ANAIS DO VI SIMPÓSIO DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO...
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ANAIS DO VI SIMPÓSIO DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DO PROGRAMA DE PÓS- GRADUAÇÃO EM REPRODUÇÃO ANIMAL Pirassununga 2016 FMVZ-USP
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ANAIS DO VI SIMPÓSIO DE
PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
DO PROGRAMA DE PÓS-
GRADUAÇÃO EM REPRODUÇÃO
ANIMAL
Pirassununga 2016
FMVZ-USP
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Sumário dos Anais do VI Simpósio de Pesquisa e Pós-Graduação do Programa de
Pós-Graduação em Reprodução Animal
Sumário
Renata A. Abreu ........................................................................................................... 4
Leticia Lima de Almeida ................................................................................................ 6
Maíra Bianchi Rodrigues Alves ...................................................................................... 8
Daniel S. R. Angrimani ................................................................................................ 10
Marcel Henrique Blank ............................................................................................... 12
Maíra M. Brito ........................................................................................................... 14
Beatriz Cardoso.......................................................................................................... 16
Angela María Gonella-Diaza ........................................................................................ 18
Renato B. Flores ......................................................................................................... 20
Moana Rodrigues França ............................................................................................ 22
Nathália Souza Gomes ................................................................................................ 24
M. B. Justo ................................................................................................................. 26
Giulia Kiyomi Vechiato Kawai ...................................................................................... 28
João D.A. Losano ........................................................................................................ 30
Guilherme Madureira, ................................................................................................ 32
Thiago Martins........................................................................................................... 34
B.P. Mello .................................................................................................................. 36
Melissa O. Ferrin ........................................................................................................ 38
Rodolfo D. Mingoti, .................................................................................................... 40
M.L. Oliveira .............................................................................................................. 42
M. A. Passarelli .......................................................................................................... 44
Ana Paula P. Pavaneli ................................................................................................. 46
Naira C. G. Pieri .......................................................................................................... 48
Gisele M. Ravagnani ................................................................................................... 50
Derek Rosenfield ........................................................................................................ 54
Bruno Rogério Rui ...................................................................................................... 56
Bárbara C. S. Silva....................................................................................................... 58
Kauê Ribeiro da Silva .................................................................................................. 60
Giovana R. Silvestrini .................................................................................................. 62
3
Adriano F. P. Siqueira ................................................................................................. 64
Mariana Sponchiado .................................................................................................. 66
Mariana A. Torres ...................................................................................................... 68
Ana B. G. Vidal ........................................................................................................... 70
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Avaliação da função respiratória na transição feto-neonatal de cães nascidos em
eutocia via vaginal e cesariana eletiva
Renata A. Abreu, Leite, B.A., Brito, M.M., Angrimani, D.S.R., Veiga, G.A.L.,
Regazzi, F.M., Lúcio, C.F., Lima, L.A., Vannucchi, C.I.
Departamento de Reprodução Animal, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil.
Palavras chave: clearance pulmonar, eutocia, cesariana eletiva, neonatos, cães.
O sucesso da adaptação imediata para a vida extrauterina depende de apropriada função
pulmonar. Em Medicina, a cesariana eletiva, sem sinais de trabalho de parto, aumenta o
risco de angústia respiratória como resultado da diminuição da reabsorção do fluido
pulmonar1. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi comparar a função respiratória
nas primeiras 24 horas de vida de neonatos caninos nascidos de eutocia via vaginal ou
cesariana eletiva. Neonatos foram alocados em 2 grupos: eutocia via vaginal – EUT
(n=9) e cesariana eletiva –CES (n=8). Após a limpeza e remoção das secreções das vias
aéreas, foi realizada avaliação clínica pelo escore Apgar (0-10, adaptado para neonatos
caninos) e aferida a temperatura aos 0, 5 e 60 minutos depois do nascimento. As
frequências cardíaca e respiratória e a temperatura foram avaliadas também 12 e 24
horas após o nascimento. Hemogasometria venosa e lactatemia foram realizadas
imediatamente após o nascimento, 1, 12 e 24 horas. Radiografias torácicas foram
realizadas aos 5 minutos de vida, 12 e 24 horas. As interações entre grupos e tempo
foram analisadas através da ANOVA e os efeitos dos grupos foram analisados pelos
testes t de Student ou Wilcoxon (p≤0,05). Os neonatos do grupo CES apresentaram
menor vitalidade, com escore Apgar menor (5,8±0,5) que o grupo EUT (8,3±0,3). Aos
60 minutos, todos apresentaram escore Apgar satisfatório (8,6±0,4). O grupo CES
apresentou hipotermia ao nascimento (33,3±0,3ºC), enquanto o grupo EUT apresentou
aos 5 minutos (34,5±0,3ºC), persistindo, em ambos, até 60 minutos. O grupo CES
apresentou menor SO2 (19,5±1,2%), pO2 (14,3±0,8mmHg) e pH (7,2±0,02), mas valores
superiores de pCO2 (50,4±2,5mmHg), comparado ao grupo EUT (24,2±1%;
17,5±0,5mmHg; 7,3±0,01; 39,5±0,8mmHg, respectivamente). Tais resultados indicam
maior hipoxemia no grupo CES, como consequência de depressão cardiorespiratória
causada pelos medicamentos anestésicos ou pela diminuição do clearance do fluido
pulmonar. Ao nascimento, o grupo EUT apresentou significativamente maior frequência
respiratória (50,2±4,5mpm) e maiores valores de lactato (10±1 mmol/L) em comparação
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com o grupo CES (14,3±4,3 mpm; 6,4±0,8 mmol/L, respectivamente). Após 60
minutos, neonatos do grupo EUT apresentaram diminuição da frequência respiratória
(41,5±5,4mpm) e da concentração de lactato (4,1±0,5mmol/L), sendo esse valor menor
do que no grupo CES (5,9±1,2mmol/L). A combinação de hipóxia fisiológica durante o
nascimento e os esforços iniciais para o preenchimento dos alvéolos pulmonares com
oxigênio resultou em anaerobiose, com o desenvolvimento de acidose lática2. Os
achados radiográficos revelaram diferença significativa (p=0,04) entre os grupos, com
discreta a moderada opacificação difusa do parênquima pulmonar no grupo CES,
independentemente do momento da avaliação, demonstrando diminuição da reabsorção
do fluido pulmonar. Em conclusão, todos os neonatos caninos apresentaram hipóxia
tecidual ao nascimento, hipotermia aos 5 e 60 minutos e escore Apgar satisfatório na
primeira hora de vida. No entanto, os recém-nascidos de cesariana necessitaram de um
tempo maior para reabsorção do fluido pulmonar, comprometendo a função respiratória
inicial.
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Caracterização da hemodinâmica e vascularização uterina e da pressão arterial em
cadelas durante as fases do ciclo estral
Leticia Lima de Almeida, Isabela Bicudo Nogueira, Daniel de Souza Angrimani,
Maíra Morales Brito, Renata Azevedo de Abreu, Camila Infantosi Vannucchi
Departamento de Reprodução Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade de São Paulo.
Palavras chave: Ultrassonografia Doppler, ação hormonal, artéria uterina, Golden
Retriever.
A caracterização da fisiologia reprodutiva da cadela é de grande importância para o
desenvolvimento de biotecnologias aplicadas à reprodução na espécie. Neste tocante, a
ultrassonografia bidimensional uterina está bem definida. Entretanto, as modificações
hemodinâmicas e da vascularização uterina, assim como a pressão arterial durante o
ciclo estral, ainda não estão elucidadas. O objetivo deste estudo foi caracterizar a
hemodinâmica uterina e a pressão arterial ao longo das fases do ciclo estral em cadelas.
Para tanto, 10 fêmeas Golden Retriever, entre 1 e 6 anos de idade, foram avaliadas nos
seguintes momentos: proestro inicial (P1) e final (P2) (determinados a partir dos
primeiros sinais de cio e citologia vaginal); estro inicial (E1) e final (E2) (determinados
pela vaginoscopia e citologia vaginal); diestro intermediário (D1) e final (D2) (25 e 65
dias a partir do primeiro dia do diestro, respectivamente) e anestro intermediário (A1) e
final (A2) (125 e 175 dias a partir do primeiro dia do diestro, respectivamente). O
diâmetro (cm) e a vascularização uterina foram mensurados em modo B e Doppler
colorido, respectivamente. A artéria uterina, na altura do corpo uterino, foi avaliada em
modo Doppler pulsado quanto aos parâmetros hemodinâmicos (índice de resistência –
RI, índice de pulsatilidade – PI e relação sístole/diástole – S/D) e velocidade do fluxo
sanguíneo (velocidade máxima do pico da sístole – PS, velocidade máxima do pico da
diástole – ED e tempo médio da velocidade máxima – TAMAX). Os dados foram
analisados por ANOVA e teste LSD (p≤0,05). O PI foi menor durante o P1 em relação
ao E1, A1 e A2, demostrando aumento na perfusão da artéria uterina durante o proestro,
possivelmente influenciado pelo aumento da concentração de estradiol. O RI foi maior
durante o E1 em relação ao E2, indicando influência da diminuição do estrógeno
simultaneamente ao aumento de progesterona no início do estro. Portanto, os índices de
pulsatilidade e resistência da artéria uterina podem ser considerados marcadores
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hemodinâmicos da transição entre o proestro e o estro. O diâmetro uterino apresentou
variações ao longo do ciclo estral, sendo maior no P2, em relação ao D2, A1 e A2,
possivelmente devido à alta concentração de estrógeno durante o proestro. A pressão
arterial média foi menor durante o P2, quando comparada ao P1, E1, E2, A1 e A2, com
um efeito taquicárdico compensatório indicado por maior frequência cardíaca no P2, em
relação ao E1, E2 e D1. A vascularização uterina não apresentou diferença durante as
fases, indicando que o útero das cadelas não responde às variações hormonais com
neovascularização, como descrito em outras espécies. Em conclusão, alterações
hormonais, principalmente em relação ao estrógeno e progesterona, impõem alterações
na hemodinâmica uterina e na pressão arterial de cadelas. Ademais, a avaliação
ultrassonográfica em modo Doppler pode ser considerada uma ferramenta adicional nos
protocolos de diagnóstico do ciclo estral na espécie.
Agradecimentos: FAPESP 2015/05617-1
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CellROX Deep Red® e CellROX Orange® são eficientes para detecção de espécies
reativas de oxigênio em espermatozoides bovinos
Maíra Bianchi Rodrigues Alves¹, Rubens Paes de Arruda², Leonardo Batissaco¹,
Shirley Andrea Florez-Rodriguez¹, Vitor Hugo Guilger Gonzaga¹, Vinícius José
Moreira Nogueira¹, Laura Nataly Garcia-Oliveros¹, João Diego de Agostini Losano3,
Eneiva Carla Carvalho Celeghini¹
¹Laboratório de Ensino e Pesquisa em Patologia da Reprodução, Departamento de
Reprodução Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - USP,
Pirassununga, SP, Brasil
²Laboratório de Biotecnologia do Sêmen e Andrologia, Departamento de Reprodução
Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - USP, Pirassununga, SP,
Brasil
3Laboratório de Andrologia, Departamento de Reprodução Animal, Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia - USP, Pirassununga, SP, Brasil
Palavras chave: sêmen, touro, estresse oxidativo, sondas fluorescentes.
A presença de diferentes espécies reativas de oxigênio (ROS) em espermatozoides pode
indicar estresse oxidativo e auxiliar nos diagnósticos de infertilidade. O objetivo do
estudo foi avaliar a eficiência das sondas fluorescentes CellROX Deep Red®, que
detecta radical hidroxila e ânion superóxido, e CellROX Orange®, que detecta peróxido
de hidrogênio, radical hidroxila, óxido nítrico e ânions peroxinitrito e superóxido, na
identificação de ROS de espermatozoides bovinos. Foram usados quatro ejaculados,
com motilidade ≥70% e vigor ≥3, de quatro touros Nelore (n=16) divididos em três
tratamentos: T0 (sem indução de produção de ROS), T50 (50% de indução de produção
de ROS) e T100 (100% de indução de produção de ROS). Para a indução da produção
de ROS em T100 foram adicionados 100µL de sulfato de ferro 4mM, 100µL de ácido
ascórbico 20mM e 200µL de peróxido de hidrogênio 4mM a 400µL de sêmen diluído
em Tyrode’s albumin lactate pyruvate (TALP) (200.106 espermatozoides/mL) sendo a
solução incubada por 10 minutos a 37ºC com a tampa do tubo aberta. A indução de T50
seguiu o mesmo protocolo, adicionando metade dos volumes dos indutores. T0 foi
diluído em TALP (20.106 espermatozoides/mL) sendo, em seguida, adicionado
CellROX Deep Red® (C-Red; Molecular Probes) 5mM e 1µL de Hoescht 33342
(Molecular Probes) 0,5mg/mL a 100µL de T0 e CellROX Orange (C-Orange;
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Molecular Probes) 2,5mM e 1µL de Hoescht 33342 0,5mg/mL a outra alíquota de
100µL de T0. As sondas foram incubadas às amostras por 30 minutos a 37ºC. Ao final,
as amostras foram centrifugadas por 5 minutos a 600g e ressuspendidas em TALP.
Procedeu-se com a leitura de 200 células classificadas em sem ou com presença de ROS
em microscópio de epifluorescência (modelo 80i, Nikon, Tóquio, Japão). T50 e T100,
ao final da indução, foram centrifugados (600g/5 minutos) desprezando o sobrenadante.
A amostra foi ressuspendida em TALP ajustando a concentração para 20.106
espermatozoides/mL. Após, foi realizada a adição de C-Red e C-Orange seguindo o
mesmo protocolo de T0. Os dados obtidos foram convertidos em porcentagens e
submetidos à análise de variância (ANOVA), utilizando o teste de médias de Tukey. Os
dados obtidos de C-Red necessitaram de prévia transformação. A regressão polinomial
também foi realizada para a obtenção do coeficiente de determinação e da equação da
reta. Foi utilizado o programa SAS (SAS Institute Inc., 2004) sendo o nível de
significância de 5%. Os tratamentos mostraram-se diferentes tanto com C-Red
(P<0,0001) quanto com C-Orange (P<0,0001). Em T0, C-Red detectou 6,83±2,39%a
dos espermatozoides com ROS; em T50, 31,06±3,22%b; e em T100, 46,68±5,67%b. C-
Orange detectou 51,06±7,08%a em T0, 94,37±1,06%b em T50 e 97,50±0,58%b em
T100. O coeficiente de determinação (R2) de C-Red foi de 0,71 com a equação da reta
y=5,48+0,54x; para C-Orange, o R2 foi de 0,64, com a equação: y=49,12+0,57x. Assim,
conclui-se que ambas C-Red e C-Orange são eficientes para a detecção de ROS em
espermatozoides bovinos.
Agradecimentos: FAPESP processo 2015/09154-6.
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Caracterização seminal e das alterações hemodinâmicas da próstata e testículos de
cães com hiperplasia prostática benigna, submetidos ou não ao tratamento com
Finasterida
Daniel S. R. Angrimani1; Brito, M.M.1; Rui, B.R.1; Abreu, R.A.1; Flores, R.B.1;
Francischini, M.C.P.1; Nichi, M.1; Vannucchi, C.I.1.
1Departamento de Reprodução Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
(FMVZ), Universidade de São Paulo (USP).
Palavras chave: Hiperplasia Prostática Benigna; Finasterida; Doppler; Avaliação
Seminal; Cães.
A hiperplasia prostática benigna (HPB) é a doença mais comum na senescência canina,
para a qual o tratamento de escolha é a orquiectomia. Contudo, para cães reprodutores,
considera-se o tratamento medicamentoso com finasterida. Por outro lado, o uso da
finasterida em homens é associado à oligospermia e azoospermia. Portanto, o objetivo
deste estudo foi avaliar os efeitos do tratamento com finasterida sobre variáveis
seminais, hemodinâmicas e vasculares da próstata e testículos de cães com HPB. Para
tal, foram selecionados vinte cães, de raças e idades (5-13 anos) variadas, alocados nos
seguintes grupos experimentais: cães acometidos pela HPB (n=5), cães acometidos pela
HPB e tratados com finasterida (HPB+F-n=5), cães isentos da HPB (CON–n=5) e cães
isentos da HPB e tratados com finasterida (CON+F–n=5). A partir de amostras
seminais, avaliou-se a concentração espermática, motilidade computadorizada do
sêmen, morfologia espermática, atividade mitocondrial dos espermatozoides,
integridade do DNA espermático, potencial mitocondrial dos espermatozóides e
integridade da membrana plasmática/acrossomal. O plasma seminal foi avaliado para o
estresse oxidativo (ensaio TBARS) e atividade de enzimas antioxidantes (glutationa
peroxidase e superóxido dismutase). Por meio da ultrassonografia Doppler, avaliamos o
volume da próstata e testículos e o perfil hemodinâmico da artéria prostática e testicular,
além da vascularização da próstata por escore subjetivo (1-3). Todas as avaliações
foram realizadas, em intervalo mensal, por 60 dias a partir do início da terapia ou do
diagnóstico (D0, D30 e D60). Os dados foram comparados por ANOVA e teste de LSD
(p≤0,05). A concentração espermática foi inferior no grupo HPB, enquanto as
velocidades média e lenta dos espermatozoides foram superiores em relação aos demais
grupos. A integridade de DNA espermático foi maior no grupo CON (95±1%), em
11
comparação ao HPB (82±6%), o qual superou o grupo HPB+F (70±6%). A
porcentagem de espermatozoides com alta atividade mitocondrial foi inferior no grupo
HPB+F (66±6%) em comparação ao CON (84±3%), bem como o índice de lesão da
membrana plasmática (HBP+F: 20±2%; CON: 11±5%). Na análise ultrassonográfica, o
volume prostático reduziu gradativamente entre D0 (63±15cm3) e D60 (42±12cm3) no
grupo HPB+F, tal como o escore de vascularização (D0: 2,6±0,2; D60: 1,6±0,2). Foi
possível observar maior velocidade ao fim da diástole da artéria prostática no grupo
HPB (21±1cm/s) em relação ao CON (16±1cm/s), assim como o índice de pulsatilidade
da artéria testicular (HPB: 1,8±0,2; CON: 1,1±0,09). Com base nos resultados, é
possível afirmar que a HPB influencia o fluxo sanguíneo da próstata e a pulsatilidade da
artéria testicular, podendo interferir na espermatogênese de tal modo a alterar a
motilidade, concentração e integridade do DNA espermático. Ainda, a terapia com
finasterida reduz o volume da próstata após 60 dias de tratamento e simultaneamente
diminui a angiogênese provocada pela HBP, porém, determina alterações espermáticas
(integridade da membrana plasmática e atividade mitocondrial). Desta maneira, é
possível concluir que a HPB promove alterações hemodinâmicas e espermáticas, as
quais podem ser agravadas pelo uso do fármaco finasterida. Logo, a avaliação seminal
acurada destes animais é necessária para a certificação do seu potencial reprodutivo.
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Perfil anual de andrógenos fecais em machos de gavião-real (Harpia Harpyja)
mantidos em cativeiro
Marcel Henrique Blank¹, Nei Moreira², Marcos José de Oliveira³, Wanderlei de
Moraes³ e Ricardo José Garcia Pereira¹
¹Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia da Universidade de São Paulo, FMVZ – USP
²Universidade Federal do Paraná, campus Palotina – UFPR
³Refugio Biológico Bela Vista, Itaipu Binacional
Palavras chave: aves de rapina, sazonalidade reprodutiva, função sexual, testosterona
Nas últimas décadas, muitos estudos têm analisado o papel dos hormônios sexuais na
regulação da atividade reprodutiva das aves selvagens. Como consequência, já é
estabelecido que alterações sistêmicas das concentrações de andrógenos regulam a
função reprodutiva de um modo cíclico, ajustando a fisiologia, a morfologia e o
comportamento das espécies de acordo com sua estratégia reprodutiva. Embora a função
desses hormônios permanece conservada entre os vertebrados, suas concentrações
circulantes e sua ciclicidade variam entre espécies. Assim, visto que outros grupos de
aves neotropicais (por exemplo, passeriformes) apresentam ciclicidade na secreção de
andrógenos, nossa hipótese é que as aves de rapina Accipitriformes também apresentam
uma sazonalidade na secreção de andrógenos. Dessa forma, foi utilizado 3 machos
adultos pareados de Harpia pertencentes ao plantel do criadouro de animais selvagens
da itaipu binacional (Foz do Iguaçu, Paraná, Brasil). Coletas de fezes foram realizadas
semanalmente durante o período de agosto de 2013 a dezembro de 2014, posteriormente
as amostras foram, extraídas e quantificadas suas concentrações hormonais utilizando o
método de ensaios imunoesnzimáticos seguindo protocolo descrito por Brown et al.,
2004. Para comparar os níveis médios de andrógenos fecais de machos reprodutores,
não reprodutores e estações foi utilizado os seguintes testes estatísticos: normalidade de
resíduos, homogeneidade das variâncias, seguindo teste de comparação de médias
utilizando o teste de Duncan p < 0.5. No geral, os níveis de andrógenos fecais
apresentaram maiores concentrações durante a primavera e verão (25,80 e 23,57 ng/g,
respectivamente), diferindo em relação ao outono (P < 0,05), quando apresentou as
menores concentrações (13,60 ng/g). Machos reprodutores e não reprodutores foram
classificados de acordo com a observação ou não de cópula e pela produção de ovos
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embrionados. Assim, indivíduos reprodutores e não reprodutores apresentaram as
seguintes médias: 28,22 e 18,53 ng/g respectivamente, não apresentando diferença
estatística (P > 0,05). Desta forma, foi possível observar que a espécie apresenta uma
fotorefratariedade após a segunda metade do outono, podendo ser observado maior
elevação nas concentrações de andrógenos conforme elevação na fotoestimulação
observada a partir da segunda metade do inverno. As concentrações de andrógenos
foram menores quando comparado com outras espécies de rapinantes já estudadas
(Pereira et al., 2010 e Blas et al., 2010), embora, tais espécies apresentam hábitos
gregários e territórios reprodutivos compactos, justificando maior elevação das
concentrações de tais hormônios pela necessidade em defender sua área de nidificação,
demonstrando maior agressividade e maior frequência de cópulas (Pereira comunicação
pessoal). Portanto, podemos aceitar nossa hipótese de que a secreção de andrógenos é
sazonal, embora a espécie apresente uma grande amplitude em suas elevações de
andrógenos, caracterizando apresentar uma atividade reprodutiva prolongada. Tais
características divergem de alguns grupos de aves tropicais que concentram sua
atividade reprodutiva em períodos específicos
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Influência da senescência reprodutiva no sêmen fresco e descongelado de cães
Maíra M. Brito1; Daniel S. R. Angrimani1; Bruno R. Rui1; Giulia .K.V. Kawai1;
N.G.T. Queiroz-Hazarbassanov2; João D. A. Losano1; Renata A. Abreu,1; Cristina O .
Massoco2; Marcilio Nichi1; Camila I. Vannucchi1
1Departamento de Reprodução Animal; 2Departamento de Patologia
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São
Paulo/SP, Brasil
Palavras chave: Senescência, criopreservação, sêmen, cães.
Cães senis tendem a produzir ejaculados com menor porcentagem de espermatozoides
normais, similar à queda da qualidade espermática em homens idosos, considerada
importante razão para a infertilidade humana. Portanto, o objetivo deste estudo foi
comparar entre cães jovens e senis a qualidade de amostras seminais pré-
criopreservação (sêmen fresco) e descongeladas. Para tanto, 23 cães foram alocados em
dois grupos experimentais de acordo com a idade: Grupo Jovem (n=12) e Grupo Senil
(n=11). Os cães de porte pequeno, médio e grande foram considerados senis,
respectivamente, a partir de 8, 7 e 6 anos de idade. Amostras de sêmen foram colhidas e
uma alíquota foi imediatamente analisada (sêmen fresco), enquanto o restante foi
submetido a protocolo de criopreservação (sêmen criopreservado). As amostras
seminais foram submetidas à análise computadorizada da motilidade (CASA),
concentração espermática, integridade de membrana plasmática (coloração de eosina-
nigrosina), integridade de membrana acrossomal (coloração de fast-green/rosa-bengala),
atividade mitocondrial (coloração citoquímica 3,3′diaminobenzidina) e morfologia
espermática (câmara úmida em formol salino). Os espermatozoides foram analisados
por citometria de fluxo quanto à porcentagem de lesão de membrana plasmática (sonda
Iodedo de Propídeo), lesão de membrana acrossomal (sonda FITC-PSA) e potencial de
membrana mitocondrial (sonda JC1). O delineamento experimental adotado foi fatorial
2x2 (Jovem X Senil e Fresco X Descongelado) e os dados foram avaliados por Teste T
Student ou Wilcoxon (p≤0,05). Independente do processamento da amostra, o Grupo
Senil apresentou maior porcentagem de defeitos totais em comparação ao Grupo Jovem
(38,41%±6,68 e 8,58%±1,07, respectivamente). Nas amostras criopreservadas, o Grupo
Jovem apresentou maior porcentagem de integridade de membrana acrossomal
comparado ao Grupo Senil (90%±1,31 e 81,18%±1,97, respectivamente). Para o sêmen
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fresco, o Grupo Senil apresentou maior porcentagem de espermatozoides com potencial
máximo de membrana mitocondrial em comparação ao Grupo Jovem (30,92%±8,56 e
04,16%±1,07, respectivamente). Ademais, cães senis apresentaram maior porcentagem
de espermatozoides com média atividade mitocondrial do que os jovens (16,38%±2.3 e
9,48%±1,12, respectivamente). As demais variáveis analisadas não diferiram entre os
grupos. Portanto, nossos resultados referentes à atividade e potencial de membrana
mitocondrial podem ser considerados um mecanismo compensatório dos
espermatozoides de cães senis, a fim de preservar a funcionalidade mitocondrial e
manter a motilidade espermática similar aos cães jovens. Em conclusão, o sêmen obtido
de cães jovens apresenta maior potencial de fecundação. Por outro lado, o sêmen de
cães senis apresenta mecanismos compensatórios dos defeitos morfológicos, por meio
do aumento de fonte energética e atividade mitocondrial e, consequentemente, da
motilidade espermática.
Agradecimento: FAPESP 2015/05419-5
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Cytobrush: uma ferramenta para avaliação molecular do endométrio bovino
Beatriz Cardoso; Guilherme Pugliesi; Milena Lopes Oliveira; Emiliana Oliveira
Santana Batista; Mario Binelli
FMVZ-USP, Pirassununga, SP, Brasil.
Palavras chave: cytobrush; útero; bovinos; expressão gênica.
Em bovinos, a compreensão molecular da biologia uterina in vivo requer um exame do
útero por meio de técnicas invasivas (e.g. biópsia). Coletas de amostras repetidamente
podem causar inflamação, danos físicos e afetar a fertilidade. Portanto, a validação de
técnicas menos traumáticas, repetíveis e que permitam a coleta de amostras
representativas e confiáveis é necessária. Neste contexto, esse estudo objetivou: (1)
comparar os aspectos estrutural e funcional de amostras endometriais coletadas por
biópsia transcervical e por escova citológica (cytobrush) e (2) caracterizar o perfil de
expressão de genes envolvidos no mecanismo de luteólise no endométrio utilizando a
técnica de cytobrush. No Experimento 1, o cio de cinco vacas Nelore foi sincronizado e
o dia da ovulação foi detectado por ultrassonografia (US). Dez dias após a ovulação,
amostras endometriais foram coletadas transcervicalmente do corpo uterino por meio de
cytobrush e, posteriormente, utilizando-se um pinça própria para biópsia. A abundância
de transcritos característicos de epitélio (KRT18), estroma (VIM), células imunes
(CD3D) e endoteliais (FLT1) e transcritos envolvidos na função uterina durante o ciclo
estral (PGR, PTGES, AKR1C4) foi medida por RT-qPCR e comparada entre as técnicas
de coleta. O efeito fixo da técnica foi analisado por one-way ANOVA utilizando o
procedimento PROC MIXED (SAS 9.2). A abundância de VIM e FLT1 foi 9,2 e 275
vezes maior em amostras de biópsia, respectivamente (P<0,05). Em contrapartida, a
abundância de KRT18 e CD3D foi 5,2 e 2,2 vezes maior em amostras cytobrush,
respectivamente (P<0,05). Embora tenha havido maior abundância do RNAm de
PTGES em amostras cytobrush (P<0,05), a abundância dos genes AKR1C4 e PGR não
foi alterada pelo método de coleta (P>0,05). No Experimento 2, o cio de cinco vacas
Nelore foi sincronizado e o dia da ovulação (D0) foi estimado por US. Nos dias 10, 13,
16 e 19 as amostras endometriais foram coletadas por cytobrush. A abundância dos
transcritos OXTR, ESR1 e PGR2 foi medida por qPCR e analisada por medidas
repetidas no tempo ANOVA utilizando-se o PROC MIXED (SAS 9.2). O teste de
diferença mínima significativa foi utilizado para comparação de médias entre os dias.
17
Houve aumento gradual na abundância de OXTR ao longo do tempo, sendo sua maior
abundância notada no D19 (P<0,05). Em contraste, a abundância do RNAm de PGR2
foi máxima no D10 em comparação aos demais tempos (P<0,05). Houve uma tendência
na diminuição gradual da abundância de transcritos para ESR1 entre os dias 10 e 16 e
novamente um aumento no D19 (P<0,1). Assim, amostras obtidas utilizando a técnica
de cytobrush fornecem amostras representativas, enriquecidas em células epiteliais, em
comparação às amostras de biópsia. As dinâmicas temporais da expressão dos
transcritos selecionados foram consistentes com a função uterina no final do ciclo estral.
Em conclusão, amostras de cytobrush podem convenientemente substituir amostras de
biópsia, proporcionando um método seguro, repetível e menos traumático para estudar a
biologia uterina bovina in vivo.
Agradecimentos: FAPESP, CNPq, CAPES.
18
Mudanças no transcriptoma e a morfologia do oviduto em vacas de corte de alta e
baixa fertilidade
Angela María Gonella-Diaza 1, Sónia Cristina da Silva Andrade 2, Mariana
Sponchiado 1, Júlio Cesar de Carvalho Balieiro 1, Nilton Pedro dos Santos 4, Guilherme
Pugliesi 1, Fernando Silveira Mesquita 3, Veerle Van Hoeck 1, Ricardo de Francisco
Strefezzi 4, Gustavo R. Gasparin 2, Luiz L. Coutinho 2, Mario Binelli 1.
1Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo,
Pirassununga, São Paulo, Brasil.
2 Laboratório de Biotecnologia Animal, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz,
Universidade de São Paulo, Av Pádua Dias, 11, Piracicaba, SP, Brasil.
3Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal do Pampa, Uruguaiana,
Brasil.
4Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo,
Pirassununga, São Paulo, Brasil.
Palavras chave: células ciliadas, células secretoras, ampola, istmo, esteroides sexuais.
Vacas que ovulam folículos de maior tamanho apresentam maiores concentrações de
estradiol (E2) na fase folicular e um maior corpo lúteo (CL), que produz maiores
quantidades de progesterona (P4) durante a fase luteal. Este perfil de esteroides sexuais
favorece a formação de um ambiente ovidutal e uterino mais receptivo ao
desenvolvimento e implantação do embrião. O nosso trabalho objetivou comparar o
transcriptoma e a morfologia do oviduto de vacas Nelore tratadas para ovular folículos
grandes (grupo FG-CLG, associado com alta receptividade ao embrião; n=21) com o de
vacas tratadas para ovularem folículos pequenos (grupo FP-CLP; n=20). No dia 4 do
ciclo estral os animais foram abatidos e amostras de ampola e istmo foram colhidas e
armazenadas a -80°C para testes moleculares ou fixadas em formalina para serem
embebidas em parafina. Após extração de RNA, o transcriptoma (n=3/grupo) foi
avaliado por sequenciamento de RNA. Amostras fixadas foram cortadas e coradas com
hematoxilina-eosina ou acido periódico de schiff para a avaliação da morfologia e
contagem das populações celulares (Primeira contagem: células ciliadas e células
secretoras; segunda contagem: células com ou sem grânulos citoplasmáticos),
respectivamente. O perfil de transcritos mostrou uma serie de genes diferencialmente
expressos (GDE) entre os grupos associados com características funcionais do oviduto
19
(ampola: 692 GDE; istmo: 590 GDE). O enriquecimento funcional mostrou que genes
que tem função no remodelamento de matriz extracelular, ramificação morfogênica,
proliferação e secreção celular foram mais expressos nas vacas do grupo FG-CLG.
Adicionalmente, estas vacas também apresentaram um maior número de pregas
primárias (P=0,04) e secundárias (P=0,07) na túnica mucosa e um número maior de
células secretoras (P=0,004) e de células com grânulos citoplasmáticos (P=0,03).
Processos de remodelamento de matriz extracelular e ramificação morfogênica
propiciam a liberação de fatores de crescimento e a maior atividade de secreção celular
o que poderia levar a um melhor desenvolvimento embrionário. Em conclusão, a maior
fertilidade das vacas do grupo FG-CLG está associada a alterações moleculares e
morfológicas no oviduto que favorecem o transporte e desenvolvimento embrionário.
20
Avaliação da fragmentação de DNA espermático por meio da coloração de azul de
toluidina em cães com hiperplasia prostática benigna submetidos ao tratamento
com Finasterida
Renato B. Flores1; Angrimani, D.S.R.1; Rui, B.R.1; Brito, M.M.1; Abreu, R.A.1;
Bicudo, L.C.1; Losano J.D.A.1; Pereira, R.J.G.1; Vannucchi, C.I.1
1Departamento de Reprodução Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
(FMVZ), Universidade de São Paulo (USP).
Palavras-Chave: Hiperplasia Prostática Benigna; Finasterida; Integridade de DNA
espermático; Azul de Toluidina; Cães.
Dentre as afecções prostáticas comuns na senescência canina, a Hiperplasia Prostática
Benigna (HPB) é a mais prevalente e é caracterizada por reduzida concentração
circulante de testosterona e excessiva de estradiol, sendo o tratamento de escolha a
orquiectomia. Porém, para cães reprodutores, preconiza-se o tratamento medicamentoso
com finasterida. Entretanto, em cães, há poucos estudos que verificam a ação da HPB e
finasterida na qualidade seminal. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a
influência da HPB e do tratamento com finasterida sobre a integridade de DNA
espermático, utilizando a coloração com azul de toluidina. Para tal, foram realizados
dois experimentos. O experimento 1 constituiu na validação da coloração com azul de
toluidina para cães. Foram selecionados seis cães, dos quais foram colhidas amostras
seminais divididas em duas alíquotas: amostra espermática com DNA íntegro (mantida
a 4°C) e amostra submetida à indução de fragmentação de DNA por exposição à luz
ultravioleta (4 horas). As amostras foram combinadas para obter proporções conhecidas
e progressivas de espermatozoides com DNA fragmentado (0%, 25%, 50%, 75% e
100%). Os esfregaços de sêmen foram realizados e submetidos à coloração com azul de
toluidina. No experimento 2, foi realizada a avaliação do tratamento com Finasterida
para a HPB sobre a integridade de DNA espermático, utilizando vinte cães, de raças e
idades (5-13 anos) variadas, os quais foram alocados em quatro grupos experimentais:
Controle (CON - n=5); Controle+Finasterida (CON+F - n=5); HPB+Finasterida
(HPB+F - n=5) e HPB (n=5). Foram realizadas colheitas seminais em três avaliações:
Dia 0 (início da terapia medicamentosa com finasterida), Dia 30 e Dia 60, para a
avaliação da integridade de DNA espermático, utilizando a coloração de azul de
toluidina. Para o Experimento 1, a regressão linear foi efetuada com o Guide Data
21
Analysis e para o Experimento 2 os dados foram comparados por ANOVA e teste de
LSD (p≤0,05). No experimento 1, foi observada significância (p<0,00001) e alto
coeficiente de regressão linear (R2=0,9912), indicando que a técnica foi considerada
eficiente para cães. No experimento 2, o grupo CON demonstrou maior integridade de
DNA espermático (95,7±1,8%) em relação ao grupo HPB (79,2±6,4%), que por sua vez,
foi superior ao HPB+F (70,5±6,3%). Tal resultado pode ser atribuído ao desbalanço
hormonal presente na HPB, com consequente efeitos deletérios sobre a
espermatogênese, os quais se agravam com o uso da finasterida. Em conclusão, a
coloração com azul de toluidina demonstrou-se eficiente para avaliação da integridade
de DNA espermático em cães e pode ser indicada para identificar eventuais efeitos
deletérios da HPB e do tratamento medicamentoso. Tal avaliação permitirá melhor
seleção de cães portadores de HPB e tratados com finasterida para fins reprodutivos.
22
Perfis endócrinos peri-ovulatórios influenciam o transporte, metabolismo e
disponibilidade de aminoácidos no lúmen uterino de vacas de corte durante o
diestro inicial
Moana Rodrigues Françaa; Maressa Izabel Santos da Silvaa; Guilherme Pugliesia;
Veerle Van Hoecka; Mario Binellia
aDepartamento de Reprodução Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade de São Paulo, Pirassununga, SP, Brasil.
Palavras chave: bovino, receptividade uterina, esteroides sexuais, Proteínas
Carreadoras de Soluto, aminoácidos.
Em vacas de corte, folículos pré-ovulatórios (FOP) maiores, maiores concentrações de
estradiol (E2) no proestro/estro e progesterona (P4) no diestro favorecem o crescimento
do concepto e a fertilidade. Porém, os mecanismos mediados pelos esteroides femininos
que influenciam a receptividade uterina ao embrião precisam ser esclarecidos. Os
aminoácidos (AA) são componentes das secreções uterinas que são cruciais para a
sobrevivência do embrião antes da implantação. A hipótese deste trabalho é que o
tamanho do FOP e as concentrações de E2 e P4 modulam a abundância de transcritos
relacionados ao transporte e metabolismo de AA no endométrio e afetam a concentração
luminal de AA. Para isso, o crescimento folicular de vacas Nelore foi manipulado com
o objetivo de formar dois grupos: FOP grande e CL grande (FG-CLG) e FOP pequeno e
CL pequeno (FP-CLP). No Dia 4 (D4; Exp 1) e Dia 7(D7; Exp 2) após a injeção de
GnRH para indução da ovulação, foram coletados tecido endometrial e lavado uterino
post-mortem. A abundância de transcritos foi avaliada por qRT-PCR e as concentrações
de AA nos lavados foram quantificadas por HPLC. No Exp 1, o tamanho do FOP,
concentrações plasmáticas de E2 no D-1 e de P4 no D4 foram 15,70mm±0,43 vs.
11,31mm±0,23 (p<0,01), 2,44pg/ml±0,19 vs. 0,65pg/ml (p<0,01) e 1,40ng/ml±0,23 vs.
0,80ng/ml±0,10 (p<0,01) para os grupos FG-CLG vs. FP-CLP, respectivamente. No
Exp 2, o tamanho do FOP, concentrações plasmáticas de E2 no D-1 e de P4 no D7
foram 13,18mm±0,44 vs. 10,63mm±0,30 (p<0,01), 2,30pg/ml±0,57 vs. 0,50pg/ml±0,13
(p<0,01) e 3,68ng/ml±0,38 vs. 2,49ng/ml±0,43 (p=0,04) para os grupos FG-CLG vs.
FP-CLP, respectivamente. No D4 a abundância de SLC1A4, SLC38A1, SLC6A6,
SLC7A4, SLCY e PRMT6 e no D7, SLC1A4, SLC6A1, SLC6A14, SLC7A4, SLC7A8,
SLC38A1, SLC38A7, SLC43A2, PRMT6 e DDO foi maior no endométrio dos animais
23
do grupo FG-CLG (p<0,05). No D4, maiores concentrações de taurina, alanina e ácido
α-aminobutírico foram observadas no grupo FP-CLP (p<0,05). Em contraste, menores
concentrações de valina e cistationina foram encontradas nos lavados uterinos do D7
dos animais do grupo FP-CLP (p< 0,05). No D4, os animais do grupo FG-CLG,
associado a maior fertilidade, apresentaram menor quantidade de AA nas secreções
uterinas, porém, a abundância dos transportadores de AA foi compatível com maior
transporte em comparação aos animais do grupo FP-CLP. Esses resultados sugerem que
antes do embrião se mover do oviduto ao útero, o transporte e metabolismo dos AA
prioriza a preparação das células endometriais para receber o embrião e não o acúmulo
nas secreções uterinas. Porém, no D7, quando o embrião está em contato direto com as
secreções uterinas, os genes relacionados ao transporte de AA no endométrio e a
concentração de AA no histotrofo são estimulados nas vacas do grupo FG-CLG.
Portanto o metabolismo e transporte de AA no sentido das células endometriais ou das
secreções uterinas pode ser um mecanismo importante para a receptividade materna.
24
A assinatura transcricional espaço-específica do endométrio bovino 7 dias após a
inseminação
Nathália Souza Gomes1; Mariana Sponchiado2; Patrícia Kubo Fontes3; Maressa Izabel
Santos da Silva4; Thiago Martins5; Guilherme Pugliesi6; Maite Del Collado7; Athos De
Assumpção Pastore8; Marcelo Fabio Gouveia Nogueira9; Mario Binelli10.
1,2,4,5,6,7,10USP, Pirassununga - SP - Brasil;
3Unesp, Botucatu - SP - Brasil;
8CRV Lagoa, Sertãozinho - SP - Brasil;
9Unesp, Assis - SP - Brasil.
Palavras chave: expressão gênica; útero; desenvolvimento embrionário.
O estabelecimento gestacional depende da interação entre os perfis de hormônios
ovarianos, o trato reprodutivo materno e o concepto em desenvolvimento. O endométrio
bovino é um tecido dinâmico que sofre modificações funcionais espaço-temporais
dirigidas pelos hormônios ovarianos, estradiol (E2) e progesterona (P4). Devido aos
arranjos vasculares locais, o aporte de esteroides sexuais no útero possui um padrão de
distribuição que varia longitudinal e transversalmente. O que ainda não se sabe é o quão
cedo o sinal do embrião no trato reprodutivo pode modular a sua função. O presente
estudo testou duas hipóteses: (1) há uma assinatura transcriptômica espaço-específica no
endométrio e, (2) a presença de um embrião influencia tal assinatura 7 dias após a IA
(D7). Esperava-se que a abundância de transcritos de genes relacionados à receptividade
uterina e de resposta aos esteroides sexuais diminuiria do terço anterior para o terço
posterior do corno uterino e do lado mesometrial para antimesometrial. Além disso,
devido ao número limitado de células, a presença de um embrião no D7 não afetaria a
expressão gênica do endométrio. Vacas Nelore multíparas e não lactantes foram
sincronizadas e alocadas em um dos dois grupos experimentais no momento do estro
(D0): Controle (Con; n=8), onde a IA foi mimetizada com diluidor seminal; ou Gestante
(Gest; n=16), vacas foram inseminadas com a mesma partida de sêmen bovino
comercial, 12h após o estro. O tamanho do folículo pré-ovulatório, a área do CL e
concentração plasmática de P4 no D7 foram semelhantes entre os grupos (p> 0,1). As
vacas foram abatidas no D7 e o corno uterino ipsilateral ao CL foi isolado e dividido em
terços anterior, médio e posterior, a partir da junção útero-tubárica. Cada terço uterino
foi lavado individualmente com DMPBS e a presença do embrião no lavado foi
25
confirmada nas vacas do grupo Gest. Todos os embriões (n=10) foram encontrados nos
lavados do terço anterior. Subsequentemente, amostras de endométrio intercaruncular
foram coletadas de cada terço uterino nas regiões mesometrial e antimesometrial. A
abundância relativa de transcritos para 89 genes-alvos foi mensurada por PCR usando a
plataforma Fluidigm (Biomark HD). Os dados foram analisados por Split-split-plot
ANOVA incluindo os efeitos de grupo (Con vs Gest), terço (anterior, médio e posterior)
e região (mesometrial e antimesometrial) e as interações. Uma regulação espacial ao
longo do corno uterino foi verificada com o decréscimo de transcritos dos genes
associados à atividade de secreção, transportadores, via das prostaglandinas e estresse
oxidativo do terço anterior em direção ao terço posterior. Em contraste, para os genes
associados ao remodelamento de matriz extracelular e fatores de crescimento verificou-
se um aumento na abundância de transcritos do terço anterior em direção ao posterior.
Em conclusão, o padrão de expressão de genes específicos varia entre as regiões do
trato reprodutivo da fêmea bovina.
26
Avaliação da transferência de imunidade passiva em cordeiros prematuros
tratados ou não com corticoterapia antenatal
M. B. Justo1; Regazzi, F. M. 1; Vidal, A. B. G. 1; Abreu, R. A. 1; Brito, M. M. 1;
Angrimani, D. S. R. 1; Almeida, L. L. 1; Leite, B. A. 1; Flores, R. B. 1; Vannucchi, C. I. 1
1Departamento de Reprodução Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
(FMVZ), Universidade de São Paulo (USP).
Palavras chave: corticoterapia, imunidade, colostro, cordeiros.
Nos animais ruminantes, incluindo ovinos, a transferência dos anticorpos maternos via
placentária não ocorre de maneira satisfatória a garantir a adequada imunidade neonatal,
sendo essencial a ingestão do colostro. A prematuridade é muitas vezes apontada como
influência negativa na produção e absorção colostral, diminuindo a eficiência da
transferência da imunidade passiva. Por outro lado, a corticoterapia antenatal favorece a
maturidade fetal, incluindo o desenvolvimento de diversas funções orgânicas, tais como
adaptabilidade pulmonar, neurológica, entre outras. Portanto, o objetivo deste estudo foi
analisar a qualidade físico-química do colostro e disponibilidade energética de cordeiros
prematuros tratados ou não com corticoterapia antenatal. Para tanto, foram utilizados 10
cordeiros neonatos e suas respectivas mães, alocados nos grupos: Grupo Corticoterapia
Antenatal (GCA) (n=4) e Grupo Controle (GC) (n=6). O parto foi induzido
prematuramente aos 135 dias de gestação, utilizando o antiprogestágeno aglepristona
(10 mg/kg, SC). No grupo GCA, administrou-se betametasona em dose única de
0,5 mg/kg de peso materno (IM) aos 133 dias de gestação. Entre 0 e 10 minutos do
nascimento, 250 mL de colostro foram ordenhados manualmente para avaliação da
densidade pelo uso do colostrômetro. Sequencialmente ao nascimento (0h), 2h, 4h, 12h,
48h e 72h, 20 mL de colostro foram obtidos para determinação da concentração de
imunoglobulina G, por meio do refratômetro de BRIX óptico. Nos mesmos momentos,
amostras de sangue foram obtidas dos cordeiros e avaliadas quanto à glicemia
sanguínea. Os dados foram analisados por ANOVA e teste LSD (p≤0.05). Em relação à
análise pelo colostrômetro (p=0,16) e concentração de IgG no colostro (p=0,6), não
houve diferença estatística entre os grupos. Entretanto, independente do grupo
experimental, observamos queda gradual da concentração de IgG no colostro
(porcentagem BRIX) ao longo do tempo, sendo os momentos 0h, 2h e 4h superiores aos
tempos 12h, 24h, 48h e 72h. Quanto ao perfil glicêmico, os cordeiros do grupo GCA
27
apresentaram valor de glicemia maior que o grupo GC às 12h de vida. No grupo GC, a
partir de 24h, foi observado aumento dos valores glicêmicos em relação às primeiras
horas de vida, à exceção da análise realizada às 2h após o nascimento. Já no grupo
GCA, observou-se aumento gradual da glicemia ao longo do tempo, com diferença
estatística entre os primeiros momentos (0h e 2h) e às 24h, 48h e 72h de vida. Em
conclusão, a corticoterapia antenatal não interfere com as características físico-químicas
do colostro em ovelhas, embora melhore a mobilização energética dos cordeiros após 12
horas de vida. Porém, a ingestão do colostro deve ser garantida nas primeiras horas, por
haver significativa redução de sólidos totais no colostro ao longo do tempo,
especialmente para cordeiros não submetidos à corticoterapia antenatal, os quais
apresentam equilíbrio energético mais lento em relação aos tratados.
28
Efeito protetor da carnosina no sêmen criopreservado de garanhões Mangalarga
Paulista
Giulia Kiyomi Vechiato Kawai1, Maíra Morales Brito1, Bruno Rogério Rui1, João
Diego de Agostini Losano1, Andressa Dalmazzo1, Carolina Camargo Rocha1, Maria
Augusta Alonso2, Camilla Motta1, Mayra Elena Ortiz D' Ávila Assumpção1, Marcilio
Nichi1.
1Instituição: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - FMVZ/USP -
Departamento: Reprodução Animal, 05508270 São Paulo – Brasil
2Fazenda Santa Rita II
Palavras chave: Sêmen de garanhão; Carnosina; Criopreservação; Malondialdeído.
O espermatozoide é uma célula extremamente suscetível ao estresse oxidativo. No
entanto, o plasma seminal possui uma série de compostos que protegem estas células
contra danos oxidativos, dentre eles, a carnosina. Este dipeptídeo pode atuar contra o
acúmulo do deletério subproduto da peroxidação lipídica, malondialdeído (MDA). Este
efeito protetor pode ser insuficiente após a remoção do plasma seminal, etapa
importante durante a criopreservação de espermatozoides equinos. Desta forma, no
presente estudo objetivamos prevenir os danos provenientes do MDA no processo de
criopreservação espermática, por meio do tratamento seminal com carnosina. Para tanto,
foram coletados sete ejaculados em duplicata (N=14) de garanhões da raça Mangalarga
Paulista. Cada amostra foi dividida em quatro alíquotas, sendo uma utilizada como
grupo controle, e as remanescentes tratadas com concentrações crescentes de carnosina
(1, 50 e 100mM), adicionadas ao meio de criopreservação. Em seguida, as amostras
foram criopreservadas/descongeladas e avaliadas quanto à integridade das membranas
plasmática e acrossomal (Iodeto de Propídio e Pisum sativum conjugada a Isotiocinato
de fluoresceína, respectivamente), suscetibilidade da cromatina à denaturação ácida
(SCSA®), susceptibilidade à peroxidação lipídica (Ensaio TBARS) e análise
computadorizada da motilidade (CASA). Os animais foram classificados quanto à
congelabilidade seminal em bons congeladores (BC, motilidade>30%) e maus
congeladores (MC, motilidade<30%). A análise estatística foi realizada por meio do
programa SAS System for Windows. Os grupos foram comparados por meio da análise
de variância (teste LSD) e do teste t de Student, sendo p<0,05 considerado significativo.
Nas amostras do grupo MC, a suscetibilidade do espermatozoide à peroxidação lipídica
29
correlacionou-se negativamente com as porcentagens de células com membrana e
acrossomo íntegros (r=-0,5; P=0,01) e integridade de DNA (r=-0,49; P=0,02). Amostras
controle de animais MC apresentaram menor integridade de DNA quando comparadas
às amostras controle do grupo BC (grupo controle MC: 99,04±0,14; grupo controle BC:
99,6±0.06; P=0,006). No entanto, quando as amostras foram tratadas com 100mM de
carnosina, foi possível observar maior porcentagem de células com DNA íntegro nas
amostras pertencentes ao grupo MC, não diferindo do grupo BC (grupo MC:
99,46±0,10; grupo BC: 99,48±0,11; P=0,86). Subprodutos da peroxidação lipídica
podem causar danos às membranas e ao DNA. Neste contexto, o tratamento seminal
com carnosina (100mM) conferiu um efeito protetor ao DNA contra o acúmulo de
MDA em amostras provenientes de garanhões considerados MC, e portanto, pode ser
utilizada como tratamento alternativo em ejaculados de animais com baixa
congelabilidade.
Agradecimentos: Os autores agradecem à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal
de Nível Superior (Capes).
30
A estimulação da via glicolítica mantém os níveis de ATP de espermatozoides
epididimários bovinos submetidos ao desacoplamento mitocondrial
João D.A. Losano1, Padin JF2, López IM2, García AG2, Barnabe VH1, Nichi M1
1 Departamento de Reprodução Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Universidade de São Paulo
2 Departamento de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de
Madrid
Palavras chave: espermatozoide bovino; epidídimo; glicólise; fosforilação oxidativa;
ATP.
Estudos têm demonstrado a importância da mitocôndria para a funcionalidade do
espermatozoide, referindo-a como a principal fonte de energia para a motilidade e
homeostase celular. No entanto, para algumas espécies, estudos recentes evidenciam
que a glicólise parece ser o principal mecanismo de produção de ATP, superior à
fosforilação oxidativa. Na espécie bovina, estes mecanismos não foram totalmente
elucidados. Portanto, o objetivo deste trabalho foi verificar a importância da via
glicolítica nos níveis de ATP de espermatozoides bovinos mediante desacoplamento
mitocondrial. Para tanto, recuperamos amostras espermáticas provenientes de seis
epidídimos bovinos (N=6). Cada amostra foi dividida em 8 alíquotas, sendo que, uma
alíquota foi utilizada como grupo controle, outra tratada com glicose (5mM) e as
alíquotas remanescentes foram submetidas à concentrações crescentes do desacoplador
da fosforilação oxidativa Carbonil cianeto 4- (trifluorometoxi) Fenilhidrazona (FCCP-
0,1µM; 0,3µM; 1µM e 3µM), na presença ou ausência de glicose (5mM). Após 15
minutos de incubação a 37°C de tais tratamentos, realizamos as dosagens de ATP por
meio da técnica de luminescência utilizando o Kit comercial CellTiter-Glo Luminescent
Cell Viability Assay (Promega®, Madison, WI, USA). Os dados foram analisados por
meio do programa SAS System for Windows (SAS Institute Inc., Cary, NC, E.U.A.),
sendo que, estes dados foram submetidos à análise de variância utilizando o teste
Tukey. Observamos redução significativa dos níveis de ATP intracelular de amostras
tratadas com 0,3µM; 1µM e 3µM de FCCP quando comparadas ao grupo controle e ao
grupo tratado somente com glicose (p<0,05). No entanto, não observamos diferenças
significativas nos níveis de ATP de amostras submetidas aos tratamentos com FCCP na
presença de glicose, quando comparadas ao grupo controle e ao grupo tratado apenas
31
com glicose. O reestabelecimento dos níveis de ATP de amostras que foram submetidas
ao desacoplamento mitocondrial associado à adição de glicólise, nos fornece fortes
evidências de que a via glicolítica, após ser estimulada, é capaz de manter os níveis de
ATP de espermatozoides epididimários bovinos.
Agradecimentos: Os autores agradecem as instituições Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Instituto Fundación Teófilo
Hernando (IFTH) pelo suporte financeiro.
32
Suplementação proteica em sistema de creep-feeding no período de cria não
interfere no desenvolvimento sexual de novilhas da raça Tabapuã (Bos taurus
indicus)
Guilherme Madureira,1; Silva, L. O.1; Carvalho, L. R.1; Alvarenga, A. B.2; Coelho, C.
F.3; Casagrande, D. R.4; Barreto Filho, J. B.5
1 Graduação - Medicina Veterinária - Universidade Federal de Lavras;
2 Mestrado - Programa de Ciência Animal e Pastagens - Escola Superior de Agricultura
“Luiz de Queiroz”;
3 Graduação - Zootecnia - Universidade Federal de Lavras;
4 Docente - Departamento de Zootecnia - Universidade Federal de Lavras;
5 Docente - Departamento de Medicina Veterinária - Universidade Federal de Lavras.
Palavras chave: dinâmica folicular; novilha; puberdade.
O objetivo deste trabalho foi avaliar o desenvolvimento sexual e o estabelecimento da
dinâmica folicular em novilhas da raça Tabapuã no período peripuberal. Foram
utilizadas oito fêmeas, com idade média de 17 ± 0,8 meses, peso médio de 302 ± 18 kg
e escore de condição corporal 3 (escala de 1-5). Durante o período de cria, os animais
foram divididos em dois grupos, com quatro animais cada, classificados em grupo
controle (GC) e grupo Creep-feeding (GCf). Ambos os grupos, a partir do nascimento,
permaneceram a pasto (Brachiaria brizantha cv. Marandu) com água ad libitum e foram
desmamados com 220 dias de idade. O GCf foi suplementado com dieta concentrada,
composta por 20% de proteína bruta, sendo fornecidos 7,0 g de ração por kg de peso
vivo, a partir dos 45 dias de idade até a desmama. Após desmamados, os grupos
permaneceram a pasto (B. brizantha cv. Marandu) com água ad libitum e suplementação
com dieta concentrada, composta por 20% de proteína bruta, sendo fornecidos 4,0 g de
ração por kg de peso vivo. O desenvolvimento sexual dos animais foi avaliado pelo
diâmetro dos cornos uterinos, comprimento de ovários, recrutamento folicular, diâmetro
máximo do folículo grande e pool de folículos pequenos, com o auxílio da
ultrassonografia (Pie Medical modelo Falco Esoate 100 e transdutor linear com
freqüência de 5 a 7 MHz), em intervalos de 48 h, durante período de 21 dias, a partir
dos 17 ± 0,8 meses de idade. A mensuração dos cornos uterinos foi realizada na altura
de sua bifurcação e dos ovários em dois eixos longitudinais, além de serem avaliados
número e tamanho dos folículos. A fase de recrutamento folicular foi determinada pela
33
quantificação do pool de folículos com diâmetro ≤ 5,0 mm no momento em que o
folículo grande (diâmetro > 8,0 mm), presente em um dos ovários, apresentou o seu
maior diâmetro. As análises estatísticas foram executadas pelo software SAS (PROC
MIXED e PROC GLIMMIX) com 5% de significância. O diâmetro médio dos cornos
uterinos foi de 1,33 ± 0,20 mm e 1,30 ± 0,26 mm no GC e GCf, respectivamente, e não
foi influenciado pelo tratamento (p=0,65). O comprimento médio do ovário esquerdo
diferiu (p=0,03) entre os dois grupos e foi de 2,16 ± 0,24 para o GC e 2,01 ± 0,37 mm
para o GCf. O ovário direito apresentou 2,24 ± 0,28 e 2,29 ± 0,34 mm de comprimento
médio para o GC e GCf, respectivamente, e também não foi influenciado pelo
tratamento (p=0,45). O GC recrutou 22,72 ± 3,95 folículos por onda folicular, e o GCf,
20,75 ± 4,83 folículos (p=0,37). O diâmetro máximo do folículo grande foi de 11,87 ±
1,27 e 11,81 ± 1,51 mm para o GC e GCf, respectivamente, e também não sofreu
influência do tratamento (p=0,92). O pool de folículos pequenos presente em cada
ovário, por dia, foi de 11,31 ± 3,61 e 9,0 ± 3,73 folículos no ovário esquerdo para o GC
e GCf, respectivamente, (p=0,82) e 11,0 ± 2,79 e 11,0 ± 3,27 no ovário direito para o
GC e GCf, respectivamente (p=1,0), bem como o número total de folículos pequenos
considerando-se os dois ovários conjuntamente (p=0,87). A suplementação alimentar
com 20% de proteína bruta, nas condições do presente trabalho, no período de cria, em
sistema de creep-feeding, não influenciou o desenvolvimento sexual e a dinâmica
folicular no período peripuberal em novilhas da raça Tabapuã.
34
Histotrofo e receptividade uterina
Thiago Martins1; Guilherme Pugliesi1; Mariana Sponchiado1; Frederich Diaz
Rodriguez1; Roney Ramos3; Ângela Maria Gonella-Diazza1; Alejandro Ojeda Rojas1;
Andréa Cristina Basso4; Júlio César Barboza da Silva5; Paulo Fantinato Neto2; Mario
Binelli1
1FMVZ-USP; 2. FZEA-USP; 3. Ouro Fino Saúde Animal; 4. In Vitro Brasil; 5. Embryo
Sys.
Palavras chave: gestação; serpina; bovino.
Em bovinos, antes da placentação, o desenvolvimento do concepto depende do
secretoma uterino (i.e., histotrofo). Apesar de fundamental, a composição e a dinâmica
de síntese do histotrofo durante a fase inicial do diestro são pouco conhecidas, bem
como a relevância desse processo dinâmico para o estabelecimento da gestação.
Portanto, este estudo teve como objetivo alterar a composição do histotrofo no diestro
inicial para avaliar os efeitos sobre (1) a sobrevivência embrionária (2) a reconstituição
de sua composição. O crescimento folicular de vacas multíparas, cíclicas e não lactantes
foi sincronizado utilizando protocolo a base de estradiol/progesterona seguido de
detecção cio (d0) duas vezes ao dia por 4 dias. No Exp1, cada corno uterino foi lavado
com 30 mL de D-PBS no d1 (n=15), d4 (n=17), d7 (n=16), ou não foi lavado (controle,
n=16). No d7,5, 3 embriões PIV foram transferidos para o corno ipsilateral ao CL. O
diagnóstico de gestação foi realizado no d25 por ultrassonografia transretal. No Exp2,
cada corno uterino foi lavado três vezes com 30 mL de D-PBS no d1 (n=9), d4 (n=9),
d7 (n=9), d1+4+7 (n=9) ou não foi lavado (controle, n=9). O procedimento foi
mimetizado (i.e. passagem de sonda de Foley sem infusão de D-PBS no útero) nos dias
que não foram realizadas as lavagens. No d7,5, os cornos uterinos de todas as vacas
foram lavados com 30 mL de D-PBS e os lavados foram usados para quantificação de
proteína total (BCA protein assay kit), abundância de albumina, proteína que é
comumente encontrada no soro (ALB; SDS-PAGE seguido de coloração com
Coomassie e quantificação por densitometria) e abundância de SERPINA14, proteína
específica do útero (SERP; Western Blotting). Os dados preliminares foram analisados
pelo SAS utilizando o teste Qui-quadrado, Exp.1, e o PROC MIXED, Exp2. No Exp1, a
prenhez (P)/TE foi similar entre os grupos controle, (60%; 9/15) e lavado no d1 (60%;
9/15), mas, comparado ao grupo controle, a prenhez no grupo lavado no d4 (29,4%;
35
5/17; p=0,06) tendeu a ser menor e no grupo lavado no d7 foi numericamente inferior
(37,5%; 6/16; p= 0,16). No Exp2, as lavagens resultaram em aumento da quantidade de
proteína. Comparado ao grupo controle, lavagens no d4 ou d7 aumentaram em 4,1 e 3,8
vezes (p<0,05) a quantidade de proteína total, enquanto que lavagens no d1 ou d1+4+7
não alteraram ou a aumentaram moderamente (1,6 vezes, p=0,07), respectivamente.
Similarmente, lavados no d4 ou d7 aumentaram em 5,8 e 5,2 vezes (p<0,05) a
abundância de ALB, enquanto que lavagens no d1 ou d1+4+7 resultaram em aumentos
de 2,1 e 2,4 vezes, respectivamente. Para SERP, lavagens no d4 ou d7 resultaram em
aumentos de 9 e 14,5 vezes (p<0,01), respectivamente, e lavagens no d1 ou d1+4+7 não
a alteraram. Conclui-se que (1) a sobrevivência embrionária foi prejudicada por
lavagens uterinas realizadas próximas a TE, enfatizando a importância de um ambiente
intrauterino adequado para o sucesso gestacional (2) lavagens uterinas, realizadas
durante o diestro inicial alteraram a composição do histotrofo, aumentando agudamente
a abundância de proteína total, sérica e útero-específica.
Agradecimentos: FAPESP, CNPq, CAPES, In Vitro Brasil.
36
Estradiol altera perfil imunohistoquímico das proteínas PKCγ, AKR1B1 e
receptor α de estradiol no endométrio de fêmeas bovinas
B.P. Mello, A.D. Gonella, G. Pugliesi, S.C. Scolari,
M. Binelli, C.M.B. Membrive
Palavras chave: estradiol, prostaglandina, luteólise, imunohistoquímica.
Em bovinos o estradiol (E2) exerce importante participação na liberação de PGF2α
endometrial associada com a luteólise, entretanto, os mecanismos moleculares
envolvidos em tal ação são pouco conhecidos. A produção de PGF2α resulta da
estimulação de uma cascata de eventos intracelulares, incluindo a participação das
proteínas kinase C gamma (PKCγ), aldo-keto redutase família 1 membro B1 (AKR1B1)
e receptor α de estradiol (ERα), presentes nas células endometriais. Hipotetizou-se que
em fêmeas tratadas com E2 ocorre uma modificação na concentração de proteinas
PKCγ, AKR1B1 e Erα no endometrio. Assim, objetivou-se investigar por
imunomarcação das proteínas PKCγ, AKR1B1 e ERα no tecido endometrial, em vacas
Nelore tratadas ou não com 3mg de 17 -estradiol por via intravenosa, no 15o dia do
ciclo estral 0, 4 e 7 horas após a injeção. Vacas Nelore (N=52), pluríparas, cíclicas e não
lactantes receberam 2mg de benzoato de estradiol (Sincrodiol, Ouro fino® Cravinhos,
Brazil) e um dispositivo intravaginal de progesterona (1g; Sincrogest; Ourofino®,
Cravinhos, Brazil) por 8 dias. As vacas receberam 0,5mg de cloprostenol sódico
(Sincrocio; Ourofino, Cravinhos, Brazil) via IM, 48 horas antes da retirada e uma
segunda aplicação na retirada do dispositivo. No dia 15 do ciclo estral (D0; estro) foram
administrados os seguintes tratamentos: placebo (P; 5mL de etanol 50%; via IV),
estradiol (E; 5mL de etanol 50% contendo 3mg de 17β estradiol; IV) ou controle (não
tratado). Considerou-se o momento da aplicação dos tratamentos como a hora 0. As
vacas foram submetidas a uma biópsia endometrial, via transcervical e de acordo com o
momento da biópsia foram subdivididas nos seguintes grupos: hora 0 no grupo controle
(C; n=10), e nos momentos 4 horas (E4; n=11 e P4; n=10) ou 7 horas (E7; n=10 e P7;
n=11). O tecido obtido por biópsia foi acondicionado em solução de formol tamponado
4% durante 24 horas e posteriormente foi mantido em álcool 70% até a inclusão em
parafina. Secções de endométrio foram avaliadas pela técnica de imunohistoquímica,
considerando a imunomarcação no epitélio luminal (EL), epitélio glandular (EG) e
estroma (E). As diferenças estatísticas foram determinadas por teste T e consideradas
37
quando P<0,05. A proteína PKCγ apresentou maior imunomarcação (P<0,05) no EL
nos grupos E4 e E7 comparados com P4 e P7h (P<0,05) e maior imunomarcação no EG
em E7 quando comparado a P7. A proteína AKR1B1 apresentou maior imunomarcação
(P<0,05) no EL nos grupos E4 e E7 quando comparados a P4 e P7 e maior expressão no
EG em E4 quando comparado a P4. Para ERα houve maior imunomarcação (P<0,05) no
EG nos grupos P4 e P7 quando comparados com E4 e E7 e maior expressão no EL em
P4 quando comparado ao grupo E4. Conclui-se que o E2 aumenta a imunomarcação das
proteínas PKCγ e AKR1B1 e dimimui a imunomarcação de ERα no tecido endometrial,
desta forma modificando a concentração de receptores endometriais para PKCγ,
AKR1B1 e ERα.
38
Efeito da suplementação de dieta líquida em leitões sobre o desempenho
reprodutivo de fêmeas suínas lactantes
Melissa O. Ferrin¹, André P. Poor¹, Maitê V. Mendonça¹, Diego, F. Leal¹, Mariana A.
Torres¹, André F. C. Andrade¹, Simone M. M. K. Martins¹
¹Núcleo de Pesquisa em Suínos–Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia-
FMVZ/USP
Palavras chave: catabolismo, lactação, desempenho reprodutivo.
A rentabilidade do sistema de produção de suínos está diretamente ligada ao número de
leitões desmamados/fêmea/ano. O melhoramento genético tornou as fêmeas mais
precoces e prolíferas, além de aumentar a produção de leite, número de leitões nascidos
e reduzir o consumo de ração, o que predispõe à mobilização de tecidos para a mantença
e produção de leite, levando ao estado catabólico (HAESE et al., 2010). A maior
heterogeneidade da leitegada tem se relacionado ao maior número total de nascidos com
baixo peso ao nascimento e a insuficiente ingestão de colostro e leite (WOLF et al.,
2008). Deste modo, o fornecimento de dieta liquida aos leitões pode reduzir a variação
no peso e idade ao abate (KIM et al., 2001). O presente estudo objetivou avaliar se a
suplementação líquida em leitões a partir do 3º dia de vida reduz o catabolismo em
fêmeas lactantes. Utilizou-se 16 fêmeas e cada leitegada recebeu um dos três
tratamentos: Controle (CT) apenas leite materno; Dieta Seca (DS) leite materno + dieta
seca; Dieta Líquida (DL) leite materno + dieta líquida. A DS e a DL eram similares,
contudo a DL foi umedecida na proporção de 1:1 (dieta:água). As características peso,
espessura de toucinho (ET), triglicerídeos, glicose, ácidos graxos não esterificados
(AGNE) e β-Hidroxibutirato (BHBA) foram avaliadas aos 107 dias de gestação, parto,
7, 14 e 21 dias de lactação, além do intervalo desmame estro (IDE) e duração do estro
(DE). Os dados foram analisados com o procedimento MIXED do software SAS (SAS,
2010) como blocos casualizados, adicionando medidas repetidas no tempo. A análise
para o efeito de tempo foi pelo PDIFF e para tratamento contraste ortogonal, para o
contraste 1, o efeito da suplementação (CT x DS + DL), e contraste 2, o efeito da forma
de suplementação (DS x DL). Os efeitos foram considerados significantes quando
P<0,05. Não houve efeito de interação em nenhuma característica avaliada e optou-se
por apresentar apenas o efeito de tratamento. O desempenho reprodutivo das fêmeas
cujos leitões foram suplementados com DL não diferiu dos demais tratamentos. A partir
39
dos 14 dias de lactação ocorreu uma taxa diferenciada de catabolismo nas mães de
leitões suplementados (DS e DL) com níveis reduzidos de glicose e elevados de
triglicerídeos sanguíneos em relação ao CT, e para triglicerídeos também foi verificado
maior nível no DL comparado ao DS (P<0,05). Aos 21 dias de lactação, evidenciou-se
maior catabolismo nas fêmeas de leitões suplementados com DS, com níveis elevados
de triglicerídeos e AGNE em relação ao DL (P<0,05). Esses resultados demonstraram
que independente da dieta recebida pelos leitões, houve mobilização de tecidos
destinados a mantença e produção de leite, o que corrobora com Haese et al (2010).
Concluiu-se que leitões suplementados com dieta líquida não reduzem o catabolismo
em fêmea lactente.
Agradecimentos: FAPESP Processo nº 2014/14676-9 e ao CNPq/Universal Processo nº
447475/2014-2.
40
Relação dose-efeito da Dexametasona (20mg/d vs 40mg/d vs 80mg/d) no protocolo
de indução de lactação em vacas da raça Holandesa
Rodolfo D. Mingoti,†; Ramos, R.S.*; Bastos, M.R.*; Rezende, M. L. G.*; Freitas, B.
G.*; Roesler, C.*; Traesel, M.*; Rezende, R. G. †;Baruselli, P.S.†
†FMVZ-USP, São Paulo - SP, Brasil; *Ourofino Saúde Animal, Cravinhos, SP, Brasil;
Palavras chave: Corticosteróide; Dexametasona; Holandesa; Protocolo de Indução de
Lactação.
O objetivo do presente estudo foi avaliar diferentes doses de dexametasona (DEX;
20mg/d vs 40mg/d vs 80mg/d) no protocolo de indução de lactação (IL; BST nos d 1, 8,
15, 21; P4 do d 1 ao 8; benzoato de estradiol do d 1 ao 15; PGF2α no d 16) em vacas da
raça Holandesa. Foram analisados o hemograma, o leucograma, a produção e a
composição do leite. O experimento foi conduzido entre maio e julho de 2015. Um total
de 52 vacas holandesas, não lactantes e não gestantes, de oito fazendas foram
distribuídas entre os tratamentos de acordo com os dados retrospectivos de produção
(produção de leite 23,9±0,9kg/d; DEL 411±25 dias; ECC 3,4±0,08) e reprodução
(número de partos 2,4±0,2 e serviços por concepção 6,5±0,5 IA). O estudo foi
desenvolvido em blocos randomizados de acordo com os seguintes grupos
experimentais: Grupo controle: vacas em lactação (GC; n=14); G20: vacas que
receberam o protocolo de IL com 20mg/d de DEX (Cortiflan® Ourofino Saúde Animal,
Brasil; n=12); G40: 40mg/d de DEX (n=13); G80: 80mg/d de DEX (n=13) nos d 19, 20
e 21 do protocolo de IL. Amostras de sangue foram coletadas 21 dias antes do início e
1, 7, 14 e 28 dias após o final do protocolo de IL. Foi utilizado para análise estatística o
PROC MIXED do SAS 9.3 (SAS Institute, Cary, NC 2011). Não houve diferença na
produção de leite (P=0,49) entre G20 (12,6kg/d), G40 (14,7kg/d) e G80 (12,8kg/d).
Porém, animais dos grupos de IL produziram menor quantidade de leite do que GC
(IL=13,3±0,8kg/d; GC=25,2±1,2kg; P<0,0001). A análise de leite apresentou interação
entre tratamento e tempo, revelando padrão superior para G80, padrão intermediário
para G40 e G20 e menor padrão para GC para proteína no leite (P=0,0001), sólidos
totais do leite (P=0,0006) e caseína (P=0,0004) no início da indução de lactação (d1 e
3). Em todos os grupos, os compostos do leite retornaram ao padrão do GC em média
cinco dias após o início da IL. Analises hematológicas apresentaram interação entre
41
tratamento e tempo, revelando maior padrão para G80, padrão intermediário para G40 e
G20, e menor padrão para GC para o neutrófilos (P=0,0001) e relação neutrófilo
linfócito (P=0,0001) no início da IL (d 1, 7 e 14). Todavia, hemoglobina (P=0,01),
hematócrito (P=0,01), eritrócitos (P=0,08) e volume corpuscular médio (P=0,01)
mostraram relação inversa, apresentando menor padrão para G80, padrão intermediário
para G40 e G20 e maior padrão para GC no início da IL (d 1, 7 e 14). Interessante, as
variáveis hematológicas do G20 e G40 retornaram ao padrão mais rápido em relação ao
G80 (média de 28 d após o início da IL). Em conclusão, foi verificada alteração no
perfil imunológico e no padrão qualidade do leite em todas as vacas submetidas ao
protocolo de IL. Porém, vacas que receberam DEX nas doses de 20mg/d e 40mg/d
recuperaram o perfil hematológico para valores de padrões fisiológicos mais
rapidamente do que vacas que receberam 80mg/d de DEX.
Agradecimentos: FAPESP Grant: 2014/19460-4; Ourofino Saúde Animal
42
Estudo dos mecanismos de ação pelos quais o estradiol estimula síntese de PGF2α
endometrial em fêmeas bovinas
M.L. Oliveira1, B.P. Mello1, G. Pugliesi1, R.S. Ramos1, S.C. Scolari1, A. Gonella-
Diaza1, M. Binelli1, C.M.B. Membrive2
1Departamento de Reprodução Animal; Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
– USP, Pirassununga-SP, Brasil
2Universidade Estadual Paulista ‘Julio de Mesquita Filho’ – Unesp, Dracena, SP, Brasil
Palavras chave: Prostaglandina F2α; Luteólise; Biópsia; Endometrio; Estradiol.
Em bovinos, o estradiol (E2) exerce importante participação na liberação de PGF2α
endometrial associada à luteólise. A hipótese é que o estradiol modula a expressão de
genes e proteínas envolvidas na síntese de PGF2α pelo endométrio de fêmeas bovinas.
Vacas Nelore (N=52), cíclicas e não lactantes receberam 2mg de benzoato de E2 via IM
(Sincrodiol, Ouro fino), e um dispositivo intravaginal de progesterona (1g; Sincrogest;
Ourofino) por 8 dias. As vacas receberam 0,5 mg de cloprostenol sódico (Sincrocio;
Ourofino) via IM 48 horas antes da retirada do dispositivo e no momento da retirada.
No dia 15 do ciclo estral (D0; estro), os animais foram divididos para receberem os
seguintes tratamentos, na hora 0 (0h): placebo (P; 5mL de etanol 50%; via IV), estradiol
(E; 5mL de etanol 50% contendo 3mg de 17β E2; IV) ou controle (não tratado).
Biópsias endometriais foram coletadas nos momentos 0h (C; n=10), 4h (E4; n=11 e P4;
n=10) ou 7h (E7; n=10 e P7; n=11). Foram obtidas duas biópsias endometrias por vaca,
para análise de expressão gênica (qPCR) e localização (Imunohistoquímica) das
proteínas de interesse. A expressão gênica foi analisada por ANOVA Two way e
comparação de médias, e a imunomarcação por teste T. A expressão do gene PTGS2 foi
menor nos grupos P7 e E7 comparado aos grupos P4 e E4, respectivamente (P<0,05).
Os genes PLA2G4 e ESR1 foram menos expressos no grupo E4 comparados ao grupo
E7 (P<0,05). A expressão do gene ESR2 foi menor nos grupos E4 e E7 comparada às
demais (P<0,05). Observou-se maior expressão de OXTR nos grupos E4 e E7
comparada às demais (P<0,05). Houve menor expressão de PRKCα no grupo E7
comparada às demais (P<0,05). Verificou-se menor expressão de PRKCβ nos grupos
P7 e E7 comparada às demais(P<0,05). A expressão de AKR1B1 e AKR1C4 foi menor
nos grupos E4 e E7 comparada às dos outros grupos (P<0,05). A proteína PKCγ
apresentou maior imunomarcação (P<0,05) no epitélio luminal (EL) nos grupos E4 e E7
43
comparada aos grupos P4 e P7h (P<0,05) e maior imunomarcação no epitélio glandular
(EG) no grupo E7 comparada à do grupo P7. A proteína AKR1B1 apresentou maior
imunomarcação (P<0,05) no EL nos grupos E4 e E7 comparada aos grupos P4 e P7 e
maior expressão no EG no grupo E4 comparada ao grupo P4. Para ERα houve maior
imunomarcação (P<0,05) no EG dos grupos P4 e P7 quando comparados aos grupos E4
e E7 e maior expressão no EL no grupo P4 quando comparado ao E4. Conclui-se que a
administração de estradiol reduziu a expressão gênica da maioria das proteínas
envolvidas de síntese de PGF2α, com exceção do OXTR. Além disso, o E2 aumentou a
imunomarcação das proteínas PKCγ e AKR1B1, e diminuiu Erα. Especula-se que o E2
cause o aumento dessas proteínas levando a um mecanismo de feedback negativo e,
consequentemente, à diminuição da abundancia dos respectivos transcritos. Assim,
torna-se necessária a quantificação proteica, para identificar se a modulação da
expressão gênica pelo E2 está associada ao aumento da abundância destas proteínas.
44
A adição de 10% de plasma seminal ao sêmen descongelado de suíno melhora o
percentual de espermatozoides móveis totais e progressivos
M. A. Passarelli; Torres, M. A¹; Ravagnani, G. M¹; Leal, D. F¹; Martins, S. M. M. K¹;
Muro, B. B. D¹; Moretti, A. S¹; De Andrade, A. F.C¹.
1.Núcleo de Pesquisa em Suínos, FMVZ, USP, Pirassununga, SP, Brasil.
Palavras chave: Plasma seminal; espermatozoides; suínos; CASA.
A presença de plasma seminal (PS) durante o processo de congelação piora a qualidade
espermática, contudo, sua presença no meio de descongelação, é fundamental para a
obtenção de melhores resultados (Okazaki et al., 2009). Assim, testou-se a adição de
10% de PS ao sêmen suíno descongelado. Foram coletadas 4 frações rica do ejaculado
de 6 cachaços (n=24), e separadas em três alíquotas: não centrifugado (NC),
centrifugado ressuspendido (CR) e centrifugado sem plasma seminal (CS). CR e CS
foram centrifugados à 500 x g/10 min. O pellet obtido de CR foi ressuspendido em
próprio PS, e em CS o sobrenadante (PS) foi retirado, centrifugado novamente, filtrado
em película de 0,2μm e armazenado à -80°C para posterior utilização. CR, NC e o
sedimento de CS foram diluídos em diluente de criopreservação (Botupharma®,
Botucatu-SP, Brasil) à 300x106 espermatozoides/mL, envasados em palhetas de 0,5 mL
e criopreservados em sistema automático (TK Tecnologia em Congelação®, Uberaba-
MG, Brasil) respeitando a curva: -0,5°C/min até 5°C; -20°C/min até -120°C seguida de
imersão em nitrogênio líquido (-196°). Duas palhetas de cada tratamento foram
descongeladas (37°C/30seg) e diluídas em diluente de criopreservação à 50x106
espermatozoides/mL. O tratamento centrifugado adicionado de PS (CP) originou-se de
CS com adição de 10% de PS (obtido durante a centrifugação) ao diluidor (v:v). As
análises foram realizadas após 5, 60 e 120 min de incubação a 37°C. Avaliaram-se
alíquotas de 5µL sob lâmina e lamínula, pelo sistema de análise computadorizada do
sêmen (SCA-Microptic®, Microptic S.L., Barcelona, Espanha). O delineamento
experimental foi em blocos generalizados adicionado do fator medidas repetidas no
tempo. Os dados foram analisados pelo programa SAS (SAS Institute Inc., 2010) e
submetido à anáise dos modelos mistos. Os tratamentos foram avaliados usando
contrastes ortogonais (efeito de centrifugação NC x CR; efeito de plama seminal CS x
CP; efeito de sem plasma seminal CS x NC + CP). Diferenças foram consideradas
significativas quando p<0,05 e todos os resultados foram apresentados em média±EPM.
45
Não houve interação tempo x tratamento (p>0,05) para as variáveis análisadas (MT:
9,39±1,11; 8,67±1,05; 9,01±1,3; 11,67±1,24, MP: 7,61±0,99; 6,91±0,91; 7,48±1,18;
9,62±1,24 para NC, CR, CS e CP respectivamente), logo, estudou-se o efeito principal
de tratamento. A centrifugação do sêmen não afetou a motilidade total e progressiva
(p>0,05). A adição do plasma seminal após descongelação aumenta (p<0,05) tanto o
número de células móveis, quanto sua progressividade. A retirada do plasma seminal
antes da criopreservação não altera as variáveis avaliadas no presente trabalho (p>0,05).
Como não houve efeito de centrifugação, os efeitos da adição e da retirada do plasma
seminal não foram influenciados pelo processo de centrifugação pré-criopreservação.
Portanto, a adição de 10% PS ao meio de descongelação melhora a qualidade pós-
descongelação do sêmen suíno.
Referências: Okazaki, T.; Abe, S.; Yoshida, S.; Shimada, M. (2009): Seminal plasma
damages sperm during cryopreservation, but its presence during thawing improves
semen quality and conception rates in boars with poor post-thaw semen quality.
Theriogenology 71, 491–498.
Agradecimentos: FAPESP Processo 2011/23484-8 e 2013/0870-8 e Botupharma®
46
Efeito do plasma seminal sobre a cinética do espermatozoide suíno refrigerado
Ana Paula P. Pavaneli1, Victor Henrique B. Rigo1,
Anoã M. Vanelli1, Simone M.M.K Martins1, André F. C. De Andrade1
1Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia/USP - Pirassununga/SP
Palavras chave: plasma seminal; espermatozoide suíno; cinética espermática.
O plasma seminal é o produto secretório de diferentes estruturas do trato reprodutivo
masculino e, devido a isso, sua composição química é heterogênea e complexa,
possuindo substâncias que exercem ações variadas tanto no trato reprodutivo masculino
como no feminino. No entanto, o plasma seminal exerce ação contrastante sobre os
espermatozoides suínos, podendo atuar ao mesmo tempo de forma benéfica ou deletéria
sobre a viabilidade dos mesmos. Assim, alguns estudos sugerem que este não seja o
melhor meio para a conservação de espermatozoides in vitro. Diante do exposto, o
objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos do plasma seminal sobre as características
de motilidade do espermatozoide suíno armazenado sob refrigeração a 17°C por 72
horas. Foram obtidos seis ejaculados de seis cachaços (n=36) pelo método da mão
enluvada, sendo coletada somente a fração rica do ejaculado. O sêmen in natura foi
avaliado de forma subjetiva quanto à motilidade e somente ejaculados com motilidade ≥
80% foram utilizados. Estes foram então acondicionados em tubos cônicos de 50 mL e
divididos em três tratamentos: não centrifugado (NC), centrifugado com o plasma
seminal retirado pós-centrifugação (CS) e centrifugado com posterior ressuspensão em
seu próprio plasma seminal (CR). A força de centrifugação utilizada foi de 500xg/10
min. Após centrifugação e diluição em meio BTS (30 x 106 sptz/mL), os diferentes
tratamentos permaneceram 90 minutos em bancada, abrigados da luz e mantidos em
temperatura ambiente, antes de serem refrigerados. Uma vez refrigeradas, as amostras
foram avaliadas através do sistema computadorizado de análise de sêmen (CASA) nos
tempos 0 (90 min pós diluição), 24, 48 e 72 horas. De acordo com os resultados obtidos
neste trabalho, a ausência do plasma seminal durante a refrigeração foi prejudicial para
as características de motilidade diante de uma redução (P ˂ 0.05) na motilidade total
(MT) e progressiva (MP) dos espermatozoides, bem como na frequência de batimento
(BFC), no tratamento CS (MT: 75.93±0.58; 75.34±0.54; 63.29±0.88; MP: 62,43±0,84;
61,36±0,90; 47,43±0,90; BFC: 3,48±0,13; 3,52±0,13; 2,37±0,05), para NC, CR e CS
respectivamente. Os valores de MT e MP também sofreram redução (P ˂ 0.05) ao
47
decorrer das análises (MT: 78.43±0.70; 73.59±0.79; 69.83±0.78; 64.00±0.98; MP:
64.97±0.87; 59.55±0.89; 55.97±0.90; 47.79±0.88), para os tempos 0, 24, 48 e 72 horas,
respectivamente. Não houve efeito de centrifugação (P ˃ 0,05) sobre as análises deste
experimento. Outras variáveis relacionadas à cinética foram avaliadas: velocidade de
trajeto (VAP); velocidade progressiva (VSL); velocidade curvilinear (VCL); amplitude
do deslocamento lateral da cabeça (ALH); retilinearidade (STR); linearidade (LIN) e
células hiperativadas (HIPER), nas quais nenhum efeito de tratamento foi observado (P
˃ 0.05). A motilidade, em conjunto com outras características espermáticas, é condição
essencial para que ocorra a fertilização do oócito. Nesse sentido, o plasma seminal
parece atuar de forma ativa sobre a cinética dos espermatozoides e pode-se assim
concluir que sua ausência em doses inseminantes refrigeradas influencia a mesma de
forma negativa.
48
Imunolocalização de proteínas no processo espermatogênico de suínos adultos
Naira C. G. Pieri1, Aline F. Souza2, Daniele S. Martins2, Fabiana F. Bressan2,3, André
C.F. Andrade1.
1Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia- Universidade de São Paulo, SP, Brasil
2Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo, SP, Brasil
3Departamento de Medicina Veterinária- Faculdade de Zootecnia e Engenharia de
Alimentos da Universidade de São Paulo, Pirassununga, SP, Brasil
Palavras chave: Espermatogônias, células tronco, proteínas.
A linhagem de células germinativas nos mamíferos é composta por células com
capacidade de auto-renovação e diferenciação. Estas células são formadas na
espermatogênese que é um processo extremamente complexo de diferenciação celular,
que inclui três estágios: proliferação, meiose e diferenciação. Entretanto, poucos estudos
têm investigado a biologia destes estágios nas células germinativas in vitro e in vivo em
suínos. Desta forma, o objetivo deste estudo foi identificar as proteínas que participam
do processo espermatogênico e que são de extrema importância para a compreensão
deste processo. Especificamente, foi realizada a análise da morfologia e a
imunolocalização das proteínas STRA8, DAZL, VASA, PLZF e OCT4 no epitélio
seminíferos do testículo de suínos adultos. Para isto, foram coletadas amostras de tecido
testicular de quatro suínos e estas foram fixadas em paraformol 4%, emblocadas em
parafina e posteriormente, cortadas em secções de 5µm. Os tecidos nas lâminas foram
diafanizados em xilol e desidratados em banhos decrescentes de etanol. Em seguida, foi
realizada a coloração de Hematoxilina e eosina e o protocolo de imunofluorescência
para os anticorpos DAZL (1:100), VASA (1:500), PLZF (1:100) e OCT4 (1:100)
(sc27333; Sc67185, sc22839; sc8629 Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) e
STRA8 (1: 100) (ab49602, Abcam, Cambridge, UK). A análise histológica mostrou que
os testículos dos suínos avaliados apresentavam espermatogêneses completa, contendo:
espermatogônias, espermatócitos, espermátides e espermatozoides. Na análise de
imunofluorescência, o PLZF foi detectado em espermatogônias localizadas próximas a
membrana basal, assim como descrito por Costa et al. (2012), segundo os autores o
PLZF está envolvido na autorrenovação e manutenção das células tronco, além de atuar
49
como um regulador epigenético (Puszyk et al. 2013). Nós avaliamos a co-
imunolocalização das proteínas DAZL e STRA8 e notamos que alguns espermatócitos
DAZL+ também eram STRA8+. O DAZL, também foi detectado em espermatogônia
diferenciadas e o STRA8 em espermátides. Segundo Niu et al. (2014), estas proteínas
estão envolvidas nas fases de diferenciação (pré-meiótica) das células germinativa e
ligadas diretamente a fertilidade nos machos. Todas as células germinativas VASA+
nos testículos dos suínos avaliados foram OCT4-. Estes dados podem ser relacionados
aos descritos por Lee et al. (2013), que afirmam que há expressão de OCT4 apenas em
células tronco espermatogoniais (SSCs). Em resumo, nossos achados sugerem que os
mecanismos fisiológicos e o nicho que mantém o processo espermatogênico é
conservado entre os mamíferos. A identificação das proteínas PLZF, DAZL, STRA8 e
VASA no presente estudo providencia um primeiro passo para futuras pesquisas sobre
autorrenovação, diferenciação e a compreensão do nicho das células tronco
germinativas, além de auxiliar no sucesso dos estudos de transplante destas células
como modelo para a infertilidade.
50
Avaliação simultânea das membranas acrossomal e plasmática e potencial
mitocondrial do espermatozoide suíno congelado em diferentes concentrações na
palheta de 0,5mL
Gisele M. Ravagnani1*; Mariana A. Torres1 ; Diego F. Leal1; Bruno B. D. Muro1;
Simone M M K Martins2; André F C De Andrade1
1Laboratório de Andrologia e Tecnologia de Embriões Suínos FMVZ- USP,
Pirassununga, SP;
2Laboratório de Pesquisa em Suínos FMVZ- USP, Pirassununga, SP
Palavras chave: Citometria de fluxo, Concentração Espermática, Congelação.
A congelação do sêmen suíno permite a difusão e conservação de doses inseminantes de
alto valor genético e apresenta-se como uma alternativa para as situações nas quais o
movimento de animais e sêmen é restrito. Inexistem trabalhos na literatura sobre a
interação entre os espermatozoides e diluidor, e não se sabe qual a concentração
espermática na palheta de 0,5mL que melhor conserva o espermatozoide suíno.
Salienta-se que quanto maior a concentração de espermatozoides na palheta menor seria
o número de palhetas descongeladas para obter a dose inseminante (1,5–3x106
espermatozoides). A integridade dessas membranas é de suma importância, por
exemplo, durante a fertilização do oócito. O objetivo deste experimento foi avaliar
através da citometria de fluxo a integridade das membranas plasmática e acrossomal e
potencial mitocondrial do espermatozoide suíno pós-descongelação, congelado em 5
diferentes concentrações, a saber: 100x106, 200x106, 300x106, 600x106 e 800x106
espermatozoides/mL, em palhetas de 0,5 mL. Foram utilizados 5 ejaculados de 5
cachaços híbridos comerciais (n=25). Realizadas as análises iniciais do sêmen in natura,
este foi diluído em meio Botusui® a fim de se obter as 5 diferentes concentrações. O
sêmen diluído foi envasado em palhetas de 0,5 mL e então submetido à congelação. O
sêmen foi descongelado (37°C/30 segundos) e avaliado por citometria de fluxo através
da associação das sondas fluorescentes Hoescht 342, Iodeto de Propídio, FITC-PSA e
JC1 quanto às seguintes características: MIAIAP (Membrana Plasmática Íntegra,
Acrossomo Íntegro e Alto Potencial Mitocondrial), MIARAP (Membrana Plasmática
Íntegra, Acrossomo Reagido e Alto Potencial Mitocondrial), MIAIBP (Membrana
Plasmática Íntegra, Acrossomo Íntegro e Baixo Potencial Mitocondrial), MIARBP
(Membrana Plasmática Íntegra, Acrossomo Reagido e Baixo Potencial Mitocondrial),
51
MLAIAP (Membrana Plasmática Lesada, Acrossomo Íntegro e Alto Potencial
Mitocondrial), MLARAP (Membrana Plasmática Lesada, Acrossomo Reagido e Alto
Potencial Mitocondrial), MLAIBP (Membrana Plasmática Lesada, Acrossomo Íntegro e
Baixo Potencial Mitocondrial) e MLARBP (Membrana Plasmática Lesada, Acrossomo
Reagido e Baixo Potencial Mitocondrial), sendo MIAIAP a de maior importância. Os
dados foram submetidos à análise de variância empregando-se o procedimento MIXED
do programa SAS 2002. Os tratamentos foram avaliados pelo teste de médias PDDIF do
PROC MIXED do programa SAS 2002, consideradando o nível de significânica de 5%.
Os espermatozoides da categoria MIAIAP possuem a capacidade de geração de energia
(mitocôndrias e membrana plasmática intactas), além de terem a capacidade de se
penetrarem na zona pelúcida. Não houve efeito de concentração na MIAIAP. Portanto,
concluímos que é possível realizar a congelação do sêmen suíno em palhetas de 0,5mL
até a concentração de 800x106 espermatozoides/mL sem prejuízo à integridade das
membranas plasmática e acrossomal e potencial mitocondrial.
52
Avaliação endócrino-comportamental do ciclo reprodutivo de pinguins-de-magalhães
(Spheniscus magellanicus) mantidos em cativeiro
1Jéssica Domato Ribeiro; 1Cristiane Schilbach Pizzutto; 1Ricardo José Garcia Pereira
1Departamento de Reprodução Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia;
Universidade de São Paulo
Palavras chave: pinguins, reprodução, programas de luz, comportamento, esteróides
fecais.
Os pinguins-de-Magalhães (Spheniscus magellanicus) têm suas colônias reprodutivas
na costa do Chile, Argentina, Uruguai e ilhas Malvinas/ Falklands, e durante sua
migração invernal são avistadas anualmente em águas do litoral sul e sudeste brasileiro.
Diversas instituições brasileiras abrigam esta espécie, entretanto pouco se sabe sobre
seu comportamento reprodutivo em condições tropicais devido à baixa taxa reprodutiva
destas aves no país. Assim, o propósito deste trabalho é realizar uma avaliação
endócrino-comportamental de indivíduos adultos da espécie mantidos em cativeiro.
Para tanto, 16 indivíduos mantidos pelo pinguinário da SABINA – Escola Parque do
Conhecimento foram monitorados semanalmente por meio de avaliações
comportamentais e coleta de material fecal para dosagens hormonais ao longo do seu
período reprodutivo (setembro a fevereiro) nos anos 2014, 2015 e 2016 após adequação
do recinto para um programa de luz que mimetizasse a quantidade de horas de luz do
ambiente natural de reprodução desta espécie. Após o período de coletas, as fezes foram
submetidas ao protocolo de extração dos metabólitos esteroidais conforme metodologia
descrita por Tempel & Gutiérre (2004), sendo liofilizadas por aproximadamente 24
horas, e posteriormente trituradas. Concluídas as etapas de secagem e trituração, 0,05 g
de excretas foram colocadas em tubos de ensaio de vidro contendo 1,0 mL de metanol
80%, e foram agitadas em vórtex por 30 segundos e posteriormente em agitador de
Kline por 12 horas. Amostras extremamente pequenas (<0,05 gramas) receberam a
quantidade proporcional de metanol 80%, e passaram por igual processo. Após agitação,
todas as amostras foram centrifugadas a 2500 rpm por 20 minutos e os sobrenadantes
foram transferidos para tubos limpos para o processo de dosagem hormonal através de
ensaios imunoenzimáticos (EIA). A escolha dos anticorpos utilizados foi conforme
sugerido por Goymann (2005), baseado em um processo de validação constituído na
realização dos testes de paralelismo, dose-resposta e validação fisiológica. As
53
informações comportamentais foram contabilizadas e divididas em atividades sócias e
reprodutivas. A sequência do estudo se dará com a correlação entre informações
hormonais e comportamentais e submissão dos dados a análise estatística. Com os
resultados finais esperamos possibilitar o desenvolvimento de técnicas de manipulação
e monitoramento do ciclo reprodutivo de pinguins-de-Magalhães e, a longo prazo,
estender estas ferramentas no manejo reprodutivo de aves da família Spheniscidae em
virtude da espécie estudada poder servir como um modelo experimental para o grupo.
54
O controle populacional de animais silvestres diante da sua superpopulação
emergente e os conflitos entre o ser humano e os animais selvagens.
Derek Rosenfield1; Schilbach Pizzutto, C.1
1Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo - VRA
Palavras chave: Conflitos ser humano-animal silvestre; capivara; febre maculosa;
imunocontracepção.
Introdução: Este projeto aborda a relevância de um controle populacional de animais
silvestres frente a uma problemática conflitante: o aparecimento das superpopulações
emergentes de muitas espécies silvestres e o quanto muitas destas conflitam com os
interesses humanos, através de epidemias de doenças, (a exemplo da febre maculosa),
destruição de plantações e acidentes de trânsito por atropelamentos. O grande paradoxo
reside no fato desses conflitos terem sua origem na ação do homem que se expandiu
alcançando os habitats naturais dos animais selvagens, diminuindo, assim, o espaço
disponível para flora e fauna. Some-se a isso o fato de que algumas atividades, como a
poluição e a caça ilegal fazem com que grandes predadores desapareçam, provocando o
surgimento de superpopulações de espécies nativas, invasão e expansão das populações
de animais exóticos. Atualmente, no Brasil, a Hydrochoerus hydrochaeris ou capivara é
exemplo típico desses três tipos de confronto. Observando-se as leis ambientais, que
proíbem caça de animais silvestres, os aspectos éticos e morais envolvidos como o bem
estar do animal, as opções para controle das populações na vida livre são extremamente
limitadas e não existe uma solução única e perfeita. Contudo, um dos métodos mais
promissores e intrigantes é baseado em técnicas de imunocontracepção e contém as
características mais desejadas de um contraceptivo considerado “ótimo” para animais
silvestres. O objetivo desse trabalho é testar a eficiência de uma vacina
imunocontraceptiva e seu prazo de efeito. Os objetivos específicos tem ênfase na
determinação da segurança do produto (observação dos efeitos colaterais patológicos e
comportamentais), verificação de sua facilidade de aplicação em animais da vida livre
(one-shot vaccine), validação dos métodos de análise em capivaras e verificação do seu
custo-benefício no tratamento de grandes grupos. Como materiais e métodos,
pretende-se utilizar 12 exemplares adultos de capivaras (6machos e /6 fêmeas) inteiras,
provenientes de vida livre que pertencem a um grupo de aproximadamente 80
indivíduos e que serão mantidos isolados em recintos construídos especialmente para o
55
desenvolvimento deste trabalho. Uma vez selecionados os animais, serão divididos em 4
grupos, com 3 animais em cada um, assim sendo: Grupo 1: Machos tratados; Grupo 2:
Fêmeas tratadas; Grupo 3: Machos controle; Grupo 4: Fêmeas controle. O projeto está
dividido em 2 fases distintas: pré-tratamento (preparatório/4 meses) e fase de tratamento
(experimental e análises/24meses). Os resultados parciais incluem: estabelecimento do
plano de cooperação com o fabricante da vacina (USDA) e com o projetor de dardos,
cooperação com o local da proveniência dos animais, preparação dos protocolos para
contenção química, análises hormonais, titulação, exames ultrassonográficos, e
preparação dos recintos. Discussão: Baseado no sucesso de trabalhos feitos com mais
de 80 espécies diferentes empregando a vacina anti-GnRH, esperamos êxito no efeito
anticoncepcional (pelo menos por 24 meses) e efeitos colaterais insignificantes, obtendo
assim uma ferramenta alternativa no controle populacional de animais silvestres com
respostas diferentes dos produtos contraceptivos disponíveis no mercado brasileiro.
56
Avaliação de protocolos para reversão sexual em pintinhos de corte e sua
influencia sobre índices reprodutivos
Bruno Rogério Rui1; Felipe Lino Kroetz Neto2; Ricardo José Garcia Pereira1
1Departamento Reprodução Animal – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia –
Universidade de São Paulo
2Merial Brasil – Sanofi Company
Palavras chave: aromatase, avicultura, reversão sexual, frango de corte, P450.
O Brasil é o maior exportador e o segundo maior produtor mundial de carne de frango.
A manutenção desta alta produtividade depende de diversos fatores como manejo
adequado, programa sanitário eficiente e altos índices reprodutivos nos matrizeiros de
frangos de corte. É sabido que o ganho de peso e a conversão alimentar de machos é
melhor quando comparado à de fêmeas. Assim é mais vantajoso economicamente para
os produtores a criação de machos. Neste sentido uma alternativa para atenuar essa
perda de eficiência zootécnica das fêmeas é considerada de grande importância para o
setor avícola. Em aves o sexo genotípico dos machos, ao contrário de mamíferos, é
homogamético ZZ, enquanto as fêmeas são heterogaméticas ZW. O sexo genotípico é
parte fundamental na diferenciação sexual das aves, entretanto outros fatores também
estão associados, como o hormônio anti-Milleriano (AMH), a P450aromatase e também
hormônios sexuais como estrógeno e testosterona. A exposição ao estrógeno durante o
estágio inicial da incubação é fundamental para o desenvolvimento dos ovários nas
fêmeas. A P450aromatase é a responsável pela conversão de testosterona em 17β-
estradiol. Com base nestes conhecimentos estudos com reversão sexual na fase
embrionária de aves foram iniciados na década de 80. A aplicação de estrógenos nos
ovos de embriões machos levaram à inibição do testículo direito e a formação de
ovotestis (ovário-testículos) e até mesmo de ovários. Como a P450aromatase é essencial
na diferenciação sexual de fêmeas, inibidores desta enzima começaram a ser
empregados com sucesso no intuito de induzir a reversão sexual. Diante disso a hipótese
do nosso experimento é que a aplicação do inibidor de aromatase no primeiro dia de
incubação resultaria em um alto do grau de masculinização das fêmeas inclusive
resultando em uma melhor eficiência zootécnica quando comparada a fêmeas não
submetidas ao tratamento. Com isso foram usados dois inibidores de aromatase (A* e
B*) aplicados in ovo no dia 0 de incubação. Após a eclosão as aves foram eutanasiadas
57
e necropsiadas para coleta de fragmentos de fígado para a sexagem genética (PCR) e
gônadas para a realização de estudo histológico. Ainda no momento da necropsia foi
observado o sexo fenotípico e a proporção de machos e fêmeas em cada tratamento.
Ainda, foi avaliada a porcentagem de ovos eclodidos. Em relação a eclodibilidade, não
houve diferença estatística entre os inibidores e o controle. A porcentagem de machos
em relação a fêmeas foi significativamente maior (p< 0.05%) na droga B*. Contudo
ainda faltam os resultados sexagem genotípica além da criação destas aves para
monitoramento da eficiência zootécnica. As fêmeas masculinizadas provavelmente
terão um maior ganho de peso e também melhor conversão alimentar quando
comparadas com as fêmeas controle.
*A nomenclatura e dose das drogas foram omitidas por se tratarem de um experimento
que poderá ser patenteado futuramente.
Agradecimentos: Agradecemos à CAPES pelo apoio financeiro.
58
Relação entre potencial de membrana mitocondrial e motilidade durante a
maturação espermática em bovinos
Bárbara C. S. Silva; Giulia K. V. Kawai; João D. A. Losano; Bruno R. Rui; Andressa
Dalmazzo; Raquel. F. Redondo; Luana C. Bicudo; Camila M. Mendes, C. M.; Mayra E.
O. D. Assumpção,; Marcilio Nichi
¹ Departamento de Reprodução Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Universidade de São Paulo
Palavras chave: epidídimo; motilidade espermática; mitocôndria; metabolismo
energético; maturação espermática.
Estudos têm demonstrado a importância da mitocôndria para a funcionalidade do
espermatozoide, referindo-a como a principal fonte de ATP para sua homeostase e
motilidade. No entanto, o papel da mitocôndria no metabolismo espermático vem sendo
tema de debate. Mukai e Okuno (2004), ao promoverem a despolarização mitocondrial
dos espermatozoides de camundongos e suplementarem estas amostras com substratos
para a glicólise, verificaram que a motilidade se manteve constante. Após a
espermiação, os espermatozoides não possuem motilidade. Este atributo é adquirido
gradativamente durante o processo de maturação ao longo do trânsito epididimário.
Alguns estudos demonstram que a mitocôndria pode não estar diretamente relacionada
com a aquisição da motilidade durante a passagem dos espermatozoides ao longo do
epidídimo. Para estudar a possível relação entre motilidade e função mitocondrial
durante a maturação espermática, coletamos espermatozoides de seis epidídimos
bovinos (N=6), sendo que, estas células foram recuperadas dos diferentes segmentos
epididimários (cabeça, corpo e cauda). Imediatamente após a recuperação espermática,
submetemos as amostras à análise de potencial de membrana mitocondrial (PMM) por
meio do fluoróforo JC-1 e análise computadorizada da motilidade (CASA). Os dados
foram analisados por meio do programa SAS System for Windows (SAS Institute Inc.,
Cary, NC, E.U.A.). Os grupos foram comparados mediante análise de variância
utilizando o teste LSD (p< 0,05 foi considerado significativo). Não observamos
diferenças na porcentagem de células com alto potencial de membrana mitocondrial
quando comparamos os três segmentos do epidídimo (cabeça: 62,91 ± 2,92; corpo:
58,03 ± 5.53 e cauda: 57,20 ± 6,74). No entanto, assim como esperado, observamos
maior porcentagem de células móveis recuperadas da cauda do epidídimo quando
59
comparada às células extraídas do corpo e da cabeça do epidídimo (cauda: 50,5 ± 5,96a;
corpo: 3 ± 1,65b; cauda: 0,66 ± 0,66b). A partir dos resultados obtidos podemos sugerir
que a aquisição da motilidade durante a maturação espermática pode não estar
diretamente relacionada ao potencial de membrana mitocondrial, já que, pudemos
observar elevada porcentagem de células provenientes da cabeça do epidídimo com alto
PMM, onde não há células móveiNo entanto, estudos mais detalhados em relação à
bioenergética do espermatozoide durante a maturação espermática devem ser realizados
para confirmar esta hipótese.
Agradecimento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq).
60
O perfil endócrino peri-ovulatório altera a expressão da DICER e AGO4, mas não
de AGO1, AGO2 ou XPO5 no oviduto bovino.
Kauê Ribeiro da Silva1, Angela María Gonella-Diaza1, Mario Binelli1
1 Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo,
Pirassununga, São Paulo, Brasil.
Palavras chave: microRNAs, RISC, Ampola, Istmo, Esteroides sexuais.
Em bovinos, sabe-se que as concentrações plasmáticas de estradiol (E2) no pró-
estro/estro e de progesterona (P4) no diestro inicial alteram o transcriptoma do oviduto
mediante a ativação dos seus receptores específicos. Os receptores interagem com
outras moléculas no interior da célula alvo para desencadear uma cascata de sinalização.
Diversos estudos sugerem que o receptor de estradiol afeta a biossíntese de microRNAs
(miRNAs) pela sua ligação com proteínas envolvidas neste processo. Sendo assim,
objetivou-se estudar se as variações nas concentrações peri-ovulatórias de E2 e P4
poderiam alterar a abundância de transcritos que codificam para XPO5, DICER e
proteínas Argonautas (AGO1, AGO2 e AGO4) na ampola e istmo de vacas com
diferentes perfis hormonais peri-ovulatórios. Vacas Nelore foram sincronizadas com um
protocolo a base de E2 e P4 para ovularem folículos pequenos (FP-CLP, n=20) ou
grandes (FG-CLG, n=21) e consequentemente resultar em diferente desenvolvimento
luteal e concentrações plasmáticas de E2 e P4 entre os grupos. No dia 4 do ciclo estral,
os animais foram abatidos e amostras de ampola e istmo colhidas. Após extração de
RNA e síntese de cDNA, a abundância de transcritos foi avaliada empregando qRT-
PCR. Os resultados foram analisados empregando ANOVA considerando os efeitos de
grupo, região e sua interação. A XPO5 exporta pré-miRNAs do núcleo até o citoplasma
e sua abundância foi similar entre grupos e regiões. A DICER é uma Ribonuclease tipo
III que é responsável pela clivagem de pré-miRNAs em miRNAs de dupla fita e sua
abundância foi 18,71 e 3,0 vezes maior na ampola e no istmo do grupo FP-CLP quando
comparado com o grupo FG-CLG, respectivamente (interação grupo*região; P=0.08). A
família AGO desempenha papel catalítico no complexo de silenciamento induzido por
RNA (RISC). A abundância de AGO1 e AGO2 foi 8,3 (P=0.02) e 4,2 (P=0,02) vezes
maior na ampola que no istmo, respectivamente, mas não apresentaram efeito de grupo
nem da interação grupo*região. A expressão de AGO4 foi afetada pela interação
região*grupo (P=0.03), onde a abundância de transcrito foi 2,1 vezes maior na ampola
61
que no istmo do grupo FP-CLP e 1,2 vezes maior no istmo que na ampola do grupo FG-
CLG. Concluiu-se que o perfil endócrino peri-ovulatório altera a expressão de DICER e
AGO4, mas não de XPO5, AGO1 e AGO2. Novos estudos onde sejam avaliados os
demais componentes do processo de biossíntese, assim como a identificação de formas
maturas e imaturas de miRNAs específicos são necessários para determinar o papel dos
hormônios esteroidais sob o controle desta via.
62
Efeito da finasterida ou orquiectomia sobre as características hemodinâmicas da
próstata de cães com hiperplasia prostática benigna
Giovana R. Silvestrini1; Angrimani, D.S.R.1; Brito, M.M.1; Abreu, R.A.1;. Vannucchi,
C.I.1.
1Departamento de Reprodução Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade de São Paulo, São Paulo/SP, Brasil
Palavras chave: Hiperplasia Prostática Benigna; Finasterida; Doppler; Orquiectomia;
Cães.
Atualmente, a geriatria em cães vem ascendendo como foco de estudo na Medicina
Veterinária. Entre as afecções intercorrentes da senescência canina, a Hiperplasia
Prostática Benigna (HPB) se destaca, sendo a orquiectomia ou o tratamento
medicamentoso com finasterida as formas terapêuticas mais adotadas. Contudo, ainda
pouco se conhece dos efeitos terapêuticos na hemodinâmica prostática. Desta forma, o
presente estudo objetivou avaliar as características hemodinâmicas e vasculares
prostáticas de cães com hiperplasia prostática benigna submetidos a distintos
tratamentos (orquiectomia ou finasterida). Para tanto, cães diagnosticados com HPB
(anamnese, sinais clínicos e ultrassonografia prostática) foram aleatoriamente alocados
em três grupos: HPB + Orquiectomia (HPB+ORQ - n=5); HPB + Finasterida (HPB+F -
n=5) e HPB (n=5). Os cães foram acompanhados por 3 avaliações em intervalo mensal
(Dia 0, Dia 30 e Dia 60), a partir do procedimento cirúrgico ou início do tratamento
medicamentoso. Por meio da ultrassonografia Doppler, o volume da próstata e o perfil
hemodinâmico da artéria prostática foram avaliados, além da vascularização da próstata
por escore subjetivo (1-3). Os dados foram comparados por ANOVA (p≤0,05). O
volume prostático apresentou redução gradativa no grupo HPB+ORQ, sendo o tempo 0
(51,1±3,7cm³) superior ao dia 30 (30±4,8cm³), o qual superou o dia 60 (16,2±2,4cm³).
Ainda, após 60 dias, o grupo HPB+ORQ apresentou menor volume prostático que o
grupo HPB (52,3±11,7cm³) e HPB+F (42,5±12,3cm³). Quanto ao índice de resistência
(RI) da artéria prostática, no grupo HPB+ORQ, houve aumento progressivo ao longo do
tempo (0,7±0,01, 0,78±0,02 e 0,8±0,009, respectivamente aos 0, 30 e 60 dias). Ainda,
após 60 dias, o RI no grupo HPB+ORQ (0,8±0,01) foi superior ao grupo HPB
(0,6±0,01). A relação sístole / diástole (S/D) da artéria prostática apresentou aumento
gradual no grupo HPB+ORQ. No dia 30, o grupo HPB+ORQ apresentou valores
63
superiores de S/D (5±0,4) em relação ao HPB (3,7±0,3). Já no dia 60, o S/D apresentou
maiores valores no grupo HPB+ORQ (6,1±0,2) e HPB+F (4,7±0,6), em comparação ao
HPB (3,4±0,1). Na análise de grupos, a velocidade ao fim da diástole (ED) foi inferior
no grupo HPB+ORQ (14,9±1,3) em relação aos grupos HPB (20,3±0,78) e HPB+F
(18,8±1,5). Entretanto, na análise da média das velocidades máximas de fluxo
(TAMAX), o grupo HPB+F (28,7±2,1) foi superior ao HPB+ ORQ (22,4±1,9). Quanto
ao escore de vascularização da próstata, houve redução com o decorrer do tempo nos
grupos HPB+F e HPB+ORQ. Além disto, nos tempos 30 e 60, o grupo HPB apresentou
maiores valores em relação ao HPB+F, superando o escore de vascularização do
HPB+ORQ. Em conclusão, ambos tratamentos para a HPB influenciam a
hemodinâmica prostática, diminuindo progressivamente a vascularização da glândula
conforme a progressão do tratamento. Entretanto, a orquiectomia desencadeia tais
efeitos de forma mais intensa e com maior rapidez em relação ao tratamento
medicamentoso com finasterida.
64
Efeito de atributos espermáticos na produção in vitro de embriões bovinos
Adriano F. P. SiqueiraA; Castro, L.S.A; Bicudo, L.C.; Assis, P.M.A; Mendes, C.M.A,B;
Visintin, J.A.B; Assumpção, M.E.O.A.A
ALaboratório da Biologia do Espermatozoide, Departamento de Reprodução Animal,
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo.
BLaboratório de Fecundação in vitro, Clonagem e Transgenia Animal, Departamento de
Reprodução Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade
de São Paulo.
Palavras chave: Qualidade seminal. Citometria de fluxo. Fecundação in vitro.
Fertilidade. Touros.
A produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos é uma ferramenta da reprodução
animal de grande relevância econômica, com aplicações acadêmicas e comerciais.
Apesar da sua aplicabilidade, a eficiência da PIVE ainda pode ser aumentada. Efeitos
espermáticos podem ser evidenciados no desenvolvimento embrionário durante a PIVE
apresentando grandes variações nas taxas de produção. Devido ao aspecto multifatorial
da fertilidade, as avaliações espermáticas têm apresentado resultados inconstantes,
mesmo com o uso de métodos mais precisos de análise como a citometria de fluxo
combinada às sondas fluorescentes, que permitem avaliar maior número de
espermatozoides e de atributos simultaneamente. O objetivo deste estudo foi avaliar o
efeito de atributos espermáticos (motilidade antes e após gradiente de Percoll®,
integridade de membranas plasmática e acrossomal, alto potencial de membrana
mitocondrial e resistência da cromatina) de maneira individual (diferença para apenas
para um atributo espermático entre dois grupos de touros) e de maneira combinada em
perfis espermáticos (diferença para todos os atributos espermáticos simultaneamente,
entre dois grupos de touros e entre dois grupos de partidas de mesmos touros) na PIVE.
Para a seleção e formação dos grupos, foram analisadas 63 partidas provenientes de 35
touros de raças diversas. Após a formação dos grupos, as amostras seminais
selecionadas foram utilizadas na PIVE (n = 365) e o efeito dos atributos espermáticos
foi avaliado por meio das taxas de clivagem, blastocisto e eficiência de
desenvolvimento embrionário (taxa de blastocisto/taxa de clivagem). Os resultados
demonstraram que os atributos motilidade prévia ao Percoll®, a integridade da
membrana acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial apresentam efeito
65
negativo sobre as taxas de desenvolvimento embrionário e de blastocisto. A motilidade
após o gradiente de Percoll®, a integridade da membrana plasmática e a resistência da
cromatina, bem como a combinação de todos os atributos espermáticos analisados, sob
mesmas condições, não apresentaram efeito sobre a PIVE. O efeito negativo sobre as
taxas de PIVE devem refletir o ambiente condicionado durante a FIV, pelos
espermatozoides com estes atributos espermáticos. Estas células provavelmente
apresentam um maior potencial de produção de EROs. Este efeito indireto dos atributos
no ambiente condicionado durante o co-cultivo dos gametas deve ser mais bem
compreendido, a fim de permitir o aprimoramento desta etapa podendo aumentar as
taxas de produção, maximizando a eficiência da PIV.
66
O endométrio bovino responde localmente à presença do embrião 7 dias após a
inseminação
Mariana Sponchiado1; Nathália Souza Gomes2; Patrícia Kubo Fontes3; Maressa Izabel
Santos da Silva4; Thiago Martins5; Guilherme Pugliesi6; Maite Del Collado7; Athos De
Assumpção Pastore8; Marcelo Fabio Gouveia Nogueira9; Mario Binelli10.
1,2,4,5,6,7,10.USP, Pirassununga - SP - Brasil;
3.Unesp, Botucatu - SP - Brasil;
8.CRV Lagoa, Sertãozinho - SP - Brasil;
9.Unesp, Assis - SP - Brasil.
Palavras chave: Desenvolvimento embrionário; útero; Interferon; ISGs.
O trato reprodutivo materno tem um importante papel no desenvolvimento embrionário
inicial. Secreções ovidutais e uterinas provêm o ambiente ótimo de estabelecimento e
manutenção da gestação. Os embriões bovinos produzem interferon-tau (IFN-t) a partir
do dia 6 após a IA. No entanto, não há evidências de sinalização do embrião no
endométrio antes do seu elongamento, o qual ocorre 13 dias após a IA. Nossa hipótese
foi que o embrião afeta o funcionamento do endométrio, incluindo a resposta ao IFN-t,
de maneira espaço-específica 7 dias após a IA. Especificamente, respostas do
endométrio à presença do embrião foram esperadas da região mais proximal à distal ao
oviduto. Vacas Nelore multíparas e não lactantes foram sincronizadas alocadas em um
dos dois grupos experimentais no momento do estro (D0): Controle (Con; n=8), onde a
IA foi mimetizada com diluidor seminal; ou Gestante (Gest; n=16), vacas foram
inseminadas com a mesma partida de sêmen bovino comercial, 12h após o estro. As
vacas foram abatidas no D7 e o corno uterino ipsilateral ao CL foi isolado e dividido em
terço anterior, médio e posterior, a partir da junção útero-tubárica (JUT). Cada terço
uterino foi lavado isoladamente com DMPBS e a presença do embrião no lavado foi
confirmada nas vacas do grupo Gest. Subsequentemente, amostras de endométrio
intercaruncular foram coletadas da JUT e de cada terço uterino. A abundância relativa
de transcritos para os Genes estimulados por interferon (ISGs; MX1, MX2, ISG15,
OAS1, IFI6 e IRF6), Receptor de interferon 2 (IFNAR2), Sintase de prostaglandina E
(PTGES) e genes de referência (GAPDH, PPIA e ACTB) foram avaliadas nas amostras
de endométrio por PCR usando a plataforma Fluidigm (Biomark HD). Dados de
abundância relativa de transcritos foram analisados por split-plot ANOVA (SAS v.9.3).
67
O tamanho do folículo pré-ovulatório, área do CL e concentração plasmática de P4
foram similares entre os grupos (p>0.1). Todos os embriões (n=10) foram encontrados
nos lavados do terço anterior. Verificou-se interação entre grupo e região para a
abundância de transcritos de ISG15 (p<0.02), MX1 (p<0.07), MX2 (p<0.03) e PTGES
(p<0.05). A abundância de ISG15, MX1, MX2 e PTGES foi maior (2.0, 1.5, 1.95 e 1.4-
vezes, respectivamente) na JUT do grupo Gest, porém foi similar nas demais regiões.
Houve efeito de região na abundância de mRNA para IFNAR2 (p<0.04), sendo
aumentada na JUT comparada às demais regiões. Propomos que o IFN-t liberado pelo
embrião atua através de receptores específicos no endométrio para estimular a
transcrição de ISGs e, possivelmente, outros genes. Além disso, a proximidade física do
embrião parece ser necessária para estimular o endométrio, provavelmente pela
capacidade limitada de síntese e secreção de sinais pelo embrião nesta fase inicial. Pela
primeira vez essa resposta do endométrio ao embrião precoce é relatada in vivo.
Potenciais papéis iniciais do IFN-t merecem mais estudos. Especulamos que a
sinalização pelo embrião modula a função endometrial para apoiar o desenvolvimento
embrionário.
68
Validação da técnica de coloração quádrupla por citometria de fluxo: avaliação
simultânea da integridade das membranas plasmática acrossomal e potencial
mitocondrial
Mariana A. Torres1; Díaz, R2; Boguen, R2; Martins, S. M. M. K1; Passarelli, M. S1;
Sepúlveda, N. B2; De Andrade, A. F. C1.
1Núcleo de Pesquisa em Suínos, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade de São Paulo, Pirassununga – SP, Brasil.
2Centro de Biotecnologia em Reprodução, Universidade de La Frontera, Temuco, Chile.
Palavras chave: espermatozoides, membrana plasmática, acrossoma, mitocôndria,
citometria de fluxo.
A avaliação individualizada dos compartimentos espermáticos não garante a fisiologia
normal da célula, uma vez que os espermatozoides necessitam da integridade da
membrana plasmática, do acrossomo e alto potencial mitocondrial para possuir
potencial fertilizante. Portanto, pode-se dizer que as análises que compreendem a
avaliação simultânea de mais de um compartimento espermático auxiliam em um
melhor diagnóstico da funcionalidade espermática (PARKINSON, 2004). Com isso,
esse trabalho objetivou validar uma técnica de citômetria de fluxo para a avaliação
simultânea da integridade das membranas plasmática e acrossomal e do potencial
mitocondrial dos espermatozoides suínos. Para tanto, foi realizada a coleta de uma
fração rica do ejaculado de nove cachaços. Após as análises de motilidade subjetiva e
concentração espermática, o sêmen foi diluido em meio TALP à 25 x 106
espermatozoides/ml e dividido em duas alíquotas, sendo uma mantida em suas
condições naturais (NS) e a outra submetida a três ciclos de congelação rápida e
descongelação lenta (FF). Os tratamentos foram realizados seguindo a proporção (T100)
100:0; (T75) 75:25; (T50) 50:50; (T25) 25:75; (T0) 0:100 para NS:FF. As amostras
foram incubadas com Hoechst 33342 (2.33 µg/ mL), iodeto de propídeo (100 µg/ mL),
PSA-FITC (13.3 µg/ mL) e JC-1 (4.08 µM) por 10 min à 37ºC, e avaliadas por
citometria de fluxo (BD FACS AriaI). A técnica validada foi eficiente (R2 = 0.9378, p =
0.006) para a avaliação da proporção dos espermatozoides que apresentam
simultaneamente a integridade das membranas plasmática e acrossomal e alto potencial
mitocondrial (PIAIC - 59.17 ± 2.71a; 38.38 ± 2.46b; 23.92 ± 2.27c; 12.38 ± 0.97d; 0.64
± 0.30e para T100, T75, T50, T25 e T0 respectivamente). Um método ideal para a
69
avaliação de qualquer parâmetro espermático deve possuir três características: rapidez,
precisão e automatização (YÁNIZ et al., 2013). A técnica da coloração quádrupla dos
espermatozoides, proposta por Celeghini et al (2007) e De Andrade et al (2007), para a
avaliação simultânea por microscopia de epifluorescência da integridade das
membranas plasmática e acrossomal e do potencial mitocondrial, é uma técnica muito
precisa e com alto coeficiente de determinação (R2), mas por ser uma técnica manual
possui a desvantagem do baixo número de células analisadas. Por outro lado, a
citometria de fluxo permite a avaliação de um grande número de células em poucos.
Portanto, o presente trabalho apresenta uma técnica eficiente para a avaliação
simultânea da integridade das membranas plasmática e acrossomal e do potencial
mitocondrial dos espermatozoides suínos.
Agradecimentos: FAPESP processos: 2011/23484-8, 2013/08070-8 e 2014/ 22972-7
70
Análise físico-química do colostro e perfil glicêmico em cordeiros termos e
prematuros
Ana B. G. Vidal1; Regazzi, F. M. 1; Justo, B. M. 1; Abreu, R. A.; Brito, M. M.;
Angrimani, D. S. R.; Almeida, L. L.; Leite, B. A.; Flores, R. B; Vannucchi, C. I.
1Departamento de Reprodução Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
(FMVZ), Universidade de São Paulo (USP).
Palavras chave: Colostro; ovino; imunoglobulinas; glicemia; prematuridade.
Os neonatos ovinos possuem a necessidade de ingestão de colostro para obtenção de
imunidade passiva, já que são desprovidos de qualquer imunidade pelo tipo placentária.
Portanto, para a adequada transferência de imunidade passiva, é preciso garantir a
qualidade de produção e a absorção colostral. Por outro lado, a prematuridade pode
comprometer a colostrogênese fisiológica e absorção do colostro, por imaturidade
gastro-intestinal dos neonatos. Desta maneira, o presente trabalho tem como objetivo
comparar a qualidade colostral e o grau de absorção do colostro, por meio do perfil
glicêmico de cordeiros nascidos termos e prematuros. Para tanto, foram delineados 2
grupos experimentais: Grupo Termo (GT, n=10), formado por cordeiros nascidos aos
150 dias e Grupo Prematuro (GP, n=6), constituído por cordeiros nascidos aos 135 dias.
No grupo GP, o nascimento foi induzido com o antiprogestágeno aglepristone na dose
de 10 mg/kg (SC) por duas aplicações com intervalos de 24 horas a partir de 133 dias
gestacionais. No grupo GT, os nascimentos ocorreram naturalmente aos 150 dias
gestacionais. Os dados foram obtidos a partir da análise da densidade do colostro por
colostrômetro (quantidade de imunoglobulinas e qualidade do colostro) e porcentagem
de sólidos totais (indiretamente concentração de imunoglobulinas G) por refratometria
óptica (porcentagem BRIX). A análise por colostrômetro foi realizada ao nascimento,
enquanto a porcentagem BRIX foi mensurada às 0h, 2h, 4h, 12h, 48h e 72h após o
nascimento. Dos cordeiros, foram obtidas amostras sanguíneas para determinação da
glicemia nos mesmos momentos da análise BRIX. Os dados foram analisados por
ANOVA e teste LSD (p≤0.05). Na avaliação da porcentagem de sólidos totais do
colostro (BRIX), a partir de 24h do nascimento, o grupo GP permaneceu superior ao
grupo GT. No grupo GP, houve decréscimo significativo da porcentagem BRIX ao
longo do tempo, especialmente a partir das 12h em relação ao nascimento. Já no grupo
GT, a porcentagem de sólidos totais reduziu significativamente às 12h e novamente às
71
24h, em relação aos momentos anteriores. Na análise do colostrômetro, não houve
diferença estatística entre os grupos. Na avaliação da glicemia, os resultados do grupo
GP foram estatisticamente inferiores ao grupo GT nos tempos 0, 2, 4, 12 e 24. No grupo
GT, houve aumento da glicemia após 12h do nascimento, permanecendo dentro dos
valores de referência para a espécie. Por outro lado, no grupo GP, o aumento glicêmico
ocorreu apenas a partir de 24h do nascimento, havendo episódios de hipoglicemia nas
primeiras horas de vida. Como conclusão, a prematuridade não influencia a qualidade
colostral ao nascimento, embora a mudança na composição do colostro em leite ocorra
mais lenta e gradativamente quando comparada ao termo. Por outro lado, os cordeiros
prematuros apresentam menor adaptabilidade do perfil glicêmico, com baixa
disponibilidade energética nas primeiras horas do nascimento, a despeito da qualidade
colostral.
