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Ana Karla Guedes de Melo AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE INDIVIDUAL AOS GLICOCORTICOIDES E EXPRESSÃO DO RECEPTOR DE GLICOCORTICOIDE EM PACIENTES COM LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO Dissertação apresentada ao curso de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Medicina São Paulo – 2011
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Ana Karla Guedes de Melo
AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE INDIVIDUAL AOS GLICOCORTICOIDES E
EXPRESSÃO DO RECEPTOR DE GLICOCORTICOIDE EM PACIENTES COM
LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO
Dissertação apresentada ao curso de Pós-Graduação
da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
para obtenção do título de Mestre em Medicina
São Paulo – 2011
Ana Karla Guedes de Melo
AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE INDIVIDUAL AOS GLICOCORTICOIDES E
EXPRESSÃO DO RECEPTOR DE GLICOCORTICOIDE EM PACIENTES COM
LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO
Dissertação apresentada ao curso de Pós-Graduação
da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
para obtenção do título de Mestre em Medicina
Área de concentração: Ciências da Saúde
Orientador: Dr. Murilo Rezende Melo
São Paulo - 2011
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Melo, Ana Karla Guedes de Avaliação da sensibilidade individual aos glicorticoides e expressão do receptor de glicocorticoide em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico./ Ana Karla Guedes de Melo. São Paulo, 2011.
Dissertação de Mestrado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo – Curso de Pós-Graduação em Medicina.
Área de Concentração: Ciências da Saúde Orientador: Murilo Rezende Melo 1. Lúpus eritematoso sistêmico 2. Glucocorticoides 3. Receptores
de glucocorticoides BC-FCMSCSP/27-11
Dedico este trabalho aos meus pais e irmão, Antonio, Aidete e Aldson,
que iluminam o caminho da minha vida,
e à minha família, Eduardo e Carlos Eduardo,
motivo maior da minha vitória.
“Nenhum trabalho de qualidade pode ser feito sem concentração e auto-sacrifício, esforço e
dúvida."
(Max Beerbohm)
Agradecimentos
Ao Professor Adjunto do Departamento de Ciências Fisiológicas da Faculdade de
Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e meu orientador, Prof. Dr. Murilo Rezende
Melo, por ter me acolhido nesta etapa tão importante da minha carreira e ter me ajudado com
as suas precisas e incisivas pontuações.
À Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e à Irmandade da Santa
Casa de Misericórdia de São Paulo, pela receptividade na minha formação em Reumatologia e
no curso de Mestrado em Ciências da Saúde.
À Coordenadora do Programa de Pós-Graduação strictu sensu da Faculdade de
Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, Profa. Dra. Carmen Lúcia Penteado
Lancellotti, pelo seu empenho e trabalho frente à direção deste Programa.
À amiga e reumatologista, Alessandra Barbosa Avelar Saramago, pelo
companheirismo e pelo imensurável auxílio no andamento deste trabalho.
À Professora Assistente da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São
Paulo e Coordenadora da Disciplina de Reumatologia do Departamento de Medicina Interna
da Santa Casa de São Paulo, Dra. Branca Dias Batista de Souza, pela credibilidade, amizade e
pelos ensinamentos que permitiram grande parte da fundamentação teórica desta dissertação.
Aos colegas do Laboratório de Medicina Molecular e aos funcionários do Laboratório
de Medicina Nuclear, em especial a Giovanni Dermartino e Flávio Richetti, sem os quais
muitos passos deste trabalho não seriam adequadamente realizados.
À equipe da Comissão de Pós-Graduação e da Biblioteca Central da Faculdade de
Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, especialmente à Sra. Mirtes Dias de Souza, por
sua presteza, dedicação e imensa capacidade de solucionar problemas.
À Dra. Roberta Borges Castro, endocrinologista e amiga, por sua paciência e
disponibilidade em dividir conhecimentos e experiências importantes para a execução dos
experimentos no Laboratório de Medicina Molecular da Santa Casa de São Paulo.
Aos pacientes que não hesitaram em participar deste estudo e aos controles, pela
confiança e credibilidade.
Ao Professor Titular da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e
coordenador do Laboratório de Medicina Molecular, Prof. Dr. Carlos Alberto Longui, pelo
brilhantismo no esclarecimento de dúvidas e pela formulação de ideias para o enriquecimento
teórico deste trabalho.
Ao FAP da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de Misericórdia de São
Paulo, pelo apoio financeiro na execução deste estudo.
E a todas as outras pessoas que, direta ou indiretamente, colaboraram para a
finalização desta etapa grandiosa da minha vida profissional.
Abreviaturas e Símbolos
ACR: Colégio Americano de Reumatologia (―American College of Rheumatology‖)
ACTH: hormônio adrenocorticotrófico
Anti-dsDNA: anti-DNA dupla hélice
Anti-Sm: Smith (nome do primeiro paciente em que foi reconhecido)
AP-1: proteína ativadora 1
AR: artrite reumatóide
cFOS: oncogene cFos
COX-2: cicloxigenase tipo 2
DP: desvio-padrão
ELAM-1: ―endothelial-leukocyte adhesion molecule 1‖
ERK: ―extracellular signal-regulated kinase‖
FAN: fator antinuclear
F%: amplitude de supressão do cortisol após o teste intravenoso com dose muito baixa de
dexametasona
FOr%: amplitude de supressão do cortisol após o teste oral com dose baixa de dexametasona
GC: glicocorticoides
GM-CSF: fator estimulador da colônia de granulócitos e monócitos
GRE: elemento responsivo aos glicocorticoides
Hep-2: linhagem de células tumorais derivadas de carcinoma laríngeo humano
HHA: hipotalâmico-hipofisário-adrenal
hsp: proteína de choque térmico
ICAM-1: “Inter-Cellular Adhesion Molecule 1‖
IFN: interferon
IkB ou IkappaB: inibidor do NF-kB
IkK ou IkappaK: inibidor da proteína cinase do NF-kB
IL-1: interleucina 1
IL-2: interleucina 2
IL-4: interleucina 4
IL-6: interleucina 6
IL-10: interleucina 10
IV-VLD-DST: ―Intravenous very-low dose dexamethasone suppresion test‖
JNK: ―c-Jun N-terminal kinase‖
LES: lúpus eritematoso sistêmico
MAPK: ―mitogen-activated protein kinase‖
MEK: MAPK/ERK kinase
MEKK3: MAPK/ERK kinase kinase 3
MSK1: mitogen- and stress-activated protein kinase
NF-kB: fator de transcrição nuclear kappa B
nGRE: elementos responsivos negativos aos glicocorticoides
NIK: “NF-kappaB-inducing kinase‖
OMIM: ―online mendelian inheritance in man‖
PKA: proteína cinase A
r: coeficiente de correlação
r2: coeficiente de determinação
RG: receptor(es) de glicocorticoide
RGα: isoforma alfa do receptor de glicocorticoide
RGβ: isoforma beta do receptor de glicocorticoide
RIP1: proteína 1 de interação ao receptor
RQ-PCR: PCR em tempo real
SLEDAI: ―Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index‖
SLICC/ACR/DI: índice de dano do Systemic Lupus International Collaborating Clinics/
American College of Rheumatology
SNC: Sistema Nervoso Central
TAK1: proteína cinase ativada 1
TCR: receptor de célula T
TGF-β: fator transformador do crescimento β
TLR: ―toll-like receptors‖
TNFα: fator de necrose tumoral alfa
TNFR: receptor do fator de necrose tumoral
TRADD: ―death domain‖
TRAF2: fator 2 associado ao receptor do fator de necrose tumoral
3’UTR: ―the three prime untranslated region‖
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO………………………………………………………………….. 01
1.1 Revisão da literatura………………………………………………………… 02
1.1.1 Lúpus eritematoso sistêmico………………………………………………. 02
1.1.2 Fator de transcrição NF-kB e suas cinases.................................................... 05
1.1.3 Glicocorticoides no LES............................................................................... 08
2. OBJETIVOS........................................................................................................... 14
3. CASUÍSTICA E MÉTODO................................................................................... 15
3.1 Desenho do estudo........................................................................................... 15
3.1.1 Testes de supressão com doses muito baixa e baixa de dexametasona........ 17
3.1.2 Separação de células mononucleares............................................................ 17
3.1.3 Extração de RNA e obtenção do DNA complementar................................. 18
3.1.4 PCR em tempo-real (RQ-PCR)..................................................................... 19
3.2 Análise estatística............................................................................................. 22
4. RESULTADOS...................................................................................................... 24
4.1 Comparação da sensibilidade in vivo aos glicocorticoides nos dois grupos
estudados................................................................................................................
26
4.1.1 Comparação das condições basais e resposta ao IV-VLD-DST entre os
grupos.....................................................................................................................
26
4.1.2 Comparação da resposta ao teste oral com dose baixa de dexametasona
entre os grupos.......................................................................................................
28
4.2 Comparação da expressão gênica entre os grupos.......................................... 29
4.3 Correlação da sensibidade in vivo e expressão gênica.................................... 29
4.4 Avaliação dos achados laboratoriais em relação aos dados clínicos nas
pacientes com LES...............................................................................................
30
4.5 Avaliação do uso ou não de prednisona nas pacientes com LES, em relação
às variáveis estudadas............................................................................................
31
5. DISCUSSÃO.......................................................................................................... 32
6. CONCLUSÕES...................................................................................................... 40
7. ANEXOS................................................................................................................ 41
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................... 49
RESUMO............................................................................................................... 59
ABSTRACT........................................................................................................... 60
APÊNDICE............................................................................................................ 61
1
1. INTRODUÇÃO
As respostas imunológicas e inflamatórias são processos fisiológicos complexos
importantes na homeostase e, consequentemente, na sobrevivência dos indivíduos. Os
mecanismos pró- e os anti-inflamatórios precisam atuar de forma equilibrada e coordenada,
para que as células respondam adequadamente aos vários estímulos ambientais que
desencadeiam as respostas imunes, evitando danos ao organismo humano(1)
.
Ao nível molecular, o aumento de mediadores inflamatórios, como fator de necrose
tumoral alfa (TNF), interleucina 1β (IL-1β), IL-6, fator estimulador da colônia de granulócitos
e monócitos (GM-CSF), fatores de crescimento, mediadores derivados dos lipídios
(prostanoides, leucotrienos), receptores do TNF e toll-like receptors, enzimas
(metaloproteinases, fosfolipase A2), moléculas de adesão e peptídeos (bradicininas,
endotelina) representa o ponto central para a propagação da inflamação. Por outro lado, para
controlar o processo inflamatório, são liberadas citocinas moduladoras e anti-inflamatórias,
como IL-4, IL-10 e TGF-β(2)
.
O fator de transcrição nuclear kB (NF-kB) desempenha uma importante função no
desenvolvimento e na regulação de respostas imunes através de interação com citocinas e
marcadores da superfície celular(3)
. Nos últimos anos, o NF-kB e a proteína ativadora 1 (AP-
1) têm sido apontados como essenciais na ativação de genes envolvidos na inflamação, além
de terem participação na origem de doenças em que há ativação crônica do sistema imune,
como asma, aterosclerose, doença inflamatória intestinal e doenças reumatológicas como a
artrite reumatoide e o lúpus eritematoso sistêmico (LES)(4)
.
Os glicocorticoides (GC) são produzidos e secretados pelo córtex adrenal. Sua
concentração sérica é regulada pelo eixo hipotalâmico-hipofisário-adrenal (HHA) e sofre a
influência de diversos fatores, como ritmo circadiano, stress e feedback negativo. A maioria
dos efeitos dos GC é mediada pela ativação dos seus receptores. Os receptores de
glicocorticoide (RG) atuam como fatores de transcrição, modificando a expressão de genes-
alvo. A sensibilidade aos GC é bastante variável entre os indivíduos, os tecidos, os sistemas
orgânicos e durante as fases do ciclo celular. Atualmente, estão disponíveis métodos de
avaliação in vivo e in vitro, os quais foram desenvolvidos com o intuito de correlacionar a
sensibilidade individual aos GC à expressão gênica do RG(5)
.
Este trabalho inédito se destina a estudar e avaliar a sensibilidade individual ao GC em
2
pacientes portadores de lúpus eritematoso sistêmico em fase de remissão da doença,
comparando-a com a expressão do RNAm do RGα e do NF-kB.
1.1 Revisão da literatura
1.1.1 Lúpus eritematoso sistêmico (LES)
O LES é uma doença inflamatória sistêmica, crônica, de natureza auto-imune e de
etiologia desconhecida. Evolui em surtos, com períodos de exacerbação e remissão, e se
caracteriza pela deposição tecidual de imunocomplexos em qualquer órgão ou sistema(6)
.
Possui etiologia multifatorial e acomete indivíduos geneticamente predispostos,
caracterizando-se por perda de tolerância ao próprio e anormalidades na imunorregulação. É
mais prevalente em mulheres na fase estrogênica e apresenta pico de incidência em
adolescentes e adultos jovens (2ª a 4ª décadas de vida)(7)
. A resposta imune ocorre por
hiperativação das células B após exposição a um possível gatilho ambiental, sendo os mais
conhecidos os agentes infecciosos e a luz ultravioleta. Sucede-se a formação de auto-
anticorpos e complexos imunes, que se depositam na parede vascular, causando um processo
inflamatório em vasos de pequeno calibre (reação de hipersensibilidade tipo III) (6,8)
.
Anormalidades nas células T foram descritas em pacientes com LES. Estudos
anteriores identificaram defeitos moleculares que incluem: aumento do influxo intracelular de
cálcio em resposta à ligação ao receptor da célula T (TCR)(9)
, fosforilação anômala da
tirosina(10,11)
e alterações na síntese da interleucina 2 (IL-2)(12)
.
Sabe-se que a produção de IL-2 é regulada, predominantemente, pelo TCR e pela
molécula coestimuladora CD28. Fatores de transcrição que induzem a síntese de IL-2 são a
AP-1 e o NF-kB, sendo que este último participa ativamente na expressão de IL-2 e na
amplificação da resposta inflamatória(13)
.
O lúpus tem um amplo espectro de apresentações clínicas, desde a doença limitada à
pele até formas multissistêmicas graves.
As manifestações mais comuns são os sintomas constitucionais, como fadiga, perda
ponderal, mialgia e febre, presentes em até 95% dos pacientes(14)
. Seguem-se as manifestações
articulares, encontradas em aproximadamente 90% dos casos. Caracterizam-se por episódios
fugazes e recorrentes de poliartrite/poliartralgia em mãos e punhos, podendo comprometer
também grandes articulações(15)
.
3
A pele é acometida em torno de 70% dos pacientes. As manifestações características
são o eritema malar em asa de borboleta, o lúpus cutâneo subagudo e a lesão discoide.
Fotossensibilidade ocorre em 30% e representa um achado característico da doença(16)
. Outras
possíveis apresentações clínicas são: alopécia frontal, fenômeno de Raynaud, púrpura,
vasculite cutânea e urticária. Úlcera oral ou nasofaríngea indolor pode estar presente em
12%–45% dos doentes(17)
.
O acometimento renal aparece clinicamente em mais de 50% dos casos. Pode-se
apresentar como síndrome nefrítica e/ou nefrótica, glomerulonefrite rapidamente progressiva
ou insuficiência renal. A glomerulonefrite proliferativa difusa (classe IV) consiste no subtipo
histológico mais comum e mais grave(18)
.
O comprometimento do Sistema Nervoso Central (SNC) é definido como um preditor
de maior gravidade do LES. Acomete cerca de 25% dos pacientes e pode manifestar-se como
distúrbio cognitivo, cefaleia, psicose, convulsão, neuropatias cranianas ou periféricas e mielite
transversa. A psicose e a convulsão constituem as manifestações neurológicas mais
específicas do LES(19)
.
Em relação ao aparelho cardiopulmonar, as manifestações mais frequentes são a
pleurite e a pericardite. São descritas menos comumente: hipertensão pulmonar, endocardite
não-infecciosa e miocardite(20)
.
O diagnóstico de LES é feito mediante um quadro clínico sugestivo e na presença do
fator anti-nuclear (FAN por imunofluorescência indireta em células Hep-2). Outros
marcadores característicos que auxiliam na confirmação diagnóstica são o anticorpo anti-
DNA dupla-hélice (anti-dsDNA) e o anti-Sm (ELISA), os quais estão presentes em 50% e
30% dos casos, respectivamente. Outros achados laboratoriais contribuem para o diagnóstico,
tais como: anemia de doença crônica ou hemolítica, leucopenia, linfopenia, plaquetopenia,
hipocomplementenemia e alterações do sedimento urinário, como hematúria, leucocitúria,
cilindrúria e proteinúria(21)
.
O American College of Rheumatology (ACR) definiu critérios classificatórios para o
LES(22)
, utilizando dados clínicos e laboratoriais para auxiliar o diagnóstico e com o intuito de
homogeneizar a definição da doença para estudos científicos (Anexo 1).
4
O tratamento do LES consiste no uso de corticosteroides em praticamente todas as
formas de apresentação da doença, sendo a dose variável de acordo com o sistema acometido
e com a gravidade do quadro. Formas mais graves, especialmente a renal e a
neuropsiquiátrica, são usualmente tratadas com o uso concomitante de imunossupressores,
como ciclofosfamida, azatioprina ou micofenolato mofetil(23)
.
Durante os períodos de atividade da doença (flares), as doses dos glicocorticoides são
comumente aumentadas, e isso ocorre de forma variável para cada paciente, dependendo da
gravidade do seu quadro clínico. Por outro lado, após atingida a remissão ou melhora clínica,
procura-se, gradualmente, reduzir a dose, ou suspender o uso do corticosteroide, com o
objetivo de reduzir os efeitos adversos relacionados ao uso prolongado de altas doses desse
medicamento. Geralmente, quando o doente entra na fase de remissão do LES, a dose
prescrita de prednisona que mantém a doença clinicamente estável é igual ou inferior a
5mg/dia, minimizando-se, dessa forma, eventos indesejáveis, como Síndrome de Cushing,
hipertensão arterial, catarata, intolerância à glicose, glaucoma, entre outros(24)
.
Não há, na literatura, estudos controlados e comparativos para determinar o melhor
esquema de redução da dose do GC no LES. Sabe-se que esse processo depende de vários
fatores, como atividade da doença, dose e duração da terapia, resposta clínica e sensibilidade
individual ao glicocorticoide(25)
.
Os experts em reumatologia recomendam a diminuição gradual do GC para permitir a
recuperação funcional da adrenal. Um dos esquemas de redução da dose de GC mais utilizado
é: decréscimo de 5 a 10mg a cada 1 ou 2 semanas, para doses de prednisona maiores de
40mg/dia, seguido por redução de 5mg a cada semana até a dose de 20mg/dia e, finalmente,
redução de 2,5mg a 5mg a cada 2 semanas até 10mg/dia. Na sequência, a dose é reduzida
2,5mg a cada 4 semanas até uma dose média de manutenção de 5mg/dia. A maioria dos
autores acredita que a dose e a duração da corticoterapia para que ocorra supressão do eixo
HHA são variáveis entre os indivíduos(26)
.
A dose de manutenção do corticoide considerada ideal no LES também é alvo de
discussões. Geralmente os pacientes utilizam drogas poupadoras de GC, como, por exemplo,
os antimaláricos, que são capazes de diminuir o número e a gravidade dos flares da doença e
garantir doses menores de GC(25)
. Medicamentos imunossupressores também podem ser
usados com a finalidade de manter a doença em remissão, diminuindo a morbimortalidade dos
5
doentes e permitindo o uso de baixas doses de prednisona ou equivalente ou até a sua
suspensão(27)
.
Diversos aspectos estão envolvidos na sensibilidade ao GC em doenças reumáticas,
incluindo o LES. A resistência hereditária aos GC é rara, e o aumento da sensibilidade ao GC
tem sido ligado a polimorfismos específicos do gene do RG(28)
. Sabe-se que apenas a
isoforma alfa do RG se liga ao GC. A isoforma β funciona como um inibidor endógeno do
GC e é expressa em vários tecidos. A resistência aos GC e, possivelmente, a necessidade de
dose de manutenção de prednisona ou equivalente na terapêutica do LES em remissão pode,
portanto, estar associada ao aumento da expressão do receptor β do RG(29)
em alguns tecidos
orgânicos nessa população.
Uma outra possibilidade discutida é o fato de que os GC parecem estimular a síntese
da proteína lipocortina 1 (ou anexina 1) que, por sua vez, inibe a síntese de eicosanoides.
Sabe-se que o gene da anexina 1 pode ter a sua ação regulada pela interação GC/RG. Foi
demonstrado que, em pacientes com artrite reumatoide e possivelmente em outras desordens
auto-imunes, anticorpos anti-lipocortina 1 são produzidos em títulos elevados(30)
. Esse fato
pode correlacionar-se, portanto, com a resistência periférica aos GC e com a necessidade de
doses de manutenção maiores de GC para garantir remissão da doença e eficácia terapêutica.
Portanto, como existem controvérsias na literatura sobre a melhor dose do GC capaz
de manter o LES fora de atividade e ainda permitir um menor risco de dano orgânico
relacionado ao uso de doses maiores desse fármaco, assim como há escassez de dados
publicados sobre a sensibilidade ao GC nessa fase do LES, foi estudado este grupo de
pacientes para avaliar a sensibilidade in vivo ao GC, utilizando o teste com dose muito baixa
de dexametasona e o teste oral com dose baixa de dexametasona.
1.1.2 Fator de transcrição NF-kB e suas cinases
O fator de transcrição NF-kB pode ser um dos grandes alvos terapêuticos do LES, pois
atua como ―chave-mestra‖ de uma cascata inflamatória que inclui muitos dos principais genes
envolvidos na inflamação, como citocinas, metaloproteinases e reguladores de mediadores de
pequenas moléculas. Caracteriza-se por um complexo grupo de fatores de transcrição homo e
heterodiméricos. Os principais membros da família são: NF-kB1 (p50/p105), NF-kB2
(p52/p100), RelA (p65), RelB e c-Rel. Heterodímeros contendo p65 e também p50 ou p52
estão entre os mais frequentemente observados em várias linhagens de células(31)
.
6
O fator nuclear kappa B se mantém na evolução do ser humano e tem ação descrita em
diversas células que compõem os organismos complexos. Possui um espectro de ação
superior a todos os fatores de transcrição descritos até o momento. Essa superioridade deve-se
aos variados estímulos que o ativam, bem como aos inúmeros genes e fenômenos que o NF-
kB regula(32)
.
Dentre os estímulos ativadores do NF-kB destacam-se os neurotransmissores (como o
glutamato, por exemplo), as neurotrofinas, proteínas neurotóxicas (como a beta-amiloide),
citocinas (interleucina-1 e fator de necrose tumoral), glicocorticoides, ésteres de forbol,
peptídeo natriurético atrial, ceramidas, produtos provenientes de vírus e bactérias, irradiação
ultravioleta, produtos de reações de enzimas como a óxido nítrico sintase induzível e a
cicloxigenase tipo 2 (COX-2). Paralelamente, parece haver participação de espécies reativas
de oxigênio (estresse oxidativo) e aumento de cálcio intracelular para a ativação do NF-kB
(32,33).
Quando não estimulado, o fator NF-kB é encontrado no citoplasma ligado a uma
proteína inibitória: o IkB. O complexo NF-kB/IkB impede a translocação do NF-kB para o
núcleo, mantendo o primeiro inativado. Portanto, a fosforilação e a degradação do IkB são
necessárias para que ocorra a translocação nuclear do NF-kB (34,35)
. (Fig. 1)
Vários estímulos podem levar à fosforilação do IkB, etapa fundamental para a sua
degradação. A fosforilação do IkB ocorre pela ação de proteínas cinases específicas, como o
complexo IkB quinase (IkK), que contém duas subunidades com propriedades de quinase:
IkKα e IkKβ(36)
. A proteína IkB fosforilada recebe a adição de ubiquitina, pela ação da
ubiquitina ligase, sendo, em seguida, degradada pelo complexo proteossoma 26S. Esse
processo resulta na liberação do NF-kB (Fig. 1). As duas subunidades do IkB (IkBα e IkBβ)
ligam-se ao p50, tornando a sequência de localização nuclear inacessível e impedindo a sua
translocação(37)
.
O complexo IkK é capaz de discernir entre o IkB já ligado ao IkK e o IkB livre,
explicando o fato de que o IkB pode acumular-se nas células onde o IkK permanece
ativado(36)
. É importante afirmar que muitas proteínas cinases estão envolvidas no processo de
fosforilação descrito e que esse mecanismo completo não está totalmente esclarecido.
O desmembramento do complexo IkB/NF-kB permite o transporte do NF-kB para o
núcleo, como já descrito, resultando em sua ligação aos genes que apresentam a sequência
7
regulatória GGGACTTTCC, junto à região promotora. Isso ocasiona um aumento na
expressão dos ―genes-alvo‖ do NF-kB, os quais agem em elementos envolvidos na resposta
inflamatória e imune, estimulando a transcrição(38)
. (Fig.1)
A ativação do NF-kB também pode ser mediada pela via do receptor do TNF (TNFR),
através de uma cascata sinalizadora de fatores intermediários e cinases. O TNF solúvel ao se
ligar ao seu receptor de membrana específico promove uma homodimerização do TNFR e
subsequente recrutamento de domínios específicos (―death domain‖ – TRADD)(39)
. Em
seguida, ocorre aderência de proteínas adaptadoras ao complexo TNFR/TRADD, como RIP1
(proteína 1 de interação ao receptor) e TRAF2 (fator 2 associado ao TNFR) (40-42)
. Por fim,
proteínas cinases específicas como TAK1, NIK e MEKK3 fosforilam o IkB e induzem sua
dissociação ao NF-kB. Esse processo leva à ativação da via do IKK-NF-kB e aumento da
inflamação tecidual (41,43-46)
.
Adicionalmente, a ligação do TNF ao seu receptor de membrana promove ativação da
família de proteínas cinases (MAPK), como ERK, p38 MAPK e JNK, as quais estão
envolvidas no controle pós-translacional do NF-kB e na ativação da AP-1 (47-49)
. Portanto,
após a ativação do NF-kB, sua atividade é modulada pela fosforilação do segmento p65S276
pela p38 MAPK, ERK, MSK1 ou proteína cinase A (PKA), com subsequente indução da
expressão de genes-alvo envolvidos na inflamação (50-52)
.
Figura 1: Via de sinalização do NF-kB (1)
8
Consequentemente, esses genes ativados promovem o aumento da expressão de
citocinas pró-inflamatórias, fatores de crescimento, COX-2, proteínas de fase aguda,
moléculas de adesão e outros elementos envolvidos na amplificação da resposta inflamatória
(53-55). Já foram determinados sítios de ligação do NF-kB aos genes do TNF-α
(56), IL-2
(57) e
ELAM-1(58)
.
Em contrapartida, alguns mecanismos reguladores da inflamação envolvendo o NF-kB
foram descritos. A ativação do NF-kB está sujeita a um mecanismo autorregulatório de
feedback negativo, pois o NF-kB pode estimular a transcrição do gene do IkBα. Logo, o novo
IkBα formado pode ligar-se ao NF-kB ativado no interior do núcleo, enfraquecendo a
interação NF-kB/DNA e promovendo o transporte do NF-kB para o citoplasma (59-61)
.
1.1.3 Glicocorticoides no LES
Os glicocorticoides (GC) são substâncias sintéticas, com potente ação anti-
inflamatória e imunossupressora e têm sido amplamente utilizados no LES e em outras
doenças auto-imunes, como a artrite reumatoide, desde 1949(62)
.
Os efeitos terapêuticos desses fármacos são mediados por receptores nucleares
específicos, denominados receptores de glicocorticoides (RG), que inibem ou estimulam a
transcrição de genes específicos, ocasionando diminuição da produção e da liberação de
citocinas pró-inflamatórias, principalmente TNF-α, IL-1, IL-2, IL-6(63-65)
. Os GC também
diminuem a expressão das moléculas de adesão E-selectina, ICAM-1 e ELAM-1, importantes
para o acesso das células inflamatórias ao local da inflamação(66)
.
O complexo (RG-GC) é capaz de inibir a expressão de genes responsáveis pela
transcrição do RNAm de citocinas, fatores de crescimento, moléculas de adesão e também a
transcrição do RNAm dos fatores de transcrição pró-inflamatórios como o NF-kB e a proteína
AP-1 (67-70)
.
Alguns autores sugerem a existência de um controle molecular da resposta
inflamatória e da resposta imune, exercido, principalmente, pela interação entre os seguintes
fatores de transcrição: o receptor de glicocorticoide, o NF-kB e a proteína AP-1. Foi
observada uma inibição mútua das atividades transcricionais entre NF-kB e RG (71,72)
e
também entre a proteína AP-1 e RG(73)
, através de interação física e funcional, sendo esse um
dos mais importantes mecanismos moleculares do efeito anti-inflamatório dos GC(74)
.
9
Como descrito acima, a ação dos GC é mediada por um receptor proteico intracelular,
o receptor de GC (RG), que pertence à superfamília dos receptores nucleares e age como um
fator de transcrição ativado pelo hormônio, regulando a expressão dos genes responsivos aos
GC. O gene do RG humano (OMIM #138040,GenBank NR3C1) encontra-se na porção distal
do cromossomo 5, sendo composto por 9 exons. Várias isoformas do receptor são produzidas
por splicing alternativo de um único gene (75,76)
. A isoforma α, a forma clássica do RG, é o
mediador primário da ação dos GC; a isoforma β não se liga ao GC e age como um inibidor
dominante negativo da isoforma α (77,78)
.
O receptor inativo, não-ligado ao hormônio, encontra-se no citoplasma associado a um
complexo multiproteico formado por uma molécula do receptor, duas moléculas da proteína
de choque térmico (hsp) 90, uma molécula de hsp 70, uma de hsp 56, hsp 40, p23 e p60. As
principais funções do complexo RG/hsp são: manter o receptor no citoplasma das células,
estabilizando-o em sua forma inativa e facilitar a ligação do hormônio ao RG(79)
.
Após a ligação ao hormônio, o RG é dissociado do complexo e ocorrem alterações na
conformação da molécula do receptor, levando à homodimerização de isoformas alfa do RG,
as quais entram no núcleo da célula(80)
.
O mecanismo de trans-ativação gênica é a forma clássica de ação dos GC e se
caracteriza pela interação direta de dímeros do receptor do RG com uma sequência
palindrômica específica no DNA, chamada elemento responsivo aos glicocorticoides (GRE),
presente geralmente na região promotora dos genes-alvo. A ligação do dímero do RG
diretamente ao GRE estimula a transcrição de genes responsivos aos GC, com envolvimento
de componentes básicos da maquinaria de transcrição gênica, como a RNA polimerase II e
fatores gerais da transcrição, além de fatores co-ativadores e co-repressores da trans-ativação
(80,81). (Fig. 2)
Além da propriedade de ativar a transcrição gênica, o RG pode também reprimi-la. A
trans-repressão pode ocorrer pela ligação do RG aos elementos responsivos negativos aos
glicocorticoides (nGRE), localizados na região promotora de genes específicos, como o
promotor do gene da proopiomelanocortina(82)
. Um segundo mecanismo de regulação da
trans-repressão gênica mediada pelos GC não envolve processos dependentes de nGRE,
porém interações do RG com outros fatores de transcrição, por meio de um antagonismo
inibitório dependente de interação proteína-proteína. Os efeitos anti-inflamatórios e
imunossupressores dos GC envolvem esta regulação negativa da transcrição gênica. A AP-1 e
10
o NF-kB são os fatores mais extensivamente estudados, os quais interferem negativamente
com a trans-ativação mediada pelo RG(83)
. Existe um crosstalk negativo entre RG e NF-kB.
(Fig.2)
Figura 2: Modulação da expressão gênica pelo complexo hormônio-receptor-elemento responsivo. Após a
ativação do receptor glicocorticoide pelo cortisol, ocorre a dissociação do complexo com as hsp, dimerização,
translocação nuclear, interação com o elemento responsivo ao glicocorticoide e trans-ativação gênica. A trans-
repressão depende da interação com NF-kB/AP-1. A ativação pelo agonista resulta em redução da expressão do
receptor de glicocorticoide pelo mecanismo de down-regulation homólogo. GR: receptor glicocorticoide;
mRNA: RNA mensageiro; hsp: proteína do choque térmico; GRE: elemento responsivo ao glicocorticoide; NF-
kB: fator nuclear kB; AP-1: proteína ativadora de transcrição 1; , isoforma alfa do receptor glicocorticoide
(GRa); : isoforma beta do receptor glicocorticoide (GRβ) (84)
Deroo e Archer(85)
propuseram que os GC são necessários para a trans-ativação do
gene promotor do IkBα. Logo, níveis aumentados de IkBα podem bloquear a ativação do NF-
kB, reduzindo o processo inflamatório local.
Estudo publicado em 2006 (86)
sugere um distúrbio na sinalização do RG, NF-kB, AP-1
e JNK em pacientes com LES, caracterizado pela redução da ligação RG e NF-kB/DNA e
uma significativa correlação entre JNK e AP-1. Essas alterações podem contribuir para uma
produção anômala de citocinas e, portanto, para a etiopatogenia do LES.
11
Adicionalmente, sabe-se que o RG é alvo de fosforregulação. Neste processo,
participam as proteínas cinases que são enzimas responsáveis pela fosforilação rápida e
reversível de certos resíduos proteicos, alterando sua estrutura, função, localização e
metabolismo. Já as fosfatases são enzimas que revertem a ação das cinases e ocasionam a
desfosforilação de resíduos celulares(87)
. Portanto, a fosforilação do RG é regulada por um
balanço entre cinases e fosfatases. O desequilíbrio desse mecanismo pode afetar a estrutura do
RG, a sua localização e translocação, bem como a sua interação com o DNA e com sítios de
trans-ativação e de trans-repressão gênica(88)
.
No RG humano, foram identificados seis sítios de fosforilação compostos por resíduos
de serina: S113, S141, S203, S211, S226, S404(89)
. A fosforilação do RG humano mediada
por p38 MAPK está associada à redução da ligação do RG ao seu ligante hormonal e à
diminuição da repressão do gene GM-CSF. Além disso, o aumento da expressão de p38
MAPK via IL-1 resulta em menor trans-ativação gênica mediada por RGα e menor ligação ao
GRE(90)
.
Recentemente, foi descrita uma inibição pelos GC da via de sinalização utilizada pelos
toll-like receptors (TLRs), que têm um papel crucial na indução da resposta imunológica inata
por reconhecer patógenos e promover a expressão de moléculas co-estimuladoras, comuns na
transdução dos sinais e na expressão de genes pró-inflamatórios(91)
.
Considerando-se que praticamente todos os efeitos dos GC são mediados pela ativação
de seus receptores, um dos principais determinantes da responsividade a esses hormônios é a
concentração intracelular da proteína RG(84)
. Entretanto, a quantificação laboratorial desta
proteína é difícil, pela ausência de anticorpos monoclonais de boa qualidade. Assim, percebe-
se, na literatura, um gradual abandono das técnicas de western blot que foram substituídas por
avaliações da expressão do RNAm do gene do RG.
Em 2004, Melo et al(92)
, em um trabalho desenvolvido no Laboratório de Medicina
Molecular da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, descreveu uma
nova técnica de quantificação absoluta do RNAm da isoforma alfa do receptor de
glicocorticoide (RG) utilizando a metodologia do PCR em Tempo Real. Este mesmo grupo
estudou formas de avaliação in vivo da sensibilidade aos GC.
Longui et al(93)
, em 2003, descreveram que a dose de 75µg/m2 de prednisona por via
oral era capaz de identificar diferentes graus de sensibilidade aos GC. Posteriormente,
12
procurou-se eliminar os interferentes de absorção e distribuição dos GC com a padronização
de um teste de supressão com dose muito baixa de GC pela via intravenosa (IV-VLD-DST–
―Intravenous very-low dose dexamethasone suppresion test‖), com a utilização de apenas
20µg/m2 de dexametasona, in bolus
(94).
Esta avaliação simultânea, in vivo e in vitro, foi realizada pela primeira vez por Cobra
et al, no mesmo laboratório, com pacientes portadores de artrite reumatoide (AR) (95)
. Como
resultado do estudo, demonstrou-se que a expressão do RG no grupo AR foi semelhante à
encontrada no grupo controle. Entretanto, a sensibilidade ao glicocorticoide foi menor nos
doentes, sugerindo um mecanismo de resistência pós-receptor de glicocorticoide por possível
aumento da expressão de fatores de transcrição como o NF-KB.
A correlação entre a quantificação da expressão do gene do RG e o espectro de
redução dos níveis de cortisol observado por meio do teste de supressão com doses muito
baixas de dexametasona torna-se importante para a identificação de estados de
hipossensibilidade ou hipersensibilidade aos GC e apresenta ampla aplicabilidade na prática
clínica.
Na reumatologia, não é incomum a administração de corticosteroides em altas doses.
Sabe-se que a saturação de praticamente todos os receptores de glicocorticoides é atingida
com a dose de 100 mg/dia de prednisona ou equivalente(96)
. Além dos mecanismos
genômicos, doses crescentes de corticoides podem promover ações não-genômicas,
contribuindo para a redução do processo inflamatório através de alterações no transporte de
cátions na membrana plasmática em células imunes(97)
. Os GC também atuam na função
linfocitária e foi demonstrada uma indução de apoptose de linfócitos, mediada,
exclusivamente, pelo receptor de glicocorticoide intracelular(77)
.
O uso de altas doses de prednisona tem sido alvo de discussões entre diversos
especialistas como nefrologistas, reumatologistas e endocrinologistas. A principal indagação
gira em torno da dose ideal de corticoide considerada eficaz para garantir o sucesso
terapêutico com ação anti-inflamatória e/ou imunossupressora e que leve ao menor número de
efeitos colaterais(98)
. Esse tema permanece controverso, uma vez que não há estudos
controlados e randomizados para uma resposta conclusiva e baseada em evidência. Até o
momento, não encontramos estudos na literatura que correlacionem a necessidade de GC nas
diferentes fases do LES com a expressão gênica do RG e/ou avaliações da sua sensibilidade in
vivo.
13
Portanto, este estudo inédito tem por objetivo determinar a sensibilidade individual aos
GC, utilizando o teste de supressão com dose muito baixa de dexametasona e o teste oral com
dose baixa de dexametasona, em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico em remissão
(fora de atividade) e confrontar essa sensibilidade com a expressão da isoforma alfa do gene
do RG e do NF-kB.
14
2. OBJETIVOS
1) Comparar a expressão do RNAm do RGα e do NF-kB em células mononucleares
periféricas, em pacientes portadores de LES em remissão em relação a controles saudáveis,
utilizando a técnica de PCR em Tempo Real.
2) Correlacionar a expressão desses genes com a sensibilidade aos glicocorticoides
reconhecida pelo teste de supressão com dose muito baixa de dexametasona nos pacientes e
nos controles estudados.
3) Comparar a capacidade dos testes de supressão com dose muito baixa e baixa de
dexametasona em identificar um espectro individual de supressão e casos com menor
sensibilidade aos GC.
4) Estabelecer correlações entre variáveis clínicas e laboratoriais e a sensibilidade, in vivo, aos
GC, em pacientes com LES fora de atividade.
15
3. CASUÍSTICA E MÉTODO
Trata-se de um estudo transversal, com uma abordagem quantitativa, que foi
desenvolvido no Laboratório de Medicina Molecular da Faculdade de Ciências Médicas da
Santa Casa de São Paulo, no período de março de 2008 a março de 2010. O projeto de
pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Irmandade da Santa Casa de
Misericórdia de São Paulo (Apêndice). Todos os participantes leram e assinaram o Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido antes de iniciar a coleta dos dados.
3.1 Desenho do estudo:
Foram incluídos nove portadores de lúpus eritematoso sistêmico acompanhados no
ambulatório de Reumatologia do Departamento de Clínica Médica da Santa Casa de São
Paulo, os quais preenchiam os critérios de classificação do Colégio Americano de
Reumatologia (ACR-1997, Anexo 1)(22)
. Todos os pacientes lúpicos se encontravam em fase
de remissão da doença, segundo constatado durante consulta médica por meio de anamnese,
exame físico minucioso e exames complementares recentes.
Os pacientes selecionados faziam uso de, no máximo, 5mg de prednisona por dia
como terapia de manutenção para a sua doença. Foram escolhidos aqueles que estavam fora
de atividade clínica e/ou laboratorial, determinada pelo SLEDAI (Systemic Lupus
Erythematosus Disease Activity Index)(99)
(Anexo 2). Devido à falta de consenso para a
definição de doença em atividade ou em remissão por esse escore, foi estabelecido que apenas
os lúpicos com SLEDAI igual a zero seriam incluídos no estudo.
Foram excluídos os doentes que já tinham apresentado, durante a evolução da sua
doença, manifestações graves do LES, como envolvimento neuropsiquiátrico caracterizado
por convulsão, psicose, doença cerebrovascular ou mielite transversa; plaquetopenia grave
(<50.000 plaquetas/mm3); glomerulonefrite proliferativa ou rapidamente progressiva;
pneumonite ou miocardite, com o intuito de evitar uma amostra de pacientes com
características heterôgeneas entre si e com necessidade de uso de doses maiores de prednisona
em sua terapia de manutenção do LES. Foram igualmente excluídos os indivíduos portadores
de endocrinopatia, asma, doença inflamatória intestinal, infecções agudas, menores de 18 anos
de idade, os que não assinaram o termo de consentimento e aqueles que fizeram uso prévio de
medicamentos que aceleram a metabolização da dexametasona, como fenitoína e barbitúricos,
bem como os que apresentaram cortisol basal <7µg/dL(100)
.
16
Foi estabelecido um grupo controle com 11 indivíduos saudáveis, pareados por sexo e
idade aos doentes com LES, para comparação e análise dos resultados. Um participante do
grupo controle foi excluído por apresentar cortisol basal igual a 3,0µg/dL, indicando
supressão do eixo hipotalâmico-hipofisário-adrenal (HHA). Em entrevista subsequente, o
indivíduo relatou que fez uso de corticoide inalatório no dia anterior à coleta.
Na primeira visita, foram determinados: características clínicas do LES, verificação do
peso e da superfície corpórea, revisão das medicações utilizadas, SLEDAI, expressão do RGα
e NF-kB em células mononucleares do sangue periférico e concentração do ACTH e do
cortisol basais, ou seja, no tempo 0 do teste de supressão com dose muito baixa de
dexametasona. Foi enfocada a dose de prednisona utilizada para o tratamento de manutenção
do LES. Os participantes realizaram as coletas de sangue para ACTH e cortisol no serviço de
Medicina Nuclear (Nuclimagem), que presta assistência terceirizada à Irmandade da Santa
Casa de São Paulo-SP. Para o resultado do ACTH hipersensível foi utilizado o método de
quimioluminescência (―IMMULITE® 2000 ACTH, Siemens Healthcare, Llanberis, United
Kingdom‖) com valor de referência inferior a 46 pg/mL, segundo o fornecedor. O cortisol
sérico foi mensurado por quimioluminescência (―Cortisol Immulite 2000‖, DPC, Los
Angeles, CA, EUA), com coeficiente de variação inter-ensaio <10% e limite de detecção de
5µg/dL, pela manhã.
A segunda visita ocorreu 2 horas após o teste de supressão com dose muito baixa de
dexametasona (20µg/m2) por via intravenosa. Nessa ocasião, foram avaliados: ACTH e
cortisol séricos. Ao término das coletas, os participantes receberam uma prescrição de
decadron® elixir 0,5mg/5ml (Prodome Química e Farmacêutica Ltda - Indústria Brasileira),
contendo a dose do GC baseada no cálculo de 20µg/Kg/dia, dividida a cada 6 horas (dose
máxima de 2mg/dia). Os participantes foram orientados a iniciar a dose oral de dexametasona
às 12:00h do mesmo dia.
Na terceira visita, isto é, após 48 horas da coleta basal, os casos e controles foram
direcionados à nova coleta de ACTH e cortisol séricos e amostra de sangue periférico para
determinação da expressão do RGα e NF-kB (às 8:00h), após o teste oral de supressão com
dose baixa de dexametasona.
Durante o período do estudo, todos os participantes foram orientados a não utilizar
qualquer medicação sem o prévio conhecimento do pesquisador, especialmente
17
glicocorticoide por via oral, parenteral e/ou inalatória, inclusive os pacientes com LES, para
não interferir na interpretação dos testes com dexametasona.
3.1.1 Testes de supressão com doses muito baixa e baixa de dexametasona
Todos os sujeitos da pesquisa foram submetidos ao teste de supressão intravenosa com
fosfato dissódico de dexametasona (DECADRON
2mg/ml - Prodome Química e
Farmacêutica Ltda - Indústria Brasileira), utilizando-se a dose de 20 µg/m2 IV em bolus. Foi
determinada a expressão da isoforma alfa do receptor de glicocorticoide e do gene NF-kB, a
partir do RNA extraído de células mononucleares periféricas.
Após um período de jejum de 10-12 horas, os indivíduos foram admitidos às 6:45h, no
Laboratório de Medicina Nuclear da Santa Casa de São Paulo, onde foi estabelecido o acesso
venoso e mantido por solução fisiológica 0,9%. Sucedeu-se um intervalo de 15 minutos de
repouso. Neste momento (tempo 0), foram colhidas as amostras de sangue para quantificação
do cortisol basal e do ACTH e para obtenção das células mononucleares. Imediatamente antes
do início do teste, foi diluída 1mL da solução-mãe de dexametasona (2mg/ml) em 19mL de
solução fisiológica 0,9%, obtendo-se uma concentração final de 100µg/mL e calculado o
volume a ser infundido em cada paciente na dose de 20µg/m2.
Após o repouso de 15 minutos e consequente coleta da amostra basal (tempo 0),
procedeu-se à administração IV em bolus da dexametasona. A coleta seguinte de sangue foi
feita após 120 minutos, para a mensuração do cortisol e do ACTH séricos. A redução
percentual de cortisol aos 120 minutos, em relação à quantificação basal, foi chamada de F%
e expressa a sensibilidade individual ao glicocorticoide.
Para verificar a existência de hipercortisolismo e com o objetivo principal de analisar
o eixo HHA, foi realizado o teste de supressão com dose baixa de dexametasona por via oral.
O objetivo desse teste é inibir a secreção hipofisária do ACTH. O procedimento consistiu em
administrar dexametasona na dose de 20µg/Kg/dia (máximo de 2,0mg/dia), dividida de 6/6
horas por dois dias consecutivos. Em indivíduos normais, o teste resulta na supressão dos
valores do ACTH e do cortisol com a dose descrita de dexametasona. Considerou-se como
resposta esperada ao teste: cortisol <1,8µg/dL e ACTH <20pg/mL. A redução percentual de
cortisol após 48h do teste oral, em relação à quantificação basal, foi chamada de FOr%.
3.1.2 Separação de células mononucleares
18
Antes da administração IV da dexametasona 20µg/m2, foi colhido sangue venoso de
cada paciente em dois tubos de 10mL com heparina sódica (―Vacutainer, Becton-Dickinson‖).
O volume de 20mL de sangue heparinizado foi mantido em temperatura ambiente por, no
máximo, 2 horas até o início do procedimento de separação das células mononucleares, o qual
foi realizado através de centrifugação a 1750rpm por 30 minutos em temperatura ambiente.
As células mononucleares, separadas pelo gradiente de densidade, foram aspiradas
com pipeta estéril tipo Pasteur e transferidas para tubo cônico estéril de 15mL. Após adição
de 10mL de tampão fosfato-salina (PBS; Isotonic Phosphate Buffered Saline Solution;
Phosphate Buffered saline tablets, Cat. Nº P4417, Sigma), o tubo foi centrifugado a 1750rpm,
por 10 minutos. O sobrenadante foi aspirado e descartado, obtendo-se o precipitado celular.
Em seguida, esse procedimento foi repetido e, posteriormente, o precipitado celular resultante
foi diluído em 1mL de PBS, aspirado cuidadosamente com pipeta Eppendorf e transferido
para tubo estéril de 2mL, ao qual foi adicionado 100µL de dimetil-sulfóxido (DMSO, Sigma)
para armazenamento em temperatura ultra-baixa (-80ºC) pelo tempo máximo de 15 dias.
A seguir, as células mononucleares foram descongeladas e o DMSO removido através
da transferência da suspensão celular para tubo cônico estéril de 15mL, adição de 10mL de
PBS estéril e centrifugação a 1000rpm, por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado, e o
precipitado, diluído e homogeneizado em 1mL de PBS.
3.1.3 Extração de RNA e obtenção do DNA complementar
Para a extração de RNA, foi utilizado um reagente baseado no tiocianato de guanidina
(TRIZOL, GIBCO BRL Cat Nº 15596), adicionado à suspensão celular na proporção de 1mL
para cada um milhão de células mononucleares viáveis. Realizou-se a centrifugação do
material para a obtenção da fase aquosa.
Na etapa de precipitação do RNA, foi adicionado, à fase aquosa, 500µL de
isopropanol a 100% para cada 1mL de reagente TRIZOL usado. Após uma fase de repouso de
10 minutos, o material foi novamente centrifugado e, em seguida, descartado o sobrenadante,
sendo o precipitado lavado com etanol 85% gelado (-20ºC), com posterior agitação do tubo e
centrifugação a 7000rpm por 8 minutos, a 4ºC, para completa remoção do etanol. O
precipitado de RNA, algumas vezes invisível antes desta centrifugação, forma um pellet
semelhante a um gel na porção inferior do tubo. Após ser diluído em 40µL de água livre de
DNase e RNase (DNase/ RNase-free water, GIBCO BRL Cat. Nº 10977-23), determinou-se a
19
concentração de RNA por meio de espectrofotometria nos comprimentos de onda de 260 e
280nm, contra um branco de água, sendo o resultado desejável, acima de 1.4, indicativo de
pureza do RNA.
Ao RNA ressuspenso, foi adicionado 1µL de enzima inibidora de RNase (RNase
Inhibitor,1U/µL,Applied Biosystems) e, em seguida, armazenou-se o tubo, devidamente
identificado, em temperatura ultra-baixa (-80ºC) por um período de, no máximo, 2 semanas.
Após a obtenção do RNA, este foi submetido à reação enzimática modulada por uma
transcriptase reversa, permitindo a síntese do DNA complementar ao RNA extraído (cDNA).
A reação foi preparada conforme a orientação do fabricante (TaqMan Reverse Transcription
Reagents, Cat Nº N808-0234, Applied Biosystems).
O cDNA obtido foi posteriormente refrigerado a -20ºC até que todas as amostras do
estudo estivessem armazenadas para a etapa seguinte, ou seja, para realização da reação de
PCR em tempo-real (RQ-PCR) e para quantificação da expressão da isoforma alfa do gene do
receptor de glicocorticoide e do gene NF-kB.
3.1.4 PCR em tempo-real (RQ-PCR)
No preparo das reações de RQ-PCR, foi utilizada uma solução-mãe para cada gene.
Esta solução foi preparada de acordo com o número de amostras e em duplicata. Em cada
corrida analítica, foi utilizada uma curva-padrão previamente estabelecida, constituída por
diluições seriadas de cDNA de células Jurkat (clone E6-1, ATCC).
Para a isoforma alfa do RG, utilizamos os mesmos primers e sonda previamente
validados por Melo et al. (2004)(92)
(sequência de orientação 5' 3'):
Iniciador Sense: G A A G G A A A C T C C A G C C A G A A
Iniciador Anti-sense: C C T A A C A T C T C G G G G A A T
Sonda: 6-FAM-GCTTCCAAACATTTTTGGATAAGACCAT-TAMRA
Tamanho do produto: 151pb
Uma das principais etapas para a análise da expressão gênica por meio de PCR em
tempo real envolve a escolha de um gene controle, cuja expressão não tenha variação entre as
amostras analisadas. Embora não exista consenso quanto aos melhores genes para
20
normalização, diversos genes podem ser utilizados para este fim, como o GAPDH, o G6PD e
o ABL.
Em nosso estudo, o gene BCR foi escolhido como normalizador, pois sua expressão é
praticamente constante ao longo do tempo, além de ser expresso em quantidade semelhante ao
RGα(92)
. O gene BCR (Breakpoint Cluster Region) está localizado no braço longo do
cromossomo 22 (22q11.21), possui 23 exons e codifica uma proteína com atividade serina ou
treonina quinase(101)
. A sonda e os iniciadores para esse gene normalizador foram os mesmos
utilizados por Branford et al (1999)(102)
e depois por Melo et al(92)
(2004), sendo as sequências
e tamanho do produto:
Iniciador Sense: C C T T C G A C G T C A A T A A C A A G G A T
Iniciador Anti-sense: C C T G C G A T G G C G T T C A C
Sonda: 6-FAM-TCCATCTCGCTCATCATCACCGACA-TAMRA
Tamanho do Produto: 67 pb
As reações de RQ-PCR para RGα e BCR foram padronizadas de forma a ocorrerem
com concentrações e condições de temperatura idênticas. O preparo da solução-mãe é descrito
na Tab. 2.
Tabela 2: Preparo das soluções-mãe utilizadas na PCR em tempo real (RGα e BCR)
Componente Volume (µL) por reação Concentração final após
adição de 2µL de cDNA
TaqMan Buffer A 10X 2,5 1X
25 mM MgCl2 4,5 4,5mm
DeoxyNTP 2,0 500µM/cada
Primer sense 0,5 200nM
Primer anti-sense 0,5 200nM
Sonda 0,5 100nM
AmpliTaq Gold 5U/µL 0,13 0,025u/µL
Água livre de RNase 12,37 -----
Total 23 -----
TaqMan™ PCR Core Kit, N808-0228, Applied Biosystems
21
Foram adicionados 23µL da solução-mãe aos tubos de 0,2mL especiais para RQ-PCR
(Optical Tubes, Applied Biosystems) e 2µL da solução com cDNA, colocando tampa de alta
transparência (Optical Caps, Applied Biosystems) para vedá-los efetivamente. Uma vez que a
quantificação é baseada na emissão de luz monocromática através do tubo e na captação da
fluorescência gerada por uma sonda, torna-se essencial a utilização de tubos e tampas de alta
transparência.
Os tubos foram então posicionados no termociclador de tempo real (ABI 7500,
Applied Biosystems), sendo realizada a programação dos parâmetros em software dedicado
(SDS-Sequence Detection System v. 1.2, Applied Biosystems) em ambiente operacional
Windows (Microsoft Co.).
A programação da temperatura compreendeu uma ativação inicial da Taq Gold, uma
modificação da enzima polimerase obtida a partir do bacilo Thermus aquaticus que não
apresenta atividade à temperatura ambiente antes de sua ativação, garantindo maior
especificidade à reação(103)
. Essa ativação enzimática ocorre a 95ºC por 10 minutos, seguida
pela amplificação da sequência em 40 ciclos de dois estágios: 15 segundos a 95ºC, para
desnaturação das fitas de cDNA e 90 segundos a 60ºC, para anelamento e extensão dos
primers. Na fase de extensão, a Taq Gold, por meio de sua atividade 5' -exonuclease, desloca
a sonda que, excitada por um feixe de raios de luz de comprimento de onda específico, emite
fluorescência quando o fluorocromo inibidor (TAMRA) se afasta do emissor (6-FAM).
O programa computacional controla a captação dos sinais luminosos por células
fotoelétricas, correlacionando a fluorescência medida com o ciclo da programação da
temperatura. Ao término da reação (duração de 120 minutos), o programa calcula o ciclo
limite (Ct, cycle threshold) e mostra o gráfico das reações, com representação colorida
diferenciando os tubos.
Para evitar falsos resultados positivos resultantes de quebra da sonda não relacionada à
amplificação, foi examinada, visualmente, a representação gráfica de cada uma das reações,
garantindo haver elevação exponencial da fluorescência com o decorrer dos ciclos. A
ocorrência de resultados falso-positivos causados por contaminação das reações com cDNA
de origem desconhecida foi controlada pela utilização dos controles negativos em cada
análise.
22
A quantificação do RNAm do NF-kB foi semelhante, utilizando a padronização da
reação previamente realizada por Cavalcante et al(104)
:
Iniciador sense: AAACACTGTGAGGATGGGATCTG (23bp, Tm 59oC)
Iniciador anti-sense: CGAAGCCGACCACCATGT (18bp, Tm 59oC)
Produto: 64bp
Nessa reação, utilizou-se a detecção por SYBR-green, um agente intercalador de
dupla-fita de DNA, que dispensa a utilização de sondas (Tab. 3). Para garantir a
especificidade da amplificação, além da programação mencionada anteriormente, foi
introduzido um ciclo de dissociação onde há captação de fluorescência durante o aquecimento
e resfriamento demorado do produto de amplificação, com posterior determinação da
temperatura de dissociação do mesmo (Tm). Para o NF-kB, foi padronizado um pico de
dissociação único, com Tm de 79,9oC (±1
oC).
Tabela 3: Preparo da solução-mãe utilizada na PCR em tempo real para o gene NF-kB
Componente Volume/Tubo (µL) Concentração final após
adição de 2µL de cDNA
Platinum SYBR mix 2X 12,5 1X
Primer sense 0,4 160nM
Primer anti-sense 0,4 160nM
Água livre de RNase 9,7 ------
Total 23 -----
SYBR: qPCR SuperMix-UDG with ROX 2X (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA)
3.2 Análise estatística
A normalização da expressão de RGα e NF-kB por BCR e o cálculo da percentagem
de supressão de cortisol após IV-VLD-DST foram realizados com auxílio do programa
computacional MS-EXCEL (Microsoft, Redmond, EUA).
A análise estatística foi elaborada com auxílio dos programas Minitab 15 (Minitab,
State College, PA, EUA) e SigmaStat v3.5 (SPSS, Chicago, Il, EUA), considerando nível de
significância p < 0,05. Para as comparações de variáveis categóricas ou qualitativas,
utilizamos o teste de qui-quadrado. Para comparações de variáveis contínuas entre os grupos,
23
usamos o teste-t ou Kruskal-Wallis, conforme a normalidade da distribuição, avaliada pelo
teste de Kolmogorov-Smirnov.
Utilizamos o teste de regressão linear para avaliar a relação entre duas variáveis
contínuas (como dias desde o último surto de LES e F%). Quando analisamos uma variável
contínua em dois momentos distintos no mesmo indivíduo (como unidades de expressão do
RGα), utilizamos o teste-t pareado ou o Wilcoxon Signed Rank Test, conforme a distribuição
da mesma. A avaliação das variáveis que estão associadas à sensibilidade individual in vivo
aos glicocorticoides (F%) foi demonstrada através de regressão linear multivariada tipo
―Backward Stepwise Linear Regression‖, com F-para-remover de 3,9, no grupo LES.
24
4. RESULTADOS
O grupo de pacientes com LES apresentou média de idade (DP) na coleta de 30,6 (2,4)
anos, e o grupo controle, 34 (3,5) anos (p=0,436). Quanto à cor da pele, os pacientes lúpicos
foram constituídos por três brancos, dois negros e quatro pardos, ao passo que o grupo
controle foi representado igualmente por indivíduos de cor branca e parda. Todos os doentes e
controles eram do sexo feminino. Não houve diferença entre pacientes e controles no que se
refere à superfície corporal e ao peso verificado no momento da coleta basal, conforme pode
ser visto na tab. 4.
Tabela 4: Características gerais do grupo com Lúpus Eritematoso Sistêmico e controle
LES Controle p
Idade (anos) * 30,6 + 2,4 34 + 3,5 0,436
Peso (kg) * 69 + 4,5 63,87 + 3,0 0,356
Superfície Corporal (m2)* 1,761 + 0,064 1,692 + 0,041 0,378
*Teste-t – dados como média + DP; p: nível de significância
Todas as lúpicas encontravam-se com doença em remissão no momento da seleção,
definida por SLEDAI de zero. A média (DP) de idade ao diagnóstico de LES foi de 26,7 (8)
anos. A média (DP) de duração da doença, desde o diagnóstico de LES até o momento da
coleta laboratorial basal foi de 7,3 (5,1) anos. O tempo médio (DP) decorrido desde o último
surto de atividade da doença até o dia da coleta foi de 840,8 (572,4) dias.
Todas as pacientes apresentavam FAN positivo em altos títulos e manifestaram o
critério articular do LES pelo ACR – 1997(6)
na apresentação de sua doença, conforme
descrição encontrada no prontuário. Quatro lúpicas tinham história de acometimento cutâneo,
definido por eritema malar em asa de borboleta e/ou lúpus discoide e/ou fotossensibilidade.
Quatro pacientes preencheram o critério renal do LES e, pela avaliação dos exames clínicos e
laboratoriais do prontuário, foi dado o diagnóstico de glomerulonefrite mesangial, por
correlação clínico-histológica segundo Esdaile, 1991(105)
. O anticorpo anti-dsDNA foi
encontrado em quatro participantes do grupo LES. Todos os dados referentes aos critérios
classificatórios do LES em cada paciente encontram-se discriminados na tabela a seguir.
25
Tabela 5: Características de cada paciente do grupo LES estudado de acordo com os
critérios do American College of Rheumatology-1997(6)
Paciente Critérios classificatórios do ACR-1997 preenchidos para o diagnóstico
1 Artrite, Comprometimento renal, Anticorpo antinuclear, Alteração imunológica
(anti-dsDNA)
2 Fotossensibilidade, Úlcera oral, Artrite, Comprometimento renal,
Leucopenia/linfopenia, Anticorpo antinuclear, Alteração imunológica (anti-
dsDNA)
3 Artrite, Serosite, Linfopenia, Anticorpo antinuclear
4 Fotossensibilidade, Artrite, Leucopenia, Anticorpo antinuclear
5 Úlcera oral, Artrite, Alteração hematológica (plaquetopenia), Anticorpo
antinuclear
6 Úlcera oral, Artrite, Comprometimento renal, Anticorpo antinuclear
7 Rash malar, Artrite, Leucopenia/linfopenia, Anticorpo antinuclear
8 Úlcera oral, Artrite, Leucopenia/linfopenia, Anticorpo antinuclear, Alterações
imunológicas (anti-dsDNA, anti-Sm)
9 Lesão discoide, Fotossensibilidade, Artrite, Comprometimento renal,
Leucopenia/linfopenia, Anticorpo antinuclear, Alteração imunológica (anti-
dsDNA)
Em todas as pacientes, foi aplicado o índice de dano do Systemic Lupus International
Collaborating Clinics/ American College of Rheumatology (SLICC/ACR/DI-1996)(106)
(Anexo 3). Foi demonstrado algum dano orgânico em quatro casos, sendo um deles por
diabetes melito; um, relacionado ao sistema vascular periférico; um, por dano
musculoesquelético (osteonecrose do fêmur esquerdo) e o último, por lesão cutânea.
Seis das nove pacientes lúpicas utilizavam prednisona por via oral na dose de 5mg/dia
em única tomada pela manhã, associada ao antimalárico (difosfato de cloroquina 250mg/dia
ou hidroxicloroquina 400mg/dia). Das três pacientes lúpicas que não utilizavam prednisona,
26
duas faziam uso isolado de difosfato de cloroquina 250mg/dia, e uma paciente usava apenas
enalapril 10mg/dia para tratamento de hipertensão arterial sistêmica.
4.1 Comparação da sensibilidade in vivo aos glicocorticoides nos dois grupos
estudados
4.1.1 Comparação das condições basais e resposta ao IV-VLD-DST entre os
grupos
A quantificação do cortisol e do ACTH no tempo 0 (valor basal) foi semelhante entre
os grupos. Após 120 minutos da administração de dexametasona 20µg/m2 (IV-VLD-DST), a
concentração de ACTH, mas não a de cortisol, foi maior no grupo LES em relação aos
controles (tab. 6). Avaliando conjuntamente as pacientes com LES e os controles, observa-se
que, com o IV-VLD-DST, ocorreu uma redução da mediana de ACTH de 18pg/mL para
10pg/mL (p<0,001, Wilcoxon Signed Rank Test) e da média (DP) de cortisol de 16,1µg/dL
(7,5) para 9,6µg/dL (4,3), com p<0,001 (teste-t pareado).
Após realizar o teste de supressão com dose muito baixa de dexametasona intravenosa
(IV-VLD-DST), observou-se que a amplitude de supressão do cortisol aos 120 minutos (F%)
foi mais intensa nos controles (mediana = 53,2% de redução) que nas pacientes com LES,
com mediana de 23,48% (p=0,014).
Utilizando o nível de corte arbitrário de 50% de redução do cortisol após o IV-VLD-
DST, encontramos 6/10 controles com essa proporção de supressão versus 0/9 das pacientes
com LES (p=0,001, qui-quadrado).
Tabela 6: Resultados do ACTH e do cortisol nos tempos 0 e 120 minutos no grupo de
pacientes com LES fora de atividade e controles saudáveis
Tempo Dado laboratorial LES Controles p
Tempo 0
ACTH (pg/mL)1 24,11 + 9,93 17,7 + 17,3 0,332
Cortisol (µg/dL)2 11,7 19,4 0,253
Tempo 120
minutos
ACTH (pg/mL)2 20 6,5 0,048*
Cortisol (µg/dL)1 10,34 + 4,91 8,96 + 3,86 0,508
27
Continuação:
Tempo Dado laboratorial LES Controles p
Relação
entre os
tempos
F%2 23,48% 53,2% 0,014*
% de casos com
supressão do
cortisol acima de
50% 3
0% 60% 0,001*
1)Teste-t - dados como média + DP ; * p< 0,05 ; 2) Kruskal-Wallis - dados como mediana. 3) Qui-quadrado
Ao avaliarmos o nível de corte de F% na discriminação entre os grupos, com a
utilização de uma curva ROC (receiver operator characteristics), também obtivemos a
melhor separação com F% = 50%, com 100% de sensibilidade e 60% de especificidade, sendo
a área sob a curva de 83,3% (IC 95%= 61,9% - 100%), com p=0,014 (fig. 3).
Figura 3: Curva ROC (receiver operator characteristics) da supressão de cortisol após
IV-VLD-DST entre os grupos controle e pacientes com LES. A linha azul mostra a variação de
sensibilidade e 1-especificidade com níveis de corte variados. A linha diagonal (verde) ilustra a nulidade de
efeito discriminante. Área sob a curva = 83,3% (IC 95%= 61,9% - 100%), com p=0,014.
28
4.1.2 Comparação da resposta ao teste oral com dose baixa de dexametasona
entre os grupos
Ao término do teste oral com dose baixa de dexametasona (48horas), verificou-se que
a amplitude de supressão do cortisol com este teste (FOr%) foi semelhante entre os grupos
LES e controle, com mediana de supressão de 94,79% e 93,9%, respectivamente (p=0,414).
Quatorze indivíduos (73,7% do total) apresentaram resposta esperada ao teste, com cortisol
<1,8µg/dL e ACTH <20pg/mL, sendo que os outros cinco apresentaram cortisol entre
2,1µg/dL e 3,68µg/dL. Destes, quatro apresentaram ACTH <20pg/mL.
Para verificar a capacidade discriminatória de FOr%, calculamos a mediana dos
valores de supressão no grupo como um todo (supressão de 94,4%) e comparamos quantos
casos suprimiram mais do que a mediana em cada um dos grupos: 5/10 nos controles e 5/9
nas pacientes com LES (p=0,809, qui-quadrado). Mesmo com a utilização da curva ROC, não
foi possível determinar um ponto de corte na supressão: área sob a curva = 38,9% (IC 95% =
12,1% - 65,7%), p=0,414.
Procuramos, então, determinar se havia concordância entre maior resposta ao IV-
VLD-DST e ao teste oral com dexametasona, avaliando os dois grupos conjuntamente. Dos
10 indivíduos que suprimiram mais do que a mediana no teste de 48hs, apenas três também
tiveram supressão maior que 50% no IV-VLD-DST (tab. 7).
Tabela 7: Distribuição cruzada entre a supressão no IV-VLD-DST (F%) e no teste oral
com dexametasona após 48hs (FOr%), avaliando-se conjuntamente pacientes com LES e
controles
F% até 50% F% acima de 50% TOTAL
FOr% até mediana (< ou = 94,4%) 6 3 9
FOr% acima da mediana (>94,4%) 7 3 10
TOTAL 13 6 19
Teste Qui-quadrado, p=0,876
29
4.2 Comparação da expressão gênica entre os grupos
As medianas da expressão gênica do RGα e NF-kB mostraram-se semelhantes em
ambos os grupos (Tab. 8).
Tabela 8: Comparação das medianas da expressão gênica do RGα e NF-kB entre os
grupos de pacientes com LES e controles
N (LES/C) LES CONTROLES p
RGα tempo 0 13 (7/6) 21,55 8,606 0,317
RGα tempo 48h 12 (9/3) 19,54 20,24 0,926
NF-kB tempo 0 13 (7/6) 29,164 3,999 0,253
NF-kB tempo 48h 12 (9/3) 30,93 31,97 0,782
N(LES/C): número total de casos analisados com sucesso em cada teste (no grupo LES / no grupo controle); p:
nível de significância; Teste Kruskal-Wallis
Foi possível avaliar o efeito do teste oral com dexametasona na expressão do RGα e
NF-kB, de forma pareada, em 10 e 9 indivíduos, respectivamente, nos quais não se observou
diferença da expressão gênica entre os tempos 0 e 48 horas (Tab. 9). Os dados não
apresentados resultaram de falha na amplificação gênica.
Tabela 9: Avaliação da expressão gênica do RGα e NF-kB de forma pareada, nos
indivíduos que apresentaram expressão no tempo basal (tempo 0) e após o teste oral de
supressão com dose baixa de dexametasona (tempo 48 horas)
Tempo 0 Tempo 48 horas p
RGα (n=10) 11,575 (7,7 - 27,6) 19,892 (8,5 - 28,6) 1,00
NF-kB (n=9) 18,272 (11,7 - 141,2) 40,213 (6,5 - 311,4) 0,250
n: número de amostras analisadas; p: nível de significância; Wilcoxon Signed Rank Test
4.3 Correlação da sensibilidade in vivo e expressão gênica
Ao avaliarmos conjuntamente as pacientes e controles, não observamos correlação
entre a expressão do RGα ou NF-kB em função da supressão de cortisol ao IV-VLD-DST:
r=8,8%, p=0,324 e r=5,7%, p=0,462, respectivamente. Semelhantemente, não houve
30
correlação entre a amplitude de supressão do cortisol obtida pelo teste oral (FOr%) e a
expressão do RGα e do NF-kB (r=7,9%, p=0,796; r=0,9%, p=0,766, respectivamente).
4.4 Avaliação dos achados laboratoriais em relação aos dados clínicos nas
pacientes com LES
Analisando os dados referentes ao tempo decorrido desde o último surto de atividade
da doença, caracterizado por SLEDAI > 6, em nove pacientes lúpicas, verificamos que a
amplitude de supressão ao IV-VLD-DST foi estatisticamente maior nas pacientes com doença
em remissão há mais tempo (r=75,6%, r2=57,1%, p=0,019) (Fig. 4).
Figura 4: Correlação entre a amplitude de supressão do cortisol obtida pelo IV-VLD-
DST e o número de dias desde o último surto de LES, definido como SLEDAI acima de
6. Os círculos representam os dados de cada paciente com LES e as linhas, a regressão linear com seus
intervalos de confiança (r=75,6%, r2=57,1%, p=0,019).
Em sete casos de pacientes com LES, foi analisada a relação entre a unidade de
expressão do gene NF-kB e RGα e o tempo transcorrido desde o último surto de atividade da
doença, por teste de regressão linear, constatando-se que não houve diferença estatística entre
os parâmetros analisados (r=8% e p=0,540 para o NF-kB e r=0,1% e p=0,948, para o RGα).
Buscando verificar quais as variáveis poderiam influir de forma complementar na
identificação da sensibilidade ao IV-VLD-DST, utilizamos uma regressão linear multivariada
do tipo "Backward Stepwise". A variável de interesse (dependente) foi F%. Incluímos, no
modelo inicial, as seguintes variáveis independentes: RGα, NF-kB, ACTH basal, cortisol
Regression, Conf. & Pred.
dias desde ultimo surto
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200
F%
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
31
basal e dias desde o último surto de atividade do LES. Todas as variáveis analisadas foram
excluídas do modelo, por apresentarem F-para-remover menor que 3,9, exceto dias desde o
último surto de LES, com r=75,6% e p=0,019.
4.5 Avaliação do uso ou não de prednisona nas pacientes com LES, em relação às
variáveis estudadas
O cortisol e o ACTH basais, a amplitude de supressão do cortisol ao IV-VLD-DST
(F%) e a expressão de RGα e NF-kB foram semelhantes entre as seis pacientes com LES que
estavam em uso de prednisona e as três que estavam sem prednisona há, pelo menos, quatro
meses (Tab. 10).
Tabela 10: Comparação das variáveis estudadas nas pacientes lúpicas, com e sem uso de
prednisona para manutenção da remissão do LES, em doses de até 5mg/dia.
LES em uso de prednisona
(n= 6)
LES sem prednisona
(n= 3)
p
Cortisol basal
(µg/dL) 10,45 13,2 0,121
ACTH basal
(pg/mL) 23 18 0,606
F% 19,2% 34,6% 0,439
RGα 14,67 23,3 0,439
NF-kB 22,35 606,1 0,197
n: número de casos analisados; dados como mediana; p: nível de significância; Teste Kruskal-Wallis
32
5. DISCUSSÃO
Os pacientes portadores de LES com doença fora de atividade foram selecionados por
terem preenchido, em algum momento na evolução de sua doença, pelo menos quatro dos
onze critérios de classificação do Colégio Americano de Reumatologia de 1997(6)
(Anexo 1).
Os casos não tiveram restrição à participação no estudo, em relação ao sexo, tempo de doença
e dias transcorridos desde o último surto de atividade do LES, mas deveriam,
obrigatoriamente, apresentar SLEDAI igual a zero no momento da coleta inicial.
Todos os pacientes eram do sexo feminino e tiveram média de idade ao diagnóstico de
LES de 26,7 anos, com uma variação de 18 anos a 42 anos. Como está bem definido na
literatura, o LES é mais prevalente em mulheres, com razão entre os sexos
feminino:masculino de 9:1 em adultos, mas pode chegar a 4:3, em crianças na primeira
década de vida e 5:1, em maiores de 50 anos. Geralmente, a idade ao diagnóstico de LES é de
15 anos a 40 anos(107)
. Logo, as características demográficas descritas no presente estudo são
semelhantes às encontradas na casuística brasileira. Quanto à cor da pele, o percentual de
pardos e brancos foi semelhante, porém vale ressaltar que é difícil a correta classificação
racial no nosso país, devido ao alto grau de miscigenação.
Em relação às manifestações clínicas do LES, todas as pacientes tinham antecedente
de artrite e a maioria delas já havia apresentado alguma manifestação cutâneo-mucosa. O
fator antinuclear (por imunofluorescência indireta em células Hep-2) estava presente em altos
títulos e com padrão nuclear. Nenhuma paciente tinha história pregressa de alteração
neuropsiquiátrica grave do LES. Quatro pacientes apresentaram manifestações renais do LES
ao diagnóstico da doença, as quais foram tratadas apenas com prednisona em altas doses
(1mg/Kg/dia), por provável correlação clínico-histológica compatível com glomerulonefrite
mesangial, segundo Esdaile et al(105)
. Pela descrição dos prontuários, houve adequada resposta
à medicação, caracterizada por redução da proteinúria de 24 horas, normalização do
sedimento urinário e da concentração das frações do complemento (C3 e C4). Não houve
necessidade de realizar biópsia renal em nenhum dos casos, como não foi necessária a
utilização de drogas imunossupressoras. Nenhuma das pacientes apresentava alterações do
sedimento urinário ou da função renal no momento da coleta das amostras. Portanto, para o
estudo, foram escolhidas doentes com LES de baixa agressividade e, portanto, em uso de
baixas doses de prednisona (< ou igual a 5mg/dia) para manutenção de remissão clínica.
33
Dano orgânico em portadores de LES está associado a aspectos sócio-econômicos,
duração da doença e mau prognóstico(108,109)
. Em nosso estudo, observamos que a presença
de dano em algum sistema orgânico foi de 44,4%. Rahman et al(109)
encontraram 28% de dano
orgânico em pacientes com um ano de doença e este dado se correlacionou com aumento da
mortalidade após dez anos, quando comparado a pacientes sem nenhum dano. Em um recente
estudo brasileiro, dano orgânico precoce foi visto em 37% dos pacientes com até três anos de
doença, sendo o dano neurológico o mais frequente(106)
. Em outro estudo nacional, Guarize et
al(110)
encontraram 68,3% de danos permanentes, sendo a maioria relacionada à pele (35%),
porém o grupo de pacientes avaliados tinha um tempo médio de doença superior (80 meses,
com DP de 23,2 meses). Na nossa casuística, a média de tempo de doença foi de 7,3 anos (DP
de 5,08 anos e variação de 2 anos a 18 anos), sendo o acometimento da pele, dos sistemas
vascular periférico e musculoesquelético e o diabetes melito os responsáveis pelo dano
permanente (SLICC/ACR), nas pacientes com mais de quatro anos de diagnóstico de LES.
Os controles mantiveram paridade segundo idade, sexo, cor da pele, peso e superfície
corporal, permitindo uma comparação adequada entre os grupos, mesmo com um pequeno
número de amostras, sobretudo no que se refere à sensibilidade aos glicocorticoides. Em
estudo anterior(94)
, nosso grupo demonstrou variabilidade da sensibilidade aos GC em função
da idade, com uma maior sensibilidade na infância, a qual diminui na adolescência e volta a
subir na idade adulta. Assim, o adequado pareamento da idade é essencial para
comparabilidade da sensibilidade aos GC avaliada pelo IV-VLD-DST.
As concentrações do cortisol basal maiores que 7µg/dL sugerem que o eixo HHA
estava normofuncionante(100)
, tanto no grupo LES quanto no controle, no momento da coleta
basal das amostras. Portanto, pode-se considerar que a concentração dos RG e os resultados
dos testes de supressão do cortisol não foram influenciados por mecanismo de
retroalimentação ou down-regulation.
Os valores basais do cortisol e do ACTH nas pacientes com LES e nos controles
mostraram resultados semelhantes. Após 120 minutos da administração de dexametasona
20µg/m2
(IV-VLD-DST), a concentração de ACTH, mas não a de cortisol, foi maior no grupo
LES em relação aos controles. A quantificação de ACTH é caracterizada por dificuldades
metodológicas importantes, já que se trata de uma proteína de peso molecular maior que o dos
esteroides (4,5kDa e 250-350Da, respectivamente), sensível ao calor e instável no plasma(111)
,
34
e a diferença observada pode ser efeito tanto da dificuldade técnica, quanto de uma
variabilidade amostral, pelo número relativamente pequeno de casos em cada grupo.
Quando analisamos a resposta ao teste intravenoso com dose muito baixa de
dexametasona de forma pareada, em pacientes e controles, houve redução de ambos os
parâmetros após o teste, indicando que este foi eficaz em estabelecer um espectro de
sensibilidade aos glicocorticoides in vivo, conforme anteriormente demonstrado pelo nosso
grupo (95,104)
. A amplitude de supressão (F%) foi menor nas pacientes com LES que nos
controles (23,5% versus 53,2%, respectivamente). Definindo um nível de corte arbitrário de
50% de redução do cortisol após 120 minutos do IV-VLD-DST, notou-se que nenhuma das
nove pacientes respondeu ao teste, ao passo que 60% dos controles apresentaram resposta.
Uma possível justificativa para a menor supressão do cortisol após o teste intravenoso
nas pacientes com LES seria o efeito residual do uso crônico e diário de GC pelas lúpicas no
eixo HHA e, portanto, uma baixa sensibilidade do RG ao uso, in bolus, de dose muito baixa
de dexametasona. Entretanto, quando comparamos a concentração de cortisol basal e a
supressão de cortisol pelo IV-VLD-DST em pacientes com LES em uso de prednisona em
relação àquelas sem o uso desta medicação, não observamos diferenças entre os grupos.
Todavia, deve-se ressaltar que apenas três pacientes não faziam uso desse fármaco, limitando
o poder dos testes estatísticos. Já foi demonstrado na literatura que um dos determinantes da
responsividade do RG são os próprios glicocorticoides, que promovem uma redução na
concentração de RG intracelular, conhecido como processo de down-regulation
homólogo(112)
. Esse achado poderia justificar a concentração de cortisol basal acima de
7µg/dL nas pacientes com LES.
Sabe-se que a regulação do eixo HHA é um mecanismo complexo e dependente de
vários fatores, como genéticos, psicopatológicos, metabólicos e imunológicos(113)
. A
dexametasona na dose de 0,25mg a 1mg já foi usada para testar a resposta inibitória que
exerce ao nível da hipófise em estudos anteriores. Demonstrou-se maior supressão do cortisol
matinal em indivíduos portadores de polimorfismo do gene do RG(28)
. Em outro trabalho,
verificou-se que mutação no gene do RG pode ser causa de resistência inata aos GC, com
alteração da concentração do RG intracelular e da sua afinidade ao ligante hormonal, baixa
estabilidade do RG, translocação nuclear anômala ou variações na sua interação com co-
fatores(114)
.
35
Estudo prévio realizado em nosso serviço(95)
, no qual se usou o IV-VLD-DST pela
primeira vez em pacientes com artrite reumatoide (AR) para avaliar a integridade do eixo
HHA e determinar a sensibilidade aos GC, constatou uma diferença significativa entre os
resultados da concentração basal do cortisol do grupo AR com moderada atividade de doença
e controle (a concentração basal do cortisol estava 58% maior no grupo controle).
Demonstrou-se ainda uma menor supressão do cortisol após o teste com dose muito baixa de
dexametasona no grupo AR, representando, possivelmente, uma resistência parcial do
feedback negativo do GC ao nível central, encontrada em indivíduos com doenças
reumatológicas que utilizam GC por tempo prolongado, como AR ou LES. Entretanto,
posteriormente, comparando um novo grupo de pacientes com AR de menor gravidade e sem
uso de GC por, pelo menos, quatro meses e controles, verificamos que não houve diferença
entre os grupos, nem da concentração de cortisol basal, nem da sensibilidade in vivo aos GC
demonstrada pela supressão do cortisol pelo IV-VLD-DST(104)
.
A adequada reprodutibilidade do IV-VLD-DST pode ser observada quando avaliamos
a série histórica das medianas de F% em controles adultos submetidos ao teste por nosso
grupo: em 2008, Faria et al(94)
demonstraram F% de 61,6% em adultos de 21-56 anos e, em
2010, Cavalcante et al(104)
obtiveram F% de 38,4% em controles com mediana de 61,5 anos.
Estes dados são semelhantes aos obtidos com o presente grupo controle: F% de 53,2%, sendo
a média de idade deste grupo de 30,6 anos.
Comparando pacientes e controles quanto à sensibilidade in vivo aos GC após o teste
oral com dose baixa de dexametasona, determinada por FOr%, observou-se que não houve
diferença entre os grupos e não foi possível identificar um grau de supressão que diferenciasse
controles de pacientes com LES. Ao analisarmos conjuntamente casos e controles para
verificar a existência de concordância entre os resultados de supressão do cortisol no teste
intravenoso e no teste oral com dexametasona, constatou-se que não existiu correlação entre
os dois testes. Esse resultado possivelmente indica que a mediana de supressão do teste oral
com dexametasona em dose baixa foi muito alta (94,4% de supressão), não permitindo a
criação de um espectro adequado de resposta que permitisse a distinção de resistência parcial
aos GC. O propósito inicial do teste (detectar hipercortisolismo por Síndrome de Cushing,
diferenciando os casos de pseudo-Cushing), reflete esta idéia de detectar apenas graus mais
importantes de resistência aos GC.
36
Pelos resultados do presente estudo, verificamos que algumas pacientes com LES
apenas responderam ao teste de supressão do eixo HHA, com redução da concentração do
cortisol sérico, quando se utilizou a dexametasona em doses mais altas que as empregadas no
teste de supressão IV. Esses achados sugerem que, neste grupo de LES, exista certo grau de
resistência aos GC. A menor sensibilidade aos GC, observada nas pacientes com LES, não foi
relacionada à menor expressão de RGα, como se poderia esperar. Igualmente, a expressão de
NF-kB, que poderia indicar um maior componente inflamatório, também não se relacionou à
sensibilidade aos GC pelo IV-VLD-DST. A expressão desses genes foi semelhante entre os
grupos estudados.
Observamos ainda que pacientes com menor tempo desde o último surto de atividade
do LES apresentavam menor sensibilidade in vivo aos GC e que o tempo transcorrido desde o
último surto de LES foi a única variável estudada que se correlacionou com a sensibilidade
aos GC, mesmo com a análise multivariada. Uma possibilidade seria a existência de efeito
pós-receptor, como, por exemplo, processo inflamatório residual após o surto de doença, não
mediado por NF-kB, que pudesse causar a resistência parcial aos GC. Translocação anômala
do RGα, co-inativação do RGα por AP-1 e/ou expressão alterada de co-ativadores poderiam
também interferir na sensibilidade do RG ao GC(115)
. Adicionalmente, alterações na
fosforilação do RG também podem associar-se à resistência aos GC, exemplificadas por
aumento da atividade de proteínas cinases como JNK, ERK e p38 MAPK(89)
. A fosforilação
do RG mediada por p38 MAPK está ligada a uma redução da atividade de transcrição gênica
do RGα. Desse modo, a resistência aos GC encontrada em alguns pacientes poderia ser
revertida pela adição de inibidores de MAPKs (como o IFN)(116)
.
Outra possibilidade é a maior expressão da isoforma beta do RG nas fases iniciais após
o surto de LES, causando a maior resistência relativa. Piotrowski et al(117)
demonstraram
maior expressão relativa do RNAm de RGβ em relação ao RGα em pacientes com LES em
alta atividade (2 casos, com SLEDAI de 17 e 30), comparada aos pacientes com
baixa/moderada atividade (média de SLEDAI de 6, com variação de 2 a 9).
A associação entre doenças auto-imunes e aumento da expressão do RGβ já foi
estudada. Publicações anteriores evidenciaram um aumento da expressão do RGβ em células
mononucleares circulantes de pacientes com asma corticorresistente, quando comparado a
controles saudáveis e pacientes responsivos ao GC (29,118)
. Também foi demonstrado que o
37
polimorfismo da porção 3’UTR do RNAm do RGβ se associou à artrite reumatoide por
aumento da expressão do RGβ nesses pacientes, in vitro(119)
.
Dados da literatura afirmam que o RGβ não possui sítio de ligação para GC e não
promove transcrição ou trans-repressão gênica(120)
. Bamberger et al(77)
demonstraram pela
primeira vez que o RGβ pode atuar como um inibidor do RGα in vitro. Oakley et al(121)
também constataram que o RGβ pode inibir a transcrição gênica induzida pelo RG alfa em
células ―HeLa‖ (―human epithelial cells from a fatal cervical carcinoma transformed
by human papillomavirus 18‖). O RNAm do RGβ foi identificado por RT-PCR em vários
tecidos, como cérebro, pulmão, fígado, músculo e medula óssea, assim como a sua proteína
foi detectada por western blot, nos mesmos órgãos ou tecidos e a expressão do gene do RGβ
não é homogênea entre eles. Foi observado que células epiteliais do pulmão, timo e ducto
biliar hepático apresentam elevada expressão do RGβ (122)
. A razão entre RGα e RGβ também
é variável. Em células mononucleares do sangue periférico é de 600:1, enquanto na hipófise é
de 30:1. Adicionalmente, algumas citocinas pró-inflamatórias como IL-2, IL-4 e TNFα
demonstraram, in vitro, aumento da expressão do RGβ em células mononucleares
periféricas(123)
.
Apesar das associações entre aumento da expressão do RGβ e doenças
imunomediadas, como asma e AR, ainda não está completamente elucidado o papel do RGβ
na patogênese de outras doenças auto-imunes, como o LES, bem como a sua real participação
na resistência ao GC, que ocorre em um subgrupo de doentes com essas patologias.
Uma vez que a nossa casuística é pequena, a eventual ocorrência de mutações no RGα,
com consequente resistência aos GC em alguns pacientes, poderia causar dificuldade na
interpretação dos dados. Fujiwara et al(124)
encontraram mutação silenciosa no codon 766
(exon 9) do RGα em 8,3% dos pacientes com LES. Este polimorfismo havia sido descrito por
Koper (1997)(125)
em idosos e foi relacionado à menor resposta ao teste oral com
dexametasona. Um outro estudo publicado por Wüst et al(126)
descreveu um polimorfismo do
gene do RG, especialmente a homozigoze do Bcl1, que resultou em menores respostas do
cortisol comparadas a controles, após a administração de ACTH ou em situações de estresse
psicossocial.
Outro mecanismo de resistência aos GC foi recentemente relatado na literatura.
Demonstrou-se que, em um subgrupo de pacientes com asma corticorresistente e
corticodependente, havia uma falha no fenômeno de translocação nuclear do RGα e posterior
38
acetilação da histona em resposta à dexametasona(127)
. A redução da acetilação de resíduos de
histona estão associados à interrupção da trancrição de genes-alvo do NF-kB (128,129)
. Os GC
podem ainda provocar modificações na fosforilação da histona, influenciando na
acessibilidade do RGα à cromatina e na transcrição dos genes-alvo(130)
.
Estudos anteriores demonstraram que a atividade do NF-kB está significantemente
aumentada em pacientes com LES versus controles saudáveis e essa é uma característica
permanente e estável do LES e não apenas um achado transitório de alguma fase da
doença(131)
. Sabe-se que os GC podem suprimir a atividade do NF-kB por aumentar os níveis
de IkB(132)
. Este mantém o NF-kB no citoplasma, em estado inativo, impedindo a sua
translocação nuclear. Um trabalho anterior pesquisou a influência de corticosteroides e/ou
outras drogas, usadas no tratamento do LES, sobre a atividade do NF-kB nesse grupo. Foram
incluídos pacientes com doença em diferentes estágios de atividade, segundo o SLEDAI, e
com doses variáveis de GC. Foi demonstrado, pelo estudo, que não houve diferença entre a
atividade do NF-kB, fase clínica da doença e terapêutica utilizada. Essa mesma publicação
sugeriu que os lúpicos apresentam um defeito na ativação do NF-kB mediada pelo TCR
(―receptor T cell‖) de células T do sangue periférico, quando comparados a pacientes
portadores de AR e controles. Ao avaliar a família do NF-kB, constatou-se uma redução da
subunidade p65/RelA por imunoblot no grupo LES e uma concentração do p50 normal nos
grupos avaliados(133)
.
Apesar de o NF-kB ser um fator importante na transcrição de muitos genes envolvidos
na resposta imune, incluindo IL-2(134)
, há dificuldades, até o presente, de estipular o impacto
da alteração de sua atividade no LES e de explicar as inúmeras anormalidades imunológicas
envolvidas nessa doença pleomórfica. Uma possibilidade para os achados encontrados neste
estudo é que o grau de inflamação sistêmica das pacientes era baixo e, portanto, insuficiente
para apresentar elevação da expressão de NF-kB, a partir de células mononucleares
periféricas.
Estudos futuros podem avaliar a expressão de cFos e Jun (proteína AP-1) e RGβ (e da
relação RGalfa/beta), bem como a identificação dos principais polimorfismos do RG, para
elucidar os mecanismos de resistência parcial aos GC existentes em alguns portadores de
LES. A ampliação da casuística pode ser de auxílio nestes estudos, inclusive podendo inserir
pacientes em diferentes estágios inflamatórios da sua doença e testar a sensibilidade ao GC, in
vivo, nesse contexto.
39
Por fim, de modo prático, resta ainda verificar se os pacientes com LES em remissão
prolongada e que apresentam maior sensibilidade aos GC pelo IV-VLD-DST podem ter as
suas doses de prednisona diminuídas em relação aos com maior resistência ao teste. Desse
modo, seria possível prevenir a ocorrência de efeitos adversos aos GC sem, entretanto,
aumentar a possibilidade de recidiva da doença, garantindo menores doses do medicamento (e
até a sua suspensão) e aumento da aderência à terapêutica.
Em resumo, este estudo inédito permitiu a verificação de que pacientes portadores de
LES em remissão clínica e em uso de baixas doses de prednisona apresentaram resistência
parcial ao teste de supressão com dose muito baixa de dexametasona, apesar da expressão do
RGα ser semelhante entre o grupo LES e controle. Demonstrou-se ainda que a maior
sensibilidade ao GC, no LES, correlacionou-se com maior tempo transcorrido desde o último
surto de atividade da doença, ou seja, com remissão clínica há mais tempo.
40
6. CONCLUSÕES
A expressão do RNAm do RGα e do NF-kB nas pacientes portadoras de LES em
remissão foi semelhante à encontrada em controles saudáveis.
Não houve correlação entre a expressão desses genes com a resposta ao teste de
supressão com dexametasona nas pacientes e controles estudados.
O teste de supressão com dose muito baixa de dexametasona foi eficaz em estabelecer
um espectro de sensibilidade aos glicocorticoides in vivo, identificando casos de pacientes
lúpicos com menor sensibilidade aos GC. A resposta ao teste de supressão com dose baixa de
dexametasona por via oral foi semelhante entre os grupos avaliados e não apresentou
concordância com o IV-VLD-DST.
A única variável que se correlacionou com maior sensibilidade, in vivo, aos GC em
pacientes com LES em remissão foi o maior tempo transcorrido desde o último surto de
atividade da doença.
41
7. ANEXOS
42
Anexo 1
1997 Update of the 1982 American College of Rheumatology Revised Criteria for Classification of
Systemic Lupus Erythematosus Criterion
Definition
1. Malar Rash Fixed erythema, flat or raised, over the malar
eminences, tending to spare the nasolabial folds
2. Discoid rash Erythematous raised patches with adherent keratotic
scaling and follicular plugging; atrophic scarring may
occur in older lesions
3. Photosensitivity Skin rash as a result of unusual reaction to sunlight,
by patient history or physician observation
4. Oral ulcers Oral or nasopharyngeal ulceration, usually painless,
observed by physician
5. Nonerosive Arthritis Involving 2 or more peripheral joints, characterized
by tenderness, swelling, or effusion
6. Pleuritis or Pericarditis 1. Pleuritis--convincing history of pleuritic pain or
rubbing heard by a physician or evidence of pleural
effusion OR 2. Pericarditis--documented by
electrocardigram or rub or evidence of pericardial
effusion
7. Renal Disorder 1. Persistent proteinuria > 0.5 grams per day or > than
3+ if quantitation not performed OR 2. Cellular casts-
-may be red cell, hemoglobin, granular, tubular, or
mixed
8. Neurologic Disorder 1. Seizures--in the absence of offending drugs or
known metabolic derangements; e.g., uremia,
ketoacidosis, or electrolyte imbalance OR 2.
Psychosis--in the absence of offending drugs or
known metabolic derangements, e.g., uremia,
ketoacidosis, or electrolyte imbalance
43
9. Hematologic Disorder 1. Hemolytic anemia--with reticulocytosis OR 2.
Leukopenia< 4,000/mm3 on ≥ 2 occasions OR 3.
Lyphopenia< 1,500/ mm3 on ≥ 2 occasions OR 4.
Thrombocytopenia<100,000/ mm3 in the absence of
offending drugs
10. Immunologic Disorder
1. Anti-DNA: antibody to native DNA in abnormal
titer OR 2. Anti-Sm: presence of antibody to Sm
nuclear antigen OR 3. Positive finding of
antiphospholipid antibodies on: an abnormal serum
level of IgG or IgM anticardiolipin antibodies and/or
a positive test result for lupus anticoagulant using a
standard method, or a false-positive test result for at
least 6 months confirmed by Treponema pallidum
immobilization or fluorescent treponemal antibody
absorption test
11. Positive Antinuclear Antibody An abnormal titer of antinuclear antibody by
immunofluorescence or an equivalent assay at any
point in time and in the absence of drugs
Fonte:www.rheumatology.org
44
Anexo 2
SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS DISEASE ACTIVITY INDEX
SELENA MODIFICATION
Physicians Global Assessment
0 1 2 3
None Mild Med Severe
SLEDAI SCORE
Check box: If descriptor is present at the time of visit or in the proceeding 10 days
Wt. Present. Descriptor. Definition
8 □ Seizure. Recent onset. Exclude metabolic, infectious or drug cause.
8 □ Psychosis. Altered ability to function in normal activity due to severe disturbance in the perception of
reality. Include hallucinations, incoherence, marked loose associations, impoverished thought content, marked
illogical thinking, bizarre, disorganized, or catatonic behavior. Excluded uremia and drug causes.
8 □ Organic Brain Syndrome. Altered mental function with impaired orientation, memory or other intelligent
function, with rapid onset fluctuating clinical features. Include clouding of consciousness with reduced capacity
to focus, and inability to sustain attention to environment, plus at least two of the following: perceptual
disturbance, incoherent speech, insomnia or daytime drowsiness, or increased or decreased psychomotor activity.
Exclude metabolic, infectious or drug causes.
8 □ Visual Disturbance. Retinal changes of SLE. Include cytoid bodies, retinal hemorrhages, serious exodate or
hemorrhages in the choroids, or optic neuritis. Exclude hypertension, infection, or drug causes.
8 □ Cranial Nerve Disorder. New onset of sensory or motor neuropathy involving cranial nerves.
8 □ Lupus Headache. Severe persistent headache: may be migrainous, but must be nonresponsive to narcotic
analgesia.
8 □ CVA. New onset of cerebrovascular accident(s). Exclude arteriosclerosis.
8 □ Vasculitis. Ulceration, gangrene, tender finger nodules, periungual, infarction, splinter hemorrhages, or
biopsy or angiogram proof of vasculitis
4 □ Arthritis. More than 2 joints with pain and signs of inflammation (i.e. tenderness, swelling, or effusion).
4 □ Myositis. Proximal muscle aching/weakness, associated with elevated creatine phosphokinase/adolase or
electromyogram changes or a biopsy showing myositis.
4 □ Urinary Casts. Heme-granular or red blood cell casts
4 □ Hematuria. >5 red blood cells/high power field. Exclude stone, infection or other cause.
4 □ Proteinuria. >0.5 gm/24 hours. New onset or recent increase of more than 0.5gm/24 hours.
4 □ Pyuria. >5 white blood cells/high power field. Exclude infection.
2 □ New Rash. New onset or recurrence of inflammatory type rash.
2 □ Alopecia. New onset or recurrence of abnormal, patchy or diffuse loss of hair.
2 □ Mucosal Ulcers. New onset or recurrence of oral or nasal ulcerations.
45
2 □ Pleurisy. Pleuritic chest pain with pleural rub or effusion, or pleural thickening.
2 □ Pericarditis. Pericardial pain with at least 1 of the following: rub, effusion, or electrocardiogram
confirmation.
2 □ Low Complement. Decrease in CH50, C3, or C4 below the lower limit of normal for testing laboratory.
2 □ Increased DNA binding. >25% binding by Farr assay or above normal range for testing laboratory.
1 □ Fever. >38˚C. Exclude infectious cause
1 □ Thrombocytopenia. <100,000 platelets/mm3
1 □ Leukopenia. <3,000 White blood cell/mm3. Exclude drug causes.
_____ TOTAL SCORE (Sum of weights next to descriptors marked present)
46
Anexo 3
System Lupus International Collaborating Clinics/ACR Damage Index for Systemic
Lupus Erythematosus*
Item Score
Ocular (either eye, by clinical assessment)
Any cataract ever 1
Retinal change or optic atrophy 1
Neuropsychiatric
Cognitive impairment (e.g. memory deficit, difficulty with
calculation, poor concentration, difficulty in spoken or written
language, impaired performance levels) or major psychosis
1
Seizures requiring therapy for 6 months 1
Cerebrovascular accident ever (score 2 > 1) 1 (2)
Cranial or peripheral neuropathy (excluding optic) 1
Transverse myelitis 1
Renal
Estimated or measured glomerular filtration rate<50% 1
Proteinuria ≥3.5 gm/24hours 1
or
End-stage renal disease (regardless of dialysis or transplantation) 3
Pulmonary
Pulmonary hypertension (right ventricular prominence, or loud P2) 1
Pulmonary fibrosis (physical and radiograph) 1
Shrinking lung (radiograph) 1
47
Item Score
Pleural fibrosis (radiograph) 1
Pulmonary infarction (radiograph) 1
Cardiovascular
Angina or coronary artery bypass 1
Myocardial infarction ever (score 2 if > 1) 1 (2)
Cardiomyopathy (ventricular dysfunction) 1
Valvular disease (diastolic murmur, or systolic murmur >3/6) 1
Pericarditis for 6 months, or pericardiectomy 1
Peripheral vascular
Claudication for 6 months 1
Minor tissue loss (pulp space) 1
Significant tissue loss ever (e.g. loss of digit or limb)(score 2 if > 1
site) 1 (2)
Venous thrombosis with swelling, ulceration, or venous stasis 1
Gastrointestinal
Infarction or resection of bowel below duodenum spleen, liver, or
gall bladder ever, for cause any (score 2 if > 1 site) 1 (2)
Mesenteric insufficiency 1
Chronic peritonitis 1
Stricture or upper gastrointestinal tract surgery ever 1
Musculoskeletal
Muscle atrophy or weakness 1
48
Item Score
Deforming or erosive arthritis (including reducible deformities,
excluding avascular necrosis) 1
Osteoporosis with fracture or vertebral collapse (excluding avascular
necrosis) 1
Avascular necrosis (score 2 if > 1) 1 (2)
Osteomyelitis 1
Skin
Scarring chronic alopecia 1
Extensive scarring or panniculum other than scalp and pulp space 1
Skin ulceration (excluding thrombosis) for > 6 months 1
Premature gonadal failure 1
Diabetes (regardless of treatment) 1
Malignancy (exclude dysplasia) (score 2 if > 1 site) 1 (2)
* Damage (nonreversible change, not related to active inflammation) occurring since onset of lupus, ascertained
by clinical assessment and present for at least 6 months unless otherwise stated. Repeat episodes must occur 6
months apart to score 2. The same lesion cannot be scored twice.
49
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59
RESUMO
Melo AKG. Avaliação da sensibilidade individual aos glicocorticoides e expressão do
receptor de glicocorticoide em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico. Dissertação de
Mestrado – 2011.
Os glicocorticoides (GC) são amplamente utilizados no tratamento do lúpus eritematoso
sistêmico (LES), e a maioria dos seus efeitos é mediada pelo receptor de glicocorticoide (RG),
modificando a expressão de genes-alvo. A sensibilidade individual aos GC é variável e pode
ser avaliada pelo teste de supressão com dose muito baixa de dexametasona (IV-VLD-DST).
O fator de transcrição nuclear kB (NF-kB) participa da regulação de genes envolvidos na
cascata inflamatória e desempenha um papel importante na etiopatogenia de doenças
imunomediadas, como o LES. Objetivos: comparar a expressão do RNAm da isoforma α do
RG e do NF-kB em células mononucleares periféricas, nos pacientes portadores de LES em
remissão em relação a controles saudáveis, utilizando a técnica de PCR em Tempo Real;
correlacionar a expressão desses genes com a sensibilidade aos glicocorticoides pelo teste IV-
VLD-DST nos pacientes e nos controles; comparar a capacidade dos testes de supressão com
dose muito baixa e baixa de dexametasona em identificar um espectro individual de supressão
e casos com menor sensibilidade aos GC; estabelecer correlações entre variáveis clínicas e
laboratoriais e a sensibilidade, in vivo, aos GC, em pacientes com LES fora de atividade.
Casuística e Método: estudo transversal com pacientes portadores de LES e SLEDAI igual a
zero, em uso de prednisona na dose menor ou igual a 5mg/dia e controles saudáveis pareados
por idade e sexo. Foram excluídos os indivíduos com cortisol basal menor que 7µg/dL. Foram
aplicados os testes de supressão com dose muito baixa de dexametasona (20µg/m2) e o teste
oral com dose baixa de dexametasona (dose de 20µg/Kg/dia, dividida de 6/6horas, por 2 dias).
Resultados: A média de idade, na coleta basal, do grupo LES foi semelhante ao grupo
controle (30,6 + 2,4 anos versus 34 + 3,5 anos, p=0,436). Todos os indivíduos eram do sexo
feminino. Não houve diferença entre os grupos em relação às medianas do ACTH e do
cortisol basais. Após 120 minutos do IV-VLD-DST, a amplitude de supressão do cortisol
(F%) foi menor no grupo LES em relação aos controles (23,48% e 53,2%, respectivamente,
p=0,014). Após 48 horas do teste oral com dose baixa de dexametasona, a amplitude de
supressão do cortisol (FOr%) foi semelhante entre os grupos LES e controle (mediana de
94,79% e 93,9%, respectivamente, p=0,414). As medianas da expressão gênica do RGα e NF-
kB no tempo 0 e após 48 horas foram semelhantes entre os grupos e não houve correlação
entre a amplitude de supressão do cortisol pelos testes com dexametasona e a expressão dos
genes estudados. A única variável analisada que se correlacionou com maior amplitude de
supressão do cortisol ao teste IV-VLD-DST foi o maior número de dias transcorridos desde o
último surto de atividade do LES definido por SLEDAI > 6 (r=75,6%, r2=57,1%,p=0,019).
Conclusões: A expressão do RNAm do RGα e do NF-kB nos pacientes com LES em
remissão foi semelhante à encontrada em controles saudáveis. Não houve correlação entre a
expressão desses genes e a resposta ao teste de supressão com dexametasona nos pacientes e
controles. O teste IV-VLD-DST foi eficaz em estabelecer um espectro de sensibilidade in vivo
ao GC. A resposta ao teste oral de supressão com dose baixa de dexametasona foi semelhante
entre os grupos e não apresentou concordância com o IV-VLD-DST. O número de dias
decorridos desde o último surto de atividade do LES se correlacionou com maior
sensibilidade in vivo ao GC.
Palavras-chave: Lúpus Eritematoso Sistêmico, glicocorticoides, receptor de glicocorticoide.
60
ABSTRACT
Melo AKG. Assessment of individual sensitivity to glucocorticoids and glucocorticoid
receptor expression in patients with systemic lupus erythematosus. Master Dissertation
– 2011.
Glucocorticoids (GC) are widely used in systemic lupus erythematosus (SLE) treatment and
most of its effects are mediated by glucocorticoid receptor (GR), which modifies the
expression of target genes. The individual sensitivity to GC is variable and can be assessed by
VLD-IV-DST (very low dose intravenous dexamethasone suppression test). The nuclear
factor kappaB (NF-kB) participates in the regulation of genes involved in inflammatory
cascade and plays an important role in the pathogenesis of immune-mediated diseases such as
SLE. Objectives: to compare the mRNA expression of GRα and NF-kB in peripheral blood
mononuclear cells in SLE patients in clinical remission compared with healthy controls, using
real time PCR; to correlate the expression of these genes with sensitivity to glucocorticoids by
VLD-IV-DST in patients and controls; to compare the ability of the suppression tests with
low and very low dose of dexamethasone in identify a spectrum of sensitivity and cases less
sensitive to GC; to establish correlations between clinical and laboratory variables and
sensitivity to GC, in vivo, in SLE patients in clinical remission. Material and Methods:
Cross-sectional study of patients with SLE and zero SLEDAI, taking prednisone at a dose less
than or equal to 5 mg daily and healthy controls matched by age and sex. We excluded
individuals with basal cortisol less than 7μg/dL. We performed very low dose intravenous
dexamethasone suppression test (20μg/m2) and oral low-dose dexamethasone test
(20μg/Kg/daily, divided every 6 hours for 2 days). Results: The mean age at baseline
collection of blood in SLE group was similar to the control group (30.6 + 2.4 years versus 34
+ 3.5 years, p = 0.436). All subjects were female. There was no difference between the groups
regarding median basal ACTH and cortisol. After 120 minutes of VLD-IV-DST, the extent of
cortisol suppression (F%) was lower in the SLE group compared to controls (23.48% and
53.2% respectively, p = 0.014). After 48 hours of oral low-dose dexamethasone test, the
extent of cortisol suppression (FOr%) was similar between the SLE patients and controls
(median of 94.79% and 93.9% respectively, p = 0.414). The medians of GRα and NF-kB
expression at time 0 and after 48 hours were similar between the groups and there was no
correlation between the extent of cortisol suppression and expression of the genes studied.
The only variable that correlated with greater extent of cortisol suppression after VLD-IV-
DST was the highest number of days elapsed since the last period of SLE activity defined by
SLEDAI > 6 (r = 75.6% r2 = 57.1%, p = 0.019). Conclusions: The mRNA expression of GRα
and NF-kB in SLE patients in remission was similar to that found in healthy controls. There
was no correlation between the expression of these genes and the response to dexamethasone
suppression test in patients and controls. The VLD-IV-DST was effective in establishing a
spectrum of sensitivity to GC in vivo. The response to the oral test suppression with low dose
of dexamethasone was similar between groups and showed no correlation with the VLD-IV-
DST. The number of days elapsed since the last period of SLE activity was correlated with
higher sensitivity to GC in vivo.
Key-words: Systemic lupus erythematosus, glucocorticoids, glucocorticoid receptor
61
APÊNDICE
62
Apêndice 1
63
Apêndice 2
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Nome:________________________________________________Idade:________
Sexo: M( ) F( ) RG:___________________ Nascimento:____/____/_________
Endereço:__________________________________________________________
Telefone:___________________________________
Este texto tem por objetivo informar ao senhor(a) sobre o estudo científico ―Avaliação
da sensibilidade individual aos glicocorticóides e expressão das isoformas alfa e beta do
receptor de glicocorticóide no acompanhamento de pacientes com lúpus eritematoso
sistêmico” e saber se o(a) senhor(a) aceita participar voluntariamente deste estudo, o qual
visa aumentar o conhecimento dos médicos sobre uma doença chamada LÚPUS
ERITEMATOSO SISTÊMICO e sobre os mecanismos de sensibilidade e resistência a um dos
medicamentos mais usados no seu tratamento, os corticóides. Você pode ter sido
convidado(a) a participar do estudo por ter lúpus ou por ser saudável e ter a mesma idade e
sexo de um dos pacientes com lúpus incluído no estudo, para que os pesquisadores possam
comparar os resultados obtidos na presença e na ausência da doença.
Se consentir em participar, o(a) senhor(a) será submetido à retirada de 20 ml de
sangue, como nos exames de rotina, para realizar testes específicos deste estudo. É necessário
também fazer o ―teste de supressão do cortisol‖, onde será injetada uma dose mínima de
dexametasona (dose vinte vezes menor em relação a que se utiliza para tratamento do lúpus).
Não existe nenhum risco grave, mas poderá ocorrer dor no local da punção com agulha e
poderão ocorrer pequenos hematomas após a punção da veia, isto é, o local pode ficar roxo,
mas isso se resolverá em alguns dias. Além disso, o teste de supressão do cortisol é um
exame que demora aproximadamente 2 horas para a coleta de sangue. Para tanto, será
necessário que o(a) senhor(a) fique em repouso durante esse período. O cortisol será
administrado em um dos braços, com uma picada, como a da coleta de sangue, e não causa
nenhuma reação adicional. No outro braço, será colocado um acesso à sua veia para a coleta
de sangue nos diferentes tempos, do mesmo modo que fazemos para dar soro no hospital. A
quantidade de sangue retirada é muito pequena e não vai lhe causar nenhum prejuízo.
Serão necessárias três visitas para a realização do presente estudo. Na visita inicial,
o(a) senhor(a) fará uma avaliação iinicial, com a determinação do seu peso e altura e será
submetido(a) à coleta de sangue como descrito acima. Na segunda visita (após 2 horas do
―teste de supressão‖), o senhor(a) receberá a presecrição de dexametasona na dose de 20
mg/Kg/dia de dexametasona por via oral, dividida de 6/6 horas, a qual deverá ser utilizada
durante 2 dias seguidos, para avaliar se existe uma condição denominada ―hipercortisolismo‖
(aumento de cortisol no sangue). Durante o período de uso do medicamento, poderá haver um
discreto aumento de apetite.
Após dois dias da visita inicial, quando será feita uma nova consulta médica, o(a)
senhor(a) deverá realizar nova coleta de sangue para a determinação do cortisol e do ACTH
64
após 2 horas da última dose de dexametasona oral. Não haverá, nesse momento, a necessidade
de usar a dexametasona intravenosa.
Dependendo dos resultados deste estudo, poderemos contribuir com ampliação do
conhecimento do lúpus, da melhoria do tratamento, além de servir como base para outros
estudos.
Após ter lido essas observações, o(a) senhor(a) deve se sentir livre para decidir se irá
ou não participar do estudo, sabendo que, independente da sua decisão, receberá a mesma
assistência médica. Além disso, é garantido ao senhor(a) o direito de retirar seu consentimento
em qualquer tempo, podendo deixar de participar do estudo mesmo após o seu início, por
qualquer motivo, sem que isso traga qualquer prejuízo à continuidade do seu tratamento nesta
instituição.
O pesquisador médico, Dra. Ana Karla Guedes de Melo, estará sempre disponível para
esclarecer qualquer dúvida que possa surgir, pessoalmente, ou pelo telefone (11) 2176- 7281.
Neste estudo, as informações obtidas de todos os pacientes e pessoas saudáveis que
aceitarem participar serão analisadas em conjunto, não sendo assim divulgados nomes ou
respostas pessoais, as quais serão mantidos em segredo pelos pesquisadores.
Declaro que, após convenientemente esclarecido pelo pesquisador através deste texto e
ainda verbalmente sobre os detalhes deste estudo e ter entendido o que me foi explicado,
consinto em participar da presente pesquisa.
São Paulo, ________de ________________de __________
_____________________________ ______________________________
Assinatura do sujeito da pesquisa ou Assinatura do Pesquisador
Responsável legal
65
Quadro 1: Dados laboratoriais e dados brutos da expressão gênica do RGα e NF-kB de pacientes
com LES e controles
BASAL
120min (IV-
VLD-DST)
48h
GRU
PO
ACTH
1*
CORTISOL
1**
ACTH
2*
CORTISOL
2**
ACTH
3*
CORTISOL
3**
F% FOr%
UE_
RGα1
UE_
RGα3
UE_NF-
kB1
UE_NF-
kB3
L 22 9,6 16 5 2,8 <1,0 47,92% 94,7% 7,900 5,202 18,272 3,624
L 34 13,2 26 10,1 24,9 3,6 23,48% 72,7% 21,550 12,215 283,425 606,063
L 24 10,2 20 14 11,4 <1,0 37,25% 95,1% 9,170 8,537 29,164 51,329
L 16 30,3 6 19,8 4,1 1,4 34,65% 95,3% 27,606 35,271 120,548 1247,934
L 31 10,7 23 8,2 2 2,1 23,36% 80,3% 3,483 28,584 18,139 40,213
L 18 11,7 12 6,1 5,3 <1,0 47,86% 95,7% 34,649 23,322 14,633 7,402
L 20 11,8 21 15 15,4 1,1 27,12% 90,6% 50,698 19,543 203,016 30,931
L 10 9,3 5 7,9 5 2,1 15,05% 77,4%
53,835
13,777
L 42 13,5 36 7 30,4 <1,0 48,15% 96,3%
9,803
6,077
C 5 10,3 7 4,3 5 <1,0 58,25% 95,1% 7,718 20,240
31,970
C 5 26,4 5 14,6 5 <1,0 44,70% 98,1% 13,981 0,112 2,920 0,641
C 5 20,5 5 12 5 2,8 41,46% 86,3% 1,580 470,76 0,295 213,150
C 5 16,7 5 7,4 5 1,3 55,69% 92,2% 2,770
0,377
C 25 29,9 6 14,6 5,3 <1,0 51,17% 98,3% 9,495
227,885
C 14 18,3 7 5,5 9,9 3 69,95% 83,6%
C 40 7,2 26 6,1 5 <1,0 15,28% 93,0% 128,08
811,111
C 12 9 10 5,2 5,6 <1,0 42,22% 94,4%
5,078
C 55 26,1 14 10,5 9,3 <1,0 59,77%
98,08
%
C 11 21 6 9,4 5,5 1,4 55,24% 93,3%
L: paciente com LES; C: controle saudável; *: pg/mL; **:µg/dL; F%: amplitude de supressão do cortisol
após IV-VLD-DST; FOr%: amplitude de supressão do cortisol após o teste oral com dexametasona; UE:
unidades de expressão
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