ANA PAULA ESKILDSEN PAGANO - USP€¦ · Capitão Jack Sparrow – Piratas do Caribe . vi Esta...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE QUÍMICA

Programa de Pós-Graduação em Química

ANA PAULA ESKILDSEN PAGANO

Efeitos de interações intermoleculares sobre as

propriedades fotofísicas de betalaínas naturais

Versão corrigida da Tese conforme Resolução CoPGr 5890

O original se encontra disponível na Secretaria de Pós-Graduação do IQ-USP

São Paulo

Data do Depósito na SPG:

10/11/2017

Ficha Catalográfica Elaborada pela Divisão de Biblioteca e

Documentação do Conjunto das Químicas da USP.

Pagano, Ana Paula Eskildsen

P131e Efe itos de int erações int ermo lecu lares sobre as

propr iedades fo to fís icas de bet a la ínas na turais / Ana Paula

Eskildsen Pagano. -- São Paulo , 2017.

199p.

Tese ( douto rado) – Inst it uto de Química da Univers idade

de São Paulo . Depart amento de Química Fundamenta l.

Or ient ador : Bastos, Er ick Le it e

1. Fotoquímica : Físico-química : orgânica 2. Fotofísica I. T.

II. Bastos, Erick Leite, o r ient ador .

547.135 CDD

ANA PAULA ESKILDSEN PAGANO

Efeitos de interações intermoleculares sobre as

propriedades fotofísicas de betalaínas naturais

Tese apresentada ao Instituto de Química

da Universidade de São Paulo para

obtenção do Título de Doutora em

Química

Orientador: Prof. Dr. Erick Leite Bastos

São Paulo

2017

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Dedico esta Tese à minha tão amada avó Frida (i.m.).

i

Agradecimentos

À minha família por ser minha base, meu colo, meu ânimo, minha razão de

viver. Por sempre me apoiarem e me incentivarem a seguir meus sonhos.

Aos meus pais por terem se desdobrado em um milhão para que eu conseguisse

chegar aqui. Por sempre estarem presentes e interessados. Por me ensinarem a agir com

o coração e seguir minha intuição. Por me ensinarem a sempre ver o lado bom das

pessoas e situações. A minha mãe por me ensinar que basta eu querer. Ao meu pai por

ter sempre exigido o melhor de mim.

À minha irmã por ser o meu lado doidinho e ao meu irmão por ser o meu lado

sereno.

À minha sobrinha linda por ter trazido muita luz para nós e me motivar a sempre

seguir em frente.

À minha avó Cecília pela preocupação, pelo zelo e pelo carinho demonstrados

ao seu modo.

Aos meus avós Frida, Nicola e Guilherme que lá de cima, com certeza, estão

olhando por mim.

Ao meu namorado e melhor amigo por estar sempre ao meu lado, escutando

meus lamentos e desabafos. Por ter me ensinado a me preocupar menos e viver mais.

Por enxergar a vida de uma maneira simples e prática. Por tornar meus dias sempre

alegres. Por ser paciente com as minhas oscilações de humor, principalmente nessa reta

final do Doutorado.

Às minhas amigas da vida; Amanda, Fe, Bia, Cathy, Mari, Rafinha, Dani e Re

por estarem sempre presentes. Por sempre torcerem por mim e acreditarem em mim.

ii

Pela amizade de anos, algumas 20, outras 14, mas todas com a mesma intensidade. Por

voltarmos a ser criança quando estamos juntas. Por sermos tão unidas e malucas. Cada

uma com suas características fazem de mim uma pessoa melhor.

Às amigas que fiz durante o Doutorado e levarei para a vida; Nathy, Carol e

Lari. Saibam que sem vocês, tudo teria sido muito mais difícil. Obrigado por tudo; pelas

risadas, pelos desabafos, pelos cinemas, pelas gordices, pelas viagens e pelos conselhos.

Por me aceitarem com meu jeitinho nada delicado de ser. Por tornarem meus dias mais

agradáveis e divertidos.

Ao Erick por ter me dado esta oportunidade. Por ter confiado em mim. Por

sempre estar ali quando precisei, por ser humano além de orientador. Pela paciência

durante esses anos. Ah, e pelos chocolates fornecidos durante todos esses anos, claro!

Aos colegas do BastosLab e todos os técnicos que trabalharam conosco por toda

a ajuda.

Ao Cássio e ao Gustavo pela companhia tão agradável e pela ajuda nas minhas

inúmeras dúvidas em relação aos sais de flavílio.

Ao Prof. Dr. Cassius V. Stevani, pelas análises no HPLC, e Prof. Dr. Thiago

Correra, pelos experimentos de espectrometria de massas.

À Jennifer e ao André pelas análises de espectrometria de massas.

À Cristiane e Janaína pelo apoio nas análises de RMN.

Ao Willi, Joey, Lolo e Panda por terem me orientado e me ajudado tanto durante

minha iniciação científica.

Ao grupo do Professor Nakajima em Tsukuba, em especial Prof. Marcos Neves

e Dr. Nauman Khalid pelo acolhimento e ajuda nos experimentos.

Às pessoas maravilhosas que conheci no Japão e foram essenciais durante minha

iii

estadia; Xenia, Boon, Kosaku e Grace.

À CAPES pela bolsa concedida e ao Instituto de Química pela estrutura

fornecida. À Natura Cosméticos pela relação produtiva.

Por fim, agradeço a Deus. Por estar sempre ao meu lado e me dar forças para

seguir em frente. Por escutar minhas orações e se fazer entender por meio de suas ações.

iv

Esta página foi deixada intensionalmente em branco

v

“The problem is not the problem; the

problem is your attitude about the problem”

Capitão Jack Sparrow – Piratas do Caribe

vi


vii

Resumo

PAGANO, A. P. E. Efeitos de interações intermoleculares sobre as propriedades

fotofísicas de betalaínas naturais. 2017. 199 f. Tese (Doutorado) – Instituto de

Química, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017.

Betalaínas são alcalóides coloridos que atuam como mediadores químicos e sensores em

processos de interesse tecnológico. Esta Tese de Doutorado investiga o comportamento

de betalaínas naturais, betanina e indicaxantina, em três sistemas químicos diferentes. O

primeiro capítulo discute a estabilidade de emulsões água-óleo-água contendo betanina.

As emulsões foram preparadas em um sistema de microcanais empregando-se óleo de

soja e tensoativos grau alimentício. Betanina pura tende a estabilizar a emulsão em

relação ao controle sem o pigmento, enquanto suco de beterraba liofilizado e betanina

comercial diluída com maltodextrina não mostram a mesma atividade. No capítulo

seguinte, a interação entre indicaxantina e cloreto de 7-metil-4-metóxiflavílio revela a

ocorrência de transferência de energia e dados de espectroscopia de 1H-RMN indicam a

formação de um complexo no estado fundamental. Finalmente, a interação entre

betanina e paraquat na presença e ausência de luz e oxigênio é investigada. Dados de

espectroscopia de 1H-RMN sugerem a formação de um complexo entre as espécies e o

estudo cinético sugere que betanina interfere na regeneração da forma oxidada do

paraquat por oxigênio.

Palavras-chave – betalaínas, emulsão por microcanais, sal de flavílio, metil viologênio.

viii


ix

Abstract

PAGANO, A. P. E. Effect of intermolecular interactions on the photophysical

properties of natural betalains. 2017. 199 p. Thesis (Doctorate) – Instituto de

Química, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017.

Betalains are colored alkaloids that act as chemical mediators and sensors in processes

of technological interest. This doctoral thesis investigates the behavior of natural

betalains, betanin and indicaxanthin, in three different chemical systems. The first

chapter discusses the stability of water-oil-water emulsions containing betanin. The

emulsions were prepared in a microchannel system using soybean oil and food grade

surfactants. Pure betanin tends to stabilize the emulsion relative to the control without

the pigment, while freeze-dried beet juice and commercial betanin diluted with dextrin

do not show the same activity. In the following chapter, the interaction between

indicaxanthin and 7-methyl-4-methoxyflavylium chloride reveals the occurrence of

energy transfer and 1H-NMR spectroscopy data suggests the formation of a complex in

the ground state. Finally, the interaction between betanin and paraquat in the presence

and absence of light and oxygen is investigated. 1H-NMR spectroscopy data suggest the

formation of a complex between species and the kinetic study suggests that betanin

interferes in the regeneration of the oxidized form of paraquat by oxygen.

Keywords – betalains, emulsion by microchannels, flavilium salt, methyl viologen.

x


xi

Lista de abreviaturas, siglas e símbolos

δ Deslocamento químico, em ppm

ΔG Energia de Gibbs

Δ‡Gcoal Energia de ativação de Gibbs do processo de coalescência

Δ‡Gfloc Energia de ativação de Gibbs do processo de floculação

ε Coeficiente de atenuação molar, em L mol-1

cm-1

ϕAi Fração de volume da fase quosa interna

ΦFL Rendimento quântico de fluorescência

ab Tensão interfacial entre os líquidos a e b

λem Comprimento de onda e emissão

λexc Comprimento de onda de excitação

Viscosidade

τFL Tempo de vida de fluorescência

τ1/2 Tempo de meia vida

Fração molar

Aab Área interfacial entre os líquidos a e b

A/O Água em óleo

A/O/A Água em óleo em água

Bn Betanina

Ca Número de capilaridade

CCR-310 Concentração de CR-310, em m/mfc(A/O)

CTween20 Concentração de Tween 20, em m/ mfc(A/O/A)

CBn Concentração de betanina, em m/m mfd(A/O)

xii

BtP Indicaxantina

d3,2 Diâmetro médio de Sauter

fA/O Fluxo da fase dispersa

fem Fenda de emissão

fem Fenda de excitação

FWHM Full width at half maximum, largura total a meia altura

HBt Ácido betalâmico

HPLC High performance liquid chromatography, cromatografia líquida de

alta eficiência

mfd(A/O) Massa da fase dispersa da emulsão A/O

mfc(A/O) Massa da fase contínua da emulsão A/O

mfc(A/O/A) Massa da fase contínua da emulsão A/O/A

MCE Microchannel emulsification, emulsificação por microcanais

ME Membrane emulsification, emulsificação por membranas

MFE Microfluidic emulsification

MMF Cloreto de 7-metil-4metóxiflavílio

MV Metilviologênio, paraquat

p Pressão interna da gota e/ou pressão de Laplace

r Raio da gota da emulsão

RMN de 1H Espectroscopia de ressonância nuclear magnética de hidrogênio

RSF Relative span fator, fator relativo de distribuição

TPi Tampão fosfato

U Fluxo da fase dispersa

xiii

Lista de estruturas

xiv


xv

Sumário

Agradecimentos .......................................................................................................... i

Resumo ................................................................................................................... vii

Abstract .................................................................................................................... ix

Lista de abreviaturas, siglas e símbolos ..................................................................... xi

Lista de estruturas .................................................................................................. xiii

Prólogo .................................................................................................................... 19

Aspectos gerais da química de betalaínas ................................................................ 21

Pigmentos vegetais ........................................................................................................ 21

Estabilidade de betalaínas ............................................................................................. 27

Estabilização de betalaínas ............................................................................................... 30

Capítulo 1. Microencapsulação de betanina em emulsão monodispersa A/O/A ....... 31

1-1. Introdução ........................................................................................................ 31

1-1.1. Propriedades de emulsões simples ....................................................................... 32

1-1.2. Emulsões multiplas .............................................................................................. 35

1-1.3. Obtenção de emulsões A/O/A por emulsificação por microcanais ......................... 36

1-2. Objetivos .......................................................................................................... 38

1-2.1. Objetivos específicos ............................................................................................ 38

1-3. Resultados e discussão ...................................................................................... 40

1-3.1. Otimização da emulsão de camada dupla A/O/A .................................................. 40

xvi

1-3.2. Efeito da fonte de betanina .................................................................................. 47

1-3.3. Efeito da temperatura e do tempo de armazenamento ......................................... 49

1-3.4.1 Coloração da emulsão .......................................................................................... 55

1-4. Conclusão ......................................................................................................... 56

1-5. Parte experimental ........................................................................................... 59

Reagentes químicos e solventes ....................................................................................... 59

Soluções tampão .............................................................................................................. 60

Obtenção de betanina ...................................................................................................... 60

Análise cromatográfica ..................................................................................................... 61

Espectroscopia de absorção UV-vis .................................................................................. 61

Formulação de emulsões A/O, fase dispersa .................................................................... 62

Formulação de emulsões A/O/A através de emulsificação em microcanal ...................... 62

Determinação do diâmetro médio de Sauter (d3,2) e da distribuição do tamanho das gotas

das emulsões A/O/A ......................................................................................................... 63

Acompanhamento da estabilidade física das emulsões A/O/A contendo betanina ......... 63

Análise de dados ............................................................................................................... 64

Capítulo 2. Interação de indicaxantina com sal de flavílio ........................................ 65

2-1. Introdução ........................................................................................................ 65

2-1.1. Indicaxantina e MMF: compostos-modelo ............................................................ 68

2-1.1.1. Efeitos do pH do meio ......................................................................................... 68

2-1.1.2. Propriedades fotofísicas e fotoquímicas .............................................................. 69

2-2. Objetivos .......................................................................................................... 71

2-2.1 Objetivos específicos ............................................................................................. 71

xvii

2-3. Resultados ........................................................................................................ 73

2-3.1. Preparações ......................................................................................................... 73

2-3.1.1. Indicaxantina ....................................................................................................... 73

2-3.1.2. Cloreto de 7-metóxi-4-metilflavílio ...................................................................... 79

2-3.2. Caracterização fotofísica de BtP e MMF ................................................................ 82

2-3.3. Estudo da interação de betalaínas com sais de flavílio ........................................... 82

2-3.4. Efeito do solvente na interação entre BtP e MMF .................................................. 85

2-3.4.1. Caracterização fotofísica de BtP e MMF .............................................................. 86

2-3.4.2. Supressão de fluorescência de MMF por BtP ...................................................... 89

2-3.4.3. Tentativa de caracterização do complexo BtP-MMF por espectroscopia de RMN

.......................................................................................................................................... 94

2-4. Discussão .......................................................................................................... 97

2-4.1. Caracterização estrutural de indicaxantina............................................................ 97

2-4.2. Caracterização estrutural de cloreto de 7-metóxi-4-metilflavílio ............................ 99

2-4.3. Estudo da interação de betalaínas com sais de flavílio ......................................... 102

2-5. Conclusão ....................................................................................................... 111

2-6. Parte experimental ......................................................................................... 112

Reagentes e solventes ................................................................................................. 112

Semissíntese e purificação de indicaxantina (BtP) .......................................................... 113

Síntese do cloreto de 7-metóxi-4-metilflavílio (MMF) .................................................... 115

Caracterização estrutural ............................................................................................... 116

Caracterização fotofísica ................................................................................................ 117

Estudo da interação de betalaínas com sais de flavílio ................................................... 119

Efeito do solvente na interação de BtP com MMF.......................................................... 120

xviii

Capítulo 3. Interação de betanina com paraquat.................................................... 125

3-1. Introdução ...................................................................................................... 125

3-2. Objetivos ........................................................................................................ 131

3-2.1 Objetivos específicos ........................................................................................... 131

3-3. Resultados e discussão .................................................................................... 132

3-3.1. Obtenção e análise de amostras de betanina ...................................................... 132

3-3.2. Interação entre betanina e paraquat .................................................................. 140

3-3.2.1. Efeito do oxigênio sobre a cinética de fotodecomposição de Bn e MV2+........... 146

3-3.2.2. Tentativa de caracterização do complexo Bn-MV2+ por espectroscopia de RMN

........................................................................................................................................ 153

3-5. Conclusão ....................................................................................................... 156

3-6. Parte experimental ......................................................................................... 157

Obtenção e purificação de betanina ............................................................................... 157

Caracterização estrutural ............................................................................................... 159

Caracterização fotofísica de betanina ............................................................................. 160

Interação entre betanina e metilviologênio ................................................................... 160

Referências ............................................................................................................ 165

Anexos................................................................................................................... 189

19

Prólogo

Nesta Tese de Doutorado serão apresentados e discutidos os resultados obtidos

nos estudos da interação de betalaínas naturais com diferentes classes de compostos

químicos. As consequências destas interações serão interpretadas de forma a entender as

funções de betalaínas em plantas e para desenvolver aplicações que dependam de

processos fotoredox e de transferência de energia. O texto contém uma introdução geral,

que apresenta algumas propriedades e funções de pigmentos vegetais com destaque para

a classe das betalaínas, três capítulos e uma conclusão final.

O primeiro capítulo trata do estudo do comportamento de betanina, a betalaína

majoritária na beterraba, em uma emulsão ternária A/O/A (água/óleo/água). As

condições de emulsificação usando óleo de soja e água e empregando-se SY-Glyster

CR-310 (tetraglicerol éster do ácido poliricinoléico, não iônico) e Tween 20

(polisorbato 20, não iônico) como emulsificantes, foram otimizadas. A estabilidade das

emulsões e da betanina obtida de três diferentes fontes (betanina comercial em

maltodextrina, betanina extraída de beterraba (Beta vulgaris) e suco de beterraba em pó

preparado por secagem por aspersão) foi avaliada ao longo do tempo.

No capítulo seguinte, a interação entre cloreto de 7-metoxi-4-metilflavílio (MMF)

e indicaxantina é descrita e os resultados racionalizados em termos da mútua

exclusividade entre betalaínas e antocianinas em plantas. O estudo foi realizado

empregando-se métodos espectrofotométricos e espectroscopia de RMN de 1H

empregando-se os pigmentos puros e suas misturas em solução aquosa de HCl pH 5,

HCl(aq) pH 5/etanol 50:50v/v e etanol puro.

O último capítulo descreve o estudo da interação entre metilviologênio, um

20

herbicida facilmente reduzível, e betanina. O estudo foi realizado em água variando-se o

pH do meio e empregando-se espectrofotometria de absorção, espectrofluorimetria e

espectroscopia de RMN de 1H. Finalmente, uma conclusão geral relaciona os três

capítulos e discute perspectivas para a aplicação de betalaínas.

Esta Tese de Doutorado foi realizada em paralelo a um projeto com a empresa

Natura Cosméticos. Contudo, nenhum dos resultados aqui apresentados consta do

projeto com a Natura e não há nenhuma sobreposição nos objetivos ou resultados dos

dois projetos.

21

Aspectos gerais da química de betalaínas

Pigmentos vegetais

A diversidade de cores encontrada na natureza tem origem na interação de

espécies químicas com a luz visível.1 Neste contexto, certos grupos químicos podem

absorver radiação eletromagnética visível, levando a uma transição eletrônica com a

formação de estados excitados. A radiação que não é absorvida é refletida e refratada e,

ao atingir o aparelho visual de animais, excitam um intricado sistema supramolecular

que converte fótons em elétrons. Os impulsos neurais resultantes são transmitidos ao

cérebro pelo nervo ótico e interpretados como imagem colorida.1

A comunicação visual intra e entre espécies se beneficia da sinalização com

cores. No reino vegetal existem, dentre as centenas de milhares de compostos, uma

enorme quantidade de substâncias químicas coloridas que serão chamados neste texto

de pigmentos vegetais†.2 Além de proporcionar beleza estética, pigmentos vegetais

possuem outras funções, podendo agir como antioxidantes3-5

, fotoprotetores6 e como

mecanismos de defesa frente ao ataque de outros organismos. As principais classes de

pigmentos vegetais são antocianinas, porfirinas, carotenóides e betalaínas (Esquema 1).7

Carotenóides são terpenóides lipossolúveis muito difundidos na natureza7,

estando presentes em plantas vasculares, algas, fungos, bactérias e pelo menos em uma

espécie de cada forma de vida animal, como insetos, crustáceos, peixes e pássaros. Estes

pigmentos não são sintetizados nesses animais, mas sim acumulados pela ingestão de

† O conceito de corantes e pigmentos está relacionado à solubilidade; corantes são colorantes solúveis,

enquanto pigmentos são insolúveis. Entretanto, compostos colorantes extraídos de produtos naturais são

chamados de pigmentos.

22

plantas e microorganismos.1 Pigmentos desta classe são vermelhos, laranjas e amarelos

e se localizam nos cloroplastos e cromoplastos de plantas onde protegem o aparelho

fotossintético do dano induzido pela luz e servem como precursores na biossíntese de

ácido abscísico, um fitohormônio envolvido nos processos de desenvolvimento das

plantas e na resposta frente ao estresse e ao ataque por agentes patogênicos.8 Porfirinas

são tetrapirróis cíclicos que atuam como ligantes de cátions metálicos e, por isso, estão

presentes como grupo prostético em citocromos, peroxidases, catalases e vitamina B12,

além da hemoglobina e a mioglobina que possuem um átomo de Fe2+

ligado aos

nitrogênios pirrólicos. Clorofilas são o subgrupo mais importante dentro das porfirinas.1

Elas possuem um átomo de Mg2+

coordenado ao centro do anel porfirínico e um

grupamento monoinsaturado de 20 carbonos como substituinte, o que as torna

parcialmente liposolúveis. Clorofilas estão presentes em cloroplastos de plantas verdes,

algas e bactérias, possuem coloração verde e sua principal função é a produção de

energia via fotossíntese.7

Esquema 1: Exemplos de compostos pertencentes às principais classes de pigmentos naturais:

clorofila (tertrapirrol), betacaroteno (carotenoide), pelargonidina (antocianina) e betanidina

(betalaína).9

23

Antocianinas são pigmentos solúveis em água, responsáveis pela coloração

vermelha, azul e violeta de flores e frutos.10-13

Elas estão presentes nas Angiospermas,

exceto em algumas famílias de plantas pertencentes à ordem das Caryophyllales, onde

são substituídas pelas betalaínas.14

Antocianinas derivam da glicosilação enzimática de

antocianidinas, agliconas que possuem um esqueleto fundamental de 2-fenil-

benzopirano, conhecido como cátion flavílio, que possui três anéis denominados A, B e

C (Esquema 2).2 Nas plantas, antocianinas garantem sinalização visual para atrair

polinizadores e oferecem proteção frente ao estresse fotoxidativo, dadas as suas

propriedades fotofísicas6, 15

e ação antioxidante.1, 13, 16

Por exemplo, cianidina-3-

rutinosídeo apresentou atividade antirradicalar de 80% frente aos íons superóxido

formados em estudo de atividade antioxidante e reduziu de 20 a 40% a apoptose e

hemólise de eritrócitos expostos a danos oxidativos.17

O pH do meio modula a cor das antocianinas. Em meio aquoso com pH entre 1 e

8, antocianinas formam, pelo menos, cinco espécies distintas (Esquema 2).1-2, 6, 18

O

cátion flavílio é a espécie dominante em meio ácido com pH < 2, e confere coloração

avermelhada às antocianinas. Quando o meio se torna mais alcalino, ocorrem dois

processos paralelos: (i) a desprotonação do cátion flavílio, dando origem a bases

quinoidais de cor azulada; (ii) o ataque nucleofílico da água ao C-2, dando origem a um

hemiacetal incolor que tautomeriza a uma cis-chalcona.6 A isomerização da cis-

chalcona leva à trans-chalcona, um processo de interesse fotoquímico.19-22

24

Esquema 2: Estrutura básica de antocianidina, onde R = OH, H ou OCH3 e reatividade de

antocianina em meio aquoso. A hidratação e a desprotonação do cátion flavílio dando origem

ao hemiacetal e às bases quinoidais, respectivamente, são dependentes do pH e ocorrem em

uma escala de tempo menor (segundos a minutos) se comparadas ao tautomerismo de

hemiacetal dando origem a cis-chalcona (minutos a horas). R1 = açúcar.

O principal processo de estabilização da cor de antocianinas em plantas é a

copigmentação.2 Copigmentos são metabólitos de plantas ricos em elétrons π e que, em

geral, absorvem luz ultravioleta; exemplos incluem ácidos orgânicos, e.g., fumárico e

caféico, catecol e seus derivados. A interação entre antocianinas e copigmentos resulta

em um complexo molecular com maior coeficiente de absorção molar (efeito

hipercrômico) e com máximo de absorção deslocado para comprimentos de onda de

menor energia (deslocamento batocrômico) dado o maior grau de deslocalização de

carga no complexo quando comparado à antocianina.23

Complexos supramoleculares

envolvendo antocianinas, copigmentos e cátions metalicos, e.g., Al3+

, são azuis.24-31

No

vacúolo das plantas (pH 5), a complexação via cátion flavílio previne a perda de cor das

25

antocianinas. Acreditava-se que a força motriz para a formação do complexo era o

efeito hidrofóbico, porém estudos recentes demonstram uma relevância da transferência

de carga nesse processo de estabilização.32

Na copigmentação, ocorre uma transferência

de carga do copigmento para a antocianina, diminuindo a carga positiva no C-2 do

cátion flavílio, o que resulta em uma redução da constante de equilíbrio de hidratação.

Dessa forma, a formação das espécies incolores, hemiacetal e chalconas, é

desfavorecida, resultando em uma maior estabilização da cor das antocianinas

(Esquema 3).23

Esquema 3: A formação do complexo de transferência de carga desloca o equilíbrio para a

espécie responsável pela coloração das antocianinas, o cátion flavílio.23

Betalaínas são pigmentos vacuolares vegetais, atóxicos e solúveis em água. Elas

são encontradas na maioria das famílias de plantas da ordem Caryophyllales e também

em alguns fungos Basidiomicetos, sendo a beterraba sua principal fonte natural (Figura

1).1-2

As betalaínas possuem um sistema 1,7-diazaheptametínico (1,7-dHm) como

cromóforo e são divididas em duas classes de acordo com sua estrutura (Esquema 4). As

betacianinas possuem coloração magenta-violácea (máximo de absorção (λabs) em torno

de 540 nm) e são produtos de condensação entre ácido betalâmico com derivados

26

glicosilados e/ou acilados da ciclo‐DOPA, enquanto betaxantinas possuem coloração

amarelo-alaranjada (máximo de absorção entre 460 e 480 nm) e se originam do

acoplamento aldimínico entre ácido betalâmico e aminoácidos essenciais.9 Betaxantinas

são fracamente fluorescentes,33-34

enquanto betacianinas não apresentam fluorescência.

As betalaínas naturais betanina e indicaxantina apresentam atividade antioxidante e

anti-inflamatória em meio biológico, exibindo interação com membranas e lipoproteínas

humanas de baixa densidade (LDLs).35-37

Sua biodisponibilidade assemelha-se a dos

flavonóides,38

podendo chegar a ordem de μmol no plasma sanguíneo humano, no caso

da indicaxantina.39

Figura 1: Fontes de betalaínas naturais; (a) flor da maravilha (Mirabilis jalapa), (b) flores do

cactus opuntia (Opuntia fícus-indica), (c) frutos da pitaia (Hylocereus undutu), (d) beterrabas

vermelha e amarela (Beta vulgaris), (e) flor da onze-horas (Portulaca grandiflora), (f) flor da

primavera (Boungaivillea spectabilis).

27

Esquema 4: Betacianinas, betaxantinas e seu precursor comum, o ácido betalâmico.

Estabilidade de betalaínas

Betalaínas são compostos sensíveis a fatores como irradiação luminosa intensa,40

alta atividade de água,41-42

extrema acidez ou basicidade43-45

e altas temperaturas44, 46-47

.

Cada um desses fatores afeta um ou mais grupos funcionais presentes nas betalaínas,

causando a sua degradação. No Esquema 5 são apresentadas algumas vias de

degradação de betacianinas, bem como os principais agentes para estas

transformações.48

Além de descarboxilação, desidrogenação e desglicosilação, as

betalaínas ainda podem sofrer hidrólise, dando origem ao precursor ácido betalâmico e a

amina correspondente. Na presença de ácido, pode ocorrer epimerização, dando origem

às isobetalaínas, e abertura do anel 1,2,3,4-tetraidropiridínico, levando à formação de

4,5-seco-DOPA. Apesar da presença de luz induzir a formação de betalaínas in vivo,49-52

a irradiação de betalaínas em solução favorece a sua decomposição.40, 53

Luz na região

UV-vis favorece a decomposição de betalaínas através de processos oxidativos, i.e., Ea

= 104,5 kJ mol–1

no escuro e 80,3 kJ mol–1

sob iluminação.40, 44, 54-56

28

Esquema 5: Possíveis vias de degradação de betacianinas.48, 57

Na betanina, ligações duplas

em vermelho são sujeitas à isomerização, ligações em azul podem sofrer isomerização e

ligações em verde são passíveis de oxidação para formação de dupla ligação. neoBn:

neobetalaína. Soluções de betalaínas são estáveis em uma faixa de pH entre 3 e 7.

NH

N

HO

GlcO

O

OH

O

OH

O

OH

NH

N

HO

GlcO

O

OH

O

OH

NH

N

HO

GlcO

O

OH

O

OH

NH

N

HO

GlcO

O

OH

O

OH

2-dCO2-Bn, vermelha

17-dCO2-Bn, vermelha-alaranjada

15-dCO2-Bn, vermelhaDESCARBOXILAÇÃO

NH

NH2

HO

GlcO

O

OH

O

OH

O

OH

O

H

Ácido betalâmico (HBt), amarelo

5-O-Glc-cicloDOPA

DESGLICOSILAÇÃO

NH

N

HO

HO

O

OH

O

OH

O

OH

Betanidina, magenta

EPIMERIZAÇÃO

(R)(R)

NH

N

HO

GlcO

O

OH

O

OH

O

OH

Isobetanina (iBn), magenta

DESIDROGENAÇÃO

N

N

HO

GlcO

O

OH

O

OH

O

OH

neoBn, amarela

NH3

O

OH

O

OH

O

H OH

NH

N

HO

GlcO

O

OH

O

OH

Betanina (Bn), magenta

melaninas

4,5-seco-DOPA

HIDRÓLISE

H2O

H2O

–CO2

+ 2H+, 2e–

–2H+, –2e–

NH

N

HO

GlcO

O

OH

O

OH+ 2H+, 2e–

NH

N

HO

GlcO

O

OH

O

OH

O

OH

Betanina (Bn)

• ácido, base

• H2O

• D

• base, O2

• D, O2

• ácido• D• 3.2.1.21

• D

29

O aumento da temperatura acelera a degradação de betalaínas. A decomposição

térmica de betanina em extratos de beterraba segue cinética de primeira ordem,

apresentando constantes de degradação variando de 6,2 min–1

(25 °C) a 35 min–1

(75

°C).56

Betacianinas são mais estáveis do que betaxantinas frente ao aumento da

temperatura e à hidrólise.46, 58-59

Por exemplo, o tempo de meia-vida da betanina tratada

termicamente (τ1/2 = 1100 min) é 11 vezes maior que o da vulgaxantina I (τ1/2 = 100

min).60

Estudos sobre termoestabilidade de betalaínas sugerem mecanismos de

degradação e caracterizam os produtos de decomposição. Sob aquecimento em meio

ácido, betalaínas epimerizam para a forma iso, possivelmente via tautomerização, e

mantém sua coloração magenta.61

A desidrogenação de betalaínas dá origem às

neobetalaínas, as quais possuem coloração amarelada. Neobetanina e neobetanidina,

assim como seus derivados descarboxilados foram identificados por HPLC-MS em

estudos de termoestabilidade de betalaínas provenientes de suco de pitaia roxa.62

Processos de descarboxilação resultam em compostos com comprimento de onda

deslocado para o azul devido a diminuição da deslocalização dos elétrons π.61

O sítio de

descarboxilação de betalaínas depende do solvente utilizado no estudo. Enquanto etanol

e sua mistura com água promovem a descarboxilação no C-17, em meio aquoso a

descarboxilação do C-2 é favorecida. Entretanto, após aquecimento prolongado essa

diferença não é mais observada e todos os sítios são afetados.63

A hidrólise de betalaínas

também é favorecida pelo aumento da temperatura.64

Devido a formação de ácido

betalâmico, a solução passa a ser amarela. Fato interessante desse processo de

degradação é sua reversibilidade com a acidificação do meio (no caso de hidrólise

alcalina) ou resfriamento65

, porém a regeneração dos pigmentos não é completa.66

Considerando que betalaínas são susceptíveis a hidrólise, a presença de água é

30

desvantajosa. Nas suas matrizes naturais, as betaxantinas60, 67

e as betacianinas44

são

mais estáveis que em solução aquosa. Os constituintes vegetais como açúcares, ácidos e

pectinas diminuem a atividade de água (aw)68,69

, aumentando a persistência70

dos

pigmentos em meio aquoso.71

O aumento na persistência de betanina foi observado em

condições onde aw era menor que 0,63.72

Estabilização de betalaínas

A estabilidade de betalaínas pode ser aumentada através da utilização de

técnicas de microencapsulação, nas quais o pigmento é envolvido por uma cápsula ou

cobertura em uma escala micrométrica (tipicamente menor que 300 µm) de forma a

diminuir sua interação com espécies químicas ou fatores externos que possam levar a

sua degradação.73

Atualmente, as técnicas mais utilizadas pela indústria são a secagem

por aspersão (spray drying) e a formação de emulsões. Betalaínas do extrato de frutos

da opuntia (Opuntia ficus-indica) foram microencapsuladas com maltodextrinas de

forma a aumentar sua aplicação como matérias primas na indústria de alimentos.

Embora o material obtido tenha maior persistência frente ao aquecimento, ainda se

mostrou bastante sensível a irradiação luminosa.74-75

MiraxantinaV e betanidina também

foram encapsuladas com maltodextrina e quitosana, empregando-se o método de

secagem por aspersão.76

As micropartículas obtidas com quitosana são menores

comparadas a maltodextrina. A combinação destes pigmentos em proporções diferentes

permitiu obter cores entre o amarelo e o magenta, passando pelo vermelho, em um

material com boa estabilidade térmica, mas ainda bastante sensível a luz.76

Extrato

aquoso de beterraba também foi encapsulado em emulsões de camada dupla do tipo

A/O/A, porém a emulsão obtida mostrou-se polidispersa e instável, apresentando a

formação de creme após alguns dias armazenada a temperatura ambiente.77

31

Capítulo 1.

Microencapsulação de betanina em

emulsão monodispersa A/O/A

1-1. Introdução

O número de consumidores que prefere matérias primas de origem natural a

substâncias artificiais nos alimentos e bebidas que ingerem vem crescendo.78-79

Produtos

sem (ou com poucas) substâncias artificiais, incluindo aditivos corantes, são chamados

de "clean label" e são associados a um menor risco à saúde e a um menor impacto

ambiental.80-82

Pigmentos naturais têm sido utilizados como colorantes na indústria

alimentícia há séculos e, eventualmente, atuam como micronutrientes com propriedades

benéficas à saúde humana.3, 83-88

Betanina é o componente principal da beterraba em pó,

um aditivo corante atóxico de cor magenta usado em alimentos (EEC# E162) que foi

aprovado pelo FDA (Food and Drug Administration, EUA) em 1967. Entretanto, a

betanina é sensível à decomposição térmica44, 46-47, 56, 62, 89-91

e fotoquímica40

e sujeita à

hidrólise em meio ácido ou básico41-45, 56, 92-93

que alteram a sua cor e limitam a sua

aplicação em alimentos. Apesar disso, betalaínas apresentam um poder tintorial três

vezes maior que antocianinas, i.e., quantidades menores de pigmento são necessárias

para colorir o produto final,94

e ainda, betalaínas são coloridas em uma faixa de pH

entre 3 e 7, condição em que antocianinas são praticamente incolores (vide Esquema 2).

A encapsulação de betalaínas em matrizes complexas aumenta a sua

persistência.95

Existem diversas técnicas para microencapsulação de substâncias

32

químicas, que incluem a emulsificação seguida por remoção de solvente,96

secagem por

aspersão e moagem. Moagem resulta em amostras polidispersas, com tamanhos de

partícula não uniformes, e – assim como a secagem por aspersão – não é adequada para

amostras sensíveis a temperatura. Emulsões água-em-óleo (A/O), aonde óleo se refere a

qualquer líquido insolúvel em água, são apropriadas para encapsular substâncias

polares, mas também tendem a produzir amostras polidispersas. Emulsões múltiplas do

tipo água-em-óleo-em-água (A/O/A) permitem encapsular substâncias hidrofílicas e

incorporá-las em água como alto grau de monodispersão, dependendo da técnica usada

para a preparação da emulsão.95

Extrato aquoso de beterraba foi encapsulado em

emulsão de camada dupla do tipo A/O/A para estudo de sua digestão intestinal in vitro,

porém a emulsão obtida demonstrou-se polidispersa e instável, apresentando formação

de creme após armazenamento a temperatura ambiente.77

1-1.1. Propriedades de emulsões simples

Emulsões são misturas entre dois ou mais líquidos imiscíveis, e.g., água e óleo,

nas quais gotas de um deles estão dispersas (fase dispersa) em uma fase contínua do

outro.97

Emulsões são dispersões coloidais com tamanho de partícula dispersa entre 100

nm e 100 μm e que tendem a ter uma aparência opaca dado o espalhamento de luz nas

suas várias interfaces.‡

Emulsões são, a priori, termodinamicamente instáveis.98

A variação de energia

de Gibbs (ΔG) para emulsificação em uma dada temperatura tem duas contribuições:

‡ A concentração da emulsão determina a sua cor: quando a luz é espalhada de maneira homogênea a

emulsão é branca; contudo, ao ser suficientemente diluída a emulsão adquire tonalidade azul graças ao

maior espalhamento da luz com menor comprimento de onda, viz., efeito Tyndall, e, analogamente, se

torna amarela quando mais concentrada. Microemulsões e nanoemulsões, nas quais o tamanho das gotas é

inferior a 100 nm, são, entretanto, translúcidas.

33

um termo relacionado às energias interfacial (γabΔAab; em uma interface entre os

líquidos a e b, Aab é definida como a área interfacial, e γab é a tensão interfacial) e um

termo entrópico que reflete o aumento do número de estados quando força mecânica

dispersa um líquido no outro:

Eq. 1

Como o aumento do número de gotas durante a emulsificação resulta em

aumento na entropia configuracional, na maioria dos casos γabΔAab ≫ –TΔS, o que

implica em ΔG positivo, ou seja, a formação da emulsão não é espontânea e o sistema

emulsionado é termodinâmicamente instável. Como resultado, observa-se a quebra da

emulsão por diversos mecanismos, incluindo floculação, coalescência, envelhecimento

de Ostwald. Nestas condições, não existe uma barreira potencial para a quebra da

emulsão por floculação e coalescência, que são controlados por difusão (das gotas ou do

líquido entre gotas, respectivamente).99

Na presença de um estabilizante, tipicamente um agente tensoativo, surgem

barreiras potenciais, as energias de ativação de Gibbs Δ‡Gfloc e Δ

‡Gcoal, que podem

proporcionar estabilidade cinética à emulsão. Uma emulsão floculada pode, caso o valor

de Δ‡Gcoal seja suficientemente alto, permanecer neste estado metaestável por longos

períodos de tempo. Da mesma forma, quando a Δ‡Gcoal é alta, a emulsão pode

permanecer indefinidamente em um estado formado por uma fase dispersa e uma fase

contínua.99

A escolha do tensoativo é realizada com base em seu balanço hidrofílico-

lipofílico (HLB). HLB é uma medida da proporção relativa entre os componentes

hidrofílico e lipofílico da molécula e sua escala varia de 0 a 20. Quanto maior o valor de

HLB, maior a solubilidade deste tensoativo em água.100-101

Emulsões A/O requerem

tensoativos com baixo HLB (3 - 6), enquanto emulsões O/A requerem tensoativos com

34

alto valor de HLB (8 – 18).98

Em geral, a regra de Bancroft se aplica e agentes

emulsificantes tendem a promover a dispersão da fase na qual são menos solúveis.102

Floculação e coalescência resultam em aumento do tamanho da gota e,

geralmente levam a formação de creme ou sedimentação. Esses dois processos são o

resultado do aumento da atração de van der Waals entre átomos e moléculas, i.e.,

dipolo-dipolo (Keesom), dipolo-dipolo-induzido (Debye) e dispersão (forças de

London), em detrimento da repulsão eletrostática (ou estérica) na interface§ criada pelo

agente emulsificante. A inversão de fase consiste na transformação de uma emulsão

A/O em uma emulsão O/A e vice-versa. Isso ocorre quando há uma mudança na

propriedade do tensoativo devido, por exemplo, a variações na temperatura. O

envelhecimento de Ostwald ocorre quando gotas menores difundem pela fase contínua

da emulsão e se fundem a gotas maiores. Devido sua instabilidade termodinâmica, as

emulsões tendem a reduzir sua energia livre de Gibbs (ΔG) através do aumento do

diâmetro das gotas da emulsão, reduzindo assim a área interfacial total. Gotas menores

possuem um maior potencial químico interno devido a maior pressão interna da gota (p)

e tendem a fundir com gotas maiores para diminuir este potencial.103

A pressão interna

da gota, também conhecida como pressão de Laplace, é definida pela equação 2, onde

γab é a tensão interfacial entre as fases dispersa e contínua da emulsão e r é o raio da

gota. Emulsões monodispersas, ou seja, com uma distribuição uniforme do tamanho das

gotas diminuem o envelhecimento de Ostwald, uma vez que as gotas terão tamanhos

semelhantes entre si.99

§ Interfase e interface são expressões usadas de forma bastante ampla. Interfase é definida como a fase

intermediária entre dois materiais em equilíbrio, irão se juntar para resultar em um sistema

microheterogêneo. Interface é o limite superficial entre fases homogêneas em equilíbrio termodinâmico.

35

Eq. 2

Figura 2: Principais processos de desestabilização de emulsões.

1-1.2. Emulsões multiplas

Emulsões de camada dupla, e.g., água-óleo-água (A/O/A) ou óleo-água-óleo

(O/A/O) (Figura 3), tem ganhado destaque na encapsulação de princípios ativos.97

No

caso da emulsão A/O/A, uma fase aquosa interna é dispersa em uma fase oleosa. Então,

essa fase oleosa é dispersa em uma fase aquosa contínua. A principal característica

desta emulsão é a capacidade de encapsulação de um composto hidrofílico com

posterior aplicação em um meio também hidrofílico, o que não é possível em uma

emulsão do tipo A/O. Betanina, por exemplo, é solúvel em água, porém é instável em

meios alcalinos (pH > 8) e bastante ácidos (pH < 3), não podendo ser utilizada em

produtos cuja formulação apresente estes valores de pH. Uma vez encapsulada em uma

emulsão de camada dupla, betanina estaria protegida pela fase oleosa e poderia ser

p = 2gab

r

36

utilizada nessas formulações. O maior problema das emulsões de camada dupla é sua

instabilidade termodinâmica devido à existência de duas interfaces.

Figura 3: Representação de emulsões A/O e de emulsões de camada dupla A/O/A.

1-1.3. Obtenção de emulsões A/O/A por emulsificação por microcanais

Emulsões A/O/A são produzidas em duas etapas utilizando diferentes técnicas,

incluindo homogeneização utilizando um rotor-estator, ultrassom ou alta rotação.104

Todas essas técnicas dão origem a emulsões polidispersas. Contudo, novas técnicas,

e.g., emulsificação por membranas (membrane emulsification, ME), por microcanais

(microchannel emulsification, MCE) ou técnicas baseadas em microfluídica

(microfluidic emulsification, MFE), foram desenvolvidas a fim de melhorar a

estabilidade física de emulsões104-105

. A emulsificação por microcanais foi proposta em

1997 por Kawakatsu e colaboradores e resulta em emulsões monodispersas.106

O

sistema consiste em um módulo de aço inoxidável que é montado de forma a imobilizar

uma placa de microcanais entre duas placas de vidro. Cada microcanal é formado por

um microfuro e uma microrranhura orientado como um T107-109

; a fases dispersa e

contínua são bombeadas por lados opostos da placa e armazenadas em um recipiente. A

geração de gotas ocorre espontaneamente devido a tensão interfacial existente entre os

dois líquidos, da geometria do microcanal e do espaçamento entre os diversos

37

microcanais.110-111

Um microscópio invertido é usado para monitorar a formação das

gotas.

38

1-2. Objetivos

Encapsular betanina em uma emulsão A/O/A formada por água, óleo de soja e

tensoativos apropriados para uso alimentício.

1-2.1. Objetivos específicos

i. Determinar a formulação mais adequada da emulsão, variando-se a fração de

volume da fase aquosa interna, a concentração do emulsificante hidrofóbico, a

concentração de betanina, a concentração do emulsificante hidrofílico e o fluxo

da fase dispersa;

ii. Determinar a influência de diferentes fontes de betanina na formulação da

emulsão;

iii. Determinar e estabilidade física das emulsões contendo diferentes fontes de

betanina a 4 °C, 25 °C e 60 °C ao longo de 7 dias;

iv. Determinar a variabilidade de cor da betanina encapsulada quando mantida a

4 °C, 25 °C e 60 °C ao longo de 7 dias.

39


40

1-3. Resultados e discussão

Este trabalho foi desenvolvido na Universidade de Tsukuba, Japão, sob a

supervisão do Prof. Marcos Neves e com a ajuda do aluno de Doutorado Nauman

Khalid.

1-3.1. Otimização da emulsão de camada dupla A/O/A

O estudo de encapsulação de betanina em emulsão múltipla A/O/A foi iniciado

com betanina comercial (amostra A), uma mistura de beterraba em pó e dextrina. A

emulsão usada para encapsular a betalaína foi estudada anteriormente pelo grupo do

Prof. Kobayashi e do Prof. Neves na Universidade de Tsukuba e requer duas etapas para

ser formulada.104-105, 109, 112

Com o auxílio de um rotor-estator, prepara-se uma emulsão

A/O formada por uma fase aquosa tamponada (TPi pH 6,2, 100 mmol L–1

), contendo

betanina (até 1,0% m/mfd(A/O)) e D-glicose (1% m/mfd(A/O)), dispersa em uma fase

contínua formada por óleo de soja e o emulsificante CR-310. D-Glicose foi usada como

redutor da atividade de água para estabilizar a betanina.61

Os emulsificantes foram

selecionados considerando-se suas toxicidades e valores na escala semi-empírica

HLB:100-101

Tween 20 tem HLB = 16,7, sendo adequado para estabilizar emulsões A/O

enquanto o CR-310, HLB < 1, que estabiliza emulsões O/A (Esquema 6). A emulsão

A/O foi dispersa na fase aquosa contínua contendo Tween 20 empregando-se um

sistema de emulsificação por microcanais (MCE). Nesse sistema, uma placa de silício

área com ativa de 10 mm2

contendo ca. 14.000 microcanais, cada um formado por um

microfuro e um microencaixe, é alimentada com as fases contínua e dispersa de forma a

produzir gotas (Figura 4).

41

Esquema 6: Estrutura dos emulsificantes utilizados na formação da emulsão A/O/A.

Figura 4. Sistema de emulsificação por microcanais. a) Seção transversal da microplaca,

composto de um microcanal cilíndrico (160 μm × 10 μm, A × L) a um micropoço (10 μm × 80

μm × 40 μm, A × L × P). b) Vista inferior do sistema multicanal, como observado no

microscópio ótico conectado ao sistema. c) Esquema simplificado do sistema multicanal.

42

Os efeitos de diferentes fatores experimentais (Tabela 1) sobre as características

da emulsão A/O/A foram investigados. Para cada condição experimental,

determinaram-se a distribuição do tamanho das gotas, o seu diâmetro médio de Sauter

(d3,2) e o grau de dispersão da emulsão, medido pelo fator de distribuição relativo,

Relative Span Factor, RSF. O diâmetro médio de Sauter das gotas (d3,2) é definido

como o diâmetro da esfera que possui a mesma proporção volume/área superficial que a

partícula de interesse:

Eq. 3

onde V e S representam o volume e a área superficial da gota, respectivamente.

Como cada parâmetro foi variado individualmente, foram definidas condições

experimentais padrão: fração de volume da fase aquosa interna (ϕAi): 30%, concentração

de CR-310 (CCR-310): 4% m/mfc(A/O), concentração de Tween 20 (CTween20): 2%

m/mfc(A/O/A), concentração de betanina (CBn): 0,5% m/mfd(A/O) e fluxo da fase dispersa

(fA/O): 10 L m–2

h–1

.

Tabela 1. Condições experimentais usadas na etapa de otimização da formulação da emulsão.

Variável Condição

Mínima Intermediária Máxima

ϕAi 0,1 0,2 0,3

CCR-310, %m/mfc(A/O) 2,0 4,0 8,0

CTween20, %m/mfc(A/O/A) 1,0 2,0 3,0

CBn, %m/mfd(A/O) 0,1 0,5 1,0

43

fA/O, L m–2 h–1. 5 20 100

Os gráficos de radar modificados apresentados na Figura 5 mostram que

somente o fluxo da fase dispersa afeta o diâmetro médio de Sauter, viz., quando o fluxo

é aumentado de 5,0 para 100 L m–2

h–1

o valor de d3,2 aumenta ca. de 10 μm. Um

aumento sutil do valor de d3,2 é provocado também com o aumento da concentração de

CR-310. O grau de monodispersão, conforme medido pelo RSF, diminui no fluxo

máximo utilizado, resultando em uma emulsão polidispersa, i.e., valor de RSF > 0.5

indica polidispersão. As demais variáveis parecem não afetar o valor de RSF. Quando a

concentração de CR-310 foi usada na condição mínima (2% m/mfc(A/O)), observou-se

quebra da emulsão com separação de fase, impossibilitando a sua caracterização (Anexo

1).

Figura 5. Gráficos de radar modificado que indicam o efeito das condições experimentais

(mínima, intermediária e máxima) de cada variável independente sobre o diâmetro médio de

Sauter (d3,2) e do Relative Span Factor, RSF. Os dados são apresentados em escala

logaritmica e os contornos utilizam suavização Belzier modificada, conforme implementado no

programa Origin.

1.060

45

fA/O

CBn

CTween20

CCR-310

φAi

min

interm.

max

50

55

d3,2

(mm)

b

fA/O

CBn

CTween20

CCR-310

φAi

min

interm.

max

0.5

RSF

a

44

As medidas de distribuição de tamanho das gotas foram feitas em um analisador

de espalhamento dinâmico de luz (dynamic light scattering, DLS) determinado por

difração a laser e são apresentadas na Figura 6. Com fluxo da fase dispersa de

10 mL m–2

h–1

, uma concentração de CR-310 intermediária (4% m/mfc(A/O)) resultou em

partículas monodispersas com menor largura à meia altura (FWHM = 7,7 µm).

Contudo, se o fluxo é aumentado acima de 80 mL m–2

h–1

, a emulsão se torna

polidispersa, conforme inferido pela análise dos valores de RSF (Anexo 2).

Figura 6: Distribuição do tamanho das gotas geradas variando-se a fração de volume de fase

aquosa interna (A), concentração de Tween 20 (B), concentração de CR-310 (C) e

concentração de betanina (C).

Esses resultados são confirmados pela visualização da formação das gotas no

sistema de microcanais (Figura 7). O aumento do fluxo de 5 para 20 L m–2

h–1

aumenta

o número de gotas, sem afetar significativamente seu tamanho. Contudo, quando o fluxo

é levado acima de 100 L m–2

h–1

observa-se que o tamanho das gotas aumenta e a

emulsão se torna polidispersa. Na emulsificação em microcanais, i.e., microfluídica, a

formação das gotas é um processo espontâneo que depende da tensão interfacial entre os

líquidos e da viscosidade, sendo definida pelo número de capilaridade (Ca):

50 100 150 2000

10

20

30

40

50

Vo

lum

e (

%)

Diâmetro da gota, d (µm)

CBn

min

CBn

int

CBn

max

CTween20

min

CTween20

int

CTween20

max

φAi min

φAi int

φAi max

CCR-310

int

CCR-310

max

fA/O

min

fA/O

int

fA/O

max

45

Eq. 4

onde é a viscosidade da fase dispersa (caso seja a fase mais viscosa), U é o fluxo da

fase dispersa e γ é a tensão interfacial. Valores de Ca ≫ 1 resultam quando a

viscosidade ou o fluxo aumentam e resultam na deformação irregular das gotas,

resultando em um maior volume das gotas na fenda e, consequentemente, uma menor

área de contato com o microcanal. Como resultado, as gotas adquirem caráter

polidisperso e tamanhos maiores.

46

Figura 7: Micrografia da geração de gotas por microcanais variando-se o fluxo da fase

dispersa. a) 5 L m–2

h–1

, b) 10 L m–2

h–1

, c) 20 L m–2

h–1

, d) 40 L m–2

h–1

e e) >100 L m–2

h–1

. A

barra corresponde a 80 μm.

Em regime de Ca baixo (< 1) a tensão interfacial é o termo mais importante, e

seu aumento implica na diminuição da área interfacial levando à formação de gotas

esféricas e à monodispersividade.113-114

Nestas condições a formação de gotas ocorre

por que a pressão exercida pela fase dispersa sobre a fase contínua supera a chamada

47

pressão de ruptura da gota (Pbt), definida por:115

Eq. 5

onde é a tensão interfacial entre a fase dispersa e a fase contínua, é o ângulo de

contato entre a gota e a superfície do microcanal e d é o diâmetro do microcanal. Nos

experimentos realizados com fluxo abaixo de 80 L m–2

h–1

, a passagem da emulsão A/O

pela fenda resulta na formação de emulsões monodispersas com gotas de cerca de 50

m. Nesta faixa de fluxo, a formação das gotas provavelmente é controlada pela tensão

superficial do líquido, i.e., quando ângulo de contato atinge um valor crítico, ocorre o

desprendimento da gota, que tem volume constante.

1-3.2. Efeito da fonte de betanina

Com estes experimentos, obtiveram-se as condições experimental otimizadas

para a realização dos estudos com outras fontes de betanina: ϕAi em 30%, CCR-310: 4%

m/mfc(A/O), CTween20: 1% m/mfc(A/O/A), CBn: 0,5% m/mfd(A/O) e fA/O: 10 L m–2

h–1

. Nestas

condições, emulsões A/O/A foram preparadas empregando-se outras duas fontes de

betanina: betanina extraída de suco de beterraba e purificada (amostra B, para detalhes

da obtenção vide Cap. 3) e suco de beterraba em pó obtido através de secagem por

aspersão (amostra C). Para que o poder tintorial das amostras, bem como os efeitos da

composição de cada amostra sobre as propriedades da emulsão, pudessem ser

comparados, a concentração de amostra foi definida em 0,5% m/mfd(A/O), i.e., 75 mg de

amostra em 15 g de fase dispersa. As concentrações finais de betanina em cada amostra

foram determinadas espectrofotometricamente em soluções aquosas considerando um

coeficiente de absorção molar de 65.000 L mol–1

cm–1

em 536 nm:116

1,5 × 10–5

mol L–1

(amostra A), 1,7 × 10–3

mol L–1

(amostra B) e 1,4 × 10–4

mol L–1

(amostra C). Para

48

medir a quantidade relativa de betalaínas na emulsão foi desenvolvida uma metodologia

baseada na análise de imagem. Fotografias dos frascos contendo as emulsões

iluminados de forma a criar uma zona de sombra foram adquiridas com o auxílio de um

telefone celular, sempre em condições idênticas. A cor na interface entre luz e sombra

foi amostrada e classificada de acordo com o espaço de cor CIELa*b

* (Figura 8).

Observa-se que a luminância (L) aumenta com a diminuição da quantidade de pigmento

e é maior nas emulsões A/O do que nas emulsões A/O/A. Os valores do parâmetro a*

indica uma escala de cores que varia do vermelho (+) ao verde (–), enquanto b* varia do

amarelo (+) ao azul (–). Nas emulsões A/O é evidente o maior potencial tintorial da

amostra B (betanina pura), evidenciado pelo valor mais alto e mais positivo de a* e mais

negativo de b* (mais vermelho e mais azul, resultando em magenta) comparado às

outras amostras. O mesmo efeito é observado em emulsões A/O/A; contudo, todas as

amostras se tornam mais opacas, resultando em diminuição do grau de saturação

(valores de a* e b

* mais próximos de zero).

Nas condições experimentais otimizadas com a amostra A, a emulsão formulada

com a amostra B também é monodispersa, porém a emulsão formulada com beterraba

em pó (amostra C) é polidispersa (Figura 9 e Anexo 4). Essa polidispersão poderia ser

explicada pela presença de enzimas e proteínas, que não são encontrados nas amostras

A e B, e que podem afetar a tensão superficial e as características da emulsão.

Considerando-se o efeito tintorial superior da betanina pura em comparação às outras

amostras, o efeito da variação do fluxo da fase dispersa sobre a emulsão contendo a

amostra B foi analisado e os resultados são apresentados no Anexo 5.

49

Figura 8. Emulsões A/O e A/O/A contendo 0,5% m/m da amostra A: betanina comercial em

dextrina, a amostra B: betanina purificada e a amostra C: suco de beterraba em pó. O

retângulo superior é um recorte da imagem do frasco contendo a emulsão (imagem bruta no

anexo 3). O retângulo inferior é a cor média (áre de 11 pixel2) e seu respectivo código CIELa

*b

*.

Figura 9: Distribuição do tamanho das gotas geradas variando-se a fonte de betanina.

Amostra A, betanina comercial em dextrina: FWHM = 7,7 µm; amostra B, betanina pura:

FWHM = 8,9 µm e amostra C, suco de beterraba em pó: FWHM = 31 µm.

1-3.3. Efeito da temperatura e do tempo de armazenamento

Emulsões A/O/A contendo betalaínas foram mantidas a 4 °C, 25 °C e 60 °C e

monitoradas por sete dias. Uma emulsão A/O/A sem a adição de betanina foi usada

como controle. Medidas de diâmetro de partícula (Figura 10) e imagens de microscopia

ótica (Figura 11) foram realizadas no primeiro e último dia, para avaliar eventuais

mudanças no tamanho e na forma das gotas e avaliar a estabilidade da emulsão. Todas

50

as amostras foram mantidas no escuro no período entre as análises.

A Figura 10 mostra a variação do diâmetro médio de Sauter (d3,2) (a) e do RSF

(b) das emulsões na ausência de betanina e na presença de 3 fontes de betanina nos dias

1 e 7. As linhas horizontais brancas representam os valores de d3,2 e RSF em cada

temperatura estudada e as linhas horizontais pretas representam o valor médio obtido,

considerando-se todas as temperaturas. A emulsão controle (sem betanina) e a emulsão

da amostra A apresentam uma variação semelhante no diâmetro médio das gotas ao

longo de uma semana, enquanto a amostra C apresenta um intervalo maior, sugerindo

que componentes do pó de beterraba bruto comprometem o efeito dos agentes

emulsificantes presentes na emulsão. A amostra B apresenta uma sutil variação no

diâmetro médio das gotas, sendo esta menor que a observada na emulsão controle. Este

fato sugere que a betanina está estabilizando a emulsão. Os valores de RSF mostram

que ao longo de uma semana a emulsão controle é polidispersa, enquanto a emulsão das

amostras A e B são monodispersas. A emulsão da amostra C é polidispersa desde o

início do ensaio de estabilidade, uma vez que no seu processo de emulsificação já é

observada polidispersão.

51

Figura 10. Graficos de Bean para o efeito da temperatura e tempo de armazenamento sobre (a)

o diâmetro médio de Sauter (d3,2) e (b) o RSF das emulsões formuladas na ausência de

betanina e na presença de três diferentes fontes do pigmento. Os gráficos foram preparados

com os dados obtidos a 4 ºC, 25 ºC e 60 ºC (linhas brancas horizontais, dados brutos no Anexo

6). As linhas pontilhadas horizontais indicam o valor médio medido, enquanto a linha pontilhada

vermelha em (b) indica o limite de uma emulsão monodispersa, RSF = 0.5.

A microscopia ótica mostra que as gotas em todas as amostras não sofrem

alteração de tamanho ou morfologia quando a emulsão A/O/A é mantida a 4 ºC por uma

semana (Figura 11). As gotas presentes nas emulsões contendo as amostras A e B têm

diâmetro similar, enquanto a amostra C resulta em gotas 25 μm maiores. A 25 ºC a

52

emulsão da amostra A sofre uma sutil redução de tamanho em uma semana. A amostra

B, além da diminuição das gotas no período, apresenta maior homogeneidade no

interior da gota, o que sugere que a emulsão A/O/A se transformou em uma emulsão

O/A. Um comportamento similar é observado para as gotas contendo as amostras C. As

gotas das emulsões das amostras A e C mantidas a 60 °C sofreram uma redução abrupta

no tamanho, apresentando valores de diâmetro menores que 3 µm no sétimo dia. A

amostra B apresentou uma pequena diminuição no tamanho das gotas. Além disso, no

primeiro dia do ensaio de estabilidade, o interior das gotas começa a apresentar uma

heterogeneidade, o que sugere o início do processo de coalescência das gotas da

emulsão. Após uma semana a 60 °C, a emulsão da amostra B sofre floculação,

confirmando a hipótese de coalescência no início do ensaio.

Para verificar a influência das diferentes amostras de betanina na taxa de

contração de volume das gostas da emulsão, o volume das gotas das emulsões mantidas

a 25 °C nos dias 1 e 7 foi calculado a partir dos dados de diâmetro médio de Sauter

(d3,2) das gotas (Anexo 6) e pode ser visualizado na Figura 12. Os cálculos foram

realizados considerando-se um comportamento ideal do sistema. A emulsão controle

apresenta uma contração de 70% em seu volume, enquanto nas amostras A e B esta taxa

é de 50% e 65%, respectivamente. A amostra C apresenta uma taxa de contração de

volume de 95 %. Esses resultados corroboram com o comportamento observado na

microscopia ótica e com a hipótese de betanina estar estabilizando a emulsão, uma vez

que as amostras A e B apresentaram uma taxa de contração de volume menor que a

emulsão controle.

53

Figura 11: Imagens de microscopia ótica das emulsões A/O/A contendo betanina comercial,

betanina purificada e suco de beterraba a 4 °C, 25 °C e 60 °C nos primeiro e último (7) dias do

ensaio de estabilidade. Todas as imagens estão na mesma escala; barra = 50 μm.

Este resultado pode estar relacionado ao aumento das forças de repulsão entre as

duplas camadas resultantes da presença de cargas negativas na betanina em pH > 3,5 117

,

hipótese que encontra suporte na teoria de estabilidade de colóides de Deryaguin,

Landau, Verwey e Overbeek (teoria DLVO).118

No suco de beterraba em pó, amostra C,

a presença de altas concentrações de sal e biomoléculas que afetam a tensão interfacial

54

podem comprometer a estabilidade da emulsão. A amostra A, por outro lado não parece

afetar as características das gotas quando comparada ao controle, visto que contém

menor quantidade de betanina e grande quantidade de maltodextrina, um polisacarídeo

neutro.

A diminuição do tamanho das gotas das emulsões mantidas a 60 °C (Figura 12)

pode ser explicada pela diminuição da viscosidade da fase dispersa, que leva, de acordo

com a Eq. 3, a uma diminuição do valor de Ca. Como consequência, a ruptura das gotas

também é facilitada em temperaturas mais altas, bem como o surgimento de novas gotas

de tamanho reduzido. O efeito da temperatura sobre a viscosidade do meio também

explica um menor diâmetro médio das gotas a 25 °C em relação as emulsões A/O/A

mantidas a 4 °C.

Figura 12. Microscopia ótica de uma gota selecionada das emulsões A/O/A contendo betanina

comercial, betanina purificada e suco de beterraba a 4 °C, 25 °C e 60 °C nos primeiro e último

(7) dias do ensaio de estabilidade. Todas as imagens estão na mesma escala; barra = 50 μm.

55

1-3.4.1 Coloração da emulsão

A coloração da betanina presente nas emulsões A/O/A foi acompanhada durante

7 dias. As amostras foram mantidas a 4 °C, 25 °C e 60 °C sob o abrigo de luz e

fotografias foram registradas a cada dois dias, a fim de observar a mudança de

coloração das emulsões. As imagens das emulsões A/O e A/O/A foram analisadas

considerando-se o espaço de cor CIELAB, i.e., as imagens foram analisadas utilizando-

se o programa Adobe Photoshop, no qual foram determinados os parâmetros a* e b

*.

Betanina proveniente de diferentes fontes encapsulada em emulsão A/O/A

mostrou-se sensível à temperatura. Em todas as emulsões A/O ocorre uma diminuição

dos valores de a* com o aumento da temperatura, o qual demonstra uma perda da cor

vermelha (Anexo 7 e Figura 13). Ao mesmo tempo é observado um aumento dos

valores de b*, indicando um deslocamento para a região do amarelo. Sabe-se que o

produto de degradação da betanina, o ácido betalâmico, é amarelo. A partir disso pode-

se inferir que o aumento da temperatura causa a degradação da betanina presente nas

emulsões A/O. Comportamento similar é observado nas emulsões A/O/A e nas amostras

controle. Ainda é possível observar que as emulsões A/O e A/O/A contendo betanina

pura apresentam maiores valores de a*, ou seja, coloração mais intensa. Isso se deve ao

fato da concentração de betanina nessa emulsão ser maior em relação às emulsões

contendo betanina comercial em dextrina e suco de beterraba em pó preparado por

liofilização, como citado anteriormente.

56

Figura 13: Cores médias (11 × 11 pixel) medidas para emulsões A/O e A/O/A contendo

betanina comercial, suco de beterraba e betanina mantidas a 4 ºC, 25 ºC ou 60 ºC por 7 dias.

As fotos e dados brutos são apresentados nos anexos 7 e 8. As imagens foram adquiridas sob

fundo preto.

1-4. Conclusão

Betanina foi encapsulada em emulsões A/O/A usando a técnica de emulsificação

por microcanais (MCE). As gotas formadas têm tamanho de partícula de 46 ± 10 µm e

são monodispersas. Agentes emulsificantes adequados para uso em alimentos e o uso de

óleo de soja resultaram em uma emulsão A/O/A que pode ser usada na preparação de

alimentos funcionais mantidos sob refrigeração por até 7 dias. As condições de

emulsificação foram otimizadas e o fluxo da fase dispersa foi o fator mais importante

para o tamanho e grau de dispersão das partículas, visto que esse parâmetro influencia

57

diretamente o número de capilaridade. O uso de suco de beterraba seco por aspersão

como fonte de betanina resultou em uma emulsão polidispersa com partículas com

maior diâmetro médio. Contudo, betanina pura tende a produzir gotas monodispersas

com distribuição de tamanho mais uniforme quando comparada ao controle sem

betalaínas, a suco de beterraba seco por aspersão e a betanina diluída com dextrina,

provavelmente pelo aumento da repulsão eletrostática entre as gotas e aumento da

barreira potencial para coalescência e floculação.

58

Essa página foi deixada intensionalmente em branco

59

1-5. Parte experimental

Reagentes químicos e solventes

As substâncias usadas e seus fornecedores estão listados na tabela Tabela 2 e

foram usados sem purificação adicional.

Tabela 2: Reagentes e solventes utilizados nesta etapa do trabalho.

Reagente/Solvente Fórmula/Abreviatura Fornecedor Obs.

Acetato de etila AcOEt Synth 99,5% v/v

Acetonitrila MeCN Tedia

grau

HPLC

Ácido clorídrico HCl Synth 36,5-38%

Ácido trifluoroacético TFA Sigma

Betanina comercial –

ABCR

GmbH

AB137484

D-(+)-glicose C6H12O6 Wako

Etanol EtOH Synth 99,5% v/v

Fosfato de sódio dibásico anidro Na2HPO4 Wako

Fosfato de sódio monobásico

dodecaidratado

NaH2PO4∙12H2O Wako

Isopropanol i-PrOH Synth 99,5% v/v

Monolaureato de sorbitan etoxilado 20

EO

Tween® 20 Wako

Óleo de soja refinado - Wako

Éster ricinoléico de monolaurato de

tetragrlicerina

CR-310 Sakamoto

Sigma: Sigma-Aldrich Inc; Wako: Wako Pure Chemical Industries, Ltd; Sakamoto: Sakamoto Yakuhin

Kogyo Co., Ltd.

60

Soluções tampão

Todas as soluções aquosas usadas foram preparadas com água desmineralizada

com condutividade a 25 ºC de 18,2 MΩ·cm, purificada em equipamento Direct Q (milli-

Q, Millipore). Tampão fosfato (TPi, 100 mmol L–1

, pH 6,2) foi preparado em um balão

volumétrico solubilizando-se NaH2PO4 (21,9 mmol, 2,63 g) e Na2HPO4 (3,1 mmol,

0,437 g) com água até um volume final de 250 mL. O pH da solução foi aferido com

um pHmetro (Metrohm, 827 pH lab) equipado com um eletrodo Primatode NTC

(Metrohm).

Obtenção de betanina

Foram usadas três fontes de betanina: extrato de beterraba vermelha dissolvido

em dextrina (betanina comercial, ABCR, amostra A), betanina bruta obtida de suco de

beterraba (amostra B) e suco de beterraba seco por aspersão (amostra C).

Betanina bruta

Betanina foi obtida a partir do suco de beterrabas vermelhas. Beterrabas foram

processadas em uma centrífuga de alimentos tipo juicer. O suco obtido foi centrifugado

(10 min, 5 °C, 7.000 ×g) e o sobrenadante foi filtrado por uma camada de sílica gel de 2

cm em um funil de Buchner de 10 cm de diâmetro ligado a um kitassato conectado a

uma trompa de vácuo. O pH do filtrado foi levado a 2 com a adição de HCl

concentrado. A solução resultante foi transferida para um tubo falcon (5 mL) e

adicionaram-se 10 mL de isopropanol (volume final 15 mL, proporção 2:1 v/v). A

solução foi congelada a –72 ºC em um banho de etanol e gelo seco e mantida por quatro

dias a –20 ºC na ausência de luz para garantir a ruptura de todas as células vegetais.

Após esse período, os tubos foram descongelados e, quando atingiram 5 ºC, as soluções

61

foram centrifugadas (15 min, 5 °C, 5.000 ×g). O precipitado foi ressuspendido em

etanol (5 mL) e a suspensão foi submetida a centrifugação (10 min, 5 °C, 5.000 ×g). O

precipitado magenta foi dissolvido em água (5 mL) e a solução foi centrifugada (5 min,

5 °C, 5.000 ×g). O sobrenadante foi separado e liofilizado, resultando em betanina

bruta. Rendimento: 100 mg de betanina a cada 500 ml (aproximadamente 1,5 kg

beterraba) de suco.

Suco de beterraba em pó

Suco de beterraba fresco (1 L) foi seco por aspersão em um equipamento Mini

Spray Dryer B-290 (Buchi) operado com temperatura de entrada do ar: 140 °C,

temperatura de saída do ar: 73 °C e velocidade de aspiração da amostra de

4,5 mL min–1

. O rendimento do processo é de 200 g de pó a cada litro de suco de

beterraba.

Análise cromatográfica

As amostras foram analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência em

condições de fase reversa em um equipamento Shimadzu 20A equipado com um

detector PDA SPD20A e controlado pelo programa LCSolution. Condições

experimentais: coluna C18 Ascentis® (250 × 4,6 mm, Supelco); gradiente de 5-95% de

B em 20 min com fluxo de 1,0 mL min–1

, detecção por absorção em 254 nm e 536 nm.

Solvente A: solução de TFA em água (1% v/v), solvente B: solução de TFA em 60%

v/v acetonitrila/água (1% v/v).119

Espectroscopia de absorção UV-vis

Os espectros de absorção de soluções contendo betalaínas foram adquiridos na

faixa entre 300 e 800 nm em um espectrofotômetro Varian Cary 50 Bio utilizando-se

62

cubetas de acrílico de 4,5 mL de volume total e caminho ótico de 10 mm.

Formulação de emulsões A/O, fase dispersa

Emulsões A/O com fração de volume da fase interna aquosa (ϕAi) entre 10-30%

foram preparadas a partir de 100 g de uma mistura bifásica formada por 70 a 90 g de

uma solução de CR-310 (2-8% m/m) em óleo de soja e 10 a 30 g de uma solução de

fonte de betanina (0,1-1,0% m/m) e D-glicose (1,0% m/m) em tampão fosfato com o

auxílio de um homogeneizador rotor-estator (PolytronPT-3000, KinematicaAG, Littau,

Suíça), operando a 10.000 rpm por 5 min. A mistura bifásica foi mantida em banho de

gelo (0 ºC) durante todo o processo.

Formulação de emulsões A/O/A através de emulsificação em microcanal

As emulsões A/O/A foram formuladas através de emulsificação em microcanal

(microchannel, MC) utilizando-se uma grade de silício de 24 × 24 mm contendo 13.752

microcanais distribuídos em uma área ativa de 10 mm2 (WMS11-1, EP Tech Co., Ltd.,

Hitachi, Japan). A placa tem 300 μm de espessura na região ao redor dos microcanais e

200 μm na área ativa. Cada microcanal tem uma configuração T, sendo constituída por

um microfuro circular vertical com 10 μm de diâmetro e 160 μm de altura posicionado

do centro de um microencaixe horizontal com dimensões 10 μm × 80 μm × 40 μm

(profundidade/largura/altura) (Figura 4). A grade foi degaseificada por 20 min em um

banho ultrassonico (100 kHz, VS-100III, As One Co., Osaka, Japan) preenchido com a

fase contínua e foi posicionada em um suporte de aço de forma que os microencaixes

sejam preenchidos com a fase contínua. A fase dispersa (emulsão A/O) foi inserida no

sistema de microcanais empregando-se uma seringa gas-tight de 10 mL conectada a um

injetor automático com controlador de fluxo (Model 11 Elite; Harvard Apparatus Inc.,

Holliston, USA) operando a 5,0 a 100 mL h–1

. A fase contínua é alimentada de forma a

63

fluir preenchendo o espaço entre a grade e uma lamínula. O sistema é acoplado a um

microscópio ótico invertido (DM IRM, Leica Microsystems, Wetzler, Germany) para

monitoramento da formação da emulsão A/O/A, que é armazenada em um recipiente

acoplado ao módulo.

Determinação do diâmetro médio de Sauter (d3,2) e da distribuição do tamanho

das gotas das emulsões A/O/A

O diâmetro médio de Sauter das gotas (d3,2) e a distribuição do tamanho das

gotas das emulsões A/O/A foram determinados em uma faixa de 40 nm a 2 mm em um

analisador de tamanho de partícula por espalhamento dinâmico de luz (LS13320,

Beckman Coulter, USA).

A largura da distribuição de tamanho das gotas foi relatada como fator de

distribuição relativo ("Relative Span Factor", RSF), definido como:

Eq. 6

onde, d90, d10 e d50 = o diâmetro das gotas em função do volume percentual acumulado.

Acompanhamento da estabilidade física das emulsões A/O/A contendo betanina

As emulsões A/O/A contendo betanina e uma emulsão controle (sem betanina)

foram mantidas a –4 °C, 25 °C e 60 °C na ausência de luz durante 7 dias e monitoradas

durante este período pela aquisição de imagens. No primeiro e no último dia, as

emulsões foram também monitoradas pela aquisição de imagem em microscópio ótico e

submetidas a análise de distribuição de tamanho de partícula por espalhamento

dinâmico de luz. A coloração das emulsões foi monitorada analisando as imagens

obtidas considerando-se o espaço de cor CIELa*b*. Cada imagem das emulsões

envasadas foi registrada com uma fonte de luz posicionada para criar uma área de

64

sombra no frasco. Um recorte de 40 pixels2

foi feito na imagem de forma a incluir a

região de sombra e a região iluminada e a cor média em uma área de 11 × 11 pixels foi

determinada empregando-se o programa ColorGraber. Valores positivos de a* indicam

maior contribuição da cor vermelha enquanto valores positivos de b* indicam

deslocamento para o amarelo.

Análise de dados

Todos os experimentos foram realizados em triplicata (N = 3) e os resultados

reportados como média ± desvio padrão. O gráfico de Bean foi gerado a partir dos

dados brutos das três replicatas utilizando-se o programa BoxPlotR

(http://shiny.chemgrid.org/). Análises de cor foram feitas empregando-se o programa

ColorHexa (http://www.colorhexa.com) e medidas de cor média foram feitas em um

espaço de 11 pixel2 na interface luz/sombra de imagens adquiridas sob fundo preto. As

análises (matemáticas e estaísticas) dos dados foram feitas com os programas Origin

(OriginLab v.2016) e Prism7 (v.7.0c, GraphPad Software, Inc.).

65

Capítulo 2.

Interação de indicaxantina com sal de

flavílio

Modelo para a mútua exclusividade de betalaínas e

antocianinas na natureza

2-1. Introdução

Clorofila, carotenóides a antocianinas podem ser encontrados juntos em uma

mesma planta. Entretanto, antocianinas e betalaínas são pigmentos mutuamente

exclusivos.1, 16, 88, 120

Betalaínas e antocianinas possuem as mesmas funções in vivo e as

razões evolutivas e ecológicas para a mútua exclusividade destes pigmentos em plantas

ainda não foram esclarecidas.121

Os padrões de acumulação destes metabólitos

secundários em relação ao crescimento, diferenciação, divisão celular e proliferação em

plantas são diferentes. Antocianinas acumulam em células da epiderme de pétalas,

frutos, pedúnculo e folhas, enquanto as betalaínas estão presentes todos os tecidos da

beterraba. Ainda, a divisão celular relaciona-se com o acúmulo de betalaínas e

diminuição de antocianinas nos tecidos vegetais.13-14, 121

Desta forma, betalaínas e

antocianinas são excelentes marcadores metabólicos para o estudo da evolução das

Angiospermas e caracterização quimiotaxonomica.121-122

A biossíntese de betalaínas depende da formação de ácido betalâmico a partir da

oxidação de L-tirosina, enquanto antocianinas são obtidas a partir da L-fenilalanina. De

forma simplificada, L-tirosina passa por duas etapas de oxidação enzimática que

66

resultam em 4,5-seco-DOPA que cicliza espontaneamente resultando em ácido

betalâmico (Esquema 7). O acoplamento aldimínico não estereoespecífico envolvendo

ácido betalâmico e aminas ou amino ácidos resulta em betacianinas e betaxantinas.

A superexpressão de DOPA-4,5-dioxigenase, enzima que cataliza a formação de

4,5-seco-DOPA a partir da clivagem oxidativa do anel aromático da L-DOPA, em

culturas celulares de plantas produtoras de antocianinas, i.e., batata (Solanum

tuberosum) e boca-de-leão (Antirrhinum majus), induziu a produção de betalaínas após

suplementação com L-DOPA.123

Tal estudo não explica a mútua exclusividade existente

na natureza, mas sugere que betalaínas e antocianinas podem, em princípio, coexistir em

uma mesma espécie.

Esquema 7: Rota biossíntética da formação de ácido betalâmico, precursor comum das

betacianinas e betaxantinas. TOH: tirosina hidroxilase, DOD: DOPA dioxigenase. Esquema

modificado da referência 124

.

Indicaxantina (BtP) é uma betaxantina amarela natural abundante em frutos do

cactus opuntia que se origina do acoplamento entre o ácido betalâmico e a L-prolina

(Esquema 8).125

As altas atividades antioxidante e anti-inflamatória de indicaxantina em

meio biológico tornaram esta betaxantina um importante micronutriente em

alimentos.35-37

Três horas após a ingestão de alimentos ricos em indicaxantina,

observou-se que lipoproteínas humanas de baixa densidade (LDLs) se tornaram 45%

mais resistentes a oxidação.39

Ainda, a peroxidação lipídica, e subsequente hemólise, de

eritrócitos induzida por hidroperóxido de cumeno foi reduzida na presença de BtP.126

67

Sua propriedade anti-inflamatória foi observada em estudos realizados com ratos com

inflamação das pleuras pulmonares (pleurisia) induzida por λ-carragenina, no qual BtP

foi a responsável pela inibição da ativação de NF-κB, um fator de transcrição chave na

cascata de inflamação.127

Comportamento similar foi observado em estudos realizados

em cultura com células epiteliais humanas da linhagem Caco-2.128

Esquema 8: Indicaxantina, betalaína natural resultante do acoplamento entre ácido betalâmico

e L-prolina.

Antocianinas também apresentam atividade antioxidante e anti-inflamatória em

meio biológico.129-133

A capacidade antioxidante de cianidina e cianidina 3-glicosídeo

frente à peroxidação lipídica mostrou-se superior àquela da vitamina E, antioxidante de

referência.134

A formação de radicais livres através da metabolização de tert-

butilidroperóxido em experimentos realizados em hematócitos primários e fígados de

ratos foi inibida na presença de antocianinas provenientes do hibisco (Hibiscus).135

Indivíduos que apresentam alto nível de colesterol no sangue estão propensos a

desenvolver arteriosclerose, uma doença inflamatória crônica e uma das maiores causas

de morte no mundo. Estudos realizados com tais indivíduos mostraram que a ingestão

de antocianinas diminui os níveis de TNF- e IL-1 no soro humano, citocinas

proinflamatórias associadas à progressão do processo de inflamação.136

68

2-1.1. BtP e MMF: compostos-modelo

2-1.1.1. Efeitos do pH do meio

A purificação de antocianinas a partir de extratos vegetais é difícil e pouco

eficiente, resultando em quantidades mínimas de material que são, muitas vezes,

comercializados como padrões e têm alto valor agregado.23

O estudo das antocianinas e

antocianidinas se beneficiou da síntese de compostos contendo o núcleo flavílio através

do acoplamento entre fenóis e -dicetonas na presença de um fluxo de ácido clorídrico

gasoso em uma reação de condensação.137

Dependendo do seu padrão de substituição,

sais de flavílio sintéticos são mais estáveis do que seus análogos naturais, em especial

frente à hidrólise em meio levemente ácido ou neutro.137

Um exemplo é o cloreto de 4-

metil-7-metóxiflavílio, MMF,138

(Esquema 9), no qual o grupo doador metoxila na

posição 7 estabiliza a carga positiva do cátion flavílio desfavorecendo a sua hidratação

até, pelo menos, pH 5.6

Esquema 9: Estrutura química do 7-metóxi-4-metilflavílio (MMF).

BtP é estável em meio aquoso neutro, sendo degradada rapidamente em meio

muito ácido pH < 2 ou básico pH > 11. Os pKas dos grupos carboxila ligados ao anel

1,2,3,4-tetraidropiridínico da indicaxantina (ou de nenhuma outra betalaína) nunca

foram determinados individualmente, mas foi encontrado através de titulação

potenciométrica um valor de pKa igual a 3,3.139

Embora não se saiba exatamente o

estado de protonação da indicaxantina em função do pH, pode-se inferir que em pH 5,

OO8

9

610

3

2

2'3'

4'

5'

6'

5

1'

4

7

12

11

69

esta betaxantina encontra-se carregada negativamente, possívelmente na forma

dianiônica, o que favoreceria a sua interação com MMF.

2-1.1.2. Propriedades fotofísicas e fotoquímicas

Em solução aquosa, BtP apresenta seu máximo de absorção e emissão em 485

nm e 510 nm, respectivamente. Esses valores sofrem pouca variação em meio alcoólico

(metanol, etanol, TFE, 1-butanol e etilenoglicol) (λabs = 482 – 486 nm e λem = 511 – 518

nm).140

Cloreto de 4-metil-7-metóxiflavílio apresenta seu máximo de absorção em 414

nm em solução aquosa (pH 2)141

e seu máximo de emissão em 480 nm (pH 1) se

sobrepõe com a absorção de BtP.142

Contudo, MMF é dez vezes mais fluorescente em

meio aquoso do que a indicaxantina, i.e., rendimento quântico de fluorescência (ΦFL) do

MMF é 4,9 × 10-2

em pH 5 e da BtP é igual a 5,3 × 10–3

. 140

Estudos de absorção de espécies transientes e o aumento do valor de ΦFL e do

tempo de vida do estado excitado (τ) da BtP em solventes viscosos sugerem que a

desativação do seu estado S1 ocorre, principalmente, via processos não radiativos.140

MMF apresenta um tempo de vida do estado singlete excitado em água pH 5

relativamente longo (τágua, pH 5 = 4,7 ns).6 Indicaxantina apresenta dois tempos de vida de

fluorescência atribuídos aos dois isômeros presentes na solução, sendo eles τfl = 4,8 e 27

ps em água (η = 0,89 cP) e τfl = 14,1 e 161 ps em etilenoglicol (η = 16,1 cP). Essa

dependência com a variação da viscosidade indica que o processo de desativação do

estado excitado S1 ocorre com mudança na geometria da molécula. Provavelmente, o

aumento da viscosidade dificulta a rotação molecular, desacelerando os decaimentos

não radiativos. Estudos de absorção transiente mostraram recuperação total de

indicaxantina para o estado fundamental (S1 → S0), indicando que fotoprodutos e o

estado excitado triplete não são formados com rendimento quântico significativo. Esses

70

fatos corroboram com a hipótese de betaxantinas serem moléculas fotoprotetoras in

vivo.140

Por apresentar altos valores de rendimento quântico de fluorescência e tempo de

vida de fluorescência, MMF vem sendo bastante utilizado em estudos de efeito da

copigmentação na fotofísica de antocianinas.6 Em meio aquoso, a fluorescência de

MMF é suprimida por copigmentos convencionais, e.g., ácido ferúlico, quercetina e

ácido protocatecuico (ácido 3,4-dihidroxibenzóico, PCA). Esta supressão é

predominantemente estática, pois ocorre a formação de um complexo entre o MMF e o

copigmento no estado fundamental. Entretanto, observa-se também supressão dinâmica

(controlada pela difusão) da fluorescência do MMF não complexado.6 A constante de

formação do complexo MMF-copigmento e, portanto, a energia de Gibbs de

complexação se correlacionam linearmente com o potencial de ionização do

copigmento, sugerindo a formação de complexos de transferência de carga no qual

MMF atua como aceptor de elétrons e os copigmentos como doadores de elétrons. A

alta constante cinética de supressão estática (ks ≥ 1011

s-1

) nos experimentos realizados

com PCA sugere que a excitação do complexo de transferência de carga MMF-PCA

resulta no processo de transferência de elétrons do copigmento para o MMF.138

No

estado S1, MMF é um ótimo aceptor de elétrons, apresentando potencial de redução em

água igual a –49 mV vs. NHE,143

sendo capaz de oxidar a maioria dos polifénóis que

atuam como copigmento.32, 138

71

2-2. Objetivos

Determinar se existe interação química entre BtP e MMF como forma de inferir

um fenômeno similar à copigmentação entre antocianinas e betalaínas.

2-2.1 Objetivos específicos

i. Sintetizar, purificar e caracterizar indicaxantina (BtP) e cloreto de 7-metóxi-

4-metilflavílio (MMF);

ii. Determinar as propriedades fotofísicas de BtP e MMF em água (pH 5),

solução de HCl em água pH 5/etanol 1:1 v/v e etanol absoluto ≥99.8%

(≤0.2% de água);

iii. Investigar a possível interação entre BtP e MMF por espectrofotometria de

absorção, supressão de fluorescência e espectrometria de ressonância nuclear

magnética de hidrogênio.

72


73

2-3. Resultados

Indicaxantina (BtP) e cloreto de 7-metóxi-4-metilflavílio (MMF) foram os

compostos-modelo escolhidos para o estudo visto que contém as porções características

de betalaínas e antocianinas e podem ser preparados convenientemente.

2-3.1. Preparações

2-3.1.1. Indicaxantina

Frutos da opuntia contém cerca de 8 mg de BtP a cada 100 g da polpa.84

A baixa

concentração desta betalaína no fruto e a oferta escassa dessa espécie de cactus no

Brasil tornam pouco viável a extração deste produto natural. Assim, para esse trabalho,

BtP foi semissintetizada através do acoplamento aldimínico entre ácido betalâmico

(HBt) e L-prolina em meio aquoso (Esquema 10).

Esquema 10: Acoplamento aldimínico entre ácido betalâmico em meio aquoso e L-prolina.

NH

N CO2H

HO2C CO2H

(S)(S)

NH

O

+H4N–O2C CO2

–NH4+

NH

(S)(S)

CO2–NH4

+

H

NH

N CO2–NH4

+

+H4N–O2C CO2

–NH4+

HO

+ 3NH4Cl + H2O

+

HCl

Cl–

2

78

10

11

14

Ácido betalâmico (HBt)sal de amônio

L-Prolinasal de amônio

Indicaxantina (BtP)sal de cloreto

74

O ácido betalâmico é o produto da hidrólise alcalina das betalaínas presentes no

suco de beterraba. O suco hidrolisado é acidulado lentamente até pH 2 com ácido

clorídrico concentrado, mantendo-se a temperatura inferior a 5 ºC, e o HBt em sua

forma protonada (neutra) é extraído com acetato de etila. Em seguida, HBt é transferido

para água, o pH é levado a 11 e L-prolina é adicionada em excesso. Rapidamente a cor

da solução muda de amarelo brilhante para um tom alaranjado, característico da

indicaxantina. O pH do meio é levado a 5 e a BtP é submetida a pré-purificação por

HPLC em escala semi-preparativa em condições de fase reversa. As frações contendo

BtP são reunidas e submetidas a purificação por cromatografia de exclusão molecular

(filtração em gel) com Sephadex LH-20 como fase estacionária e água como eluente. O

produto foi caracterizado por espectrofotometria UV-vis, cromatografia líquida de alta

eficiência (HPLC), espectrometria de massas por injeção direta e espectrometria de

ressonância magnética nuclear de 1H.

O cromatograma de BtP apresenta apenas um pico cromatográfico (Anexo 9),

sugerindo a presença de apenas uma espécie na amostra, fato confirmado pelos

experimentos de espectrometria de massas e de RMN. Na caracterização por

espectrometria de massas por injeção direta com ionização por eletrospray em modo

positivo (MS(ESI+)), o íon quasi-molecular [M+H]+ encontrado apresenta a relação

massa carga (m/z) esperada de 309,16 (Anexo 10). O espectro de RMN de 1H de BtP em

D2O é apresentado no Anexo 11. Nas ampliações das regiões de deslocamento químico

entre 8,6 e 8,0 ppm e entre 6,5 e 5,2 ppm (Figura 14), pode-se observar os sinais

correspondentes a quatro isômeros, sendo dois deles majoritários (identificados em rosa

e verde). De acordo com estudos de espectroscopia de RMN de 1H e

13C, os

estereoisômeros E,E, Z,E, Z,Z e E,E da BtP coexistem em solução aquosa, sendo E,E e

75

Z,E os isômeros majoritários (Esquema 11).144

Os sinais mais importantes para a

caracterização da BtP (Esquema 11) são os átomos de hidrogênio 2 (quiral, porção

iminoprolina), 7 (+N=CH), 8 (

+N=CH–CH), 10 (a e b, diastereotópicos), 11 (quiral,

porção 1,2,3,4-tetraidropiridínica) e 14 (Csp2, porção 1,2,3,4-tetraidropiridínica).

Esquema 11: Quatro isômeros geométricos da BtP considerando a configuração S do carbono

assimétrico do anel 1,2,3,4-tetrahidropiridínico.

Na ampliação da região do espectro de deslocamento químico entre 4,7 e 3,5

ppm, o hidrogênio H-2 da porção da molécula correspondente a L-prolina aparece como

um duplo dubleto. É possível observar os sinais correspondentes aos dois isômeros

majoritários (identificados em rosa e verde) e um sinal de menor intensidade referente,

provavelmente, aos isômeros minoritários. Experimentos de espectroscopia de

correlação homonuclear (COSY) mostram seu acoplamento vicinal com os hidrogênios

H-3 a/b (Figura 15). Os deslocamentos químicos e o valor das constantes de

acoplamento do sistema H-2/H-3 (4,52 ppm, 3J2,3 = 3,9; 8,3 Hz para o isômero A e 4,37

ppm, 3

J2,3 = 4,8; 8,7 Hz para o isômero B) são similares aos relatados na literatura (4,63

ppm, 3J2,3 = 3,5; 8,4 Hz para o isômero A e 4,53 ppm,

3J2,3 = 4,3; 8,6 Hz para o isômero

B) 144

Os hidrogênios do sistema 1,7-diazaheptametínico, H-7 e H-8, aparecem como

dubletos. Neste caso, é possível observar os sinais correspondentes aos dois isômeros

majoritários (identificados em rosa e verde) e aos dois isômeros minoritários

(S)(S)

NH

(E)H

CO2HHO2C

N

(S)(S)

CO2H

(Z)H

H

(S)(S)

NH

(E)H

CO2HHO2C

N(S)(S)HO2C

(E)H

H

(S)(S)

NH

(Z)H

CO2HHO2C

N(S)(S)HO2C

(Z)H

H

(S)(S)

NH

(Z)H

CO2HHO2C

N

(S)(S)

CO2H

(E)H

H

(Z,E)-BtP, (B)(E,E)-BtP, (A) (Z,Z)-BtP, (D)(E,Z)-BtP, (C)

76

(identificados em azul e laranja). Seu acoplamento vicinal pode ser observado no

espectro de 1H-

1H COSY (

Figura 16) e apresenta valores de constante de acoplamento (3J7,8 = 12,3 Hz (isômero

A), 3J7,8 = 12,4 Hz (isômero B),

3J7,8 = 12,1 Hz (isômero C) e

3J7,8 = 12,0 Hz (isômero

D)) similares aos relatados na literatura (3J7,8 = 12,2 Hz (isômero A) e

3J7,8 = 12,3 H

(isômero B), 3J7,8 = 12,0 Hz (isômero C) e

3J7,8 = 12,4 Hz (isômero D)).


ppm, o H-14 aparece como um singleto e é possível observar os sinais correspondentes

aos 4 isômeros presentes na amostra. Os sinais correspondentes aos hidrogênios H-10

a/b e H-11 são observados no espectro, porém apresentam sobreposição dos sinais dos

isômeros. Experimentos de espectroscopia de correlação homonuclear (COSY) mostram

o acoplamento entre seus spins, mas a falta de resolução do sinal no espectro de 1H

impossibilita a determinação das constantes de acoplamento. Através dos experimentos

de espectroscopia de correlação homonuclear (COSY) ainda é possível observar o

acoplamento entre os hidrogênios H-5 a/b e H-4 a/b da porção da molécula

correspondente a L-prolina (Figura 15).

77

Figura 14: Ampliação do espectro de RMN de 1H de BtP em D2O, 500 MHz. (A) Região do

espectro de deslocamento químico entre 8,6 e 8,0 ppm. (B) Região do espectro de

deslocamento químico entre 6,5 e 5,2 ppm. (C) Região do espectro de deslocamento químico

entre 4,7 e 3,5 ppm. (D) Região do espectro de deslocamento químico entre 3,3 e 2,0 ppm. Os

hidrogênios apresentados em verde e rosa representam os isômeros majoritários A e B,

respectivamente. Os hidrogênios apresentados em azul e laranja representam os isômeros

minoritários C e D, respectivamente. Os hidrogênios indicados em preto apresentam

sobreposição dos sinais dos isômeros.

78

Figura 15: Ampliação do espectro de 1H-

1H COSY de BtP na região de 4,55 – 1,85 ppm,

mostrando o acoplamento entre os hidrogênios H-2 e H-3 a/b, H-10 a/b e H-11 e H-4 a/b e H-5

a/b da indicaxantina.

Figura 16: Ampliação do espectro de 1H-

1H COSY de BtP na região de 8,55 – 5,15 ppm,

mostrando o acoplamento entre os hidrogênios H-7 e H-8 da indicaxantina.

79

2-3.1.2. Cloreto de 7-metóxi-4-metilflavílio

Cloreto de 7-metóxi-4-metilflavílio (MMF) foi obtido com rendimento de 53%

através da reação de condensação entre 3-metóxifenol e benzoilacetona em ácido

acético glacial saturado com HCl gasoso (Esquema 12). O HCl gasoso foi gerado pela

reação entre cloreto de cálcio e ácido sulfúrico e foi borbulhado durante 4 horas.

Esquema 12: Síntese do cloreto de 7-metóxi-4-metilflavílio (MMF).

O sal de flavílio foi precipitado com a adição de éter etílico gelado à mistura de

reação. O precipitado foi filtrado a vácuo, lavado com éter etílico gelado, colocado em

um dessecador aonde o resíduo de éter foi evaporado e o sólido restante foi mantido em

sob vácuo durante 24 h na presença de um agente secante para retirar traços de água. A

amostra obtida foi caracterizada por espectrometria de massas por injeção direta e

espectrometria de ressonância magnética nuclear de 1H. Na caracterização por


positivo (MS(ESI+)), o íon quasi-molecular [M+H]+ encontrado apresenta relação

massa carga (m/z) esperada de 251 (Anexo 13).

Os espectros de RMN de 1H de MMF em C2D5OD (A), CD3OD (B) e D2O (C)

são apresentados nos Anexos 14, 15 e 16. Os sinais da molécula estão concentrados na

região de campo baixo devido sua aromaticidade. Na ampliação da região do espectro

de deslocamento químico entre 8,8 e 8,3 ppm (Figura 17) encontram-se os sinais

correspondentes aos hidrogênios H-3 (singleto), H-5 (dubleto), H-2’ e H-6’ (dubleto).

80

Em A e B os sinais apresentam-se bem definidos, mas em C o singleto correspondente

ao H-3 aparece sobreposto ao dubleto dos hidrogênios H-2’ e H-6’. Nota-se que o

aumento da polaridade do solvente deuterado aumenta a blindagem os átomos de H, i.e.,

desloca os sinais dos 1H na direção da região de campo alto do espectro, provavelmente

devido à estabilização da carga positiva do oxigênio via ligação de hidrogênio. O H-3

apresenta o maior deslocamento, 0,3 ppm de A para C.


ppm (Figura 18) encontram-se os sinais correspondentes aos hidrogênios H-8 (dubleto),

H-4’ (tripleto), H-3’ e H-5’ (tripleto) e H-6 (duplo dubleto). Nessa região, os sinais não

apresentam uma grande mudança nos valores de deslocamento químico com a variação

do solvente, com exceção do hidrogênio H-8 que apresenta um deslocamente de 0,23

ppm na direção da região de campo alto do espectro com o aumento da polaridade.

Os valores das constantes de acoplamento entre os hidrogênios das moléculas

também foram determinados. O hidrogênio H-6 (3J5,6 = 9,3 Hz (A, B, C) e

4J6,8 = 2,5 Hz

(A e C) e 2,2 Hz (B)) apresenta uma forte interação com H-5 (3J5,6 = 9,3 Hz (A, B, C)) e

uma pequena interação com o hidrogênio H-8 (4J6,8 = 2,4 Hz (A) e 1,9 Hz (B)). O

hidrogênio H-4’ (3J4’,3’ =

3J4’,5’ = 7,5 Hz (A, B, C)) apresenta um acoplamento vicinal

com os hidrogênios H-3’ e H-5’(3J4’,3’ =

3J4’,5’ = 7,9 Hz (A) e 7,8 Hz (B)). H-3’ e H-5’

também apresentam acoplamento vicinal com os hidrogênios H-2’ e H-5’ (3J2’,3’ =

3J5’,6’

= 7,4 Hz (A) e 7,8 Hz (B)).

Na região blindada do espectro é possível observar um singleto (4,19 ppm (A e

B) e 4,15 ppm (C)) correspondente aos hidrogênios do grupo metóxi ligado ao anel A

do flavílio (Anexos 14, 15 e 16). O sinal correspondente aos hidrogênios do grupo

metila ligado ao anel C da molécula não são observados. Provavelmente, devido à

81

acidez desses prótons, ocorre a troca dos átomos de H por átomos de D e não há geração

de sinal.

Figura 17: Ampliação do espectro de RMN de 1H de cloreto de 7-metóxi-4-metilflavílio (MMF)

em C2D5OD, CD3OD e D2O, 500 MHz. Região do espectro de deslocamento químico entre 8,8

e 8,3 ppm.

Figura 18: Ampliação do espectro de RMN de 1H de cloreto de 7-metóxi-4-metilflavílio (MMF)

em C2D5OD, CD3OD e D2O, 500 MHz. Região do espectro de deslocamento químico entre 8,0

e 7,55 ppm.

82

2-3.2. Caracterização fotofísica de BtP e MMF

Espectros de absorção, excitação e emissão de BtP e MMF foram adquiridos em

água (pH 5). O ajuste do pH foi realizado com solução de HCl 1,0 mol L–1

.

Indicaxantina apresenta seu máximo de absorção em 485 nm com coeficiente de

absorção molar de 48.000 L mol–1

cm–1

.145

Sua excitação entre 400 e 500 nm resulta em

emissão de fluorescência verde com máximo em 517 nm, como se pode observar pelos

espectros de excitação e emissão na Figura 19. MMF apresenta seu máximo de absorção

e emissão em 415 e 474 nm, respectivamente. O rendimento quântico de BtP e MMF

também foi determinado em meio aquoso (pH 5), sendo eles 3,8 × 10–3

e 4,9 × 10–2

,

respectivamente.

Figura 19: Espectro de absorção (linha preta), emissão (λexc = 370 nm) (linha vermelha) e

excitação (linha azul tracejada) de indicaxantina (BtP) e cloreto de 7-metóxi-4-metilflavílio

(MMF) em água (pH 5).

2-3.3. Estudo da interação de betalaínas com sais de flavílio

A interação entre betalaínas e sais de flavílio foi investigada através de ensaios

de espectrofotometria de absorção e de supressão de fluorescência (método de Stern-

Volmer) entre BtP e MMF em solução aquosa (pH 5). Supressão de fluorescência se

refere a qualquer processo que diminua a fluorescência de uma determinada molécula.

Através da análise dos espectros de absorção e emissão de MMF na ausência e na

83

presença de BtP e da construção de um gráfico contendo a relação da intensidade de

fluorescência de MMF na ausência (F0) e na presença (F) de BtP (F0/F) no eixo y e a

concentração de BtP no eixo x, é possível determinar se BtP está suprimindo a

fluorescência de MMF. Foram preparadas soluções aquosas de MMF e BtP em pH 5

nas concentrações 10–5

mol L-1

e 10–6

mol L–1

, que serão chamadas de concentrada e

diluida, respectivamente. O ajuste do pH foi realizado com solução de HCl 1,0 mol L–1

.

Os experimentos foram realizados nessas duas concentrações para observar o efeito da

concentração de BtP e MMF no meio sob a interação. O pH 5 foi escolhido pois tanto a

BtP quanto MMF encontram-se estáveis neste valor de pH e também porque em pH 5, a

espécie de betalaína predominante no meio possui as 3 porções carboxílicas

desprotonadas, possuindo assim cargas negativas. A presença de grupos aniônicos

favorece a interação entre BtP e MMF, uma vez que MMF é um cátion. Neste

experimento, a concentração de MMF (3,6 × 10–5

mol L-1

ou 3,6 × 10–6

mol L-1

) foi

mantida fixa e a concentração de BtP foi variada entre 0,1 e 1,0 equiv., sendo então o

MMF o fluoróforo e BtP a molécula supressora de fluorescência. Nos ensaios de

fluorescência acompanhou-se a emissão de MMF em 474 nm e utilizou-se um λexc =

370 nm.

Na Figura 20A é possível observar um pequeno deslocamento batocrômico da

banda de absorção do MMF com o aumento da concentração de indicaxantina no meio.

Através da análise da segunda derivada dos espectros de absorção (Anexo 17) pode-se

inferir que esse deslocamento é apenas um efeito aditivo dos espectros de BtP e MMF.

Nos experimentos realizados com MMF concentrado (10–5

mol L-1

), a intensidade de

fluorescência do MMF diminui (56%) com o aumento da concentração de BtP e a

absorção da BtP provoca a supressão de parte da banda de emissão de BtP resultando

84

em uma aparente nova banda de emissão é observada em aproximadamente 510 nm.

Quando a concentração da solução é 10–6

mol L–1

, a diminuição da intensidade de

fluorescência do MMF com o aumento da concentração de BtP passa a ser 10% e não é

observada supressão (Figura 20B).

No gráfico de Stern Volmer para as duas concentrações de MMF e BtP podemos

observar comportamentos diferentes. Para o sistema concentrado, observa-se uma

dependência linear entre F0/F e a concentração do supressor com coeficiente linear

próximo a 1, como esperado considerando-se a equação de Stern-Volmer, F0/F = 1 +

KSV[Q], e KSV igual a (0,40 ± 0,03) × 105 mol

-1 L (Figura 20C). Para a solução diluída,

não se observa o comportamento esperado e o efeito do sequestrador, se existe, é sutil e

complexo.

85

Figura 20: Espectros de absorção (A) e emissão (λexc = 370 nm) (B) de solução aquosa de

MMF em pH 5 na ausência e na presença de diferentes concentrações de BtP variando entre

0,1 e 1 equiv. Excitação em 370 nm. Os gráficos a esquerda são referentes aos experimentos

realizados com as soluções a 10-5

mol L-1

e os gráficos a direita são referentes aos

experimentos realizados com as soluções a 10-6

mol L-1

(C) Gráficos de Stern-Volmer

construídos a partir dos dados da segunda derivada do espectro de emissão (Anexo 17). As

linhas verdes representam as bandas de confiança com 95% de nível de confiança.

2-3.4. Efeito do solvente na interação entre BtP e MMF

Com o objetivo de verificar a influência da polaridade do meio sobre a interação

entre MMF e BtP, decidiu-se prosseguir com os estudos em outros meios: solução de

HCl em água pH 5/etanol 1:1 v/v e etanol absoluto ≥99.8% (≤0.2% de água). Antes de

86

prosseguirmos com os experimentos de supressão foi realizada a caracterização

fotofísica de BtP e MMF nesses meios.

2-3.4.1. Caracterização fotofísica de BtP e MMF

Em solução de HCl em água pH 5/etanol 1:1 v/v e em etanol absoluto ≥99.8%

(≤0.2% de água), BtP apresenta uma mudança no perfil de seu espectro de absorção em

relação a solução aquosa (pH 5). Sua banda de absorção passa a ser mais estreita e a

intensidade do ombro em comprimentos de onda menores diminui. O perfil de emissão

de BtP é semelhante nos dois meios, apresentando um deslocamento hipsocrômico da

banda de emissão partindo da solução aquosa (pH 5) em direção ao etanol absoluto

≥99.8% (≤0.2% de água) (Figura 21).

MMF apresenta um sutil deslocamento batocrômico de sua banda de absorção

em solução de HCl em água pH 5/etanol 1:1 v/v e etanol absoluto ≥99.8% (≤0.2% de

água) em relação ao meio aquoso (pH 5) e seu máximo de absorção é deslocado para

420 nm e 422 nm, respectivamente. Além disso, em ambos os casos, podemos observar

o aparecimento de uma banda em torno de 340 nm, a qual se apresenta mais definida em

etanol absoluto (Figura 21). O surgimento dessa banda sugere que a fração molar de

água presente no meio causa alguma mudança na molécula de MMF. Para constatar

essa hipótese, foram realizados estudos com etanol anidro contendo diferentes frações

molares de água e em diferentes valores de pH.

Em etanol anidro, MMF apresenta um perfil de absorção semelhante à solução

de água/etanol absoluto ≥99.8% 1:1 v/v (pH 5) e seu máximo de absorção encontra-se

em 421 nm (Figura 22A). O efeito da fração molar de água (χW

) na mistura

hidroalcoólica sobre os perfis de absorção e fluorescência de MMF foi estudado

adicionando-se água ao etanol anidro até que o valor de χW

atingisse 0,4. Conforme

87

água é adicionada ao meio, a intensidade da banda de absorção de MMF em 421 nm

diminui e a banda em 340 nm aparece. Ao atingir uma determinada fração molar de

água no meio (H2O

= 0,25), a adição de água não causa mais alterações no espectro de

absorção. Quando o valor do pH do meio é ajustado para 5, há um pequeno aumento na

intensidade da banda de absorção. Finalmente, em pH 2, a banda de absorção

característica do MMF volta a apresentar uma alta intensidade, maior do que a

observada no início do experimento (Figura 22A). MMF apresenta seu máximo de

emissão em 477 nm e o aumento da H2O

causa uma diminuição na intensidade em sua

banda de emissão, o que corrobora com a diminuição da intensidade da banda de

absorção. Ao ajustarmos o pH do meio para 5, observa-se um aumento da intensidade

de emissão e um deslocamento hipsocrômico da banda de emissão. Em pH 2, o valor da

intensidade de emissão dobra e passa a ser 200 unidades maior que a intensidade de

emissão em etanol anidro (Figura 22B).

88

Figura 21: Espectro de absorção (linha preta), emissão (λexc = 370 nm) (linha vermelha) e

excitação (linha azul tracejada) de indicaxantina (BtP) e cloreto de 7-metóxi-4-metilflavílio

(MMF) em solução de água/etanol absoluto ≥99.8% 1:1 v/v (pH 5) (superiores) e etanol

absoluto ≥99.8% (≤0.2% de água) (inferiores).

Figura 22: Espectros de absorção (A) e emissão (λexc = 370 nm) (B) de MMF em etanol anidro

com diferentes frações molares de água (H2O) e diferentes valores de pH.

89

Nos experimentos realizados em etanol anidro, as cubetas utilizadas foram

tampadas com septo de borracha para evitar a entrada de água na solução. As bandas de

absorção presentes nos espectros de MMF na região do UV próximo a 300 nm

correspondem a substâncias do septo solúveis em etanol. O aumento do número de

inversões da cubeta para incorporar água ou ácido na solução resulta em um aumento na

intensidade destas bandas, demonstrando que quanto maior o contato do septo com

etanol, maior a quantidade de substâncias do septo presentes em solução (Anexo 18).

2-3.4.2. Supressão de fluorescência de MMF por BtP

Como foi observado um maior efeito de supressão utilizando-se concentrações

de BtP e MMF na ordem de 10-5

mol L-1

, esta foi a concentração escolhida para a

realização dos experimentos. Em relação à variação da concentração de BtP, optou-se

por aumentar o intervalo estudado (0,1-2 equivalentes de BtP – vide Parte

Experimental). Os meios escolhidos para o estudo foram água (pH 5), solução de HCl

em água pH 5/etanol 1:1 v/v e etanol absoluto ≥99.8% (≤0.2% de água).

Nesta parte do trabalho, além dos estudos de espectrofotometria de absorção e

de supressão de fluorescência, também foram registrados os tempos de vida de

fluorescência de MMF para os experimentos realizados em água (pH 5) e em solução de

HCl em água pH 5/etanol 1:1 v/v. Não foi possível obter resultados reprodutíveis com

etanol. Os decaimentos do tempo de vida de emissão de MMF na ausência e na

presença de BtP e os parâmetros dos ajustes monoexponenciais obtidos encontram-se

nos Anexos 21, 22 e 23. Nos ensaios de fluorescência foi acompanhada a emissão de

MMF em 474 nm e foi utilizado um λexc = 370 nm.

Na caracterização fotofísica de MMF observa-se que a fração molar de água

presente no etanol interfere em seus espectros de absorção e emissão. Então, antes de

90

iniciarmos os experimentos etanol absoluto ≥99.8% (≤0.2% de água), uma condição do

experimento de supressão de fluorescência de MMF por BtP (0,5 equivalente de BtP em

relação ao MMF) também foi estudada em etanol anidro. Esse experimento foi realizado

para verificar se os resultados obtidos com etanol absoluto ≥99.8% (≤0.2% de água)

seriam os mesmos obtidos com etanol anidro. Nestas condições concentradas (10–5

mol

L–1

) a adição de 0,5 equiv de BtP resulta em supressão e a quantidade de betalaína é a

menor possível.

Na Figura 23 podemos observar o desaparecimento da banda de absorção de

MMF quando 0,5 equivalente de indicaxantina é adicionado ao meio. Isto ocorre tanto

em etanol absoluto quanto em etanol anidro. A emissão de MMF segue o mesmo

comportamento, apresentando uma diminuição brusca em sua emissão na presença de

BtP. Como os resultados obtidos em etanol anidro apresentam-se semelhantes aos

obtidos em etanol absoluto ≥99.8% (≤0.2% de água), prosseguiu-se com os

experimentos utilizando-se etanol absoluto ≥99.8% (≤0.2% de água).

91

Figura 23: Espectros de absorção e emissão (λexc = 370 nm) de MMF na ausência e na

presença de 0,5 equivalente de BtP em etanol anidro de etanol absoluto ≥99.8% (≤0.2% de

água).

Na Figura 24A é possível observar um pequeno deslocamento batocrômico da

banda de absorção do MMF com o aumento da concentração de indicaxantina no meio

nos experimentos realizados em água (pH 5) e em solução de água/etanol absoluto

≥99.8% 1:1 v/v (pH 5). Através da análise da segunda derivada dos espectros de

absorção pode-se inferir que esse deslocamento é apenas um efeito aditivo dos espectros

de BtP e MMF. Os gráficos da segunda derivada encontram-se no Anexo 20. Em etanol

esse comportamento sofre uma mudança e podemos observar o desaparecimento da

banda de absorção correspondente ao MMF a partir de 0,5 equivalentes de BtP no meio.

Nos espectros de emissão de MMF em água (pH 5) e em solução de água/etanol

absoluto ≥99.8% 1:1 v/v (pH5) observa-se a diminuição da intensidade de fluorescência

92

de MMF conforme aumentamos a concentração de BtP no meio. Além disso, uma nova

banda passa a aparecer em aproximadamente 510 nm (Figura 24B). Experimentos

controle realizados apenas com BtP nas mesmas concentrações desse estudo mostram

que BtP apresenta uma banda de emissão nessa mesma região, porém com intensidade

de fluorescência de cem a trezentas vezes menor (Anexo 19). Nota-se ainda que a

diminuição da intensidade de emissão é maior em solução de água/etanol absoluto

≥99.8% 1:1 v/v (pH5). Assim como na absorção, em etanol é possível observar a

ausência de emissão a partir de 0,5 equivalentes de BtP no meio. A banda de emissão

em aproximadamente 510 nm ainda aparece, mas com intensidades de fluorescência

bastante baixas (Figura 24B). Experimentos controle realizados apenas com BtP nas

mesmas concentrações desse estudo mostram que BtP apresenta uma banda de emissão

nessa mesma região com valores de intensidade de fluorescência bastante similares

(Anexo 19).

Foi observada a supressão de fluorescência de MMF por BtP em todos os meios,

mas o mecanismo pelo qual ela ocorre parece ser dependente do meio em que as

espécies se encontram. Nos experimentos realizados em água (pH 5) é possível observar

duas regiões com comportamento distinto no gráfico de Stern-Volmer. Esta mudança

ocorre a partir do ponto em que a concentração de BtP no meio é igual a de MMF. A

relação entre o tempo de vida de fluorescência do MMF na ausência (τ0) e na presença

(τ) de BtP apresenta-se independente da concentração de BtP, mantendo-se constante

em todas as concentrações de BtP (Figura 24C). Em solução de solução de HCl aquoso

pH 5/etanol 1:1 v/v e em etanol absoluto ≥99.8% (≤0.2% de água) o sistema apresenta

um comportamento diferente. O gráfico de Stern-Volmer apresenta uma curva com a

concavidade voltada para cima, indicando a ocorrência de supressão da fluorescência de

93

MMF por dois mecanismos, estático e dinâmico. Assim como nos experimentos

realizados em água, o tempo de vida de fluorescência de MMF mostra-se independente

da concentração de BtP no meio (Figura 24C) em solução de HCl aquoso pH 5/etanol

1:1 v/v.

Figura 24: Espectros de absorção (A) e emissão (B) (λexc = 370 nm) de MMF

(3,6 × 10–5

mol L-1

) em água (pH 5), solução de HCl aquoso pH 5/etanol 1:1 v/v e etanol

absoluto ≥99.8% (≤0.2% de água) em dependência da concentração de BtP no meio. (C)

Gráficos de Stern Volmer (F0/F, quadrado preto) e tempo de vida de fluorescência (0/ , círculo

vermelho) para a supressão de MMF em água (pH 5), solução de HCl aquoso pH 5/etanol 1:1

v/v e etanol absoluto ≥99.8% (≤0.2% de água) em dependência da concentração de BtP no

meio. As intensidades de fluorescência (F e F0) utilizadas para a construção do gráfico de Stern

Volmer foram obtidas através da segunda derivada dos gráficos de emissão para os

experimentos realizados em água (pH 5) e em solução de HCl aquoso pH 5/etanol 1:1 v/v. Os

gráficos da segunda derivada são apresentados no Anexo 20. Esses experimentos foram feitos

em quintuplicata (N = 5).

94

2-3.4.3. Tentativa de caracterização do complexo BtP-MMF por espectroscopia de RMN

Estudos de RMN de 1H e NOESY 2D foram realizados para verificar a possível

interação entre indicaxantina e MMF em meio aquoso (pH 5). Primeiramente, 0,5 mg de

MMF (1,45 × 10–7

mol) foi solubilizado em 600 µL de D2O (pD 5) e um espectro de 1H

foi registrado em um equipamento 500 MHz. O pD foi ajustado para 5 com a adição de

DCl. Solução concentrada de BtP (2,87 × 10–3

mol L-1

) em D2O (pD 5) foi adicionada

ao tubo em diferentes proporções até atingir 1 equivalente em mol em relação ao MMF

(Tabela 10). Para cada concentração de BtP foi registrado um espectro de 1H. Ao atingir

1 equivalente de BtP em relação ao MMF também foi registrado um espectro

bidimensional NOESY.

Comparando-se os espectros de MMF na ausência e na presença de BtP (0,1; 0,5

e 1 equivalente) é possível observar o deslocamento dos sinais referentes aos

hidrogênios H-7 e H-8 da indicaxantina e hidrogênio H-5 do MMF, ambos para região

de campo alto. Nos experimentos de NOESY 2D é possível observar uma pequena

correlação entre H-8 da BtP e H-3, H-2’, H6’ do MMF, assim como entre H-11 da BtP e

o sinal correspondente a metoxila do MMF. O espectro de NOESY 2D completo

encontra-se no Anexo 24.

95

Figura 25: Comparação dos deslocamentos químicos (δ) de 1H de MMF em D2O (pD 5) na

ausência de BtP e na presença de 0,1, 0,15 e 1 equivalente de BtP na região do espectro de

deslocamento químico entre 8,36 e 8,26 ppm.

Figura 26: Comparação dos deslocamentos químicos (δ) de 1H de BtP em D2O (pD 5) na

presença de MMF na região do espectro de deslocamento químico entre 6,1 e 5,5 ppm.

Destaque para o deslocamento do H-8 da BtP.

96

Figura 27: Comparação dos deslocamentos químicos (δ) de 1H de BtP em D2O (pD 5) na

presença de MMF na região do espectro de deslocamento químico entre 8,2 e 8,0 ppm.

Destaque para o deslocamento do H-7 da BtP.

Figura 28: Ampliação do espectro de NOESY 2D de MMF na presença de 1 equivalente de BtP

em D2O (pD = 5), 500 MHz. Acoplamento dos hidrogênios H-3, H-2’ e H-6’ do MMF (δ = 8,33

ppm) com o H-7 da BtP (δ = 8,15 ppm).

97

Figura 29: Ampliação do espectro de NOESY 2D de MMF na presença de 1 equivalente de BtP

em D2O (pD = 5), 500 MHz. Acoplamento do grupo metoxila do MMF (δ = 4,07 ppm) com o H-

11 da BtP (δ = 4,20 ppm).

2-4. Discussão

2-4.1. Caracterização estrutural de indicaxantina

Através da interpretação dos espectros de RMN de 1H e

1H-

1H COSY e da

comparação dos dados experimentais com dados da literatura, foi possível realizar a

caracterização dos 2 isômeros majoritátios (A = isômero 1E, 8E e B = isômero 1Z, 8E) e

a caracterização parcial dos 2 isômeros minoritários (C = isômero 1E, 8Z e D = isômero

1Z, 8Z) presentes na solução aquosa de indicaxantina (Tabela 3). Através dos valores

das integrais dos sinais do espectro foi possível determinar a proporção entre os

isômeros presentes na amostra, sendo ela 46 % de A, 40% de B, 5% de C e 9% de D.

98

Tabela 3: Atribuição dos sinais obtidos nos experimentos de RMN de 1H de BtP em D2O, 500

MHz.(s: singleto, d: dubleto, dd: duplo dupleto, m: multipleto, *: sobreposição de sinais).

Indicaxantina Posição do 1H δH (ppm)

7 A 8,10 (d, 3J7,8 = 12,3 Hz, 1H)

7 B 8,21 (d, 3J7,8 = 12,4 Hz, 1H)

8 A 5,98 (d, 3J7,8 = 12,3 Hz, 1H)

8 B 5,68 (d, 3J7,8 = 12,4 Hz, 1H)

2 A 4,52 (dd, 3J2,3 = 3,9; 8,3 Hz, 1H)

2 B 4,37 (dd, 3J2,3 = 4,8; 8,7 Hz, 1H)

14A 6,13 (s, 1H)

14 B 6,08 (s, 1H)

5 a/b A 3,77 – 3,59 (m)*

5 a/b B 4,00 – 3,08 (m)*

10 a/b A e B 3,13*

3 a/b A e B 2,21 – 2,07 (m)*

4 a/b A e B 2,06 – 1,96*

11 4,21 (m)*

H7 C e D: 8,55 (d, 3J7,8 = 12,0 Hz, 1H) e 8,43 (d,

3J7,8 = 12,0 Hz, 1H), respectivamente.

H8 C e D: 5,30 (d, 3J7,8 = 12,1 Hz, 1H) e 5,58 (d,

3J7,8 = 12,0 Hz, 1H), respectivamente.

H14 C e D: 6,40 (s, 1H) e 6,41 (d, 1H), respectivamente. A, B, C e D referem-se aos 4

isômeros geométricos presentes na amostra, sendo A = isômero E,E, B = isômero Z,E,

C = isômero E,Z e D = isômero Z,Z.

O nitrogênio carregado positivamente na posição 1 da molécula de BtP causa um

efeito de desblindagem no hidrogênio H-7 devido ao efeito retirador de elétrons por

conjugação, fazendo com que seu sinal esteja presente na região de campo baixo do

espectro. Os hidrogênios H-8 e H-14 apresentam deslocamento químico próximo, pois

99

apresentam a mesma distância em relação aos átomos de nitrogênio próximos a eles.

Apesar de a carga positiva estar representada no nitrogênio na posição 1, esta também

está presente no N da porção 1,2,3,4-tetraidropiridínica devido a conjugação do sistema

π. Como os hidrogênios H-8 e H-14 estão mais distantes dos átomos de nitrogênio

comparando-se com o H-7, estão menos desblindados e deslocados para a região de

campo alto do espectro.

Os hidrogênios H-2 e H-11 também apresentam valores de deslocamento

químico próximo e estão blindados. Esses hidrogênios estão próximos aos nitrogênios,

porém não fazem parte do sistema conjugado. Além disso, estão localizados em posição

α ao carboxilato, o que poderia de alguma forma sugerir que a estabilização ou não da

carga negativa do grupo CO2– por ligação de hidrogênio ou cátion metálico pode

influenciar o seu deslocamento químico.

2-4.2. Caracterização estrutural de cloreto de 7-metóxi-4-metilflavílio

O mecanismo de formação do anel flavílio é apresentado na Figura 30. A reação

precisa ser realizada em meio fortemente ácido (AcOH/HCl(g)) para ocorrência de

ciclização e resulta no cloreto de flavílio, que é insolúvel em éter etílico e pode ser

precipitado com facilidade.

Figura 30: Equilíbrio de formação do MMF no acoplamento entre fenol e benzoilacetona.

100

Através da interpretação dos espectros de RMN de 1H de MMF em C2D5OD

(A), CD3OD (B) e D2O (C) foi possível realizar a atribuição dos sinais do espectro aos

hidrogênios da molécula (Tabela 4). De acordo com a análise dos espectros realizados

nos 3 solventes deuterados, os hidrogênios H-3, H-2’, H-6’, H-5 e H-8 apresentam uma

mudança no deslocamento químico com o aumento da polaridade do meio, sendo H-3 e

H-8 os hidrogênios mais afetados. O oxigênio carregado positivamente na posição 1 do

anel C causa um efeito de desblindagem nos hidrogênios citados devido ao efeito

retirador de elétrons por conjugação. O aumento da polaridade do meio estabiliza esta

carga positiva, diminuindo o efeito retirador de elétrons e deslocando os sinais para

região de campo alto do espectro. Os hidrogênios H-3 e H-8 estão mais próximos desta

carga positiva, então são mais afetados pela estabilização da carga. Apesar de

apresentarem a mesma distância em relação ao oxigênio carregado positivamente, o

hidrogênio H-8 apresenta valores de deslocamento químico menores que o hidrogênio

H-3. Isso ocorre, pois o H-8 também sente um efeito doador de elétrons por conjugação

do grupo metóxi da molécula, o que causa um efeito de blindagem nesse hidrogênio.

Em D2O, o deslocamento do sinal do H-8 causa uma sobreposição deste sinal com os

sinais dos hidrogênios H-3’ e H-5’ e um multipleto passa a ser observado. A integração

deste multipleto indica a presença de 4 hidrogênios, fato que não pôde ser explicado.

O hidrogênio H-6 é o mais blindado do sistema aromático, pois está em posição

β com o grupo metóxi, doador de elétrons por conjugação. O sinal referente aos

hidrogênios do grupo metila ligado ao anel C não é observado, pois ocorre a troca dos

átomos de hidrogênio por átomos de deutério. Os hidrogênios do grupo metóxi são

observados em região de campo alto devido ao efeito de blindagem causado pelo

oxigênio.

101

Tabela 4: Atribuição dos sinais obtidos nos experimentos de RMN de 1H de MMF em C2D5OD,

CD3OD e D2O, 500 MHz.(s: singleto, d: dubleto, dd: duplo dupleto, m: multipleto).

H (ppm)

C2D5OD CD3OD D2O

3 8,73 (s, 1H) 8,61 (s, 1H)

8,41 – 8,38 (m, 3H)

sobreposição

2’ e 6’

8,59 (d, 2H)

3J2’,3’ =

3J5’,6’ = 7,4 Hz

8,53 (d, 2H)

3J2’,3’ =

3J5’,6’ = 7,8 Hz

8,41 – 8,38 (m, 3H)

sobreposição

5

8,50 (d, 1H)

3J5,6 = 9,3 Hz

8,46 (d, 1H)

3J5,6 = 9,3 Hz

8,37 (d, 1H)

3J5,6 = 9,3 Hz

8

7,98 (d, 1H)

4J6,8 = 2,4 Hz

7,91 (d, 1H)

4J6,8 = 1,9 Hz

7,77 – 7,73 (m, 4H)

sobreposição

4’

7,88 (t, 1H)

3J4’,5’ =

3J4’,3’ = 7,5 Hz

7,88 (t, 1H)

3J4’,5’ =

3J4’,3’ = 7,5 Hz

7,86 (t, 1H)

3J4’,5’ =

3J4’,3’ = 7,5 Hz

3’ e 5’

7,76 (t, 2H)

3J = 7,9 Hz

7,78 (t, 2H)

3J = 7,8 Hz

7,77 – 7,73 (m, 4H)

sobreposição

6

7,60 (dd, 1H)

3J5,6 = 9,3 Hz

4J6,8 = 2,5 Hz

7,62 (dd, 1H)

3J5,6 = 9,3 Hz

4J6,8 = 2,2 Hz

7,58 (dd, 1H)

3J5,6 = 9,3 Hz

4J6,8 = 2,5 Hz

OCH3 4,19 (s, 3H) 4,19 (s, 3H) 4,15 (s, 3H)

OO8

9

610

3

2

2'3'

4'

5'

6'

5

1'

4

7

12

11

102

2-4.3. Estudo da interação de betalaínas com sais de flavílio

Nos experimentos iniciais realizados em água (pH 5) podemos observar no

gráfico de Stern Volmer uma dependência linear entre (F0/F) e a concentração do

supressor, no caso a BtP, o que indica supressão de fluorescência. Uma variedade de

interações pode dar origem à supressão, como rearranjos moleculares, reações de estado

excitado, transferência de energia, formação de complexos no estado fundamental e

colisões no estado excitado entre fluoróforo e supressor. Dependendo da natureza

dessas interações, essa supressão pode ser estática ou dinâmica.146

Supressão estática ocorre quando fluoróforo e supressor interagem no estado

fundamental, formando um complexo não fluorescente. Ao absorver luz, este complexo

retorna imediatamente ao estado fundamental por processos não emissivos. Este

mecanismo pode ser descrito pela equação 1, onde F0 e F se referem a intensidade de

fluorescência na ausência e na presença do supressor, respectivamente; Q é a

concentração do supressor e KSV é a constante de associação do complexo. Na

supressão dinâmica, o supressor colide com o fluoróforo no estado excitado,

ocasionando o decaimento não emissivo de parte dos fluoróforos contidos no meio. Este

mecanismo dinâmico de supressão é descrito pela equação de Stern-Volmer (Equação

2), na qual F0 e F se referem a intensidade de fluorescência na ausência e na presença do

supressor, respectivamente; kq é a constante bimolecular de supressão, τ0 é o tempo de

vida do fluoróforo na ausência do supressor, Q é a concentração do supressor e KD é a

constante de Stern Volmer. As duas equações apresentam uma relação linear entre as

intensidades de fluorescência e a concentração do supressor.146

Eq. 1

103

Eq. 2

A determinação do tempo de vida de fluorescência (τFL) das amostras permite,

em muitos casos, determinar se ocorre principalmente supressão estática ou dinâmica.

Na supressão estática, o complexo formado não é fluorescente e a fluorescência

observada está relacionada somente aos fluoróforos não complexados. Esta fração de

fluoróforos não é perturbada, então tempo de vida de fluorescência é τ0 e τ0/ τ = 1. Já na

supressão dinâmica, parte dos fluorófros que estava no estado excitado decai para o

estado fundamental por processos não emissivos, então τ0/ τ = F0/F (Figura 31). Um

método adicional para a distinção dos dois mecanismos é a análise do espectro de

absorção do fluoróforo. A supressão dinâmica ocorre somente no estado excitado, então

o espectro de absorção permanece inalterado. Já na supressão estática, ocorre a

formação de um complexo no estado fundamental, podendo causar perturbações no

espectro de absorção do fluoróforo. Contudo, nem todo complexo molecular leva a uma

mudança dramática no espectro de absorção e os resultados devem ser avaliados com

cuidado.

Em muitos os casos, a supressão de fluorescência pode ocorrer pelos dois

mecanismos simultaneamente. Neste caso o gráfico de Stern-Volmer apresenta uma

curvatura ascendente (Figura 31) e o processo é descrito pela equação 3, na qual KD e

KS se referem a constante de supressão dinâmica e estática, respectivamente. Um desvio

da linearidade no gráfico de Stern-Volmer também pode estar relacionado ao modelo de

esfera de ação. De acordo com esse modelo, a supressão ocorre quando o supressor está

perto do fluoróforo no momento da excitação, mas fluoróforo e supressor não formam

um complexo e é descrito pela equação 4, onde V é o volume da esfera de ação e N é a

104

constante de Avogadro. A molécula supressora deve estar dentro desse volume para

ocorrer a supressão.146

Eq. 3

Eq. 4

Figura 31: Mecanismos de supressão estática e dinâmica. F = fluoróforo e Q = supressor.

Em meio aquoso (pH 5), os espectros absorção de BtP e emissão de MMF são

sobreponíveis (Figura 32), o que favorece a ocorrência de processos de transferência de

energia. Contudo, não há evidência da ocorrência de emissão oriunda da BtP com a

excitação do MMF. Nos experimentos realizados a 10-5

mol L-1

, a diminuição da

intensidade da banda de emissão do MMF com a adição de BtP no meio sem a mudança

no tempo de vida sugerem a ocorrência de supressão estática. Além disso, a partir dos

valores de Ksv e de MMF é possível calcular a constante bimolecular de supressão

(kq). Ksv foi calculado e é igual a (0,4 ± 0,03) x 105 mol

-1 L, enquanto de MMF é 4,7

ns, resultando em kq = 8,5 x 1012

mol-1

L s-1

. Sabe-se que kq = 2,0 x 1010

mol-1

L s-1

indica o limite para a ocorrência de supressão por um mecanismo difusional, o que

105

confirma a supressão da fluorescência de MMF por BtP via mecanismo estático. Nos

experimentos realizados a 10-6

mol L-1

, não é observada a supressão de parte da banda

de emissão do MMF e a formação de uma aparente nova banda de emissão em

aproximadamente 510 nm. Isto ocorre, pois esta “supressão” é, na realidade, a

ocorrência de reabsorção devido a concentração das espécies no meio. Nos

experimentos realizados a 10-5

mol L-1

, os valores de absorção de BtP estão acima de 1,

enquanto a 10-6

mol L-1

, estes valores estão abaixo de 0,2, impossibilitando a ocorrência

de reabsorção.

Figura 32: Espectros de absorção (linha contínua) e emissão (linha tracejada, área preenchida)

de MMF (azul) e BtP (laranja) em água (pH 5), solução de água/etanol absoluto ≥99.8% 1:1 v/v

(pH 5) e etanol absoluto ≥99.8% (≤0.2% de água). λexc = 370 nm para MMF e λexc = 474 nm

para BtP.

A Figura 25 mostra que o gráfico de Stern Volmer para os experimentos

realizados em etanol absoluto ≥99.8% (≤0.2% de água) não é linear, mas sim uma curva

com a concavidade voltada para cima. Neste caso, o processo de supressão pode ser

estudado através do modelo de Kapp (equação 3), no qual ocorre sequestro dinâmico e

estático (Figura 33). Os dados resultam em uma reta que é racionalizada como KsKD =

1,1 x 106 mol

-2 L

2 e Ks + KD = 2,5 x 10

11 mol

-1 L, que resultam em dois valores de

constante; 77,9 x 104 mol

-1 L e 32,19 x 10

4 mol

-1 L. O cálculo das constantes

bimoleculares de supressão para os dois processos resultaram em kq > 2,0 x 1010

mol-1

L

106

s-1

, ou seja, as duas constantes parecem estar relacionadas a um mecanismo estático.

Uma possível explicação para este comportamento seria a formação de dois complexos

no estado fundamental com diferentes constantes de estabilidade ou ainda a formação

de um complexo ocorrendo concomitantemente com a degradação de um dos

componentes do sistema.

Talvez em água/etanol, a quantidade de água no meio seja tão grande que o

resultado seja parecido mais com água (vide absorção e emissão).

Figura 33: Modelo de sequestro dinâmico e estático da fluorescência de MMF por BtP.

Os espectros de absorção de MMF em solução de água/etanol absoluto ≥99.8%

1:1 v/v (pH 5) e etanol absoluto ≥99.8% (≤0.2% de água) apresentaram uma banda de

absorção em torno de 340 nm, a qual não é característica da molécula. Além disso, esta

banda possui uma intensidade maior em etanol absoluto ≥99.8% (≤0.2% de água). O

aparecimento dessa banda sugere que a fração molar de água presente no meio causa

alguma mudança na molécula de MMF. Experimentos realizados com etanol anidro

mostraram que o aumento da fração molar de água no meio causa uma diminuição na

intensidade da banda de absorção de MMF em 420 nm e o aparecimento da banda em

340 nm. Além disso, a mudança de pH para valores de pH mais baixos (meio ácido)

resultou na regeneração da banda de absorção do MMF em pH 2 para sua forma

107

original.

Devido a presença do grupo doador metoxila na posição 7 da molécula de MMF,

o equilíbrio prototrópico presente em antocianinas é bloqueado, impedindo a formação

de bases quinoidais. Este mesmo grupo metoxila estabiliza a carga positiva do cátion

flavílio desfavorecendo a sua hidratação até, pelo menos, pH 5.6 Uma possível

explicação para uma mudança estrutural na molécula de MMF é apresentada no

Esquema 13. Etanol (7,44) apresenta maior nucleofilicidade em relação à água (5,20)147

e, caso o meio não esteja suficientemente ácido, pode realizar um ataque nucleofílico na

posição 2 do anel C do MMF, levando a formação do acetal e posterior tautomerismo

para a forma chalcona carregada positivamente. Esta reação é reversível e deslocada

para a formação do cátion flavílio. Na presença de água, ocorre a formação da chalcona

em sua forma neutra.

Esquema 13: Equilíbrio das espécies do sal de flavílio MMF presentes em meio hidroalcoólico.

Em outras palavras, em meio aquoso MMF persiste em pH 5 mas em meio

etanólico, pequenas quantidades de água na presença de um catalisador básico geral,

como um carboxilato, poderiam resultar na hidratação do MMF e consequente abertura

do anel, o que corroboraria com a hipótese da formação de um complexo ocorrendo

concomitantemente com a degradação de um dos componentes do sistema nos

experimentos realizados em etanol absoluto ≥99.8% (≤0.2% de água). Para verificar

108

essa hipótese, uma solução de MMF em etanol com acetato de sódio no lugar de BtP foi

realizado (Figura 34). Observa-se o desaparecimento das bandas de absorção e de

emissão do MMF, exatamente como ocorre com BtP (mas não no experimento controle

sem base) sugerindo que nessas condições a diminuição da emissão ocorre pela abertura

do anel do fluoróforo.

Figura 34: Efeito da adição de acetato de sódio sobre os perfis de absorção e de fluorescência

de MMF em etanol puro.

Os dados obtidos por espectroscopia de RMN sugerem mudanças nos sinais de

hidrogênios tanto da BtP quanto do MMF que são condizentes com a interação entre

essas espécies formando um complexo. Em pH 5 a interação é maior quando comparada

a pH 2, visto que os pKas dos grupos carboxílicos da BtP são próximos a 3,3 (Esquema

13). MMF apresenta-se com carga positiva tanto em pH 5 quanto em meios mais ácidos.

Indicaxantina apresenta carga negativa em pH 5 e carga positiva em uma faixa de pH

entre 2 e 3,5.

109

Esquema 14: Estrutura química de MMF e BtP em meio aquoso em diferentes pHs.

Uma estrutura preliminar de uma possível forma de interação entre BtP e MMF

é apresentada na Figura 35. A interação entre o hidrogênio ácido H-11 da BtP com a

metoxila do MMF, bem como a interação entre o grupo carboxilato com a proximidade

do núcleo positivo do MMF justificam os deslocamentos químicos observados nos

sinais de H dos espectros de RMN. Contudo, o NOE discreto, e eventualmente

inexistente, entre as moléculas torna difícil uma descrição conclusiva da interação entre

MMF e BtP provavelmente devido a uma baixa constante de estabilidade do complexo

formado.

110

Figura 35: Orbitais de fronteira de um possível complexo BtP:MMF. Otimização em nível DFT

SMD(água)/M06-2x/6-31+g(d,p).

111

2-5. Conclusão

BtP e MMF foram sintetizados e sua interação foi estudada por espectroscopia

de RMN, espectrofotometria de absorção UV-vis, espectroscopia de fluorescência no

estado estacionário e resolvida no tempo. Em água, a fluorescência de MMF é

suprimida por BtP dada a sobreposição da banda de absorção de BtP com a emissão do

MMF. Contudo, o gráfico de Stern-Volmer apresenta dois segmentos e uma curvatura

que poderiam sugerir a ocorrência de supressão estática e dinâmica combinada ou a

presença de um segundo supressor cuja concentração aumenta com o aumento da

concentração de BtP, e.g., supressão da fluorescência de MMF por um complexo

BtP:MMF. A ausência de efeito da presença de BtP sobre o tempo de vida do MMF

sugere que a supressão estática seja mais relevante, o que é confirmado pelos dados de

espectroscopia de RMN, os quais indicam que a presença dos dois compostos em

solução resulta em alterações dos deslocamentos químicos de átomos de hidrogênio

específicos em relação aos experimentos controle. Em etanol, a adição de BtP favorece

a decomposição de MMF, provavelmente via hidratação com catálise básica geral. Fato

relevante para a eventual decomposição de antocianinas em meio hidrofóbico, visto que

estes pigmentos naturais são ainda menos estáveis que o MMF. Assim, os dados

apresentados mostram que a interação entre BtP e MMF provoca alterações na

fluorescência e sugerem a ocorrência de formação de complexo entre as espécies. Em

etanol a interação entre estas espécies e água leva a decomposição do MMF, o que pode

ser relevante no contexto da interação de antocianinas e betalaínas in vivo.

112


Reagentes e solventes

As substâncias químicas utilizadas nesta parte do trabalho estão listadas na

tabela Tabela 5.

Tabela 5: Reagentes e solventes utilizados no trabalho.


3-metóxifenol - S.A. 96%

Acetato de etila AcOEt Synth 99,5%

Acetonitrila MeCN Tedia HPLC

Ácido acético glacial HAc(glacial) S.A. 99%

Ácido clorídrico concentrado HCl Synth 36,5-38%

Ácido fórmico HCOOH Fluka >98%

Ácido L-ascórbico C6H8O6 S.A. >99%

Ácido sulfúrico H2SO4 Synth 98%

Ácido clorídrico deuterado DCl S.A. 35 wt% em D2O

Água deuterada D2O S.A.

≥99.9% átomos

D

Benzoilacetona - S.A. 99%

Cloreto de cálcio granulado CaCl2 Anidrol

Etanol EtOH Synth 99,5%

Éter etílico (C2H5)2O Synth

Hidróxido de amônio NH4OH Vetec 30-32%

Isopropanol i-PrOH Synth 99,5%

S.A.: Sigma Aldrich

113

Semissíntese e purificação de indicaxantina (BtP)

Extração de ácido betalâmico em acetato de etila

Ácido betalâmico foi obtido em acetato de etila utilizando-se procedimento

padrão do grupo, adaptado da literatura148

. Primeiramente, cerca de 2 kg de beterrabas

frescas (Beta vulgaris) foram cortadas e processadas em uma centrífuga de alimentos

tipo juicer (Phillips-Walita, modelo PI1855) para obtenção de suco de beterraba. 500

mL de suco foi filtrado em filtro de pano e transferido para um béquer de 1 L e resfriado

a 10 °C. Sob agitação mecânica, foi adicionado hidróxido de amônio 32%, até que a

solução atingisse valor de pH 11,4, acompanhado com o auxílio de um eletrodo de pH.

Após aproximadamente 30 min, ainda sob agitação mecânica, foi observada a mudança

de coloração da solução de vinho para castanho amalerada, indicando que houve a

hidrólise das betalaínas presentes no suco, formando ácido betalâmico (HBt, Esquema

15). O béquer foi mergulhado em banho de gelo seco com etanol, de forma que a

temperatura da solução ficasse próxima a 0 °C, em seguida, foi adicionado HCl 37% em

pequenas porções, de forma que a temperatura da solução não fosse superior a 5 °C, até

que o valor de pH da solução fosse aproximadamente 2. Duas extrações com acetato de

etila (50 mL, ou 10% do volume inicial de suco) foram realizadas. Cerca de 90 mL da

suspensão contendo fase orgânica (HBt em acetato de etila), e suco foi centrifugada a

7.000xg, 2 min, 0 °C. O sobrenadante amarelo foi congelado em banho de etanol e gelo

seco (–80 °C), de forma que cristais brancos de gelo contendo sais e água se formassem.

O precipitado foi filtrado e a concentração da solução de HBt em acetato de etila foi

determinada espectofotometricamente (εAcOEt

378nm = 30.000).

114

Esquema 15: Hidrólise das betalaínas presentes no suco de beterraba, originando HBt.

Acoplamento aldimínico

BtP foi semissintetizada através do acoplamento aldimínico entre ácido

betalâmico e L-prolina em água, uma vez que a amina não é solúvel em acetato de etila.

Cerca de 50 mL de HBt em acetato de etila foi reduzido a 1/3 de seu volume sob

pressão reduzida (20 mmHg, 25 °C), resultando em aproximadamente 17 mL de ácido

betalâmico. HBt foi extraído para água em funil de separação e a fase superior (acetato

de etila) foi descartada. Ao ácido betalâmico em água foi adicionado NH4OH 32% até

que a solução atingisse pH 11. Então L-prolina (10 eq.) foi adicionada e a reação foi

mantida sob agitação magnética a temperatura ambiente por cerca de 30 minutos. Após

este período observou-se a mudança de coloração da solução de um amarelo brilhante

para um amarelo ouro, característico da BtP. Neste momento, a reação foi resfriada em

banho de gelo e o pH foi ajustado para 5 pela adição lenta de HCl 37% para garantir a

desidratação da BtP formada. A reação foi mantida sob agitação magnética a

temperatura ambiente por mais 30 minutos (Esquema 10). A solução de BtP obtida foi

armazenada sob refrigeração (-20 °C) para posterior purificação.

115

Purificação de indicaxantina

A BtP bruta foi purificada em duas etapas. Primeiramente, L-prolina em excesso

foi removida por HPLC em condições de fase reversa e escala semi-preparativa em um

equipamento Shimadzu 20A equipado com detector PDA SPD20A, nas condições:

coluna de Sílica C-18 Luna (5µm, 250 x 10 mm, Phenomenex), em condição isocrática

de 10% de B em 40 minutos com fluxo de 3 mL min-1

. A mistura de solvente utilizada

foi solvente A: 0,05% ácido fórmico em água e solvente B: 0,05%TFA em acetonitrila e

a corrida foi acompanhada em 254 nm. As frações correspondentes a BtP foram

coletadas entre 18,6 min e 19,6 min. Após esta etapa, traços de ácido betalâmico ainda

presentes na amostra foram removidos por cromatografia de exclusão de tamanho,

utilizando-se coluna de Sephadex LH-20 e água como eluente. As frações coletadas

foram analisadas por espectrofotometria UV-vis e HPLC analítico.


BtP purificada foi analisada por HPLC analítico em um equipamento Shimadzu

20A equipado com detector PDA SPD20A em fase reversa, nas condições: C18

Ascentis ® (250 x 4,6 mm, Supelco), em condição isocrática de 20% de B em 15

minutos, com fluxo de 1 mL min-1

detecção em λmax = 254 nm e 485 nm. A mistura de

solvente utilizada foi solvente A: 0,05% ácido fórmico em água e solvente B:

0,05%TFA em acetonitrila. Os dados foram obtidos utilizando o programa de aquisição

LCSolution.

Síntese do cloreto de 7-metóxi-4-metilflavílio (MMF)

Cloreto de 7-metóxi-4-metilflavílio foi sintetizado e purificado utilizando-se

procedimento descrito previamente na literatura.137

2 mmol de 3-metóxifenol e 2 mmol

116

de benzoilacetona foram adicionados a um balão de fundo redondo contendo

aproximadamente 20 mL de ácido acético glacial. HCl(g) gerado in situ (CaCl2 + H2SO4)

foi borbulhado no meio reacional durante 4 horas (Esquema 12). Ao final da reação, o

sal de flavílio (sólido amarelo) foi precipitado com a adição de éter etílico gelado. O

precipitado foi filtrado a vácuo, lavado com éter etílico gelado e mantido em dessecador

sob vácuo durante 24 horas. A massa obtida foi de 267 mg, obtendo-se um rendimento

de 53 %.

Caracterização estrutural

A caracterização estrutural da indicaxantina semissintetizada e do MMF

sintetizado foi realizada por espectrometria de massas por injeção direta com ionização

por eletrospray em modo positivo (MS(ESI+)), realizada no laboratório do Professor

Doutor Thiago Carita Correra e espectroscopia de ressonância magnética (RMN),

realizada na Central Analítica do IQ-USP.

Espectroscopia de ressonância nuclear magnética

Os experimentos de RMN de 1H e

1H,

1H-COSY de BtP foram obtidos a 25°C

em espectrômetro Bruker Avance III 500, operando a 500,13 MHz, equipado com uma

sonda de tripla ressonância (TXI) de 5mm com detecção inversa. Para a análise, cerca

de 5 mg de BtP foi solubilizada em 700 µL de D2O. Os ensaios de 1H foi realizado com

a solução em tubos de 5mm, com ns = 256, td = 64K, ds = 0 e o ensaio de 1H –

1H

COSY com pulseprog = cosyprqf, ns = 32, td = 2048, ds = 16.

Os experimentos de 1H-RMN de MMF foram obtidos a 25°C em espectrômetro

Bruker Avance III 500, operando a 500,13 MHz, equipado com uma sonda de tripla

ressonância (TXI) de 5mm com detecção inversa. Para a análise, cerca de 5 mg de

117

MMF foi solubilizada em 700 µL de C2D5OD, CD3OD e D2O. Os ensaios de 1H foram

realizados com as soluções em tubos de 5mm, com ns = 256, td = 64K, ds = 0.

Espectrometria de massas por injeção direta

A análise por espectrometria de massas foi realizada em modo positivo em um

espectrômetro de massas do tipo ion trap (Amazon SL - Bruker) modificado para

realização de espectroscopia de íons (IRMPD). As amostras foram analisadas por

injeção direta (180 uL/h) e a fonte de íons mantida a 4500 V em relação ao terra, o gás

de nebulização em 7.24 psi e o gás de secagem 4 L/min. A unidade de dessolvatação foi

mantida a 180 ºC. Os espectros foram adquiridos no modo de alta resolução (Δm à

largura total do pico na metade de sua altura máxima - FWMH < 0,2) com 50

varreduras.

Caracterização fotofísica

Espectrometria de absorção, emissão e excitação.

Os espectros de absorção foram realizados em um espectrofotômetro Varian

Cary Bio 50 e os espectros de emissão e excitação foram realizados em um

espectrofotômetro Varian Cary Eclipse. Os espectros foram adquiridos em solução

aquosa pH 5, solução de água/etanol absoluto ≥99.8% 50:50 v/v (pH 5) e etanol

absoluto ≥99.8% (≤0.2% de água) em cubeta de quartzo de 3 mL com caminho ótico de

1 cm. Para investigar a influência da fração molar de água presente em etanol nos perfis

de absorção e emissão de MMF, espectros de absorção e emissão foram registrados em

etanol anidro na ausência e na presença de água (H2O = 0,02; 0,14; 0,25 e 0,40).

Quando H2O = 0,40 verificou-se ainda a influência do pH. pH 5 e pH 2 foram

118

estudados. Os espectros foram adquiridos em cubeta de quartzo de 3 mL com caminho

ótico de 1 cm.

Os parâmetros utilizados para os espectros de emissão e excitação de BtP foram,

respectivamente, λexc = 474 nm, fex = fem = 10 nm, tensão = 600 V e λem = 515 nm, fex =

fem = 10 nm, tensão = 600 V. Os parâmetros utilizados para os espectros de emissão e

excitação de MMF foram, respectivamente, λexc = 370 nm, fex = 2,5 nm, fem = 5 nm,

tensão = 600 V e λem = 474 nm, fex =2,5 nm, fem = 10 nm, tensão = 600 V.

Determinação de rendimento quântico de fluorescência

Rendimento quântico de fluorescência (ΦFL) é definido como a razão entre o

número de fótons emitidos e absorvidos por uma molécula. Esta propriedade pode ser

determinada indiretamente por comparação do rendimento quântico de fluorescência de

um padrão secundário utilizando-se a Equação 2. Para a resolução desta equação os

seguintes parâmetros são necessários; a absorção da amostra em estudo (AX) e do

padrão (AP) no comprimento de onda de excitação, as áreas sobre as curvas de emissão

(S), os índices de refração dos solventes utilizados (n) e o rendimento quântico de

fluorescência do padrão (ΦFl).

Eq. 2

Para evitar problemas relacionados à eficiência do sistema de detecção em

diferentes comprimentos de onda, o padrão utilizado deve ter perfil de absorção e

emissão similar à amostra149

. Para a determinação do rendimento quântico de BtP e

MMF em água (pH 5), fluoresceína e perileno foram utilizados como padrão,

respectivamente (Tabela 6). Os espectros de absorção e emissão das amostras e dos

119

padrões utilizados foram adquiridos em cubetas de quartzo de 1,5 mL com caminho

ótico de 10 mm. A absorção das soluções foi mantida abaixo de 0,1 para evitar efeitos

de filtro interno146

e os experimentos foram realizados em triplicata. Os espectros de

emissão de BtP e fluoresceína foram adquiridos nas mesmas condições (λexc = 475 nm,

fexc = fem = 20 nm, tensão = 600V), assim como os espectros de emissão de MMF e

perileno (λexc = 370 nm, fexc =5, fem = 10 nm, tensão = 600V).

Tabela 6: Padrões utilizados na determinação do ΦFL de BtP e MMF e parâmetros relevantes.

Composto Solvente ΦFL Excitação (nm) Emissão (nm) Ref.

Fluoresceína NaOH(aq) 0,1 mol L-1

0,79 470 - 500 500 - 600 150

Perileno Ciclohexano 0,92 350 - 430 400 - 600 151

Estudo da interação de betalaínas com sais de flavílio

Espectroscopia de absorção e emissão de MMF na presença de BtP

Para a determinação do efeito da adição de BtP nos espectros de emissão e

absorção de MMF , a concentração de MMF foi mantida fixa na cubeta (Vf = 2 mL) em

3,6 × 10–5

mol L-1

ou 3,6 × 10–6

mol L-1

, a partir de uma solução estoque 7,2 × 10–5

mol

L-1

ou 7,2 × 10–6

mol L-1

. A concentração de BtP foi variada de 0,1 × 10–5

mol L-1

ou

0,1 × 10–6

mol L-1

a 3,6 × 10–5

mol L-1

ou 3,6 × 10–6

mol L-1

(Tabela 7), a partir de uma

solução estoque de indicaxantina (7,2 × 10–5

mol L-1

ou 7,2 × 10–6

mol L-1

). Os

experimentos foram realizados em água em pH 5. O ajuste do pH foi realizado com a

adição de solução de HCl 1 mol L-1

. As medidas de absorção e emissão foram

realizadas em cubetas de plástico de 3 mL com caminho ótico de 10 mm em um

espectrofotômetro Varian Cary Bio 50 e um espectrofotômetro Varian Cary Eclipse,

respectivamente. Para cada concentração de BtP foram registrados um espectro de

absorção em uma faixa de varredura de 300 – 600 nm e espectros de emissão (λexc = 370

120

nm, fexc = 2,5 nm, fem = 5 nm, tensão = 600 V). Para os experimentos realizados com

concentração de MMF e BtP 10-6

mol L-1

, as fendas utilizadas foram fexc = 5 nm, fem = 5

nm.

Tabela 7: Concentrações de BtP utilizadas nos estudos de supressão de fluorescência de

MMF.

N° de equivalentes Concentração final (mol L-1

)

0,1 0,4 × 10–5

/10-6

0,3 1,1 × 10–5

/10-6

0,5 1,8 × 10–5

/10-6

0,8 2,9 × 10–5

/10-6

1 3,6 × 10–5

/10-6

Efeito do solvente na interação de BtP com MMF

Espectroscopia de absorção e emissão de MMF na presença de BtP

Para a determinação do efeito da adição de BtP nos espectros de emissão e

absorção de MMF , a concentração de MMF foi mantida fixa na cubeta (Vf = 2 mL) em

3,6 × 10–5

mol L-1

, a partir de uma solução estoque 7,2 × 10–5

mol L-1

. A concentração

de BtP foi variada de 0,1 × 10–5

mol L-1

a 7,2 × 10–5

mol L-1

(Tabela 8 e Tabela 9), a

partir de uma solução estoque de indicaxantina (5 × 10–4

mol L-1

). Os experimentos

foram realizados em água em pH 5, em solução de água/etanol absoluto ≥99.8% 50:50

v/v (pH 5) e etanol absoluto ≥99.8% (≤0.2% de água). O ajuste do pH foi realizado com

a adição de solução de HCl 1 mol L-1

. As medidas de absorção e emissão foram

121

realizadas em cubetas de plástico (experimentos realizados em água) e quartzo

(experimentos realizados em solução de etanol/água e em etanol) de 3 mL com caminho

ótico de 1 cm em um espectrofotômetro Varian Cary Bio 50 e um espectrofotômetro

Varian Cary Eclipse, respectivamente. Para cada concentração de BtP foram registrados

um espectro de absorção em uma faixa de varredura de 300 – 600 nm e espectros de

emissão (λexc = 370 nm, fexc = 2,5 nm, fem = 5 nm, tensão = 600 V) na ausência e na

presença de MMF.

Tabela 8: Variação das concentrações de BtP utilizadas no estudo realizado em água

N° de equivalentes Concentração na cubeta (mol L-1

)

0,1 0,4 × 10–5

0,3 1,1 × 10–5

0,5 1,8 × 10–5

0,8 2,9 × 10–5

1 3,6 × 10–5

1,2 4,5 × 10–5

1,5 5,5 × 10–5

1,7 6,3 × 10–5

2 7,2 × 10–5

Tabela 9: Variação das concentrações de BtP utilizadas nos estudos realizados em solução de

água/etanol absoluto ≥99.8% 50:50 v/v (pH 5) e etanol absoluto ≥99.8% (≤0.2% de água).


)

0,1 0,4 × 10–5

122

0,5 1,8 × 10–5

1 3,6 × 10–5

1,5 5,5 × 10–5

2 7,2 × 10–5

123

Determinação do tempo de vida de fluorescência de MMF na presença de BtP

O tempo de vida de fluorescência de MMF foi adquirido em equipamento

Edinburgh FL980, com sistema Time Correlated Single Photon Counting (TCSPC),

acoplado a laser EPLED-340 (λexc = 335,6 nm, amplitude do pulso = 649,8 ps, largura

da banda = 13,8 mm), de 40 kHz. As condições do equipamento foram: λexc = 335,6 nm,

λem = 474 nm; fex = 5 nm, fem = 10 a 20 nm, 3.000counts, 2048 canais, numa janela

temporal de 50 ns. A função da resposta instrumental (IRF) foi coletada com Ludox,

com λexc = λem = 335,6 nm. Os ajustes das curvas de decaimento de fluorescência foram

realizados por meio da deconvolução do IRF, pelo software Fast (Edinburgh Fotonics).

As amostras a serem analisadas foram preparadas como citado no item anterior e

as medidas foram realizadas em cubetas de quartzo de 3 mL com caminho ótico de 10

mm.

Tentativa de caracterização do complexo BtP-MMF por espectroscopia de RMN

Para o estudo da interação entre BtP e MMF em água (pH 5) por espectrometria

de ressonância magnética nuclear foram realizados experimentos de RMN de 1H e

NOESY 2D. Os espectros foram obtidos a 25°C em espectrômetro Bruker Avance III

500, operando a 500,13 MHz, equipado com uma sonda de tripla ressonância (TXI) de

5mm com detecção inversa. Os ensaios de 1H foram realizados com as soluções em

tubos de 5mm, com ns = 256, td = 64K, ds = 0.

Primeiramente, 0,5 mg de MMF (1,45 × 10–7

mol) foi solubilizado em 600 µL

de D2O (pD 5) e um espectro de 1H foi registrado. O pD foi ajustado para 5 com a

adição de DCl. Solução concentrada de BtP (2,87 × 10–3

mol L-1

) em D2O (pD 5) foi

adicionada ao tubo em diferentes proporções até atingir 1 equivalente em mol em

124

relação ao MMF (Tabela 10). Para cada concentração de BtP foi registrado um espectro

de 1H. Ao atingir 1 equivalente de BtP em relação ao MMF também foi registrado um

espectro bidimensional NOESY (noesygpphpr) com ns = 32, ds = 32, td = 2048 x 512.

Tabela 10: Variação das proporções de BtP utilizadas nos estudos de RMN.

Equivalentes de BtP Número de mols de BtP (10-7

)

0,1 0,15

0,3 0,43

0,5 0,72

0,8 1,15

1 1,45

125

Capítulo 3.

Interação de betanina com paraquat

Modelo para processos de transferência de elétron via

complexos de transferência de carga

3-1. Introdução

Paraquat, metil viologênio (MV2+

) ou dicloreto de N,N’-dimetil-4,4’-bipiridínio,

é um herbicida não seletivo que age inibindo a fotossíntese.152

Paraquat retira elétrons

do fotossistema I compromentendo, assim, a redução de NADP+ a NADPH

(Eo'(NADP+/NADPH) = –320 mV vs. NHE)

153 e, consequentemente, o ciclo de Calvin,

que promove a fixação de carbono pela planta a partir de dióxido de carbono e água.154-

156 Paraquat é um dímero de N-metilpiridina e, desta forma, é um sal formado por um

cátion com carga formal 2+ e dois íons cloreto. Nesta forma oxidada, MV2+

é incolor

em solução aquosa (ε257 nm

= 14.000 mol L–1

cm–1

)157

e pode ser reduzido em um elétron

(Eo'(MV

2+/MV

+●) = –446 mV vs. NHE e que se mantém constante na faixa de pH entre

5 e 13) resultando em um cátion radical MV+●

de cor azul (ε396 nm

= 41.100 mol L–1

cm–

1; ε

606 nm = 13.800 mol L

–1 cm

–1).

158 A reversibilidade desta reação redox torna o

paraquat um composto bastante usado em dispositicos eletrocrômicos, como janelas

com luminosidade controlada pela corrente, como transportador de elétrons na

otimização de processos biológicos e energéticos e em processos de biorremediação.159-

160,161 Na ausência de oxigênio, MV

+● em solução aquosa persiste por horas a

temperatura ambiente e seu espectro de absorção não sofre alterações na faixa de pH

126

entre 0 e 7.162

Na presença de oxigênio, MV+●

é oxidado a MV2+

produzindo o ânion

superóxido (O2–●

, Eo'(O2/O2

–●) = –155 mV vs. NHE)

153 com uma constante de

velocidade de 7,7 × 108 L mol

–1 s

–1.163

A ocorrência desta reação in vivo acarreta na

formação de peróxido de hidrogênio e radical hidroxila,163

o que explica a alta

toxicidade do paraquat também para animais e torna controverso o uso deste composto

como herbicida.164

O cátion-radical de metil viologênio pode ser reduzido em um

elétron em solução aquosa pH 7 levando ao metil viologênio neutro (Eo'(MV

+●/MV

0) =

–880 mV vs. NHE).158, 165

A solução aquosa de MV0 é amarela e pode dar origem ao

dímero catiônico (Eo'(MV

0/(MV)2

2+) = –930 mV vs. NHE, comprometendo a oxidação

de MV0 a MV

+●.159

A fotorredução de MV2+

levando à formação de MV+●

é um processo

fotoquímico de grande interesse na área de conversão de energia solar.162

O potencial de

redução do paraquat excitado para a formação do respectivo cátion radical (E

o'([MV

2+]*/MV

+●)) é 3,65 V vs. NHE, indicando que [MV

2+]* é um oxidante muito

forte.162, 166-167

Em solução aquosa, paraquat é fotorreduzido por doadores de elétrons

como EDTA, Cl– e SCN

– quando irradiado com luz UVA. A formação de MV

+● se

relaciona com a formação de complexos de transferência de carga no estado

fundamental entre MV2+

e as espécies doadoras de elétron.

Esquema 16: Estados de oxidação de Paraquat em meio aquoso.

Em células de combustível para a geração de H2 baseadas em um fotoeletrodo de

silício, paraquat em sua forma oxidada MV2+

é fotoreduzido a MV+●

, gerando um

127

produto de redução capaz de decompor H2O, gerando H2 (Equações 4 e 5).161

Eq. 4

Eq. 5

Betanina (Bn, Esquema 18), o principal pigmento da beterraba vermelha, é um

importante antioxidante natural, que pode ser oxidado por espécies reativas de oxigênio

e nitrogênio.128, 168

Sua estrutura química contém tanto um anel catecol 5-O-glicosilado

quanto o sistema 1,7-diazaheptametínico característico das betalaínas, estruturas que ao

serem oxidadas individualmente em um elétron podem estabilizar o radical formado por

ressonância. Os potenciais de pico anódico medidos por voltametria diferencial de pulso

em pH 7,4 são Ep(a)1 = 620 mV, Ep(a)2 = 840 mV e Ep(a)3 = 1,22 V vs. NHE.169-170

Os

segundo e terceiro potenciais de betanina são muito semelhantes aos dois potenciais

determinados para indicaxantina (Ep(a)1 = 830 mV e Ep(a)2 = 1,12 V vs. NHE), sugerindo

que a primeira oxidação de betanina ocorre na porção catecol que é ausente na

indicaxantina.170

O processo de oxidação de betanina envolve dois elétrons e dois

prótons e dá origem a 2-descarbóxi-2,3-dehidrobetanina (dhBt). A primeira oxidação da

betalaína dá origem ao radical semiquinona, o qual é posteriormente oxidado a

quinona.171-174

Esta sofre uma descarboxilação, dando origem a dhBt. Outro possível

produto de oxidação é a neobetanina. O potencial de pico anódico da betanina depende

do pH do meio, variando entre 450 mV vs. NHE em pH = 3 a 670 mV vs. NHE em pH

= 6.169, 175

Betalaínas, especialmente as betacianinas, apresentam um alto potencial como

antioxidantes naturais, sendo a base de estudos clínicos de doenças relacionadas ao

estresse oxidativo.168, 176-178

Uma possível explicação para tal comportamento é que a

128

presença de duplas conjugadas e grupos aromáticos nas betalaínas estabilizam por

ressonância os radicais formados quando estas atuam como doadoras de elétron ou

hidrogênio para radicais livres (Esquema 17).38

Esquema 17: Exemplo de possíveis interações de uma betalaína com um radical genérico RO.

No caso (A) vê-se como o grupo ciclo-DOPA da betanidina poderia atuar estabilizando radicais

por transferência de hidrogênios179

formando a semiquinona e no caso de R1 = H a quinona;

(B) observa- se como a indicaxantina poderia estabilizar o radical por transferência de elétrons

(caminho i) ou transferência de hidrogênio (caminho ii). Note que ambos os caminhos levam

após nova oxidação ao derivado neobetalâmico que contém uma porção 2,6-

dicarboxipiridínica. A piridina é apresentada protonada para viabilizar a representação

estequiométrica das reações.

Devido sua habilidade de doar elétrons e seu alto coeficiente de atenuação molar

N

R2R2

O

O

R1O

OHRO + N

R2R2

O

O

R1O

OROH + N

R2R2

O

O

R1O

Odd

d d

RO + N

R2R2

O

O

O

O

H

ROH + N

R2R2

O

O

O

O

(A)

N

N

H

H

H

O

O

OH

O

HO

O

RO +

N

N

H

H

HOOCH

O

O

OH

O

RORO

N

N

H

O

O

O

O

O

O

+ + 2 ROH

N

N

H

H

O

O

OH

OO

OH

+ ROH

N

N

H

O

O

OH

OO

OH

RO

(B)

i

ii

129

(ε), betalaínas são bons candidatos para utilização em processos que envolvem

transferência de elétrons induzida por fótons, como em células solares sensibilizadas

por corante (DSSCs).180

As porções carboxílicas presentes em sua estrutura favorecem a

ligação na superfície do TiO2, utilizado como óxido condutor.174

Betacianinas

apresentam-se promissoras na conversão de energia fotovoltaica em relação a

betaxantinas devido maior sobreposição de seu espectro com o espectro de energia

solar.181

Um estudo recente de Sandquist e McHale mostra a confecção de uma célula

solar fotossensibilizada por betanina com eficiência de conversão de energia maior que

2,7%, o maior rendimento registrado para um fotossensibilizador natural.182

Apesar do

baixo rendimento em relação às células solares sensibilizadas por corantes sintéticos

(11%), o uso de pigmentos naturais apresenta menor custo e maior apelo ambiental.

Betanina também vêm sendo utilizada em células de combustível que produzem

H2. O desenvolvimento de catalisadores para transferência de elétrons fotoinduzida

possibilita a produção de H2 e O2 a partir da redução de H+ e oxidação da água.

Entretanto, a produção de oxigênio resulta em um produto de baixo valor econômico,

difícil de separar que, se produzido em escala global e em grandes quantidades, pode

impactar as formas de vida no planeta, como fez há cerca de 2 bilhões de anos.183

Esses

dispositivos, assim como as DSSCs, são constituídos de um semicondutor e um

fotossensibilizador que é responsável pela captação da energia solar e transferência de

elétrons para a banda de condução do semicondutor.184

Em um dispositivo contendo

nanocristral de óxido de zinco como semicondutor e [FeFe(mcbdt)(CO)6] como

catalisador, betanina foi utilizada como sensibilizador e aumentou a eficiência de

produção de H2 em ca. 5 vezes comparado ao dispositivo na ausência do

sensibilizador.185

Recentemente foi desenvolvido um dispositivo fotovoltaico nano-

130

híbrido que permite a produção de H2 com eficiência de até 20%, maior eficiência

registrada para este tipo de dispositivos. Além disso, as etapas de produção

fotocatalítica de H2 e a oxidação do poluente formado ocorrem simultaneamente. Neste

trabalho, nanopartículas de prata (AgNPs) estabilizadas com betanina e derivados foram

utilizadas como sensibilizadores. Betanina e seus produtos de decomposição, ácido

betalâmico, cyclo-DOPA 5-O-glicosídeo e neobetanina foram utilizados como

regeneradores, retardando a recombinação entre elétron e o orbital vazio, aumentando

assim a eficiência na transferência de elétrons.184

A interação entre betanina e paraquat em meio aquoso pode levar a um sistema

redox reversível que pode ter utilidade no desenvolvimento de dispositivos

fotovoltáicos. Desta forma, é importante investigar a interação entre estes compostos no

estado fundamental na presença e na ausência de irradiação com luz ultravioleta.

131

3-2. Objetivos

Determinar se existe interação química entre betanina e paraquat considerando

seus potenciais redox.

3-2.1 Objetivos específicos

i. Verificar a formação de um complexo entre betanina e paraquat;

ii. Determinar se betanina é um doador de elétron eficiente para paraquat excitado;

iii. Determinar se o grau de pureza da betanina afeta a interação com paraquat.

132

3-3. Resultados e discussão

Os estudos de interação entre betanina e paraquat foram feitos utilizando-se três

amostras de betanina: suco de beterraba em pó diluído com dextrina (amostra A),

betanina precipitada de suco de beterraba (amostra B) e betanina purificada por HPLC

(amostra C). Estes experimentos foram feitos para determinar o efeito do grau de pureza

da betanina sobre a sua interação com o herbicida.

3-3.1. Obtenção e análise de amostras de betanina

A amostra A é comercial e foi usada como recebida. Betanina foi precipitada a

partir do suco fresco de beterraba acidulado usando isopropanol como antissolvente,

resultando na amostra B. Embora esta amostra seja composta praticamente só por

betanina, ela foi submetida a uma etapa de purificação por HPLC em condições de fase

reversa e escala semi-preparativa que produziu a amostra C. A análise cromatográfica

analítica revelou que a amostra A contém duas betalaínas, enquanto as amostras B e C

apresentam somente um pico cromatográfico cada, que foi identificado como betanina

por comparação do tempo de retenção com amostra submetida a análise de HPLC/MS

(ESI(+) m/z 551).

Soluções das três amostras em D2O foram comparadas qualitativamente por

espectrometria de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN de 1H) (Figura

36, Anexos 5 – 7). Pode-se observar que a amostra A contém uma quantidade pequena

de betalaínas, que impedem a visualização de seus sinais característicos em torno de 7

ppm (H4 (Csp2, porção catecol), H7 (Csp2, porção catecol)), e uma grande quantidade de

dextrina, como evidenciado pelos sinais intensos na região entre 4 e 3 ppm. A amostra

B de betanina obtida por precipitação mostra que o material obtido contém outras

betacianinas como é possível inferir pelos sinais intensos na região entre 4 e 3 ppm e

133

pela comparação com os sinais da amostra A (betanina purificada por HPLC) que estão

de acordo com uma amostra mais pura.

Esquema 18: Estrutura química da betanina (Bn), betacianina natural resusltante do

acoplamento aldimínico entre ácido betalâmico e ciclo-DOPA 5-O-glicosilada.

Figura 36. Espectros de RMN de 1H (500 MHz, D2O) para as amostras A, B e C e

maltodextrina. O sinal de H2O em 4.79 ppm foi suprimido para favorecer a visualização.

Espectros de RMN de 1H,

1H,

1H-COSY,

1H,

13C-HSQC,

1H,

13C-HMQC da

NH

N

COOH

COOHHO

O

O

OHHOOH

HO

H

HOOC

H

H

HH

H

HH

15

4

7

11 12

1814

2

3

6'5'

4'3'

2'

1'

134

betanina em D2O são descritos na literatura,186

assim como RMN de 1H em solventes

orgânicos acidificados como ACN-d3/TFA-d187

. Os sinais mais importantes para a

caracterização da betanina (Esquema 19) são os átomos de hidrogênio 4 (Csp2, porção

catecol), 7 (Csp2, porção catecol), 2 (quiral, porção ciclo-DOPA), 11 (+N=CH), 12

(+N=CH–CH), 14 (a e b, diastereotópicos), 15 (quiral, porção 1,2,3,4-

tetraidropiridínica) e 18 (Csp2, porção 1,2,3,4-tetraidropiridínica) (Esquema 18).

Na ampliação da região de deslocamento químico entre 7,2 e 6,9 ppm (Figura

37), pode-se observar os singletos correspondentes aos hidrogênios 4 e 7 de betanina

pura e precipitada. Na ampliação da região de deslocamento químico entre 5,1 e 4,9

ppm (Figura 37) pode-se observar o duplo dubleto referente ao H-2 e o dubleto

referente ao H-1’. O valor das constantes de acoplamento referentes aos H-2 (4,94 ppm,

J32,3 = 10.2, 3.0 Hz) e H-1’ (4,98 ppm, J

31’,2’ = 7.6 Hz) de betanina pura e H-2 (5,03

ppm, J32,3 = 10.2, 2.3 Hz) e H-1’ (4,98 ppm, J

31’,2’ = 7.5 Hz) de betanina precipitada são

similares aos valores relatados na literatura (H-2 (4,92 ppm, J32,3 = 10.3, 3.1 Hz), H-1’

(4,98 ppm, J31’,2’ = 7.4 Hz)).

186, 188 Nota-se ainda que no espectro de Bn precipitada, o

sinal correspondente ao H-2 apressenta um deslocamento para campo baixo em relação

a betanina pura possivelmente pela presença de ácido residual na amostra. No espectro

da betanina comercial não conseguimos observar os sinais correspondentes a esses

hidrogênios. Na ampliação da região entre os deslocamentos químicos 7,2 e 6,9 ppm

observamos um sinal que pode estar associado ao H-4.

135

Figura 37: Ampliação da região de deslocamento químico entre 7.2 e 6.9 ppm e da região entre

5.1 e 4.9 ppm do espectro de RMN de 1H de betanina pura, betanina precipitada e betanina

comercial em dextrina em D2O, 500 MHz.

Na ampliação da região de deslocamento químico entre 4,2 e 3,0 ppm (Figura

38) observa-se que é possível atribuir os sinais obtidos com a amostra C (betanina pura).

O multipleto em 3,55 ppm se refere à β-D-glicose ligada na posição 5 da ciclo-DOPA.

Para Bn purificada por HPLC também foi possível atribuir os sinais referentes aos H6’a

(3,84 ppm, J35’,6’a = 12.5, J

44’,6’a = 2.2 Hz) e H6’b (3,69 ppm, J

35’,6’b = 12.5, J

44’,6’b = 5.4

Hz), cujas constantes de acoplamento são similares aos valores da literatura (3,85 ppm,

J35’,6’a = 12.3, J

44’,6’a = 1,6 Hz, 3,7ppm, J

35’,6’b = 12.3, J

44’,6’b = 5.3 Hz).

188

136

Figura 38: Ampliação da região de deslocamento químico entre 4,2 e 3,0 ppm do espectro de

RMN de 1H (D2O, 500 MHz) de betanina pura, betanina precipitada, betanina comercial em

dextrina e maltodextrina.

As Tabelas 11 e 12 apresentam a atribuição dos sinais de RMN de 1H para

betanina pura e betanina precipitada.

137

Tabela 11: Atribuição dos sinais obtidos nos experimentos de RMN de 1H de betanina pura em

D2O em 500 MHz.(s: singleto, d: dubleto, t: tripleto dd: duplo dupleto, m: multipleto, b: broad).

Betanina

pura

Posição

do 1H

δH (ppm)

2 4.94 (dd, J32,3 = 10.2, 3.0 Hz, 2H)

4 7.07 (s, 1H)

6’ a 3.84 (dd, J35’,6’ = 12.5, J

44’,6’ = 2.2 Hz, 1H)

6’ b 3.69 (dd, J35,6 = 12.5, J

44’,6’ = 5.4 Hz, 1H)

7 7.01 (s, 1H)

11 8.23 (bd)

12 5.86 (bd)

14 a/b 3.14 (dd, J214a,14b = 16.8, J

314a,15 3.0 Hz, 2H)

15 4.42 (t, J = 7.0 Hz, 1H)

18 6.22 (bs)

1’ 4.98 (d, J = 7.6 Hz, 1H)

3’, 4’, 5’ 3.62 - 3.49 (m, 6H)

2’ 3.47 – 3.42 (m, 2H)

NH

N

COOH

COOHHO

O

O

OHHOOH

HO

H

HOOC

H

H

HH

H

HH

15

4

7

11 12

1814

2

3

6'5'

4'3'

2'

1'

138

Tabela 12: Atribuição dos sinais obtidos nos experimentos de RMN de 1H de betanina

precipitada em D2O em 500 MHz.(s: singleto, d: dubleto, t: tripleto dd: duplo dupleto, m:

multipleto, b: broad).

Betanina

precipitada

Posição

do 1H

δH (ppm)

2 5.03 (dd, J32,3 = 10.2, 2.3 Hz, 2H)

4 7.07 (s, 1H)

7 7.02 (s, 1H)

11 8.27 (bd)

12 5.91 (bd)

14 a/b 3.14 (dd, J214a,14b = 16.8, J

314a,15 3.0 Hz, 2H)

15 4.42 (t, J = 7.0 Hz, 1H)

18 6.23 (bs)

1’ 4.98 (d, J = 7.5 Hz, 1H)

NH

N

COOH

COOHHO

O

O

OHHOOH

HO

H

HOOC

H

H

HH

H

HH

15

4

7

11 12

1814

2

3

6'5'

4'3'

2'

1'

139

Os perfis espectrofotométricos de soluções aquosas das três amostras foram

comparados. Betanina pura apresenta seu máximo de absorção em 536 nm com

coeficiente de absorção molar de 65.000 L mol–1

cm–1116

. Apesar de pouco fluorescente

(ΦFL < 10-4

)189

, a excitação entre 500 e 600 nm resulta em emissão de fluorescência

laranja com máximo em 615 nm, como se pode observar pelos espectros de excitação e

emissão na Figura 39A. Betanina precipitada também apresenta seu máximo de

absorção em 536 nm e uma banda com largura semelhante à betanina pura, porém

apresenta uma região de alta absorção no UV referente, possivelmente, a açúcares

presentes na amostra. A excitação em 530 nm resulta em emissão de fluorescência

laranja com máximo em 615 nm. Em seu perfil de excitação é possível verificar um

ombro em torno de 490 nm, região do espectro característica de betaxantinas (Figura

39B). Betanina comercial apresenta uma banda de absorção mais larga em comparação

a betanina pura e precipitada com máximo em 531 nm. Nota-se ainda uma alta absorção

na região UV do espectro, o que é esperado, uma vez que além dos açúcares presentes

na beterraba, esta amostra contém dextrina. Sua excitação em torno de 480 nm resulta

em emissão de fluorescência verde com máximo em 545 nm como se pode observar

pelos espectros de excitação e emissão apresentados na Figura 39C. Seu espectro de

excitação mostra um perfil bem definido de betaxantinas com máximo em 483 nm.

140

Figura 39: Espectros normalizados de absorção (linha preta), emissão (linha vermelha) e

excitação (linha azul tracejada) de betanina pura (A), betanina precipitada (B) e betanina

comercial em dextrina em água. λexc = 530 nm e λem = 615 nm para as amostras A e B. λexc =

480 nm e λem = 545 nm para a amostra C.

3-3.2. Interação entre betanina e paraquat

Metilviologênio em sua forma dicatiônica (MV2+

) apresenta um máximo de

absorção em 258 nm com um coeficiente de atenuação molar de 14.000 mol L-1

cm-1

referente a transições π-π*. Apesar de pouco fluorescente, apresenta um máximo de

141

emissão em 345 nm.190

Seu baixo rendimento quântico de fluorescência se deve a

desativação favorável por processos não radiativos como a rotação dos anéis piridínicos

em torno da ligação C-C e a fotorreação existente entre MV2+

e água.191-192

A

excitação de metilviologênio em água em 280 nm dá origem ao espalhamento Raman da

água (310 nm), porém se o exc > 310 nm, observa-se uma fluorescência verde com

máximo de emissão em 520 nm. O mesmo comportamento foi observado para outros

compostos bipiridínicos e esta banda de emissão foi atribuída não ao MV2+

, mas a

traços de oxo-viologênios (Esquema 19) presentes na amostra. Esses compostos podem

ser fomados a partir da incidência de luz e/ou calor na amostra e são altamente

fluorescentes.193

Esquema 19: Estruturas químicas do oxo – metil viologênio, composto formado a partir MV2+

por incidência de luz e/ou calor.

Para verificar a possível interação entre betanina (Bn) e metilviologênio (MV)

foram realizados experimentos de espectrofotometria de absorção e fluorescência pelo

método da variação contínua e experimentos de supressão de fluorescência. Os

experimentos foram realizados em água com as três fontes de betanina. Nos

experimentos de supressão de fluorescência, a concentração de Bn foi mantida fixa em

5 × 10–6

mol L–1

e a concentração de MV2+

(supressor) foi variada entre 0 e 500 × 10–6

mol L–1

. Como não há sobreposição entre o espectro de absorção de MV2+

com o

espectro de emissão da Bn a ocorrência de supressão deveria estar relacionada à

formação de um complexo não fluorescente entre Bn e MV2+

.

Nos ensaios de fluorescência acompanhou-se a emissão em 615 nm (λexc = 530

142

nm) para betanina pura e precipitada e 545 nm (λexc = 480 nm) para betanina comercial.

A intensidade da banda de emissão de betanina não diminui com o aumento da

concentração de metilviologênio no meio. Também não são observadas alterações no

perfil de absorção de betanina (Figura 40).

Figura 40: Gráficos de absorção e emissão (λexc = 530 nm (Bn pura e precipitada) e λexc = 480

nm (Bn comercial) de betanina pura, betanina precipitada e betanina comercial em

maltodextrina em dependência da concentração de metilviologênio (MV2+

) no meio.

Nos experimentos de espectrofotometria de absorção e fluorescência pelo

método da variação contínua foram utilizadas soluções de betanina pura, betanina

precipitada, betanina comercial e metilviologênio com a mesma concentração (5 × 10–6

mol L–1

). No método da variação contínua, também conhecido como método do gráfico

de Job,194

a soma das concentrações de Bn e MV2+

são mantidas constantes na solução e

a proporção relativa entre elas é variada. A propriedade mais utilizada nesses estudos é

a absorção, mas qualquer propriedade que apresente uma correlação linear com as

concentrações de Bn e MV2+

pode ser utilizada. A partir da construção de um gráfico

contendo ΔAbs (diferença entre absorção de Bn na ausência e na presença de MV2+

) em

143

um determinado comprimento de onda (λx) no eixo y e fração molar no eixo x, pode-se

determinar qualitativamente a estequiometria do complexo formado pelo máximo da

curva obtida.195

Para os experimentos de absorção, o comprimento de onda acompanhado foi 536

nm para betanina pura e precipitada e 531 nm para betanina comercial. Para os

experimentos de fluorescência, o comprimento de onda acompanhado foi 615 nm para

betanina pura e precipitada e 545 nm para betanina comercial. Os gráficos de Job para a

absorção de betanina precipitada e betanina comercial resultaram em uma dispersão de

pontos, indicando que não há a formação de complexo no estado fundamental. Os

gráficos de Job para a emissão apresentam-se em forma de uma parábola com a

concavidade voltada para baixo, sugerindo a formação de um complexo. Além disso, o

ponto máximo da parábola encontra-se fixado em MV = 0,5, mostrando que o complexo

formado possui estequiometria 1:1 (Figura 42). Os gráficos de absorção e emissão de

betanina precipitada e betanina comercial utilizados para a construção dos gráficos de

Job encontram-se no Anexo 9.

É importante ressaltar que para o monitoramento por fluorescência, a equação

que descreve a formação de um complexo 1:1 entre duas espécies é idêntica à equação

de Stern-Volmer, sendo, portanto, impossível determinar, a priori, a constante de

estabilidade do complexo. Contudo, a análise do gráfico de Job para a fluorescência

mostra que a adição de MV2+

aumenta a emissão de Bn ao invés de resultar em

supressão.

144

Figura 41. Espectros de absorção e emissão de betanina na presença de paraquat.

Figura 42: Gráficos de Job de absorção e emissão (λexc = 530 nm (Bn pura e precipitada) e λexc

= 480 nm (Bn comercial)) de betanina pura, betanina precipitada e betanina comercial em

dextrina. A absorção foi acompanhada em 536 nm (Bn pura e precipitada) e 531 nm (Bn

comercial). A fluorescência foi acompanhada em 615 nm (Bn pura e precipitada) e 545 (Bn

comercial).

A adição de paraquat provoca o aumento da fluorescência de Bn, o que está de

acordo com um eventual aumento da rigidez desta betalaína pela sua interação com

paraquat. O tratamento para obtenção do gráfico de Job foi aplicado para toda a curva

145

de emissão, de forma a obter o espectro diferencial da espécie formada quando paraquat

e Bn estão na proporção 1:1 (Figura 43). Em cada espectro foi realizado tratamento que

dá origem à análise do método de variação contínua, ou seja, as intensidades em 615 nm

do último gráfico correspondem aos valores do gráfico de Job da figura anterior. A

partir dessa análise é possível observar a presença de uma banda de emissão com

intensidade baixa no último gráfico, o que corrobora com a possível formação de um

complexo fracamente fluorescente entre Bn e MV2+

.

146

Figura 43: Espectros de emissão de Bn nas condições do experimento para obtenção do Job

Plot em água.

3-3.2.1. Efeito do oxigênio sobre a cinética de fotodecomposição de Bn e MV2+

Em solução aquosa, metilviologênio em sua forma oxidada (MV2+

) pode ser

reduzido ao cátion radicalar (MV•+

) através da incidência de luz na região do

ultravioleta. Na presença de oxigênio, essa reação é deslocada para a formação de

147

MV2+

, porém, em atmosfera inerte, MV•+

apresenta-se estável durante horas. Estudos de

absorção e fluorescência foram realizados na presença e na ausência de O2 para verificar

a formação de MV•+

e sua interação com Bn. Foram utilizadas soluções aquosas de

betanina pura (5 × 10–6

mol L–1

), metilviologênio (5 × 10–6

mol L–1

) e Bn na presença

de MV2+

na proporção 1:1 (v/v) (2,5 × 10–6

mol L–1

). Foram registrados os espectros de

absorção, emissão (λexc(Bn) = 530 nm) e excitação (λem(Bn) = 615 nm) das amostras. Pode-

se observar o deslocamento batocrômico de 4 nm da banda de absorção de

metilviologênio na presença de betanina, o que demonstra um aumento de

deslocalização de carga no sistema, o que sugere a presença de interação entre Bn e

MV2+

. Os espectros de emissão (λexc = 530 nm) e excitação (λem = 615 nm) da solução

de betanina na presença de metilviologênio são a soma dos espectros individuais de

cada um dos compostos.

Após a caracterização do sistema, as soluções aquosas de Bn, MV2+

e Bn na

presença de MV2+

foram irradiadas com luz UV (λ = 254 nm) na presença de O2

durante 31 min e a cinética da reação foi acompanhada por espectrofotometria UV-vis.

A cinética de degradação de betanina pura foi acompanhada por 18 min, pois nesse

tempo houve degradação total da betalaína. Na Figura 44 pode-se observar o

deslocamento hipsocrômico de 16 nm da banda de absorção com máximo em 536 nm

nas soluções de Bn na ausência e na presença de MV2+

ao decorrer da cinética. Também

é possível observar o surgimento de uma banda de absorção em torno de 400 nm que

pode estar relacionada à formação de neobetanina por um processo de fotooxidação. A

banda de absorção de MV2+

com máximo em 258 nm sofre um deslocamento

batocrômico de 4 nm na presença de betanina. Além disso, os espectros de absorção de

MV2+

na ausência e na presença de betanina apresentam um ponto isosbéstico em

148

aproximadamente 300 nm.

Na ausência de O2, o perfil de absorção de betanina e metilviologênio durante a

cinética com irradiação de luz na região do UV é semelhante ao observado na presença

de O2. Neste caso, as soluções aquosas de Bn, MV2+

e Bn na presença de MV2+

foram

irradiadas com luz UV (λ = 254 nm) durante 43 minutos. Na Figura 44 pode-se observar

o deslocamento hipsocrômico de 13 nm da banda de absorção com máximo em 536 nm

nas soluções de Bn na ausência e na presença de MV2+

ao decorrer da cinética. Também

é possível observar o surgimento de uma banda de absorção em torno de 400 nm que

pode estar relacionada à formação de neobetanina por um processo de fotooxidação. A

banda de absorção de MV2+

com máximo em 258 nm sofre um deslocamento

batocrômico de 2 nm na presença de betanina. Além disso, os espectros de absorção de

MV2+

na ausência e na presença de betanina apresentam um ponto isosbéstico em

aproximadamente 300 nm.

149

Figura 44: Espectros de absorção de betanina, metil viologênio e betanina na presença de metil

viologênio na proporção 1:1(v/v) em água em função do tempo de irradiação de luz (λ = 254

nm) na ausência e na presença de luz. tirr = 18 minutos para Bn e 31 minutos para MV2+

e a

mistura de Bn e MV2+

na presença de O2. tirr = 43 minutos na ausência de O2.

Dado o alto grau de sobreposição e complexidade de alguns espectros, decidiu-

se por realizar o tratamento cinético com os valores de intensidade obtidos por

espectroscopia de segunda derivada. Esta abordagem diminui efeitos de linha base e

150

sobreposição de bandas. Os espectros de segunda derivada são apresentados na Figura

45.

Figura 45: Segunda derivada dos espectros de absorção UV-Vis para Bn, MV2+

e Bn+ MV2+

em

função do tempo.

Os perfis cinéticos na presença e ausência de O2 são apresentados na Figura 46.

Para a reação de degradação de betanina em água, os máximos de absorção versus

151

tempo foram ajustados com uma função monoexponencial para determinar o valor da

constante cinética observada, kobs A reação segue uma cinética de primeira ordem com

kobs de 0,8 × 10–1

min-1

, correspondendo a um tempo de vida (t1/2 = 8,2 min). Na

presença de metilviologênio, betanina apresenta um comportamento diferente. Até 14

minutos de irradiação, o sistema parece seguir uma cinética de ordem zero e, a partir

desse tempo, passa a seguir uma cinética de primeira ordem com kobs de 1,5 × 10–1

min-1

e t1/2 = 4,6 min. Esse perfil de decaimento sugere a ocorrência de uma reação de ordem

zero catalisada, por exemplo, por metilviologênio.

O perfil de degradação de metilviologênio em água parece seguir uma cinética

de ordem zero, mas na presença de betanina são observadas mudanças nesse perfil. Até

11 min de irradiação, os valores de absorção em 258 nm são constantes e, a partir desse

ponto, o sistema passa a seguir uma cinética de ordem zero.

Apesar de possuirem perfis de absorção semelhantes, os experimentos realizados

em atmosfera inerte apresentam decaimentos e valores de constante cinética diferentes

dos obtidos na presença de O2. Para a reação de degradação de betanina em água e

betanina na presença de metilviologênio, os máximos de absorção versus tempo foram

ajustados com uma função monoexponencial para determinar o valor da constante

cinética observada, kobs. As reações seguem uma cinética de primeira ordem com kobs de

0,55 × 10–1

min-1

, correspondendo a um tempo de vida (t1/2 = 12,4 min) para betanina

pura e kobs de 0,64 × 10–1

min-1

(t1/2 = 10,8 min) para betanina na presença de

metilviologênio.

O perfil de degradação de metilviologênio em água segue uma cinética de ordem

zero até 26 min. Após esse tempo, a absorção parece ficar constante. Na presença de

betanina, os valores de absorção em 258 nm são constantes até aproximadamente 6

152

minutos e, a partir desse ponto, o sistema passa a seguir uma cinética de ordem zero.

Os resultados sugerem que na ausência de O2, a fotodegradação de betanina não

é afetada por paraquat. Contudo, após 20 min de reação paraquat atinge o equilíbrio

enquanto na presença de Bn este herbicida continua se degradando, sugerindo que o

produto de degradação da Bn possa reagir de alguma forma com paraquat. Na presença

de oxigênio ocorre um processo mais complexo no qual MV2+

ou um produto de

fotodegradação catalisa a decomposição de Bn, mas o paraquat tem um certo período de

latência para sua decomposição. Esse resultado poderia ser racionalizado considerando-

se o equilíbrio entre a forma oxidada MV2+

e o radical cátion de MV, que é deslocado

para esquerda pelo O2, que é convertido em ânion superóxido (que pode destruir Bn).

Da mesma forma como na ausência de O2, o produto de degradação da Bn parece

catalisar a decomposição de MV após 15 min de reação.

Figura 46: Monitoramento da variação da absorção nos comprimentos de onda máximo da Bn

(542 nm após segunda derivada) e MV2+

(259 nm depois da segunda derivada) em função do

tempo para Bn pura, MV2+

puro e misturas entre os dois.

153

3-3.2.2. Tentativa de caracterização do complexo Bn-MV2+ por espectroscopia de

RMN

Como os experimentos realizados com betanina pura sugeriram a formação de

um complexo no estado fundamental, estudos de ressonância magnética nuclear foram

realizados para verificar possíveis mudanças ou deslocamentos de sinais nos espectros

de 1H de betanina e metilviologênio.

Também foram realizados experimentos de NOESY para verificar uma possível

interação entre os hidrogênios dos dois compostos. Primeiramente, 0,88 mg de betanina

pura (0,86 × 10–6

mol) foi solubilizado em 600 µL de D2O e um espectro de 1H-RMN

foi registrado em um equipamento operando em uma frequência de 500 MHz. Solução

concentrada de MV2+

(6,5 × 10–3

mol L-1

) em D2O foi adicionada ao tubo em diferentes

proporções até os sinais correspondentes ao MV2+

apresentarem intensidade semelhante

aos sinais da betanina. Ao atingir 0.3 equiv. de MV2+

em relação à Bn, as intensidades

dos sinais tornaram-se equivalentes. Para cada concentração de MV2+

foi registrado um

espectro de 1H.

Na Figura 47 pode-se observar ampliações do espectro de Bn na ausência de

MV2+

e na presença de 0,15 e 0,30 equiv. de MV2+

. O aumento da concentração de

metilviologênio resulta no deslocamento dos sinais referentes aos hidrogênios H-1’, H-

2, H-4, H-7, H-14 a/b e H-15 da betanina. Em todos os casos, os picos deslocaram para

região de campo alto, sendo que o H-2 apresentou o maior deslocamento; 0,01 ppm. O

pico referente ao H-15 se sobrepõe com um singleto referente aos hidrogênios do grupo

metila do MV2+

. Os sinais do MV2+

não apresentaram deslocamento.

154

Figura 47: Comparação dos deslocamentos químicos (δ) de 1H de betanina pura em água na

ausência de MV2+

e na presença de 0,15 e 0,30 equivalentes de MV2+

. Destaque para os

hidrogênios 4, 7, 2, 1’, 14 a/b e 15.

Para verificar a formação do complexo, o sistema foi irradiado com luz visível

durante 5 minutos. Não foi verificada mudança nos deslocamentos químicos do espectro

de 1H. Para verificar uma possível interação entre os hidrogênios de betanina e os

hidrogênios de metilviologênio foi realizado um experimento de NOESY (Figura 48).

Não foi possível observar no espectro alguma correlação entre os sinais das duas

moléculas. As correlações apresentadas no mapa correspondem apenas aos hidrogênios

de cada molécula interagindo entre si separadamente.

155

Figura 48: Espectro de NOESY 2D de Bn na presença de 0,3 equivalente de MV2+

em D2O

após irradiação de luz visível durante 5 minutos, 500 MHz.

156

3-5. Conclusão

Betanina e paraquat são compostos com grande diferença em seus potenciais

redox, sendo amplamente doadores (no estado fundamental) e aceptores de elétron (no

estado excitado). O estudo do efeito da concentração de paraquat sobre a fluorescência

de betanina sugere a formação de um complexo fracamente fluorescente, que

possívelmente tem características de transferência de carga. Na presença de irradiação

com luz ultravioleta, observa-se a decomposição tanto da betanina quanto do paraquat,

com constantes cinéticas que dependem da presença ou ausência de oxigênio. Contudo,

a decomposição de Bn se torna mais lenta na presença de paraquat quando O2 está

dissolvido em solução. Experimentos de espectroscopia de RMN foram realizados para

caracterizar a interação entre os compostos. Embora ocorra deslocamento dos sinais de

H específicos, não há NOE entre Bn e MV2+

, eventualmente pela baixa concentração de

complexo formado nas condições do experimento. Desta forma, embora não sejam

conclusivos, os resultados sugerem que betanina, ou algum produto de sua

decomposição, catalisa a transformação de MV2+

, conforme monitorado por

espectroscopia de absorção. Este resultado oferece as bases para estudos mais

elaborados para a aplicação do par betanina/paraquat em células a combustível.

157


As substâncias químicas utilizadas nesta parte do trabalho estão listadas na

Tabela 13.

Tabela 13: Reagentes e solventes utilizados no trabalho.


Acetonitrila MeCN Tedia HPLC

Ácido clorídrico concentrado HCl Synth 36,5-38%

Ácido fórmico HCOOH Fluka >98%

Água deuterada D2O S.A.

≥99.9%

átomos D

Betanina comercial em dextrina abcr GmbH

Dicloreto de metilviologênio

hidratado

MV2+

S.A. 98%

Etanol EtOH Synth 99,5%

Isopropanol i-PrOH Synth 99,5%

S.A.: Sigma Aldrich

Obtenção e purificação de betanina

Foram usadas três fontes de betanina: suco de beterraba em pó diluído com

dextrina (amostra A), betanina precipitada de suco de beterraba (amostra B) e betanina

purificada por HPLC (amostra C).

Betanina precipitada de suco de beterraba

Betanina foi obtida a partir do suco de beterrabas vermelhas. Beterrabas foram

processadas em uma centrífuga de alimentos tipo juicer. O suco obtido foi centrifugado

158

(10 min, 5 °C, 7.000 ×g) e o sobrenadante foi filtrado por uma camada de sílica gel de 2

cm em um funil de Buchner de 10 cm de diâmetro ligado a um kitassato conectado a

uma trompa de vácuo. O pH do filtrado foi levado a 2 com a adição de HCl

concentrado. A solução resultante foi transferida para um tubo falcon (5 mL) e

adicionaram-se 10 mL de isopropanol (volume final 15 mL, proporção 2:1 v/v). A

solução foi congelada a –72 ºC em um banho de etanol e gelo seco e mantida por quatro

dias a –20 ºC na ausência de luz para garantir a ruptura de todas as células vegetais.

Após esse período, os tubos foram descongelados e, quando atingiram 5 ºC, as soluções

foram centrifugadas (15 min, 5 °C, 5.000 ×g). O precipitado foi ressuspendido em

etanol (5 mL) e a suspensão foi submetida a centrifugação (10 min, 5 °C, 5.000 ×g). O

precipitado magenta foi dissolvido em água (5 mL) e a solução foi centrifugada (5 min,

5 °C, 5.000 ×g). O sobrenadante foi separado e liofilizado, resultando em betanina

bruta. Rendimento: 100 mg de betanina a cada 500 ml (aproximadamente 1,5 kg

beterraba) de suco.

Betanina purificada por HPLC

Betanina obtida pelo processo de precipitação foi purificada por HPLC em

condições de fase reversa e escala semi-preparativa em um equipamento Shimadzu 20A

equipado com detector PDA SPD20A, nas condições: coluna de Sílica C-18 Luna (5µm,

250 x 10 mm, Phenomenex), em condição isocrática de 10% de B em 40 minutos com

fluxo de 3 mL min-1

. A mistura de solvente utilizada foi solvente A: 0,05% ácido

fórmico em água e solvente B: 0,05%TFA em acetonitrila e a corrida foi acompanhada

em 254 nm. As frações correspondentes a BtP foram coletadas entre 19,7 min e 20,7

min. As frações coletadas foram analisadas por espectrofotometria UV-vis e HPLC

analítico.

159


Betanina purificada foi analisada por HPLC analítico em um equipamento

Shimadzu 20A equipado com detector PDA SPD20A em fase reversa, nas condições:

C18 Ascentis ® (250 x 4,6 mm, Supelco), em modo isocrático 20% de B e15 minutos,

com fluxo de 1 mL min-1

detecção em λmax = 254 nm e 536 nm. A mistura de solventes

utilizada foi solvente A: 0,05% ácido fórmico em água e solvente B: 0,05% ácido

fórmico em acetonitrila. Os dados foram obtidos utilizando o programa de aquisição

LCSolution.

Caracterização estrutural

A caracterização estrutural da betanina pura foi realizada por espectroscopia de

ressonância magnética (RMN), realizada na Central Analítica do IQ-USP e por


positivo (MS(ESI+)), realizada no laboratório do Professor Doutor Thiago Carita

Correra.

Espectrometria de ressonância nuclear magnética

O experimento de RMN de 1H foi obtido a 25°C em espectrômetro Bruker

Avance III 500, operando a 500,13 MHz, equipado com uma sonda de tripla

ressonância (TXI) de 5mm com detecção inversa. Para a análise de betanina, cerca de 5

mg de Bn foi solubilizada em 700 µL de D2O. Os ensaios de 1H foi realizado com as

soluções em tubos de 5mm, com ns = 256, td = 64K, ds = 0.

Espectrometria de massas por injeção direta

A análise por espectrometria de massas foi realizada em modo positivo em um

160

espectrômetro de massas do tipo ion trap (Amazon SL - Bruker) modificado para

realização de espectroscopia de íons (IRMPD). As amostras foram analisadas por

injeção direta (180 uL/h) e a fonte de íons mantida a 4500 V em relação ao terra, o gás

de nebulização em 7.24 psi e o gás de secagem 4 L/min. A unidade de dessolvatação foi

mantida a 180 ºC. Os espectros foram adquiridos no modo de alta resolução (Δm à

largura total do pico na metade de sua altura máxima - FWMH < 0,2) com 50

varreduras.

Caracterização fotofísica de betanina

Espectrometria de absorção, emissão e excitação.

Os espectros de absorção foram realizados em um espectrofotômetro Varian

Cary Bio 50 e os espectros de emissão e excitação foram realizados em um

espectrofotômetro Varian Cary Eclipse. Os espectros foram adquiridos em água em

cubeta de quartzo de 3 mL com caminho ótico de 1 cm. Os parâmetros utilizados para

os espectros de emissão e excitação de betanina precipitada e betanina pura foram,

respectivamente, λexc = 530 nm, fex = fem = 20 nm, tensão = 600 V e λem = 615 nm, fex =

fem = 20 nm, tensão = 600 V. Os parâmetros utilizados para os espectros de emissão e

excitação de betanina comercial em dextrina foram, respectivamente, λexc = 480 nm, fex

= fem = 20 nm, tensão = 600 V e λem = 545 nm, fex = fem = 20 nm, tensão = 600 V.

Interação entre betanina e metilviologênio

Espectroscopia de absorção e emissão de betanina na presença de paraquat

O estudo de interação entre betanina e metilviologênio foi divido em duas

partes; supressão de fluorescência da betanina pelo metilviologênio e estudos de

161

absorção e emissão pelo método da variação contínua. Para os estudos de supressão de

fluorescência, a concentração de Bn foi mantida fixa na cubeta (Vf = 2 mL) em 5 × 10–6

mol L-1

, a partir de uma solução estoque 1 × 10–5

mol L-1

. A concentração de MV foi

variada de 5 × 10–6

mol L-1

a 500 mol L-1

(Tabela 14), a partir de uma solução estoque

de metilviologênio (5 × 10–2

mol L-1

). Nos estudos pelo método da variação contínua, as

concentrações de Bn e MV na cubeta foram mantidas fixas em 5 × 10–6

M e a fração

molar de cada um deles foi variada (Tabela 15 e Tabela 16). Os experimentos foram

realizados em água. As medidas de absorção e emissão foram realizadas em cubetas de

quartzo de 3 mL com caminho ótico de 10 mm em um espectrofotômetro Varian Cary

Bio 50 e um espectrofotômetro Varian Cary Eclipse, respectivamente. Para cada

concentração de MV foram registrados um espectro de absorção em uma faixa de

varredura de 200 – 700 nm e espectros de emissão (λexc = 525 nm (betanina pura e

betanina precipitada) e 480 nm (betanina comercial), fexc = 10 nm, fem = 20 nm, tensão =

600 V).

Tabela 14: Variação da concentração de metilviologênio utilizada nos estudos de supressão de

fluorescência de betanina.


)

0,2 1 × 10–6

0,6 3 × 10–6

1 5 × 10–6

1,4 7 × 10–6

1,8 9 × 10–6

2,2 11 × 10–6

2,6 13 × 10–6

162

3 15 × 10–6

100 500 × 10–6

Tabela 15: Variação da fração molar de Bn e MV2+

nos experimentos de absorção e emissão

pelo método da variação contínua realizados com betanina pura e betanina precipitada.

Fração molar Bn Volume de Bn (µL) Fração molar MV2+

Volume de MV2+

(µL)

1 2000 0 0

0,75 1500 0,25 500

0,5 1000 0,5 1000

0,25 500 0,75 1500

0 0 1 2000

Tabela 16: Variação da fração molar de Bn e MV2+

nos experimentos de absorção e emissão

pelo método da variação contínua realizados com betanina comercial em dextrina.

Fração molar Bn Volume de Bn (µL) Fração molar MV2+

Volume de MV2+

(µL)

1 2000 0 0

0,875 1750 0,125 250

0,75 1500 0,25 500

0,625 1250 0,375 750

0,5 1000 0,5 1000

0,375 750 0,625 1250

0,25 500 0,75 1500

0,125 250 0,875 1750

0 0 1 2000

Efeito do oxigênio sobre a cinética de fotodecomposição de Bn e MV2+

Soluções aquosas de betanina pura (5 × 10–6

M), metil viologênio (5 × 10–6

M) e

Bn na presença de MV2+

na proporção 1:1 (v/v) (2,5 × 10–6

M) foram irradiadas com luz

na região do ultravioleta (λ = 254 nm) na ausência e na presença de oxigênio. As

soluções utilizadas para realizar os experimentos na ausência de O2 foram purgadas com

163

N2(g), transferidas para a cubeta de quartzo e tampadas logo em seguida. Espectros de

absorção foram registrados durante 31 minutos para os experimentos realizados na

presença de O2 e 43 minutos na ausência de O2. Foram registrados os espectros de

absorção, emissão (λexc(Bn) = 530 nm), excitação (λem(Bn) = 615 nm) e sincronizado (Δ =

50 nm) das amostras antes e após a irradiação das soluções. As medidas de absorção,

emissão e excitação foram realizadas em cubetas de quartzo de 3 mL com caminho

ótico de 10 mm em um espectrofotômetro Varian Cary Bio 50 e um espectrofotômetro

Varian Cary Eclipse, respectivamente. Os espectros de absorção foram adquiridos em

uma faixa de varredura de 200 – 700 nm e espectros de emissão, excitação e

sincronizado foram adquiridos nas seguintes condições; fexc = 20 nm, fem = 20 nm,

tensão = 600 V.

Tentativa de caracterização do complexo Bn-MV2+ por espectroscopia de RMN

Para o estudo da interação entre Bn e MV2+

por espectrometria de ressonância

magnética nuclear foram realizados experimentos de RMN de 1H e NOESY 2D Os

experimentos de RMN de 1H foram obtidos a 25°C em espectrômetro Bruker Avance

III 500, operando a 500,13 MHz, equipado com uma sonda de tripla ressonância (TXI)

de 5mm com detecção inversa. Os ensaios de 1H foram realizados com as soluções em

tubos de 5mm, com ns = 256, td = 64K, ds = 0.

Primeiramente, 0,88 mg de Bn (0,86 × 10–6

mol) foi solubilizado em 600 µL de

D2O e um espectro de 1H foi registrado. Solução concentrada de MV

2+ (6,5 × 10

–3 mol

L-1

) em D2O foi adicionada ao tubo em diferentes proporções até que a intensidade dos

sinais de MV2+

fossem semelhantes às observadas para Bn e algum deslocamento dos

sinais fosse observado, no caso 0,30 equivalentes. Para cada concentração de MV2+

foi

registrado um espectro de 1H. Ao atingir 0,3 equivalentes de MV

2+ em relação a Bn,

164

também foi registrado um espectro bidimensional NOESY (noesygpphpr) com ns = 32,

ds = 32, td = 2048 x 512.

165

Conclusão Geral

Nesta tese foram realizados estudos da interação de betalaínas naturais com

diferentes classes de compostos químicos. As consequências destas interações foram

interpretadas de forma a entender as funções de betalaínas em plantas e para

desenvolver aplicações que dependam de processos fotoredox e da estabilização destas

betalaínas.

No Capítulo 1, betanina foi encapsulada em emulsões A/O/A usando a técnica

de emulsificação por microcanais (MCE). As emulsões formuladas apresentaram-se

monodispersas e podem ser utilizadas na preparação de alimentos funcionais mantidos

sob refrigeração por, pelo menos, 7 dias. Além disso, essas emulsões possibilitam a

utilização de betanina em formulações hidrofílicas.

No Capítulo 2 observou-se a supressão de fluorescência de MMF na presença de

BtP. O mecanismo pelo qual essa supressão ocorre mostrou-se dependente do meio e os

experimentos sugerem que a supressão estática seja mais relevante, ocorrendo a

formação de um complexo entre as espécies. Em etanol, a interação entre estas espécies

e água leva a decomposição do MMF, o que pode ser relevante no contexto da interação

de antocianinas e betalaínas in vivo.

No Capítulo 3, o estudo do efeito da concentração de paraquat sobre a

fluorescência de betanina sugere a formação de um complexo com características de

transferência de carga. Além disso, estudo cinético de fotodecomposição de betanina e

paraquat sugere que betanina interfere na regeneração da forma oxidada do paraquat por

oxigênio. Este resultado oferece as bases para estudos mais elaborados para a aplicação

do par betanina/paraquat em células a combustível.

166

Referências

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um líquido (e.g., uma solução) e da água pura na mesma temperatura, i.e., aW = 1

indica água pura e aW = 0 indica ausência de água "livre".

70. Persistência se refere a uma espécie com tempo de vida longo e está associada

com a cinética de reação, i.e., a barreira de ativação para qualquer reação é alta. Desta

forma, a persistência é bastante dependente do contexto (meio) no qual a substância está

submetida. Estabilidade por outro lado é um conceito termodinâmico intrínseco de uma

dada substância em relação a um referencial. Portanto, dizer que uma substância é

estável não significa dizer que seu tempo de vida é longo em termos absolutos, mas que

a variação de energia livre para sua transformação em um composto referência instável

é maior que zero.

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186


187

Súmula Curricular

I DADOS PESSOAIS

Nome: Ana Paula Eskildsen Pagano

Local e data de nascimento: São Paulo – SP, 01 de maio de 1989

II EDUCAÇÃO

Universidade de São Paulo, SP, 2012, Bacharel em química com atribuições

tecnológicas e biotecnológicas

III FORMAÇÃO COMPLEMENTAR

Não possui

IV ATIVIDADES ACADÊMICAS

IV.I Estágios de monitoria acadêmica realizados no Instituto de Química – USP

Período

Disciplina

Curso de graduação

Supervisor

1° semestre de 2014 (bolsista PAE)

QFL 0350 - Química Orgânica

Bacharelado em Ciências Biomédicas

Prof. Dr. Erick Leite Bastos

Período

Disciplina

Curso de graduação

Supervisor

2° semestre de 2013

QFL 2343 - Química Orgânica

Experimental

Bacharelado em Química

Prof. Dr. Josef W. Baader

V. PUBLICAÇÕES

V. I. Artigos completos publicados em periódicos

Gonçalves, L. C. P.; Marcato, A. C.; Rodrigues, A. C. B.; Pagano, A. P. E.; Freitas, B.

C. de; Machado, C. de O.; Nakashima, K. K.; Esteves, L. C.; Lopes, N. B.; Bastos, E. L.

Betalains: from the Colors of Beetroots to the Fluorescence of Flowers. Rev. Virtual.

Quim. 2014, 7, p. 292-309.

Bartoloni, F. H.; Ciscato, L. F. M. L.; Peixoto, M. M. M.; Santos, A. P. F.; Santos, C.

S.; Oliveira, S.; Augusto, F. A., Pagano, A. P. E.; Baader, W. J.; Bastos, E. L. Luz: um

raro produto de reação. Química Nova 2011, 34, p. 544–554.

188

V. II. Trabalhos publicados em anais de congressos (resumos)

PAGANO, A. P.; MACHADO, C. O.; SILVA, C. P.; QUINA, F. H.; BASTOS, E.L. A

chemical model for the mutually exclusive occurence of anthocyanins and betalains in

plants. In: XII Encontro latino-americano de fotoquímica e fotobiologia, 2015,

Maresias. ELAFOT, 2015.

PAGANO, A. P.; ESTEVES, L. C.; MACHADO, C. O.; RODRIGUES, A. C. B.;

WATTS, C.; BASTOS, E.L. Semisynthesis and theorethical study of betalains. In: 49th

International Union of Pure and Applied Chemistry, 2017, São Paulo. IUPAC, 2017.

PAGANO, A. P.; BASTOS, E.L. Estabilização de indicaxantina em hidrogel de

polivinilpirrolidina. In: 37ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2014,

Natal. SBQ, 2014. p.FOT-011.

VI OUTRAS INFORMAÇÕES RELEVANTES

VI I. Estágios de pesquisa realizados durante o doutorado

Maio/2015 a Julho/2015: Faculty of Life and Environmental Sciences, Universidade de

Tsukuba sob orientação do Prof. Marcos Neves e The Food Research Institute (NFRI),

Tsukuba, sob supervisão do aluno de doutorado Nauman Khalid.

189

Anexos

Anexo 1: Imagens registradas com câmera digital das emulsões A/O formuladas com

emulsificante hidrofóbico CR-310 nas concentrações 2, 4 e 8 % (m/m).

Anexo 2: Medidas de diâmetro médio das gotas (A) e distribuição do tamanho das gotas

geradas (B) em dependência do fluxo da fase dispersa da microemulsão A/O/A contendo

betanina extraída de beterraba. (C) Imagens de geração de gotas por microcanais das

microemulsões A/O/A da amostra de betanina comercial em dextrina em dependência do fluxo

da fase dispersa.

190

Anexo 3: Imagens registradas com câmera digital das emulsões A/O (esquerda) e A/O/A

(direita) das amostras de betanina comercial (A), betanina pura (B) e suco de beterraba em pó

(C).

Anexo 4: Imagens de geração de gotas por microcanais das microemulsões A/O/A contendo

betanina comercial em maltodextrina (A), betanina pura (B) e suco de beterraba em pó (C).

Anexo 5: Medidas de diâmetro médio das gotas (A) e distribuição do tamanho das gotas

geradas (B) variando-se o fluxo da fase dispersa da microemulsão A/O/A contendo betanina

pura.

191

Anexo 6: Medidas de diâmetro médio das gotas e valores de RSF (entre parênteses) da

emulsão A/O/A controle e das emulsões A/O/A contendo betanina comercial, betanina extraída

de beterraba e suco de beterraba a 4 °C, 25 °C e 60 °C ao longo dos 7 dias de ensaio de

estabilidade.

Anexo 7: Variação dos valores dos parâmetros de cor a* e b* correspondentes ao espaço de

cor CIELAB de acordo com a variação de temperatura das emulsões A/O e A/O/A contendo

betanina comercial, betanina pura e suco de beterraba em pó.

a* b*

4 °C 25 °C 60 °C 4 °C 25 °C 60 °C

Betanina

comercial

Controle 31 ± 0 28.7 ± 0.6 0 ± 0 9 ± 1.7 6 ± 1 11 ± 1

A/O 5 ± 0 4.7 ± 0.6 1.3 ± 0.6 0 ± 0 2.7 ± 0.6 5.3 ± 0.6

A/O/A - 0.7 ± 1.2 -3.7 ± 0.6 -2 ± 2 -2 ± 0 0 ± 1 5.7 ± 0.6

Betanina

pura

Controle 2 ± 0 2.7 ± 0.6 11 ± 2.6 -0.3 ± 0.6 -0.3 ± 0.6 2.3 ± 0.6

A/O 68 ± 0 73.3 ± 0.6 20.7 ± 0.6 -41 ± 1 -34 ± 0 20 ± 0

A/O/A 31.3 ± 1 32 ± 0 0.7 ± 0 -10 ± 0 -8.3 ± 0.6 6.3 ± 0.6

Suco de

beterraba

Controle 28.7 ± 0.6 30.3 ± 0.6 2 ± 1.7 13.7 ± 1.5 17.7 ± 1.5 21.3 ± 0.6

A/O 21.7 ± 0.6 20 ± 0 2 ± 1 -1.3 ± 0.6 2.7 ± 0.6 11.3 ± 1.1

A/O/A 1.3 ± 0.6 -1.3 ± 0.6 0.7 ± 1.2 1 ± 0 3 ± 0 4 ± 0

Controle Betanina comercial

Betanina pura

Suco de beterraba

4 °C

Dia 1

51,7 ± 0,59 (0,29 ± 0,01)

43,4 ± 0,26 (0,22 ± 0,01)

45,8 ± 0,29 (0,21 ± 0,01)

72,4 ± 0,40 (0,58 ± 0,01)

Dia 7

53,9 ± 0,24 (1,73 ± 0,05)

47,6 ± 0,14 (0,21 ± 0,00)

49,40 ± 0,38 (0,23 ± 0,00)

75,6 ± 1,65 (0,72 ± 0,01)

25 °C

Dia 1

46,1 ± 0,05 (0,38 ± 0,05)

41,6 ± 0,1 (0,21 ± 0,0)

44,4 ± 0,09 (0,22 ± 0,00)

75,2 ± 2,57 (0,77 ± 0,04)

Dia 7

30,5 ± 0,21 (0,26 ± 0,01)

33,1 ± 0,11 (0,24 ± 0,00)

31,1 ± 0,77 (0,21 ± 0,07)

27,0 ± 9,6 (0,74 ± 0,07)

60 °C

Dia 1

32,2 ± 0,18 (0,22 ± 0,04)

27,8 ± 0,72 (0,37 ± 0,22)

32,9 ± 0,78 (0,27 ± 0,02)

35,1 ± 1,7 (0,65 ± 0,01)

Dia 7

3,09 ± 0,02 (2,55 ± 0,04)

1,84 ± 0,01 (0,26 ± 0,01)

34,9 ± 0,41 (0,52 ± 0,01)

1,10 ± 0,01 (2,81 ± 0,34)

192

Anexo 8: Recorte das fotos das emulsões A/O e A/O/A contendo betanina comercial, suco de

beterraba e betanina mantidas a 4 ºC, 25 ºC ou 60 ºC por 7 dias. As imagens foram adquiridas

sob fundo preto e retratam o fundo dos frascos nos quais as emulsões foram mantidas durante

os 7 dias.

Anexo 9: Cromatograma de BtP acompanhado por UV-vis em 254 nm e 480 nm (coluna de

fase reversa C18, 250 ×4,6 mm; sistema cromatográfico: 0 – 20% B em 15 min, sendo o

solvente A: 0,05% H3COOH/água e solvente B: 0,05% H3COOH /acetonitrila com fluxo de 1 mL

min–1

.

193

Anexo 10: Espectro de massas de baixa resolução de indicaxantina em água.

235.06

309.161+

408.14 583.85 815.58

BtP_agua_modo positivo000.d: +MS

200 300 400 500 600 700 800 900 m/z0.0

0.5

1.0

1.5

7x10

Intens.

194

Anexo 11: Espectro de 1H-RMN de indicaxantina em D2O, 500 MHz.

195

Anexo 12: Espectro de correlação homonuclear 1H-

1H (COSY) de indicaxantina em D2O, 500 MHz.

196

Anexo 13: Espectro de massas de baixa resolução de MMF em água.

251.131+

322.24 479.63

MMF_agua(+)0.d: +MS

100 200 300 400 500 600 700 m/z0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

8x10

Intens.

197

Anexo 14: Espectro de 1H-RMN de MMF em C2D5OD , 500 MHz.

198

Anexo 15: Espectro de 1H-RMN de MMF em CD3OD , 500 MHz. O sinal com deslocamento químico 1,99 ppm refere-se a acetato presente na amostra.

199

Anexo 16: Espectro de 1H-RMN de MMF em D2O , 500 MHz. O sinal com deslocamento químico 2,09 ppm refere-se a acetato presente na amostra.

200

Anexo 17: Segunda derivada dos espectros de absorção (A) e emissão (λexc = 370 nm) (B) de

solução aquosa de MMF em pH 5 na ausência e na presença de diferentes concentrações de

BtP. Os gráficos a esquerda são referentes aos experimentos realizados com as soluções a 10-

5 mol L

-1 e os gráficos a direita são referentes aos experimentos realizados com as soluções a

10-6

mol L-1

.

Anexo 18: Espectro de absorção de etanol anidro antes (linha preta) e após contato com o

septo de borracha utilizado para tampar a cubeta.

201

Anexo 19: Espectros de emissão (λexc = 370 nm) de BtP na ausência e na presença de MMF

em diferentes concentrações em água (pH 5) (A), solução de água/etanol absoluto ≥99.8% 1:1

v/v (pH 5) (B) e etanol absoluto ≥99.8% (≤0.2% de água) (C).

202

Anexo 20: Segunda derivada dos espectros de absorção (A) e emissão (λexc = 370 nm) (B) de

solução de MMF em pH 5 na ausência e na presença de diferentes concentrações de BtP. Os

gráficos a esquerda são referentes aos experimentos realizados em solução aquosa e os

gráficos a direita são referentes aos experimentos realizados em solução de água/etanol

absoluto ≥99.8% 1:1 v/v (pH 5).

Anexo 21: Decaimentos do tempo de vida de emissão de fluorescência de MMF na ausência e

203

na presença de BtP em meio aquoso (pH 5) e solução de água/etanol absoluto ≥99.8% 1:1 v/v

(pH 5).

Anexo 22: Parâmetros dos ajustes mono-exponenciais dos decaimentos de emissão de MMF

na ausência e na presença de BtP em solução de água/etanol absoluto ≥99.8% 1:1 v/v (pH 5).

Amostra τFL (ns) 2

MMF 3,92 1,24

MMF + 0,1 eq. BtP 3,89 1,26

MMF + 0,5 eq. BtP 3,86 1,30

MMF + 1,0 eq. BtP 3,82 1,24

MMF + 1,5 eq. BtP 3,79 1,33

MMF + 2,0 eq. BtP 3,80 1,24

Anexo 23: Parâmetros dos ajustes mono-exponenciais dos decaimentos de emissão de MMF

na ausência e na presença de BtP em meio aquoso (pH 5).

Amostra τFL (ns) 2

MMF 4,61 1,30

MMF + 0,1 eq. BtP 4,59 1,23

MMF + 0,5 eq. BtP 4,47 1,29

MMF + 1,0 eq. BtP 4,37 1,35

MMF + 1,5 eq. BtP 4,30 1,30

MMF + 2,0 eq. BtP 4,22 1,43

204

Anexo 24: Espectro de NOESY 2D de MMF na presença de 1 equivalente de BtP em D2O (pD = 5), 500 MHz.

205

Anexo 25: Cromatogramas de betanina pura, betanina precipitada e betanina comercial obtidos em condições de fase reversa. C18 Ascentis ® (250 x

4,6 mm, Supelco), em modo isocrático 20% de B em15 minutos (Bn pura) e modo gradiente 5-60%B em 20 minutos (betanina precipitada e betanina

comercial), com fluxo de 1 mL min-1

detecção em λmax = 254 nm e 536 nm. A mistura de solvente utilizada foi solvente A: 0,05% ácido fórmico em água

e solvente B: 0,05% ácido fórmico em acetonitrila.

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