinhos

Tipo Turrax

60


61

ModeloCapacidade aproximada

Motor (rpm) Volt.Dimensões (cm)

Larg. x Prof.Altura (cm)

Peso (kg)

UM-12 12 l – 7 kg

1750 - 3500

Trifásica

220ou

380V

70 x 45 97 55

UM-25 25 l – 15 kg 80 x 77 120 125

UM-44 44 l – 27 kg 90 x 77 125 140

UM-130E 130 l – 80 kg 140 x 112 190 600


Multiprocessadora de Alimentos Cutter Mixer(Linha UM)

62

Extração Purificação

Suporte sólido

Impureza

Anticorpo anti micotoxinas

Micotoxinas

Extrato da amostra

Ampliação após

passagem do extrato

da amostra na IAC

CLAE

Detecção quantificação

CCD

Detecção quantificação

Análises e quantificação de micotoxinas nas amostras

63

[email protected]

Rio de Janeiro – Outubro de 2009

AMOSTRAGEM PARA ANÁLISE E DETERMINAÇÃO DE … · 2013-03-25 · Aflatoxinas Ocratoxina...

Documents

Transcript of AMOSTRAGEM PARA ANÁLISE E DETERMINAÇÃO DE … · 2013-03-25 · Aflatoxinas Ocratoxina...