Total de Trabalhos: 00020 VII Reunião Regional da FeSBE – Regional 2012

Resumo: 01.011

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ANÁLISE MORFOLÓGICA DO EFEITO MIOTÓXICO INDUZIDO POR UMA METALOPROTEASE ISOLADA DA PEÇONHA DA SERPENTE Bothrops moojeni

Autores

1,3MAMEDE, C. C. N.

4, FACHINELLI, T. C.

1,3, QUEIROZ, M. R.

2, SILVA, T. K. A.

2, MATIAS,

M. S. 1, OLIVEIRA, F. D.

1 Instituto de Genética e Bioquímica - UFU,

2 Instituto de Ciências

Biomédicas - UFU, 3 Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Nano-Biofarmacêutica - MCT,

4

Instituto de Ciências Biológicas - UFU

Apoio Financeiro: FAPEMIG / CNPq / MCT

Resumo Objetivos Avaliar o efeito miotóxico induzido por uma metaloprotease isolada da peçonha da serpente B. moojeni, denominada Moozincina. Metodos A evolução da lesão tecidual foi avaliada injetando 50 µg da metaloprotease no músculo gastrocnêmio de camundongos machos Swiss (n= 3; 25-45 g; aproximadamente 2 meses de idade). Solução salina estéril foi injetada no grupo controle. Após 3, 6, 12, 24 e 48 horas da injeção da Moozincina, os múculos foram removidos e fixados em formaldeído a 10%. O material foi desidratado e incluído em parafina. Cortes histológicos de 5 micrômetros de espessura foram obtidos e corados com hematoxilina e eosina (HE) para análise por microscopia ótica. Os testes foram realizados em conformidade com as diretrizes atuais para experimentação animal, estabelecidas pelo Comitê de Ética na Utilização de Animais (CEUA/UFU), Minas Gerais, Brasil (Protocolo n° 028/09). Resultados A análise morfológica da evolução da lesão muscular mostrou a ocorrência de eventos degenerativos e infiltração leucocitária já na terceira hora após a aplicação da Moozincina. Esses efeitos predominaram até 48 horas e somente após esse tempo foi observado o surgimento de focos hemorrágicos no tecido. Como o efeito hemorrágico só é observado tardiamente no tecido muscular, provavelmente deve ser desencadeado pela ação característica de metaloproteases sobre componentes vasculares e/ou por ação indireta decorrente da lesão muscular. Conclusão A Moozincina, uma metaloprotease isolada da peçonha da serpente B. moojeni, apresenta ação miotóxica caracterizada pela degeneração de fibras musculares esqueléticas e infiltração leucocitária e uma ação hemorrágica tardia.

Palavras-chaves: Bothrops, Metaloprotease, Histologia

Resumo: 01.012

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Influência do polimorfismo da Apolipoproteína E sobre a infecção por S. mansoni em humanos

Autores

1FONSECA, C. S. M.

1, SANTOS, B. S.

1, PIMENTA FILHO, A. A.

1, SILVA JUNIOR, J. G.

1,

NASCIMENTO, W. M. 2, DOMINGUES, A. L. C.

1, LIMA, V. L. M.

1 Departamento de Bioquímica -

UFPE, 2 Hospital das Clínicas - UFPE

Apoio Financeiro: FACEPE, CNPq e CAPES.

Resumo Objetivos A esquistossomose afeta cerca de 300 milhões de pessoas em todo o mundo. Fatores ambientais, comportamentais, dos parasitas e dos vetores estão envolvidos na susceptibilidade à infecção. Entretanto, diferenças genéticas entre a população também podem influenciar no risco de infecção. A identificação de fatores genéticos associados à infecção pode contribuir para o entendimento da doença e ajudar na definição de novas estratégias para diagnóstico, terapia e vacinas. Um possível fator genético do hospedeiro que poderia afetar a susceptibilidade à infecção é a Apolipoproteína E (APOE). Há evidências de que os alelos da APOE (ε2, ε3, ε4)podem ter um papel importante na infecção e desenvolvimento de diversas infecções. No presente estudo, foram avaliados os genótipos da APOE com o intuito de verificar se há existência de associação com a infecção por S. mansoni. Também, foi investigada a associação entre os genótipos da APOE e a severidade da doença. Metodos Após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido, 115 indivíduos infectados e 108 indivíduos sem esquistossomose de ambos os sexos formaram os grupos de estudo. Amostras de sangue total conservado em EDTA foram coletadas após jejum de 12h. O diagnóstico de esquistossomose foi feito através de análise de amostras fecais utilizando a técnica de Kato-Katz. As fases clínicas da esquistossomose foram acessadas através de exame físico e de ultra-som. DNA genômico proveniente de leucócitos foi utilizado para genotipagem de APOE por meio de PCR seguido de digestão com a enzima endonuclease Hha I e eletroforese em gel de Agarose (RFLP). Diferenças nas freqüências dos alelos e genótipos de APOE entre indivíduos infectados e controle foram testadas através de χ 2 . Análise de regressão logística foi utilizada para estimar o valor de Razão de Chance, com intervalo de confiança de 95%, de maneira a investigar o fator de risco genético para infecção por S. mansoni. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software Statview SAS Inc. (1998, NC, USA). A aprovação ética para todos os procedimentos foi obtida do Comitê de Ética em Pesquisa do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco – CEP/CCS/UFPE, através do ofício Nº098/09, protocolo 359/09 CEP/CCS, SISNEP FR. 226543. Resultados A frequência dos alelos de APOE entre os indivíduos participantes foi de 8,39% para ε2, 72,48% para ε3 e 19,13% para ε4. Foi observada uma frequência significativamente maior de indivíduos infectados entre aqueles que apresentaram o alelo ε4. Similarmente, análise feita através de regressão logística revelou um risco de infecção 2,3 vezes maior em portadores do alelo ε4. Também foi analisada a influência do polimorfismo da APOE sobre a gravidade da infecção, no entanto não foram observadas diferenças significativas. Conclusão Nossos resultados sugerem que o polimorfismo da APOE pode influenciar na susceptibilidade à infecção por S. mansoni, contudo aparentemente, não influencia o grau de severidade da infecção.

Palavras-chaves: Apolipoproteina E, Esquistossomose, Fator de Risco Genético

Resumo: 01.013

Atividade biológica de células-tronco de tecido adiposo submetidas a um protocolo de criopreservação

Autores 1SOARES, D. M.

1, GINANI, F.

1, SILVA, G. L. A.

1, BARRETO, M. P. V.

1, BARBOZA, C. A. G.

1

Departamento de Morfologia - UFRN

Apoio Financeiro: CAPES

Resumo Objetivos Avaliar a influência de um protocolo de criopreservação na atividade biológica de células-tronco derivadas do tecido adiposo. Metodos O presente estudo foi submetido ao comitê de ética no uso de animais da UFRN (protocolo: 008/2011). O tecido adiposo para obtenção das células-tronco foi extraído da região inguinal de um camundongo albino Swiss macho, com 2 meses de idade e 28,5g, e mantido em tampão fosfato (PBS) até o processamento em câmara de fluxo laminar. Os espécimes teciduais foram submetidos a três lavagens com meio alfa-MEM enriquecido com antibióticos e em seguida foi realizada a digestão enzimática com solução contendo 3 mg/mL de colagenase I por 1h a 37°C. Após o processamento, as células foram cultivadas em placas de Petri contendo meio alfa-MEM suplementado com 10% de soro fetal bovino. As culturas foram mantidas a 37ºC em 5% de CO2, até atingirem 70 a 90% de confluência, com troca de meio a cada três dias. Na primeira passagem (P1), as células foram divididas em dois grupos: Grupo F (células frescas), onde o cultivo celular seguiu normalmente até a terceira passagem (P3); e Grupo C (células criopreservadas), onde uma alíquota de 1 x 10 6 células foi submetida ao seguinte processo de criopreservação: imersão em criofrasco com soro fetal bovino (FBS) com 10% de dimetilsulfóxido (DMSO), congelamento gradual (2 horas a 4º C, 18 horas a -20º C, e então mantidas a -80º C) e conservação a -80ºC por um período de 30 dias. As células do Grupo C foram descongeladas através do contato imediato em água a 37°C em banho-maria e cultivadas. No terceiro subcultivo (P3), as células dos dois grupos foram cultivadas em placas de 24 poços e submetidas a contagem em Câmara de Neubauer para avaliação da proliferação celular e obtenção da curva de crescimento nos intervalos de 24, 48 e 72 horas. Com a finalidade de verificar a presença de alterações nucleares, foi utilizada a marcação pelo DAPI (4’-6-Diamidino-2-phenylindole) nos dois grupos, em todos os intervalos de tempos estudados. Os resultados das contagens celulares foram submetidos à análise estatística através dos testes de Kruskal-Wallis e Friedman, com nível de significância de 5%. Resultados A contagem das células através do método de azul de tripan revelou as seguintes médias (expressas em nº de células x 10 4 ± desvio padrão da média): Grupo F: 2,5±0,6 (T24); 4,8±0,9 (T48); 6,5±0,7 (T72); Grupo C: 2,0±0,4 (T24); 3,3±1,0 (T48); e 4,0±0,9 (T24). Os dados mostram que ambos os grupos apresentaram curvas crescentes de proliferação celular, sendo esta menor no grupo submetido à criopreservação, com diferença estatisticamente significante apenas no intervalo de 72h ( p < /i> Conclusão O processo de criopreservação utilizado não causa alterações nucleares nas células-tronco do tecido adiposo, porém parece influenciar negativamente a proliferação celular em períodos de tempos maiores (72h).

Palavras-chaves: Células-tronco, Criopreservação, Cultivo celular, Tecido adiposo

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Resumo: 01.014

Influência do protocolo de digestão enzimática do tecido adiposo na obtenção de células-tronco

Autores 1GINANI, F.

1, SOARES, D. M.

1, XAVIER, L.

1, SILVA, G. L. A.

1, BARBOZA, C. A. G.

1

Departamento de Morfologia - UFRN

Apoio Financeiro: CAPES

Resumo Objetivos O presente estudo tem como objetivo estabelecer um protocolo de extração de células-tronco derivadas do tecido adiposo, a partir da avaliação do rendimento celular de dois métodos de digestão enzimática. Metodos Trata-se de um estudo de caráter experimental in vitro, que foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da UFRN (protocolo: 008/2011). Fragmentos de tecido adiposo foram extraídos da região inguinal de um camundongo albino Swiss macho (com dois meses de idade e pesando 28,5g) e transportados para câmara de fluxo laminar em tubo tipo Falcon de 15 ml contendo 5 ml de tampão fosfato. O fragmento tecidual foi submetido a três lavagens, com 10 minutos cada, em meio alfa-MEM enriquecido com antibióticos. Após lavagem os fragmentos de tecido adiposo foram processados por dois protocolos distintos: Grupo I - digestão enzimática com solução contendo 3 mg/mL de colagenase I por 1 hora a 37°C; Grupo II - digestão enzimática com solução contendo 3 mg/mL de colagenase I e 1mL de tripsina/EDTA por 1 hora a 37°C. Após a digestão enzimática, as amostras foram centrifugadas e submetidas ao cultivo em placas de Petri de 60mm de diâmetro contendo meio alfa-MEM suplementado com 10% de soro fetal bovino. As culturas foram mantidas a 37º C em 5% de CO2, com troca de meio a cada três dias, até atingirem 70 a 90% de confluência. Uma alíquota de cada grupo foi cultivada com meio osteogênico e meio adipogênico, para identificação do potencial multipotente de diferenciação celular. Na terceira passagem (P3), as células foram cultivadas em placas de 24 poços e submetidas à contagem em Câmara de Neubauer para avaliação da proliferação celular e obtenção da curva de crescimento nos seguintes intervalos de tempo: 24, 48 e 72h, sendo 4 poços para cada intervalo estudado. Os dados da contagem celular foram analisados a partir dos testes de Kruskal-Wallis e Friedman com nível de significância de 5%. Resultados Os dois grupos exibiram um padrão de crescimento contínuo ao longo do experimento, com as seguintes médias de contagem celular (expressas em nº de células x 10 4 ± desvio padrão da média): Grupo I: 2,5±0,6 (T24); 4,8±0,9 (T48); 6,5±0,7 (T72); Grupo II: 3,1±1,3 (T24), 3,8±2,1 (T48) e 3,9±0,3 (T72). Estes dados revelaram uma proliferação celular mais evidente no Grupo I, com diferença estatística significante em 72h ( p < /i><0,05). Conclusão As células-tronco obtidas do tecido adiposo apresentam um melhor rendimento quando submetidas à digestão enzimática com colagenase sem associação com tripsina.

Palavras-chaves: Células-tronco, Cultivo celular, Tecido adiposo

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Resumo: 01.015

EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS KI-67 E P16INK4A EM CARCINOMAS ESPINOCELULARES PERI-ORAIS QUIMICAMENTE INDUZIDOS EM MODELO MURINO

Autores

1FILHO, R. N. P.**

1, NASCIMENTO, M. F. D.**

1, ALVES, Â. V. F.*

1, CAVALCANTE, D. R.

R.** 1, MELO, M. F. B.

1, GOMES, M. Z.

1, ALBUQUERQUE-JUNIOR, R. L. C.

1 Istituto de

Tecnologia e Pesquisa - Unit

Apoio Financeiro: FAPITEC/SE

Resumo Objetivos Estudos vêm sendo conduzidos em modelo experimental, visando compreender os mecanismos envolvidos na carcinogênese oral, particularmente a participação de proteínas do ciclo celular. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão imuno-histoquímica das proteínas Ki-67 e p16INK5A em Carcinomas Espinocelulares (CECs) peri-orais induzidos quimicamente com 9,10-dimetil-1,2-benzantraceno (DMBA) em modelo murino. Metodos Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de ética no Uso de Animais da Universidade Tiradentes (Parecer nº 191208). Os CECs foram induzidos na comissura labial de 10 ratos machos (Rattus novergicus albinus, linhagem Wistar, 60 dias de idade, 300 ±50 g) por meio de aplicação tópica de DMBA (diluído a 0,5% em acetona), em dias alternados durante 20 semanas. O procedimento foi repetido nas comissuras direitas, utilizando apenas a acetona (Controle). Os animais foram mantidos em gaiolas plásticas com camas de maravalha, sob condições controladas (22ºC, ciclo claro-escuro de 12h), e recebendo água e ração ad libitum. Durante o período experimental, foi registrado o momento de emergência clínica das lesões e determinado seu volume tumoral médio (V = 4/3 x π x d onde V= volume; π = 3,14; d = diâmetro médio). Na 26ª semana (seis semanas depois de encerrado o período de indução dos tumores), os animais foram sacrificados em câmara de CO2 e o sítio anatômico de indução tumoral foi removido para análise histológica. Secções histológicas dos espécimes previamente parafinados foram submetidas à coloração pelo HE e a técnicas imuno-histoquímicas para identificação das proteínas Ki-67 e p16INK4A. A gradação histológica dos CECs foi realizada de acordo com a diferenciação morfológica tumoral. O percentual de células ciclantes (Ki-67 positivas) foi obtido pela contagem de células marcadas em 1000 células tumorais, multiplicado por 100. A expressão da proteína p16INK4A foi graduada pela porcentagem de células marcadas (1, menos que 30%; 2, entre 30 e 60%; 3, mais de 60%). A correlação entre as variáveis estudadas foi determinada pelo teste de correlação de Spearman, considerando tanto mais forte a relação quanto mais próximo de 1,0 fosse o valor de R. Resultados Após 26 semanas observou-se desenvolvimento tumoral em todos os animais experimentais, mas não houve formação tumoral no lado controle. O tempo médio de surgimento das lesões foi de 19,8 ± 1,13 semanas e o volume tumoral médio foi de 555,91 ± 205,52 mm3. Dos tumores produzidos, 80% foram classificados como de baixo escore e 20% como de alto escore. Foi evidenciada positividade difusa para Ki-67 e p16INK4A em 100% das lesões. O índice de marcação para Ki-67 foi de 50,1 ± 18. Verificou-se correlação direta forte entre a expressão do Ki-67 e o volume tumoral (R=0,811), e com a gradação histológica tumoral (R=0,796). A expressão da proteína p16INK4A se mostrou heterogênea, sendo que, dos tumores estudados, 40% se mostraram padrão 3 de marcação, 30% padrão 2 e 30% padrão 1. Foi observada fraca correlação entre a expressão da p16INK4A e o volume tumoral (R=0,533), mas não com o escore de malignidade ou com a expressão do Ki-67. Conclusão Conclui-se que, em modelo experimental de carcinogênese peri-oral DMBA-induzida, a progressão tumoral está associada

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à fração proliferativa do tumor (células ciclantes Ki-67 positivas) e com a gradação histológica tumoral, mas não apresenta relação com a expressão da proteína p16INK4A.

Palavras-chaves: carcinogênese oral, DMBA, Imunohistoquímica

Resumo: 01.016

CONSTRUÇÃO DE VÍRUS RECOMBINANTE DA FEBRE AMARELA EXPRESSANDO O GENE REPÓRTER GAUSSIA LUCIFERASE

Autores 1KASSAR, T. C.

1, CARVALHO, A. G. O.

1, GIL, L. H. V. G.

1 Dpto. de Virologia e Terapia

Experimental - CPqAM-FIOCRUZ-PE

Apoio Financeiro: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Resumo Objetivos A febre amarela é uma doença viral não contagiosa causada por um arbovírus da família Flaviviridae. A reemergência da doença e sua significância como um problema de saúde pública, tem gerado interesse para o desenvolvimento de novas ferramentas vacinais e agentes antivirais contra este vírus. O objetivo deste estudo foi construir um vírus recombinante da febre amarela, expressando o gene repórter da Gaussia Luciferase, que servirá como uma potente ferramenta para estudo de muitos mecanismos moleculares da biologia do vírus. Metodos Para a construção do clone infeccioso utilizou-se o plasmídeo pBSC-YFV-YFP-DENVlinker #3, previamente construído em nosso laboratório. O plasmídeo foi digerido com a enzima de restrição específica (NarI), para liberação do gene repórter YFP (Yellow Fluorescent Protein). A amplificação por PCR do gene repórter Gaussia Luciferase utilizou como molde o plasmídeo pGLuc-NS(WF10). A reação utilizou primers contendo sequências homólogas sobrepostas para a recombinação em levedura Saccharomyces cerevisiae, cepa RFY206, através da transformação com acetato de lítio. Resultados A construção pBSC-YFV17D-GLuc foi confirmada por PCR. Seis possíveis clones foram crescidos em meio específico (YNB, sem triptofano) e o DNA plasmideal extraído. Na triagem, foram realizados dois PCRs de cada um dos seis clones para a confirmação da clonagem. Os seis clones apresentaram amplicons de tamanho esperado, mostrando sucesso na construção. Conclusão Este trabalho permitiu a clonagem do gene repórter Gaussia Luciferase no genoma do vírus da febre amarela. O vírus recombinante gerado representa um instrumento de pesquisa poderoso, pois contribuirá para o conhecimento de aspectos genéticos, moleculares, imunológicos e de patogenia; também podendo ser usado no desenvolvimento de vacinas virais e eventualmente, dirigir intervenções como terapias antivirais e triagem de drogas.

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Palavras-chaves: febre amarela, Gaussia luciferase, virus

Resumo: 01.017

INVESTIGAÇÃO DE POLIMORFISMO DO COMPOSTO CPISOX ATRAVÉS DA DETERMINAÇÃO DAS PROPRIEDADES ESTRUTURAIS, UTILIZANDO ESTUDOS DE DIFRAÇÃO DE RAIOS X

Autores

1SILVA, G. S.

1, PEREIRA, M. A.

2, FRIGO, L. M.

2, FLORES, A. F. C.

1, BALLIANO, T. L.

1

Instituto de Química e Biotecnologia - UFAL, 2 Centro de Ciências Naturais e Exatas, Departamento

de Química - UFSM

Apoio Financeiro: CAPES, CNPq, FAPEAL, UFSM, UFAL

Resumo Objetivos A doença de Alzheimer (DA), caracterizada pelo neuropatologista alemão Alois Alzheimer em 1907, é uma afecção neurodegenerativa progressiva e irreversível de aparecimento insidioso, que acarreta perda da memória e diversos distúrbios cognitivos. Em geral o acometimento é tardio, de incidência ao redor de 60 anos de idade, ocorrendo também de forma precoce, ao redor de 40 anos, sendo ambas de indistinguíveis unidades clínicas e nosológicas. No intuito de identificar novos inibidores para enzima acetilcolinesterase, busca-se através de compostos, previamente sintetizados no Núcleo de Química de Heterociclos do Departamento de Química da Universidade Federal de Santa Maria, que apresentem analogia aos intermediários metabólicos do ácido γ-aminobutírico (GABA), identificar compostos com maior seletividade e alto potencial e com efeitos colaterais menores, se comparados aos fármacos disponíveis no mercado. Metodos O composto obtido foi recristalizado, com a utilização de solventes variados e cristais foram obtidos após a recristalização com acetato de etila e metanol, através da evaporação lenta de solvente. O levantamento de dados cristalográficos foi executado a temperatura ambiente (T = 298K), onde foi usado um difratômetro Kappa CCD Enraf Nonius com o detector da área em de MoK radiação monocromática (0.71073 Å). Resultados Os principais dados cristalográficos que foram obtidos, para amostra cristalizada em acetato de etila são: sistema ortorrômbico, num grupo especial F2dd são: a=14,3320(2)Å, b=14,7242(2)Å e c=37,5249(5)Å; Z=36moléculas/cela unitária, V=7918,88(9)Å3 e F(000)=3952. O número de reflexões coletadas foi de 17393 reflexões e 4807 independentes com Rint=0.0399, Robs=0.0312 e S=1,1900. Para amostra cristalizada em metanol são: sistema monoclínico, num grupo especial Cc são: a=14,3215(4)Å, b=14,7233(2)Å e c=20,0773(5)Å β=110.914(1)°; Z=16moléculas/cela unitária, V=3954,68(7)Å3 e F(000)=1984. O número de reflexões coletadas foi de 9104 reflexões e 9099 independentes com Rint=0,0174, Robs=0,0476 e S=1,1830. A estrutura cristalina foi determinada usando métodos diretos e refinada anisotropicamente e pelo método de mínimos quadrados sobre F2 usando o programa SHELX97. Conclusão Essa diferença de empacotamento do composto CPISOX nos permite investigar e confirmar o polimorfismo de empacotamento ou orientacional. Associando outras técnicas de caracterização, tais como RMN, IV, UV, RAMAN estão

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sendo feitas para verificação de diferenças estruturais do composto.

Palavras-chaves: Acetilcolinesterase, Gaba, Estudos Estruturais, Polimorfismo

Resumo: 01.018

INVESTIGAÇÃO DOS MECANISMOS TRANSCRICIONAIS RESPONSÁVEIS PELA EXPRESSÃO ABERRANTE DE ISOFORMAS DE SPLICING DA OSTEOPONTINA

Autores 1NETTO, C. C.

2, MATOS, A. R.

1, SILVA, T. C. N.

1,2, GIMBA, E. R. P.

1 RIR - UFF,

2 CPQ - INCA

Apoio Financeiro: FAPERJ, CNPQ/PIBIC, Swiss Bridge Foundation

Resumo Objetivos A osteopontina (OPN) é uma proteína que apresenta importante papel na progressão de diversos tumores. O gene da OPN sofre splicing alternativo, gerando as isoformas OPNa, OPNb e OPNc, sendo que as duas últimas apresentam os éxons 5 e 4 deletados, respectivamente. Demonstramos anteriormente que a OPNc é expressa especificamente em tumores ovarianos, apresentando importante papel na progressão destes tumores Tilli et al., 2011a). No entanto nada é conhecido sobre os mecanismos transcricionais que regulam a expressão aberrante desta isoforma. Neste sentido, este projeto tem por objetivo : 1) Investigar se alterações nas sequências de DNA que circundam o éxon 4 e os íntrons adjacentes se relacionam com o perfil de expressão tumor-específico destas isoformas e; 2) se mudanças nos padrões de expressão de fatores reguladores do splicing poderiam estar relacionados ao perfil de expresssão das isoformas OPNb e OPNc em tumores. Metodos Foram utilizadas linhagens celulares e amostras teciduais de tumores de ovário que expressam especificamente a OPNc para extrair DNA e RNA. Serão comparadas as sequências de DNA de amostras que expressam ou não esta isoforma quanto às sequências de DNA presentes nas junções exon-íntrons e no interior das sequências intrônicas. Foram projetados oligonucelotídeos iniciadores específicos para as regiões nas extremidades do éxons 4 e nas sequências intrônicas adjacentes a este éxon. Os fragmentos amplificados serão sequenciados para determinação das sequencias de DNA. Para avaliação do perfil de expressão de genes codificadores de proteínas reguladoras do splicing, foram projetados oligonucleotídeos específicos para estes genes e reações de PCR em tempo real. Resultados Dentre diversas temperaturas de anelamento testadas (entre 500C e 600C), a temperatura de anelamento de 600C foi definida como a ideal para amplificação de fragmentos de DNA únicos compreendidos o éxon 4 e os íntorns adjacentes. Estes fragmentos foram amplificados a partir de amostras de tecidos tumorais que expressam ou não expressam a OPNc. Ao comparar o perfil de expressão de 11 genes codificadores de fatores de splicing da família SR (SFRS1, SFRS3, SFRS4, SFRS5, hnRNPC2, hnRNPK, PTB, hnRNPB11, SRFS6. hnRNPA1 e hnRNPA2/B , 8 dentre eles apresentaram-se com expressão aumentada em amostras de RNA de uma linhagem celular que não expressa a OPNc (IOSE, ovariana não tumoral), em comparação com uma linhagem que expressa a OPNc (OVCAr-3, de tumores ovarianos). Conclusão

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Nossos dados mostram a padronização da amplificação de fragmentos de DNA contendo os íntrons adjacentes e as sequencias de DNA codificadora do éxons 4, de modo a propiciar a realização do sequenciamento de DNA destas regiões genômicas. Adicionalmente, observamos expressão aumentada de fatores de splicing da família SR em células que não expressam a isoforma OPNc, podendo potencialmente constituir-se em um dos mecanismos responsáveis pela geração de expressão aberrante da OPNc.

Palavras-chaves: osteopontina, splicing alternativo, câncer de ovário

Resumo: 01.019

LPSF/GQ-02 REDUZ A EXPRESSÃO DE MATRIZ METALOPROTEINASE-9 (MMP-9) E EVOLUÇÃO DA PLACA ATEROSCLERÓTICA EM CAMUNDONGOS DEFICIENTES DO RECEPTOR DE LDL (RLDL-/-)

Autores

1SPINOLA, M. G. D.

1, SILVA, A. K. S.

1, TORRES, D. O. C.

1, ROCHA, S. W. S.

1, SILVA, B. S.

1,

GOMES, F. O. S. 3, LIMA, M. C. A.

3, GALDINO, S. L.

3, PITTA, I. R.

1,2, PEIXOTO, C. A.

1

Entomologia - CPqAM/Fiocruz, 2 Ciência e Tecnologia - CETENE,

3 Farmácia - LABSINFA

Apoio Financeiro:

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e

Fundação de Amparo a Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco

(FACEPE).

Resumo Objetivos Evidências experimentais sugerem que a matriz metaloproteinase-9 (MMP-9) pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento de doenças cardiovasculares, tais como a aterosclerose, resultando em ruptura da placa aterosclerótica. Dessa forma, este estudo investigou os efeitos dos derivados tiazolidínicos LPSF/GQ-02 e LPSF/GQ-16 sobre a expressão da matriz metaloproteinase-9 (MMP-9) e evolução da placa aterosclerótica em RLDL-/ -. Metodos Todos os experimentos foram aprovados pelo comite de ética local (L-010/09 CEUA-FIOCRUZ). Trinta e dois camundongos machos com 21 dias de idade pesando aproximadamente 15g foram divididos em quatro grupos: 1-alimentados com dieta rica em gordura (HFD) (21% de Gordura de leite de gordura+ 1,25% de colesterol), 2-HFD + pioglitazona (20mg/kg/dia), 3-HFD + LPSF/GQ -02 (30mg/kg/dia) e 4-HFD+LPSF/GQ-16 (30mg/kg/dia). Os experimentos foram conduzidos durante 10 semanas e nas duas últimas semanas, os fármacos foram administrados diariamente por gavagem. Em seguida, os animais foram sacrificados e a aorta foi rapidamente retirada e processada para microscopia de luz e armazenadas a -80°C para análise de proteínas por western blot. Para analisar as lesões ateroscleróticas, foi realizado teste não paramétrico ANOVA (Kruskal-Wallis) e teste post hoc de Dunn’s e os resultados de western blot foram avaliados por teste t. Resultados As aortas dos grupos HFD, pioglitazona e LPSF/GQ-16 apresentaram inúmeros macrófagos no espaço subendotelial, contendo gotículas lipídicas, caracterizando as células espumosas. No grupo LPSF/GQ-02, houve um menor número de células espumosas no espaço subendotelial, com a preservação da túnica média. A análise morfométrica demonstrou que

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o tratamento com a pioglitazona (74252±34762) não reduzir a área das lesões ateroscleróticas quando comparado com o grupo HFD (92882±9533). Por outro lado, LPSF/GQ-02 (18287±5463) inverteu as condições causadas por dieta rica em gordura, reduzindo significativamente a lesão aterosclerótica. No grupo LPSF/GQ-16 (140503±26699) a área lesionada aumentou consideravelmente em relação a todos os outros grupos. A Análise da expressão de MMP-9 mostrou que os grupos da pioglitazona (20020 ± 8744) e LPSF/GQ-16 (14260 ± 7739) não reduziram a expressão de MMP-9 em comparação com o grupo HFD (24670 ± 4375). Por outro lado, LPSF/GQ-02 (7710 ± 3213) foi eficaz em diminuir a expressão de MMP-9 em comparação com o grupo HFD (24670 ± 4375). Conclusão Estes resultados sugerem que a LPSF/GQ-02 possui ações antiateroscleróticas diretas, tornando-se um candidato promissor para o tratamento da aterosclerose.

Palavras-chaves: Aterosclerose, Fármacos, Metaloproteinase-9 , Western Blot

Resumo: 01.020

Nova enzima coagulante isolada da peçonha de Bothrops moojeni - Purificação e Caracterização.

Autores

1,1MORAIS, N. C. G.

3,2, SILVA, T. K. A.

3, PEREIRA, D. F. C.

3, MIGLIORINI, T. M.

2,3,

MARINHO, A. L. Z. 1,2,3

, OLIVEIRA, F. D. 1,2

, FONSECA, K. C. 1 Instituto de Genética e Bioquímica

- UFU, 2 Nano-biofarmacêutica - N-Biofar,

3 Instituto de Ciências Biomédicas - UFU

Apoio Financeiro: UFU, INCT, CAPES

Resumo Objetivos Purificar uma metaloprotease da peçonha da serpente Bothrops moojeni e caracterizá-la quanto a aspectos bioquímicos. Metodos Dois passos cromatográficos foram utilizados sendo o primeiro uma cromatografia de troca iônica em DEAE-Sephacel seguida de outra de gel filtração em Sephacryl S-300. Frações foram submetidas a eletroforese em SDS-PAGE 14% e a massa molecular foi estimada por análise de imagem em software Kodak 1D. As atividades fibrinogenolíticas foram realizadas de acordo com Edgar e Prentice (1973), parcialmente modificado. Os ensaios aconteceram sob ação de inibidores, em diferentes temperaturas e pHs. Todos os experimentos foram feitos de acordo com COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA PARA O PROTOCOLO REGISTRO CEP/UFU 055/11 Resultados Foi purificada uma metaloprotease fibrinogenolítica da peçonha da serpente Bothrops moojeni denominada Moojenina, A análise em SDS-PAGE indicou que Moojenina consiste em uma única cadeia polipeptídica e possui massa molecular de aproximadamente 45 kDa, sob condições redutoras e 30 kDa, sob condições não-redutoras. A enzima cliva primeiro a cadeia Aα do fibrinogênio bovino, seguido pela cadeia Bβ, e não mostra efeitos sobre a cadeia γ. A atividade de fibrinogenolítica da Moojenina foi inibida pela pré-incubação com EDTA, 1,10-fenantrolina e β-mercaptoetanol. A Moojenina mostrou atividade máxima entre 30-40°C e o pH ótimo foi de 4. Sua atividade foi completamente perdida em temperaturas

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superiores a 50°C. Conclusão Neste trabalho descrevemos o processo de purificação e caracterização parcial de uma metaloprotease com atividade fibrinogenolítica denominada Moojenina. Esta possui peso molecular com cerca de 45kDa. Esta enzima apresenta atividade ótima em pH 4,0 e 30-40°C. As atividades foram inibidas por EDTA, β-mercaptoetanol, 1,10 fenantrolina e em menor proporção por benzamidina. Mais estudos serão realizados para conhecimento pleno das atividades desta enzima.

Palavras-chaves: Proteina, Bothrops moojeni, Fibrinogenolítica

Resumo: 01.021

Isolamento, clonagem e construção do complexo polimerase do vírus influenza A/duck/UKR/1/1963(H3N8) através de genética reversa viral feita por recombinação homóloga em levedura

Autores

1SILVA JÚNIOR, J.V.J.

2, BERTANI, G. R.

3, BRENTANO, L.

1, GIL, L. H. V. G.

1 Laboratório de

Virologia e Terapia Experimental - CPqAM, Fiocruz/PE, 2 Departamento de Bioquímica - UFPE,

3

Centro Nacional de Pesquisas de Aves e Suínos - Embrapa

Apoio Financeiro: MAPA, CNPq, Fiocruz

Resumo Objetivos Entende-se por genética reversa viral (GRV) a geração de partículas virais por meio da transfecção de células eucariotas com o cDNA viral (cDNAv) clonado ou RNA viral (RNAv) transcrito in vitro. A GRV tem se mostrado uma ferramenta para investigações sobre o ciclo de replicação viral, desenvolvimento de vacinas e análise de drogas antivirais. Essa tecnologia, por sua vez, tem sido usada para o vírus influenza, principalmente na confecção de vacinas contra influenza sazonal e pandêmica, sendo os vírus pandêmicos de influenza todos resultantes de mutação pontual ou rearranjo gênico envolvendo vírus de influenza aviária (IA). Assim, ao reconhecer a importância da GRV para o entendimento da replicação viral e a participação dos vírus de IA na formação dos vírus pandêmicos de influenza, construímos o complexo polimerase viral (CPV) do influenza A/duck/UKR/1/1963(H3N8) através de GRV e recombinação homóloga em levedura. Metodos O vírus de IA foi isolado de aves silvestres brasileiras e cultivado em ovos Specific Pathogen Free (SPF). Após o isolamento, o RNAv foi extraído e o cDNAv obtido por RT-PCR. O cDNAv de cada segmento gênico foi clonado de forma individual em vetor comercial (pDrive/pGEM-T Easy) e em seguida subclonado no vetor pJG-Ch2008, por recombinação homóloga em levedura. Todos os clones tiveram a identidade avaliada por sequenciamento gênico e análise comparativa com as sequencias depositadas no National Center for Biotechnology Information (NCBI), o que nos permitiu escolher os clones menos mutados para a construção do CPV. Os clones menos mutados responsáveis pela codificação das proteínas do CPV (PB2, PB1, PA e NP) foram transfectados em célula HEK-293T em adição aos plasmídeos KW-RFP ou pGLuc-NS (WF10) [contendo o gene repórter red fluorescent protein (RFP) e Gaussia luciferase (GLuc), respectivamente, ambos flanqueados pelas sequencias da untranslated region (UTR) do influenza], sendo o controle negativo feito nas mesmas condições, porém com o CPV incompleto. 48 horas pós-transfecção, a avaliação da funcionalidade do CPV foi feita a partir

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leitura do RFP e da GLuc. Resultados O sequenciamento indicou que todos os segmentos gênicos do isolado brasileiro apresentaram maior homologia com as sequencias do A/duck/UKR/1/1963(H3N8) depositadas no NCBI. Os clones mais estáveis foram os: PB2.3pGEM, PB1.6pDrive, PA3pGEM, HA10pDrive, NP3pGEM, NA10pDrive, M4pDrive, NS3pDrive, que ao serem subclonados no vetor pJG-Ch2008 resultaram nos clones pJG-PB2.3Ch2008, pJG-PB1.6Ch2008, pJG-PA3Ch2008, pJG-HA10Ch2008, pJG-NP3Ch2008, pJG-NA10Ch2008, pJG-M4Ch2008, pJG-NS3Ch2008. A transfecção dos clones pJG-PB2.3Ch2008, pJG-PB1.6Ch2008, pJG-PA3Ch2008 e pJG-NP3Ch2008 mais os plasmídeos KW-RFP ou pGLuc-NS (WF10) resultou, após 48 horas, na visualização da expressão de RFP e GLuc, respectivamente, validando o CPV construído. Conclusão O presente trabalho relata a primeira construção feita no Brasil do CPV do influenza através de recombinação homóloga em levedura. A disponibilidade de tal tecnologia ajudará no entendimento e elucidação dos mecanismos moleculares envolvidos na replicação do influenza, além de poder ser usado como modelo para a análise in vitro de drogas antivirais que tenham como alvo de ação as etapas de replicação do genoma viral, contribuindo dessa forma para, ainda incipiente, virologia molecular nacional.

Palavras-chaves: Genética reversa viral, Influenza, Recombinação homóloga em levedura

Resumo: 01.022

EFEITO HEPATOPROTETOR E ANTI-INFLAMATÓRIO DA DIETILCARBAMAZINA (DEC) EM MODELO DE INFLAMAÇÃO HEPÁTICA CRÔNICA INDUZIDA POR TETRACLORETO DE CARBONO (CCl4)

Autores

1FRANÇA, M. E. R. D.

1, ROCHA, S. W. S.

2, SILVA, J. C. D.

1, BARBOSA, K. P. D. S.

1, SILVA,

A. K. S. E. 1,2

, PEIXOTO, C. A. 1, GOMES, F. O. D. S.

1, SILVA, B. S. D.

1, RIBEIRO, E. L.

1,

FRAGOSO, I. T. 1 Entomologia - CpqAM,

2 Microscopia - CETENE

Apoio Financeiro: FACEPE

Resumo Objetivos Estudos farmacológicos mostram que a DEC interfere no metabolismo do ácido araquidônico, atuando como um fármaco anti-inflamatório. O objetivo do estudo foi examinar o efeito da DEC sobre a inflamação hepática crônica induzida pelo tetracloreto de carbono (CCl4). Metodos 18 camundongos machos com 60 dias de idade, pesando cerca de 25-30g da linhagem C57BL/6J foram divididos em 3 grupos experimentais (n=8/grupo): (1) grupo controle, (2) grupo CCl4 e (3) grupo CCl4+DEC 50mg/kg (CEUA/FIOCRUZ 11/2010). A solução de DEC (50mg/kg) foi administrada nos bebedouros dos animais em volume total de 150 ml, por 6 semanas sendo padronizadas diariamente de acordo com o peso dos animais. A indução da inflamação foi feita pelo CCl4

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(0,5µl/g) por 6 semanas (2 injeções intraperitoneais/semana – terças e quintas). Após o esquema terapêutico os animais foram eutanaziados e fragmentos hepáticos foram processados para histopatologia (HE), marcação específica de lipídios (Oil Red O) e imunohistoquímica. A quantificação da imunomarcação foi realizada utilizando o programa de imagem Gimp 2.6. A análise estatística dos dados foram realizados através do ANOVA one-way, seguido dos testes Dunnet e Tukey usando o programa GraphPadPrism v.5.0. Os dados foram expressos em média ± erro padrão da média. Resultados Os resultados histopatológicos do grupo controle (1) apresentaram características morfológicas típicas, com arquitetura hepática íntegra. No grupo CCl4 (2) foi observada marcante degeneração citoplasmática e nuclear, com a presença de necrose e fibrose e infiltrados inflamatórios. Os animais tratados com CCl4+DEC (3), mostraram uma diminuição de todas as lesões observadas no grupo CCl4. A marcação de lipídeos do grupo 1 (7194±1348) mostrou hepatócitos Oil red negativos, obtendo apenas uma fraca marcação de gorduras no citoplasma, sendo esta característica padrão do tecido hepático. O grupo 2 (74091±1134) apresentou células Oil red positivas, com a presença de grandes gotículas lipídicas dispersas na região intra e intercelular. No entanto o grupo 3 (9939±13947) mostrou diminuição significativa na marcação de lipídios. Áreas oil red positivas foram quantificadas pelo programa de imagem Gimp 2.6. A imunohistoquímica para COX-2 do grupo 1 (641.5 ± 155.1) não mostrou imunopositividade substancial. Por outro lado, uma forte expressão para COX-2 foi encontrada no grupo 2 (519432 ± 20993), sendo esta marcação observada na áreas fibróticas e em células inflamatórios, principalmente em áreas perivenulares. O grupo 3 (80825±33625) apresentou redução evidente na expressão de COX-2. Conclusão De acordo com os resultados a DEC pode ser utilizada como um potente fármaco anti-inflamatório e hepatoprotetor frente à lesão hepática crônica. Ensaios ainda estão em desenvolvimento em nosso laboratório, a fim de esclarecer o papel da DEC sobre os mecanismos moleculares da cascata inflamatória e da peroxidação lipídica.

Palavras-chaves: Inflamação Hepática Crônica, Dietilcarbamazina, Anti-inflamatório, Tetracloreto de Carbono

Resumo: 01.023

CARACTERIZAÇÃO DE GENES ENVOLVIDOS EM CÂNCER DE PRÓSTATA

Autores 1DÓSEA, V. N.

2, COSTA, M. S. A.

2, SAITA, A. P.

2, RAMOS, R. G. P.

1, OCTACILIO-SILVA, S.

1

Morfologia - UFS, 2 Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos - USP

Apoio Financeiro: LGMD

Resumo Objetivos O câncer de próstata está em segundo lugar entre os homens, sendo esperados para 2012, de acordo com o INCA, 60 mil novos casos. Dois dos genes que se encontram deletados na maioria dos casos de câncer de próstata são: Tumor suppressor candidate 3 (TUSC3), cuja proteína possui similaridade de 57% de aminoácidos com CG7830 de Drosophila e Kruppel-like factor 6 (KLF6), com similaridade de 68% com CG42741 de Drosophila. Devido à incidência deste tipo de câncer, é de extrema importância conhecer genes envolvidos na tumorigênese. Dentro deste contexto, Drosophila melanogaster pode ser um bom modelo experimental, devido à similaridade de sequências de seus genes com os de humanos, que pode se refletir na similaridade de mecanismos moleculares básicos. Assim sendo, o objetivo deste trabalho

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é analisar os genes CG7830 e o CG42741 de Drosophila, seus fenótipos e funções e características moleculares, correlacionando o conhecimento obtido com as características dos genes homólogos em humanos. Metodos Os estoques utilizados neste trabalho foram mantidos em meio padrão a 25º C, incluindo os cruzamentos e coletas de larvas, pupas e adultos. Para a coleta de embriões, adultos foram mantidos em meio padrão de suco de uva para oviposição. A quantificação da expressão dos dois genes ao longo do desenvolvimento foi realizada a partir de cDNAs de embriões, larvas, pupas e adultos do estoque selvagem, que foram utilizados para reações de PCR em tempo real. Adultos portadores de deficiências que incluem os genes CG7830 e CG42741 tiveram suas asas retiradas para observação em estereomicroscópio. As deficiências aqui utilizadas foram caracterizadas in silico no banco de dados genômicos Flybase. Resultados Indivíduos adultos portadores de deficiências que incluem os genes CG7830 e CG42741 possuem asas com bordas recortadas, sendo este fenótipo associado a genes envolvidos em vias de morte celular programada, que é uma característica afetada nas células tumorigênicas. As deficiências aqui utilizadas estão compreendidas em regiões maiores do que os genes CG7830 e CG42741 e sua caracterização in silico mostrou que outros genes também se encontram deletados. A letalidade dos estoques (observada em trabalho anterior) e o fenótipo de asas recortadas podem ser devido a estes outros genes, portanto, análises futuras serão realizadas com estoques portadores de RNA de interferência para os genes de interesse. Os perfis de expressão gênica destes genes indicam que ambos são regulados durante o desenvolvimento, com CG7830 apresentando picos nos estágios iniciais e intermediários de embrião e pupa, enquanto CG42741 tem uma menor expressão, com picos em estágios embrionários e pupais intermediários. Ambos os genes são expressos em adultos. Conclusão A caracterização fenotípica preliminar dos genes CG7830 e CG42741 mostraram que eles estão provavelmente envolvidos no desenvolvimento das asas. A análise molecular indicou que suas expressões são reguladas ao longo do desenvolvimento. Estudos posteriores através da interferência em suas expressões serão necessários para compreender especificamente seus efeitos durante o desenvolvimento.

Palavras-chaves: câncer de próstata, Drosophila melanogaster, TUSC3, KLF6

Resumo: 01.024

ESTUDO DOS PROCESSOS BIOQUÍMICOS E FISIOLÓGICOS DO INSETO RHYNCHOPHORUS PALMARUM, PRAGA DAS CULTURAS DE COQUEIRO (COCUS NUCIFERA L.)

Autores

1NASCIMENTO, J. S. D.

1, COSTA, M. D. M.

1, ALMEIDA, C. P. D.

1, COSTA, Y. G. F. D.

1,

SILVA, A. T. D. 1, DORNELAS, C. B.

1, GRILLO, L. A. M.

1 laboratório de bioquímica e biologia

molecular - UFAL

Apoio Financeiro: FAPEAL

Resumo Objetivos

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O Brasil apresenta condições naturais propícias ao cultivo do coqueiro, porém a incidência de pragas e doenças nos coqueiros do Brasil constitui um problema limitante a essa exploração. O metabolismo da glicose desempenha um papel essencial na fisiologia e no desenvolvimento de quase todos os organismos vivos. No caso de animais ovíparos, os embriões não podem obter nutrientes externos antes da eclosão. Em casos como estes, os embriões desenvolvem diversos mecanismos diferentes, envolvendo aminoácidos, lipídios e glicose a fim de controlar o balanço energético para desenvolvimento do organismo. Desta forma, o trabalho tem como objetivo avaliar alguns aspectos do metabolismo energético durante o desenvolvimento das larvas de Rhynchophorus palmarum, através das medidas do conteúdo de glicose e conteúdo de glicogênio, a fim de gerar conhecimento sobre a biologia de vetores de pragas de coqueiros. Metodos A avaliação foi feita a partir da dissecação de dois estádios das larvas cultivadas, L1 (com peso entre 1,0g-1,8g) e L2 (com peso entre 2,0g-2,8g), sendo realizada a separação dos tecidos como o conteúdo de intestino anterior (CIA), tecido do intestino anterior (TIA), intestino posterior (IP) e corpo gorduroso (CG). Em seguida cada parte foi homogeneizada e centrifugada, sendo posteriormente retirado o sobrenadante para avaliação do conteúdo de glicose e conteúdo de glicogênio utilizando Kit diagnóstico da Labtest. Os resultados foram descritos a partir da avaliação estatística utilizando o programa GradPrism de tratamento estatístico. Resultados Resultados: Os dados referentes à medida do conteúdo de glicose, mostram uma variação considerável do estágio L1 para o L2, tanto no conteúdo de intestino anterior (CIA, 0,02-0,08 mg/dL), como no tecido do intestino anterior (TIA, 0,04-0,2mg/dL). No que se refere à avaliação do conteúdo de glicogênio ambos os tecidos sofreram variação, em especial a concentração no corpo gorduroso (CG, 15-65mg/dL) do estádio L1 para o L2. Conclusão Os resultados indicam que a variação do conteúdo de glicose está relacionada a uma maior atividade metabólica das larvas de Rhynchophorus palmarum do estágio L1 para o L2. E em relação à concentração de glicogênio é evidenciado um acúmulo de reserva energética que será utilizada na faze de pupa, o que demonstra o desenvolvimento energético das larvas até a fase de inseto.

Palavras-chaves: Rhynchophorus palmarum, metabolismo, carboidratos

Resumo: 01.025

DESENVOLVIMENTO DE MODELO EXPERIMENTAL EM CAMUNDONGOS PARA NEUROTUBERCULOSE A PARTIR DO Bacillus Calmette-Guérin

Autores

1OLIVEIRA, T. F.

1, FEITOSA, Vera Lucia Corrêa

3, REIS, F. P.

2, BADAUÊ-PASSOS, D Jr.

2,

ANTONIOLLI, Â. R. 1, JUNIOR, W. D. L.

1 Departamento de Morfologia - UFS,

2 Departamento de

Fisiologia - UFS, 3 Faculdade de Medicina - Unit

Apoio Financeiro: FAPITEC / PPSUS

Resumo Objetivos

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A doença causada pelo Mycobacterium tuberculosis é uma das mais importantes doenças infecciosas oportunistas no mundo, responsável por 8,8 milhões de novos casos de tuberculose (TB) em 2005 e cerca de 1,6 milhões de mortes a cada ano, inclusive em pacientes co-infectados com HIV (WHO, 2007). Apesar da gravidade da apresentação clínica, os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na patogênese do comprometimento da TB no sistema nervoso central (SNC) são pouco compreendidos (Tunkel and Scheld, 1993). Portanto, o desenvolvimento de um modelo experimental animal se torna importante para esclarecimento da fisiopatologia da TB no SNC, além de contribuir para desenvolvimento de possíveis estratégias terapêuticas. O objetivo deste trabalho foi desenvolver, em camundongos, um modelo experimental da TB no SNC. Metodos Foram utilizados camundongos Swiss, machos, pesando entre 20 e 30 gramas, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Sergipe, protocolo CEPA (04/2010). Após confirmação do parâmetro estereotáxico para injeção intracerebroventricular (icv), o primeiro grupo passou por cirurgia para microinjeção icv (1μL) do bacillus calmette-guérin (BCG), o segundo foi submetido a cirurgia com microinjeção de tampão fosfato (PBS) 10mM como controle. Passado quatro semanas da cirurgia os animais foram anestesiados e submetidos a perfusão intracárdica para fixação do tecido e processamento histoquímico. Foram feitas secções, no criostato, de todo o cérebro a 20μm e as lâminas foram coradas com hematoxilina-eosina. Resultados Um mês após as cirurgias estereotáxicas com microinjeções icv, a histologia por hematoxilina-eosina evidenciou o surgimento de infiltrados de células inflamatórias no SNC dos animais submetidos à microinjeção icv de BCG (grupo experimental), enquanto que nos animais submetidos à microinjeção de PBS 10mM (grupo controle) não foi encontrado infiltrados de células inflamatórias. Conclusão A análise das lâminas mostrou um padrão distinto no tecido cerebral entre os animais com microinjeção de BCG e animais do grupo controle. Foram identificados infiltrados anormais de células inflamatórias, constituindo grânulos densamente povoados por núcleos de células no interior do tecido. A presença de tais achados implica em infecção bem sucedida através da vacina BCG.

Palavras-chaves: intracerebroventricular, microinjeção, neurotuberculose

Resumo: 01.026

TESTE DE MICRONÚCLEO COMO BIOMARCADOR PARA AVALIAÇÃO DA CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL DO RESERVATÓRIO DE ITAPARICA BA/PA – SUBMÉDIO SÃO FRANCISCO.

Autores 1,2

SANTOS, F. L. B. 1, SILVA, J. M.

1, MACHADO, S. S.

1, GALDINO, F. C. A.

1, BARRETO, E. O.

1 INSTITUTO DE QUÍMICA E BIOTECNOLOGIA - UFAL,

2 EDUCAÇÃO - UNEB

Apoio Financeiro:

Resumo Objetivos

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O teste do micronúcleo é conhecido como indicador de genotoxicidade e permite a detecção desses efeitos genotóxicos provocados por vários agentes químicos e físicos, podendo ser utilizado para avaliação das condições ambientais. Estudos foram realizados nos últimos anos com o objetivo de avaliar a genotoxicidade de poluentes do meio ambiente. O presente trabalho teve como objetivo realizar uma avaliação preliminar dos possíveis efeitos genotóxicos da poluição aquática em peixes do Reservatório de Itaparica, localizado na divisa entre os estados de Pernambuco e Bahia, região do submédio São Francisco, onde estão fixadas diversas áreas de reassentamento integradas a projetos de irrigação. Metodos As espécies de peixes utilizadas neste estudo foram o apanhari (Astronotus ocellatus) por se tratar de uma espécie exótica de fácil captura e a pirambeba (Serrasalmus sp.) por se tratar de uma espécie nativa. As coletas ocorreram nos meses de maio e outubro de 2011. Foi utilizada a metodologia do teste do micronúcleo, onde os peixes foram capturados, as amostras de sangue foram obtidas por meio de inserção no opérculo mediante o uso de seringa e agulha. O sangue foi gotejado sobre a lâmina e em seguida realizou-se o esfregaço, permanecendo em temperatura ambiente para secagem. Após secagem, as células foram fixadas em metanol absoluto por 5 minutos e o esfregaço foi corado com Giemsa 5% por 30 minutos. Em seguida, a lâmina foi lavada com água destilada e novamente deixada a temperatura ambiente. As lâminas preparadas foram analisadas em microscopia óptica (imersão Lx 400) para identificação e quantificação de micronúcleos, cujo número de eritrócitos micronucleados (MN) foi determinado a partir de 1.000 eritrócitos contados por lâmina. O projeto foi submetido e aprovado sob parecer consubstanciado do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Alagoas sob protocolo nº 006258-2011-21. Resultados Os resultados obtidos são preliminares advindos de duas coletas. Observou-se que os valores de frequência de micronúcleo para ambas as espécies trabalhadas foram mais altos na segunda coleta (outubro), sendo eles: 8,79 ± 1,884; 8,01 ± 3,143, para pirambeba e apanhari, respectivamente, possivelmente em função do período de estiagem que resulta em diminuição do volume de água do reservatório, levando assim a um aumento da concentração de poluentes presentes. Conclusão Como estes estudos preliminares revelaram uma variação na frequência de micronúcleo, nossa pesquisa está em andamento com maior frequência de amostragem e inclusão de uma espécie contrôle.

Palavras-chaves: genotoxicidade, peixes, poluentes

Resumo: 01.027

O FATOR-1 DE CRESCIMENTO SEMELHANTE À INSULINA ESTIMULA IN VITRO EVENTOS ENVOLVIDOS NO PROCESSO DE ANGIOGÊNESE

Autores

1VIANA, I. M. M. N.

2, ALMEIDA, M. E. S.

1, LINS, M. P.

1, SANTOS, R. V.

1, VIEIRA, L. F. A.

1,

SMANIOTTO, S. 1 Laboratório de Biologia Celular - UFAL,

2 Laboratório de Biologia do Movimento

Celular - USP

Apoio Financeiro: CNPq, Capes, Fapeal.

Resumo Objetivos

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O fator-1 de crescimento semelhante à insulina (IGF-1) corresponde a um peptídeo mitogênico com estrutura homóloga à insulina envolvido em múltiplas funções sobre a vascularização. A fibronectina é uma glicoproteína da matriz extracelular que atua na ativação das células endoteliais e estimula a morfogênese tubular durante a angiogênese, processo em que estas células tornam-se sensíveis a estimulação por fatores de crescimento. Assim, o objetivo do presente estudo foi investigar in vitro os efeitos do fator-1 de crescimento semelhante à insulina (IGF-1) na produção de fibronectina, expressão de seu receptor integrina e reorganização do citoesqueleto de F-actina em células endoteliais. Metodos Os estudos foram realizados com a linhagem de células endoteliais tímicas (tEnd.1) tratadas ou não com IGF-1 na concentração de 100 ng/mL por um período de 24 horas. A expressão do receptor para IGF-1, o IGF-1R, e o receptor para fibronectina, a integrina CD49e (VLA-5), na superfície celular foi analisada por citometria de fluxo. Através do método de imunofluorescência indireto, foi avaliado o efeito do tratamento sobre a produção de fibronectina pelas células tEnd.1. Para avaliar a reorganização do ciotoesqueleto de F-actina, células tEnd.1 foram cultivadas em lamínulas de vidro revestidas ou não com fibronectina e após tratamento, foram coradas diretamente com Faloidina-Alexa 488 e analisadas por microscopia confocal. A análise estatística foi realizada através de teste t de Studente e os valores foram representados pela média ± erro padrão da média (n=3), sendo considerados significativos quando p < 0,05. Resultados Através da análise citofluorométrica foi constatado que as células tEnd.1 apresentam uma alta expressão do receptor para IGF-1, contudo não houve diferença significativa no percentual de células que expressaram o IGF-1R (92.21 ± 0.66) quando comparado às células que não receberam o tratamento (92.91 ± 0.48). Verificou-se que o tratamento com IGF-1 aumentou a deposição de fibronectina pelas células tEnd.1, mas não alterou o percentual de células que expressaram CD49e (97.77 ± 0.3106) quando comparado ao controle (97.74 ± 0.1827). Por fim, as células tEnd.1 tratadas com IGF-1 mostraram o citoesqueleto de F-actina mais alongado evidenciando uma forma celular fusiforme delgada e quando as células foram cultivadas sobre matriz de fibronectina, estas características foram acentuadas em relação ao controle negativo. Conclusão A partir dos resultados obtidos, podemos sugerir que as células tEnd.1 expressando o receptor para IGF-1 são responsivas ao fator de crescimento, estimulando a deposição de fibronectina e a reorganização do citoesqueleto de F-actina, podendo assim contribuir para o processo de angiogênese.

Palavras-chaves: Célula endotelial , Citoesqueleto, Fibronectina, IGF-1

Resumo: 01.028

EFEITO DO TRITERPENO PENTACÍCLICO UVAOL SOBRE CÉLULAS DO SISTEMA IMUNOLÓGICO IN VITRO

Autores 1MELO, R. R. S. D.

1, BRANDÃO, A. R. A.

1, VIANA, I. M. M. N.

1, BARRETO, E. D. O.

1,

SMANIOTTO, S. 1 Laboratório de Biologia Celular - UFAL

Apoio Financeiro: CNPq, Capes, Fapeal

Resumo

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Objetivos O uvaol é um composto natural, pertencente à classe dos triterpenos, presente principalmente nas folhas da oliveira e no óleo de oliva (Olea europea). O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial efeito do triterpeno pentacíclico uvaol sobre células do sistema imunológico in vitro. Metodos Camundongos Swiss machos (18-25g) de 6-8 semanas foram utilizados para obtenção de linfócitos dos linfonodos mesentéricos e macrófagos peritoneais. As células foram submetidas ao tratamento in vitro com RPMI ou triterpeno uvaol nas concentrações de 10-3 µM/ml, 10-2 µM/ml, 10-1 µM/ml, 1 µM/ml, 10 µM/ml e 102 µM/ml. A proliferação de linfócitos estimulada por concavalina A e a viabilidade celular foram avaliadas por MTT nos tempos de 24, 36 e 48 h após tratamento com uvaol. Análise morfológica e ensaios de fagocitose de partículas de zymosan, avaliados pela taxa de fagocitose e capacidade fagocítica expressos como unidades arbritárias (u.a.) foram realizados para avaliar o efeito do uvaol sobre os macrófagos. Os resultados foram representados como média ± erro padrão da média (EPM), e avaliados estatisticamente através do teste t de Student e One-Way ANOVA com um nível de significância selecionado para p < 0.05. Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética institucional da UFAL, sob o protocolo 010095/2009-67. Resultados A exposição de linfócitos a diferentes concentrações de uvaol não alterou a viabilidade e a proliferação celular nos diferentes tempos avaliados. O tratamento com uvaol induziu alteração na morfologia dos macrófagos peritoneais quando comparados ao controle. Os macrófagos tratados apenas com RPMI (controle) exibiram forma arredondada, poucos prolongamentos citoplasmáticos e núcleo excêntrico em forma de rim. Os macrófagos tratados com uvaol nas concentrações de 10-3 µM/ml, 10-2 µM/ml, 10-1 µM/ml demonstraram morfologia semelhante ao controle, porém algumas células apresentaram formas variadas, com projeções citoplasmáticas mais evidentes e núcleo centralizado. Nas concentrações de 1 µM/ml e 10 µM/ml as células apresentaram núcleos maiores e citoplasma abundante, ao passo que as células submetidas ao tratamento na concentração de 102 µM/ml se apresentaram picnóticas. No ensaio de fagocitose, o tratamento com uvaol (102 µM/ml) diminuiu a porcentagem de células capazes de fagocitar, expresso como taxa de fagocitose (de 80,3 ± 1,2 u.a. para 39,3 ± 4,6 u.a.). Além disso, este mesmo tratamento (uvaol, 102 µM/ml) diminuiu a capacidade fagocítica das células de 0,5 ± 0,03 u.a para 0,1 ± 0,05 u.a. As demais concentrações não foram capazes de alterar os parâmetros avaliados. Conclusão Os resultados sugerem que o triterpeno uvaol não interfere na resposta imune adaptativa no que se refere à proliferação de linfócitos, mas possui atividade moduladora sobre macrófagos peritoneais agindo sobre a resposta imune inata.

Palavras-chaves: In vitro, Sistema Imunológico, Uvaol

Resumo: 01.029

Sexagem Molecular de Psitacídeos

Autores 1CARDOSO, G. C.

1, SILVA, L. A. F. D.

1, TOVAR, F. J.

1, TOVAR, F. J.

1 Instituto de Ciências

Biológicas e da Saúde - UFAL

Apoio Financeiro: Laboratório DNA Forense, UFAL

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Resumo Objetivos Conhecer a biologia dos organismos é o primeiro passo para um programa de conservação e proteção ambiental. Isso é especialmente válido para espécies brasileiras em perigo de extinção. No caso específico das aves e especialmente no caso dos psitacídeos brasileiros, isso está sendo feito, como pode ser demonstrado pela bibliografia disponível. Uma forma de abordar os estudos é a aplicação de métodos de identificação sexual molecular em espécies sem dimorfismo, o que pode facilitar enormemente os cruzamentos em cativeiro. O presente trabalho teve como objetivo fazer a identificação sexual de psitacídeos com base na amplificação do gene CHD1 presente nos cromossomos sexuais Z e W. Metodos Foram utilizadas penas em crescimento dos papagaios para isolamento do DNA, gentilmente cedidas pelo IBAMA-AL. O DNA genômico foi extraído utilizando a técnica de extração orgânica de fenol-clorofórmio. Para amplificação da região alvo foi feita PCR utilizando os primers 1237L/1272H. Os produtos de PCR foram submetidos a técnica de RFLP usando enzima de restrição Hae III e logo foram submetidos a eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante 7%. O gel foi corado com 20mg/ml de brometo de etídio e visualizados em transiluminador U.V.. Resultados As penas em crescimento da região cervical demonstraram ser apropriadas para o isolamento do DNA. O protocolo de extração de DNA mostrou-se satisfatório, já que foi obtida quantidade e qualidade suficiente de DNA para as reações de PCR. As condições de termociclagem e utilização dos iniciadores 1237L/1272H demonstraram-se satisfatórias, amplificando os dois cromossomos sexuais. O gel de poliacrilamida mostrou-se eficiente conseguindo observar bandas nítidas de DNA, contudo não foram eficazes para separar os fragmentos entre as variantes cromossômicas Z e W. A técnica de RFLP utilizando a enzima de restrição Hae III foi bem sucedida, conseguindo por meio desta, fazer a identificação sexual da espécie Amazona aestiva. Conclusão Com base nos procedimentos realizados conclui-se que: o protocolo de purificação de DNA utilizado funcionou de acordo ao esperado; A amplificação da região alvo com os iniciadores 1237L e 1272H funcionou em todas as espécies testadas; A eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante 7% foi informativa; A utilização da enzima de restrição Hae III para a técnica de RFLP foi bem sucedida; Foi estabelecido um protocolo para sexagem molecular em psitacídeos.

Palavras-chaves: DNA genômico, PCR, RFLP

Resumo: 01.030

EFEITO DO HORMÔNIO DO CRESCIMENTO NA INFLAMAÇÃO PULPAR E NA POLPA DENTAL DE MOLARES DE RATOS.

Autores 1SANTOS, T. C.

1, LIMA, C. F. M.

1, COSTA, R. F. F.

1, MARTINS-NETO, A. A.

1, SMANIOTTO,

S. 1, SMANIOTTO, S.

1 Laboratório de Biologia Celular - UFAL

Apoio Financeiro: CNPq e FAPEAL

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Resumo Objetivos O sucesso para o reparo no processo inflamatório pulpar depende de uma apropriada interação célula/célula e célula/matriz extracelular (MEC) que inclui neovascularização, proliferação, migração e diferenciação celular. Nesse sentido, o hormônio do crescimento (GH) tem sido descrito como modulador da matriz extracelular. O presente estudo tem como objetivo realizar a análise morfológica e avaliar a expressão de componentes da MEC sobre um modelo induzido de injúria pulpar em ratos tratados com GH. Metodos Para isso, foram utilizados 12 ratos Wistar, com a idade de 60 dias, submetidos à exposição pulpar do primeiro molar inferior (PMI) do lado direito, sendo o esquerdo utilizado como descrição da polpa dental não exposta ao meio oral. Eles foram divididos em 02 grupos tratados ou não com uma dose diária de GH na concentração de 20µg/kg, via intraperitoneal. Após 07 dias de tratamento, os animais foram eutanasiados, tiveram as regiões da mandíbula correspondentes fixadas e processadas para microscopia de luz. Em seguida, cortes com 5µm de espessura foram corados em HE ou submetidos à imunoperoxidase utilizando anticorpos primários anti-colágeno, anti-fibronectina ou anti-laminina. Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética institucional da UFAL, sob o número de protocolo 028370/2009-07. Resultados Por análise histológica demonstrou-se que estruturas e organização da polpa dental no PMI esquerdo dos animais não tratados apresentaram uma qualidade compatível com estruturas normais descritas na literatura. Nos animais tratados com GH, o tecido pulpar mostrou intenso infiltrado celular e com maior presença de células na camada subodontoblástica. Na polpa radicular de todos os PMI com exposição pulpar, tratados ou não com GH, observou-se processo inflamatório com a presença de células polimorfonucleadas e mononucleadas e poucas células na região correspondente a monocamada odontoblástica. A análise por imunohistoquímica mostrou que o GH induziu uma redução na expressão de colágeno, fibronectina e laminina na polpa dental dos PMI que não foram submetidos ao procedimento experimental quando comparados ao grupo PMI esquerdo dos animais não tratados. Por outro lado, a expressão de colágeno e fibronectina foi a mesma nos PMI submetidos à exposição pulpar dos grupos tratados ou não com GH, no entanto a expressão de laminina aumentou no grupo dos animais tratados com o hormônio. Conclusão Assim, nossos dados sugerem que o GH na concentração usada modulou o reparo tecidual em injúria pulpar e aumentou a expressão de laminina.

Palavras-chaves: Hormônio do Crescimento, Polpa Dental, Inflamação Pulpar, Matriz Extracelular