ANA PAULA CARNEIRO DOS SANTOS -...

ANA PAULA CARNEIRO DOS SANTOS

Construção e seleção de uma biblioteca de

anticorpos monoclonais scFv contra células

tumorais de tireóide

CAMPINAS-SP

2010

ii

ANA PAULA CARNEIRO DOS SANTOS

Construção e seleção de uma biblioteca de

anticorpos monoclonais scFv contra células

tumorais de tireóide

Orientadora: Laura Sterian Ward

Co-orientador: Luiz Ricardo Goulart

CAMPINAS-SP

2010

Dissertação de Mestrado apresentada á Pós-

Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da

Universidade Estadual de Campinas para obtenção

do título de Mestre em Ciências Médicas, área de

concentração Clínica Médica

v

Dedicatória

À minha mãe Adagmar, pelo exemplo de vida, amor e o incentivo de todos os dias.

Ao meu irmão Guilherme, pelo apoio e força em todos os momentos.

vi

Agradecimentos

Gostaria de agradecer a todos que, de maneiras diferentes, contribuíram para este trabalho:

Ao Deus, por todas as graças que tenho alcançado e por me dar saúde, sabedoria e

perseverança para finalizar mais uma etapa da minha formação.

Agradeço imensamente a minha mãe, Adagmar Batista Carneiro, e ao meu irmão

Guilherme Carneiro, pelo amor, amizade e pelo grande apoio.

Aos meus orientadores Dra. Laura Sterian Ward e Dr. Luiz Ricardo Goulart pela

oportunidade de realizar essa pesquisa e por todo o conhecimento a mim transmitido.

A querida Carol, pelo companheirismo em todos os momentos do Mestrado, no laboratório,

nas longas viagens, nas coletas das amostras no Centro Cirúgico... Sem a Carol tudo teria

sido mais difícil.

A minha família, em especial a minha tia Ivone e Sheila Tatiana que sempre torceram pelo

meu sucesso!

Agradeço aos meus companheiros de trabalho do Laboratório de Nanobiotecnologia da

UFU: Ana Carolina, Ângela, Carlos, Carolina, Érica, Janaína, Fabiana, Fausto, Juliana,

Karina, Flávia, Larissa Goulart Patrícia, Paula Cristina, Paula Sousa, Rafael, Rone, Thaise,

Washington, Galber e Yara.

Ao Carlos Ueira, pelos importantes conselhos e esclarecimentos, que foram fundamentais

para a minha formação acadêmica.

A querida Yara Cristina de Paiva Maia, pela apoio em vários momentos difíceis e

importante ajuda com a Estatística.

A querida Patrícia Tieme, pelo carinho e exemplo de força e coragem.

vii

Ao Rafael Nascimento, pelo apoio, ajuda e pelos momentos de descontração.

A equipe médica da Cirurgia Cabeça e Pescoço do Hospital de Clínicas da Universidade

Federal de Uberlândia, em especial ao Dr. Sindeval pela confiança e oportunidade de

coletar as amostras.

A Valeska Guzman, pelo exemplo de pesquisadora e por nos apresentar

à Dra. Janethe Pena, que nos ajudou com a cultura de células.

As professoras Maria Aparecida de Souza (Cida) e Janethe Pena, por todos os ensinamentos

sobre cultura de células e também por disponibilizar o laboratório para realizarmos as

culturas.

A Dra. Janete Cerruti por fornecer as células tumorais de tireóide (NPA).

Ao Dr. Fernando Augusto Soares pela doação das lâminas de Micro-arranjo de tecido

(TMA).

Ao Dr. José Vassallo, por disponibilizar seu laboratório para fazer as imunoistoquímicas e

pela gentileza em nos ajudar a analisar as lâminas. E ao Paulo, pela ajuda nos experimentos.

Meu sincero agradecimento a Elaine Cristina Morari, pelos inúmeros favorzinhos e ajuda

com a imunoistoquímica na Unicamp e no Hospital AC Camargo.

A Natássia, Cristina e Aline pelas hospedagens...

A todos do laboratório GEMOCA, que de alguma forma contribuíram para este trabalho.

A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa de

mestrado.

viii

Resumo

Fragmentos de anticorpos recombinantes têm se tornado ferramentas importantes em

diversas áreas, tais como: Biologia Molecular, Farmacêutica e pesquisa Médica. Avanços

recentes estão relacionados à aplicação desses anticorpos na oncologia, com estratégias

diagnósticas e terapêuticas para diferentes carcinomas. Neste estudo, uma biblioteca de

fragmentos de anticorpos monoclonais scFv foi construída utilizando RNA total de sangue

periférico de 25 pacientes com Carcinoma Diferenciado da Tireóide. Essa biblioteca scFv

foi selecionada utilizando os métodos Bioppaning and Rapid Analysis of Selective

Interactive Ligands (BRASIL) e Phage display contra células tumorais de tireóide, com o

objetivo de encontrar ligantes específicos a superfície celular tumoral. Os clones

selecionados foram identificados por Dot blotting, e a reatividade contra proteínas de

tumor, adenoma e bócio foi analisada por Elisa. O clone scFv-C1 apresentou melhor

reatividade pelas proteínas tumotais e foi escolhido para a imunoistoquímica. Esta foi

realizada com lâmina de Micro-arranjo de tecido (TMA) com duzentos e vinte nove casos

de tireóide, sendo 110 Carcinomas, 52 Adenomas Foliculares, 49 Bócios e 18 tecidos

normais de tireóide. O anticorpo scFv-C1 reagiu especificamente aos tecidos de câncer,

com reatividade ao citoplasma das células tumorais, foi capaz de distinguir o Grupo Câncer

do Controle (Bócio, Adenoma e tireóide normal) com significância estatística (p<0,0001) e

entre os carcinomas reagiu melhor com os tumores pequenos (TNM 1 e 2) e com pouca

agressividade (p=0,050). O fragmento de anticorpo scFv-C1 pode ser um potencial

candidato a biomarcador para o diagnóstico do Câncer de tireóide.

ix

Abstract

Recombinant antibody fragments have become important tools in several fields, including

molecular biology, pharmaceutical and medical research. In this study, a human single-

chain variable fragment (scFv) antibody library was constructed using total RNA of

leukocyte cells obtained from blood of patients with well differentiated thyroid carcinoma.

This scFv antibody library was selected using the Biopanning and Rapid Analysis of

Selective Interactive Ligands method (BRASIL) and Phage display technology against

tumor thyroid cells, aiming to find specific cell-surface binders. The selected clones were

identified by dot blot and ELISA assays and their reactivity analyzed against tumor, goiter

and adenoma proteins. One clone (scFv-C1) presented the highest reactivity ratio between

cancer and the control group (goiter and adenoma) and was chosen for further analysis.

Immunohistochemistry was performed by means of Tissue Microarray with two hundred

and twenty-nine thyroid cases (110 carcinomas, 52 follicular adenomas, 49 goiters and 18

normal tissues) including 38 papillary, 42 follicular and 30 variant follicular in the

carcinoma group. The scFv-C1 reacted specifically to cancer tissues sections, showed

strong reactivity with cytoplasm and was able to distinguish cancer to control groups

(goiter, adenoma and normal thyroid) with statistically significance (p<0,0001). The scFv-

C1 fragment antibody described here may be a potential biomarker candidate for

diagnostics and prognostics of thyroid cancer.

x

Lista de Abreviaturas

% Porcentagem

°C Graus Celsius

µg Microgramas

mL Microlitros

mm Micrometro

mM Micromolar

BCIP 5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato

BSA Soro-albumina bovina

cDNA Ácido desoxirribonucléico complementar

DNA Ácido desoxirribonucléico

DEPC Dietil pirocarbonato

dNTP Desoxirribonucleotídeo trifosfatado

O.D. Densidade ótica

DTT Ditiotreitol

EDTA Ácido etilenodiamino tetracético

ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

g Grama

IgG Imunoglobulina G

IPTG Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosideo

kDa Quilodalton

L Litro

M Molar

M13KE Bacteriófago filamentoso

mA Miliampere

mRNA Ácido ribonucléico mensageiro

NBT Cloreto nitroblue tetrazolium

ng Nanogramas

xi

Ni Níquel

rpm Rotações por minuto

RNA Ácido ribonucléico

pmol Picomol

pb Pares de base

PBS Tampão salina fosfato

pComb3XSS Fagomídeo

PCR Reação em cadeia da polimerase

PEG Polietilenoglicol

pH Potencial de Hidrogênio

p/v Peso por volume

scFv single-chain Fv fragment

SDS Dodecil sulfato de sódio

Taq Enzima Taq DNA polimerase de Thermus aquaticus

TBS Tampão tris-base salino

TMA Micro-arranjo de tecido

U Unidade de enzima

ufc Unidades formadoras de colônias

UFU Universidade Federal de Uberlândia

Unicamp Universidade Estadual de Campinas

xii

Lista de Tabelas

Tabela 1. Oligonucleotídeos utilizados no trabalho. -------------------------------------------------- 23

Tabela 2. Seqüência de aminoácidos de clones VL (Cadeia variável leve: kappa ou

lambda) obtidos no programa IgBlast. ------------------------------------------------------------- 62

Tabela 3. Características dos pacientes da lâmina de micro-arranjo (TMA) ---------------------- 68

Tabela 4. Resultado da marcação do fragmento de anticorpo scFv- C1 para as variáveis a

anátomo patológicas dos casos de tireóide analisados por micro-arranjo de tecido

(TMA) -------------------------------------------------------------------------------------------------- 70

Tabela 5. Comparação entre a marcação positiva do anticorpo scFv-C1 e as variáveis

anátomo patológicas das casos de tireóide analisados por micro-arranjo de tecido

(TMA) -------------------------------------------------------------------------------------------------- 71

Tabela 6. Análise da intensidade e área da marcação entre os grupos com o teste ANOVA-

Bonferroni ---------------------------------------------------------------------------------------------- 73

xiii

Lista de Figuras

Figura 1. Estrutura básica de um anticorpo IgG. ------------------------------------------------------ 10

Figura 2. Representação esquemática de diferentes formatos de fragmentos de anticorpos. --- 11

Figura 3. Representação esquemática do fragmento scFv. ------------------------------------------- 12

Figura 4. Estrutura básica de um bacteriófago filamentoso. ----------------------------------------- 14

Figura 5. Ciclos de seleção de proteínas ligantes a partir de uma biblioteca de Phage

Display -------------------------------------------------------------------------------------------------- 17

Figura 6. Vetor fagomídeo pComb3X usado na construção de bibliotecas combinatoriais

de anticorpos. ------------------------------------------------------------------------------------------ 22

Figura 7. Esquema da construção e seleção da biblioteca de scFv de pacientes com

carcinoma diferenciado de tireóide. ---------------------------------------------------------------- 24

Figura 8. Método BRASIL de seleção de ligantes na superfície celular. -------------------------- 44

Figura 9. Análise do produto da amplificação das regiões variáveis da cadeia pesada (VH),

cadeia leve (VL) e do fragmento de anticorpo scFv. -------------------------------------------- 61

Figura 10. Culturas de células humanas de tireóide visualizada em microscópio invertido63

Figura 11. Dot Immunoblotting para análise da expressão dos fragmentos de anticorpos em

cultura induzida por IPTG. -------------------------------------------------------------------------------- 64

Figura 12. Gel SDS-PAGE para análise das proteínas extraídas de tecidos tireoidianos. ------- 65

Figura 13. Reatividade do fragmento de anticorpo scFv nas células tumorais de tireóide. ----- 69

xiv

Lista de Gráficos

Gráfico 1. Elisa para análise da reatividade dos scFvs selecionados. ------------------------------- 66

Gráfico 2. Análise da intensidade e área da coloração na lâmina TMA. ---------------------------- 72

xv

Lista de Quadros

Quadro 1. Classificação do Carcinoma da Tireóide de acordo com a 6ª edição da UICC

(International Union Against Cancer) -------------------------------------------------------------- 54

Quadro 2. Classificação do TNM dos pacientes da lâmina TMA ----------------------------------- 55

xvi

Sumário

1-Introdução ----------------------------------------------------------------------------------------------- 1

1.1- Câncer ---------------------------------------------------------------------------------------------- 2

1.2- Câncer de tiróide ---------------------------------------------------------------------------------- 3

1.2.1-Epidemiologia -------------------------------------------------------------------------------- 3

1.2.2- Nódulos de tireóide ------------------------------------------------------------------------- 3

1.2.3-Diagnóstico do carcinoma de tireóide ---------------------------------------------------- 4

1.3-Resposta imune contra tumores ----------------------------------------------------------------- 6

1.4-Imunoglobulinas ----------------------------------------------------------------------------------- 8

1.5- Fragmentos de anticorpos ---------------------------------------------------------------------- 10

1.6- Apresentação de fragmentos de anticorpos scFv por Phage display --------------------- 12

2-Objetivos ------------------------------------------------------------------------------------------------ 18

2.1- Objetivo Geral ----------------------------------------------------------------------------------- 19

2.2- Objetivos Específicos --------------------------------------------------------------------------- 19

3- Material e métodos ----------------------------------------------------------------------------------- 20

3.1- As soluções utilizadas estão descritas no ANEXO 1. -------------------------------------- 21

3.2-Linhagem de Células Humanas ---------------------------------------------------------------- 21

3.3- Linhagens Bacterianas -------------------------------------------------------------------------- 21

3.4- Vetor fagomídeo --------------------------------------------------------------------------------- 21

3.5- Bacteriófago auxiliar ---------------------------------------------------------------------------- 22

3.6- Oligonucleotídeos Sintéticos ------------------------------------------------------------------ 22

3.7- Construção da Biblioteca de anticorpos: Amplificação das Sequências

Codificadoras de VH e VL por PCR e Montagem do scFv ------------------------------------- 24

3.7.1- Obtenção das amostras e extração de RNA total de Linfócitos dos Pacientes

com Carcinoma de Tiróide -------------------------------------------------------------------------- 25

xvii

3.7.2- Síntese da primeira fita de cDNA -------------------------------------------------------- 25

3.7.3- Primeiro ciclo de PCR --------------------------------------------------------------------- 26

3.7.4- Precipitação e purificação dos produtos de PCR -------------------------------------- 28

3.7.5- Amplificação dos fragmentos scFv ------------------------------------------------------ 29

3.7.6- Precipitação e purificação dos produtos de PCR -------------------------------------- 30

3.7.7- Restrição dos scFvs obtidos por PCR e do vetor pComb3XSS com a Enzima

SfiI ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 30

3.7.8- Ligação do scFv com o vetor pComb3XSS digeridos com a Enzima SfiI e

purificados --------------------------------------------------------------------------------------------- 31

3.7.9- Ligação definitiva dos fragmentos de DNA scFv com o vetor pComb3X --------- 32

3.8- Análise do repertório da biblioteca de scFv ------------------------------------------------- 33

3.9- Seleção da biblioteca ---------------------------------------------------------------------------- 33

3.9.1- Preparação de células eletrocompetentes ----------------------------------------------- 33

3.9.2- Preparação do fago auxiliar VCSM13 -------------------------------------------------- 34

3.9.2.1- Obtenção de placas de lise ------------------------------------------------------------ 34

3.9.2.2- Amplificação de placas de lise ------------------------------------------------------- 35

3.9.2.3- Determinação do título da preparação de fagos auxiliares ----------------------- 35

3.9.3- Transformação de Células de Escherichia coli por Eletroporação com a

Biblioteca----------------------------------------------------------------------------------------------- 36

3.9.4- Preparação de DNA plasmidial em placas de microtitulação ------------------------ 38

3.9.5- Reamplificação da biblioteca ------------------------------------------------------------- 40

3.9.6- Cultura de células humanas de tireóide ------------------------------------------------- 41

3.9.6.1- Congelamento de células humanas -------------------------------------------------- 42

3.9.6.2- Descongelamento de células humanas ---------------------------------------------- 42

3.9.7- Seleção da biblioteca de scFv contra células humanas de tireóide pelo método

BRASIL ------------------------------------------------------------------------------------------------ 43

xviii

3.9.8- Transformação de bactérias eletrocompetentes com a biblioteca scFv

selecionada --------------------------------------------------------------------------------------------- 45

3.10- Produção de scFv na forma solúvel --------------------------------------------------------- 46

3.11- Detecção de proteína recombinante por Dot blot ----------------------------------------- 47

3.12- Ensaio de Imunoadsorção por ligação enzimática (ELISA) para seleção dos

fragmentos de anticorpos scFv com maior afinidade às proteínas de tumor de tireóide ---- 47

3.12.1- Tecidos tireoidianos ---------------------------------------------------------------------- 47

3.12.2- Extração de proteínas totais ------------------------------------------------------------- 48

3.12.3- ELISA -------------------------------------------------------------------------------------- 48

3.12.4 Gráficos ------------------------------------------------------------------------------------- 49

3.13- Sequenciamento de DNA --------------------------------------------------------------------- 49

3.14- Purificação de scFv por cromatografia de afinidade em HPLC ------------------------- 50

3.15- Ensaios de Western Blotting ------------------------------------------------------------------ 51

3.16- Imunoistoquímica ------------------------------------------------------------------------------ 52

3.16.1- Procedimento ------------------------------------------------------------------------------ 52

3.16.2- Estadiamento dos tumores dos pacientes da lâmina de micro-arranjo de

tecido (TMA) ------------------------------------------------------------------------------------------ 54

3.16.3- Leitura dos resultados -------------------------------------------------------------------- 56

3.16.4- Análise estatística ------------------------------------------------------------------------- 57

4-Resultados ---------------------------------------------------------------------------------------------- 59

4.1- Amplificação dos fragmentos da cadeia pesada (VH) e da cadeia leve (VL) e dos

fragmentos scFv --------------------------------------------------------------------------------------- 60

4.2- Análise do repertório da biblioteca de scFv ------------------------------------------------- 60

4.3- Culturas de células humanas de tireóide ----------------------------------------------------- 63

4.4- Análises dos clones selecionados ------------------------------------------------------------- 64

4.4.1- Análise Monoclonal por Dot Immunoblotting ----------------------------------------- 64

xix

4.4.2- Ensaio de Imunoadsorção por ligação enzimática (ELISA) para seleção dos

fragmentos de anticorpos scFv com maior afinidade às proteínas de tumor de tireóide ---- 65

4.4.2.1- Análise das proteínas utilizadas no ensaio ELISA por eletroforese em gel

SDS-PAGE -------------------------------------------------------------------------------------------- 65

4.4.2.2- Elisa em extrato protéico -------------------------------------------------------------- 65

4.4.3- Clone selecionado para imunoistoquímica --------------------------------------------- 67

4.4.4- Análise in Silico do clone selecionado -------------------------------------------------- 67

4.5- Imunoistoquímica ------------------------------------------------------------------------------- 67

5- Discussão ---------------------------------------------------------------------------------------------- 74

6- Conclusão ---------------------------------------------------------------------------------------------- 79

7-Referências Bibliográficas --------------------------------------------------------------------------- 81

8- ANEXOS ---------------------------------------------------------------------------------------------- 90

1

1-INTRODUÇÃO

2

1.1- Câncer

Existem evidências da existência do câncer desde que as primeiras civilizações

humanas começaram a deixar registros de suas atividades. Essa doença já era bem

conhecida na sociedade egípcia, mas como sempre esteve associada à velhice e só se tornou

mais evidente em meados do século XIX, quando a expectativa média de vida da população

como um todo, aumentou consideravelmente. Atualmente, a principal causa de morte no

mundo são as doenças do coração, e nos países subdesenvolvidos, doenças como

desnutrição e infecções parasitárias são problemas ainda mais sérios do que o câncer. No

entanto, estima-se que, no mínimo, um em cada três indivíduos vai desenvolver algum tipo

de câncer (Franks e Teich, 1997).

O termo câncer descreve um processo de doença caracterizado por uma proliferação

celular descontrolada que leva à formação de um tumor, também chamado neoplasma ou

neoplasia (Thompson e Thompson, 2002). O câncer ocorre devido a danos genéticos

herdados e/ou adquiridos que alteram a expressão ou as propriedades bioquímicas de genes

envolvidos na regulação do crescimento e diferenciação celular (Bishop, 1987; Knudson,

1993; Ward, 1997). Anormalidades tanto nos genes estimuladores de divisão celular

(chamados de proto-oncogenes), como nos protetores ou bloqueadores do ciclo celular

(chamados de genes supressores tumorais), podem conferir a uma célula vantagens de

crescimento e desenvolvimento sobre as células normais (Ward e Fagin, 1998). Os genes

que controlam o tempo de vida ou a morte celular, como o gene da telomerase, os genes

envolvidos na apoptose e os genes de reparo do DNA também intervêm diretamente no

processo de tumorigênese (Ward, 1997).

3

1.2- Câncer de tiróide

1.2.1-Epidemiologia

O câncer de tireóide é considerado raro embora seja o tumor endócrino mais freqüente

(Jemal et al., 2008; American Cancer Society, 2003). O Carcinoma Diferenciado da Tireóide

(CDT) corresponde a aproximadamente 1% de todos os tipos de câncer (Hundahl et al., 2000;

Jemal et al., 2004) e de acordo com o Instituto Nacional do Câncer (INCA, 2009) é o câncer

mais comum da região da cabeça e pescoço e três vezes mais freqüente no sexo feminino.

A freqüência do CDT tem aumentado progressivamente cerca de 3% ao ano por

fatores etiopatogênicos desconhecidos e devido à melhora nos métodos de diagnóstico.

Estima-se a ocorrência de mais de 300.000 casos nos Estados Unidos da América, 37.200

casos novos sendo diagnosticados em 2009, com 1630 mortes relacionadas ao câncer de

tireóide (National Cancer Institute, 2009).

1.2.2- Nódulos de tireóide

Nódulos de tireóide são extremamente comuns. Estima-se que 10% da população

venham a desenvolver um nódulo palpável durante a vida e vários dados indicam que este

número deve ser ainda maior no Brasil, onde, há poucas décadas atrás, ainda havia extensas

áreas carentes de aporte adequado de iodo na alimentação (Welker e Orlov, 2003; Knobel e

Medeiros-Neto, 2004; Tomimori et al., 1995; Furlanetto et al., 2000). Mais recentemente, o

uso da ultra-sonografia como método acessível a grandes populações e de custo

relativamente pequeno em nosso meio, vem aumentando sensivelmente o número de

pacientes com nódulos diagnosticados já que a ultra-sonografia diagnostica nódulos em até

67% da população (Chow et al., 2003; Hegedus et al., 2003; Tan e Gharib, 1997). No

entanto, a maioria dos nódulos tireoidianos é causada por doenças benignas, como nódulos

4

colóides, cistos e neoplasias Foliculares benignas, de modo que menos de 5% dos pacientes

são portadores de câncer de tireóide (Tan e Gharib, 1997; Hegedus et al., 2003).

Os tumores benignos da tireóide são denominados Adenomas. São raros, de origem

epitelial, bem encapsulado, não invadem os tecidos vizinhos e não produzem metástases. Os

tumores malignos da tireóide são raros e apresentam quadros clínicos extremamente variáveis,

desde aqueles com crescimento muito lento e compatível com uma expectativa de vida normal,

até aqueles com péssima evolução e que levam ao óbito em períodos de semanas ou meses

(Morari, 2006).

O Carcinoma Papilífero é o mais freqüente tipo de câncer de tireóide, acomete

aproximadamente 85% dos casos diagnosticados (Jemal et al., 2008). Cerca de 10% dos

carcinomas diferenciados são classificados de Foliculares. O carcinoma de tireóide medular é

derivado de células C para-Foliculares, tem uma taxa de herança familiar de aproximadamente

10% e é responsável por cerca de 5% dos cânceres da tiróide (Robbins et al., 1991). Há ainda

um pequeno número de carcinomas indiferenciados denominados tumores anaplásicos que são

mais agressivos e fatais.

1.2.3-Diagnóstico do carcinoma de tireóide

O exame de ultra-som (US) é muito empregado no diagnóstico dos nódulos

tireoidianos benignos e malignos, muitas vezes o nódulo é descoberto a partir de um US de

rotina. No entanto, seus achados são muito inespecíficos para caracterização do nódulo,

quanto à sua natureza (Barraclough e Barraclough, 2000).

Assim, o diagnóstico de CDT necessita de confirmação citológica ou histológica. A

aspiração por agulha fina (PAAF) é a forma mais interessante, do ponto de vista custo-

efetividade, para distinguir lesões benignas de malignas. Na maior parte dos casos, a

5

citologia obtida na punção aspirativa por agulha fina possibilita adequado planejamento

cirúrgico. Entretanto, principalmente nas lesões Foliculares denominadas “suspeitas” para

Carcinoma Folicular ou neoplasia de Hürthle, o diagnóstico definitivo do CDT depende de

cuidadoso exame anatomopatológico. A invasão da cápsula do nódulo ou de vasos é

essencial para o diagnóstico de Carcinoma Folicular (incluindo a variante de Hürthle)

(Schlumberger e Torlantano, 2000).

Com isso, o diagnóstico citológico das lesões de padrão Folicular não é tão simples.

É difícil distinguir Adenomas de Carcinomas Foliculares, além de vários casos de

Carcinomas Papilíferos de variante Folicular e mesmo casos de hiperplasias poderem se

assemelhar. Marcadores moleculares de malignidade como a galectina- 3, as citoqueratinas

e o HBME-1, entre outros, podem ajudar no diagnóstico, embora nenhum marcador tenha

se mostrado particularmente útil até o presente momento (Schlumberger e Torlantano,

2000; Boone et al., 2003; Matos et al., 2005).

Pesquisadores têm buscado intensamente marcadores moleculares que possam, ao lado

dos clássicos parâmetros clínicos e anatomopatológicos, distinguirem pacientes com tumores

que poderiam evoluir de forma desfavorável daqueles com melhor prognóstico, e assim

determinar um tratamento mais apropriado para cada indivíduo, minimizando os riscos

cirúrgicos e o custo efetivo de cada tratamento (Ward e Assumpção, 2004). Os pacientes de

alto risco poderiam ser alvo de uma abordagem cirúrgica mais agressiva e de um seguimento

mais próximo, em oposição à grande maioria de casos de bom prognóstico, ou baixo risco, que

poderiam ser poupados de tais medidas (Mazzaferri e Jhiang, 1994; Zidan et al., 2003; Ward

et al., 2003; Souza et al., 2003).

6

Portanto, a busca de marcadores para esses tumores é importante para melhorar

tanto o diagnóstico como o prognóstico, assim como para diminuir o número de cirurgias

desnecessárias.

1.3-Resposta imune contra tumores

A possibilidade de que cânceres possam ser erradicados por respostas imunológicas

específicas foi o ímpeto para grande quantidade de trabalhos no campo da imunologia

tumoral. O conceito de vigilância imunológica, proposto por Macfarlane Burnet na década

de 1950, afirma que uma função fisiológica do sistema imunológico é reconhecer e destruir

clones de células transformadas antes que eles se transformem em tumores e destruir os

tumores depois que já estão formados. Embora a importância da vigilância imunológica

tenha sido controversa, está claro que o sistema imunológico de fato reage contra muitos

tumores, e o aproveitamento dessas reações para destruir tumores de forma específica

continua sendo um objetivo dos pesquisadores (Abbas et al., 2000).

A imunidade contra tumores é mediada por células Natural killer (NK), macrófagos

do sistema imune inato; linfócitos T e anticorpos do sistema adaptativo. Ocorre a partir do

reconhecimento de antígenos tumorais expressos pelos tumores. Contudo, a maioria dos

tumores é fracamente imunogênica e as respostas imunológicas com freqüência não

previnem o crescimento de tumores (Abbas et al., 2000). Além do sistema imune não

eliminar com eficácia as células tumorais, o estudo de Lewis e Pollard (2006) detalhou que

os macrófagos podem ser “reeducados” pelas células cancerosas para tornarem fábricas de

citocinas e fatores de crescimento que nutrem o desenvolvimento tumoral. Ou seja, os

7

tumores interceptam o sistema imune para promover seu próprio crescimento e

sobrevivência.

Com relação aos antígenos tumorais que desencadeiam uma resposta imune no

paciente, estes podem ser de vários tipos, tais como: produtos de oncogenes e genes

supressores de tumorais, mutantes de genes celulares não envolvidos em tumorigênese,

produtos de genes que são silenciosos na maioria dos tecidos normais, produtos de genes

hiperexpressos, produtos de vírus oncogênicos, antígenos oncofetais, glicolipídeos e

glicoproteínas, antígenos de diferenciação normalmente presentes no tecido de origem

(Abbas et al., 2000). Esses antígenos podem ser utilizados como marcadores tumorais

auxiliando o diagnóstico precoce e prognóstico do câncer.

Tradicionalmente, a maioria dos métodos de identificação de marcadores tumorais é

baseado em anticorpos monoclonais (mAbs). Os mAbs são gerados tanto pela tecnologia de

hibridoma, quanto por bibliotecas de anticorpos (Popkov, 2004), as quais podem ser do tipo

naïve, semi-sintética ou completamente sintética (Hust e Dubel, 2004). Diversas são as

vantagens apresentadas por anticorpos recombinantes, tais como: podem ser produzidos em

bactérias, fungos ou plantas, não necessitam de imunização e as suas propriedades

intrínsecas que incluem imunogenicidade, afinidade, especificidade e estabilidade podem

ser aprimoradas por tecnologias mutagênicas (Pansri et al., 2009). A construção e seleção

de bibliotecas combinatórias de anticorpos expressos em fagos filamentosos tem se tornado

uma alternativa na busca de clones antígeno-específicos, sem reatividade cruzada, mas com

aplicação diagnóstica e terapêutica (Kim et al., 2005).

A técnica de bibliotecas apresentadas na superfície de fagos permite a utilização não

de apenas um anticorpo monoclonal, mas de uma vasta biblioteca de anticorpos ou

peptídeos contra o conjunto das proteínas do tumor. Desde a sua concepção, a técnica de

8

Phage display vem sendo empregada visando à identificação de marcadores tumorais

(Austin, 1989).

1.4-Imunoglobulinas

As imunoglobulinas são moléculas capazes de localizar, reconhecer e ligar-se a

antígenos específicos com a finalidade de inativar ou dar início a eliminação destes. Essas

moléculas são produzidas por linfócitos B, são glicoproteínas de massa molecular elevada,

em torno de 150 kDa, e estão presentes por exemplo no sangue circulante e na linfa

(Silverton, 1977).

As imunoglobulinas são de natureza tetramérica, compostas por duas cadeias leves e

duas cadeias pesadas, unidas por uma extensiva rede de interações não-covalentes,

estabilizadas por pontes dissulfeto. Tanto as cadeias leves quanto as pesadas contêm uma

série de unidades homólogas repetidas, cada uma com cerca de 110 resíduos de

aminoácidos que se enovelam independentemente em um motivo globular classificado

como Domínio Imune (Padlan, 1994).

A cadeia leve é composta por uma porção variável (VL) e uma porção constante

(CL), e a cadeia pesada é composta de uma porção variável (VH) e três ou quatro porções

constantes, dependendo da classe de imunoglobulina, chamadas de CH1, CH2, CH3 e CH4

(Figura 1). A região constante da cadeia leve pode apresentar dois tipos de domínios

segundo suas seqüências de aminoácidos: kappa (κ) ou lambda (λ). Já as regiões constantes

das cadeias pesadas são constituídas de três ou quatro domínios agrupando-se em cinco

padrões diferentes de seqüências de aminoácidos designadas pelas letras do alfabeto grego

α, δ, ε, γ e μ. Esse último é o critério determinante da classe ou isótipo ao qual o anticorpo

9

pertence, podendo este ser uma IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM, correspondendo,

respectivamente, aos cinco tipos de regiões constantes (Abbas et al., 2000).

A imunoglobulina pode ser subdividida em porções Fc e Fab, a Fab é constituída

pelos domínios VH-CH1 e VL-CL, no qual a regiões variáveis (V) determinam a

especificidade, diversidade e afinidade da ligação ao antígeno. Em cada domínio variável

existem três regiões hipervariáveis, essas regiões são responsáveis pelo reconhecimento

antigênico com a formação de um sítio complementar ao epítopo (região que é reconhecida

no antígeno), essas regiões hipervariáveis são também chamadas de regiões determinantes

de complementaridade (CDRs) (Weisser, 2009).

As três CDRs de cada cadeia são nomeadas como CDR1, CDR2 ou CDR3, ou

então, H1, H2, H3 e L1, L2, L3, explicitando a cadeia a qual pertencem, pesada ou leve,

respectivamente. As regiões que intercalam as CDRs são conhecidas como arcabouço

(Framework – FW) dos domínios variáveis (Abbas et al., 2000).

Além da porção Fab responsável pelo reconhecimento de antígenos, a

imunoglobulina é constituída pela porção Fc que é responsável por manter a estrutura do

anticorpo, determinar a meia- vida sérica e desencadear funções efetoras. Entre as funções

efetoras está a liberação de citocinas, a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e

a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Com relação à função ADCC

nas células, tumorais a ativação do sistema imune ocorre da seguinte maneira, após a

ligação do anticorpo a um antígeno da superfície celular tumoral a porção Fc pode interagir

com células efetoras de sistema imune como as células NK, que provocam a lise celular

pela liberação de granzimas e perforinas, os debris celulares resultantes da lise celular são

apresentados aos Linfócitos T e B que agirão especificamente nas células tumorais (Adams,

2005).

10

Figura 1. Estrutura básica de um anticorpo IgG. Cadeias pesadas (azul); cadeias leves

(amarelo); domínios variáveis (VH e VL). A molécula de IgG possui um carboidrato na

região N- terminal ligado ao aminoácido Asn297 do domínio CH2. A ligação funcional do

antígeno é mediada pela porção Fab, sendo a especificidade ao antígeno determinada pela

porção Fv. As funções biológicas efetoras são mediadas pela região Fc da molécula

(Adaptado de Weisser e Hall, 2009)

1.5- Fragmentos de anticorpos

Fragmentos de anticorpos recombinantes (rAb) estão se tornando alternativas em

relação ao uso de anticorpos monoclonais inteiros uma vez que são menores, possuem

diferentes propriedades vantajosas em determinadas aplicações médicas (diagnóstica e

terapêutica), podem ser produzidos de forma mais econômica e são facilmente alteráveis

por manipulação genética (Weisser, 2009). Uma grande variedade de formatos de rAb

(Figura 2) tem sido construídos para diversas aplicações, tais como: biomarcadores de

doenças, acoplados a reagentes incluindo drogas e toxinas para o tratamento do câncer,

vírus para terapia gênica, lipossomos para melhorar a entrega de drogas e biosensores para

detecção em tempo real das moléculas alvo (Hollinger e Hudson, 2005).

11

Figura 2. Representação esquemática de diferentes formatos de fragmentos de anticorpos. Uma

molécula clássica de IgG é mostrada e também uma variedade de fragmentos de anticorpos, incluindo scFv,

Fab, Bis-scfv, diabodies, triabodies e tetrabodies (Adaptado de Hollinger e Hudson, 2005).

Um dos tipos mais populares de rAb são scFvs (single-chain variable fragment),

cuja massa molecular é de 26 a 28 kDa, são compostos pelas cadeias VH e VL unidas por

um peptídeo conector flexível (Maynard e Georgiou, 2000) (Figura 3). Os primeiros scFvs

foram desenvolvidos independentemente por Huston et al. (1988) e Bird et al. (1988) e

foram originalmente derivados de genes isolados de linhagens celulares de hibridomas. Os

peptídeos conectores que ligam as cadeias VH e VL são usualmente compostos por 10 a 25

aminoácidos, sendo o decapeptídeo (Gly4Ser)3 o mais comum deles. As regiões variáveis

podem ser conectadas no sentido VH-conector-VL ou VL-conector-VH e a orientação das

cadeias no scFv pode afetar a eficiência da expressão (Merk et al., 1999), a estabilidade e a

capacidade de ligação do mesmo ao antígeno (Desplancq et al., 1994).

12

Figura 3. Representação esquemática do fragmento scFv. Os domínios VH e VL presentes na

molécula scFv aparecem nas cores verde e vermelho, respectivamente. O polipeptídeo (peptide

linker) estabilizador dos domínios está indicado em azul.

1.6- Apresentação de fragmentos de anticorpos scFv por Phage

display

Diversas metodologias de apresentação de moléculas na superfície de vírus e células

têm sido descritas, incluindo as técnicas de Phage-Display (Ph.D.) (McCafferty et al.,

1990), Ribossome Display (Hanes e Pluckthun, 1997; He e Taussig, 1997) e Cell-Surface

Display (Francisco et al., 1993), através das quais anticorpos ou fragmentos de anticorpos

podem ser selecionados pela reatividade a antígenos de interesse.

A tecnologia Phage Display (Ph.D.) de apresentação de polipeptídeos na superfície

de bacteriófagos filamentosos foi introduzida pela primeira vez por G. Smith em 1985

(Smith, 1985). Ph.D. é a mais antiga e mais utilizada técnica de apresentação de moléculas

e é utilizada para apresentar, enriquecer e amadurecer a afinidade de um vasto número de

proteínas e peptídeos a partir de uma grande biblioteca com mais de 1010

variantes. A

13

vantagem crucial desta tecnologia é sua capacidade de conectar o fenótipo experimental (a

molécula apresentada) com o seu genótipo encapsulado (o DNA codificante da molécula

apresentada) (Scott e Smith, 1990).

Tipicamente, utilizam-se bacteriófagos da família Inoviridae (M13, fd, f1) (Sidhu,

2001), vírus bacteriófagos filamentosos que parasitam bactérias gramnegativas que

possuem o pílus F. O vírus aproveita a maquinaria de replicação, transcrição e tradução da

bactéria para se reproduzir. O bacteriófago M13 não provoca lise na célula hospedeira, mas

induz um estado no qual a célula infectada origina e libera partículas virais, causando uma

queda na taxa de reprodução bacteriana (Azzazy e Highsmith, 2002).

A partícula de fago é formada por uma fita simples de DNA circular envolta por

uma capa protéica constituída por cinco proteínas (pIII, pVI, pVII, pVIII e pIX) (Figura 4).

Destas cinco proteínas, existem aproximadamente 2800 cópias da pVIII e cinco cópias da

pIII. Neste sistema, o gene codificador do peptídeo ou proteína de interesse é geralmente

fusionado a um dos genes destas duas proteínas da capa protéica do fago (Phizicky e Fields,

1995).

14

Figura 4. Estrutura básica de um bacteriófago filamentoso. A- Sítio de clonagem no

fagomídeo junto à seqüência da proteína pIII. B- Estrutura do capsídeo viral, mostrando as

proteínas de superfície pIII, pVII, pVIII e pIX. C- Sub-unidades D1 e D2 da proteína pIII,

mostrando a extremidade N- terminal da proteína ( Adaptado de Hollinger e

Williams,1999).

Em 1990, foram obtidos os primeiros fragmentos de anticorpos expressos em fago

(McCafferty et al., 1990). Normalmente, bibliotecas combinatórias de anticorpos são

sintetizadas a partir da construção de genes dos fragmentos de anticorpos recombinantes na

forma de scFv ou Fab e, em seguida, estes genes são introduzidos por manipulação genética

em fagomídeos fusionados ao gene codificador de uma proteína capsídica. No caso de

bibliotecas, são utilizados genes codificantes para milhões de fragmentos distintos.

Os fagomídeos representam uma alternativa prática ao uso e manipulação do DNA

viral para expressão de anticorpos recombinantes. Fagomídeos são plasmídeos que

15

possuem origem de replicação bacteriana, origem de replicação viral, gene de fusão (pIII ou

pVIII), sítio de inserção do fragmento codificante do anticorpo ou qualquer outra proteína

de interesse e genes de resistência a antibióticos para seleção em meio apropriado. Como os

fagomídeos não possuem todas as proteínas necessárias para a encapsidamento da partícula

viral, fagos auxiliares (helper) contendo todos os genes dos bacteriófagos filamentosos são

utilizados nas culturas de células transformadas com o fagomídeo, permitindo o resgate da

partícula viral (Barbas et al., 2001).

Durante a infecção viral, o DNA proveniente dos fagomídeos é revestido pelas

proteínas estruturais, pois os fagos helper possuem mutações na origem de replicação,

dificultando sua reprodução e empacotamento de seu próprio material genético (Barbas et

al., 2001).

A descoberta de que sítios funcionais de anticorpos, como os scFvs, podem ser

apresentados na superfície de bacteriófagos permitiu a seleção de anticorpos contra

antígenos de interesse sem a necessidade de utilização da tecnologia do hibridoma

(McCafferty et al., 1990). Bibliotecas de scFv apresentadas em fagos consistem de diversos

domínios de cadeias leves e pesadas fusionados à proteína pIII do fago e apresentados

externamente como um scFv (Vaughan et al., 1996). Os fragmentos de anticorpos podem

ser expressos em bactérias rapidamente, em grandes quantidades e a baixos custos, se

comparados à expressão de anticorpos completos em cultura de células animais. O DNA

codificante para uma biblioteca de scFv pode ser clonado no genoma de um fago ou em um

vetor fagomídeo para produzir uma fusão scFv-pIII. Em vetores, o DNA codificante da

biblioteca pode ser clonado no genoma de fagos filamentosos (Scott e Smith, 1990) ou

pode ser inserido como um cassete gênico que codifique a seqüência completa da fusão

scFv pIII dentro do genoma do fago. Ambos os tipos de vetores possuem seqüências

16

codificantes para todas as proteínas necessárias para a replicação e montagem do fago

(McLafferty et al., 1993).

O método mais comum de Ph.D. para bibliotecas de anticorpos é realizado com

vetores fagomídeos, uma vez que esse sistema utiliza uma estratégia de clonagem mais fácil

e apresenta uma estabilidade genética maior quando comparados aos demais vetores, além

de permitir a ligação mais eficiente do scFv ao alvo. Fagomídeos têm sido desenvolvidos

para aumentar a eficiência da expressão (Pavoni et al., 2007) e fagos auxiliares têm sido

remodelados para reduzir sua influência negativa („bald phage‟ background) nos processos

de seleção dos fagos ligantes (Kristensen e Winter, 1998).

A seleção dos fragmentos de anticorpos das bibliotecas de scFv expressas em fagos

é um procedimento relativamente padronizado que envolve a exposição dos fagos ao

antígeno alvo, permitindo a ligação e enriquecimento daqueles que expressam moléculas

antígeno-específicas em um processo conhecido como panning (Figura 5).

No processo de seleção, a biblioteca de fagos apresentando os fragmentos de

anticorpos é incubada com o antígeno alvo que está imobilizado em um suporte sólido,

como uma placa de microtitulação (Schofield et al., 2007), ou ligada a antígenos

biotinilados em solução (Parmley e Smith, 1988). Os fagos não ligantes são removidos por

sucessivas lavagens e os ligantes são eluídos pela incubação dos mesmos em soluções com

valores de pH extremamente altos ou baixos (Mackenzie e To, 1998; Pincus et al., 1988),

por clivagem proteolítica (Goletz et al., 2002) ou utilizando centrifugação em gradiente ou

em fase orgânica (Giordano, 2001).

17

Figura 5. Ciclos de seleção de proteínas ligantes a partir de uma biblioteca de Phage Display. Bibliotecas

de proteínas (coloridas) são apresentadas em partículas de fagos fusionadas às proteínas de superfície (preto).

Bibliotecas altamente diversas (1010

) podem ser apresentadas em fagos e clones com especificidade a

determinados antígenos podem ser selecionados pela ligação aos antígenos imobilizados, seguido pela

lavagem e remoção dos fagos não ligantes. Os fagos ligantes podem ser amplificados pela infecção em

bactérias e utilizados em outros ciclos de seleção, para enriquecimento dos fagos ligantes ao antígeno de

interesse. O DNA de cada clone selecionado pode ser sequenciado e revelar a sequencia da proteína

apresentada que possua afinidade com o antígeno (Adaptado de Sidhu e Koide, 2007).

Diversas bibliotecas de scFv expressas em fagos têm sido desenvolvidas (Azriel-

Rosenfeld et al., 2004; Krebs et al., 2001; Vaughan et al., 1996), algumas delas com

finalidades específicas, como para otimizar a expressão de anticorpos no citoplasma celular

(biblioteca de anticorpos internos) (Philibert et al., 2007), ou para aumentar o

reconhecimento de antígenos como proteínas (Sheets et al., 1998) ou carboidratos (Ravn et

al., 2004). Embora diversas formas de anticorpos estejam sendo desenvolvidas para Ph.D.,

os scFvs mantêm-se ainda como os mais utilizados.

18

2-OBJETIVOS

19

2.1- Objetivo Geral

O objetivo geral deste trabalho consistiu na construção de uma biblioteca de

fragmentos de anticorpos monoclonais scFv expressa em fagos para seleção e

caracterização de anticorpos ligantes a células tumorais de tireóide.

2.2- Objetivos Específicos

1. Construção de uma biblioteca imune e humana de fragmentos de anticorpos

monoclonais (scFv) apresentada em fagos (Phage Display) de pacientes com

Carcinoma Diferenciado da Tireóide.

2. Avaliação da qualidade da biblioteca por análise da diversidade do repertório de

anticorpos clonados.

3. Seleção de fragmentos de anticorpos ligantes e específicos à células tumorais de

tireóide.

4. Caracterização dos fragmentos de anticorpos selecionados.

5. Análise da reatividade do scFv aos tecidos de carcinoma de tireóide, bócio colóide,

Adenoma Folicular e tireóide normal por imunoistoquímica.

6. Relacionar a reatividade do fragmento de anticorpo scFv na imunoistoquímica com

os dados clínicos, como o estadiamento de tumor, evolução clínica, idade ao

dignóstico.

20

3- MATERIAL E MÉTODOS

21

3.1- As soluções utilizadas estão descritas no ANEXO 1.

3.2-Linhagem de Células Humanas

NPA: linhagem de células tumorais de Carcinoma Papilífero de tireóide.

3.3- Linhagens Bacterianas

As linhagens de Escherichia coli utilizadas na metodologia do trabalho foram:

XL1-Blue (Stratagene) supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA46 relA1 lac [F' ProAB

lacIq lacIqZ M15, Tn10(tetr)]. Essa linhagem foi utilizada para produção de partículas

virais, transformação e amplificação de fagomídeos.

Top 10 (Invitrogen): F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ∆M15 ∆lacX74

recA1 araD139 galU galK ∆(ara-leu) 7697 rpsL (StrR) endA1 nupG. Essa linhagem foi

empregada na expressão de scFv em solução.

3.4- Vetor fagomídeo

pComb3XSS -f(-)-4,5 kb, promotores plac, ori ColE1, ori f1, AmpR (Figura 6)

Após a região de clonagem do gene do anticorpo há uma região com seis histidinas (H6)

para purificação na coluna de níquel ou para detecção com anticorpo monoclonal anti-His

Tag e uma região codificadora de resíduos que constituem o epítopo de uma hemaglutinina

(HA) que possibilita a detecção do scFv utilizando um anticorpo anti-hemaglutinina (anti-

HA). Apresenta ainda um códon de parada âmbar (TAG) não reconhecido eficientemente

por linhagens supressoras como a XL 1-Blue ou ER2537, mas reconhecido por cepas de

bactérias não supressoras como a TOP 10 permitindo assim a expressão de proteínas de

22

fusão ou a produção do anticorpo na forma solúvel livre da proteína III. Possui a sequência

codificadora para parte da proteína III de bacteriófagos filamentosos (Scott e Barbas III,

2000).

3.5- Bacteriófago auxiliar

VCSM13: Derivado do bacteriófago M13 com o gene II mutado: origem de

duplicação plasmidial derivada do p15 e gene de resistência à kanamicina (Stratagene).

3.6- Oligonucleotídeos Sintéticos

Os oligonucleotídeos utilizados estão listados na Tabela 1. Os iniciadores utilizados

para amplificar os cDNAs específicos de genes de imunoglobulinas foram sintetizados

segundo Marks e colaboradores (1991). Os iniciadores MMB4 e MMB5 utilizados no

seqüenciamento foram desenhados por Maranhão e colaboradores (2001).

Figura 6. Vetor fagomídeo pComb3X usado na construção de bibliotecas combinatoriais de

anticorpos. O vetor foi desenhado para expressar fragmentos de anticorpos na superfície de fagos

filamentosos ou como proteínas solúveis. Os fragmentos de anticorpos (scFv ou Fab) são fusionados

ao domínio C-terminal da proteína III (coat protein III) e são expostos na superfície das partículas de

fagos. O códon âmbar foi inserido entre o sítio de restrição da enzima SfiI (posição 39) e a porção

terminal do gene III. Isto permite a expressão da proteína em solução por bactérias não supressoras

sem a excisão do gene III. A cauda de histidina (HIS) foi inserida na porção C-terminal do fragmento

Fd para purificação universal de proteínas. O decapeptídeo hemaglutinina (HA) foi inserido para

detecção usando anticorpos anti-HA (Adaptado de Andris-Widhopf et al., 2000).

23

Tabela 1. Oligonucleotídeos utilizados no trabalho.

VH primers senso

HSCVH1-F 5‟ GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GG 3‟

HSCVH2-F 5‟ GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CAG ATC ACC TTG AAG GAG TCT GG 3‟

HSCVH35-F 5‟ GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC GAG GTG CAG CTG GTG SAG TCT GG 3‟

HSCVH3a-F 5‟ GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC GAG GTG CAG CTG KTG GAG TCT G 3‟

HSCVH4-F 5‟ GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GG 3‟

HSCVH4a-F 5‟ GGT TCC TCT AGA TCT TCC CAG GTG CAG CTA CAG CAG TGG GG 3‟

VH primers reverso

HSCG1234-B 5‟ CCT GGC CGG CCT GGC CAC TAG TGA CCG ATG GGC CCT TGG ARG C 3‟

HSCM-B 5‟ CCT GGC CGG CCT GGC CAC TAG TAA GGG TTG GGG CGG ATG CAC TCC C 3‟

Vκ primers senso

HSCK1-F 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCC AGA TGA CCC AGT CTC C 3‟

HSCK24-F 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGA TGA CYC AGT CTC C 3‟

HSCK3-F 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGW TGA CRC AGT CTC C 3‟

HSCK5-F 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCA CACTCA CGC AGT CTC C 3‟

Vκ primers reverso

HSCJK14o-B 5‟ GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC TTT GAT YTC CAC CTT GGT CCC 3‟

HSCJK2o-B 5‟ GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC TTT GAT CTC CAG CTT GGT CCC 3‟

HSCJK3o-B 5‟ GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC TTT GAT ATC CAC TTT GGT CCC 3‟

HSCJK5o-B 5‟ GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC TTT AAT CTC CAG TCG TGT CCC 3‟

Vλ primers senso

HSCLam1a 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGB TGA CGC AGC CGC CCT C 3‟

HSCLam1b 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGC TGA CTC AGC CAC CCT C 3‟

HSCLam2 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG CCC TGA CTC AGC CTC CCT CCG T 3‟

HSCLam3 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AGC TGA CTC AGC CAC CCT CAG TGT C 3‟

HSCLam4 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGC TGA CTC AAT CGC CCT C 3‟

HSCLam6 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCA TGC TGA CTC AGC CCC ACT C 3‟

HSCLam78 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGG TGA CYC AGG AGC CMT C 3‟

HSCLam9 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGC TGA CTC AGC CAC CTT C 3‟

HSCLam10 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG GGC AGA CTC AGC AGC TCT C 3‟

Vλ primers reverso

HSCJLam1236 5‟ GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC GCC TAG GAC GGT CAS CTT GGT SCC 3‟

HSCJLam4 5‟ GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC GCC TAA AAT GAT CAG CTG GGT TCC 3‟

HSCJLam57 5‟ GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC GCC GAG GAC GGT CAG CTS GGT SCC 3‟

Primers da extensão overlap

RSC-F senso 5‟ GAG GAG GAG GAG GAG GAG GCG GGG CCC AGG CGG CCG AGC TC 3‟

RSC-B reverso 5‟ GAG GAG GAG GAG GAG GAG CCT GGC CGG CCT GGC CAC TAG TG 3‟

Primers para sequenciamento do scFv clonado no vetor pComb3XSS

MMB4 5‟ GCT TCC GGC TCG TAT GTT GTG T 3‟

MMB5 5‟ CGT TTG CCA TCT TTT CAT AAT C 3‟

24

3.7- Construção da Biblioteca de anticorpos: Amplificação das

Sequências Codificadoras de VH e VL por PCR e Montagem do scFv

A Figura 7 apresenta um esquema geral de todos os passos executados para a

obtenção da biblioteca de fragmentos de anticorpos scFv apresentados em fagos e posterior

seleção contra células humanas de tireóide.

Figura 7. Esquema da construção e seleção da biblioteca de scFv de pacientes com carcinoma

diferenciado de tireóide.

Crescimento e transformação de

XL1-Blue e vetor pComb3XSS

Preparação do RNA

Síntese do cDNA

↓ ↓

Preparação de plasmídeo PCR Vκ e VH

↓ ↓

Digestão de 20 µg com SfiI Purificação em gel

↓ ↓

Purificação do gel / vetor e

fragmento Fab liberado

→ Ligação teste

(Transformação) Quantificação

↓ ↓

Ligação dos scFvs

PCR Overlap para produzir a

ligação cadeias leve e pesada

↓ ↓

Transformação de células

competentes Purificação em gel

↓

Digestão com SfiI

↓

Purificação em gel

↓

scFv preparado

↓

Ligação teste

(Transformação)

Titulação → Resgate com fago

auxiliar → Preparação dos fagos

↓

↑ Seleção Titulação

↓

Infecção ← Centrifugação ← Incubação com o antígeno

25

3.7.1- Obtenção das amostras e extração de RNA total de Linfócitos dos

Pacientes com Carcinoma de Tiróide

Vinte e cinco pacientes atendidos no Hospital de Clínicas da Unicamp com

diagnóstico estabelecido de Carcinoma diferenciado de tiróide foram doadores de sangue

para este trabalho. O trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Ciências

Médicas número 096/2008 (ANEXO 2).

De cada paciente foram coletados cerca de 4 mL de sangue total em tubo contendo

EDTA. O material foi encaminhado ao Laboratório de Genética Molecular do Câncer

(GEMOCA) e o RNA foi extraído conforme o protocolo em ANEXO 3.

3.7.2- Síntese da primeira fita de cDNA

Para a síntese da primeira fita de cDNA foi utilizado o kit SuperScript® III

(Invitrogen) com primer randômico, a reação foi submetida às seguintes condições: 5 µg de

RNA total, 1µL do primer randômico, 1 µL do mix de dNTPs (10mM) e H2O DEPC para

completar 13µL de volume final. As amostras foram incubadas em termociclador PTC-150

(MJ Research, Inc.) a 65°C por 5 minutos e colocadas imediatamente no gelo por 1 minuto.

Em seguida foi adicionada a cada reação uma mistura de: 1 µL de RNase Out, 4 µL de 5X

tampão da primeira fita, 1 µL de DTT 0,1M e 1 µL de superscript III. Na sequencia, a

amostra foi incubada a 25°C por 5 minutos e, posteriormente, a 50°C por 60 minutos e a

70°C por 15 minutos. Para remover o RNA complementar do cDNA foi adicionado 1µL de

RNase H e incubado a 37°C durante 20 minutos. A primeira fita de cDNA foi estocado a -

20°C para posterior amplificação.

26

3.7.3- Primeiro ciclo de PCR

Para a construção da biblioteca de scFv foram realizadas 12 reações de PCR para

amplificação dos genes da cadeia variável pesada VH e 43 reações para os genes da cadeia

leve, esta subdividida em Vκ (kappa) e Vλ (lambda). Em cada reação foi utilizado o cDNA

como molde e uma combinação de primer, como listado abaixo:

Combinações de VH:

Reação 1 HSCVH1-F com HSCG1234-B


Reação 3 HSCGVH4-F com HSCG1234-B

Reação 4 HSCVH1-F com HSCM-B




Reação 8 HSCVH3a-F com HSCG1234-B

Reação 9 HSCVH4a-F com HSCG1234-B


Reação 11 HSCVH3a-F com HSCM-B

Reação 12 HSCVH4a-F com HSCM-B

Combinações de Vκ:

Reação 13 HSCK1-F com HSCJK14o-B









Reação 22 HSCK5-F com HSCJ14o-B



27





Combinações de Vλ:

Reação 29 HSCLam1a com HSCJLam1236

Reação 30 HSCLam2 com HSCJLam1236














Reação 44 HSCLam1b com HSCJLam1236












28

Cada uma dessas reações consistia de:

cDNA (~0,5µg) 2 µL

Primer 5‟ (10 pmoles/μL) 60,0 pmoles

Primer 3‟ (10 pmoles/μL) 60,0 pmoles

Tampão de PCR 10X 10,0 µL

dNTPs (10 mM) 2 mM

MgCl2 2,5 mM

Taq DNA Polimerase (0,5 U/μL) 0,5 µL

Água bidestilada q.s.p. 100,0 µL

As reações em cadeia da polimerase foram realizadas nas seguintes condições:

1. 94°C por 5 minutos;

2. 37 ciclos de:

94°C por 1 minuto;

57°C por 1 minuto;

72°C por 90 segundos;

3. 72°C por 10 minutos.

As reações foram aplicadas em gel de agarose 1,5% para análise dos fragmentos

amplificados. As bandas de VH e VL tem aproximadamente 400 pb e 350 pb,

respectivamente.

3.7.4- Precipitação e purificação dos produtos de PCR

Pools dos produtos de cada tipo de reação VH, Vκ e Vλ foram precipitadas com 2

volumes de etanol e 0,1 volume de acetato de sódio 3M (pH 5,0), centrifugados e

posteriormente ressupensos em 20 µL de água. Em seguida, foram submetidos à

eletroforese em gel de agarose 1,5% e purificados conforme protocolo (ANEXO 4). Os

produtos foram quantificados em espectrofotômetro a 260 nm.

29

3.7.5- Amplificação dos fragmentos scFv

Para a amplificação dos fragmentos de anticorpos scFv, os produtos da amplificação

das cadeias VH e VL foram reunidos em quantidades iguais para gerar um produto final de

sobreposição (overlap). Os primers do primeiro ciclo criaram sequências complementares

na região variável da cadeia leve e pesada o que possibilitou a extensão do produto gerando

o fragmento scFv.

Dez replicas de cada reação seguiram as combinações (VH + Vκ) e (VH + Vλ)

foram realizadas como descrito a seguir:

Fragmentos amplificados VH 200 ng

Fragmentos amplificados Vκ ou Vλ 200 ng

Primer RSC-F senso 60,0 pmoles

Primer RSC-B reverso 60,0 pmoles

Tampão de PCR 10X 10,0 µL

dNTPs (10 mM) 2 mM

MgCl2 2,5 mM

Taq DNA Polimerase (5 U/ µL) 0,5 µL

Água bidestilada q.s.p. 100,0 µL

As reações em cadeia da polimerase foram realizadas nas seguintes condições:

1. 56°C por 1 minuto

2. 72°C por 5 minutos





7. Dez vezes o passo 4



30


11. Quinze vezes o passo 8

Extensão final a 72°C por 10 minutos.

As reações foram aplicadas em gel de agarose 1,5% para análise e separação dos

fragmentos amplificados. O produto scFv apresentou banda de aproximadamente 800 pb.

3.7.6- Precipitação e purificação dos produtos de PCR

Pools dos produtos de cada tipo de reação (VH +Vκ) e (VH +Vλ) foram precipitadas

com 2 volumes de etanol e 0,1 volume de acetato de sódio 3M (pH 5,0), centrifugados e

posteriormente ressupensos em 20 µL de água. Em seguida, foram submetidos à

eletroforese em gel de agarose 1,5% e as bandas de aproximadamente 800pb foram

purificados utilizando o kit Promega. Após a purificação, os fragmentos scFv foram

quantificados em espectrofotômetro a 260 nm.

3.7.7- Restrição dos scFvs obtidos por PCR e do vetor pComb3XSS com a

Enzima SfiI

Os fragmentos scFv bem como o vetor pComb3XSS foram digeridos com a enzima

SfiI (Fermentas) de acordo com as reações descritas abaixo:

scFv purificado 12 µg

SfiI (20 U por µg de DNA) 443 U

Tampão da enzima 10X 20 µL

Água Bidestilada q.s.p. 200 µL

Vetor pComb3XSS contendo fragmento não relacionado 10µg

31

SfiI (40 U por µg de DNA) 400U

Tampão da enzima 10X 20 µL


As reações foram incubadas a 50°C em banho-maria durante 36 horas.

Os fragmentos digeridos (scFv, vetor pComb3XSS) foram precipitados com 2

volumes de etanol e incubados a -80°C durante a noite. Em seguida, foram submetidos à

eletroforese em gel de agarose 1,5% para o fragmento scFv e gel a 0,8% para o vetor, em

seguida purificados conforme protocolo em ANEXO 4. Após a purificação, os fragmentos

scFv foram quantificados em espectrofotômetro a 260 nm.

3.7.8- Ligação do scFv com o vetor pComb3XSS digeridos com a Enzima SfiI e

purificados

Primeiramente foram feitos testes de ligação em pequena escala para verificar a

qualidade do vetor e insertos para uma eficiente ligação e transformação. Cada uma destas

reações está descrita abaixo:

Ligação teste

pComb3XSS digerido com SfiI 140ng

scFv digerido com SfiI 125 ng

Tampão de ligase 5X 4 µL

T4 DNA ligase 1 µL


32

Ligação controle (teste de auto ligação do vetor)

pComb3XSS digerido com SfiI 140 ng


T4 DNA ligase 1 µL


As amostras foram incubadas a 24°C em termociclador durante 20 horas. Em

seguida 3µL de cada sistema foram utilizados para transformar alíquotas de XL1-Blue

competentes. Após incubação durante a noite a 37°C, foram feitos os cálculos da eficiência

da ligação. É considerada uma boa ligação se a produção é de pelo menos 108

unidades

formadoras de colônias (cfu) por µg de DNA e a ligação teste de auto-ligação não exceder

10%.

3.7.9- Ligação definitiva dos fragmentos de DNA scFv com o vetor pComb3X

pComb3XSS digerido com SfiI 1500 ng

scFv digerido com SfiI 700 ng


T4 DNA ligase 10 µL


Quatro sistemas idênticos de ligação foram realizados para aumentar a variabilidade

da biblioteca. As reações de ligação foram incubadas a 24ºC no termociclador durante 20

horas. No dia seguinte, as ligações foram precipitadas com a adição de 1,5 µL de

glicogênio, 20 µL de acetato de sódio 3M e 440 µL de etanol absoluto e incubados a -80°C

por 16 horas. Em seguida, a biblioteca foi centrifugada a 14000 x g por 15 minutos a 4°C e

33

o sobrenadante foi descartado. O pellet foi lavado com etanol 70% (v/v) e os tubos foram

deixados à temperatura ambiente por 15 minutos para evaporação do etanol residual. O

pellet foi diluído em 15 µL de água bidestilada.

Em seguida 1,5 µL de cada sistema foram misturados e utilizados para transformar

alíquotas de bactéria XL1-Blue competentes, foram realizados os cálculos do número de

colônias e estimado o tamanho da biblioteca.

3.8- Análise do repertório da biblioteca de scFv

Uma investigação da variabilidade dos fragmentos de anticorpos presentes na

biblioteca com relação à definição das famílias de imunoglobulinas foi feita com base em

alinhamento usando o programa Blast contra banco específico de imunoglobulinas, o

programa IgBlast (www.ncbi.nlm.nih.gov).

3.9- Seleção da biblioteca

Os protocolos desta seção descrevem a preparação de ferramentas necessárias para a

produção e seleção da biblioteca, tais como a preparação de bactérias eletrocompetentes,

obtenção do fago auxiliar, a cultura de células humanas e a seleção propriamente dita.

3.9.1- Preparação de células eletrocompetentes

Uma colônia de células XL1-Blue foi isolada e inoculada em 10 mL de meio SB

contendo tetraciclina (30 g/mL) e incubada a 37ºC sob agitação de 250 rpm por 16 horas.

Cinco microlitros do pré-inóculo foi inoculado em 500 mL de meio SB contendo 2,5 mL da

solução estoque de glicose 2M e 2,5 mL de solução estoque de Mg 2 M em um frasco de

34

1L. Foi incubado a 37ºC sob agitação de 250 rpm até atingir uma densidade óptica OD a

600 nm igual a 0,7. Após ter atingido a OD desejada, os frascos foram resfriados no gelo

durante 15 minutos e a cultura foi centrifugada a 3000 rpm durante 20 minutos a 4ºC. O

sobrenadante foi descartado e os sedimentos ressuspendidos em 100 mL de glicerol 10%

gelado. A suspensão de células foi centrifugada a 3000 rpm durante 20 minutos a 4ºC e o

sobrenadante descartado. Os sedimentos foram submetidos a mais duas lavagens com 50 e

25 mL de glicerol 10% gelado. Após a terceira lavagem, as células foram ressuspendidas no

volume residual de glicerol e aliquotadas em volume de 75 L e transferidas para

microtubos novos e estéreis. As alíquotas foram congeladas em banho de álcool e gelo seco

e estocadas a -80ºC até serem utilizadas para eletroporação e para os experimentos de

seleção.

3.9.2- Preparação do fago auxiliar VCSM13

Adaptado de Rader et al., 2000.

3.9.2.1- Obtenção de placas de lise

Para a obtenção das placas de lise foram inoculados 2 L de células XL1-Blue

competente em 2 mL de meio SB contendo tetraciclina a uma concentração final de 10

g/mL, em seguida incubado a 37ºC sob agitação de 250 rpm até atingir OD a 600nm igual

a 0,5. Diluições do fago helper VCSM13 da ordem de 10-6 a 10

-11 foram preparadas, sendo

utilizado 1 μL de cada diluição na inoculação de 200 μL da cultura de bactérias.

Posteriormente, células e fagos foram incubados durante 15 minutos a temperatura

ambiente. Os 200 L da cultura foram plaqueados em placa de petri contendo LB ágar com

tetraciclina a 10 g/mL. As placas foram incubadas a 37ºC durante a noite e no dia seguinte

35

observou-se a formação de placas de lise (colônias de bactérias com retardo no crescimento

devido à infecção pelo fago).

3.9.2.2- Amplificação de placas de lise

Para a amplificação das placas de lise, foram inoculados 10 L de células XL1-Blue

competente em 10 mL de meio SB contendo tetraciclina 10 g/mL, em um tubo de 50 mL e

incubado a 37ºC durante uma hora sob agitação. Uma placa de lise, obtida no experimento

anterior, foi selecionada com o auxílio de um palito estéril e transferida para o tubo

contendo a cultura de bactérias, seguido de incubação nas mesmas condições por 2 horas. A

cultura infectada foi então transferida para um frasco tipo erlenmeyer de 1L com 500 mL

de meio SB contendo tetraciclina a 10 g/mL kanamicina a 70 g/mL. Após

homogeneização metade da cultura foi transferida para outro frasco erlenmeyer de 1L e

ambos os frascos foram incubados a 37ºC durante a noite sob agitação de 250 rpm. No dia

seguinte, a cultura foi transferida para tubos, centrifugado a 2500 x g durante 15 minutos e

o sobrenadante coletado em tubos novos. O sobrenadante foi submetido à incubação a 70ºC

durante 20 minutos para eliminar as células residuais. Em seguida, as amostras foram

centrifugadas novamente a 2500 x g durante 15 minutos, ao sobrenadante foi acrescentado

0,02% de azida sódica, em seguida transferido para novos tubos e estocados a 4ºC.

3.9.2.3- Determinação do título da preparação de fagos auxiliares

O título do fago foi obtido em um procedimento de infecção de cultura de células

XL1-Blue como descrito para a obtenção de placas de lise do item 3.2.4.1. Após a

36

incubação durante a noite, o título foi determinado pela contagem do número de placas de

lise presentes multiplicada pela diluição do fago.

3.9.3- Transformação de Células de Escherichia coli por Eletroporação com a

Biblioteca

Dois microlitros de cada sistema de ligação foram misturados e mantidos no gelo,

bem como uma cubeta de eletroporação e a alíquota de células eletrocompetentes recém

retiradas do ultrafreezer (200 µL).

Cinco microlitros do pool das ligações precipitadas foram adicionadas ao tubo das

células eletrocompetentes recém descongeladas e misturadas com pipeta e transferidos para

a cubeta pré-resfriada. Após 1 minuto de incubação, as células foram submetidas à

eletroporação em eletroporador (Bio-Rad) nas seguintes condições: voltagem de 2,5 kV, 25

µF de capacitância e 200 Ω de resistência, gerando pulsos de cerca de 4 a 5 mili segundos

de duração.

Imediatamente após, adicionou-se 1mL de meio SOC à cubeta e posteriormente 2

mL, os 3 mL foram colocados em um tubo de 50 mL e incubados a 37°C sob agitação de

250 rpm por 1 hora.

Após a incubação, uma alíquota de 50 μL dessa biblioteca original foi plaqueada em

meio LB ágar com 100 μg/mL de carbenicilina e incubada a 37°C por 16 horas. As colônias

isoladas foram calculadas para estimar o tamanho da biblioteca e selecionadas com palito

estéril para posterior extração de DNA plasmidial e seqüenciamento.

Ao restante da cultura foram adicionados 10 mL de meio SB contendo 3 μL de

carbenicilina a 100 mg/mL e 15 μL de tetraciclina a 10 mg/mL. Os 15 mL de cultura foram

37

incubados por 1 hora a 37ºC e 250 rpm, seguidos pela adição demais 4,5 μL de

carbenicilina a 100 mg/mL e incubação sob as mesmas condições por mais 1 hora.

A cultura foi transferida para um frasco do tipo erlenmeyer de 1L e a ela

acrescentados 2 mL de fago auxiliar VCSM13 (1012

a 1013

pfu/mL) e 183 mL de meio SB

contendo 92,5 μL de carbenicilina a 100 mg/mL e 185 μL de tetraciclina a 10 mg/mL. A

cultura foi então incubada a 37ºC sob agitação de 250 rpm por 2 horas.

À cultura foram adicionados 140 μL de Kanamicina a 100 mg/mL, sendo a mesma

mantida sob agitação durante a noite (por aproximadamente 14 horas) nas mesmas

condições descritas no passo anterior.

A cultura crescida durante a noite foi centrifugada a 3.000 x g por 15 minutos a 4ºC

e o sedimento de bactérias descartado. Os sobrenadantes foram transferidos para novos

tubos e centrifugados novamente sob as mesmas condições. Os sobrenadantes foram então

transferidos para novos tubos e aos mesmos foram adicionados Ao sobrenadante foram

adicionados 8 g [4% (p/v)] de polietilenoglicol (PEG 8.000) e 6 g [3% (p/v)] de cloreto de

sódio (NaCl). A fase sólida foi dissolvida incubando-se as soluções a 37ºC sob agitação de

250 rpm por 10 minutos.

Os fagos foram coletados por centrifugação a 15.000 x g por 15 minutos a 4ºC. Os

sobrenadantes foram descartados e os tubos contendo os sedimentos de fagos foram

deixados invertidos sobre papel toalha por 10 minutos para secagem.

Os sedimentos de fagos foram ressuspendidos em 2 mL de TBS-BSA 1% (p/v) e

transferidos para microtubos, que foram então centrifugados a 14.000 rpm por 5 minutos a

4ºC.

38

Em seguida, os sobrenadantes contendo as partículas virais foram transferidos para

novos microtubos contendo azida sódica a uma concentração final de 0,02% e estocados a

4ºC.

3.9.4- Preparação de DNA plasmidial em placas de microtitulação

Após a transformação de bactérias XL1-Blue com a biblioteca original, 50 μL do

produto foi plaqueado em meio LB ágar acrescido de 100 μg/mL de carbenicilina e

incubado por 16 horas a 37ºC.

Clones isolados foram retirados das placas e inoculados em 1 mL de meio SB

contendo 100 μg/mL de carbenicilina em placa do tipo deep well.

A placa foi selada com selo perfurado para permitir a aeração e então incubada por

20 horas a 37ºC sob agitação de 300 rpm. Após a incubação, a placa foi centrifugada a 3700

rpm por 10 minutos a 20ºC, os sobrenadantes foram retirados e os sedimentos de bactérias

ressuspensos em 240 μL de GET. A placa foi selada e agitada por 2 minutos em vortex para

ressuspensão das células. Em seguida, a placa foi centrifugada novamentea 3700 rpm por

10 minutos a 20ºC.

Os sobrenadantes foram descartados e a placa invertida em papel toalha por 5

minutos. As bactérias foram ressuspensas novamente em 80 μL de GET.

Foram adicionados 2,5 μL de RNAse A (10 mg/mL) a cada poço de uma placa de

microtitulação de fundo redondo para onde foram transferidos 60 μL da suspensão de

células.

A cada poço foram adicionados 60 μL de uma solução recém preparada de NaOH

0,2 N e SDS 1%. Em seguida a placa foi fortemente selada com um adesivo novo e

39

cuidadosamente invertida por 20 vezes, incubada por 10 minutos a temperatura ambiente e

centrifugada rapidamente.

Em seguida foram adicionados 60 μL de Acetato de Potássio 3M a cada poço, sendo

a placa selada e agitada 20 vezes por inversão, seguida de incubação por 10 minutos a

temperatura ambiente e rápida centrifugação.

O adesivo foi removido e a placa incubada em estufa a 90ºC por 25 minutos, sendo

posteriormente selada e incubada no gelo por 10 minutos. A placa foi então centrifugada

por 10 minutos a 3700 rpm e 20ºC.

Os sobrenadantes foram transferidos para uma placa com filtro (Millipore) fixada

com adesivo no topo de uma microplaca de fundo em “V” e, em seguida, centrifugados por

6 minutos a 3700 rpm a 20ºC.

Ao filtrado foram adicionados 100 μL de isopropanol, que foi levemente

homogeneizado e centrifugado a 3700 rpm e 20ºC por 45 minutos.

Após o descarte do sobrenadante, o DNA foi lavado com 200 μL de etanol 70%

gelado e centrifugado a 3700 rpm e 20ºC por 5 minutos.

Os sobrenadantes foram retirados e a placa, invertida em papel toalha, foi

centrifugada até atingir a rotação de 900 rpm. A placa foi deixada à temperatura ambiente

por 60 minutos para evaporação do etanol residual.

O DNA foi ressuspenso em 60 μL de água bidestilada, analisado em gel de agarose

1% corado com brometo de etídio e então estocado a -20ºC.

40

3.9.5- Reamplificação da biblioteca

Foram inoculados 50 μL de células XL1-Blue em 50 mL de meio SB contendo 10

μg/mL de tetraciclina. A cultura foi incubada a 37ºC e 270 rpm por 1,5 a 2,5 horas até

atingir uma OD 600nm igual a 1,0.

À cultura foram adicionados 70 μL de fagos, seguido pela incubação a temperatura

ambiente por 30 minutos. Em seguida foram adicionados 10 μL de carbenicilina a 100

mg/mL e 2% (v/v) de glicose 2M, seguido pela incubação a 37ºC e 270 rpm por 1 hora.

Após esse período, foram adicionados à cultura 15 μL de carbenicilina a 100 mg/mL,

seguido pela incubação por 1 hora nas mesmas condições.

A cultura foi então centrifugada a 3000 x g por 10 minutos e ressuspensa em 200

mL de meio SB contendo 100 μL de carbenicilina a 100 mg/mL e 100 μL de tetraciclina a

20 mg/mL.

Em seguida foram adicionados 2 mL de fago auxiliar VCSM13, a cultura foi então

incubada a 37ºC e 250 rpm por 2 horas, seguida da adição de 140 μL de kanamicina a 100

mg/mL e incubação nas mesmas condições durante 14 horas.

A cultura foi centrifugada a 3000 x g por 15 minutos a 4ºC, o sobrenadante foi

retirado, transferido para novo frasco e centrifugado nas mesmas condições. Dois mililitros

(2 mL) do sobrenadante foram estocados para futuras análises de atividade ligante das

partículas virais aí presentes.

Ao sobrenadante foram adicionados 8 g [4% (p/v)] de polietilenoglicol (PEG 8.000)

e 6 g [3% (p/v)] de cloreto de sódio (NaCl). A fase sólida foi dissolvida por agitação a 37ºC

e 270 rpm por 5 minutos. Em seguida o sobrenadante foi incubado no gelo por 30 minutos.

41

A solução foi centrifugada a 15000 x g e 4ºC por 15 minutos e o sobrenadante

descartado. O frasco contendo os fagos sedimentados foi então invertido em papel toalha

estéril por 10 minutos para secagem do sedimento.

O sedimento de fagos foi ressuspendido em 2 mL de TBS e BSA 1% (p/v),

transferido para um microtubo e centrifugado a 14000 rpm a 4ºC por 5 minutos. Em

seguida, o sobrenadante contendo as partículas virais foi transferido para um microtubo

novo, adicionado azida sódica a uma concentração final de 0,02% e estocado a 4ºC.

3.9.6- Cultura de células humanas de tireóide

Uma vez construída a biblioteca de anticorpos recombinantes procedeu-se a seleção

contra células de tireóide. Para tanto foi utilizada uma linhagem celular tumoral de

Carcinoma Papilífero de Tireóide, denominada NPA, que é uma cultura secundária, ou seja,

com capacidade ilimitada de crescimento em cultura, essas células NPAs foram gentilmente

doada pela Profa. Dra. Janete Maria Cerutti – UNIFESP. Foi também utilizada uma cultura

primária de células de bócio colóide, designada primária porque foi desenvolvida a partir de

tecidos tireoidianos de pacientes com bócio que foram submetidos à Tireoidectomia pela

Equipe de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital das Clínicas de Uberlândia, sob a

coordenação do Dr. Sindeval José da Silva.

As células foram cultivadas em meio DMEM (Eagle modificado por Dulbecco da

Nutricell) suplementado com antibiótico estreptomicina e adicionado 10% de soro fetal

bovino (SFB, Nutricell), mantidas em uma atmosfera de 5% de CO2.

Com relação à cultura primária de bócio, foram realizados os seguintes

procedimentos: o tecido de bócio foi coletado durante a cirurgia em seguida colocado em

um tubo contendo meio DMEM para o transporte até o Laboratório de Biologia Molecular-

42

UFU, sob orientação das professoras Dra. Janethe Deolina de Oliveira Pena e Dra. Maria

Aparecida de Souza; em seguida o tecido foi colocado em placa de petri estéril e cortado

com bisturi em fragmentos menores de aproximadamente 5 mm; esses fragmentos foram

colocados em uma garrafa de cultura (25 cm2) e adicionados sobre eles 100 μL de meio

DMEM; após 20 minutos os tecidos já estavam aderidos a garrafa e em seguida foi

adicionado 5 mL de meio DMEM suplementado com 20% de SFB; por fim, as garrafas

foram mantidas em uma atmosfera de 5% de CO2.

As células tumorais secundárias (NPA) e as células primárias de bócio não são

aderentes, e as células de bócios apresentam crescimento mais lento comparado com as

células tumorais. As trocas de meio foram realizadas a cada 4 ou 5 dias e os repiques

quando as garrafas estavam confluentes. Para garantir um estoque de células, estas foram

congeladas em meio próprio contendo DMSO.

3.9.6.1- Congelamento de células humanas

Após serem coletadas por centrifugação a 2000 rpm por 10 min., as células com

aproximadamente 500 μL de meio foram transferidas para tubo de congelamento e em

seguida, adicionado 500 μL de SFB (gelado) e 100 μL de DMSO. Seguido de incubação a

-80°C por 24 horas e posterior estocagem em N2 líquido.

3.9.6.2- Descongelamento de células humanas

As células retiradas do N2 líquido foram transportadas em gelo até a câmara de

fluxo. Em seguida, foram ressuspendidas em meio DMEM sem SFB e transferido para um

tubo de 15 mL. Posteriormente, as células foram centrifugadas a 2000 rpm por 10 min, o

sobrenadante descartado e ressuspendidas em meio DMEM suplementado com 10% de

43

SFB. As células foram adicionadas em uma garrafa de cultura e mantidas em uma

atmosfera de 5% de CO2.

3.9.7- Seleção da biblioteca de scFv contra células humanas de tireóide pelo

método BRASIL

A seleção da biblioteca de anticorpos procedeu-se na superfície das células visando

à obtenção de anticorpos contra antígenos expressos nas células de carcinoma Papilífero de

tireóide. A metodologia de seleção empregada foi descrita por Giordano e colaboradores

(2001) e denomina-se BRASIL (Biopanning and Rapid Analysis of Selective Interactive

Ligands), está esquematizada na Figura 8.

Para selecionar ligantes específicos a antígenos de células tumorais de tireóide

foram utilizadas células de cultura de bócio colóide (doença benigna) para a seleção

negativa, o que permite a redução de ligantes não desejáveis. Foram conduzidos três ciclos

de seleção, sendo cada um deles antecedido pela reamplificação da biblioteca de scFv,

como descrito no item 3.8.5.

As células em cultura foram centrifugadas e ressuspensas em meio a uma

concentração de cerca de 1 x105 células por mL. Estas células foram incubadas com 70 μL

dos fagos por 1 hora no gelo. Após esse período, 100 μL da suspensão células fagos foram

transferidas para um tubo tipo eppendorf de 500 μL contendo 200 μL de uma mistura de

9:1 de dibutil phthalato: cicloexano e centrifugadas a 10.000 x g por 10 minutos a

temperatura ambiente. Alternativamente, nas etapas de subtração da biblioteca, quando os

fagos eram incubados com a linhagem de células normais após a centrifugação, recolhia-se

a fase líquida acima da camada orgânica e estes fagos eram incubados por mais 1,5 hora,

com as células tumorais em gelo. Após a centrifugação, o tubo foi congelado em nitrogênio

44

líquido para a base ser cortada, esse sedimento foi transferido para um tubo contendo 50 ml

de uma cultura de E.coli XL1-Blue em fase log e incubado por 15 minutos a temperatura

ambiente, para a recuperação dos fagos.

A. Seleção Negativa B. Seleção na célula tumoral

Figura 8. Método BRASIL de seleção de ligantes na superfície celular. A estratégia de seleção para isolar

fagos que se ligam especificamente em células de tireóide. A. Subtração da biblioteca em células controle, de

bócio. Células de bócio são incubadas com a biblioteca de fragmentos de anticorpos scFv e separadas por

centrifugação na fase orgânica. B. Seleção contra as células tumorais. O sobrenadante contendo células

tumorais (NPA) e após incubação as células e os fagos a elas ligados são separados por centrifugação em fase

orgânica. Os fagos aderidos às células tumorais no sedimento são recuperados por infecção de E. coli,

amplificados e usados em um novo ciclo de seleção (Adaptado de Giordano et al., 2001).

Célula controle de tireóide (bócio)

Célula tumoral de tireóide

Fagos apresentando o fragmento de anticorpo

Fase orgânica

45

3.9.8- Transformação de bactérias eletrocompetentes com a biblioteca scFv

selecionada

Após a seleção dos fragmentos de anticorpos scFv ligantes às células de Carcinoma

Papilífero da Tireóide (NPA), os mesmos foram expressos em sobrenadante de cultura por

bactérias TOP10 (Invitrogen) em placas do tipo deep well.

Para que a expressão em bactérias TOP10 fosse realizada, os fagos oriundos do

terceiro ciclo de seleção foram amplificados em bactérias XL1-Blue, o DNA plasmidial das

mesmas foi então extraído e utilizado para transformar bactérias TOP10 eletrocompetentes.

Para tanto, bactérias XL1-Blue foram amplificadas em 50 mL de meio SB contendo

10 μg/mL de tetraciclina até atingir uma OD600= 0,5. À cultura foram adicionados 90 μL de

fagos eluídos no segundo ciclo de seleção, seguido por incubação a temperatura ambiente

por 15 minutos e acréscimo de 2% (v/v) de glicose 2M e carbenicilina a uma concentração

final de 50 μg/mL. A cultura foi incubada por 14 horas a 37ºC e 250 rpm.

O DNA plasmidial das bactérias amplificadas foi extraído utilizando-se o kit

GenEluteTM Plasmid Miniprep (Sigma-Aldrich), seguindo-se as recomendações do

fabricante. O DNA foi quantificado em espectrofotômetro e utilizado para transformar

bactérias TOP10 eletrocompetentes. O protocolo utilizado para transformação foi o mesmo

descrito para a transformação de bactérias XL1-Blue com a biblioteca de anticorpos, com

poucas modificações. As bactérias transformadas foram plaqueadas em meio LB ágar

acrescido de 2% (v/v) de glicose 2M e carbenicilina a 50 μg/mL e incubadas a 37ºC por 16

horas.

46

3.10- Produção de scFv na forma solúvel

Em duas placas do tipo deep well de 96 poços foi adicionado, a cada poço, 1 mL de

meio SB contendo carbenicilina a 50 μg/mL e 2% (v/v) de glicose 2M, seguido pela

inoculação de uma colônia de bactérias TOP10 transformadas com a biblioteca de scFv

selecionada. Em um poço de cada placa, foram amplificadas bactérias TOP10 utilizadas

como controle da expressão e que foram transformadas apenas com o plasmídeo vazio

pComb3XSS, sem a inserção de sequências codificadoras para fragmentos de anticorpos

scFv. As placas foram seladas com filme plástico, sendo o mesmo perfurado para permitir a

aeração, seguido pela incubação por 14 horas a 37ºC e 300 rpm.

No dia seguinte, 50 μL de cultura de cada clone foram transferidos para outras duas

placas contendo, em cada poço, 1 mL de meio SB acrescido de carbenicilina a 50 μg/mL e

2% (v/v) de glicose 2M. As placas foram seladas, perfuradas e incubadas por 4 horas a

37ºC e 300 rpm.

Após incubação por 4 horas, as placas foram centrifugadas a 3.700 rpm por 10

minutos e o sobrenadante descartado. Cada pellet de bactérias foi então ressuspendido em 1

mL de meio SB contendo 50 μg/mL de carbenicilina e IPTG a uma concentração final de

2,5 mM. As placas foram incubadas por 18 horas a 30ºC e 300 rpm.

Após a incubação, as placas foram submetidas à centrifugação a 3.700 rpm durante

15 minutos a 4ºC, o pellet foi estocado com glicerol 25% a -20ºC e o sobrenadante

contendo as moléculas scFv na forma solúvel foi transferido para outra placa e armazenado

a 4ºC por até ser utilizado nos ensaios de Dot blot e ELISA.

47

3.11- Detecção de proteína recombinante por Dot blot

Para detectar os clones que secretavam scFv no sobrenadante de cultura induzida

por IPTG foi realizado o Dot blot. Para tanto, 5 μL do sobrenadante de cultura de cada

clone expresso foram aplicados em uma membrana de nitrocelulose HybondTM ECL de 0,2

μm (Amersham Biosciences) e deixados secar por 30 minutos a temperatura ambiente.

Em seguida, a membrana foi bloqueada com uma solução de PBS e BSA 3% por 1

hora a temperatura ambiente. Após o bloqueio, a membrana foi lavada 2 vezes com PBST

0,05% e então incubada em uma solução de PBS contendo o anticorpo anti-HA marcado

com peroxidase (Roche Applied Science) em diluição de 1:2.500 por 1,5 hora a

temperatura ambiente. Em seguida, a membrana foi lavada 3 vezes com PBST 0,05% e

revelada com SigmaFastTM 3,3‟-Diaminobenzidine (Sigma-Aldrich).

Para parar a reação, a membrana foi lavada com água e deixada secar a temperatura

ambiente.

3.12- Ensaio de Imunoadsorção por ligação enzimática (ELISA)

para seleção dos fragmentos de anticorpos scFv com maior afinidade às

proteínas de tumor de tireóide

3.12.1- Tecidos tireoidianos

Os fragmentos de tecidos tireoidianos (Tumor, Bócio e Adenoma) utilizados na

extração de proteínas para o ensaio ELISA foram provenientes de pacientes submetidos à

Tireoidectomia pela Equipe de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital das Clínicas de

Uberlândia, sob a coordenação do Dr. Sindeval José da Silva. O estudo foi aprovado pelo

48

Comitê de Ética da Universidade Federal de Uberlândia número 249/2009 (ANEXO 5),

assim como o Termo de Consentimento e Questionário (ANEXO 6 e 7).

3.12.2- Extração de proteínas totais

Proteínas totais foram extraídas de biópsias de tecido de tireóide, tais como: tumor

de Carcinoma Papilífero, Adenoma Folicular e Bócio colóide. Os tecidos foram macerados

em nitrogênio líquido, em seguida foi adicionado ao macerado o tampão de extração

(40mM Hepes pH 7,4, 10mM EDTA, 2mM EGTA, 1mM DTT, 1mM Benzamidina,

0,5mM PMSF) e por fim centrifugado por 30 minutos a 4000 x g. O sobrenadante foi

coletado e as proteínas quantificadas pelo método de Bradford. O perfil protéico foi

avaliado por SDS-PAGE (10%).

3.12.3- ELISA

Após a análise da expressão dos fragmentos de anticorpos em sobrenadante de

cultura por Dot blot, os clones com marcação positiva foram testados em ensaio

imunoenzimático ELISA para seleção daqueles com maior afinidade às proteínas de tumor

de carcinoma Papilífero de tireóide.

Uma placa de microtitulação de alta afinidade (Nunc) foi sensibilizada em triplicata

com 1 μg de proteínas de tecido de tumor, Adenoma e bócio colóide em poços diferentes.

As proteínas foram diluídas 100 μL de tampão carbonato (bicarbonato de sódio 0,1M, pH

8,6), que foram então incubados por 14 horas a 4°C.

As placas foram lavadas 3 vezes com 350 μL/poço de PBST 0,05% (PBS e Tween

20 a 0,05%) e bloqueadas com 350 μL/poço de PBSM 5% (PBS e leite desnatado a 5%),

sendo então incubadas a 37ºC por 1 hora.

49

Após o bloqueio, cada poço foi lavado 3 vezes com 350 μL de PBST 0,05% e

incubado por 2 horas a 25ºC com 50 μL de sobrenadante de cultura de bactérias contendo

os fragmentos de anticorpos scFv expressos. As placas foram lavadas 3 vezes com 350

μL/poço de PBST 0,05% e incubadas por 1 hora a 37ºC em uma solução de PBSM 5%

contendo o anticorpo anti-HA marcado com peroxidase (Roche Applied Science) em

diluição de 1:1000.

Após a incubação, as placas foram lavadas 4 vezes com 350 μL/poço de PBST

0,05% e reveladas com SigmaFastTM OPD (Sigma-Aldrich). A reação foi parada utilizando-

se 20 μL/poço de ácido sulfúrico 4N e as placas lidas a 492 nm em leitor de microplaca

(ThermoPlate).

3.12.4 Gráficos

Os resultados do ensaio Elisa foram analisados por gráficos construídos no

programa Prisma.

3.13- Sequenciamento de DNA

O sequenciamento das cadeias leve e pesada da biblioteca de anticorpos e dos

clones selecionados após o Biopanning foi realizado utilizando o kit DyEnamic ET Dye

Terminator Cycle Sequencing e o seqüenciador automático capilar MegaBaceTM 1000 (GE

Healthcare). O DNA dos clones selecionados foram extraídos de bactérias TOP10

utilizando-se o kit GenEluteTM Plasmid Miniprep (Sigma-Aldrich), seguindo-se as

recomendações do fabricante.

50

As amostras foram preparadas em placas de 96 poços contendo aproximadamente

500 ng de DNA plasmidial e 2,5 picomoles do oligonucleotídeo MMB4 (senso) ou 2,5

picomoles do oligonucleotídeo MMB5 (reverso) em um volume final de 10 µL.

As reações de PCR foram realizadas nas seguintes condições:

1) 95ºC por 20 segundos;

2) 50ºC por 15 segundos;

3) 60ºC por 1 minuto.

As reações foram precipitadas com o kit de seqüenciamento conforme

recomendações do fabricante e as placas foram injetadas imediatamente no seqüenciador

automático.

3.14- Purificação de scFv por cromatografia de afinidade em HPLC

A cromatografia líquida de alta afinidade (HPLC) para purificação de proteínas é

fundamentada na capacidade de alguns aminoácidos doadores de elétrons tais como a

histidina (his), o triptofano (trp) e a fenilalanina (phe) de se ligarem de maneira reversível a

íons metálicos (como o níquel) imobilizados em uma matriz. O Kit HisTrap HP (GE

Healthcare Life Sciences) utilizado neste passo foi desenvolvido para uma rápida e

reproduzível purificação de proteínas recombinantes expressas com calda de histidina

(HisTag). A purificação foi realizada seguindo as recomendações do fabricante.

O sobrenadante de cultura de 200 mL resultante da expressão dos fragmentos de

anticorpos scFv por bactérias TOP10 (produzido como descrito no item 3.9, resguardada as

51

devidas proporções), foi dividido em quatro alíquotas de 50 mL, centrifugado a 10.000 rpm

por 60 minutos a 4°C e então filtrado em filtro de 0,45 μm (Millipore). Para preparar a

amostra, 25 mL de tampão fosfato 8X e 1 mL de imidazol 2M foram adicionados a 174 mL

do sobrenadante de cultura filtrado. O pH da solução foi então ajustado para 7,4.

A coluna HisTrap de 1 mL foi umidificada pela injeção de 5 mL de água destilada e

conectada ao aparelho HPLC. Em seguida, a coluna foi equilibrada com 10 mL de tampão

de ligação (Fosfato 20 mM, NaCl 0,5 M, Imidazol 20mM, pH 7,4).

A amostra foi aplicada à coluna sob fluxo de 2 mL/min até o volume final de 50 mL

por purificação. Em seguida, a coluna foi lavada com 10 mL de tampão de ligação para

lavagem das moléculas não ligantes.

Após a lavagem, os fragmentos de anticorpos foram eluídos com 5 mL de tampão

de eluição (Fosfato 20 mM, NaCl 0,5 M, Imidazol 500 mM, pH 7,4), que foram coletados

em alíquotas de 0,5 mL. As alíquotas foram armazenadas a 4ºC e analisadas por dot blot

para detecção dos anticorpos scFv, seguindo-se o mesmo protocolo descrito anteriormente.

A amostra resultante foi congelada a -80ºC por 1 hora, liofilizada por 24 horas e

ressuspendida em 1 mL de água bidestilada. A amostra foi então quantificada em

espectrofotômetro NanoDrop® e estocada a -20ºC.

3.15- Ensaios de Western Blotting

Foi realizado o ensaio de western blottting para detectar a presença do scFv-C1 na

amostra produzida pela purificação cromatográfica, 50 μg do scFv purificado foram

separadas eletroforeticamente em um gel SDS-PAGE 16% e, em seguida, transferidas para

uma membrana de nitrocelulose (HybondTM-ECL de 0,2 μm; Amersham- Biosciences)

52

utilizando-se o sistema de transferência Mini Trans-Blot Eletrophoretic Transfer Cell (Bio-

Rad). A transferência foi realizada durante 16 horas sob as condições elétricas de 300 V e

20 mA a 4°C.

Após a confirmação da transferência pela visualização do marcador na membrana, a

mesma foi incubada sob agitação com PBSM 5% (PBS e Leite Desnatado 5%) a

temperatura ambiente por 1 hora para bloqueio de sítios inespecíficos. A membrana foi

então lavada três vezes com tampão PBST 0,05%.

Após o bloqueio, a membrana foi incubada sob leve agitação, a 37ºC e por 2 horas

com PBSM 5% contendo o anticorpo anti-HA conjugado com peroxidase (Roche) na

proporção de 1:5000. Em seguida, a membrana foi lavada três vezes com PBST 0,05% e

revelada com SigmaFastTM 3,3‟- Diaminobenzidine (Sigma-Aldrich). Para parar a reação, a

membrana foi lavada com água e deixada secar a temperatura ambiente.

3.16- Imunoistoquímica

3.16.1- Procedimento

A afinidade do fragmento de anticorpo scFv aos tecidos tireoidianos foi verificada

por imunoistoquímica. Inicialmente foram feitas algumas lâminas testes e em seguida,

duzentos e vinte nove casos de tireóide foram analisados utilizando uma lâmina de Micro-

arranjo de tecido (TMA) fornecida pelo Prof. Dr. Fernando Augusto Soares do

Departamento de Anatomia Patológica do Hospital AC Camargo, São Paulo. A lâmina

TMA era composta por 110 casos de carcinoma diferenciado de tireóide, sendo 38 de

Carcinoma Papilífero, 42 de Folicular e 30 de Papilífero variante Folicular e também casos

benignos como 35 Adenomas Foliculares, 49 Bócios e 18 tireóides normais.

53

Os cortes foram desparafinizados em banho de xilol a 110°C e, a seguir, banhos

subseqüentes em xilol à temperatura ambiente. Logo após este processo, as lâminas foram

hidratadas em álcool etílico nas concentrações decrescentes de 100%, 80%, 50% e

posteriormente lavadas por 5 minutos em água corrente e destilada. Em seguida, as secções

foram incubadas com peróxido de hidrogênio 3% por três vezes de 5 minutos para bloqueio

da peroxidase endógena.

Para a recuperação antigênica, as lâminas foram imersas em tampão citrato de sódio

(1M, pH 6,0) a 95ºC durante 35 minutos, para atingir a temperatura desejada foi utilizada a

panela a vapor Arno Aqua Timer. Após as lâminas esfriarem, estas foram lavadas por 5 min

em água corrente e destilada, e em seguida incubadas com PBSBSA 10% durante 30

minutos à temperatura ambiente com para bloqueio dos sítios inespecíficos.

Os cortes foram lavados com PBS e o scFv-C1 foi adicionado às secções, seguido

por incubação overnight a 4ºC. Os cortes utilizados como controles negativos da reação

foram incubados somente com PBS. A ligação dos fragmentos de anticorpos ao antígeno

foi verificada pela incubação dos cortes com o anticorpo anti-HA conjugado com

peroxidase (Sigma-Aldrich) diluído no tampão (Novocastra IHC Diluent) na proporção de

1:200.

Após esta etapa, para realçar a marcação da peroxidade as lâminas foram incubadas

com o reagente Advance HRP Enzyme (Dako) a 37° C durante 30 minutos. Posteriormente,

o anticorpo que reagiu com as células tireoidianas foi detectado com DAB líquido (3-3‟ –

diaminobenzidine tetrahydrochloride, Dako código K3468) durante cinco minutos a

temperatura ambiente e em seguida as lâminas foram contracoradas com Hematoxilina de

Mayer durante 30 segundos.

54

Por fim, os cortes foram desidratados com álcool etílico e diafanizadas em xilol, e

em seguida montadas utilizando Entellan™ (Merck 1079610100).

3.16.2- Estadiamento dos tumores dos pacientes da lâmina de micro-arranjo de

tecido (TMA)

O estadiamento das neoplasias malignas da tireóide da lâmina TMA foram

classificadas de acordo com a sexta edição do International Union Against Cancer (UICC),

que se baseia na idade do paciente ao diagnóstico, no tipo histológico e no sistema TNM.

Este sistema inclui 3 componentes: o tamanho do tumor primário (T), a presença ou

ausência de metástase para linfonodo regional (N) e a presença ou ausência de metástase a

distância (M) (Varandas et al., 2004) (Quadro 1).

Quadro 1. Classificação do Carcinoma da Tireóide de acordo com a 6ª edição da UICC

(International Union Against Cancer)

Tumor

Tx Sem definição do tamanho tumoral

T1 < 2cm, restrito à tireóide

T2 > 2 e ≤ 4 cm, restrito à tireóide

T3 > 4 cm, restrito à tireóide ou mínima extensão extra-tireoideana

T4a tumor com extensão além da cápsula,invasão de tecido mole subcutâneo,

laringe, traquéia, esôfago ou nervo laringeo recorrente

T4b tumor invadindo fáscia pré-vertebral, vasos mediastínicos ou artéria

carótida

Linfonodo

Nx Sem definição de acometimento de linfonodos

N1 Metástase para linfonodo regional

N1a Metástase nível VI (pré e para-traqueal, pré-laríngeo e de Delphian)

N1b Metástases em outros cervicais unilaterais,bilaterais ou contra-laterais ou

55

mediastínicas

Metástase

Mx Sem definição de metástases à distância

M0 Sem metástases à distância

M1 Metástases à distância

Estádio I TxNxM0 < 45 anos; T1N0M0 ≥ 45 anos

Estádio II TxNxM1 < 45 anos; T2N0M0 ≥ 45 anos

Estádio III T3N0M0 > 45 anos; T1–3N1aM0 ≥ 45 anos

Estádio IV IVA: T1-3N1bM0 > 45 anos; T4aN0–1 M0 ≥ 45 anos

IVB: T4bNxM0 ≥ 45 anos

IVC: TxNxM1 ≥ 45 anos

Fonte: (Varanda et al., 2007)

De acordo com a classificação de TNM da International Union Against Cancer

(UICC) os casos da lâmina TMA foram agrupados de acordo com o Quadro 2.

Quadro 2. Classificação do TNM dos pacientes da lâmina TMA

TNM Estadiamento

TNM 1 T1

TNM 2 T2

TNM 3 T3

TNM 4 T4a e T4b

TNM 5 Estádio IV: subgrupo IVA

TNM 6 Estádio IV: subgrupo IVB

TNM 7 Estádio IV: subgrupo IVC

56

3.16.3- Leitura dos resultados

A verificação da marcação do fragmento de anticorpo scFv pelos tecidos de tireóide

foi analisada de modo semi-objetivo pelo Prof. Dr. José Vassallo e pela Dra. Elaine Cristina

Morari no microscópio óptico de luz (Axiophot, Zeiss). A análise semi-objetivo foi

realizada da seguinte maneira, toda a extensão do tecido foi analisada e os casos positivos e

negativos foram diferenciados e agrupados, foram consideradas positivas as células com

coloração marrom. Depois de confirmada a marcação positiva do scFv, a intensidade e a

área da marcação dos casos da lâmina TMA foram quantificados pelo equipamento ACIS

(Dako) do Hospital AC Camargo, São Paulo.

Inicialmente a lâmina TMA foi digitalizada e as imagens fornecidas pelo software

foram exibidas em um monitor. A partir dessas imagens foi realizada uma padronização

prévia do contraste, foco e saturação das imagens dos tecidos, ou seja, foram determinadas

para o software algumas regiões consideradas como marcação positiva ou negativa para

posteriormente este diferenciar o que é marcação positiva de negativa e também excluir as

marcações de artefatos. Após essa padronização foram realizadas todas as análises de

intensidade da coloração.

Para avaliar a intensidade da coloração, o sistema de análise de imagem

HistoQuant ™ (3DHistech ™, Budapeste, Hungria) foi utilizado. Este software

identifica e quantifica a marcação da imunoistoquímica minimizando a presença de

artefatos de coloração através de filtros de imagem. O valor relativo emitido pelo software

referente à intensidade da coloração varia de 0 a 250, o valor 0 é o mínimo e

correspondente a luz branca e o valor 250 é o máximo e corresponde a luz negra.

A intensidade da coloração e a área da marcação de cada paciente foram analisadas

em triplicata, foram consideradas três regiões diferentes de cada spot, os valores numéricos

57

da intensidade e da área da marcação foram anotados, em seguida foi realizada a média

desses valores para cada grupo de pacientes. Além disso, os valores da intensidade e da

área da marcação foram submetidos à seguinte fórmula: intensidade multiplicada pela área

marrom e dividida pelo somatório área azul mais área marrom, essa fórmula foi realizada

para as três análises de cada paciente e depois foi feita a média para obter um valor único

para cada caso, com esse valor foi realizada a análise estatística.

3.16.4- Análise estatística

O software SPSS (Software Package Statistical System) versão 10.0 foi utilizado

para as análises estatísticas e o Prisma para fazer os gráficos. O teste Qui-quadrado foi

usado para avaliar a diferença entre freqüências de variáveis categorizadas e o teste

ANOVA quando as variáveis eram quantitativas.

Inicialmente foi feita uma análise descritiva da freqüência dos resultados positivos

ou negativos da imunoistoquímica para cada grupo de pacientes. Posteriormente, foi

utilizado o teste Qui-quadrado para comparar o resultado da marcação do scFv entre duas

variáveis de anátomo patológico, como o Carcinoma Papilífero e o Adenoma Folicular. A

finalidade dessa análise foi avaliar se a marcação desse fragmento de anticorpo é capaz de

diferenciar os grupos de pacientes, foram consideradas significativas as diferenças com

valor p<0,05.

O teste Qui-quadrado também foi empregada ao grupo câncer (Papilífero, Folicular

e Papilífero Variante Folicular) para correlação da marcação do scFv e o estadiamento do

tumor. Essa análise foi baseada na classificação do carcinoma da tireóide de acordo com a

6ª edição da UICC (International Union Against Cancer) apresentado no Quadro 1 do item

3.15.2. Foram comparados os tumores de estágio inicial e restritos a tireóide (T1 e T2)

58

contra os demais estágios, com tumores com extensão extra-tireoidiana, com acometimento

de linfonodos e ou metástase. O objetivo dessa análise foi verificar se o fragmento de

anticorpo scFv reconhece tumores de estágio inicial ou avançado, de mal prognóstico.

Outra comparação utilizando o Qui-quadrado foi realizada entre o resultado da

imunoistoquímica (positivo ou negativo) com os dados clínicos, como a presença ou

ausência de metástase no paciente e conclusão clínica de cura ou evolução ruim (presença

de metástase ou aumento da tireoglobulina). Definiu-se o prognóstico como bom para os

pacientes que evoluíram sem evidência de doença ativa, caracterizando este grupo por níveis de

Tg abaixo de 2ng/dL, ausência de queixas ou imagens suspeitas de recidiva local ou à distância

durante o período de acompanhamento. E como pertencentes ao grupo de má evolução ou de

mau prognóstico os pacientes que apresentavam evidência de recidiva local ou à distância ou

que evoluíram para óbito durante o acompanhamento.

A análise estatística da intensidade e área da marcação entre os grupos de pacientes

foi realizada pelo teste ANOVA, seguido do coeficiente de correção Bonferroni, sendo

consideradas significativas as diferenças com valor p<0,05. Nessa análise foi utilizada a

fórmula intensidade e área da marcação descrita no item anterior.

59

4-RESULTADOS

60

4.1- Amplificação dos fragmentos da cadeia pesada (VH) e da cadeia

leve (VL) e dos fragmentos scFv

Os tamanhos dos fragmentos gênicos observados no gel de agarose correspondentes

às cadeias leves VL (cerca de 350 pb) e pesada VH (cerca de 400 pb) coincidiram com o

tamanho esperado (Figura 9). A figura 9C mostra o produto resultante da fusão gênica entre

as cadeias leves e pesada resultando no fragmento scFv com tamanho igual a 800 pb.

Nos três géis de agarose da Figura 9 foi observada a presença de vários fragmentos

de DNA de tamanhos diferentes do esperado, no caso das cadeias leves e pesadas isso é

devido à amplificação de produtos inespecíficos, e com relação ao gel do scFv os produtos

menores que 800 pb são fragmentos de VH e VL que não foram unidos na formação do

produto final.

4.2- Análise do repertório da biblioteca de scFv

Foram seqüenciadas 48 amostras com os primers MMB4 para VH e MMB5 para

VL, os resultados das seqüências com o primer MMB4 foram apresentados maiores e de

melhor qualidade. Com a análise do repertório da biblioteca realizado no programa IgBlast

pode-se concluir que a biblioteca resultante possui no mínimo genes VH de três famílias

diferentes (VH 1, 3 e 4) e os genes da cadeia leve pertencem às famílias VL 1, 2, 3 , 4, 6 e

7. As seqüências resultantes da análise no programa Igblast foram caracterizadas quanto à

família e as regiões determinantes de complementariedade (CDR) e framework (FR,

regiões conservadas) indicadas na Tabela 2.

61

Figura 9. Análise do produto da amplificação das regiões variáveis da cadeia pesada (VH),

cadeia leve (VL) e do fragmento de anticorpo scFv. A. Colunas 1 a 6: Fragmentos VH (~400pb),

B. Colunas 1a 6: Fragmentos VL (~350pb), C. Colunas 1 a 6: Fragmentos scFv (~800pb). Tanto em

A quanto em B e C- Coluna M é Marcador de massa molecular 100pb (Invitrogen). Eletroforese em

gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio.

62

Tabela 2. Seqüência de aminoácidos de clones VL (Cadeia variável leve: kappa ou lambda) obtidos no programa IgBlast. As regiões

determinantes de complementariedade (CDR) e framework (FR, regiões conservadas) estão indicadas. IGKV= Imunoglobulina variável leve

kappa, IGLV= Imunoglobulina variável leve lambda.

Clone

família

VL

FR 1 CDR 1 FR 2 CDR 2 FR 3 CDR 3

Subgrupo I

IGKV1-5*03 D I Q M T Q S P S T L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I S S W L A W Y Q Q K P G K A P K L L I Y K A S S L E S G V P S R F S G S G S G T E F T L T I S S L Q P

IGKV1D-33*01 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C Q A S Q D I S N Y L N W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D A S N L E T G V P S R F S G S G S G T D F T F T I S S L Q P E D I A T Y Y C Q Q Y D N L P

IGKV1D-16*01 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q G I S S W L A W Y Q Q K P E K A P K S L I Y A A S S L Q S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C QQ

IGKV1-16*01 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q G I S N Y L A F Q Q K P G K A P K S L I Y A S S L Q S S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y

IGKV1D-12*02 D I Q M T Q S P S S V S A S V G D R V T I T C R A S Q G I S S W L A W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A A S S L Q S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D

IGKV1D-13*01 T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q G I S S A L A W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D A S S L E S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A

IGLV1-44*01 Q S V L T Q P P S A S G T P G Q R V T I S C S G S S S N I G S N T V N W Y Q Q L P G T A P K L L I Y S N N Q R P S G V P D R F S G S K S G T S A S L A I S G L Q S E D E A D Y Y

IGLV1-47*01 Q S V L T Q P P S A S G T P G Q R V T I S C SG S S S N I G S N Y V Y W Y Q Q L P G T A P KL L I Y R N N Q R P S G V P D R F S G S K S GT S A S L A I S G L R S E D E A D Y Y C

IGLV1-51*01 Q S V L T Q P P S V S A A P G Q K V T I S C S G S S S N I G N N Y V S W Y Q Q L P G T A P K L L I Y D N N K R P S G I P D R F S G S K S G T S A T L G I T G L Q T G D E A D Y Y C

IGLV2-8*01 Q S A L T Q P P S A S G S P G Q S V T I S C T G T S S D V G G Y N Y V S W Y Q Q H P G K A P K L M I Y E V S K R P S G V P D R F S G S K S G N T A S L T V S G L Q A E D E A D Y Y C SSY

Subgrupo II

IGKV2D-30*01 D V V M T Q S P L S L P V T L G Q P A S I S C S S Q S L V Y S D G N T Y L N W F Q Q R P G Q S P R R L I Y K V S N W D S G V P D R F S G S G S G T D F T L K I S R V E A E D V G V Y YC

IGLV2-14*01 Q S A L T Q P A S V S G S P G Q S I T I S C G T S S D V G G Y N Y V S W Y Q Q H P G K A P K L M I Y E V S N R P S G V S N R F S G S K S G N T A S L T I S G L Q A E D E A D Y Y C

Subgrupo III

IGKV3-20*01 E V L T Q S P G T L S L S P G E R A T L S C R A S Q S V S S S Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y G A S S R A T G I P D R F S G S G S G T D F T L T I S R L

IGKV3-11*01 E I V L T Q S P A T L S L S P G E R A T L S C R A S Q S V S S Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y D A S N R A T G I P A R F S G S G S G T D F T L T I S S L E P E D F

IGKV3-15*01 E I V M T Q S P A T L S V S P G E R A T L S C R A S Q S V S S N L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y G A T R A T G I P A R F S G S G S G T E F T L T I S S L Q S E D F A V Y Y C Q

IGLV3-21*02 L T Q P P S V S V A P G Q T A R I T C G G N N I G S K S V H W Y Q Q K P G Q A P V L V V Y DD S D R P S G I P E R F S G S N S G N T A T L T I S R V E A G D E A D

Subgrupo IV

IGLV4-69*01 Q L V L T Q S P S A S A S L G A S V K L T C T L S S G H S S Y A I A W H Q Q Q P E K G P R Y D G S H S K G D G I P D R F S G S S S G A E R Y L T I S S L Q S E D E A D Y

Subgrupo VI

IGLV6-57*01 N F M L T Q P H S V S E S P G K T V T I S C T R S S G S I A S N Y V Q W Y Q Q R P G S S P T T V I Y E D N Q R P S G V P D R F S G S I D S S S N S A S L T I

Subgrupo VII

IGLV7-46*02 Q A V V T Q E P S L T V S P G G T V T L T C GS S T G A V T S G H Y P Y W F Q Q K P G Q A P R T L I Y D T S N K H S W T P A R F S G S L L G G

63

4.3- Culturas de células humanas de tireóide

As células humanas de tireóide (Figura 10), tanto da cultura secundária tumoral

(NPA) como da primária de bócio, cresceram em suspensão no meio, o que dificultou o

contato entre célula-célula importante para a dispersão celular, por isso essas linhagens

apresentaram crescimento celular lento e demoraram cerca de um mês para atingirem a fase

log, período durante o qual a multiplicação é máxima e constante. A cultura primária de

bócio apresentou crescimento mais lento comparado com a cultura secundária e tempo de

vida curto de aproximadamente três meses, após esse período foi observada grande número

de células mortas. Já a cultura secundária é capaz de proliferar indefinidamente e não

entrou em fase de senescencia.

Figura 10. Culturas de células

humanas de tireóide visualizada em

microscópio invertido. Cultura primária

de bócio (A) 400X, (B) 200X e cultura

secundária de células tumorais de

tireóide (C) 200X.

64

4.4- Análises dos clones selecionados

4.4.1- Análise Monoclonal por Dot Immunoblotting

Os clones do último ciclo de seleção depois de induzidos com o reagente IPTG para a

produção de scFv na forma solúvel foram avaliados por Dot Immunoblotting quanto à expressão

desses fragmentos no sobrenadante de cultura, como mostrado na Figura 11.

Dentre os 96 fragmentos de anticorpos expressos em placas deep well, 21 clones (23%)

expressaram o epítopo da hemaglutinina e foram reconhecidos pelo anticorpo anti-HA no Dot

blottting. Os clones positivos foram utilizados no ensaio imunoenzimático ELISA para seleção

dos fragmentos de anticorpos scFv com maior afinidade às proteínas de tumor de tireóide.

Figura 10. Dot Immunoblotting para análise da expressão dos fragmentos de anticorpos em cultura

induzida por IPTG. As marcações circundadas na membrana foram consideradas positivas, sendo os

demais clones negativos por não apresentarem reatividade ao anticorpo anti- HA.

65

4.4.2- Ensaio de Imunoadsorção por ligação enzimática (ELISA) para seleção dos

fragmentos de anticorpos scFv com maior afinidade às proteínas de tumor de tireóide

4.4.2.1- Análise das proteínas utilizadas no ensaio ELISA por eletroforese em gel

SDS-PAGE

O processo de extração de proteínas de tecidos tireoideanos, como o tumor, Adenoma e

bócio foi eficiente, como pode ser observado pelo padrão de bandas formadas no gel SDS-

PAGE (Figura 12), no qual o evidenciamento de várias bandas é um indicativo da diversidade

das proteínas.

Figura 11. Gel SDS-PAGE para análise das proteínas extraídas de tecidos

tireoidianos. Coluna M: Marcador de peso molecular Prestained SDS-PAGE

Standards Broad Range (Bio-rad). Colunas 1 a 6: 15 microgramas de proteínas de

tecidos tireoidianos de bócio.

4.4.2.2- Elisa em extrato protéico

O ensaio imunoenzimático ELISA possibilitou a seleção de treze fragmentos de

anticorpos com maior afinidade às proteínas tumorais de tireóide. Os resultados foram

66

analisados quanto à absorbância absoluta e quanto à razão entre as reatividades dos clones às

proteínas de tumor pela média entre Bócio e Adenoma.

O fragmento de anticorpo scFv-C8 mostrou maior reatividade absoluta, provavelmente

devido a sua maior produtividade no sobrenadante de cultura. Entretanto, a análise quanto à

razão entre as reatividades às proteínas de tumor e Bócio e Adenoma, os clones A4, A9, C1, E4

e F3 mostraram as maiores diferenças (Gráfico 1). O sobrenadante de cultura de bactérias

expressando o pComb3XSS vazio, sem a inserção de um fragmento de anticorpo scFv, foi

analisado quanto à reatividade às proteínas de tumor de tireóide, Bócio e Adenoma e, em todos

os casos, foi pouco reativo.

Gráfico 1. Elisa para análise da reatividade dos scFvs selecionados. Fragmentos de anticorpos scFv solúveis

(induzidos por IPTG) contra proteínas de tecido de Câncer (azul), Adenoma (rosa) e Bócio (verde). Todos os

clones mostraram melhor reatividade com as proteínas de câncer. Razão OD 492nm: proteínas de câncer dividido

pela média entre as proteínas de Adenoma e Bócio de cada clone analisado.

Razão DO 492nm

Câncer/ Média (Bócio: Adenoma)

A4- 1,90

A5- 1,65

A9- 2,07

C1- 2,04

C4- 1,58

C8-1,69

C9- 1,86

D8- 1,50

D11- 1,73

E3-1,62

E4-2,02

F3-1,94

G1- 1,72

67

4.4.3- Clone selecionado para imunoistoquímica

O clone scFv-C1 foi escolhido para a realização da imunoistoquímica, pois apresentou

melhor afinidade às proteínas de tumor comparado com as proteínas de bócio e adenoma no

ensaio Elisa.

4.4.4- Análise in Silico do clone selecionado

A análise da sequência do clone scFv-C1 realizada no programa IgBlast foi feita como

na Figura 10. A Cadeia Leve (VL) e Pesada (VH) desse fragmento de anticorpo fazem parte da

família 3, com as respectivas denominações fornecidas pelo programa, IGLV3-21*03 e

IGHV3-7*01.

4.5- Imunoistoquímica

O fragmento de anticorpo monoclonal scFv, clone C1, foi empregado em um micro-

arranjo de tecido (TMA) contendo 229 casos de tireóide. Formado por 110 Carcinomas

Diferenciados da Tireóide, sendo 38 de Carcinoma Papilífero, 42 de Folicular e 30 de Papilífero

variante Folicular e também casos benignos como 35 Adenomas Foliculares, 49 Bócios e 18

tireóides normais. Destes, 164 eram do sexo feminino e 36 do sexo masculino e a idade ao

diagnóstico variou de 15 a 88 anos, com média de 48,78±15,95 anos. Os dados do TNM e

tempo de seguimento em meses do grupo Carcinoma também estão na inseridos na Tabela 3.

68

Tabela 3. Características dos pacientes da lâmina de micro-arranjo (TMA)

O scFv-C1 reagiu especificamente ao citoplasma e membrana das células tumorais de

tireóide, e não ocorreu marcação nos tecidos controles incubadas sem o anticorpo scFv

representado na Figura 13. A marcação do anticorpo recombinante scFv foi positiva em 55%

dos casos de carcinomas, ou seja, o anticorpo provavelmente reconhece uma proteína que não é

Carcinomas Controles

Papilífero Pap. Variante

Folicular Folicular

Adenoma

Folicular

Bócio

colóide

Tireóide

Normal

Números de pacientes Números de pacientes

Total 38 30 42 52 49 18

Idade

Média 48 46 55

45 48 58

Mín- Máx 16-69 15-74 28-88 15-77 16-77 30-73

F(%)/ M(%) 26 (74,3)

9 (25,7)

21 (77,8)

6 (22,2)

31 (83,8)

6 (16.2)

41 (83,7)

8 (16,3)

31 (83,8)

6 (16,2)

14 (93,3)

1 (6,7)

TNM n/total (%)

1.T1 18/38 (47,4) 19/26 (73,1) 7/17 (41,2)

2.T2 1/38 (2,6) 2/26 (7,7) 3/17 (17,6)

3.T3 10/38 (26,3) 4/26 (15,4) 0

4. T4a e b 0 0 0

5.IVA 6/38 (15,8) 0 1/17 (5,9)

6.IVB 1/38 (2,6) 1/26 (3,8) 5/17 (29,4)

7.IVC 2/38 (5,3) 0 1/17 (5,9)

Tempo

seguimento

Média (Min-

Max)

51,08 (9-81) 51,92 (21-87) 70,57 (1-175)

69

expressa em todos os pacientes com carcinoma de tireóide. Com relação ao grupo controle,

houve marcação positiva do scFv em 29% dos casos de Adenoma, em 6% dos Bócios e não

ocorreu marcação em tireóides normais (Tabela 4).

Figura 12. Reatividade do fragmento de anticorpo scFv nas células tumorais de tireóide, em marrom

(indicado pelas setas). Marcação positiva na lâmina A. Carcinoma Papilífero (aumento original x 400) e B.

Carcinoma Folicular (aumento original x 200). Marcação negativa foi observada em C. Bócio (aumento original

x 400) e na lâmina controle D. um Carcinoma Papilífero sem o scFv-C1.

70

Tabela 4. Resultado da marcação do fragmento de anticorpo scFv- C1 para as variáveis a

anátomo patológicas dos casos de tireóide analisados por micro-arranjo de tecido (TMA)

Análises estatísticas realizadas no programa SPSS revelaram que a marcação positiva do

fragmento de anticorpo scFv foi capaz de diferenciar o grupo câncer do grupo controle com

significância estatística (p< 0,0001), entretanto para o grupo câncer não distinguiu os casos de

Carcinoma Papilífero, Folicular e Papilífero variente folicular (Tabela 5).

No grupo câncer foi realizada a análise estatística para verificar se existe relação entre a

marcação do anticorpo scFv- C1 e o estadiamento do tumor. Foi observado que o scFv reagiu

em maior número de tumores pequenos e restritos a tireóide (T1 e T2), ou seja, reconheceu

tumores considerados de baixa agressividade e de bom prognóstico. O valor de p resultante

dessa comparação foi igual a 0,005, considerado um valor limítrofe e estatisticamente

significativo.

Também com relação ao prognóstico, foi observado a reatividade do scFv-C1 em maior

número de casos de pacientes com boa evolução. Do total de 49 pacientes positivos na

Variáveis Fragmento de anticorpo scFv-C1

Negativo

N (%)

Positivo

N (%)

Total

Carcinoma Papilífero 18 (47%) 20 (53%) 38

Carcinoma Papilífero variante

Folicular 15 (50%) 15 (50%) 30

Carcinoma Folicular 17 (40%) 25 (60%) 42

Adenoma Folicular 37 (71%) 15 (29%) 52

Bócio 46 (97%) 3 (6%) 49

Normal 18 (100%) 0 18

Total 110

71

imunoistoquímica, 40 casos eram de pacientes com evolução sem metástase. Entretanto, esse

dado não foi estatisticamente significativo (p=0,916) devido ao pequeno número de casos de

pacientes com mal prognóstico, o que impossibilita a comparação entre os dois grupos (bom e

mal prognóstico).

Tabela 5. Comparação entre a marcação positiva do anticorpo scFv-C1 e as variáveis anátomo

patológicas das casos de tireóide analisados por micro-arranjo de tecido (TMA)

Variáveis

N casos (% positivo para o anticorpo scFv-C1)

P#

Grupo Câncer

N=110 (55%)

Normal 18 (0%) 0,000*

Bócio 49 (6%) 0,000*

Adenoma Folicular 52 (29%) 0,002*

Grupo controle 119 (15%) 0,000*

Carcinoma Papilífero

N=38 (52%)

Normal 18 (0%) 0,000*

Bócio 49 (6%) 0,000*



Folicular 30 (50%) 0, 829

Carcinoma Folicular 42 (59%) 0,535


Folicular

N=30 (50%)

Normal 18 (0%) 0,000*

Bócio 49 (6%) 0,000*


Carcinoma Folicular 42 (59%) 0,423

Carcinoma Folicular

N=42 (59%)

Normal 18 (0%) 0,000*

Bócio 49 (6%) 0,000*


O grupo Carcinoma é formado pelo Carcinoma Papilífero, Papilífero variante Folicular e o

Folicular, e o grupo Controle pelos casos de Bócio, Adenoma Folicular e tireóide normal. #valor de P para comparação de freqüências.

*valor de P significativo entre os grupos.

72

A análise da intensidade para cada grupo está representada no Gráfico 2. A, e os valores

resultantes da fórmula da intensidade e área da marcação no Gráfico 2. B. A análise estatística

da intensidade e área da marcação entre os grupos de pacientes foi realizada pelo teste

ANOVA- Bonferroni (Tabela 6) foi observada diferença significativa entre o grupo Carcinoma

Papilífero clássico em relação ao bócio e tireóide normal, o Carcinoma Papilífero variante

Folicular foi diferente dos grupos bócio e tireóide normal, o Carcinoma Folicular apresentou

diferença estatística além dos casos de bócio e tireóide normal foi diferente também do grupo

Adenoma Folicular. Não foi observada diferença significativa entre os carcinomas.

Gráfico 2. Análise da intensidade e área da coloração na lâmina TMA. O Gráfico A. mostra o valor relativo da

intensidade da coloração de todos os pacientes positivos na imunoistoquímica. O Gráfico B. apresenta os valores

resultantes da fórmula intensidade e área da marcação: intensidade multiplicada pela área marrom e dividida pelo

somatório área azul mais área marrom. n= Número de casos positivos na Imunoistoquímica para cada grupo

anátomo patológico. * O valor de P é significativo entre os grupos.

73

Tabela 6. Análise da intensidade e área da marcação entre os grupos com o teste ANOVA-

Bonferroni

Grupo de pacientes P


Carcinoma Papilífero Variante Folicular

Carcinoma Folicular

Tireóide Normal

Bócio

Adenoma Folicular

1,000

1,000

0,001*

0,000*

0,109


variante Folicular

Carcinoma Folicular

Tireóide Normal

Bócio

Adenoma Folicular

1,000

0,004*

0,000*

0,319

Carcinoma Folicular

Tireóide Normal

Bócio

Adenoma Folicular

0,000*

0,000*

0,003*

Adenoma Folicular Tireóide Normal

Bócio

0,527

0,189 * A diferença é significativa entre os grupos.

74

5- DISCUSSÃO

75

O objetivo do presente estudo foi a construção de uma biblioteca humana de fragmentos

de anticorpos monoclonais (scFv) apresentada em fagos (Phage display), seleção dessa

biblioteca contra células tumorais de tireóide e posterior caracterização das moléculas scFv

ligantes à superfície celular tumoral. Almeja-se que esses scFvs possam ser utilizados como

biomarcadores auxiliando as metodologias já existentes no diagnóstico e prognóstico do

carcinoma de tireóide.

Este trabalho é a primeira investigação de fragmentos de anticorpos scFv em carcinoma

diferenciado de tireóide, porém existem várias pesquisas relacionadas a busca por anticorpos

monoclonais em outros tipos de carcinomas, tais como: próstata (Flego M, 2007), carcinoma

renal, pancreático, gástrico, de ovário, cólon e pulmão (Kurosawa G, 2008).

A vantagem da utilização de uma biblioteca de fragmentos de anticorpos humana e

imune em aplicações terapêuticas, ou seja, produzida a partir de material (sangue) de pacientes

com carcinoma de tireóide, está associado à eliminação de possível resposta imune não desejada

contra anticorpos produzidos em camundongos (Hwang e Foote, 2005). Além disso, partindo do

princípio que os pacientes com carcinoma de tireóide produzem anticorpos contra o tumor,

utilizar os linfócitos circulantes no sangue periférico dos pacientes parece ser uma fonte

plausível de potenciais ligantes a antígenos tumorais, de certa forma, eles podem ser

considerados imunizados pelo tumor (Dantas-Barbosa, 2004).

O tamanho da biblioteca de fragmentos de anticorpos monoclonais scFv produzida a

partir de pacientes com carcinoma diferenciado de tireóide é de 1,02x106

clones. Segundo

alguns autores, o sucesso na obtenção de anticorpo de alta afinidade geralmente está associado

ao tamanho inicial da biblioteca, mesmo que, essa relação dependa mais real interação do

anticorpo com o antígeno, que não pode ser prevista em teoria. As bibliotecas bem sucedidas

variam na ordem de 106 a 10

10 (Itoh et al., 2003, Vaughan et al., 1996).

76

Com relação aos segmentos gênicos da cadeia pesada (VH), estes são divididos em três

subgrupos, sendo que o subgrupo I possui as famílias VH1, VH5 e VH7, o subgrupo II é

formado por VH2, VH4 e VH6 e o subgrupo III contém apenas a família VH3. A biblioteca de

anticorpos scFv construída nesse trabalho possui no mínimo genes VH de três famílias

diferentes VH 1, 3 e 4, portanto possui um representante gênico VH de cada subgrupo. Segundo

os autores Honjo e Matsuda, a família VH3 é a mais abundante do repertório humano, a VH1 é

a segunda mais representada seguida por VH4 e, contribuindo com pequena proporção do

repertório estão as famílias VH2, VH5, VH6 e VH7. Com isso, a biblioteca scFv possui os

genes VH das famílias mais representativas do repertório humano de imunoglobulinas.

O repertório da cadeia leve apresentou mellhor variabilidade (VL 1, 2, 3, 4, 6 e 7)

comparado com a cadeia pesada, isso pode ser devido a melhor qualidade do seqüenciamento

dos fragmentos VL, que possibilitou melhor análise in silico. Outra característica importante da

biblioteca de scFv é que os fragmentos de anticorpos expressam 50% tanto de cadeia leve κ

(kappa) quanto de λ (lambda), sendo que no repertório humano cerca de 70% dos anticorpos

expressam cadeia leve κ e apenas 30% a cadeia leve λ (Farner et al., 1999). A mesma proporção

dos subtipos da cadeia leve (κ e λ) presente na biblioteca foi devido a utilização de quantidades

iguais de genes codificadores dessas regiões durante a construção do fragmento scFv.

Nesse estudo, a biblioteca de scFv foi selecionada contra toda a superfície das células

tumorais de tireóide não utilizando proteínas isoladas. A maioria das seleções é realizada com

proteínas isoladas, ou seja, com um antígeno previamente conhecido e relacionado à biologia do

câncer, como por exemplo, o estudo sobre a seleção de fragmentos de anticorpos específicos ao

receptor do fator de crescimento fibroblástico (Gorbenko et al., 2009; Martinez et al., 2005;

Rauchenberger et al., 2003). A utilização de metodologias que permitem fazer uma varredura

77

das células tumorais, sem conhecimento prévio das proteínas nelas presente, propicia a

identificação de marcadores tumorais novos (Dantas- Barbosa, 2004).

Além disso, o procedimento de seleção com a célula é vantajoso em comparação ao uso

de proteínas isoladas, pois a expressão e purificação dessas proteínas geralmente são difíceis e

com o uso das células as proteínas associadas à membrana mantêm a estrutura complexa e a

conformação nativa (Lipes, 2008).

Assim, o procedimento da imunoistoquímica além de analisar a reatividade do fragmento de

anticorpo scFv-C1 pelas células de tireóide teve o objetivo de avaliar a utilidade prognóstica desse

fragmento de anticorpo. A associação da reatividade do scFv com tumores primários relacionados a

outros parâmetros bem conhecidos de prognóstico poderia ajudar a traçar diferentes estratégias de

tratamento para o CDT.

Os resultados da imunoistoquímica sugerem que o fragmento de anticorpo scFv-C1 é

específico às células tumorais de tireóide e com capacidade de distinguir o grupo câncer

(Carcinoma Papilífero, variante Folicular e Folicular) do grupo controle (Adenoma, bócio e

tireóide normal) com significância estatística (p<0,0001). Com relação aos valores da

intensidade e da área da marcação do scFv-C1 analisados pelo programa ACIS (Dako), foi

observado valores maiores para o grupo câncer do que para o grupo controle, ou seja, o

anticorpo recombinante apresentou maior reatividade pelos tecidos tumorais. Com isso, esse

scFv é um potencial candidato para complementar o diagnóstico diferencial entre lesões de

padrão folicular da tireóide, um grupo que inclui nódulos Adenomatosos ou hiperplásicos,

Adenomas Foliculares, Carcinomas Foliculares e variantes Foliculares dos carcinomas

Papilíferos, que comumente causam dificuldades diagnósticas (Sosa e Udelsman, 2006; Cheung

et al., 2001; Demellawy et al., 2008; Serra e Asa, 2008). Além disso, um diagnóstico

78

histopatológico correto é essencial para o planejamento clínico e cirúrgico e conseqüente

prognóstico do paciente (Ward et al., 2008; Fagin et al., 2007).

Além de diferenciar o grupo câncer do controle, uma análise do anticorpo scFv somente

no grupo câncer demonstrou que o scFv-C1 reagiu em maior número de pacientes com

carcinomas T1 e T2 com significância estatística. Os tumores T1 e T2 são pequenos, menores

que 4 cm e restritos a tireóide, essa classificação dos tumores foi baseada na 6ª edição da

International Union Against (UICC) (Varanda et al., 2007). Pode-se concluir que o anticorpo

scFv-C1 possui maior reatividade por tumores de baixo risco e de pouca agressividade,

indicando ser um possível marcador de bom prognóstico para tumores de tireóide.

Outro dado que reforça a proposição do scFv ser um possível marcador de bom

prognóstico é a sua reatividade em maior número de pacientes com evolução clínica sem

metástase e livre de doença, entretanto esses dados não foram significativos devido ao pequeno

número de casos com evolução clínica ruim, é frequente a maioria dos casos de carcinoma

diferenciado de tireóide ter bom prognóstico.

Neste trabalho, foi construída uma biblioteca imune e humana de fragmentos de

anticorpos monoclonais scFv apresentados em fagos, essa biblioteca apresentou repertório

variado e tamanho adequado para prosseguir a seleção. A seleção foi realizada utilizando os

métodos Brasil e Phage display contra células tumorais de tireóide para obtenção de anticorpos

específicos ao tumor. Os ligantes selecionados foram caracterizados quanto à sequência e

reatividade em relação às proteínas e tecidos tireoidianos. Após a caracterização encontramos

um possível bom candidato a marcador de diagnóstico de Câncer de Tireóide. Para afirmarmos

se esse anticorpo terá utilidade clínica serão necessários mais testes de validação.

79

6- CONCLUSÃO

80

O fragmento de anticorpo scFv-C1 pode ser um potencial candidato a biomarcador para

o diagnóstico do Câncer de tireóide, pois foi capaz de distinguir o grupo Câncer do grupo

Controle e mostrou reatividade significativa aos tumores com estadiamento T1 e T2.

81

7-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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90

8- ANEXOS

91

ANEXO 1

MEIOS DE CULTURA

Meios para cultivo de Bactéria

Meio LB (Luria Bertani), pH 7,0

Peptona de caseína 1,0% (p/v)

Extrato de levedura 0,5% (p/v)

NaCl 1,0% (p/v)

Meio LB ágar (sólido)

Meio LB adicionado de ágar bacteriológico a uma concentração final de 1,4% (p/v).

Meio SB, pH 7,0



MOPS 1,0% (p/v)

Meio SOB, pH 7,0



NaCl 0,05% (p/v)

KCl 0,00186% (p/v)

Meio SOC

Meio SOB 97 mL

Glicose 2M (filtrada) 1mL

MgCl2 1M (autoclavado) 1 mL

Mg SO4 (autoclavado) 1 mL

92

Os meios foram autoclavados a 120°C durante 20 minutos e conservados a temperatura

ambiente até a utilização.

MEIOS PARA CULTIVO DE CÉLULAS HUMANAS

Meio de cultura Dulbecco‟s Modified Eagle Medium – D-MEM (Nutricell)

ANTIBIÓTICOS

As soluções estoque dos antibióticos: ampicilina, carbenicilina e kanamicina foram

preparadas em água milli Q nas concentrações de 150, 100 e 50 mg/mL, respectivamente. A

solução de tetraciclina foi preparada a 20 mg/ml em etanol. Todas essas soluções foram

esterilizadas por filtração em filtro Millipore 0,2 m e estocadas em alíquotas de 2 mL a -20ºC,

sob o abrigo da luz.

SOLUÇÕES DE USO GERAL

Tampão TE

Tris-HCl pH 8,0 10 mM

EDTA pH 8,0 1 mm

Glicose 20%

Glicose anidra 20 mL

Água bidestilada q.s.p. 100 mL

Solução esterilizada por filtração em filtro Millipore de 0,2 mm.

Glicerol 10%

Glicerol 10 mL


Solução esterilizada por autoclavagem.

93

Glicerol 50%

Glicerol 50 mL


Solução esterilizada por autoclavagem.

TBS-BSA 1%

Tris-HCl (pH 7,5) 50mM

NaCl 150mM

Albumina Bovina Sérica (BSA) 1% (p/v)

IPTG (isopropil-β-D tiogalactosídeo) 0,5M

Para solução estoque de 0,5M foram dissolvidos 3,0g de IPTG em 25 mL de água milli

Q, em seguida a solução foi esterilizada por filtração em filtro Millipore 0,2 m, dividida em

alíquotas de 1 mL e estocadas a -20°C.

SOLUÇÕES PARA ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE E DE

POLIACRILAMIDA

Tampão de corrida para gel de Agarose (TBE) 10X

Tris base 54g

Ácido bórico 27,5g

EDTA 0,5M; pH 8,0 20 mL

Água bidestilada q.s.p 1000mL

Ajustar o pH para 8,3 se necessário.

Tampão de amostra para gel de agarose

Glicerol 50% (v/v)

Azul de bromofenol 0,2% (p/v)

Solvente TBE 2,5%

Estocado a 4ºC.

94

Solução de Brometo de Etídeo

Estoque 5 mg/mL

Uso 0,1-0,5 µg/mL

Estocada a temperatura ambiente e ao abrigo da luz.

Tampão de corrida para SDS-PAGE (5X)

Tris base 125 mM

Glicina 0,96 M

SDS 0,5% (p/v)

Estocado a temperatura ambiente.

Tampão da amostra para SDS-PAGE (2X)

Tris-HCl pH 6,8 100mM

SDS 4% (v/v)

Glicerol 20% (v/v)

β –mercaptoetanol 5% (v/v)

Azul de bromofenol 0,2% (p/v)

Estocada a 4°C.

Acrilamida 49,5% (49:0,5)

Acrilamida 49g

Bis- acrilamida 0,5g

Água bidestilada q.s.p 100 mL

Estocada na geladeira ao abrigo da luz.

Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8

Tris 36,34g


95

Tris-HCl 1,0 M, pH 6,8

Tris 12,11g


SDS 10% (p/v)

SDS 10 g


PSA 10%

Persulfato de Amônio 100mg


Gel empilhamento SDS-PAGE

Solução Acrilamida/Bis-acrilamida (49,5%) 420 µL

Tris-HCl 1,0 M pH 6,8 717 µL

Água bidestilada 1.860 µL

Temed 9 µL

Persulfato 10% 54 µL

Gel Separador SDS-PAGE

Solução Acrilamida/Bis-acrilamida (49,5%) 2.980 µL

Tris-HCl 1,0 M pH 6,8 2.980 µL

H2O 1.326 µL

Glicerol 1.683 µL

Temed 9 µL

Persulfato 10% 54 µL

Solução Corante para Gel SDS-PAGE

Azul brilhante de Coomassie R-250 0,25% (p/v)

Metanol 30% (v/v)

Ácido acético glacial 7% (v/v)

96

Agitar bem (agitador magnético)

Solução filtrada em papel alumínio

Solução descorante para Gel SDS-PAGE

Metanol 30% (v/v)

Ácido acético glacial 7% (v/v)

SOLUÇÕES PARA ELISA, DOT BLOT E WESTERN BLOT

Tampão PBS (Phosphate- Buffered Saline) 10X pH 7,4

NaCl 80g

KCl 2,0g

Na2HPO4 17,0g

KH2PO4 1.63g

Completado para 1 litro deágua bidestilada e esterilizado por autoclavagem, pH 7,4,

ajustado quando necessário.

PBST 1X, pH 7,4

PBS adicionado de tween 20 a 0,05% (v/v).

Vermelho de Ponceau S- solução estoque 10 X

Ponceau S 2 g

Ácido tricloroacético 30 g

Ácido sulfosalicílico 30 g


Solução de bloqueio (Dot blot e Western)

PBS 1X adicionado de albumina bovina sérica a 3% (p/v).

Solução de bloqueio (Elisa)

PBS 1X adicionado de leite desnatado a 5% (p/v).

97

Ácido Sulfúrico 4N (parar reação de Elisa)

H2O 60 mL

Ácido sulfúrico 40 mL

Adicionar primeiro a água e depois o ácido.

Tampão de transferência

Tris 5,8g

Glicina 2,9 g

SDS 0,37 g

Metanol 200 mL


O pH deve ser de 8,3 sem precisar de ajuste.

Tampão da fosfatase alcalina (APB)

NaCl 100 mM

Tris-HCl; pH 9,5 100 mM

MgCl2 5 mM

Solução reveladora para Western blot

Para o preparo da solução estoque de NBT (nitro blue tetrazolium) foram diluídos 50 mg

em 1 mL de dimetil formamida a 70%, e o BCIP (Fosfato de bromo cloroindolil) foram diluídos

50 mg em 1mL de água. Solução trabalho: 134 µL de NBT em 10mL de APB, misturar e

adicionar 66 µL de BCIP nessa solução.

Solução reveladora de peroxidase

Foi dissolvido 10 mg de DAB em pó em 15 mL de PBS 1X, filtrado em filtro Millipore

0,2 m e adicionado 12 µL de H2O2 a 30%.

Anticorpos

Anti-HA marcado com fosfatase

Anti-HA marcado com peroxidase

98

SOLUÇÕES PARA PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA EM COLUNA DE NÍQUEL

(HPLC)

Tampão fosfato 8X, pH 7,4

NaCl 23,38g

Na2HPO4 . 2H2O 1,42g

NaH2PO4 . H2O 1,11g


A solução foi filtrada com filtro Millipore de 0,22 μm.

Imidazol 2M, pH 7,4

Imidazol 27,4g



Tampão de ligação, pH 7,4

Tampão fosfato 1X

Imidazol 10 mM


Tampão de Eluição, pH 7,4

Tampão fosfato 1X

Imidazol 500 mM


Todos os tampões da purificação foram armazenados a 4°C.

SOLUÇÕES DE PREPARAÇÃO DE DNA PLASMIDIAL

GET

Glicose filtrada 20% 0,92 %

EDTA 0,5 M pH 8,0 (autoclavado) 10 mM

Tris-HCl 1M pH 7,4 (autoclavado) 26mM

99

KOAc

Ácido acético glacial 60,0 mL

KOAc 5M (filtrado) 11,5 mL

Água milli Q (autoclavada) 28,5 mL

RNase

RNase A 10 mg

Água bidestilada q.s.p. 1mL

Dissolvida em água milli Q e fervida em banho-maria por 15 minutos.

SOLUÇÃO PARA DOSAGEM DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DE

BRADFORD

Reagente de Bradford

Coomassie Blue G-250 100 mg

Etanol 95% 50 mL

Ácido ortofosfórico 100 mL


O Coomassie Blue foi dissolvido no etanol, em seguida adicionado o ácido ortofosfórico

e o volume completado com água. Esse reagente é estável a 4°C por até seis meses.

Solução padrão de proteína em tampão PBS

Albumina de soro bovino (BSA) 1mg/ mL

100

ENZIMAS, REAGENTES E KITS UTILIZADOS

Agarose (BioNovagency) para gel de eletroforese.

Cubetas de 0,2 cm – (Bio-Rad) usadas para eletroporação no equipamento Gene Pulser com

Pulser Controller.

Platinum Taq DNA Polimerase - (Invitrogen, 5 U/ L) fornecida com o seu tampão de reação

10X, utilizada nas reações de PCR.

Mistura de dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 100mM (Sinapse) utilizados nas reações de

PCR.

Marcador de Massa Molecular 100bp (Sinapse).

DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit for MegaBace- (Amershan) Mix de

reação de sequenciamento.

T4 DNA Ligase - (Invitrogen, 1 u/ L) fornecida com o seu tampão 5X, utilizada nas reações de

ligação.

PEG-8000 Anresco-(GoldLab) para precipitação dos fagos.

Soro bovino fetal (Nutricell)

Glicogênio - (Roche Molecular Biochemicals) 20 mg/mL.

Enzima de restrição Sfi I - (New England Biolabs, 20 U/ L), acompanhada do tampão de

reação NEB 2 10X, utilizada para restrição do vetor pComb e o fragmento do anticorpo scFv.

HisTrap™ HP Columns - Easy, High-performance Purification GE Healthcare

101

ANEXO 2

102

ANEXO 3

Extração de RNA de Sangue

1- Colocar todo o sangue em tubo falcon (15mL);

2- Centrifugar o sangue por 10 min a 2.500 rpm a 4°C;

3- Transferir o plasma para um microtubo e armazenar a -80°C;

4- Deixar no máximo 2,5mL no tubo. Caso o volume esteja à cima de 2,5mL dividir o total em

dois tubos;

5- Adicionar nove partes (11,5mL) de cloreto de amônio e uma parte (1,25mL) de bicarbonato

de amônio. Misturar antes de adicionar às células, 5 vezes o volume das hemáceas;

6- Inverter delicadamente para misturar bem;

7- Incubar em gelo por 15 minutos;

8- Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos a 4°C e descartar o sobrenadante;

9- Adicionar 1,0mL de solução D (ou 950µL de solução D + 50µL de sarcosil 10%);

10- Adicionar 8µL de β-mercaptoetanol;

11- Agitar no vórtex para diluir o pellet de células e mergulhar no gelo;

12- Adicionar 100µL de acetato de sódio 2M pH= 4;

13- Adicionar 1,0 mL de fenol saturado em água (pH = 4 e 5);

14- Acrescentar 200µL de clorofórmio-álcool isoamílico (49:1, 196µL: 4µL);

15- Vortexar a suspensão por 10 segundos e distribuir a mistura em tubos de 2,0mL (nomear

cada tubo). Colocar no gelo por 15 minutos;

16- Centrifugar a amostra por 15 minutos a 12.000g a 4°C;

17- Após centrifugar, transferir no máximo 1,0 mL da fase aquosa para cada microtubo de 2mL

e adicionar cerca de 750µL de isopropanol gelado e manter a -20ºC (freezer) – Deixar

overnight (mínimo 4 horas);

18- Centrifugar a 12.000g por 15 min a 4°C e descartar o álcool com cuidado;

19- Lavar com 1,0mL de Etanol 75% e descartar o sobrenadante;

Deixar o RNA secando por 15 minutos e ressuspender o pellet em 25µL de água

Mesmo dia

103

ANEXO 4

Precipitação e Purificação dos produtos de gel de agarose

1- Adicionar 2µL de acetato de amônio (7,5M) para cada 8µL de produto

2- Coletar em tubo novo, acrescentar 30µL de etanol absoluto (ou Isopropanol) gelado, para

cada 10µL de produto com acetato. Cuidadosamente homogeneizar como no vortex;

3- Incubar overnight a -20o C;

4- Centrifugar 13.000 rpm por 15 minutos, -4o C;

5- Remover o sobrenadante e adicionar 250µL de etanol 70% (175µL etanol + 75µL água);

6- Centrifugar 13.000rpm por 7 minutos, -4oC. Descartar o sobrenadante e secar por 15

minutos;

7- Ressuspender em água ou TE (20µL). Se o pellet for pequeno ressuspendê-lo em 15µL

de água;

8- Incubar 15 minutos no banho-maria a 37o C;

9- Aplicar 3µL de produto em gel de agarose 1,5%.

104

ANEXO 5

105

ANEXO 6

Termo de Consentimento

Projeto de Pesquisa em Câncer de Tireóide

Pesquisador: Prof. Dra. Laura Sterian Ward

Prof. Dr. Luiz Ricardo Goulart

Paciente ou Responsável pelo paciente

Sr (a) _______________________________________________________________

_______ anos RG:_____________ HC:____________________

Endereço:___________________________________________________________

Telefone:___________________________________________________________

Concordo em doar sangue, saliva e biópsia de tecido (provenientes dos procedimentos

rotineiros do centro cirúrgico do HC/UFU), para pesquisa de ácidos nucléicos e proteínas que

podem estar envolvidas em doenças malignas e benignas da tireóide. Sei que se trata de uma

pesquisa científica e concordo em que os dados de meu caso, registrados no meu prontuário

médico, sejam utilizados na pesquisa, sabendo que meu nome assim como meus dados clínicos

e de laboratório não serão individualmente citados e que em nenhum momento meu diagnóstico

ou tratamento serão prejudicados por tal doação. Também sei que esta pesquisa pode trazer

benefícios para a cura ou tratamento das doenças tireoidianas no futuro, mesmo que eu não me

beneficie disso agora. Não terei nenhum gasto com a doação do meu material para esta pesquisa

e sei que poderei cancelar minha decisão e deixar de participar em qualquer momento. Também

não serei submetido a qualquer procedimento que não faça parte da rotina de meu tratamento

normal, sob a orientação de meu médico habitual.

Estou consciente da importância de minha participação da qual posso desistir em

qualquer momento. Fui informado de que este projeto está aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa e sei que poderei obter todas as informações que desejar e necessitar no fone: (34)

3218-2478.

Assinatura do Paciente

Assinatura do Pesquisador

Prof. Dr. Luiz Ricardo Goulart - Coordenador do Laboratório de Nanobiotecnologia

Bloco 2E, sala 24, Universidade Federal de Uberlândia-UFU

CEP: 38.400-920. Uberlândia, Minas Gerais

(34) 3218-2478

106

ANEXO 7

Questionário de Avaliação Câncer de Tireóide Data da avaliação:_________________

Número do prontuário do paciente: ______________________________

Iniciais do nome do paciente:___________________________________

Identificação

1.Nome:___________________________________________________

2.Sexo: ( ) M ( ) F 3. Cor: _______________

4.Idade:_______________ Data Nascimento:____________

5.Estado civil:_____________

6.Residência atual: ___________________________________N°______

Bairro:______________________________ Cidade:________________

Telefone: _________________

7. Diagnóstico: ________________________________________________

8. Procedimento realizado:

__________________________________________________________________

______________________________________________________

História clínica

1.Fumante: ( ) não ( ) sim

Há quanto tempo e com que freqüência?

__________________________________________________________________

___________________________________________________

2. Faz uso de bebidas alcoólicas? : ( ) não ( ) sim

Há quanto tempo e com que freqüência?

__________________________________________________________________

______________________________________________________

3. Tem outra doença relacionada à tireóide?Qual?

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

________________________________________________

4. História pessoal prévia de câncer de tireóide? ( )Não ( )Sim

( ) Benigna ( ) Maligna

Procedimentos realizados : _____________________________________

5. Já fez algum tratamento para o câncer? ( )Não ( )Sim

107

6. História pessoal de outros tipos de câncer? ( ) Não ( )Sim

( ) Benigno ( ) Maligno. Local _______________________________

7. História familiar de câncer? ( ) Não ( ) Sim

( ) Benigno ( ) Maligno

Local:_____________________ Grau de parentesco __________________


8. História familiar de outro câncer? ( ) Não ( ) Sim

( ) Benigno ( ) Maligno



9. Tem alguma doença crônica (Toma alguma medicação diária)?

Infecciosas: __________________________________________________

Hormonais: __________________________________________________

Metabólicas: _________________________________________________

Psicológicas: _________________________________________________

Crônico - degenerativa: ________________________________________

Alergia: ____________________________________________________

Outros tipos de câncer:_________________________________________

10. Informações adicionais:

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

_____________________________________________

ANA PAULA CARNEIRO DOS SANTOS -...

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