MARCELLA MERGULHÃO TAGLIARINI

ANÁLISE CITOGENÉTICA COMPARATIVA ENTRE OS REPRESENTANTES DAS FAMILIAS CATHARTIDAE E

ACCIPITRIDAE: INFERÊNCIAS SOBRE SUAS RELAÇÕES FILOGENÉTICAS E EVOLUÇÃO

CARIOTÍPICA

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Neurociências e Biologia Celular, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Genética. Orientador: Prof. Dr. Edivaldo H. C. de Oliveira BELÉM

2007

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À família que é a chave para tudo!

3

AGRADECIMENTOS: Muitas pessoas fizeram parte da minha jornada até este ponto da minha vida e de alguma forma contribuíram para meu crescimento pessoal e profissional, a todas elas meus sinceros agradecimentos. No entanto, algumas pessoas foram primordiais para meu aprendizado, participando do meu dia-a-dia, e me dando apoio e suporte para que eu traçasse meu caminho até aqui: - Agradeço à Deus, por me amar profundamente e estar ao meu lado mesmo quando eu não merecia. - Aos meus pais Eduardo Marechal Tagliarini e Rosa Maria Mergulhão Tagliarini por serem tudo pra mim, por terem me dado condições e sempre terem valorizado o conhecimento, superestimando-o e sempre preocupando-se com nossa educação. Obrigada pelo apoio e pelo amor incondicional. Espero conseguir retribuir tudo isso de alguma forma. Meu amor por vocês é infinito! - Aos meus irmãos Denise Mergulhão Tagliarini e Eduardo Mergulhão Tagliarini e ao meu filho Pingo Harrison de Madagascar por serem meu porto seguro, para quem eu volto todos os dias, por me acompanharem independente do caminho a ser trilhado e por me amarem acima de qualquer coisa. Amo muito vocês. - À todos meus amigos, os quais seria impossível listar aqui, por todos os momentos de alegria, descontração e conselhos. E em especial agradeço a três amigas que são irmãs que eu escolhi ter: Luciana Quintana, Caroline Moreira e Denise Costa. Não tenho palavras pra descrever o que vocês significam pra mim. Obrigada por cada sorriso, cada lágrima, cada madrugada, cada explicação, cada conselho, cada demonstração de carinho, cada tarde se empanturrando de comida em um lugar qualquer ou “peruando” no shopping. São momentos como esses que fazem a vida da gente valer a pena. Amo vocês! - Ao meu amigo, companheiro, conselheiro, cúmplice e amado, Rodolfo Santana pelo carinho, suporte e paciência durante todo esse tempo. A sua presença é imprescindível e é o que faz tudo ter sentido. Eu te amo!! - Ao meu orientador Edivaldo Herculano Corrêa de Oliveira por ser pra mim algo difícil de descrever. Você é um anjo na minha vida. Apenas sua forma de falar já torna todas as coisas mais simples. Obrigada por dedicar tanto tempo a mim e apostar na minha capacidade. Não sei o que seria de mim sem você! - À toda equipe do Laboratório de Citogenética da UFPA. Obrigada pela torcida e por tornar o ambiente de trabalho algo tão agradável. - Aos Criadouros e ao PZMPEG que colaboraram cedendo o material biológico; ao CNPq, pela bolsa e à UFPA por toda infra estrutura que me foi fornecida.

4

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 1 1.1 OS PROBLEMAS DA CLASSIFICAÇÃO 1 1.2 ORDEM FALCONIFORMES 4 1.3 ORDEM CATHARTIFORMES 10 1.4 CITOGENÉTICA DE AVES 11 1.5 DADOS DE PINTURA CROMOSSÔMICA EM AVES 14 1.6 A APLICAÇÃO DOS ESTUDOS CROMOSSÔMICOS EM

ANÁLISESFILOGENÉTICAS. 18

1.7 DADOS CITOGENÉTICOS DE FALCONIFORMES E CATHARTIFORMES

20

2 OBJETIVOS 24 2.1 OBJETIVO GERAL 24 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 24 3 MATERIAL E MÉTODOS 25 3.1 COLETA DE AMOSTRAS 25 3.2 CULTURA DE LEUCÓCITOS 25 3.3 CULTURA DE FIBROBLASTOS 26 3.4 PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS 28 3.5 TÉCNICAS DE COLORAÇÃO E BANDEAMENTOS

CROMOSSÔMICOS 28

3.6 TÉCNICAS DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU COM FLUORESCÊNCIA (FISH)

30

3.6.1 Hibridação fluorescente in situ (FISH) com sonda de DNAr 18S/28S 30 3.6.2 Hibridação fluorescente in situ (FISH) com sonda cromossomo-

específicas de Gallus gallus 31

3.6.3 Desnaturação das Sondas de DNA e dos Cromossomos Metafásicos

32

3.6.4 Hibridação e detecção dos sinais correspondentes 33 3.7 ANÁLISE CARIOTÍPICA 34 3.8 ORGANIZAÇÃO DO CARIÓTIPO 35 4. RESULTADOS 34 4.1. O CARIÓTIPO DAS ESPÉCIES DE CATHARTIDAE 34 4.2 O CARIÓTIPO DAS ESPÉCIES DE ACCIPITRIDAE 40 4.3 EXPERIMENTOS DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU 53 4.3.1 Hibridizações com 18s/28s r-dna 53 4.3.2 Hibridizações com sondas cromossomo-específicas de gallus

gallus 57

5. DISCUSSÃO 59 5.1 SISTEMA INTERNACIONAL PARA PADRONIZAÇÃO DO CARIÓTIPO

DE AVES 59

5.2 O COMPLEMENTO CROMOSSÔMICO DAS ESPÉCIES DA FAMÍLIA CATHARTIDAE

60

5.3 O COMPLEMENTO CROMOSSÔMICO DAS ESPÉCIES DA FAMÍLIA ACCIPITRIDAE

64

5.4 DADOS CROMOSSÔMICOS E A POSIÇÃO FILOGENÉTICA DE CATHARTIDAE E ACCIPITRIDAE

69

6. CONCLUSÃO 73 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 76 ANEXO

5

LISTA DE FIGURAS

Figura 01 Algumas das propostas de Classificação para a ordem

Falconiformes (Fonte: Griffiths, 1999)................................ 01

Figura 02 Proposta de Sibley & Alhquist (1999) para a classificação de Falconiformes, incluindo esse grupo como uma infra-ordem dentro de Ciconiiformes, e excluindo Cathartidae, que foi incluída na infra-ordem Ciconiidae..........................

03

Figura 03 Proposta das relações filogenéticas dos diferentes gêneros de Accipitridae, de acordo com LERNER & MINDELL (2005).................................................................

07

Figura 04 Estudos baseados em sequenciamento do gene cyt-b e em distâncias de hibridização de DNA, incluindo cegonhas (família Ciconiidae) e alguns gêneros de abutres do Novo Mundo (SLIKAS, 1997)...........................

09

Figura 05 O típico cariótipo das Aves inclui um pequeno número de macrocromossomos (entre oito e dez pares) e um grande número de microcromossomos, como Ara chloroptera (DE OLIVEIRA et al., 2006)

13

Figura 06 Princípio da técnica de pintura cromossômica (uso de sondas cromossomo-específicas marcadas com fluorescência): cromossomos de uma determinada espécie são isolados e marcados com um fluorocromo ou uma molécula repóter. Ao ser hibridizado no cariótipo de outra espécie, essas sondas marcarão o segmento ou cromossomo com o qual apresenta homologia (baseado em DE OLIVEIRA, 2001)....................................................

14

Figura 07 Rearranjos cromossômicos no cariótipo da harpia (Harpia harpyja). Comparado com o cariótipo ancestral hipotético das aves (2n = 80), o cariótipo da harpia passou por uma grande reorganização, com a ocorrência de fusões e fissões cromossômicas envolvendo tanto os macrocromossomos como os microcromossomos. Entre os autossomos, as sondas cromossomo-específicas de Gallus gallus utilizadas na comparação corresponderiam a 10 pares de macrocromossomos e 20 pares de microcromossomos no cariótipo ancestral. Os pares GGA1-6 foram identificados individualmente. O par sexual não se encontra representado no esquema (baseado em DE OLIVEIRA et al., 2006)..................................................

20

Figura 08 Figura 08 – A: Cariótipo do urubu rei (Sarcoramphus papa) em coloração convencional, com 2n=80 e NF=90; B: Idiograma representando os pares de macrocromossomos de S. papa, mais o par sexual (Legenda: m=metacêntrico; sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico; a=acrocêntrico).....................................

35

Figura 09 Padrão de bandeamento G dos pares de 1 a 20 do urubu rei (Sarcoramphus papa)...................................................

36

Figura 10 Padrão de bandeamento C de Sarcoramphus papa. O cromossomo W apresenta-se indicado..............................

36

Figura 11 A: Cariótipo do urubu de cabeça vermelha (Cathartes

aura) em coloração convencional, com 2n=80 e NF=90; B:

Idiograma representando os pares de

macrocromossomos e o par sexual (Legenda:

m=metacêntrico; sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico;

a=acrocêntrico)..................................................................

38

6

Figura 12 Padrão de bandeamento G dos pares de 1 a 10 do urubu de cabeça vermelha (Cathartes aura)................................

39

Figura 13 Padrão de bandeamento C de Cathartes aura. O par 8,

heteromórfico, apresenta-se indicado. 39

Figura 14 A: Cariótipo do urubu de cabeça amarela (Cathartes burrovianus) em coloração convencional, com 2n=80 e NF=90; B: Idiograma representando os pares de macrocromossomos e o par sexual (Legenda: m=metacêntrico; sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico; a=acrocêntrico).

41

Figura 15 Padrão de bandeamento G dos pares de 1 a 10 do urubu de cabeça amarela (Cathartes burrovianus).

42

Figura 16 Padrão de bandeamento C de Cathartes burrovianus. O cromossomo W apresenta-se indicado.

42

Figura 17 A: Cariótipo da harpia (Harpia harpyja) em coloração

convencional, com 2n=58 e NF=102; B: Idiograma

representando o cariótipo dessa espécie (Legenda:

m=metacêntrico; sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico;

a=acrocêntrico).

44

Figura 18 Padrão de bandeamento G de Harpia (Harpia harpyja),

fêmea. 45

Figura 19 Padrão de bandeamento C de Harpia harpyja. O cromossomo W apresenta-se indicado.

46

Figura 20 A: Cariótipo do gavião pega macaco (Spizaetus tyrannus)

em coloração convencional, com 2n=68 e NF=108; B:

Idiograma representando o cariótipo dessa espécie

(Legenda: m=metacêntrico; sm=submetacêntrico;

st=subtelocêntrico; a=acrocêntrico).

47

Figura 21 Padrão de bandeamento G do gavião pega macaco (Spyzaetus tyrannus), fêmea.

48

Figura 22 Padrão de bandeamento C de Spizaetus tyrannus. O cromossomo W apresenta-se indicado

49

Figura 23 A: Cariótipo do gavião branco (Leucopternis albicollis) em

coloração convencional, com 2n=66 e NF=104; B:

Idiograma representando o cariótipo dessa espécie

(Legenda: m=metacêntrico; sm=submetacêntrico;

st=subtelocêntrico; a=acrocêntrico).

51

Figura 24 Padrão de bandeamento G do gavião branco

(Leucopternis albicollis), fêmea 52

Figura 25 Padrão de bandeamento C de Leucopternis albicollis. O

cromossomo W apresenta-se indicado. 53

Figura 26 Hibridizações com sondas 18S/28S R-DNA em Cathartidae. A, C e E mostram sinal da sonda em amarelo, e o contra-corante DAPI em azul. B, D e F mostram padrão de DAPI invertido. O cromossomo W está indicado no caso das fêmeas. A e B: Sarcoramphus

7

papa; C e D: Cathartes aura; E e F: Cathartes burrovianus.

54

Figura 27 Hibridizações com sondas 18S/28S R-DNA em

Accipitridae. A, C e E mostram sinal da sonda em

amarelo, e o contra-corante DAPI em azul. B, D e F

mostram padrão de DAPI invertido. A e B: Harpia harpyja;

C e D: Spizaetus tyrannus; E e F: Leucopternis albicollis.

56

Figura 28 Resultado da hibridização de sondas cromossomo-

específicas de Gallus gallus (cromossomos 1 a 4) em

metáfases de Cathartes aura. O sinal das sondas é

mostrado em amarelo, e o contracorante DAPI em azul.

57

Figura 29 Resultado da hibridização de sondas cromossomo-

específicas de Gallus gallus (cromossomos 5 a Z) em

metáfases de Cathartes aura. O sinal das sondas é

mostrado em amarelo, e o contracorante DAPI em azul

58

Figura 30 Mapeamento dos cromossomos de Gallus gallus (à direita

dos cromossomos) no cariótipo de Cathartes aura. 58

LISTA DE TABELAS Tabela I Espécies analisadas no presente trabalho 23

LISTA DE ANEXOS

Anexo I Variação cariotípica em Accipitridae (Amaral e Jorge,

2003)

8

RESUMO

Três espécies da família Cathartidae (Sarcoramphus papa, Cathartes aura e Cathartes burrovianus) e três espécies da família Accipitridae (Harpia harpyja, Spizaetus tyrannus e Leucopternis albicollis) foram analisados citogeneticamente através de técnicas de citogenética clássica e molecular. As espécies de Cathartidae mostraram cariótipos muito semelhantes, com número diplóide igual a 80 e NF=90, dez pares de macrocromossomos, o cromossomo Z sumbetacêntrico e o W metacêntrico. O uso de sondas de R-DNA mostrou a localização de regiões organizadoras de nucléolo em um pequeno par nas três espécies. Houve diferenças na distribuição e quantidade de blocos heterocromáticos, sendo que em S. papa houve apenas marcações pericentroméricas e no cromossomo W, enquanto nas duas espécies de Cathartes observaram-se blocos heterocromáticos no braço longo de um par de acrocêntricos. A hibridização de sondas cromossomo-específicas de Gallus gallus em Cathartes aura mostrou total conservação dos cromossomos de 1 a 7 e Z, exceto o cromossomo 4 de Gallus, que corresponde a dois cromossomos em C. aura. As espécies de Accipitridae analisadas mostraram grande variação cariotípica, com números diplóides diferentes. Harpia harpyja apresentou o menor número diplóide, com 54 cromossomos. Spizaetus tyrannus apresentou 2n=68 e Leucopternis albicollis 2n=66. Essas espécies apresentaram cariótipos graduais, sem separação clara entre macro e microcromossomos, e apenas um pequeno número de cromossomos puntiformes. O uso de sondas de R-DNA revelou dois pares portadores de regiões organizadoras de nucléolo em H. harpyja, um pequeno par em S. tyrannus e um cromossomo médio em L. albicollis. Enquanto H. harpyja apresentou segmentos heterocromáticos na região pericentromérica de todos os seus cromossomos, S. tyrannus e L. albicollis apresentaram poucos cromossomos marcados pelo bandeamento C. Em comum, todas elas apresentaram blocos heterocromáticos mais extensos no cromossomo W. A análise cariotípica de Cathartidae e Accipitridae revela duas tendências diferentes, pois enquanto Cathartidae conserva um cariótipo ancestral, Accipitridae apresenta um complemento muito derivado. Isso coloca Cathartidae mais basal em relação a Accipitridae e Falconidae. Entretanto, os dados citogenéticos ainda são muito incompletos para o esclarecimento das relações filogenéticas entre essas famílias e outros grupos, como Ciconiidae.

9

ABSTRACT

Three species of family Cathartidae (Sarcoramphus papa, Cathartes aura and Cathartes burrovianus) and three species of Accipitridae (Harpia harpyja, Spizaetus tyrannus e Leucopternis albicollis) were analyzed through classical and molecular cytogenetic techniques. Cathartidae species showed very similar karyotypes, with a diploid number of 80 and NF=90, ten pairs of macrochromosomes, the Z chromosome submetacentric and the W metacentric. The use of R-DNA probes showed nucleolar organizer regions on a small pair in all the species species. They showed differences in the amount and distribution of heterochromatic blocks. S. papa showed heterochromatin only on the pericentromeric region and on W chromosome, while both species of Cathartes had heterochromatic blocks also on the long arm of an acrocentric pair. The hybridization of Gallus gallus chromosome specific probes onto Catharte aura chromosomes revealed the conservation of chromosome 1 to 7 and Z, except chromosome 4, which corresponded to two different pairs in C. aura. The species of Accipitridae showed a great chromosomal variation, with different diploid numbers. Harpia harpyja had the lower diploid number, 2n=54. Spizaetus tyrannus had 2n=68 and Leucopternis albicollis 2n=66. These species showed gradual karyotypes, without a clear distinction between macro and microchromosomes, and only a few pairs of tiny chromosomes. The use of R-DNA probes showed two NOR-bearing pairs in H. harpyja, a small pair in S. tyrannus and a medium sized chromosome pair in L. albicollis. While H. harpyja showed heterochromatic segments on the pericentromeric region of all the chromosomes, S. tyrannus and L. albicollis showed few chromosomes with C-positive bands. In common, the three species showed larger blocks on the W chromosome. The karyotypic analysis in Cathartidae and Accipitridae reveals two different tendencies: while Cathartidae retained the Avian ancestral karyotype, Accipitridae showed much derived complements. This fact places Cathartidae in a more basal position in relation to Accipitridae and Falconidae. However, the cytogenetic data are still incomplete to clarify the phylogenetic relationship between these families and other groups, such as Ciconiidae..

10

1. INTRODUÇÃO

1.1 OS PROBLEMAS DA CLASSIFICAÇÃO

A ordem Falconiformes é um grupo de aproximadamente 290 espécies

que inclui aves de rapina exímias caçadoras diurnas e espécies

especializadas na necrofagia. A sistemática dos falconiformes encontra-se

entre as mais problemáticas dentre as Aves, e um grande número de aves de

rapina foi agrupado em uma única ordem porque, historicamente, as

propostas de classificação dependiam principalmente da estrutura das patas

e do bico (FEDUCCIA, 1999) (Fig. 01).

Figura 01 – Algumas das propostas de Classificação para a ordem Falconiformes (Fonte: Griffiths, 1999).

11

Tanto o monofiletismo como as relações das famílias dentro da própria

ordem estão em questão. Não existem registros fósseis indicando que as

diferentes famílias originaram-se de um ancestral comum, sugerindo assim,

que os Falconiformes podem ter resultado de uma convergência evolutiva

entre grupos de origem polifilética, fazendo com que não haja nenhuma

relação estrita entre as espécies fósseis e as espécies viventes (BROWN &

AMADON, 1968; FEDUCCIA, 1980; DEL HOYO et al., 1994).

De acordo com classificações morfológicas tradicionais (BROWN &

AMADON, 1968; STORER, 1971; STRESEMAN & AMADON, 1979;

CRACRAFT, 1981), Sagittaridae, Cathartidae, Acciptridae e Falconidae

pertencem à ordem Falconiformes. No entanto, baseado em detalhados

estudos morfológicos de muitas famílias, JOLLIE (1976,1977) concluiu que os

Falconidaes e Acciptridaes não são proximamente relacionados. De acordo

com essa interpretação, a ordem Falconiformes é polifilética, especialmente

com respeito à inclusão dos abutres do novo mundo (Cathartidae); essa visão

é apoiada por estudos de muitos tratos comportamentais (KÖNIG, 1982) e,

mais recentemente por análises moleculares (SIBLEY & AHLQUIST, 1990;

SEIBOLD & HELBIG, 1995; WINK et al., 1998).

SIBLEY & AHLQUIST (1990) estimaram a similaridade genômica total

por hibridização DNA-DNA e propuseram uma nova classificação das aves,

onde os abutres do novo mundo aparecem proximamente relacionados às

cegonhas (Ciconiidae). Na classificação deles, o táxon falconiforme é

colocado dentro de uma ordem expandida, os Ciconiiformes que inclui a

infraordem Falconides (incluindo Falconidae e Accipitridae) e Ciconiides

12

(incluindo a família Ciconiidae com as subfamílias Cathartinae e Ciconiinae)

(Fig.02).

Figura 02 – Proposta de Sibley & Alhquist (1999) para a classificação de Falconiformes, incluindo esse grupo como uma infra-ordem dentro de Ciconiiformes, e excluindo Cathartidae, que foi incluída na infra-ordem Ciconiidae.

13

Análises de seqüências do gene citocromo b (cyt b) (AVISE et

al.,1994; SEIBOLD & HELBIG, 1995; WINK et al.,1998) apóiam essa posição

taxonômica para os abutre do novo mundo, mas a relação dos Ciconiidae

com respeito aos Acciptridae e Cathartidae ainda não foi resolvida.

A lista de aves do Brasil apresentada pelo Comitê Brasileiro de

Registros Ornitológicos (CBRO) (disponível em http: www.ib.usp.br/cbro) tem

uma estrutura, sobretudo a seqüência, baseada grandemente na lista de

aves do SACC (South American Classification Committee da AOU –

American Ornithologists’ Union), mas há discordâncias diversas. Dessa

forma, levando em consideração a controvérsia da relação entre os abutres

do Novo Mundo, os remanescentes Falconiformes e os Ciconiiformes, a lista

do CBRO inclui esses grupos em três ordens distintas: Cathartiformes,

Falconiformes e Ciconiiformes. A inclusão dos abutres do Novo Mundo na

ordem Cathartiformes já havia anteriormente sido sugerida por alguns

autores, baseados em dados morfológicos (JOLIE, 1977) e citogenéticos (DE

BOER & SINOO, 1984), entre outros.

1.2 FAMILIA ACCIPITRIDAE

Inclui aves de rapina diurnas e os necrófagos do Velho Mundo, unidas

por certos caracteres relacionados à predação, como o bico curto e afiado,

em forma de gancho, com uma massa macia em sua base superior, chamado

de cera, sendo o local por onde passam suas narinas. As patas apresentam-

se fortes e com garras longas e curvadas e com um dedo oposto

(FEDUCCIA, 1999).

14

Os jovens têm um rápido crescimento de sua plumagem primária,

seguido de seis a oito semanas de cuidados no ninho para realizar o seu

primeiro vôo. E no período de um a três anos de idade são considerados

adultos ainda sexualmente imaturos. Os sexos em geral se assemelham

quanto ao colorido. Macho e fêmea distinguem-se geralmente pelo tamanho,

sendo freqüentemente a fêmea maior, podendo chegar a ser um terço maior

que seu companheiro (SICK, 1997).

Esta família inclui aproximadamente 65 gêneros, distribuída por todo o

mundo, com exceção do continente Antártico, e com sua diversidade maior

concentrada nos Neotrópicos (SICK, 1997). Apesar de diversas revisões

taxonômicas, a história evolutiva dessa família ainda não foi suficientemente

explorada usando-se métodos de inferência filogenética, e a maioria das

propostas de classificação são baseadas principalmente na plumagem e

ecologia das espécies (OLSON, 1985). Análises filogenéticas baseadas em

dados morfológicos são de difícil resolução (BROWN & AMADON, 1968;

JOLLIE, 1976, 1977). Dessa forma, em muitos casos essas classificações

dificilmente refletem as verdadeiras relações filogenéticas entre as espécies

(AMARAL, 2006). A diversidade morfológica de Accipitridae tem sido

tradicionalmente representada em subgrupos de espécies similares ou

supostamente próximas, como gaviões, águias, e buteonineos (THIOLLAY,

1994).

Alguns estudos evidenciaram inclusive o polifiletismo de certos

gêneros. Dessa forma, estudos baseados no sequenciamento de quatro

genes mitocondriais sugerem o polifiletismo de Leucopternis e Buteogallus,

ambos neotropicais (AMARAL et al., 2006). Outros estudos tentam desvendar

15

a verdadeira relação entre gêneros agrupados por semelhanças

morfológicas, mas com distribuições geográficas que dificultam o

entendimento de sua biogeografia, como o caso do grupo das águias harpias,

com gêneros na América e nas Ilhas Filipinas, e do gênero Spizaetus, com

representantes neotropicais e na Malásia (HELBIG et al., 2004; LERNER &

MINDELL, 2005)

LERNER & MINDELL (2005), analisaram cerca de 50% das espécies

pertencentes à família Accipitridae através do sequenciamento de genes

mitocondriais e nucleares, e propuseram que a várias das subfamílias

reconhecidas não representam grupos monofiléticos (Fig. 03). A inclusão dos

abutres do Velho Mundo em Accipitridae foi bem apoiada nesse estudo.

1.3 FAMÍLIA CATHARTIDAE

Com suas asas poderosas, os abutres do Novo Mundo são excelentes

planadores. Exibem características morfológicas que facilmente os

distinguem dos abutres do Velho Mundo, incluídos entre os Accipitridae.

Assim, os abutres do Novo Mundo não produzem sons, e apresentam o septo

nasal perfurado. Várias espécies vivem em florestas, onde seu olfato muito

desenvolvido os auxilia na localização de carcaças (BROOKE, 1991).

Existem sete espécies atuais de Cathartidae, incluindo o raro condor

da Califórnia (Gymnogyps californianus) e o condor dos Andes (Vultur

gryphus), que são espécies muito grandes, chegando a pesar 11,5 Kg, com

uma envergadura de aproximadamente três metros. As outras cinco espécies

são: o urubu-rei (Sarcoramphus papa), que ocorre do México até a Argentina;

o urubu-preto (Coragyps atratus) e o urubu de cabeça vermelha (Cathartes

16

aura), ambos bastante comuns também na América do Norte, e duas

espécies de urubus de cabeça amarela (Cathartes melambrotus e Cathartes

burrovianus) (AMADON, 1977, FEDUCCIA, 1999).

Figura 03 – Proposta das relações filogenéticas dos diferentes gêneros de Accipitridae, de acordo com LERNER & MINDELL (2005).

17

Apesar dos abutres do Novo Mundo ainda serem incluídos na ordem

Falconiformes mesmo em algumas classificações tão recentes quanto à

década de 90 (WETMORE, 1960; CRACAFT, 1981; GRIFFITHS, 1994, entre

outras), já havia suspeitas desde 1873 de que essas espécies não seriam

abutres verdadeiros (GARROD, 1873 apud SEIBOLD & HELBIG, 1995). De

fato, HUDSON (1948) sugeriu a inclusão de Cathartidae em uma ordem

separada de outras aves de rapina, baseado em estudo dos músculos

pélvicos, e AMADON (1977) afirmou que os Cathartidae seriam muito

distintos dos abutres do Velho Mundo anatomicamente, e que suas inclusão

na ordem Falconiformes seria duvidosa.

Atualmente, apesar de algumas classificações manterem Cathartidae

dentro da ordem Falconiformes, o fato dos abutres do Novo Mundo não

serem aves de rapina encontra-se bem estabelecido (KÖNIG, 1982; SIBLEY

& AHQUIST, 1990; AVISE et al., 1994; SEIBOLD & HELBIG, 1995).

SIBLEY & AHQUIST (1990), baseados em estudos de DNA, afirmaram

que as espécies de Cathartidae encontram-se proximamente relacionados à

família Ciconiidae. De fato, juntamente com as cegonhas, os abutres do Novo

Mundo são as únicas espécies que se refrescam por uro-hidrose,

derramando seus líquidos urinários em suas patas (KAHL, 1963 apud

FEDUCCIA, 1999). Outros estudos morfológicos, como LIGON (1967) e REA

(1983), também apóiam a estreita relação filogenética entre esses dois

grupos. Entretanto, outros estudos moleculares não obtiveram o mesmo

resultado, sugerindo que Cathartidae não seria um grupo filogeneticamente

mais próximo de Ciconiidae (SLIKAS, 1997) (Fig. 04).

18

Figura 04 – Estudos baseados em sequenciamento do gene cyt-b e em distâncias de hibridização de DNA, incluindo cegonhas (família Ciconiidae) e alguns gêneros de abutres do Novo Mundo (SLIKAS, 1997).

19

1.4 CITOGENÉTICA DE AVES

Existe uma defasagem no estudo do cariótipo das Aves, quando

comparado a outros grupos, como mamíferos e peixes. Isto se deve não só

às características peculiares do cariótipo das aves e às dificuldades técnicas

delas decorrentes, mas também ao pouco investimento pessoal e financeiro

nesta área de estudo (DE OLIVEIRA & JORGE, 2000). Estima-se que apenas

10% das espécies de aves brasileiras tiveram seus cariótipos conhecidos até

a década de 90 (DE LUCCA & ROCHA, 1992). Infelizmente este percentual

ainda não sofreu alteração significativa.

A classe Aves apresenta certa variação no número de cromossomos,

porém há uma uniformidade quanto ao conteúdo de DNA nuclear, que é o

menor e mais uniforme entre os vertebrados (VENTURINI et al., 1987). De

fato, GREGORY (2002) sugere que o baixo valor C pode estar relacionado

com a diminuição do volume celular, diminuindo também seu peso corpóreo.

Os cromossomos sexuais de aves são do tipo ZZ/ZW, o que significa

que a fêmea apresenta o par sexual heteromórfico. Devido ao reduzido

tamanho do genoma das aves, a heterocromatina constitutiva, região rica em

seqüências repetitivas, está localizada principalmente no W e na região

pericentromérica dos macrocromossomos (BLOOM et al., 1993).

As duas principais características do cariótipo das Aves são: um

número diplóide elevado e a presença de muitos cromossomos de tamanho

diminuto, denominados microcromossomos (DE OLIVEIRA & JORGE, 2000).

Um cariótipo típico das aves apresenta 6 a 8 pares de macrocromossomos e

cerca de 32 pares de microcromossomos, totalizando em torno de 80

cromossomos. Entretanto, algumas espécies apresentam número reduzido

20

de cromossomos, como alguns Falconidae, nos quais o número diplóide pode

estar reduzido a 50. No galo (Gallus gallus), aproximadamente 55% do

genoma está contido nos cinco primeiros pares que constituem os

macrocromossomos, 20% nos cromossomos de 6 a 10, e os 25% restantes

nos microcromossomos (BLOOM et al.,1993).

Atualmente, estudos citogenéticos em aves tendem a uma

caracterização mais detalhada do cariótipo, com contagem exata do número

de cromossomos, localização dos genes para RNA ribossômico e uma

melhor compreensão da estrutura cromossômica. A análise citogenética tem

contribuído sobremaneira para o estabelecimento de relações evolutivas

entre vários grupos. Além disso, contribui para que se entenda o papel dos

rearranjos cromossômicos na especiação, e vem esclarecendo acerca da

diferenciação dos cromossomos sexuais e o mecanismo de determinação

sexual nas aves. De forma mais aplicada, tem auxiliado na identificação de

espécies consideradas crípticas, e possibilitando a identificação do sexo em

espécies que não apresentam dimorfismo sexual fenotípico aparente (DE

LUCCA & ROCHA, 1992).

Um número maior de espécies analisadas por técnicas de

bandeamento, tais como bandeamento G, C, NOR, permitirá a análise mais

pormenorizada dos mecanismos envolvidos na diferenciação cromossômica

nessa classe. Além disso, os dados obtidos de tais estudos poderão

contribuir para estudos filogenéticos, e os resultados somariam importantes

contribuições para o entendimento de suas relações filogenéticas (DE

OLIVEIRA et al., 2006)

21

Espécies que apresentam o cariótipo formado por um grupo de

macrocromossomos (aproximadamente 8-10 pares) e muitos pares de

microcromossomos mostram uma grande constância cariotípica, com a

maioria dos grupos sintênicos mantendo-se inalterada (Fig. 05). Esse

cariótipo básico deve ser semelhante ao cariótipo ancestral das Aves, já que

alguns répteis apresentam o cariótipo bimodal e as análises de mapeamento

gênico identificaram uma ordem semelhante àquela observada em Gallus

(RODIONOV, 1997; DERJUSHEVA et al. 2004).

1.5 DADOS DE PINTURA CROMOSSÔMICA EM AVES

As novas técnicas de citogenética molecular, como a pintura

cromossômica (”Chromosome painting”, WIENBERG et al., 1990; 1992;

JAUCH et al., 1992; STANYON et al., 1992) trouxeram um notável progresso

à citogenética comparativa. Desta forma, diferenças que não eram evidentes

por técnicas de bandeamento por incluírem segmentos muito pequenos dos

cromossomos, e a confirmação de homologias baseadas em padrões de

bandeamento podem ser observadas e analisadas a um nível de resolução

muito maior, já que na citogenética molecular as homologias são baseadas

no conteúdo gênico dos cromossomos analisados (DE OLIVEIRA, 2001).

Segundo LYSAK et al (2001), o termo pintura cromossômica, proposto

por PINKEL et al. (1988), denota a marcação in situ de regiões

cromossômicas através de sondas cromossomo-específicas (Fig. 06). Essa

metodologia foi utilizado com muito sucesso em cromossomos de mais de 40

espécies de mamíferos (FERGUSON-SMITH, 1997), em algumas aves

22

(SHETTY et al., 1999; ZIMMER et al., 1997, DE OLIVEIRA et al, 2005),

répteis (MUÈHLMANN-DIAZ et al., 2001) e insetos (FUCHS et al.,1998).

Figura 05 – O típico cariótipo das Aves inclui um pequeno número de macrocromossomos (entre oito e dez pares) e um grande número de microcromossomos, como Ara chloroptera (DE OLIVEIRA et al., 2006).

23

Figura 06 – Princípio da técnica de pintura cromossômica (uso de sondas cromossomo-específicas marcadas com fluorescência): cromossomos de uma determinada espécie são isolados e marcados com um fluorocromo ou uma molécula repóter. Ao ser hibridizado no cariótipo de outra espécie, essas sondas marcarão o segmento ou cromossomo com o qual apresenta homologia (baseado em DE OLIVEIRA, 2001).

HIBRIDIZAÇÃO

24

Poucos artigos com aplicação de sondas cromossomo-específicas em

aves foram publicados, explorando diferentes abordagens evolutivas, tais

como mecanismos de diversificação cromossômica (SHETTY et al., 1999; DE

OLIVEIRA et al., 2005), filogenia (SHIBUSAWA et al., 2004 a, b),

diferenciação dos cromossomos sexuais (GRAVES & SHETTY, 2001), e

mapeamento cromossômico (MASABANDA et al., 2004), entre outros.

Até o momento, foram utilizadas sondas de uma única espécie (Gallus

gallus) nas comparações cromossômicas entre aves. Essa espécie apresenta

o mapeamento gênico bem desenvolvido. A aplicação de sondas

cromossomo-específicas dos macrocromossomos de Gallus em emu

(Dromaius novaehollandiae), duas espécies separadas por 80 milhões de

anos, revelou apenas um rearranjo cromossômico entre as duas espécies: a

sonda específica do cromossomo GGA 4 marcou um macrocromossomo e

um microcromossomo em Dromaius (SHETTY et al. 1999). Posteriormente, o

mesmo resultado foi observado em outras espécies diferentes, como no

condor da Califórnia (Gymnogyps californianus), pombo (Columba livia),

tentilhão (Fringilla coelebs), tordo (Turdus iliacus) e três espécies de faisão

(RAUDSEPP et al. 2002, GUTTENBACH et al. 2003, DERJUSHEVA et al.

2004). Aparentemente, o cromossomo GGA 4 representaria uma condição

apomórfica originada pela fusão dos dois pares marcados pela sonda nas

outras espécies.

25

1.6 A APLICAÇÃO DOS ESTUDOS CROMOSSÔMICOS EM ANÁLISES

FILOGENÉTICAS.

A citogenética desenvolveu-se principalmente a partir da década de 50

e seu progresso acompanhou o aprimoramento de técnicas e equipamentos

de microscopia. É a ciência que estuda os constituintes celulares portadores

da informação genética (cromossomos). Compreende qualquer estudo

relativo ao cromossomo, em suas diferentes formas, tanto ao que diz respeito

à morfologia, organização, função e replicação quanto no tocante à sua

variação e evolução (SACCHET, 1999).

Cromossomos mitóticos oferecem uma oportunidade única de se

observar o genoma nuclear de forma microscópica, além de explorar seus

componentes tanto individualmente como globalmente através da análise

cariotípica. Como o cariótipo representa uma visão fenotípica do genótipo,

não é surpreendente que análises cromossômicas sejam usadas para

entendimento de relações sistemáticas e filogenéticas entre as espécies,

assim como para esclarecer sobre os possíveis mecanismos de especiação

(KOLT’SOB, 1922; GATES, 1925; LEWITSKY, 1925, 1931 apud DOBIGNY et

al., 2004). É possível detectar sinapomorfias (caracteres que são

compartilhados a partir de um ancestral comum), e identificar relações de

grupos irmãos entre os táxons (HENNIG, 1966 apud AMORIM, 2002). De

fato, rearranjos cromossômicos parecem candidatos ideais como marcadores

genéticos em investigações filogenéticas, por serem considerados

modificações genômicas raras (ROKAS & ROKND, 2000), e fornecer

caracteres cladísticos com nível de nomoplasia muito baixo (ex: MURPLY et

al., 2004; WIENBERG, 2004; DE OLIVEIRA et al., 2005).

26

Os bandeamentos cromossômicos, técnicas de coloração diferencial

desenvolvidas nas décadas de 60 – 70 expandiram os horizontes da

citogenética, e a primeira aplicação do bandeamento deu-se no pareamento

cromossômico. Essas técnicas têm possibilitado um melhor entendimento

das alterações cromossômicas que se estabelecem em cada genótipo

(GUERRA, 1988), e são agrupados dentro da citogenética clássica.

O desenvolvimento de novas metodologias em sequenciamento de

DNA, mapeamento gênico e análise cromossômica permitiram um grande

avanço na compreensão da organização, estrutura e evolução do

complemento cromossômico. As técnicas de hibridização in situ permitiram

uma ligação entre os dados moleculares de seqüências de DNA e a

citogenética, podendo ser utilizadas no mapeamento físico dessas

seqüências e na identificação e caracterização de cromossomos ou

segmentos cromossômicos (SCHWAZACHER & HESLOP-HARRISON, 2000;

DE OLIVEIRA et al., 2006)

Nos anos mais recentes, o ZOO-FISH (Pintura cromossômica

comparativa) vem sendo utilizado como um dos mais eficientes métodos para

rápida detecção de similaridades moleculares entre cromossomos de

diferentes espécies (CHOWDHARY et al, 1998; CHOWDHARY &

RAUDSEPP, 2001). Esse método é particularmente útil para transferir

informações genéticas de espécies com mapas gênicos mais desenvolvidos

para aquelas cujos mapas gênicos são pobremente conhecidos, ou

simplesmente não existem. Recentemente, a pintura cromossômica de todos

os macrocromossomos e alguns microcromossomos da galinha foi utilizada

com muito sucesso para detectar homologias entre cromossomos de

27

algumas espécies de aves (SHETTY et al, 1999; SCHMID et al, 2000;

GRÜTZNER et al, 2001; RAUDSEPP et al, 2002).

1.7 DADOS CITOGENÉTICOS DE ACCIPITRIDAE E CATHARTIDAE

As aves de rapina encontram-se entre os grupos de aves com o maior

número de espécies analisada citogeneticamente (BED’HOM, 1999,

AMARAL & JORGE, 2003) (Anexo I), devido principalmente à atraente

diversidade cariotípica observada, incomum para a maioria de ordens de

aves, que conservam um cariótipo muito semelhante entre si, sem grandes

variações no número ou fórmula cromossômica. A análise dessa variação

cromossômica poderá revelar importantes caracteres para análises

filogenéticas (DE OLIVEIRA et al., 2006).

As aves de rapina diurnas apresentam números cromossômicos

relativamente baixos, entre 50-70, e poucos pares de microcromossomos. De

fato, os cromossomos diminuem de tamanho gradativamente, deixando entre

quatro e oito pares de microcromossomos, distintos dos restantes pelo seu

tamanho diminuto (BED’HOM, 1999).

Uma grande expectativa foi criada em relação aos resultados de

pintura cromossômica em aves de rapina: as hipóteses sobre a evolução

cromossômica nesse grupo sempre evocaram a ocorrência de translocações

e fusões envolvendo principalmente os microcromossomos (DE BOER, 1976;

ANSARI & KAUL, 1986; BED’HOM, 1999). Recentemente, foram publicados

os primeiros resultados utilizando sondas cromossomo-específicas de Gallus

em experimentos de hibridização in situ no cariótipo da harpia (Harpia

harpyja) (DE OLIVEIRA et al. 2005). Como outras aves de rapina, a harpia

28

apresenta um número diplóide relativamente baixo, 2n = 58, e poucos pares

de microcromossomos. O experimento revelou uma completa reorganização

genômica na harpia, com a ocorrência de fusões, translocações e fissões

(Fig. 07). Além disso, foi mostrado que os pares cromossômicos maiores de

Gallus apresentam-se fissionados no cariótipo da harpia, originando de 2 a 5

cromossomos distintos. A sonda cromossomo-específica GGA Z marcou não

só o cromossomo Z da harpia, mas também quase a totalidade do

cromossomo W, que se apresenta normalmente de grande tamanho em

algumas aves de rapina. Esses dados mostram a ocorrência de uma drástica

reorganização genômica na harpia, que pode ser estendida para outras aves

de rapina.

Os estudos de NANDA et al. (2006) com pintura cromossômica em

abutres do Velho Mundo também revelaram extensa reorganização

cariotípica. Como observado na harpia, os cromossomos de 1 a 5 de Gallus

também hibridizaram com mais de um par de cromossomos (entre três e

cinco) nas diferentes espécies analisadas, que também apresentam um baixo

número de microcromossomos, e um número diplóide aproximado de 66.

Várias espécies de Cathartiformes tiveram seus cariótipos analisados.

A maioria dos estudos limitou-se à publicação do número diplóide e

morfologia cromossômica (TAKAGI & SASAKI, 1974; DE BOER, 1975, 1976;

WILLIAM & BENIRSCHKE, 1976 apud AMARAL & JORGE, 2003;

RAUDSEPP et al., 2003). Aparentemente, há uma grande conservação

cariotípica nessa família, com todas as espécies apresentando 2n=80, com

exceção de Cathartes aura, com 2n=76. Nada se sabe sobre a distribuição de

29

blocos heterocromáticos e regiões organizadoras de nucléolo, entre outras

características cromossômicas.

Figura 07 - Rearranjos cromossômicos no cariótipo da harpia (Harpia harpyja). Comparado com o cariótipo ancestral hipotético das aves (2n = 80), o cariótipo da harpia passou por uma grande reorganização, com a ocorrência de fusões e fissões cromossômicas envolvendo tanto os macrocromossomos como os microcromossomos. Entre os autossomos, as sondas cromossomo-específicas de Gallus gallus utilizadas na comparação corresponderiam a 10 pares de macrocromossomos e 20 pares de microcromossomos no cariótipo ancestral. Os pares GGA1-6 foram identificados individualmente. O par sexual não se encontra representado no esquema (baseado em DE OLIVEIRA et al., 2006).

30

O condor da Califórnia é uma exceção, já que o padrão de

bandeamento C e localização de 28 S R-DNA foram analisados juntamente

com estudos de pintura cromossômica (RAUDSEPP et al., 2003).

Seguindo a tendência dos estudos morfológicos e moleculares, os

estudos citogenéticos revelam uma grande diferença entre os Cathartidae e

as aves de rapina tradicionais (Falconidae e Accipitridae). Assim, os abutres

do Novo Mundo conservam o cariótipo típico da classe Aves, com números

diplóides próximos ou iguais a 80, e cerca de nove pares de

macrocromossomos (AMARAL & JORGE, 2003; RAUDSEPP et al., 2003).

Além disso, enquanto os estudos de citogenética molecular na harpia (Harpia

harpyja) (DE OLIVEIRA et al., 2005), e nos abutres do Velho Mundo (NANDA

et al., 2006), revelaram um grande número de rearranjos em relação ao

cariótipo ancestral hipotético das aves, a análise do condor da Califórnia

(Gymnogyps californianus) com a mesma metodologia revelou a retenção

aparentemente total dos grupos sintênicos do cariótipo ancestral

(RAUDSEPP et al., 2003), mostrando que os Cathartiformes parecem

apresentar um cariótipo semelhante ao padrão da maioria das aves, que

poderia ser considerado muito próximo ao cariótipo ancestral hipotético do

grupo, e assim corresponderia a uma característica plesiomórfica.

31

2. OBJETIVOS:

2.1 OBJETIVO GERAL

Os avanços no campo da citogenética, associados à escassez de

estudos cromossômicos em aves e aos problemas relacionados à filogenia

de Cathartiformes e Falconiformes nos levaram a definir, como objetivo geral,

a caracterização citogenética de algumas espécies pertencentes às ordens

Cathartidae (Cathartes aura, Cathartes burrovianus e Sarcoramphus papa) e

Accipitridae (Harpia harpyja, Spizaetus tyrannus e Leucopternis albicolis).

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Definir o número diplóide das espécies citada acima;

- Definir a morfologia cromossômica e padronizar de seus cariótipos;

- Apresentar o padrão de bandeamento G

- Definir a distribuição de blocos de heterocromatina constitutiva;

- Definir a distribuição das regiões organizadoras de nucléolo;

- Utilizar pintura cromossômica para analisar as homeologias entre

Cathartes e Gymnogyps, previamente publicado.

- Comparar os resultados obtidos entre Cathartidae e Accipitridae com

dados previamente publicados, inferindo sobre a filogenia e evolução

cromossômica.

32

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 COLETA DE AMOSTRAS

Foram coletadas amostras de diferentes espécies de aves

pertencentes às famílias Cathartidae e Accipitridae, mantidas em cativeiro no

Parque Zoobotânico do Museu Paraense Emílio Goeldi, e em criadouros

particulares, como o Criadouro Gavião Real e Crocodilo Safári (tabela I). De

cada indivíduo, foram coletados entre 1,5 mL e 2,5 mL de sangue periférico

em seringas descartáveis heparinizadas. Quando presentes foram coletados

bulbos de penas jovens, colocados em tubos de centrífuga contendo meio

Iscovi’s com uma dose extra de antibióticos. Esses procedimentos de coleta

foram acompanhados pelos médicos veterinários das instituições

responsáveis pelos animais.

Tabela I – Espécies analisadas no presente trabalho Nome Científico Nome Vulgar Sexo Material

Coletado Procedência

Cathartidae Sarcoramphus papa Urubu-rei Fêmea

Macho Pena, Sangue Pena, Sangue

MPEG MPEG

Cathartes burrovianus Urubu de cabeça amarela

Macho Sangue CGR

Cathartes aura Urubu de cabeça vermelha

Macho Pena, Sangue CGR

Accipitridae Harpia harpyja Harpia Fêmea

Macho Pena, Sangue Pena, Sangue

CGR CGR

Leucopternis albicollis Gavião Branco Fêmea Pena CGR Spizaetus tyrannus Gavião pega

macaco Fêmea Macho

Pena Pena, Sangue

CGR CGR

Legenda: MPEG = Parque Zoobotânico do Museu Paraense Emílio Goeldi; CGR= Criadouro Gavião Real

33

3.2 CULTURA DE LEUCÓCITOS

Foi utilizada a técnica clássica de cultura de leucócitos

(MOORHEAD et al.,1960), com algumas modificações:

- Após a coleta, a seringa foi deixada na posição vertical, para que

haja a separação do anel de linfócitos por precipitação.

- Com a ajuda de uma agulha nova acoplada à seringa, foi retirado

o anel de leucócitos, e as células foram cultivadas adicionando-se o material

em um frasco contendo 5mL de meio de cultura (meio RPMI, enriquecido

com soro bovino fetal, vitaminas, antibióticos e fitohemaglutinina). Os frascos

foram levemente agitados e colocados em estufa à 37ºC, durante 72 horas.

- Com 71 horas completas, os frascos foram retirados da estufa e

adicionou-se ao material, 0,1 mL de colchicina 10-6 M. Novamente os frascos

foram gentilmente agitados e levados à estufa para completar as 72 horas.

- No final desse processo, os frascos foram agitados para

desprender possíveis células que estivessem aderidas ao fundo, e o material

foi transferido para um tubo de centrífuga e centrifugado a 1000 rpm por 10

minutos. O sobrenadante foi desprezado.

- Foram adicionados 10 mL de solução de cloreto de potássio (KCl)

0,075M a 37ºC. O material foi ressuspendido utilizando pipeta Pasteur, e

deixado na estufa por mais 1 hora. Passado esse tempo, foi acrescentado 1

mL de fixador Carnoy (numa proporção de 3:1 de metanol e ácido acético,

respectivamente), ressuspendido mais uma vez e centrifugado por 10

minutos a 1000 rpm.

- O sobrenadante foi descartado, e foram acrescentados 5mL de

fixador Carnoy gelado e recém preparado. O material foi ressuspendido e

34

centrifugado por 10 minutos a 1000 rpm. Esse processo foi repetido por mais

três vezes e na última lavagem, foi adicionada quantidade de fixador

suficiente para conseguir uma diluição adequada. Depois disso o material foi

acondicionado em geladeira.

3.3 CULTURA DE FIBROBLASTOS

Foi utilizada a técnica de desagregação enzimática de polpa de

pena segundo MARTINS (1988) para cultura de fibroblastos, ambas com

modificações:

- Em uma câmara de fluxo laminar, o bulbo da pena foi colocado em

uma placa de Petri estéril e, com o auxílio de tesoura (ou bisturi) e pinça

estéreis, foi aberto para que sua polpa fosse retirada;

- O tecido limpo foi transferido para uma segunda placa de Petri,

contendo 3 mL de colagenase tipo IV, e então foi seccionado em pequenos

fragmentos.

- O material foi ressuspendido com pipeta Pasteur e incubado por 30

minutos.

- Foram adicionados 2mL de meio de cultura à temperatura ambiente

com 10% de soro de galinha.

- O material foi novamente ressuspendido, e então foi transferido para

um tubo de centrífuga, sendo centrifugado por 10 minutos, à 800rpm.

- Após ser centrifugado, o sobrenadante foi desprezado, e foram

adicionados ao tubo 5mL de meio completo (contendo 10% de soro de

galinha, 1% de antibióticos, 0,5% de fungizona e 1% de L-glutamina) para

35

que o material pudesse ser ressuspendido novamente e transferido para uma

garrafa de cultura (Corning 25 cm²).

- A garrafa foi incubada a uma temperatura de 37 a 40°C, dando início

desta maneira à cultura primária.

- Por um período de 48 horas, esse material não foi manipulado para

que ocorresse uma perfeita adesão das células à superfície da garrafa

banhada pelo meio.

- Após esse tempo foi realizada uma lavagem da cultura com 2mL de

Versene (Gibco), e foram adicionados 5mL de meio à cultura, e a mesma foi

observada diariamente para que fossem tomadas as medidas apropriadas

referentes à troca de meio e repique.

3.4 PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS

Antes de sua utilização, as lâminas foram rigorosamente lavadas

com detergente neutro, colocadas em um recipiente com água destilada e

guardadas na geladeira.

- No momento de serem utilizadas, as lâminas foram retiradas do

recipiente contendo álcool, e secas com lenço de papel.

- A lâmina foi deixada por alguns minutos em uma caixa de

alumínio em banho-maria a aproximadamente 50ºC

- A suspensão cromossômica condicionada em tubo de centrífuga

foi devidamente ressuspendido com pipeta Pasteur e com uma micropipeta,

20µL desse material foram gotejados na lâmina.

- Após alguns minutos, a lâmina foi retirada da caixa, e levada para

estufa para envelhecimento ou corada para análise.

36

3.5 TÉCNICAS DE COLORAÇÃO E BANDEAMENTOS CROMOSSÔMICOS

Coloração Convencional

É normalmente utilizada para localização de metáfases, análise do

número e morfologia dos cromossomos. Para esse tipo de análise, o material

citológico foi corado com Eosina Azul de Metileno, segundo Giemsa (Merck).

- 1,5 mL de corante foi diluído em 28 mL de tampão fosfato pH 6,8,

obtendo-se assim uma solução a 5%. A solução foi despejada sobre a

lâmina, permanecendo por 10 minutos.

- Logo depois a lâmina foi lavada com água destilada, e secada à

temperatura ambiente.

Técnica de Bandeamento G

O bandeamento G é utilizado para identificação individual e

dedução de homeologias cromossômicas. Utilizou-se a técnica segundo

SEABRIGHT (1971) com modificações:

- Uma solução de Tripsina 0,05% foi preparada;

- Depois de envelhecida em estufa a 37°C por 2 a 3 dias, a lâmina

foi mergulhada na solução de tripsina por 5 segundos;

- A lâmina foi lavada com água destilada gelada (para cortar a ação

da tripsina), e secou à temperatura ambiente.

- Logo depois a lâmina foi corada com Giemsa a 5% por 10

minutos.

37

Técnica de Bandeamento C

Essa técnica tem como objetivo identificar as regiões

cromossômicas ricas em heterocromatina constitutiva, compostas por DNA

altamente repetitivo e que replicam tardiamente na fase S. Para evidenciar

essas regiões, foi utilizada a técnica descrita por SUMNER (1972), com

modificações:

- A lâmina previamente envelhecida foi incubada por 15 minutos

em uma solução de ácido clorídrico (HCl) 0,1N à temperatura ambiente, e

depois lavada em água destilada.

- Depois de secar o excesso de água, a lâmina foi incubada por 2

minutos em solução de hidróxido de bário (Ba(OH)2) a 4%, à 47ºC;

- Logo depois a lâmina foi mergulhada em ácido clorídrico (HCl)

0,1N à temperatura ambiente para neutralizar a ação do hidróxido de bário, e

lavada imediatamente com água destilada.

- Após isso, a lâmina foi incubada em solução salina 2X

concentrada (2XSSC) à 60º C por 30 minutos e lavada com água destilada.

- Finalmente, depois de secar a temperatura ambiente, a lâmina foi

corada com Giemsa a 5% por 20 minutos e analisada ao microscópio.

3.6 TÉCNICAS DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU COM FLUORESCÊNCIA (FISH)

Dois tipos distintos de sondas foram utilizados. As sondas

cromossomo-específicas de Gallus gallus, obtidas por citometria de fluxo

foram cedidas pelo FISH Laboratory, Veterinary School, University of

38

Cambridge. Já as sondas de 18S/28S DNAr humano foram gentilmente

cedidas pelo Dr. Vladimir Trifonov.

3.6.1 Hibridação fluorescente in situ (FISH) com sonda de DNAr 18S/28S

Preparação e marcação da sonda de rDNA

As sondas de DNA ribossômico humano (18S e 28S) foram

marcadas com biotina pela técnica de Nick Translation, utilizando-se o kit

“Nick Translation” da Gibco, segundo as especificações do fabricante, e

mantidas em freezer até o momento do uso.

Preparação das lâminas

As lâminas foram preparadas como no item 3.4, e imediatamente

após sua secagem, foram observadas ao microscópio com contraste de fase,

para avaliação de sua qualidade. Constatada uma boa qualidade, as lâminas

com as preparações cromossômicas foram tratadas com RNAse e

desidratadas, seguindo as etapas abaixo:

- As lâminas foram incubadas com uma solução de RNase diluída

em 4xSSC/T (100 µg/ml) por 20 minutos, a 37ºC.

- Após esse período, as lâminas foram incubadas em 2xSSC por 5

minutos, por duas vezes.

- As lâminas foram então desidratadas em uma série de etanois a

70% (2x), 90% (2x) e 100%, 5 minutos em cada banho.

- Depois disso, as lâminas foram incubadas por duas horas em

estufa a 65ºC.

39

3.6.2 Hibridação fluorescente in situ (FISH) com sonda cromossomo-

específicas de Gallus gallus

Preparação e marcação da sonda

As sondas cromossomo-específicas de Gallus gallus,

correspondentes aos pares 1 a 7 e o cromossomo Z, obtidas por citometria

de fluxo, foram amplificadas e marcadas por DOP-PCR. Utilizamos duas

marcações específicas: biotina e fluorosceína.

Preparação das lâminas

As lâminas foram preparadas como no item 3.4, e imediatamente

após sua secagem, foram observadas ao microscópio com contraste de fase,

para avaliação de sua qualidade. Constatada uma boa qualidade, as lâminas

com as preparações cromossômicas seguiram para desidratação na série de

etanóis e incubadas a 65ºC por duas horas, como descrito anteriormente.

3.6.3 Desnaturação das Sondas de DNA e dos Cromossomos

Metafásicos

Antes de sua utilização, as sondas foram adicionadas à solução de

hibridização, em uma proporção de 1 µL de sondas para 14 µL de solução,

em um tubo de microcentrífuga. Seguiu-se a desnaturação das sondas,

mantendo o tubo a 75ºC por 10 minutos e imediatamente utilizada. No caso

das sondas cromossomo-específicos, o material permaneceu a a 75ºC por 10

minutos, a preparação foi mantida a 37ºC por 30 minutos antes do uso,

permitindo assim que as seqüências repetitivas de DNA se reassociem.

40

Da mesma forma, as lâminas seguiram para o processo de

desnaturação dos cromossomos metafásicos, seguindo os seguintes passos:

- As lâminas foram incubadas por 90 segundos em formamida

70%/2xSSC a 73ºC.

- Imediatamente após a desnaturação, as lâminas foram

mergulhadas em etanol a 70%, gelado, e incubadas por 4 minutos.

- As lâminas foram desidratadas em uma série de etanois a 70%

(x), 90% (2x) e 100%, 2 minutos em cada banho.

3.6.4 Hibridação e detecção dos sinais correspondentes

Após as sondas serem denaturada, em solução de

hibridização, foram aplicados 15 µL de solução de hibridização contendo as

sondas, de acordo com os passos a seguir:

- Foram aplicados, sobre as lâminas, cerca de 15 µl da solução de

hibridação;

- As lâminas foram incubadas em câmara úmida a 37ºC “overnight”

no caso das sondas de rDNA, e por 72 horas no caso das sondas

cromossomo-específicas.

- Seguiu-se com a lavagem de estringência, incubando-se as

lâminas com solução de formamida 50% em 2xSSC pH 7,0 por 5 minutos, a

42ºC, duas vezes;

- As lâminas foram lavadas com 2xSSC a 42ºC, por 5 minutos;

- Cerca de 200 µl de solução de detecção foram colocados sobre

cada lâmina, e procedeu-se com a incubação das mesmas por 20 minutos, a

37 ºC.

41

- Depois disso, as lâminas foram lavadas por três vezes com

4xSST a 38 ºC, 5 minutos cada.

- Após escorrer o excesso de 4xSST, colocou-se cada lâmina

sobre uma lamínula contendo duas gostas de meio de montagem (antifade e

DAPI).

- O excesso de meio de montagem foi retirado em um bloco de

papel filtro, e a lamínula foi selada com o uso de esmalte incolor.

3.7 ANÁLISE CARIOTÍPICA

Citogenética Clássica

Todas as preparações cromossômicas (coloração convencional e

bandeamentos G, C e NOR) foram analisadas em microscópio óptico Zeiss

Axiostar com objetiva de imersão com 100 vezes de aumento e ocular com

20 vezes de aumento. As localizações das melhores metáfases foram

registradas em uma lâmina branca, para posterior captura em sistema digital.

De cada animal, pelo menos 20 metáfases em coloração convencional

completas foram utilizadas para a definição do número diplóide e morfologia

cromossômica.

Experimentos de FISH e Captura de Imagens

As lâminas com coloração fluorescente foram analisadas em

fotomicroscópio de fluorescência Zeiss Axiophot II, com objetiva de 100x e

ocular com aumento de 10x. O optovar foi de 1,6, e os filtros utilizados foram

Zeiss BP 436, FT 460 e LP 470.

42

As imagens das preparações foram capturadas digitalmente com o

auxílio de câmera Zeiss AxioCam MRm por meio do programa AxioVision 3.1

(controlador da câmera de vídeo e de captura digital de imagens). No caso da

preparação com fluorescência, foi feita uma pseudocoloração das imagens

no próprio programa AxioVision. Na edição final das imagens, utilizamos o

programa Adobe Photoshop 7.1.

3.8 ORGANIZAÇÃO DO CARIÓTIPO

Para montagem dos cariótipos, foi usado o programa Adobe

Photoshop 7.1. Com o auxílio desse programa, os cromossomos foram

“recortados” e organizados aos pares, em ordem decrescente de tamanho,

de acordo com a proposta de LADJALI – MOHAMMEDI et al. (1999) para o

sistema internacional de padronização de cariótipos de aves. A determinação

do comprimento relativo dos braços (maior ou menor) foi feita com o auxílio

do programa Adobe Photoshop 7.1. Os valores médios de cada par foram

calculados para poder determinar a relação de braços (RB). Para o cálculo de

NF os cromossomos metacêntricos (M), submetacêntricos (SM) e

subtelocêntricos (ST) foram considerados com dois braços, enquanto que os

acrocêntricos (A) constituídos por um único braço.

A identificação cromossômica foi feita seguindo a nomenclatura

proposta por LEVAN et al.(1964), onde os tipos cromossômicos são:

METACÊNTRICOS (M)................................RB = 1,00 - 1,70

SUBMETACÊNTRICOS (SM)......................RB = 1,71 - 3,00

SUBTELOCÊNTRICOS (ST).......................RB = 3,01 – 7,00

ACROCÊNTRICOS (A)................................RB = maior que 7,0

43

4. RESULTADOS

4.1. O CARIÓTIPO DAS ESPÉCIES DE CATHARTIDAE

As espécies de abutres do Novo Mundo analisadas no presente

trabalho apresentaram constituições cariotípicas bastante semelhantes, com

o mesmo número cromossômico. Entretanto, diferenças foram observadas na

distribuição e quantidade de blocos heterocromáticos.

Sarcoramphus papa

Foram analisados dois exemplares de urubu-rei (S. papa), um

macho e uma fêmea, que apresentaram 2n=80 e NF=90. Convencionou-se

classificar os dez primeiros pares como macrocromossomos, por

apresentarem-se bem diferenciados dos restantes pares, que por sua vez

apresentaram-se bastante homogêneos quanto à forma e tamanho. O par

sexual encontra-se formado por um cromossomo Z submetacêntrico, com

tamanho próximo ao do quarto par, e um cromossomo W metacêntrico, com

tamanho próximo ao do nono par (fig. 08A). O idiograma referente aos dez

primeiros pares mais o par sexual está representado na figura 08B, com a

sua respectiva classificação morfológica.

Na figura 09 apresentamos o padrão de bandeamento G dos pares

de 1 a 10 e do par sexual. Na foto da metáfase, observa-se que os menores

pares apresentados não mostraram um padrão definido, devido ao seu

pequeno tamanho.

44

O bandeamento C revelou blocos heterocromáticos na região

pericentromérica de todos os cromossomos, porém com tamanhos diferentes,

sendo mais extensos nos pares 1, 2, 3 e no cromossomo W (fig.10).

Figura 08 – A: Cariótipo do urubu rei (Sarcoramphus papa) em coloração convencional, com 2n=80 e NF=90; B: Idiograma representando os pares de macrocromossomos de S. papa, mais o par sexual (Legenda: m=metacêntrico; sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico; a=acrocêntrico)

45

Figura 09 – Padrão de bandeamento G dos pares de 1 a 20 do urubu rei (Sarcoramphus papa).

Figura 10 – Padrão de bandeamento C de Sarcoramphus papa. O cromossomo W apresenta-se indicado.

46

Cathartes aura

O exemplar de urubu de cabeça vermelha (Cathartes aura)

analisado, uma fêmea, apresentou 2n=80 e NF=90. Os dez primeiro pares

foram considerados macrocromossomos, por se apresentarem distintos dos

demais pares, que tinham tamanho menor e uniforme. O par 8 apresentou-se

heteromórfico em todas as metáfases analisadas. O par sexual encontra-se

formado por dois cromossomos Z submetacêntricos, com tamanho próximo

ao do quarto par (fig. 11A). O idiograma referente aos dez primeiros pares

mais o par sexual está representado na figura 11B, com a indicação de sua

classificação morfológica.

Pelo padrão de bandeamento G, foi possível identificar os

homólogos dos maiores pares. Entretanto, os menores pares não

apresentaram um padrão distinto que permitisse sua identificação (fig. 12).

Blocos de heterocromatina foram observados na região

pericentromérica de todos os cromossomos, inclusive microcromossomos.

Além disso, grandes blocos de heterocromatina constitutiva foram revelados

nos cromossomos de C. aura, nos pares 6 e 8. Observa-se um bloco de

heterocromatina constitutiva na região terminal do braço longo em apenas um

dos cromossomos do par 8 (fig. 13).

47

Figura 11 – A: Cariótipo do urubu de cabeça vermelha (Cathartes aura) em coloração convencional, com 2n=80 e NF=90; B: Idiograma representando os pares de macrocromossomos e o par sexual (Legenda: m=metacêntrico; sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico; a=acrocêntrico).

48

Figura 12 – Padrão de bandeamento G dos pares de 1 a 10 do urubu de cabeça vermelha (Cathartes aura).

Figura 13 – Padrão de bandeamento C de Cathartes aura. O par 8, heteromórfico, apresenta-se indicado.

49

Cathartes burrovianus

O urubu de cabeça amarela (Cathartes burrovianus) analisado

neste trabalho, uma fêmea, apresentou o mesmo número diplóide das

espécies anteriores, com 2n=80 e NA= 92. Seu cariótipo em coloração

convencional é mostrado na figura 14A, juntamente com o idiograma dos dez

primeiros pares mais o par sexual na figura 14B. O par sexual é composto

por um cromossomo Z submetacêntrico, com tamanho aproximado entre o

terceiro e quarto pares, e um cromossomo W metacêntrico, com tamanho

aproximado do nono par.

Como seu cariótipo apresenta um grande número de

microcromossomos, o bandeamento G produziu um padrão identificável

apenas nos maiores pares, permitindo a identificação dos homólogos (fig.

15). A técnica de bandeamento C revelou blocos heterocromáticos

pericentroméricos em todos os cromossomos do complemento. Além disso,

observou-se um bloco heterocromático na região terminal do braço longo do

par 6, e um bloco extenso no cromossomo W (fig. 16).

4.2 O CARIÓTIPO DAS ESPÉCIES DE ACCIPITRIDAE

Foram analisadas três espécies da família Accipitridae. Uma

grande diversidade cromossômica foi observada entre as espécies essas

espécies, com números diplóides variando de 2n=58, na harpia (Harpia

harpyja), a 2n=68, no gavião pega macaco (Spizaetus tyrannus) A

distribuição de heterocromatina constitutiva também mostrou variação em

sua distribuição e quantidade.

50

Figura 14 – A: Cariótipo do urubu de cabeça amarela (Cathartes burrovianus) em coloração convencional, com 2n=80 e NF=90; B: Idiograma representando os pares de macrocromossomos e o par sexual (Legenda: m=metacêntrico; sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico; a=acrocêntrico).

51

Figura 15 – Padrão de bandeamento G dos pares de 1 a 10 do urubu de cabeça amarela (Cathartes burrovianus).

W

52

Figura 16 – Padrão de bandeamento C de Cathartes burrovianus. O cromossomo W apresenta-se indicado.

Harpia harpyja

Dois exemplares foram analisados, e a morfologia cromossômica

confirmou o sexo dos animais: um macho e uma fêmea. O número diplóide

foi igual a 58, e o NF=102. Apenas os pares 20, 25, 26, 27 e 28 são

acrocêntricos. Os cromossomos apresentaram uma diminuição gradual de

tamanho. Os quatro últimos pares, puntiformes, podem ser classificados

como microcromossomos. O Z apresentou-se metacêntrico, com tamanho

equivalente ao primeiro par, e o W submetacêntrico, menor, correspondendo

a aproximadamente um terço do tamanho do Z. O par 8 mostrou-se

heteromórfico na fêmea, e no elemento maior observa-se uma constrição

secundária evidente (fig. 17A). O idiograma da figura 17B representa todos

os cromossomos da harpia (Harpia harpyja).

O bandeamento G é mostrado na figura 18, e a maioria dos pares

apresentou um padrão distinto que permitiu a identificação dos homólogos,

principalmente nos pares de maior tamanho. Porém alguns pares médios e

pequenos, com morfologia semelhante, revelaram padrões pouco

informativos, dificultando sua correta identificação.

Os blocos heterocromáticos apresentaram-se distribuídos somente

na região pericentromérica de todos os cromossomos. Entretanto, alguns

pares médios metacêntricos apresentaram blocos menos conspícuos. Um par

de acrocêntricos, provavelmente par 20, revelou um bloco heterocromático no

braço longo. Além disso, o cromossomo W apresentou-se parcialmente

heterocromático, sendo banda-C positivo no braço curto e em parte do braço

longo (fig. 19).

53

Figura 17 – A: Cariótipo da harpia (Harpia harpyja) em coloração convencional, com 2n=58 e NF=102; B: Idiograma representando o cariótipo dessa espécie (Legenda: m=metacêntrico; sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico; a=acrocêntrico).

A

B

54

Figura 18 – Padrão de bandeamento G de Harpia (Harpia harpyja), fêmea.

55

Figura 19 – Padrão de bandeamento C de Harpia harpyja. O cromossomo W apresenta-se indicado.

Spizaetus tyrannus

O gavião pega macaco (Spizaetus tyrannus) apresentou 2n=68 e

NF=108. Seu cariótipo, típico de Accipitridae, mostrou uma variação gradual

do tamanho dos pares cromossômicos. Os seis menores pares poderiam ser

classificados como microcromossomos. O cromossomo Z, submetacêntrico,

apresentou um tamanho próximo ao do quinto par. Já o cromossomo W

apresentou-se metacêntrico, com tamanho aproximado ao do décimo sexto

par. A constrição secundária apresentou-se evidente no par 25 (fig. 20A). O

idiograma representativo do cariótipo dessa espécie é mostrado na figura

20B.

Mostramos o padrão de bandeamento G na figura 21, onde se

percebe uma melhor definição nos pares de maior tamanho, que diminui

proporcionalmente com o tamanho dos cromossomos.

56

Figura 20 – A: Cariótipo do gavião pega macaco (Spizaetus tyrannus) em coloração convencional, com 2n=68 e NF=108; B: Idiograma representando o cariótipo dessa espécie (Legenda: m=metacêntrico; sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico; a=acrocêntrico).

A

B

57

Figura 21 – Padrão de bandeamento G do gavião pega macaco (Spyzaetus tyrannus), fêmea.

58

Dois pares de microcromossomos e um par metacêntrico médio,

provavelmente correspondendo ao par 8, apresentaram a região

pericentromérica claramente marcada, assim como a região pericentromérica

e terminal do braço longo de um par médio de cromossomos acrocêntricos,

enquanto outros blocos coraram-se de maneira mais pálida. O cromossomo

W apresentou o braço curto heterocromático (fig.22).

Figura 22 – Padrão de bandeamento C de Spizaetus tyrannus. O cromossomo W apresenta-se indicado.

W

59

Leucopternis albicollis

O gavião branco (Leucopternis albicollis) analisado, fêmea,

mostrou um complemento cromossômico com 2n=66 e NF=104. O cariótipo

apresentou cromossomos diminuindo gradativamente de tamanho e poucos

cromossomos puntiformes, com um Z submetacêntrico, com tamanho

próximo aos pares 3 e 4, e o W submetacêntrico, menor, com um tamanho

próximo ao par 16. No par 9, observa-se uma constrição secundária (fig.

23A). Na figura 23B mostramos o idiograma representativo, contendo todos

os pares cromossômicos da espécie.

O bandeamento G permitiu a identificação dos pares homólogos,

sendo essa identificação mais exata nos primeiros pares, de maior tamanho.

Não se observou padrões de bandeamento G nos menores pares (fig. 24).

A aplicação da técnica de bandeamento C revelou blocos

heterocromáticos apenas na região pericentromérica dos pares 1, 2 e 3, de

dois pares acrocêntricos (provavelmente pares 22 e 24), e em um três pares

de microcrossomos. Além desses, um par acrocêntrico, provavelmente par 27

ou 28, apresentou-se heterocromático. O cromossomo W apresentou um

extenso bloco que se estendeu por grande parte do seu comprimento total

(fig. 23).

60

Figura 23 – A: Cariótipo do gavião branco (Leucopternis albicollis) em coloração convencional, com 2n=66 e NF=104; B: Idiograma representando o cariótipo dessa espécie (Legenda: m=metacêntrico; sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico; a=acrocêntrico).

A

B

61

Figura 24 – Padrão de bandeamento G do gavião branco (Leucopternis albicollis), fêmea.

62

Figura 25 – Padrão de bandeamento C de Leucopternis albicollis. O cromossomo W apresenta-se indicado.

4.3 EXPERIMENTOS DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU

4.3.1 HIBRIDIZAÇÕES COM 18S/28S R-DNA

Família Cathartidae

As três espécies de abutres do Novo Mundo analisadas no

presente trabalho mostraram apenas um cromossomo marcado pelas sondas

de 18S/28S r-DNA. Em todas elas, um pequeno par de cromossomos

apresentou sinais de hibridização. Em Sarcoramphus papa o par marcado

correspondeu ao tamanho aproximado entre os pares 8-10, acrocêntrico (fig.

26A, B). Um resultado semelhante foi observado em Cathartes burrovianus

(fig. 26C, D) e em Cathartes aura (fig 26E, F).

W

63

Figura 26 – Hibridizações com sondas 18S/28S R-DNA em Cathartidae. A, C e E mostram sinal da sonda em amarelo, e o contra-corante DAPI em azul. B, D e F mostram padrão de DAPI invertido. O cromossomo W está indicado no caso das fêmeas. A e B: Sarcoramphus papa; C e D: Cathartes aura; E e F: Cathartes burrovianus.

64

Família Accipitridae

Os resultados dos experimentos de hibridização de sondas de

18S/28S r-DNA foram bastante variados nas espécies da família Accipitridae.

Harpia harpyja apresentou dois pares com sinais de hibridização, sendo um

par subtelocêntrico e heteromórfico (par 8) e o outro um par pequeno,

acrocêntrico, provavelmente par 25 (fig. 27A, B). A marcação no par 8,

heteromórfico no indivíduo analisado, concordou com a localização da

constrição secundária.

Spizaetus tyrannus e Leucopternis albicolis apresentaram apenas

um par marcado. Entretanto, enquanto o par portador da NOR apresentou-se

pequeno e acrocêntrico em S. tyrannus. O par marcado corresponde

provavelmente ao par 25, que apresentou uma evidente constrição

secundária. Da mesma forma, no indivíduo analisado por essa técnica, o par

apresentou-se visivelmente heteromórfico, fato também evidente pelo

tamanho do sinal da sonda, bem maior em um dos homólogos (fig. 27C, D)

Em L. albicolis, observamos apenas um par marcado, como na

espécie anterior. Porém, o mesmo correspondeu a um par submetacêntrico

grande, correspondente ao par 9. A marcação concordou com a constrição

secundária observada em coloração convencional. (fig. 27E, F).

65

Figura 27 – Hibridizações com sondas 18S/28S R-DNA em Accipitridae. A, C e E mostram sinal da sonda em amarelo, e o contra-corante DAPI em azul. B, D e F mostram padrão de DAPI invertido. A e B: Harpia harpyja; C e D: Spizaetus tyrannus; E e F: Leucopternis albicollis.

4.3.2 HIBRIDIZAÇÕES COM SONDAS CROMOSSOMO-ESPECÍFICAS DE

Gallus gallus

66

Os experimentos de hibridização in situ com sondas cromossomo

específicas de Gallus gallus foram realizados apenas na espécie Catharte

aura.

Com exceção do par 4, todas as sondas utilizadas marcaram apenas um

cromossomo de C. aura cada. A sonda GGA 4 marcou um par de

macrocromossomos e um par de microcromossomos. As figuras 28 e 29

ilustram o resultado dos experimentos de hibridização in situ com as sondas

de Gallus gallus correspondentes aos cromossomos de 1 a 7 e o

cromossomo Z.

Figura 28 – Resultado da hibridização de sondas cromossomo-específicas de Gallus gallus (cromossomos 1 a 4) em metáfases de Cathartes aura. O sinal das sondas é mostrado em amarelo, e o contracorante DAPI em azul.

67

Figura 29 – Resultado da hibridização de sondas cromossomo-específicas de Gallus gallus (cromossomos 5 a Z) em metáfases de Cathartes aura. O sinal das sondas é mostrado em amarelo, e o contracorante DAPI em azul.

Figura 29 – Mapeamento dos cromossomos de Gallus gallus (à direita dos cromossomos) no cariótipo de Cathartes aura.

68

5. DISCUSSÃO

5.1 SISTEMA INTERNACIONAL PARA PADRONIZAÇÃO DO CARIÓTIPO

DE AVES

Com o desenvolvimento do mapa genético molecular de Gallus gallus,

vários encontros na década de 80 e 90, com o objetivo de se padronizar a

organização de cariótipos de aves, facilitando assim futuras comparações.

Na década de 80, em resposta às sugestões feitas no IV Colóquio

Europeu de Citogenética de Animais Domésticos, um grupo de

citogeneticistas especializados em Aves concordou que os cromossomos de

aves deveriam ser numerados e organizados no idiograma de acordo com o

tamanho, decrescente. Os cromossomos sexuais (Z e W) seriam o par

terminal. A nomenclatura de rearranjos heteromórficos seguiria as

recomendações da ISCN (1978), assim como a definição e nomenclatura das

bandas longitudinais (Q, G e R) (LADJALI-MOHAMMEDI, 1999).

No início da década de 90, novos encontros tiveram como principal

objetivo reforçar o uso das normas propostas para publicação e organização

do cariótipo de aves. Assim, LADJALI-MOHAMMEDI et al. (1999) publicaram

o Sistema Internacional para Padronização do Cariótipo de Aves

(International System for Standardized Avial Karyotypes – ISAAK), que

seguiam as normas propostas na década de 80, adicionando a descrição do

padrão de bandas de cada par de macrocromossomos de Gallus gallus.

A análise de cariótipos de aves previamente publicados mostra que os

cariótipos bimodais, ou seja, formados por macro e microcromossomos, são

normalmente ordenados de acordo com as normas da ISAAK. Entretanto, os

69

cariótipos de aves de rapina (Accipitridae e Falconidae) tendem a ser

ordenados com base no tamanho decrescente e posição do centrômero,

iniciando com os cromossomos de dois braços, e o segundo grupo iniciando

com o maior acrocêntrico/telocêntrico (ANSARI & KAUL, 1986; BED’HOM et

al., 1998, 2003; BED’HOM, 1999; NANDA et al., 2006). Porém, a

padronização proposta pelo ISAAK foi utilizada por DE OLIVEIRA et al.

(2005), na análise do cariótipo de Harpia harpyja.

Tendo em vista essa controvérsia, e na ausência de outras

publicações que discutam a padronização do cariótipo de aves, com exceção

das citadas anteriormente, decidiu-se utilizar a proposta da ISAAK para todas

as espécies analisadas no presente trabalho. Salienta-se que nesse trabalho

incluímos espécies com cariótipo bimodal (Cathartidae) e gradual

(Accipitridae). O uso de dois padrões diferentes na organização dos

cariótipos tornaria mais difícil sua comparação e análise.

5.2 O COMPLEMENTO CROMOSSÔMICO DAS ESPÉCIES DA FAMÍLIA

CATHARTIDAE

Das sete espécies da família Cathartidae, cinco já tiveram seus

cariótipos analisados, pelo menos com o número diplóide determinado.

Apenas o urubu da mata (Cathartes melambrotus) e o urubu de cabeça

amarela (Cathartes burrovianus) não apresentam dados citogenéticos

publicados até o momento.

As três espécies aqui analisadas mostraram complementos

cromossômicos muito semelhantes, com uniformidade no número de

cromossomos e de braços. Cathartes burrovianus, espécie cujo cariótipo foi

70

analisado pela primeira vez, mostrou seguir a tendência de outros

congêneres, apresentando 2n=80. Apesar do número de cromossomos de

Cathartes aura ter sido anteriormente determinado como 2n=76 (WILLIAM &

BENIRSHKE, 1976), nossos dados mostraram que essa espécie apresenta

2n=80, mesmo número encontrado nas outras espécies da família.

Uma das principais causas da dificuldade em se determinar o número

diplóide nos abutres do Novo Mundo pode ser atribuída à sua organização

genômica: como a maioria das aves analisadas até o momento, os

Cathartidae mostraram cariótipos formados por dez pares de

macrocromossomos e um grande número de microcromossomos.

De fato, o cariótipo de Cathartidae pode ser classificado como uma

característica plesiomórfica, ou seja, um caráter que se encontra em um

estado ancestral, não derivado. Ao se comparar as espécies aqui analisadas

com outras previamente publicadas, observa-se que a morfologia

cromossômica é muito conservada, com os pares apresentando os mesmos

índices centroméricos. Os primeiros pares, de 1 a 5, apresentaram-se

metacêntricos, submetacêntricos ou subtelocêntricos, assim como o par 9,

metacêntrico, em todos os Cathartidae analisados.

Os blocos de heterocromatina apresentaram uma certa variação tanto

em tamanho como em localização. Além disso, em alguns casos, houve a

ausência de blocos heterocromáticos em certos pares. No caso do

Gymnogyps californianus, o par 3 não apresentou nenhum bloco

heterocromático revelado pelo bandeamento C (RAUDSEPP et al., 2002).

Dentre as espécies analisadas, C. aura e C. burrovianus apresentaram os

cariótipos mais diferenciados, por apresentarem, além de marcações na

71

região pericentromérica de todos os cromossomos, um grande bloco

heterocromático no par 6, na região distal do braço longo. Em C. aura, a

presença de um bloco heterocromático na mesma posição em um dos

cromossomos do par 8, causou um heteromorfismo observado em coloração

convencional. Sarcoramphus papa apresentou marcações somente na região

pericentromérica dos cromossomos, com exceção do cromossomo W, que

apresentou-se heterocromático na maior parte de seu comprimento. O

mesmo foi observado no Gymnogyps californianus (RAUDSEPP et al., 2002).

A presença de extensos blocos heterocromáticos no cromossomo W em aves

é um fato comum, inclusive em espécies com o par sexual monomórfico (DE

OLIVEIRA et al., 2006). A comparação com dados previamente publicados

indica que o cariótipo de Cathartes apresenta certa semelhança com o de

Coragyps atratus, que tem blocos heterocromáticos conspícuos em um par

de cromossomos acrocêntricos (CORNELIO et al., 2001)

Os experimentos de hibridização in situ confirmaram a constância

cromossômica e manutenção dos grupos sintênicos entre os abutres do Novo

Mundo. A utilização de sondas 18S/28S r-DNA marcou um único par de

microcromossomos nas três espécies de Cathartidae analisadas. Um

resultado similar foi observado no condor da Califórnia (Gymnogyps

californianus) (RAUDSEPP et al., 2002). A localização da região

organizadora de nucléolos (NOR) em um par de microcromossomos também

parece ser uma característica ancestral em aves. Segundo LADJALI-

MOHAMMEDI et al. (1999), em Gallus gallus convencionou-se que o par 16

corresponde aos microcromossomos portadores da NOR. Tal convenção

72

caberia bem na família Cathartidae, já que o par portador da NOR

assemelha-se em tamanho com o observado em G. gallus.

Com exceção da sonda GGA 4, as sondas cromossomo-específicas

correspondentes aos sete primeiros pares e o cromossomo Z de G. gallus

hibridizaram em um único par cada uma. Isso indica uma total conservação

desses grupos sintênicos entre essas duas espécies. Resultados

semelhantes, incluindo a hibridização de dois pares pela sonda GGA4, foram

obtidos em Gymnogyps californianus e em outras aves pertencentes a ordens

diferentes, como em Anseriformes, Strigiformes, Columbiformes e

Strutioniformes (GUTTENBACH et al., 2003). A conservação desses grupos

sintênicos foi comprovada entre Gallus e uma espécie de tartaruga,

Pelodiscus sinensis, com o uso de BACs (MATSUDA et al., 2005),

confirmando seu estado ancestral. No caso dos Cathartidae, a identificação

dos pares hibridizados pela sonda GGA4 foi facilitado pela morfologia desses

cromossomos, correspondendo ao par 4 (submetacêntrico) e ao par 9

(metacêntrico) de Cathartes aura, assim como em Gymnogyps californianus

(RAUDSEPP et al., 2002).

Os dados obtidos até o momento indicam que a diferenciação

cariotípica entre as espécies de Cathartidae relaciona-se somente à

quantidade e distribuição dos blocos heterocromáticos, sem modificações no

número diplóide, número de braços ou cromossomos portadores de regiões

organizadoras de nucléolo. Talvez a aplicação de sondas loco-específicas ou

BACs possam revelar rearranjos intracromossômicos não revelados pelas

técnicas já empregadas.

73

5.3 O COMPLEMENTO CROMOSSÔMICO DAS ESPÉCIES DA FAMÍLIA

ACCIPITRIDAE

Vários autores descrevem o cariótipo das espécies pertencentes à

família Accipitridae como atípicos, quando comparados a outros grupos de

aves (ANSARI & KAUL, 1986; BED’HOM, 1999; BED’HOM et al., 2001;

AMARAL & JORGE, 2003; DE OLIVEIRA et al., 2005, 2006). Essa

denominação vem da organização peculiar do cariótipo dessas espécies que,

ao invés de se apresentar formado por alguns pares de macrocromossomos

e um grande número de microcromossomos, inclui cromossomos que

diminuem gradualmente de tamanho, e apenas os últimos pares que

correspondem a uma pequena parte do total de cromossomos, são

microcromossomos puntiformes.

As três espécies analisadas não fugiram a essa regra. Os números

diplóides variaram de 58 a 68, podendo ser considerados relativamente

baixos quando comparados com valores próximos a 80, encontrados na

maioria das espécies de aves analisadas (DE LUCCA, 1992).

O gavião real ou harpia (Harpia harpyja) apresentou 2n=58. Esse

número é concordante com publicações prévias (HOFFMANN et al, 1976; DE

OLIVEIRA et al., 2005) e se encontra entre os mais baixos reportados e aves

de rapina. De fato, entre Accipitridae, a única espécie publicada até o

momento que apresenta um número diplóide menor, igual a 56, foi Morphnus

guianensis (WILLIAM & BERNISCKE, 1976). É interessante notar que os

gêneros Harpia e Morphnus parecem ser próximos filogeneticamente

(LERNER & MINDELL, 2005). Talvez a diminuição do número cromossômico

seja uma característica citogenética da subfamília Harpiinae, na qual esses

74

dois gêneros neotropicais estão incluídos, juntamente com Harpyopsis

novaeguineae, cujos dados citogenéticos ainda são desconhecidos.

Ressalta-se que o cariótipo de Harpia harpyja apresenta um grande número

de cromossomos de dois braços. A diminuição do número diplóide pode estar

relacionada com essa característica: apesar dos cromossomos de dois

braços poderem ser originados a partir de inversões pericêntricas, alguns

deles podem se originar através de processos Robertsonianos (fusões

cêntricas). No caso da harpia, provavelmente ocorreram os dois casos, já que

observamos uma diminuição no número diplóide, mas também um aumento

do número de braços em relação às outras espécies.

O padrão de bandeamento C revelou a presença de blocos

heterocromáticos na região pericentromérica de todos os cromossomos,

sendo que em alguns pares a marcação não foi conspícua, sendo que

apenas depois da análise de muitas metáfases foi possível sua detecção.

Como em outras espécies de Aves, o cromossomo W apresentou-se

parcialmente heterocromático. Um grande bloco heterocromático também foi

observado no braço longo de um par acrocêntrico, provavelmente

correspondente ao par 16. Esse padrão é concordante com outras aves, já

que nessa classe, com poucas exceções, os cromossomos apresentam

pouca heterocromatina constitutiva, concentrada principalmente na região

pericentromérica.

Diferentemente das outras espécies analisadas, Harpia harpyja

apresenta dois pares portadores de regiões organizadoras de nucléolo

(NORs). Esse fato também é concordante com os resultados obtidos por

impregnação por prata (DE OLIVEIRA et al., 2005). Poucas espécies de Aves

75

apresentam suas NORs descritas. De forma interessante, no caso de outros

Accipitridae (BED’HOM, 1999), Gruidae (NISHIDA & SASAKI, 1980),

Columbidae (SMALL et al., 1993), Tinamidae (GARNERO, 1996) e Rheidae

(GUNSKI et al., 1998), observamos NORs reveladas por impregnação por

prata em um único par de microcromossomos. O mesmo resultado foi

observado entre as espécies aqui analisadas, todas com apenas um par de

cromossomos portadores de NORs. Ao que parece, a observação de mais de

um par de cromossomos portadores de NORs é um fato raro entre Aves.

Em alguns organismos, como em peixes, a duplicação das regiões

organizadoras de nucléolo é considerada como uma característica derivada,

enquanto um par portador de NOR seria o estado ancestral ou plesiomórfico

(GALLETI et al., 1995). Apesar da controvérsia a esse respeito, o cenário

apresentado pelas aves se encaixaria bem nessa proposta, visto que a

duplicação da NOR estaria associada também a um cariótipo altamente

derivado, no caso da harpia. Seria interessante a existência de dados

referentes à localização de NORs no cariótipo de outros Harpiinae: talvez a

duplicação das NORs poderia ser um marcador cromossômico para esse

grupo, e talvez indique a proximidade filogenética entre outros gêneros de

Accipitridae que também apresentem mais de um par de cromossomos

portadores de NOR.

O par 6, que corresponde aos macrocromossomos portadores da NOR

em H. harpyja, apresentou-se heteromórfico em um dos indivíduos. Esse

heteromorfismo relaciona-se com comprimentos diferentes dos braços curtos,

muito maior em um deles. Além disso, o cromossomo maior apresentou uma

conspícua constrição secundária, não visível em seu homólogo. O uso de

76

sondas de DNA ribossômico comprovou que esse heteromorfismo deveu-se

a uma amplificação da região organizadora de nucléolos em um dos

homólogos, visto que o sinal de hibridização foi muito mais intenso e ocupou

uma maior extensão no cromossomo de maior comprimento. Esse tipo de

polimorfismo no tamanho da NOR é relativamente comum, sendo inclusive

utilizado como marcador populacional em alguns organismos (HIRAI et al.,

1998).

Spizaetus tyrannus apresentou um número diplóide igual a 68,

semelhante a muitas outras espécies de Accipitridae (Anexo II). Outra

espécie do gênero, S. nipalensis, também apresenta 2n=68, com a presença

de quatro pares de microcromossomos (TAKAGI & SASAKI, 1974). Uma

espécie de outro gênero, relacionado com Spizaetus, Stephanoaetus

coronatus, apresentou 2n=66, com cinco pares de microcromossomos (DE

BOER & SINOO, 1984).

Um dado interessante sobre o cariótipo de S. tyrannus é a pequena

quantidade de heterocromatina observada: muitos pares não apresentaram

nenhuma marcação pelo bandeamento C, ou apresentaram blocos pouco

evidentes. Apesar do cariótipo das aves ser caracterizado por uma pequena

quantidade de heterocromatina, geralmente somente na região

pericentromérica, a maioria das espécies apresenta marcações em todos os

cromossomos, ou pelo menos na maioria dos pares. Esse não é o caso de

Spizaetus tyrannus, que mostrou blocos pouco conspícuos em alguns de

seus cromossomos, com exceção de dois pares de microcromossomos que

foram marcados fortemente pelo bandeamento C.

77

A localização das regiões organizadoras de nucléolo em um pequeno

par de cromossomos em Spizaetus tyrannus foi diferente das outras espécies

de Accipitridae analisadas no presente trabalho. Porém, dados semelhantes

foram observados em outras espécies de Accipitridae, como em Aquila

adalbertii (PADILLA et al., 1999). É possível associar a localização de NORs

em microcromossomos com um estado menos derivado que sua localização

em macrocromossomos. Nos resultados apresentados por DE OLIVEIRA et

al. (2005), demonstrou-se que o par de macrocromossomos portador da NOR

originou-se a partir da fusão entre um macrocromossomo e um

microcromossomo de Gallus gallus. Resta ser comprovado se o

macrocromossomo portador da NOR em outras aves de rapina, como

Leucopternis albicolis, corresponde ao mesmo observado em harpia. Além

disso, apenas um par portador de NOR parece corresponder a uma condição

mais basal, como discutido anteriormemte.

Dos gêneros que se encontram mais próximos de Leucopternis

albicolis filogeneticamente, são disponíveis informações cariotípicas apenas

para o gênero Buteo. Nesse gênero, o número diplóide é igual a 68 ou 70 e

aproximadamente quatro pares de microcromossomos (DE BOER, 1976; DE

LUCCA, 1985; SCHNOFFNER, 1974 apud AMARAL & JORGE, 2003;

SCHMUTZ et al., 1993). Isso faz com que Leucopternis e Buteo tenham

cariótipos semelhantes pelo menos no número diplóide e de

microcromossomos.

Como em Spizaetus tyrannus, poucos blocos heterocromáticos foram

detectados em Leucopternis albicollis. Aparentemente, a existência de

poucos blocos heterocromáticos é mais regra do que exceção entre aves de

78

rapina. A presença de um ou dois pares com a maior parte de seu

comprimento heterocromático e microcromossomos com blocos

heterocromáticos ocorrem com freqüência nesse grupo: esse fato foi

observado em Harpia harpyja, Spizaetus tyrannus e Leucopternis albicollis,

no presente trabalho, e em outras espécies como Theratopius ecaudatus

(BED’HOM et al., 1998) e Elanus caeruleus (BED’HOM et al., 2003).

Leucopternis albicollis apresentou a região organizadora de nucléolo

localizada em um macrocromossomo submetacêntrico. Esse fato, juntamente

com um maior número de cromossomos de dois braços quando comparado

com Spizaetus, faz os cariótipos de Harpia e Leucopternis mais semelhantes

entre si.

Os dados obtidos dessas três espécies de Accipitridae confirmam a

necessidade de análises cariotípicas mais pormenorizadas e em um maior

número de espécies, para que se tenha um panorama da evolução cariotípica

ocorrida no grupo. Mesmo com poucas espécies analisadas, alguns aspectos

parecem se relacionar e têm potencial para serem utilizados como caracteres

em análises filogenéticas, como o caso das regiões organizadoras de

nucléolo. A aplicação de sondas cromossomo-específicas deverá trazer

respostas importantes para as relações intra e intergenéricas. A variabilidade

cariotípica está presente: precisamos saber explorá-la.

.

5.4 DADOS CROMOSSÔMICOS E A POSIÇÃO FILOGENÉTICA DE

CATHARTIDAE E ACCIPITRIDAE

Exceto pela família Cathartidae, que reteve um cariótipo plesiomórfico

e semelhante à maioria das espécies de aves analisadas, os outros grupos

79

classicamente incluídos na Ordem Falconiformes apresentam cariótipos

bastante derivados, com um número diplóide mediano, em torno de 66, e

poucos pares de microcromossomos (ANSARI & KAUL, 1986; BED’HOM,

1999).

Apesar de LIGON (1967 apud AMARAL & JORGE, 2003) sugerir a

existência de afinidades entre o complemento cromossômico de Cathartidae

e Ciconiiformes, a análise do cariótipo de espécies desses dois grupos não

mostra semelhanças maiores que entre Cathartidae e espécies pertencentes

a outras ordens que conservam a mesma organização cariotípica. Assim,

Mycteria americana (Ciconiidae) apresenta apenas dois pares acrocêntricos

entre os dez maiores pares de seus complementos (pares 3 e 9), sendo os

outros pares, de 1 a 10, de dois braços (FRANCISCO & GALETTI JR, 2000).

Da mesma forma, FRANCISCO & GALETTI JR (2000) sugerem que

Mycteria americana, com 2n=72, seria o cariótipo ancestral de Ciconiidae, já

que este grupo tende a ter números diplóides entre 2n=52 a 72. Esse fato, na

verdade, aproximaria Ciconiiformes de Accipitridae e Falconidae, cujos

números diplóides tendem a apresentar números semelhantes. Entretanto, é

importante frisar que números diplóides per si dizem muito pouco: sua análise

tem que ser complementada com padrões de bandeamento e mapeamento

gênico, o que infelizmente ainda não foi publicado. Os cariótipos das

espécies de Ciconiidae apresentam um número menor de

microcromossomos, mas ainda são bimodais, com uma distinta divisão entre

macro e microcromossomos (FRANCISCO & GALETTI JR, 2000).

A retenção de um cariótipo conservado em Cathartidae foi confirmada

com os dados de pintura cromossômica em Gymnogyps californianus

80

(RAUDSEPP et al., 2002) e em Cathartes aura, aqui apresentado. As outras

espécies dessa família apresentaram cariótipos similares. É razoável afirmar

que os grupos sintênicos estejam conservados entre todas as espécies,

apoiados nos dados obtidos até o momento. Dessa forma, se considerarmos

as famílias que são incluidas nas propostas clássicas, dentro da ordem

Falconiformes – Cathartidae, Saggitaridae, Falconidae e Accipitridae - a

posição basal de Cathartidae seria apoiada pelos dados citogenéticos. Um

cariótipo menos derivado é observado em Saggitarius serpentarius, que

também apresenta 2n=80. Porém, seu cariótipo apresenta um grande número

de cromossomos de dois braços, resultantes provavelmente de rearranjos

intracromossômicos (BED’HOM, 1999). De qualquer forma, do ponto de vista

citogenético, Cathartidae e Saggitaridae seriam mais basais em relação a

Accipitridae e Falconidae.

Ambas as espécies de Accipitridae analisadas no presente trabalho –

Harpia harpyja, Spizaetus tyrannus e Leucopternis albicollis – apresentaram

cariótipos com números diplóides menores que Cathartidae. Essa diminuição

no número de cromossomos é reusltado de uma extensa reorganização

cromossômica. Apesar de muitos autores sugerirem que so principais tipso

de rearranjo ocorridos sejam as fusões envolvendo microcromossomos (DE

LUCCA, 1992; AMARAL & JORGE, 2003), os experimentos de pintura

cromossômica revelaram que, na verdade, tanto macrocromossomos como

microcromossomos sofreram rearranjos, e tanto fusões como fissões

ocorreram em grande número (DE OLIVEIRA et al., 2005).

Finalmente, os dados cromossômicos existentes para aves até o

momento, apesar de fragmentados e incompletos na maioria das vezes, com

81

ausência de caracterização de padrão de bandas, apontam para uma posição

filogenética próxima entre Accipitridae e Falconidae, e uma posição mais

basal para Saggitaridae e Cathartidae. Essas famílias distinguem-se entre si

cromossomicamente. Entretanto, os dados existentes ainda não são o

bastante para esclarecer as relações filogenéticas entre Cathartidae e

Ciconiidae, já que esses últimos parecem apresentar um cariótipo mais

derivado em relação ao complemento cromossômico tido como ancestral nas

Aves, o qual se assemelha àquele observado em Cathartidae.

82

6. CONCLUSÕES

A análise citogenética de três espécies de Cathartidae e três espécies

de Accipitridae nos permitiu concluir que:

1. Sarcoramphus papa apresenta 2n=80 e NF=90. Seu cariótipo é do tipo

bimodal, com 10 pares de macrocromossomos. O par sexual é formado por

um cromossomo Z submetacêntrico e um W metacêntrico. Além das regiões

pericentroméricas de todos os cromossomos, um grande bloco

heterocromático foi observado no cromossomo W. As sondas de 18S/28S r-

DNA marcaram um pequeno par de microcromossomos.

2. Catharte aura apresenta 2n=80 e NF=90. Seu cariótipo é do tipo bimodal,

com 10 pares de macrocromossomos. Por se tratar de um macho, apenas a

morfologia do cromossomo Z foi determinada, sendo um cromossomo

submetacêntrico. Grandes blocos heterocromáticos foram observados na

região terminal do braço longo do par 6 e em um dos cromossomos do par 8,

além das regiões pericentroméricas de todos os cromossomos. As sondas de

18S/28S r-DNA marcaram um pequeno par de microcromossomos.

3. Catharte burrovianus apresenta 2n=80 e NF=90. Seu cariótipo é do tipo

bimodal, com 10 pares de macrocromossomos, com o cromossomo Z

submetacêntrico e o W metacêntrico. Grandes blocos heterocromáticos foram

observados na região terminal do braço longo do par 6, além das regiões

pericentroméricas de todos os cromossomos e no W. As sondas de 18S/28S

r-DNA marcaram um pequeno par de microcromossomos. As sondas

cromossomo-específicas de Gallus gallus mostraram que Cathartes aura

83

apresenta os grupos sintênicos correspondentes aos cromossomos de 1 a 7

e mais o Z de Gallus conservados, com exceção do par 4, que se encontra

dividido em dois cromossomos distintos.

4. A família Cathartidae apresenta-se muito conservada do ponto de vista

citogenético, com todas as espécies analisadas até o momento exibindo

número diplóide e de braços iguais. A principal variação constatada foi

quanto à quantidade e distribuição de blocos heterocromáticos.

5. Harpia harpyja apresentou o menor número diplóide dentre as espécies

analisadas, com 2n=58. O cromossomo Z é submetacêntrico, assim como o

W. Seu cariótipo é semelhante ao de outras espécies de Accipitridae, e difere

do padrão das aves por ser formado por cromossomos que diminuem

gradativamente de tamanho. Apenas os menores cromossomos de seu

complemento são puntiformes. Os blocos heterocromáticos aparecem na

região pericentromérica de seus cromossomos, no braço longo de um par de

acrocêntricos e no cromossomo W. Apresentou dois pares cromossômicos

marcados pelas sondas de R-DNA.

6. Spizaetus tyrannus apresentou 2n=68, com um cariótipo gradual e cerca

de cinco pares de microcromossomos. O cromossomo Z é submetacêntrico e

o W metacêntrico. Poucos cromossomos apresentaram blocos

heterocromáticos visíveis pelo bandeamento C. O W apresentou apenas um

dos braços heterocromático. Um par de cromossomos pequenos apresentou-

84

se hibridizado pela sonda de R-DNA, correspondendo ao par com constrições

secundárias visíveis pela coloração convencional.

7. Leucopternis albicollis apresentou 2n=66. Seu cariótipo, da mesma forma

que os outros accipitrídeos analisados, apresentou uma diminuição gradual

do tamanho de seus cromossomos. O cromossomo Z apresentou-se

submetacêntrico, assim como o W. Poucos cromossomos paresentaram

blocos heterocromáticos. Entretanto, um par de pequenos acrocêntricos

mostrou-se intensamente marcado, assim como grande parte do

comprimento do cromossomo W. Um par de submetacêntricos foi hibridizado

pelas sondas de R-DNA, correspondendo à localização da constrição

secundária.

8. Os Accipitridae analisados confirmaram a extensa variação cromossômica

que caracteriza essa família. Essa variabilidade cromossômica pode revelar

características importantes para estudos filogenéticos. Para isso, um maior

número de espécies precisa ser analisado citogeneticamente.

9. A retenção de um cariótipo plesiomórfico em Cathartidae faz com que esse

grupo se posicione de forma basal em relação aos Accipitridae e Falconidae,

reforçando a proposta de que essa família não se apresenta próxima

filogeneticamente de outras aves de rapina. Entretanto, os dados

citogenéticos existentes até o momento ainda não são o bastante para indicar

alguma relação entre Cathartidae e Ciconiidae, ou outro grupo de aves

qualquer.

85

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96

ANEXO

97

The chromosomes of the Order Falconiformes: a review

Ararajuba 11 (1): 65-73 67

Table 1. Karyoty characterization of Falconiformes

98

68 Ararajuba 11 (1): 65-73

Species 2n Mac Mic Z W Author Main remarks

Accipitridae Accipiter badius 66 - - 1stsm ? Kaul and ansari 1975 W not identified

A. dadius 66 32 10 1stsm ? t Misra and srivastava 1976 W is a small t, difficult to identify

A. gentilis 76 - - 4stsm ? m Jovanovic and Molosevic 1972 W not identified

A. gentilis 78 70 8 ? ? Boer 1976 Z and W not identified. Sant 4 th pair

A. nisus (?) * 64 - - 1stsm 6th ? Renzoni and Vegni-Talluri 1966 W is tentatively

Accipiter novaeholhandiae 66-68 - - ? ? Boer and Sinoo 1984 Z and W not identified. Sant 5 th pair

Aegypius monachus 66 58 8 1stsm ? Boer and Sinoo 1984 W not identified. Sant 16 th pair

Aquila adalberti 82 58 24 1stsm ? sm Padilha et al. 1999 W not distinguish between 3th and 4th pair

A. audax 66 58-60 6-8 1stsm ? m Boer 1976 W not identified A. rapax 68 58 10 1stsm ? Boer and Sinoo 1984 W not identified A. chrysaetos 62 56 6 ? ? Takagi and Sazaki 1974 Z and W not identified A. chrysaetos 66 56 10 ? ? Hoffmam 1976 Identical A. heliaca 68 58 10 ? ? Takagi and Sazaki 1974 Identical

Buteo albicaudatus 68 - - ? ? Lucca 1985 Z and W not identified. Sant 7th pair

B. buteo 68 - - 4thm ? Renzoni and Vegni-Talluri 1966 W not identified

B. buteo 68 60 8 ? ? Boer 1976 Z and W not identified. Sat 6th pair

B. jamaicensis 70 - - ? 4th m ? m Shoffner 1974 Z tentatively. W not identified. Sat 5th pair

B. lagopus 68 - - ? ? Balatova 1977 No information on the Z and W. Sat 4th pair

B. magnirostris 68 60 8 ? ? Lucca 1983 Z and W not identified. Sat 5th pair

B. magnirostris (Rupornis magnirostris) 68 60 8 1st sm Amaral and Jorge (pers.

Comm. 2001) W not identified

B. nitidus 68 - - ? ? Schmutz et al. (1993) Z and W not identified Sant 4th pair

B. platypterus 68 - - ? 1st m ? Schmutz et al. (1993) Z tentatively. W not identified B. regalis 68 - - ? ? Schmutz et al. (1993) Z and W not identified B. swainsoni 68 - - ? m ? Schmutz et al. (1993) Identical

Circaetus gallicus 66 58 8 ? m ? st Boer and Sinoo 1984 Z and W not identified. Sat mic 29th pair

Circus aeruginosus 70-72 62 8-10 1st sm ? Boer and sinoo 1984 W not clearly identified. Sat 2th pair

C. cyaneus 72 62 10 ? ? Boer and Sinoo 1984 Z and W not clearly identified C. pygarpus 70-72 62 8-10 1st sm ? Boer and Sinoo 1984 W not clearly identified

Geranoaetus melanoleucus 68 60 8 1st sm ? Boer and Sinoo 1984 W not clearly identified. Sant 5th pair

Geranospiza caerulescens 66 58 8 1st sm 15st m Williams and Benirschke 1976

Gypaetus barbatus 60 52 8 ? 1st sm ? m Boer 1976 Z tentatively. W not disringuish between 7th, 8th and 9th pair

99

Table 1. Continued.

Species 2n Mac Mic Z W Author Main remarks

Gyps bengalensis 66 58 8 ? 1st sm ? Boer and sinoo 1984 Z tentatively. W not identified. Sat 16th pair

G. coprotheres 66 58 8 1st sm 4th st Boer (1975, 1976) Sat 16th pair G. fulvus 66 58 8 1st sm 4th st Boer 1976 identical G. rueppellii 66 58 8 1st sm Boer and Sinoo 1984 W not identified. Sat 16th pair

Haliaeetus alacanus 66 58 8 ? 4th sm ? m Au et al. 1975 Z is between 3th and 4th pair W not identified Sat 4th pair

H. albicilla 66 58 8 ? 2nd sm ? sm Omura 1976 Z tentatively. W not identifiel H. albicilla 66 58 8 1st sm ? m Boer 1976 W not identified H. albicilla 66 58 8 1st sm ? m Boer and Sinoo 1984 W not identified. Sat 4th pair H. leucocephalus 66 58 8 ? ? Takagi and Sazaki 1974 Z and W not identified

H. leucocephalus 66 58 8 ? 4th sm ? sm Au et al. 1975 Z is between 3th and 4th pair. W is tentatively. Sat 4th pair

H. leucocephalus 66 58 8 4th sm ? sm Hoffmann et al. 1975 W not identified H. leucocephalus 66 58 8 1st sm ? m Boer and Sinoo 1984 W not identified. Sat 4th pair H. leucoryphus 66 58 8 ? sm ? m Boer and Sinoo 1984 Z and W not indentified H. leucogaster 66 58 8 1st sm ? m Boer and Sinoo 1984 W not identified

H. pelagicus 66 58 8 1st ? ? st Takagi and Sazaki 1974 Z tentatively sm or sr. W not identified

H. vocifer 68 58 10 1st sm 11th m Hoffmann et al. 1975 Discrepancy 2n compared with other species of genus

H. vocifer 66 58 8 1st sm ? 11th m Boer 1976 W tentatively. Sat 9th pair H. vocifer 66 58 8 ? 1st sm ? 11th m Boer and Sinoo 1984 Z and W tentatively. Sat 4th pair Haliastur Indus 66 58 8 1st sm ? m Boer 1976 W not identified. Sat 4th pair

Harpia harpyja 58 52 6 1st sm 9th ? Amaral and Jorge (pers. Comm. 2001) W tentatively

H. harpyja 58 52 6 ? ? Hoffmann et al. (1975) Z and W not identified

Lophoaetus occipitalis 66-68 56-58 8-10 1st sm ? m Boer and Sinoo 1984 W not identified probably between 7th an 9th pair

Milvus migrans 66 58 8 2nd sm ? sm Takagi and Sazaki 1974 W not identified M. migrans 66 56 10 ? ? Misra and Srivastava 1976 Z and W not identified Morphnus guianensis 54 48 6 3rd sm ? 19th m Williams and Benirscke 1976 W tentatively

Necrosyrtes monachus 66 58 8 ? ? Boer and Sinoo 1984 Z and W not identified. Sat 16th pair

Parabuteo unicinctus 68 - - ? m ? Schmutz et al. 1993 Z tentatively a large m pair. W not identified. Sat 4th pair

Pernis apivorus 66-68 58 8-10 1st ? ? st Takagi and Sazaki 1974 Z not defined probably sm or st. W not identified

P. apivorus 66-68 58 8-10 1st sm ? sm Boer and Sinoo 1984 W notg identified. Sat mic 29th pair

Pithecophaga jeffery 66 58 8 1st sm ? st Takagi and Sazaki 1974 Z tentatively sm or st. W not identified

P. jeffery 66 58 8 1st sm ? Hoffmann et al. (1975) W not identified P. jeffery 66 58 8 1st sm ? Boer 1976 Identical Sarcogyps calvus 66 58 8 1st sm 4o st Boer 1976

100

The chromosomes of the Order Falconiformes: a review Ararajuba 11 (1): 65-73 69

101

Species 2n Mac Mic Z W Author Main remarks

S. ccalvus 68 58 10 1st ? ? st Takagi and Suzuki 1974 Z tentatively sm or st. W not identified

Spizaetus nipalensis 68 60 8 1st ? ? t Takagi and Sazaki 1974 Identical

Stephanoaetus coronatus 66 56 10 ? 1 st sm ? Boer and Sinoo 1984 Z is tentantively. W not identified. Sat 29th pair

Terathopius ecaudatus 66 58 8 1 st sm ? 4th st Bed´Hom et al. 1998 W is tentatively 4th pair. Sat 16th pair

Torgos tracheliotus 66 58 8 1 st sm ? Boer and Sinoo 1984 W not identified. Sat 16th pair Falconidae Falco biarmicus 52 - - ? ac ? ac Boer 1975 – 1976 Z and W not identified

F. chiquera 50 - - ? ? Schumutz and Oliphant 1987 Just the diploid number described

F. columbarius 40 20 20 ? ? Longmire et al. 1988 Z and W not identified F. Jugger 48 - - ? 9th ac ? ac Belterman and Boer 1984 Z is tentatively. W small ac F. mexicanus 48 - - ? ? Schumutz and Oliphant 1987 Z and W not identified F. peregrinus 48 - - ? ? Schumutz and Oliphant 1987 Identical F. rusticolus 52 - - ? ? Schumutz and Oliphant 1987 Identical

F. Sparverius 80 - - 7th t 10th sm Shoffner 1974 Discrepancy between the diploid number

F. Sparverius 50 18 32 4th t 10th m Lucca 1983 (2n = 80 and 2n = 50)

F. tinnunculus 52 - - 1st ? 6th ? Renzoni and Vegni-Talluri 1966 Discrepancy on the Z and W

F. tinnunculus 50 - - 9th t ? t Bulatova and Radjabli 1974

Mivalgo chimachina ? 84 - - ? ? Belterman and Boer 1984 Diploid number is tentavilely. Z and W not identified

Phalcoboernus

megalopterus ? 90 - - ? ? Belterman and Boer 1990 Identical Polyborus plancus 84 - - ? ac ? ac Boer (1975, 1976) Z and W not identified

Pandionidae Pandion haliaetus 74 52 22 1st sm 7th sm Kholer and Achaadt 1989 Sagittariidae Sagittarius serpentarius 80 36 44 ? ? Boer (1975, 1976) Discrepancy between diploid S. serpentarius 74 - - ? ? Hoffmann et al. 1975 Number Z and W not identified

(m) Metacentric, (sm) submetacentric, (st) subtelocentric, (ac) acrocentric, (t) telocentric, (Mac) macrocromosome, (Mic), microcromosome, (Sat) Satellites, (-) absence of distinction between mac and mic, (?) not identified, (?t, ?m, ?st) not clearly identified. (*) Unknown especies, probabely A. nisus.

102

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