Analise de hibridização

Análise de Hibridização

Caio Fagundes

João Moreira

Breve histórico

• A idéia de imobilizar e hibridizar moléculas em um suporte sólido foi primeiro proposta por Denhardt (1966), conduzindo ao desenvolvimento de metodologias de identificação de seqüências no DNA genômico e de clonagem.

• O passo seguinte foi dado por Southern (1975), quando demonstrou como poderia ser feita a transferência de DNA do gel para membranas;

• Segundo Dyson (1991), desde as descobertas de

Denhardt e Southern as técnicas de hibridização

em membranas tornaram-se gradativamente

sofisticadas, principalmente devido a melhor

compreensão acerca dos fatores que influenciam a

taxa de hibridização e estabilidade dos híbridos.

Hibridização de ácidos nucléicos

• É o pareamento complementar de bases entre os

ácidos nucléicos de fita simples, gerando um

produto dupla fita.

• Pode ser:

– DNA/DNA

– RNA/RNA

– DNA/RNA

Como se mantem unidas as fitas?

• Pontes de hidrogênio entre as bases;

• Interações hidrofóbicas entre as bases adjacentes de uma mesma fita.

Hibridização de ácidos nucléicos

Fatores que afetam a estabilidade dos híbridos

• Número de pares GC v/s pares AT;• Grau de complementariedade;• Tamanho das fitas (número de pares de bases) ;• Concentração de sal na solução;• Temperatura;• Concentração de formamida (para híbridos de RNA).


• Número de pares GC v/s pares AT:

– Maior número de ligações de H entre as fitas maior estabilidade dos híbridos.

• 3 ligações de H entre G e C

• 2 ligações de H entre A e T


• Grau de complementariedade:

– Menor complementariedade de bases:

menos ligações de H formadas;

menor estabilidade.


• Tamanho das fitas:

– Maior tamanho (cDNAs >200pb):

mais ligações de H;

maior estabilidade do híbrido.

– Menor tamanho (oligos <50pb):

Maior especificidade;

Menor probalidade de hibridização cruzada.


• Concentração de sal na solução:

[sal] estabilidade do híbrido

– Cátions monovalentes (Na+) ou divalentes (Mg++)

– As cargas negativas dos grupos fosfato repelem umas às outras.

– Os íons positivos da solução reduzem a repulsão eletrostática entre as fitas.


• Temperatura:

– Maior T aumenta a energia cinética das fitas e desestabiliza a estructura dos ácidos nucléicos.

as fitas se separan.

• pH:

[OH- ] ionização dos grupos fosfato, favorecendo

a repulsão eletrostática entre as fitas.

• Concentração de formamida:

– Provavelmente forma ligações de H com os ácidos nucléicos;

– Desestabiliza a formação de híbridos.


O efeito combinado destes fatores pode ser expresso em uma equação para o

cálculo da Tm• O que é Tm?

Tm = temperatura de melting ou temperatura de separação das fitas.

A Tm é uma medida de estabilidade dos híbridos, definida como a temperatura na qual 50% dos híbridos se encontram formados e 50% permanecen dissociados.

50%5’ - - - - - - - - - - -3’3’ - - - - - - - - - - 5’ 50%

5’ - - - - - - - - - - 3’

3’ - - - -

- - - - -

- -5’

Tm = 81,5 ºC + 16,6log[Na] + 41(%G+C) - 0,63(%formamida) - (500/L)

Tm = 79,8 ºC + 18,5log[Na] + 58,4(%G+C) + 11,8(%G+C)2 - 0,5(%formamida) - (820/L)

Para DNA:DNA

Para DNA:RNA

Para oligonucleotidos em 1 M Na+

Tm (oC) = 4 (G+C) + 2 (A+T)

Dot/Slot Blot

• Desenvolvido primeiramente por Kafatos et al em 1979.

• Usado na determinação da abundância relativa de uma seqüência alvo em uma série de amostras de DNA

• Aplicada em análise genômica de espécies relacionadas

• Zoo Blot: blots contendo DNA de uma variedade de espécies relacionadas.

Dot/Slot Blot • Técnica de imobilização

de DNA não fracionado em uma membrana de nitrocelulose ou de nylon. Posteriormente a análise de hibridização pode ser feita.

• Dot ou Slot: Diferenças na geometria do blot

Dot/Slot Blot

• Dot/Slot blotting de DNA em membranas não carregadas de nitrocelulose e nylon:– Aprelho de sucção e um manifold– Materiais:

• SSC 6x e 20x• DNA a ser analizado• Solução de desnaturação: 1.5M NaCl/0.5M NaOH• Solução de neutralização: 1M NaCl/0.5M tris.Cl pH 7,0• Membrana• Folhas de papel de filtro• Manifold• Plástico transparente a luz UV• Fonte UV

Dot/Slot Blot

• Embeber a membrana e o filtro de papel em SSC 6x por 10 min.

• Posicionar a membrana sobre o filtro no manifold. Observar se há bolhas de ar.

• Diluir DNA com água e SSC 20x p/ um volume de 400ul. Desnaturar o DNA em banho de água a 100 ºC por 10 min.

• Ligar o aparelho de sucção ao manifold, adicionar 500ul de SSC 20x e permitir filtragem (5 min).

• Centrifugar amostras de DNA e aplicar aos poços.• Filtrar.

Dot/Slot Blot

• Após filtragem, colocar membrana sobre um papel de filtro embebido em solução de desnaturação por 10 minutos.

• Levar membrana a um papel embebido em solução de neutralização por 5 minutos.

• Embrulhar a membrana no plástico transperente a UV e posicioná-la com o DNA voltado para baixo na fonte de UV pelo tempo indicado.

• Secar a membrana.


• DNA de fita simples e RNA de sequencias definidas podem parear com um segundo DNA ou RNA com uma seqüência complementar, com a estabilidade do híbrido dependendo do grau de pareamento de bases.

• Experimentalmente usa-se uma sonda marcada e um DNA alvo imobilizado em uma membrana. É um método bastante sensível.


• Imobilização;• Adição das sondas na solução de hibridização;• Lavagem: grau de complementaridade;• Sondas: 100 a 1000 bp marcados radioativamente;• Diversos protocolos: Southern e Dot

Análise de hibridização de DNA com sonda de DNA marcada

• Bloqueio de sítios não específicos• Incubação com a sonda.• Lavagem.• Materiais:

– Sonda– Solução de pre-hibridização/hibridização– 2x SSC/0,1% SDS, 0,2x SSC/0,1% SDS, 0,1x

SSC/0,1% SDS, 2x e 6x SSC– Incubadora– Tubo de hibridização– Reagentes para marcação de DNA e autoradiografia

Análise de hibridização de DNA com sonda de DNA marcada

• Marcação da sonda de DNA (nick translation ou random priming) a atividade especifica de 1x108

dpm/ug;• Molhar a membrana com o DNA em 6x SSC;• Incubar membrana no tubo de hibridização com

APH (1ml para 10cm2) por 3 hr a 68 ºC;• Desnaturar sonda a 100 ºC por 10 min;• Repor a APH contendo a sonda no tubo e incubar

overnight a 68 ºC;• Lavar a membrana (SSC/SDS - ciclos de 10 min);• Fazer autoradiografia.

Análise de hibridização de DNA com sonda de RNA marcada

• Construção de sondas de RNA (RNA pol:SP6, T3 ou T7) para o DNA template;

Para marcação radioativa adicionar NTPs radioativos.

• Molhar a membrana com o DNA em 6x SSC;• Incubar membrana no tubo de hibridização com

FPH (1ml para 10cm2) por 3 hr a 42 ºC;• Trocar o FPH, adicionar a sonda no tubo e incubar

overnight a 42 ºC, sob agitação;• Lavar a membrana (SSC/SDS - ciclos de 10 min).

• Repor a solução de lavagem e adicionar igual volume de 2x SSC (25g/ml RNase A + 10U/ml RNase T1) e incubar 30 min;

• Realizar a autoradiografia.• Para remover as sondas da membrana hibridizada

basta realizar um tratamento com 0,4 M de NaOH à 45 ºC, ou com 0,1% de SDS. Assim a membrana poderá ser novamente hibridizada.

Random priming: Nick translation:

DESNATURACIONALINEAMIENTO DE PARTIDORES

DNA POLIMERASA +dNTPs + dNTP-P

ds DNA

DNase I quebra o DNA

DNA pol Iagrega NTPs

Analise de hibridização

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