Analisando  área  e  comprimento  foliar  com  ImageJ  –  por  Rafael  E.  Machado  JAN/2012  (machado.rem@gmail.com)  

Antes  de  iniciar  as  medições:  

• Nas  imagens  obtidas  com  scanner  as  folhas  não  devem  estar  sobrepostas.  Caso  estejam  se  tocando  deverá  ser  feita  uma  pequena  correção  com  editor  de  imagens  apagando  as  áreas  de  contato,  lembrando  que  este  processo,  mesmo  que  sensivelmente,  irá  reduzir  a  área  da  folha.  Há  uma  alternativa  no  próprio  ImageJ  que  envolve  selecionar  a  imagem  desejada  com  algumas  das  ferramentas  de  seleção  da  barra  de  ferramentas.  

• Não  há  necessidade  de  preencher  os  espaços  vazios  do  interior  das  folhas  (ex.:  buracos  de  herbívoros).  • É   imprescindível   saber   a   resolução   da   imagem   em   dpi.   Isso   não   é   a   mesma   coisa   que   o   tamanho   (ex.:  

1024x768).  Caso  você  não  saiba  o  dpi  da   imagem,  você  pode  ver   isso  no  Photoshop  ou  em  um  software  gratuito  chamado  XnViewMP  (http://www.xnview.com).  

Configurando  a  escala:  

• dpi   significa  o  número  de  pixels  por  polegada   (inch)  em  uma  dimensão.  Dessa   forma,   cada   resolução  de  imagem  (150,  300  dpi)  possui  um  número  diferente  de  pixels  por  unidade  de  medida.  Como  a  unidade  de  interesse  é  centímetros,  o  ajuste  deve  ser  feito  da  seguinte  forma:    1)  na  calculadora  dividir  a  resolução  da   imagem  por  2,54  (1   inch  =  2,54  cm)  –  dpi/2,54  (ex.:  300/2,54  =  118,11);    

2)  no  ImageJ,  em  Analyse  –>  Set  Scale  e  preencher  como  na  figura  abaixo  e  dar  OK  (o  primeiro  campo  é  o  valor  obtido  na  calculadora).  

 

 

OBS.:  Provavelmente  esse  ajuste  deverá   ser   feito  a   cada  vez  que  o  programa   for  aberto!!!  Mas   se  mantém  entre  uma  imagem  e  outra,  caso  não  tenha  fechado  o  programa  antes.  

____________________________________________________________________________________________________________________________________  

1. Ao  iniciar  o  programa  clicar  em  Open  do  menu  File,  selecionar  a  imagem  a  ser  analisada.    2. No  menu  Image  clicar  em  Type  –>  8-­‐bits  para  transformar  a  imagem  em  escala  de  cinza.  Caso  a  imagem  já  

tenha  sido  escaneada  em  escala  de  cinza,  pular  para  o  ítem  seguinte.  3. No  menu   Image   selecionar  Adjust   e   clicar   em  Threshold.   Definir   a   imagem   em  preto   e   branco   (B&W).   A  

janela  Threshold  poderá  já  ser  fechada.    

 

 4. No  menu  Analyze  clique  em  Set  Measurements  e  marque  as  opções  Area,  Feret’s  diameter  e  Display  label,  e  o  

que  mais   for  de   interesse  para   a   análise,   e   então   clique   em  OK.  Feret’s   diameter  mede  a  maior  distância  entre  dois  pontos  do  polígono  selecionado,  o  que  corresponde  ao  comprimento  da  folha.    NOTA:  essas  configurações  deverão  ser  realizadas  apenas  uma  vez,  o  programa  irá  mantê-­‐las  para  futuras  análises  com  outras  imagens.  

   

5. No  menu  Analyze   selecionar  Tools   e   clicar  em  ROI  Manager   (ROI  =  Regions  Of   Interest),   e  uma   janela   se  abrirá,  mantenha-­‐a  aberta.    

6. Selecione  a  ferramenta  Wand  (tracing)  da  barra  de  ferramentas  do  ImageJ.  

 7. Clique  em  uma  folha  e  ela  será  selecionada  e  um  contorno  em  amarelo  aparecerá.  Na  janela  ROI  Manager  

clique  em  Add  (ou  simplesmente  “t”).  Repita  o  processo  em  cada  folha  da  imagem.  Por  fim  selecione  todas  as  folhas  clicando  sobre  as  imagens  com  a  tecla  Shift  pressionada  e  clique  novamente  em  Add.  Estes  valores  correspondem  à  coordenadas  na  imagem  das  folhas  selecionadas,  sendo  o  último  valor  correspondente  ao  somatório  de  todas  as  folhas.    

 

OBS.:   é   importante   certificar-­‐se   de   que   antes   de   adicionar   a   folha   à   lista   ROI   Manager   esta   esteja  devidamente  contornada  em  amarelo.  Algumas  vezes  a  seleção  é  feita  em  algum  pequeno  polígono  interno  da  folha,  o  que  acarretará  em  um  erro  sério  de  medida.  Quando  isso  acontece,  no  Results  (passo  8)  o  valor  apresentado  será  muito  pequeno  (ex.:  2.222E-­‐5)  

 8. Retornando  à  janela  ROI  Manager,  clique  em  Measure.  

 

Uma   janela   Results   aparecerá   com   os   valores   de   cada   folha.   A   última   linha   da   lista   corresponde   às  medições  de  todas  as  folhas  juntas,  caso  você  tenha  procedido  exatamente  como  descrito  no  passo  5.  Salve  os  Results  em  File  -­‐>  Save  As.  Dê  o  mesmo  nome  da  imagem.  O  arquivo  salvo  será  uma  planilha  Excel  que  será   utilizado   para   a   obtenção   dos   valores   de   área   em   cm2.   É   possível   copiar   os   dados   diretamente   da  janela  Results  e  colar  em  uma  planilha  Excel.  

 

Casos  especiais  e  algumas  soluções  

1. Selecionando   foliólulos   de   leguminosas   tipo   mimosáceas:   para   não   ter   que   selecionar   um   a   um   dos  foliólulos,   em   primeiro   lugar   delete   tudo   da   imagem   que   não   seja   desejado   (por   exemplo,   sujeiras,  sombras,  ...).  Para  isso  utilize  qualquer  uma  das  ferramentas  de  seleção  da  barra  do  ImageJ  e  aperte  Delete  no  teclado.  

  Aumente  o  contraste  da  imagem  (Process  -­‐>  Enhace  Contrast  -­‐>  50%  -­‐>  OK).  Em  Process,  clique  em  Binary  -­‐>  Make  Binary.  Novamente  em  Process,  clique  em  Binary  -­‐>  Fill  Holes   (para  preencher  os  espaços  internos  das  folhas).  Na  sequência,  vá  em  Edit  -­‐>  Selection  e  clique  na  opção  Create  Selection.  Pronto,  estão  selecionados  cada  foliólulo.    

2. Ao  transformar  a  imagem  em  B&W  a  imagem  fica  com  áreas  brancas  nas  bordas:  

    Isto  ocorre  por  causa  do  excesso  de  brilho  em  algumas  parte  da  imagem.  Neste  caso  há  3  coisas  que  podem   ser   feitas,   aumentar   o   contrate   (Process   -­‐>   Enhace   Contrast   -­‐>   50%   -­‐>   OK),   aumentar   Threshold  

manualmente   (na  maioria   das   vezes   isso   resolve)   e/ou   preencher  manualmente   o   contorno   das   bordas  com   a   ferramenta   Paintbrush   da   barra   de   ferramentas.  Não   há   necessidade   de   preencher   o   interior   da  figura.