ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DA … · Defesa apresentada ao Programa de...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

LABORATÓRIO DE GENÉTICA DE RECURSOS MARINHOS

ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DA

PIRAÚNA (Cephalopholis fulva: SERRANIDAE) AO LONGO

DA COSTA E ILHAS OCEÂNICAS BRASILEIRAS

Allyson Santos de Souza

Natal/RN – 2011

ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)

ii





Defesa apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências Biológicas

como pré-requisito para obtenção do

título de Mestre em Ciências Biológicas

pela Universidade Federal do Rio

Grande do Norte.

Prof. Dr. Mauro Pichorim (Orientador)

Prof. Dr. Wagner Franco Molina (Co-orientador)

Natal/RN – 2011


iii





Banca examinadora:

Prof. Dr. Mauro Pichorim (Orientador)

Departamento de Botânica, Ecologia e Zoologia, UFRN

Prof. Dr. Wagner Franco Molina (Co-orientador)

Departamento de Biologia Celular e Genética, UFRN

Prof. Dr. Sérgio Maia Queiroz Lima (Membro externo)

Departamento de Genética, UFRJ

Prof. Dr. Adrian Antônio Garda

Departamento de Botânica, Ecologia e Zoologia, UFRN

Nata/RN - 2011


iv

Agradecimentos

Agradeço primeiramente à Deus e aos espíritos protetores; Aos

meus pais, Azuílo e Rosália, pelo apoio e confiança sempre dados a

mim; Ao Professor Dr. Wagner Franco Molina pela orientação desde

2003, por acreditar no desenvolvimento deste projeto e pela amizade.

Muito obrigado por tudo!; À minha esposa Cristina, a qual sempre me

incentiva, apoia e colabora nos projetos profissionais e pessoais; Ao

Professor Dr. Mauro Pichorim pela orientação durante o mestrado e pela

amizade; À Academia Brasileira de Ciências e aos professores Dr.

Horácio Schneider e Dra. Iracilda Sampáio; À tia Neide por todo

incentivo; Ao amigos e companheiros de trabalho Antônio Jales e Eurico

Jr.; À Luciano de Rio do Fogo pelo apoio logístico; À José Garcia Jr. e a

galera do LGRM; Ao Prof. Dr. Walter e Louise da PPCB; À CAPES pela

bolsa concedida e a todos que contribuíram de forma direta ou indireta

no desenvolvimento deste trabalho.


v

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS .............................................................................................v

LISTA DE TABELAS ........................................................................................... vi

RESUMO...............................................................................................................1

ABSTRACT ...........................................................................................................2

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................3

2. OBJETIVOS ......................................................................................................8

2.1 Objetivos específicos ..........................................................................8

3. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................8

3.1 Coleta de material biológico ...............................................................8

3.2 Extração de DNA ................................................................................9

3.3 Amplificação e Sequenciamento da região hipervariável 1 (RHV-1)

da alça D-Loop do DNAmt ...................................................................... 10

3.4 Análises das Sequências .................................................................. 10

4. RESULTADOS ............................................................................................... 13

4.1 Características moleculares ............................................................. 13

4.2 Estrutura genética populacional........................................................ 16

4.3 Neutralidade e história demográfica ................................................. 20

5. DISCUSSÃO ................................................................................................... 23

6. CONCLUSÕES ............................................................................................... 32

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 33


vi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Histórico da produção pesqueira marinha no Brasil. ...........................3

Figura 2 – Alguns colomorfos de Cephalopholis fulva utilizados neste trabalho .5

Figura 3 – Representação esquemática do genoma mitocondrial dos

vertebrados. ..........................................................................................................7

Figura 4 – Pontos de coleta de Cephalopholis fulva ao longo da costa brasileira

e do Arquipélago de Fernando de Noronha. .........................................................9

Figura 5 – Representação esquemática da região d-loop. ................................. 10

Figura 6 – Análise de saturação entre as transições e transversões das

sequências d-loop de Cephalopholis fulva .......................................................... 14

Figura 7 – Estrutura populacional de Cephalopholis fulva estimada com o

modelo K = 2 ....................................................................................................... 16

Figura 8 – Histograma de distribuição do parâmetro Alpha (α) para K = 2, sob

análise no programa Structure, no conjunto de dados de Cephalopholis fulva ... 17

Figura 9 – Dendograma de similaridade entre as sequencias de d-loop de

Cephalopholis fulva gerado pelo método de NJ .................................................. 18

Figura 10 – Frequências das diferenças par-a-par entre as sequências ............ 21

Figura 11 – Variações no nível do oceano Atlântico e o período de expansão

populacional (entre 117.000 e 132.000 anos – em amarelo) de Cephalopholis

fulva na costa brasileira ....................................................................................... 28

Figura 12 – Margem continental do tipo Atlântico ............................................... 29

Figura 13 – A costa nordeste do Brasil e Cadeia de Fernando de Noronha ao

longo das oscilações oceânicas nos últimos 350 mil anos .................................. 30


vii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Índices de diversidade genética entre sequências da RHV1 de

diferentes amostras geográficas de Cephalopholis fulva .................................... 15

Tabela 2 - Haplótipos de sequencias de d-loop da espécie Cephalopholis fulva

compartilhados dentro e/ou entre regiões geográficas ........................................ 15

Tabela 3 - Diferenciação genética entre as populações de Cephalopholis fulva a

partir da estimativa de FST ................................................................................... 16

Tabela 4 - Análise da variância molecular das populações de Cephalopholis

fulva em diferentes agrupamentos ...................................................................... 17

Tabela 5 - Divergência genética intrapopulacional em Cephalopholis fulva com

base em sequencias da região hipervariável 1 do d-loop (DNAmt) ..................... 17

Tabela 6 - Índices de neutralidade e expansão populacional de Cephalopholis

fulva da costa brasileira amostradas entre 2008 e 2010 ..................................... 20


1

RESUMO

O Brasil possui cerca de 8.500 km de litoral e diante desta dimensão, a pesca

historicamente constitui uma importante fonte de proteína animal para consumo

humano. O histórico nacional na pesca mostra um crescimento da produção pesqueira

marinha até 1985 e a partir deste período registrou-se um contínuo decréscimo. A partir

do ano de 2003 as estatísticas pesqueiras apontam para certa “recuperação” da

produção pesqueira total, o que provavelmente esta relacionada a uma mudança nas

práticas do setor. O alvo da pesca comercial passou a ser espécies menores e de baixo

valor comercial, porém muito abundantes. A piraúna, Cephalopholis fulva (Serranidae) é

uma destas espécies alvo que vem sofrendo uma maior pressão pesqueira nos últimos

anos. A fim de fornecer dados sobre a real situação da diversidade genética destas

populações, diversos marcadores moleculares vêm sendo utilizados para esta

finalidade. O prévio conhecimento da variabilidade genética é crucial para o manejo e

conservação da biodiversidade. Neste intuito, sequências da região controle (d-loop) do

DNAmt de Cephalopholis fulva (Serranidae) de cinco pontos geográficos da costa

brasileira (Ceará, Rio Grande do Norte, Bahia e Espírito Santo) e o Arquipélago de

Fernando de Noronha (FN) foram sequenciadas e sua diversidade genética analisada.

Os valores de FST se revelaram muito baixos (0.0246 a 0.000), indicando intenso fluxo

gênico entre os pontos amostrados. Os índices h e π indicam um contato secundário

entre linhagens alopátricas previamente diferenciadas ou a grandes e estáveis

populações com longa história evolutiva; Os testes de Fu e Tajima indicaram expansão

para todas as populações. Já as diferenças par-a-par e o SSD indicaram expansão

apenas para as populações costeiras. Diferentemente de outras espécies do Atlântico

que foram profundamente afetadas por eventos Pleistocênicos mais tardios, os padrões

genético-populacionais presentes em C. fulva parecem estar relacionados a eventos

mais recentes ocorridos a cerca de 130.000 anos. Além disso, os dados apresentados

pelas amostras geográficas da espécie C. fulva demonstram elevada diversidade

genética, indicando ainda a ausência de efeitos deletérios da sobrepesca da espécie,

bem como evidências de panmixia plena tanto entre as áreas continentais, como entre

estas e o regiões insulares.

Palavras-chave: DNAmt, d-loop, filogeografia, serranidae, panmixia, pleistoceno.


2

ABSTRACT

Brazil has about 8,500 km of coastline and on this scale, fishing is a historically

important source of animal protein for human consumption. The national fishing background

shows a growth of marine fishery production until 1985 and within this period it was recorded

a steady decline. From the year 2003 fishing statistics aim to some "recovery" of the total

fisheries production, which probably is related to a change in industry practice. The target of

commercial fishing became smaller species with low commercial value, but very abundants.

The coney, Cephalopholis fulva (Serranidae), is one of these species that have been

suffering a greater fishing pressure in recent years. In order to provide data about the current

situation of the genetic diversity of these populations, several molecular markers have been

being used for this purpose. The prior knowledge of genetic variability is crucial for

management and biodiversity conservation. To this end, the control region sequences (d-

loop) of mtDNA from Cephalopholis fulva (Serranidae) from five geographical points of the

coast of Brazil (Ceará, Rio Grande do Norte, Bahia and Espírito Santo) and the Archipelago

of Fernando de Noronha (FN) were sequenced and their genetic diversity analyzed. The FST

values were very low (0.0246 to 0.000), indicating high gene flow between the sampled

spots. The indices h and π indicate a secondary contact between previously allopatric

lineages differentiated or large and stable populations with long evolutionary history. Tests of

Tajima and Fu showed expansion for all populations. In contrast, the mismatch distribution

and SSD indicated expansion just for coastal populations. Unlike other species of the Atlantic

which have been deeply affected by events on later Pleistocene, the population-genetic

patterns of C. fulva may be related to recent events occurred approximately 130,000 years

ago. Moreover, the data presented by geographical samples of the specie C. fulva showed

high genetic diversity, also indicating the absence of deleterious effects of over-exploitation

on this specie, as well as evidence of complete panmixia between all sampled populations.

Keywords: DNAmt, d-loop, filogeography, serranidae, panmixia, pleistocene.


3

1. INTRODUÇÃO

O Brasil possui cerca de 8.500 km de área costeira com algumas ilhas

oceânicas, as quais as principais são Fernando de Noronha, Atol das Rocas,

Arquipélago de São Pedro e São Paulo, Abrolhos, Trindade e Martin Vaz, totalizando

3,5 milhões de km² de ZEE (Zona Econômica Exclusiva), que se estende desde o

Cabo Orange (5º N) até o Chuí (34º S) e encontra-se, em sua maior parte, em

regiões tropicais e subtropicais (CNIO, 1998). Diante desta dimensão, a pesca situa-

se entre as quatro maiores fontes de proteína animal para consumo humano no

país. O histórico oficial sobre a produção brasileira de pescado marinho para o

período de 1960 a 2009 mostra uma tendência de crescimento até 1985, quando

atingiu cerca de 760.400 toneladas. A partir de então, registrou-se um contínuo

decréscimo. Em 1990, o total pescado foi de apenas 435.400 t, uma queda de 57%

na produção. Apesar de alguma flutuação entre 1990 e 2002, a produção pesqueira

marinha parece ter ficado estagnada. Desde o ano de 2003 as estatísticas

pesqueiras apontam para certa recuperação da produção pesqueira total, chegando

a 585.000 toneladas no ano de 2009, como pode ser vista na Figura 1 (IBAMA,

2000, 2001, 2002a, 2002b, 2003, 2004, 2005, 2006 2007, 2008, 2009).

Figura 1. Histórico da produção pesqueira marinha no Brasil nos últimos 50 anos. Fonte: IBAMA (http://www.ibama.gov.br/recursos-pesqueiros/documentos/estatistica-pesqueira/)

A exploração desordenada desses estoques pode acarretar sérios

problemas nas populações naturais. Essa exploração pode ultrapassar a produção

máxima sustentável (FAO, 1996), causando impacto na abundância das espécies

alvo e expondo-as à ameaça de extinção (Casey & Myers, 1998; Dulvy et al., 2004).


4

As espécies mais suscetíveis à sobrepesca são aquelas que apresentam

alto valor comercial, maturam tardiamente, possuem limitações geográficas e/ou

recrutamento esporádico (Sadovy, 2000; Dulvy et al., 2004). A sobrepesca provém

da redução significativa do número de adultos e da captura progressiva dos

indivíduos juvenis, o que compromete o recrutamento nos anos posteriores (Paes,

2002).

Outros fatores também tendem a influenciar a diversidade genética e o

tamanho das populações ao longo dos oceanos, tais como duração do período larval

pelágico e estratégia de reprodução das espécies, dinâmica das correntes oceânicas

e eventos históricos (Shulman & Bermingham, 1995; Shulman, 1998; Barber et al.,

2000; Nelson et al., 2000), tais como a série de períodos glaciais e interglaciais

ocorridas durante o período Pleistoceno (Imbrie et al., 1992).

Algumas espécies da família Serranidae apresentam características

biológicas peculiares que as tornam particularmente vulneráveis às mudanças

climáticas, à pressão da pesca e à degradação do habitat, tais como alta

longevidade, maturação sexual tardia, hermafroditismo, agregação reprodutiva e a

necessidade de "berçários" para os juvenis em regiões estuarinas (Coleman, 1999;

Morris et al., 2000). Segundo Morris et al. (2000), cerca de 40% das espécies dessa

família foram consideradas sob algum nível de ameaça diante da pressão antrópica.

Na subfamília Epinephelinae, com cerca de 159 espécies distribuídas em 15

gêneros (Nelson, 2006), estão presentes grandes serranídeos como o sirigado,

Mycteroperca bonaci (Poey, 1860) e o mero, Epinephelus itajara (Lichtenstein,

1822), espécies que possuem um grande valor econômico e ecológico, com

indicações que esta última esteja ameaçada de extinção no Brasil (MMA, 2004).

Pertencente a esta subfamília, a espécie Cephalopholis fulva (Linnaeus,

1758), popularmente conhecida como piraúna, apresenta uma ampla distribuição

geográfica na costa ocidental do Atlântico, desde as Bermudas e Carolina do Sul até

o sudeste do Brasil, incluindo o Atol das Rocas, o Arquipélago de Fernando de

Noronha (Heemstra & Randall, 1993; Freitas et al., 2003; Sazima et al., 2005) e as

Ilhas de Trindade e Martim Vaz (Gasparini & Floeter, 2001).

Ao longo da costa e ilhas oceânicas, podem ser encontradas piraúnas com

diferentes padrões de coloração (colomorfos), variando desde o amarelo até o

marrom-escuro (Figura 2)


5

Figura 2. Alguns colomorfos de Cephalopholis fulva utilizados neste trabalho (exceto o colomorfo A -amarelo). A barra possui 1 cm.

A espécie Cephalopholis fulva é hermafrodita protogínica, ou seja, todos os

indivíduos nascem fêmeas. As fêmeas atingem a maturação sexual com um

comprimento total de 160 mm e a partir de 200 mm pode ocorrer reversão sexual,

onde os indivíduos tornam-se machos, apresentando territorialidade e formando

haréns (Heemstra & Randall, 1993; Coelho, 2001; Araújo & Martins, 2006).

Além disso, esta espécie apresenta alta variabilidade na relação entre idade

e comprimento. Araújo e Martins (2006) ao analisar essa relação em exemplares de

piraúna coletados ao longo da costa do Espírito Santo, encontraram indivíduos com

comprimento mínimo de 172 mm e máximo de 428 mm e idade mínima e máxima de

2 e 25 anos, respectivamente. Ainda segundo estes autores, a estimativa teórica dos

parâmetros de crescimento mostra que a piraúna cresce rapidamente no início da

vida, chegando a 60% do tamanho teórico máximo no primeiro ano e então segue

crescendo lentamente.

Entre 1996 e 2000 a piraúna representou 2,4% da produção total

desembarcada pela frota pesqueira no nordeste do Brasil (Frédou et al., 2006) e foi

a espécie mais abundante nas amostras coletadas entre os pescadores que fazem

pesca de linha na costa central do Brasil, entre 1997 e 1998 (Martins et al., 2007).

Klippel et al (2005) estimaram um desembarque médio de 1.116 toneladas/ano entre

1997 e 2000 naquela região. Martins et al. (2005) citam que o desembarque de C.

fulva, por parte dos barcos que realizam pesca de linha e anzol, tem aumentado


6

desde o início da década de 1990, nos portos do Espírito Santo, e seu principal

destino é a exportação para consumo nos Estados Unidos.

No porto de Natal, Rio Grande do Norte, ocorre algo semelhante. Apesar dos

barcos também utilizarem linha e anzóis, as piraúnas são principalmente pescadas

com armadilhas chamadas “covos”. Durante o presente estudo, foi consultada uma

empresa local a qual exporta a piraúna. Esta empresa informou que, apenas ela,

exporta em média duas toneladas de piraúna por mês, tendo como principais

destinos as cidades de Miami e Nova Yorque (EUA).

Apesar dos dados pesqueiros, Cephalopholis fulva é citada pela IUCN

(International Union for Conservation of Nature and Natural Resources) como

espécie “não ameaçada”, porém, em processo de “redução”. A pesca sobre esta e

várias outras espécies parece ter aumentado continuamente devido a um

deslocamento da pressão pesqueira sobre espécies de menor porte, tendo em vista

a diminuição das populações de peixes maiores e comercialmente mais valiosos

(IUCN, 2010). O aumento da produção pesqueira a partir do ano de 2003 (Figura 1)

pode estar relacionado a esse deslocamento da pressão pesqueira sobre espécies

que não eram atraentes do ponto de vista comercial.

Estudos sobre a biologia, ecologia e particularmente genética populacional

são extremamente escassos em Epinephelinae. Esta última abordagem tem sido

empregada de forma recente e crescente em serranídeos, peixes com alto valor

comercial e ecológico (Rivera et al., 2004; Zatcoff et al., 2004; Maggio et al., 2006;

Silva-Oliveira et al., 2008).

Para C. fulva existe um único estudo genético populacional, através de

isoenzimas, envolvendo as populações da costa do Ceará (n = 20) e do Atol das

Rocas (n = 5) (Freitas et al., 2003), embora de amplitude geográfica e amostral

restrita. Apesar de pioneiro, este estudo teve pequena capacidade explicativa sobre

as relações existentes entre as populações litorâneas e as das ilhas oceânicas

brasileiras, mediadas pelo cenário dinâmico das correntes oceânicas reinantes no

Atlântico Ocidental.

Nesse contexto, é imprescindível a realização de estudos que demonstrem a

real situação da variabilidade genética das populações de C. fulva para,

consequentemente, fornecer subsídios técnicos para a formulação de estratégias de

gestão dos recursos pesqueiros. O conhecimento prévio da variabilidade genética a

nível populacional é fundamental para a conservação dos recursos genéticos


7

naturais e da biodiversidade (Tzeng et al., 2004; Zhang et al., 2006) seja com fins

conservacionistas ou exploratórios (Begg & Waldmam, 1999).

A identificação de estoques pesqueiros e sua variabilidade genética tem sido

realizada de forma crescente e eficaz pela utilização de marcadores moleculares

altamente polimórficos (Blaber et al., 2005; Caddy & Seijo, 2005; Carmen & Ablan,

2006; Santos et al., 2006), como de sequências da região D-loop, também

conhecido como região controle do DNAmt. Esta região (Figura 3), por ter uma taxa

evolutiva duas a cinco vezes mais rápida que o restante do genoma mitocondrial

(Meyer, 1993), fornece informações genéticas que permitem inferir relações entre

táxons próximos e a história de populações através de estudos de fluxo gênico,

especiação, sistemática e estrutura de populações (Avise, 1994).

Figura 3. Representação esquemática do genoma mitocondrial dos vertebrados. Em destaque a

região D-loop, utilizada para inferir relações populacionais. Modificado de Shadel e Clayton

(1997).


8

2. OBJETIVOS

Quantificar a diversidade e conectividade genética entre populações de

Cephalopholis fulva, provenientes de diferentes regiões geográficas brasileiras,

costeiras e insulares, por meio da análise de sequências parciais da região D-loop

do seu genoma mitocondrial.

2.1. Objetivos específicos

• Estimar os índices de diversidade genética intra e interpopulacional de C. fulva

ao longo da costa do Brasil e Arquipélago de Fernando de Noronha;

• Analisar possíveis estruturações genéticas populacionais da espécie ao longo

do litoral brasileiro e/ou no Arquipélago de Fernando de Noronha;

• Inferir sobre a história demográfica das populações estudadas;

• Verificar, através de dados genéticos, indícios de sobrepesca para a espécie C.

fulva no Brasil.

• Verificar a eficiência do marcador mitocondrial D-loop para caracterização de

populações de Cephalopholis fulva.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Coleta de material biológico

Os pontos de coleta abrangeram mais de 2.700 km de litoral ao longo da

costa brasileira e os exemplares coletados foram identificados de acordo com

Heemstra e Randall (1993). Ao todo foram utilizados 189 indivíduos capturados com

o uso de anzóis, tarrafas ou covos no litoral brasileiro e no Arquipélago de Fernando

de Noronha.

Dos 189 indivíduos coletados, 37 foram provenientes da costa de Fortaleza

(CE) (3º42’S - 38º30’O), 36 do litoral de Rio do Fogo (RN) (5º16’S - 35º22’O)

(Licença IDEMA Dec. Nº 15.746/2001, Ofício Nº 574/2002-DG), 50 indivíduos de

Salvador (BA) (13º00’S - 38º29’O), 30 indivíduos da costa de Vila Velha (ES)

(20º20’S - 40º14’O) e 36 exemplares provenientes do Arquipélago de Fernando de

Noronha (FN, pertencente ao estado do Pernambuco) (3º50’S - 32º24’O), neste

último ponto sob a licença do IBAMA Nº 02001.001902/06-82 (Figura 4).

Fragmentos de tecido hepático e/ou nadadeiras foram retirados dos

exemplares, acondicionados em microtubos (1,5 ml) contendo solução fixadora de

DNA composta por álcool etílico e álcool metílico (1:1) e armazenados a temperatura

de -20°C.


9

3.2. Extração de DNA

A partir dos fragmentos de tecido obtidos de cada animal foi realizada a

extração de DNA, de acordo com o protocolo de Sambrook et al., (1989). As

amostras foram maceradas após imersão em nitrogênio líquido e homogeneizadas

em tampão de extração adicionado de Proteinase K. O DNA foi extraído com fenol,

clorofórmio e álcool isoamílico (25:24:1) e precipitado com NaCl 5M e isopropanol

100% gelado, recebendo ainda uma lavagem com etanol 70% gelado para retirada

do excesso de sal; e ressuspenso com água ultrapura. Após a extração, o DNA foi

quantificado a partir de comparação visual com auxilio de marcador de 100 pares de

bases em gel de agarose 0,8%. A corrida eletroforética teve duração de

aproximadamente 30 min de migração sob voltagem de 85 V, a partir da qual o gel

foi corado com brometo de etídio e observado com o auxílio do trans-iluminador de

luz ultravioleta.

Figura 4. Pontos de coleta de Cephalopholis fulva ao longo da costa brasileira e do Arquipélago

de Fernando de Noronha. CE = Ceará, RN = Rio Grande do Norte, FN = Arquipélago de

Fernando de Noronha, BA = Bahia e ES = Espírito Santo. O tracejado em vermelho destaca a

Cadeia de Fernando de Noronha com (acima) e sem batimetria (abaixo). Batimetria modificada

de Vital et. al. (2010). As estrelas vermelhas indicam os pontos onde as coletas foram

realizadas.


10

3.3. Amplificação e Sequenciamento da região hipervariável 1 (RHV-1) da alça

D-Loop do DNAmt.

A região controle do DNAmt foi amplificada, utilizando os primers Lee-CR-A

e Lee-CR-E descritos em Lee et al. (1995) (Figura 5).

Reações com volume total de 25 µl contendo 4 µl de DNTP (1,25 mM), 2,5 µl

de tampão (10x), 1 µl de MgCl2 (50 mM), 2,0 µl de cada primer (10 pmol/µl), 1-1,5 µl

de DNA total, 0,3 µl de Taq DNA Polimerase (5U/µl) (Invitrogen, EUA) e água

purificada para completar o volume final, foram realizadas nas seguintes condições:

desnaturação inicial a 94 ºC por 2 minutos; 30 ciclos de desnaturação a 94 ºC por 45

segundos, hibridização a 52 ºC por 45 segundos, extensão a 72 ºC por 1 minuto; e

extensão final a 72 ºC por 2 minutos. Os produtos da PCR foram purificados com as

enzimas exonuclease I e fosfatase alcalina de camarão (GE Healthcare), com o

auxílio do termociclador, submetendo-se o DNA amplificado a uma ciclagem de 30

minutos a 37 ºC e 15 minutos a 80 ºC para ação das enzimas.

Em seguida as amostras seguiram para a reação de sequenciamento do

DNA que foi realizada na Plataforma de Sequenciamento da EMBRAPA

(Brasília/DF).

Figura 5. Representação esquemática da região d-loop. Setas com letras acima indicam o local onde

o respectivo primer se anela e sentido da síntese do DNA; RHV (Região Hipervariável); “CytB” indica

o final do fragmento de Citocromo B; “12S rRNA” indica o início do gene 12S. No retângulo, as

sequências dos primers A (Lee-CR-A) e E (Lee-CR-E) utilizados neste estudo.

3.4. Análises das Sequências

Após o sequenciamento, os cromatogramas obtidos foram visualizados para

conferência e as sequências de bases nucleotídicas alinhadas através do programa

BIOEDIT (Hall, 1999).

A existência de saturação entre as transições e transversões ao longo das

sequências foi analisada através do programa DAMBE (Xia & Xie, 2001). Este teste

verifica a ocorrência de mais de uma substituição em determinados sítios. Como


11

resultado tem-se um gráfico onde a coordenada representa os valores das

distâncias de cada par de táxons usados e a abscissa o número de transições (Xs)

ou de transversões (∆v) presentes em cada par de táxons. No caso de não haver

saturação, a relação entre estes parâmetros é linear, isto é, com o aumento da

distância, há o aumento do número de Xs ou ∆v. Se houver substituições múltiplas,

o gráfico atinge um platô no qual, aumentando-se a distância, não há o aumento no

número de Xs ou ∆v (Pereira, 2000).

Pelo programa ARLEQUIN 3.5 (Excoffier & Lischer, 2010) foram calculados

os índices de diversidade genética haplotípica (h; Nei, 1987), nucleotídica (π; Nei,

1987) e a diferenciação genética entre as populações a partir da estimativa de FST

(Wright, 1978) com testes de significância dos resultados baseados em 10.000

permutações. O índice FST de Wright representa uma medida do grau de

diferenciação genética ou de subdivisão interpopulacional (Slatkin, 1993). Segundo

Wright (1978), valores entre 0 e 0.05 indicam pouca diferenciação genética, entre

0.05 e 0.15 indicam diferenciação moderada, entre 0.15 e 0.25, alta diferenciação e

valores acima de 0.25 representariam diferenciação genética muito alta.

Como abordagem complementar para explorar a estrutura genética das

populações, uma análise Bayesiana, implementada no programa Structure v2.2

(Pritchard et al. 2000), foi realizada para inferir o número mais provável de grupos

genéticos representados nas amostras (K). O método de atribuição Bayesiana

delineia grupos de indivíduos com base em múltiplos loci do genótipo sem a

utilização de qualquer informação geográfica ou fenotípica.

Vinte corridas foram realizadas no programa Structure para cada K. Foram

testados K = 1 – 12, assumindo o “modelo de mistura” e “frequências alélicas

correlacionadas”. Para cada corrida, 100.000 interações MCMC (Markov Chain

Monte Carlo) foram realizadas após um período burn-in de 50.000 interações. Além

disso, foi seguida a recomendação de Evanno et al. (2005) e calculada a estatística

de ∆K para detectar o verdadeiro K, baseado na taxa de mudança de segunda

ordem em LnP(D), que é uma estimativa da probabilidade posterior dos dados para

um dado K. Nesta análise, o nível de mistura dentro de cada população foi avaliado

ao estimar a percentagem média de adesão (Q) em cada grupo genético, o qual foi

obtido pela média dos coeficientes de adesão individual (q). A média do LnP(D) das

vinte corridas realizadas para cada K foram utilizadas na determinação do K

verdadeiro.


12

A fim de evidenciar possíveis agrupamentos genéticos entre os indivíduos

amostrados, utilizou-se o programa MEGA4 (Tamura et al., 2007) para verificar a

porcentagem de divergência genética entre as sequências e para a confecção de um

dendograma de similaridade genética utilizando o método de agrupamento de

vizinhos (neighbor-joinning). A confiabilidade dos ramos foi testada pela análise de

bootstrap utilizando 1000 replicações.

Para avaliar a diversidade na estrutura genética populacional, foi empregada

a análise hierárquica da variância molecular (AMOVA) através de seus índices

(Excoffier et al., 1992) e para verificar a possível ocorrência de eventos de expansão

demográfica histórica foram examinadas por diferentes abordagens, ambas as

análises utilizando o programa ARLEQUIN 3.5 (Excoffier e Lischer, 2010).

Um conjunto de testes foi empregado para evidenciar possíveis eventos de

expansão populacional. Os testes Fs (Fu, 1997) e D (Tajima, 1989) foram utilizados,

com 10.000 permutações, para verificar se a neutralidade se mantém. Estes testes

analisam a influência das mutações sobre a história de vida das populações. O

desvio do equilíbrio neutro só ocorre quando estes valores são significativamente

maiores ou menores que zero. Os valores positivos de Fs sugerem seleção

balanceadora, subdivisão populacional ou efeito gargalo; valores negativos sugerem

seleção direcional recente, seleção de alelos ligeiramente deletérios, expansão

populacional ou efeito carona (hitchhiking) (Fu, 1997). Valores positivos de D

sugerem a existência de um gargalo populacional recente ou alguma forma de

seleção balanceadora; valores negativos de D sugerem expansão populacional

(Tajima, 1989). O índice de raggedness (Harpending, 1994) e a Soma dos Desvios

Quadrados (Sum of Square Deviations - SSD; Schneider & Excoffier, 1999) entre a

distribuição observada e esperada também foram utilizados como testes estatísticos

para validar ou não o modelo de expansão estimado pelos testes de Fu e Tajima.

Populações em expansão exibem baixos valores de raggedness, enquanto, o oposto

é observado em populações estáveis ao longo do tempo (Harpending, 1994). A

significância do SSD (valor p) foi obtida com 10.000 réplicas de bootstrap

paramétrico. Neste teste, se 95% ou mais da distribuição mismatch simulada

mostram um melhor ajuste da curva que o observado, a hipótese de expansão é

rejeitada. Tanto o índice de raggedness quanto o SSD indicam a existência ou não

de expansão populacional utilizando como hipótese nula a não ocorrência de

expansão da população. Complementarmente, a condição de crescimento

populacional foi investigada através da análise das frequências das diferenças par-a-


13

par (distribuição mismatch) com base em três parâmetros, θ0, θ1 (frequências das

diferenças par-a-par entre as sequências antes e após a expansão da população) e

τ (tempo de expansão expressa em unidades de tempo mutacional e representada

pela letra grega Tau) (Rogers & Harpending, 1992; Rogers, 1995). Os parâmetros de

expansão demográfica τ, θ0 e θ1 foram estimados através de uma abordagem não

linear de mínimos quadrados generalizados e os intervalos de confiança dos

parâmetros foram calculados utilizando uma abordagem paramétrica de bootstrap

(Schneider & Excoffier, 1999). Valores de τ foram transformados em tempo real,

desde o tempo estimado de expansão, através de duas equações: Primeiramente, u

= µ . mt, onde “u” é a taxa mutacional por geração, "µ" (mi) taxa de mutação

estimada para o segmento analisado; "mt" é a quantidade de bases nucleotídicas

analisadas. Posteriormente, τ = 2ut, onde "t" é o tempo estimado de ocorrência da

expansão desde então. O tempo de geração adotado para a espécie C. fulva foi de

um ano, com base em Heemstra e Handall (1993) e Araújo e Martins (2006, 2009).

Para datar os eventos de expansão populacional utilizou-se a diferenciação entre

Chromis multilineata e Chromis atrilobata, ambos Perciformes, assim como C. fulva

após o surgimento do Istmo do Panamá. Este evento vicariante tem sido usado em

vários estudos para calibrar e estimar as taxas de mutação (µ) em linhagens

estreitamente relacionados (Bermingham & Lessios, 1993; Knowlton et al., 1993;

Bermingham & Lessios, 1993; Bermingham et al., 1997; Donaldson & Wilson, 1999;

McCartney et al., 2000, Domingues et al., 2006; Craig, et al., 2009), bem como os

mesmos primers utilizados no presente estudo (CR-A e CR-E) para amplificar a

RHV1 do D-Loop das espécies C. multilineata e C. atrilobata, da costa oeste do

México (Oceano Atlântico) e costa leste do Panamá (Oceano Pacífico),

respectivamente (Domingues et al., 2005). Com base na divergência nucleotídica

das sequências RHV1 entre estas duas espécies e no tempo de separação entre

elas devido ao surgimento do Istmo do Panamá (3.1–3.5 Ma; Coates e Obando,

1996), estabeleceu-se uma taxa mutacional (µ) entre 8.24 x 10-8 e 9,30 x 10-8

(mutação/ano). Estas taxas foram utilizadas para estimar o tempo da possível

expansão demográfica nas populações de Cephalopholis fulva.

4. RESULTADOS

4.1. Características moleculares

A amostragem abrangeu pontos geográficos em praticamente toda a área de

distribuição de Cephalopholis fulva na costa brasileira, incluindo o Arquipélago de


14

Fernando de Noronha. Um total de 5% das sequências obtidas foram repetidas,

indicando completa concordância entre as amostras. As sequências da região HVR1

aqui analisadas não apresentaram indícios de saturação entre as transições e

transversões (Figura 6).

Figura 6. Análise de saturação entre as transições e transversões das sequências d-loop de Cephalopholis fulva.

Ao todo, 189 amostras da espécie foram sequenciadas, produzindo

fragmento de 431 pares de base (pb). Para um melhor alinhamento entre as

sequências foi estabelecida uma sequência consenso de 436pb devido à inserção

de gaps (ocasionado pelas inserções ou deleções nucleotídicas). Foram

encontrados 89 sítios parcimônia-informativos dentre 153 substituições nucleotídicas

(23 transversões e 130 transições). Entre as sequências analisadas, o conteúdo A/T

foi claramente maior (72,74%) do que o G/C (médias: G = 10,86%, C = 16,39%, T =

28,43% e A = 44,31%). Outros autores já haviam descrito que o D-Loop é uma

região do genoma mitocondrial rica em bases A/T (Brown et al., 1986; Saccone et

al., 1987; Chiang et al., 2006; Kong et al., 2010). Além disso, a quantidade de bases

nucleotídicas da região D-Loop de C. fulva seguiu a regra A > T > C > G, o que

parece ser uma característica comum para organismos distintos (Sbisà et al., 1997).

Encontramos 160 haplótipos únicos dentre as 189 amostras sequenciadas

com similaridade que variava de 95,4% a 100%. A diversidade haplotípica (h), para

as amostras, por sua vez, variou de 0,977 a 0,998 e a diversidade nucleotídica (π)

de 0,062 a 0,070 entre os sítios (Tabela 1).


15

Tabela 1. Índices de diversidade genética entre sequências da RHV1 de diferentes amostras geográficas de Cephalopholis fulva.

Pontos amostrais N H h* ± DP π* ± DP

CE 37 36 0,998 ± 0,006 0,066 ± 0,034

RN 36 32 0,992 ± 0,009 0,062 ± 0,033

FN 36 34 0,996 ± 0,007 0,063 ± 0,033

BA 50 46 0,995 ± 0,005 0,065 ± 0,034

ES 30 22 0,977 ± 0,014 0,070 ± 0,037

Todos 189 160 0,997 ± 0,001 0,064 ± 0,033 N = Número amostral; H = Número de haplótipos; h = Diversidade haplotípica; π = Diversidade nucleotídica; *sem correção Gamma; DP = Desvio Padrão.

Todas as populações apresentaram ao menos um haplótipo compartilhado

com outra população, exceto o Espírito Santo que não compartilhou nenhum com

Fernando de Noronha, Rio Grande do Norte e Ceará (Tabela 2).

Tabela 2. Haplótipos de sequencias de d-loop da espécie Cephalopholis fulva compartilhados dentro e/ou entre regiões geográficas.

HAPLÓTIPOS

NÚMEROS DE CADA HAPLÓTIPOS POR POPULAÇÃO

Ceará Rio Grande

do Norte Fernando de

Noronha Bahia Espírito Santo

Hap_7 (6) 3 2 1

Hap_10 (3)* 1 1 1

Hap_15 (2)* 2

Hap_16 (2)* 1 1

Hap_22 (2)* 2

Hap_49 (2)* 1 1

Hap_52 (2)* 2

Hap_57 (2)* 1 1

Hap_67 (2)* 2

Hap_96 (4)* 1 3

Hap_99 (2)* 2

Hap_100 (2)* 2

Hap_106 (2)* 1 1

Hap_109 (2)* 1 1

Hap_142 (2)* 2

Hap_144 (3)* 3

Hap_145 (2)* 2

Hap_147 (2)* 2

Hap_151 (2)* 2

Hap_157 (3)* 3

*total de haplótipos.


16

4.2. Estrutura genética populacional

O FST de Wright (1978) se mostrou negativo ou não significativo para a

maioria das populações. Entre as populações do nordeste brasileiro (Ceará, Rio

Grande do Norte e Bahia) incluindo as ilhas de Fernando de Noronha, o fluxo gênico

é irrestrito, porém, a população do Espírito Santo apresentou pequena diferenciação

genética em relação às demais, exceto com o Ceará (Tabela 3).

Tabela 3. Diferenciação genética entre as populações de Cephalopholis fulva a partir da estimativa de FST.

Rio Grande do Norte Ceará Fernando de Noronha Bahia

Rio Grande do Norte -

Ceará -0,0218 -

Fernando de Noronha -0,0044 0,0043 -

Bahia 0,0018 0,0035 0,0028 -

Espírito Santo 0,0246* 0,0057 0,0199* 0,0171*

*Significativo para 95% de confiabilidade (p < 0,05);

A análise de agrupamento onde apenas os valores de LnP(D) para os

diferentes Ks foram considerados, não foi clara em relação ao melhor número de

grupos genéticos para os dados. Porém, a estatística ∆K (Evanno et al., 2005)

indicou a existência de dois agrupamentos distintos (o mais alto ∆K foi obtido para K

= 2) (Figura 7). Os valores de α para o conjunto de dados variou de 0,04 a 0,22

(Figura 8).

Figura 7. Estrutura populacional de Cephalopholis fulva estimada com o modelo K = 2. Cada indivíduo é representado por uma linha vertical e dividido em duas cores (referentes aos dois Ks, ou dois agrupamentos, evidenciados nesta análise). A fração de cada cor é proporcional à estimativa daquele indivíduo pertencer ao agrupamento verde ou vermelho. Linhas verticais pretas separam os indivíduos por populações.


17

Figura 8. Histograma de distribuição do parâmetro Alpha (α) para K = 2, sob análise no programa Structure, no conjunto de dados de Cephalopholis fulva.

O dendograma de similaridade, utilizando o método de agrupamento de

vizinhos (NJ), apresentou a grande maioria dos ramos com baixos valores de

bootstrap, exibindo ausência de qualquer forma de estruturação populacional. Pode-

se constatar pelo dendograma gerado que não há qualquer indício de diferenciação

populacional e que 87% dos indivíduos analisados apresentam uma relação

politômica (Figura 9).


18

Figura 9. Dendograma de similaridade entre as sequencias de d-loop de Cephalopholis fulva gerado pelo método de NJ. Valores de bootstrap acima de 70 são mostrados nos ramos correspondentes. Cada ramo da árvore representa um indivíduo. As letras representam as populações e os números são referentes à sua identificação na amostragem.

Análises levando-se em consideração os colomorfos não evidenciaram

qualquer relação com possíveis diferenciações genéticas entre eles.

Diferentes agrupamentos populacionais foram testados por meio da Análise

da Variância Molecular (AMOVA) com base nos indícios de estruturação exibidos

pelos valores de FST (Tabela 3).

Ao confrontar a população do Espírito Santo contra as demais populações

individualmente, verificamos que o ela difere 1,72%, 2,00% e 2,46% da Bahia,

Arquipélago de Fernando de Noronha e Rio Grande do Norte. Porém, os valores de

FST apresentaram diferenciação de 0,5% entre o Espírito Santo e o Ceará, no

entanto, esta não foi significativa (p = 0,2). Para os agrupamentos “(ES) x (RN, FN,

BA)” e “(ES) x (RN, FN, BA, CE)” não foram encontradas diferenciações

significativas. Em todos os agrupamentos testados, as maiores variações ocorreram

entre os indivíduos dentro das populações (entre 97,54 e 98,28%) (Tabela 4).


19

Tabela 4. Análise da variância molecular das populações de Cephalopholis fulva em diferentes agrupamentos.

Grupos Fonte de Variação Variação Estatística F Valor p

(ES, RN) Entre populações 2,46% ɸ/FST=0,024 p=0,01*

Entre indivíduos dentro das populações

97,54% - -

(ES, FN) Entre populações 2,00% ɸ/FST=0,019 p=0,02*


98,00% - -

(ES, BA) Entre populações 1,72% ɸ/FST=0,017 p=0,02*


98,28% - -

(ES, CE) Entre populações 0,57% ɸ/FST=0,,005 p=0,20


99,43% - -

((ES) x (RN, FN, BA)) Entre grupos 2,12% ɸ/FCT=0,021 p=0,25

Entre as populações dentro dos grupos

0,01% ɸ/FSC=0,000 p=0,40


97,87% ɸ/FST=0,021 p=0,02*

((ES) x (CE, RN, FN, BA)) Entre grupos 1,97% ɸ/FCT=0,019 p=0,19

Entre as populações dentro dos grupos

0,00% ɸ/FSC=0,000 p=0,60


98,2% ɸ/FST=0,018 p=0,08

(ES, CE, RN, FN, BA) Entre populações 0,5% ɸ/FST=0,005 p=0,08


99,5% - -

ɸ/FST = Diferença genética entre populações, ɸ/FCT = ,= entre grupos definidos a priori e ɸ/FSC = entre populações dentro dos grupos. *significativo (p < 0,05).

A divergência entre as sequências foi estimada para cada população

individualmente. A menor divergência foi encontrada para as populações do CE e

ES, onde ambas variaram entre 0,00 e 3,7%, e a maior divergência foi encontrada

entre as sequências de FNoronha (0,00 a 4,6%) (Tabela 5).

Tabela 5 – Divergência genética intrapopulacional em Cephalopholis fulva com base em sequencias da região hipervariável 1 do d-loop (DNAmt). Populações Divergência entre sequências

RN 0,0 – 4,1%

CE 0,0 – 3,7%

FN 0,0 – 4,6%

BA 0,0 – 4,3%

ES 0,0 – 3,7%


20

4.3. Neutralidade e história demográfica

Os testes de neutralidade Fs e D apresentaram valores negativos e

significativos para todas as populações analisadas, exceto a população do Espírito

Santo que apresentou valor D negativo, porém não significativo (Tabela 6).

A análise dos histogramas de frequência das diferenças par-a-par

(distribuição mismatch) das populações revelou um padrão suave e unimodal para

todos os locais amostrados (Figura 10 a, b, c, e, f), exceto para a população de

Fernando de Noronha, que apresentou tendência a formar um padrão bimodal de

distribuição (Figura 10 d), típico de populações estáveis.

O índice de raggedness (Harpending, 1994) e o teste da Soma dos Desvios

Quadrados (SSD) exibiu valores p não significativos (p > 0,05) para todas as

populações analisadas, indicando expansão populacional exceto a população de

Fernando de Noronha, onde a hipótese nula de estabilidade populacional foi aceita

(Tabela 6).

Com base nos valores τ, as populações costeiras apresentaram valores

semelhantes, senão iguais deste índice (Tabela 6). A expansão da população do

Espírito Santo teria ocorrido entre 143 e 127 mil anos (média de 135 mil anos),

enquanto na costa nordeste do Brasil (Ceará, Rio Grande do Norte e Bahia), a

expansão teria ocorrido entre 132 e 117 mil anos (média de 124,5 mil anos).


21

Figura 10. Frequências das diferenças par-a-par entre as sequências. A, Rio Grande do Norte; B, Ceará; C, Bahia; D, Arquipélago de Fernando de Noronha; E, Espírito Santo e F, todas as populações.


22

Tabela 6. Índices de neutralidade e expansão populacional de Cephalopholis fulva da costa brasileira amostradas entre 2008 e 2010.

Locais

Tajima´s D FS Fu Distribuição Mismatch

D p Fs p Rag, (p) SSD (p) Ɵ0 Ɵ1 τ Tempo da expansão (Ma)

Ceará -1,70 0,02 -24,78 0,00 0,006 (0,73) 0,001 (0,60) 0,010 234,843 9,4 0,132 - 0,117

RGNorte -1,66 0,02 -22,60 0,00 0,008 (0,68) 0,003 (0,45) 0,000 69,921 9,4 0,132 - 0,117

FNoronha -1,66 0,02 -24,80 0,00 0,005 (0,84) 0,037 (0,00) - - - -

Bahia -1,71 0,01 -24,76 0,00 0,005 (0,84) 0,000 (0,83) 0,015 98,046 9,4 0,132 - 0,117

ESanto -1,04 0,14 -6,58 0,01 0,015 (0,11) 0,007 (0,10) 0,000 9999,00 10,2 0,143 - 0,127

Todos -1,93 0,00 -24,35 0,00 0,004 (0,73) 0,000 (0,62) 0,047 121,718 9,4 0,132 - 0,117

Tajima´s D = Estatística de Tajima (Tajima, 1989); FS Fu = Estatística de Fu (Fu, 1997); Rag, = Índice Raggedness; τ = (tau) Unidade de crescimento populacional; Ɵ0 e Ɵ1 = Frequências das diferenças par-a-par entre as sequências antes e após o crescimento da população; Ma = Milhões de anos, respectivamente, Ceará = Estado do Ceará, RGNorte = Estado do Rio Grande do Norte, FNoronha = Arquipélago de Fernando de Noronha, Bahia = Estado da Bahia, ESanto = Estado do Espírito Santos.


23

5. DISCUSSÃO

As amostras geográficas de piraúna apresentaram altos valores de

diversidade haplotípica (0,998 - 0,977) e nucleotídica (6% - 7%). De acordo com

Grant e Bowen (1998), alta diversidade haplotípica acompanhada de alta

diversidade nucleotídica pode ser atribuída à contato secundário entre linhagens

alopátricas previamente diferenciadas ou à grandes e estáveis populações com

longa história evolutiva. Contudo, diante dos dados obtidos neste estudo, a segunda

condição parece mais parcimoniosa.

Para todas amostras geográficas, os diferentes índices apontam expansão

populacional, exceto Fernando de Noronha. Dentre todas regiões analisadas, a

amostra do Espírito Santo apresentou a menor diversidade haplotípica (h = 0,977).

Apesar de não se descartar a existência da maior frota pesqueira e, consequente

maior pressão sobre a espécie naquela região, a diversidade haplotípica, quando

comparada com outras espécies ainda é elevada, mesmo entre espécies que não

são alvos de exploração, como Scarus psittacus (Winter et. al,. 2010) com h = 0,83,

Chromis chromis com h = 0,79 (Domingues et al., 2005) e Ophioblennius atlanticus

exibindo h = 0,80 (Muss et al., 2001).

Valores de diversidade semelhantes aos encontrados para piraúna são

reportados para representantes das mais diversas famílias, tais como Lutjanidae -

Lutjanus erythropterus (h = 0,94 – 0,99; π = 0,02 – 0,03; Zhang et al., 2006),

Pomacentridae - Chromis limbata (h = 0,94 – 1,00; π = 0,03 – 0,05; Domingues et

al., 2006), Scombridae - Thunnus obesus (h = 0,99 – 1,00; π = 0,03 – 0.04; Chiang

et al., 2006), Scaridae - Chlorurus sordidus (h = 0,97 – 1,00; π = 0,02 – 0,04; Bay et

al., 2004), entre outros. Geralmente estes valores são encontrados em espécies

amplamente distribuídas e que ainda não sofreram, pelo menos em grande

extensão, pressão da sobrepesca.

O FST de Wright (1978) revelou um fluxo gênico intenso entre as populações

do nordeste brasileiro e valores um pouco maiores na população do Espírito Santo,

sugerindo algum grau de isolamento. Porém, curiosamente, mesmo sem haplótipos

compartilhados, os dados entre Espírito Santo e Ceará indicaram um alto fluxo

gênico. Esta condição é peculiar tendo em vista as populações intermediárias,

seguindo a linha da costa no sentido sul/norte, da Bahia e Rio Grande do Norte entre

estas regiões. Cenários complexos de restrições populacionais poderiam gerar um

padrão deste tipo, contudo, diante de uma história geomorfológica mais ortodoxa em


24

relação a outras áreas do Atlântico, parece pouco provável, possivelmente estando

relacionado a efeitos amostrais.

No único trabalho anterior abordando a genética populacional de C. fulva,

através de isoenzimas, apesar de um número limitado de indivíduos analisados as

amostras do Atol das Rocas (n = 5) e do Ceará (n = 20), indicaram para aquelas

localidades a ocorrência de fluxo gênico irrestrito (FST = 0,048, p > 0,05) (Freitas et

al., 2003),

Diante das similaridades genéticas entre Atol das Rocas e Ceará e entre

Ceará e Fernando de Noronha (Tabela 3) é provável que os indivíduos de C. fulva

do Atol das Rocas e de Fernando de Noronha constituam um mesmo pool gênico

com acentuadas similaridades entre si. Além disso, dois fatores tendem a contribuir

para este cenário: as montanhas submersas da “Cadeira de Fernando de Noronha”

e as correntes oceânicas daquela região, principalmente as correntes Sul Equatorial

e Equatorial Atlântica.

A maior divergência genética encontrada envolveu as amostras do Espírito

Santo e Rio Grande do Norte (2,46%) (Tabela 3), porém, entre as sequencias de

Fernando de Noronha foram encontradas diferenças de até 4,6% apesar do reduzido

espaço geográfico (Tabela 5).

Apesar de não se descartar o envolvimento de contingências históricas e

paleogeológicas, a similaridade genética encontrada entre Espírito Santo e Ceará

parece estar relacionada a casualidade amostral, entre amostras que exibem altos

valores de diversidade e baixo limite de diferenciação genética. Assim, mesmo

quando se comparam os valores de FST para a população de C. fulva do Espírito

Santo, em relação às demais áreas, com os exibidos por outras populações de

outros Serranídeos, percebe-se que estes são realmente baixos. Isto é evidenciado

entre populações das espécies Epinephelus akaara (FST ≤ 0,379; p < 0,001), (Chen

et al., 2008) e E. itajara (FST ≤ 0,287; p < 0,010) (Silva-Oliveira et al., 2008) utilizando

sequências D-Loop, ou mesmo em E. labriformis (FST ≤ 0,661; p = 0,001), analisando

sequências do citocromo b (Craig et al., 2006) onde fica demonstrada uma alta a

muito alta diferenciação genética.

A análise desta estrutura populacional pelo método de agrupamento

bayesiano através da estatística ∆K indicou a existência de dois agrupamentos, o

que não foi possível distinguir graficamente (Figura 7). Isto corrobora a pequena

diferenciação genética evidenciada pelos valores de FST.


25

Condição semelhante foi observada em populações de Syngnathus floridae

do Atlântico e do Golfo do México que revelaram resultados semelhantes ao

presente trabalho. Nesta espécie baixos valores de FST ocorrem entre as

populações, os quais variaram entre 0,001 e 0,054, com um K = 2 (Mobley et al.,

2010). No entanto, diferentemente de C. fulva, as análises pelo Structure

evidenciavam claramente dois agrupamentos distintos, um formado pelas

populações do Atlântico e outro pelas do Golfo do México. Como poderiam os

valores baixos de FST resultar em clara diferenciação populacional pelo método

bayesiano em S. floridae e não em C. fulva? Esta incoerência exibida entre esses

dois conjuntos de dados, pode ser aparentemente explicado para C. fulva pelo

isolamento pela distância dos dados e se refere à ideia de que indivíduos podem

estar espacialmente distribuídos em uma região, mas com dispersão local (Pritchard

et al., 2007. Nesta situação as frequências alélicas variam gradualmente nas regiões

e quando isto ocorre, o valor de K inferido e suas frequências alélicas para cada

grupo podem ser bastante arbitrárias. Em casos como este sugere-se analisar

“pontos informais” para a escolha do K real (Pritchard et al., 2007). Um destes

pontos é o parâmetro α (alpha). Se as populações são realmente separadas, α se

manterá relativamente constante, muitas vezes com um intervalo de 0,2 ou menos.

Entretanto, se não há uma estrutura populacional real, α normalmente irá variar

muito (Pritchard et al. 2007). De fato esta foi a condição encontrada entre as

amostras geográficas de C. fulva, pois, α variou bastante, num intervalo entre 0,04 e

0,22. Estes dados corroboram os resultados do FST, onde o alto fluxo gênico entre os

pontos amostrados mantém a ausência de forte diferenciação genética ao longo da

costa e ilhas oceânicas, favorecendo um quadro de panmixia.

A falta de diferenças significativas dentro dos agrupamentos “(ES) x (RN,

FN, BA)” e “(ES) x (RN, FN, BA, CE)” apontada pela AMOVA, isto indica um cenário

de panmixia recente, embora pouco claro se em processo de homogeneização ou

de divergência genética. As condições físicas presentes entre as regiões

continentais analisadas para a piraúna apresentam algumas características que

favorecem a coesão genética entre os indivíduos e favorecem a existência de fluxo

gênico regular entre todas as regiões amostradas.

Cephalopholis fulva exibe alta produção larval, com liberação de 150.000 a

282.000 ovos por fêmea (Heemstra & Randall, 1993); grande capacidade de

dispersão e colonização, diante da distribuição a qual a espécie é encontrada

(Nelson, 2006; Heemstra & Randall, 1993); mesmo sem dados específicos, pertence


26

a uma família a qual o período larval pelágico pode ser de até 80 dias em algumas

espécies (Lara et al., 2009) e, associado a estes fatores, no litoral Atlântico brasileiro

está submetida a influência de correntes oceânicas que favorecem a dispersão larval

e a consequente homogeneização populacional.

Na região de abrangência dos pontos amostrados para C. fulva, a corrente

Sul-Equatorial flui no sentido Leste/Oeste e se bifurca entre as latitudes 12 e 14,

formando a Corrente Norte do Brasil e a Corrente do Brasil. A Corrente do Brasil flui

paralela à plataforma continental, no sentido nordeste/sudeste enquanto a Corrente

Norte do Brasil no sentido nordeste/norte (Castro & Miranda, 1998; Lumpkin &

Garzoli, 2005). Já na região da cadeia de montanhas de Fernando de Noronha, a

Corrente Equatorial Atlântica, originada entre a costa norte e nordeste do Brasil, flui

por baixo e em sentido oposto à Corrente Sul Equatorial (Mendes, 2006). Os dados

encontrados indicam que estas correntes desempenham um papel importante na

dispersão larval de diversas espécies de peixes ao longo da costa e ilhas emersas e

submersas da cadeia de Fernando de Noronha.

O índice de raggedness (Harpending, 1994) se mostrou baixo e não

significativo (p > 0,05) para todas as populações, sugerindo expansão populacional.

Os testes de neutralidade de Fu (Fs) (Fu, 1997) e Tajima (D) (Tajima, 1989) para as

amostras apresentaram valores negativos e significativos para todas as populações

de C. fulva, exceto para o Espírito Santo cujo valor D negativo não era significativo,

indicando que na região do CE, RN, BA e FN as populações de C. fulva teriam

sofrido expansão populacional.

A inferência de expansão através de análise das diferenças par-a-par

(mismatch distribution) também indicam ter havido expansão populacional em todos

os pontos amostrado, que apresentaram histogramas suaves e unimodais, exceto

em Fernando de Noronha, que mostrou tendência a formar um padrão bimodal,

característico de populações estáveis (Slatkin & Hudson, 1991; Rogers &

Harpending, 1992; Ray et al., 2003; Excoffier, 2004), o mesmo revelado através da

analise da Soma dos Desvios Quadrados (SSD), a partir da qual foi testada a

hipótese de expansão populacional súbita. Esta análise indicou valores de SSD

baixos e não significativos diretamente relacionados a populações que passaram por

expansão súbita recente (Schneider e Excoffier, 1999), exceto também para a

população de Fernando de Noronha, onde o SSD se mostrava significativo.

É possível que esta estabilidade populacional em Fernando de Noronha

esteja relacionada a limitações físicas do ambiente e, sobretudo, menor amplitude


27

de mudanças, mesmo diante das oscilações no nível do oceano ao longo das

glaciações pleistocênicas.

Analisando os períodos de expansão na costa brasileira como um todo,

observa-se que os valores médios de expansão para as populações do Nordeste do

Brasil são mais recentes (124,5 mil anos) do que aquela para o ES, onde este

evento poderia ser mais antigo (135 mil anos). Contudo, os valores máximos e

mínimos apresentam larga faixa de sobreposição sugerindo que apesar das

especificidades em geral as populações podem ter sido submetidas a processos,

geologicamente, quase simultâneos de expansão. Em concordância, os valores de

θ0 (frequência das diferenças par-a-par antes da expansão populacional) se

mostraram semelhantes e muito baixos para todas as populações costeiras,

sugerindo que Cephalopholis fulva tenha sido submetida à “gargalos populacionais”

(efeito bottleneck) antes da expansão.

As glaciações do Pleistoceno têm sido apontadas como eventos relevantes

para o estabelecimento dos padrões filogeográficos e populacionais exibidos

atualmente pelos peixes marinhos (Domingues et al., 2005, 2006, 2007; Santos et

al., 2006; Craig et al., 2006; Zhang et al., 2006; He et al., 2010; Mobley et al., 2010;

Viñas et al., 2010). Da mesma forma, a atual modelagem populacional da espécie

Cephalopholis fulva no litoral brasileiro demonstra ter sido afetada por estes eventos

Pleistocênicos. Provavelmente, as populações brasileiras de C. fulva devem ter

sofrido sua última expansão demográfica após a penúltima Máxima Glacial.

Períodos de Máxima Glacial são marcados por grande acúmulo de água, na forma

de gelo, nos pólos e consequente redução do nível dos oceanos (regressão

marinha).

A datação por termoluminescência de isótopos de oxigênio em dois terraços

marinhos na costa do Rio Grande do Norte constatou que o nível do Atlântico

chegou a 8 ± 2 m acima do nível atual por volta de 123,5 ± 5,7 mil anos atrás (Figura

11), praticamente o mesmo período identificado como o valor médio da expansão

populacional de C. fulva nas áreas do Nordeste do Brasil. Níveis semelhantes de

elevação do oceano foram determinados para os terraços marinhos localizados na

costa da Bahia (Bernat et al., 1983). Esta datação corresponde exatamente ao

período da penúltima transgressão marinha do Pleistoceno (Barreto et al., 2002).

Transgressões marinhas são precedidas por regressões e nesta penúltima

regressão (durante a Máxima Glacial) do Pleistoceno, em algumas áreas litorâneas,


28

os níveis dos oceanos chegaram a atingir até 100 metros abaixo do atual (Hearty,

1998).

A penúltima máxima regressão marinha do Pleistoceno ocorreu por volta de

140 mil anos atrás e deixou toda a plataforma continental brasileira exposta (Figuras

11, 12C e 13C). A redução de largas áreas de habitat natural foi provavelmente

causa do efeito gargalo evidenciado pelos baixos valores de θ0 (Tabela 6) obtidos

para Cephalopholis fulva. Esta espécie habita áreas em profundidades de 2 a 35

metros (Gasparini & Floeter, 2001), embora já tenha sido registrada em até 150

metros de profundidade (Smith, 1997; Figura 12B). A perda de áreas da plataforma

continental pode ter obrigado a espécie a ocupar a estreita margem do talude

continental e/ou montes submarinos que então tenham ficado em profundidades

acessíveis (Figuras 12C e 13C), como aqueles da Cadeia de Fernando de Noronha.

Figura 11. Variações no nível do oceano Atlântico e o período de expansão populacional (entre 117.000 e 132.000 anos – em amarelo) de Cephalopholis fulva na costa brasileira (modificado de Barreto et al. (2002).


29

Figura 12. Margem continental do tipo Atlântico. A = Indicação das partes da margem

continental. Ilha representando Fernando de Noronha, apoiado sob o assoalho abissal;

B = Nível do oceano atual; C = Nível do oceano há 140.000 anos atrás. Em vermelho

está destacada a área provavelmente ocupada pela piraúna nos dois períodos.

Em sentido oposto, com o progresso da penúltima transgressão, o qual

atingiu seu ápice por volta dos 123,5 ± 5,7 mil anos atrás, a plataforma continental e

várias montanhas marinhas voltaram a ser submersas (Figura 12B; 13B),

disponibilizando novos habitats a serem ocupados e consequentemente provocando

a expansão populacional evidenciada. Estes penúltimos eventos glaciais, tanto a

regressão quanto a transgressão marinha, parecem ter ficados registrados nas

sequências nucleotídicas da região D-loop do DNAmt da espécie Cephalopholis

fulva.

Porém, diante das oscilações oceânicas durante o Pleistoceno, como se

explica a estabilidade populacional evidenciada no Arquipélago de Fernando de

Noronha? Basicamente, três fatores, um geológico, um geográfico e um físico

parecem ter contribuído para a ausência de crescimento populacional, verificado em

populações continentais de C. fulva no Arquipélago de Fernando de Noronha. A

forma geológica e a posição geográfica na qual se encontra o arquipélago parece

ser a responsável por sua estabilidade populacional ao longo das glaciações. É

constituído por ilhas oceânicas não apoiadas sobre a plataforma continental, a partir

de um monte cônico com cerca de 60 km de diâmetro na base, apoiado no assoalho


30

oceânico a 4.000 metros de profundidade. Do ponto de vista geológico este

arquipélago, juntamente com o Atol das Rocas e pelo menos mais seis montes

oceânicos, participa de um alinhamento de montes vulcânicos submarinos

chamados de Cadeia de Fernando de Noronha. Desta cadeia, atualmente apenas o

Atol das Rocas e o próprio Arquipélago de Fernando de Noronha encontram-se

emersos (Almeida, 2002) (Figura 13B). Apesar da distância atual do continente

(aproximadamente 360 km), geograficamente em períodos de máxima regressão a

cadeia de elevações oceânicas a qual faz parte devem ter garantido algum aumento

no grau de conectividade com o talude continental.

Figura 13. A costa nordeste do Brasil e Cadeia de Fernando de Noronha ao longo das oscilações oceânicas nos últimos 350 mil anos. A = Baseado em Barreto et al., 2002; B e C = Batimetria em três dimensões. Modificado de Vital et al. (2010).

O período de transgressão marinha relacionado à expansão populacional

percebida nas populações continentais de C. fulva tenderia a provocar, e conforme

foi comprovado pelos dados, um efeito contrário em regiões insulares como o

Arquipélago de Fernando de Noronha, com perda de espaço físico e diminuição do

nicho ecológico, pela perda de habitats, devido ao aumento da profundidade.

Os dados apresentados pelas amostras geográficas da espécie C. fulva

demonstram elevada diversidade genética, indicando ainda a ausência de efeitos

deletérios da sobrepesca da espécie, bem como evidências de panmixia plena tanto

entre as áreas continentais, como entre estas e o regiões insulares.


31

Os padrões demográficos históricos desta espécie no Atlântico, envolvendo regiões

oceânicas, sugerem efeitos históricos de não expansão ou tendência à retração

populacional durante eventos de transgressão marinha. Ambientes insulares estão

entre as principais áreas mapeadas como hotspots de biodiversidade. Diante de

fatores climáticos atuais, como o aquecimento global, os dados evidenciados em C.

fulva, demonstram um claro modelo do impacto da elevação do nível do mar sobre

uma grande parcela da biodiversidade, em grande parte endêmica.


32

6. CONCLUSÕES

• Os índices de diversidade genética de Cephalopholis fulva são típicos de

populações naturais amplamente distribuídas ao longo dos oceanos e que não

sofrem qualquer tipo pressão antrópica, como a realizada pela pesca

comercial;

• As análises do DNA mitocondrial revelaram que ao longo da costa brasileira e

no Arquipélago de Fernando de Noronha a espécie C. fulva representa uma

população panmítica com intenso fluxo gênico entre os pontos amostrados no

litoral do Brasil;

• Além de outros fatores, como correntes marinhas e dispersão larval, a condição

geológica do Arquipélago de Fernando de Noronha situado sobre uma cadeia

de montanhas oceânicas que se estende sequencialmente até a plataforma

continental, deve ter contribuído durante eventos regressivos, para a atual

conectividade genética populacional com as áreas continentais;

• Os colomorfos de Cephalopholis fulva (piraúna) não evidenciaram qualquer

diferenciação genética entre si, indicando tratar-se de um polimorfismo

cromático;

• Os índices de neutralidade e demografia indicam que as populações da costa

brasileira parecem ter sofrido expansão populacional entre 117 e 132 mil anos

atrás, período este correspondente ao final da penúltima glaciação

pleistocênica;

• Os dados da demografia histórica da espécie C. fulva traz indicações sobre a

ação potencialmente restritiva das transgressões marinhas em regiões

insulares e fornece parâmetro sobre os efeitos do aquecimento global sobre a

maior parcela de vertebrados, os peixes, habitantes endêmicos de ilhas e atóis.


33

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DA … · Defesa apresentada ao Programa de...

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