Slide 1

Slide 2

Anlises epidemiolgicas e populacionais em Trypanosoma cruzi a partir de estudos de microssatlites Juliana Ramos Pimenta Orientadora: Prof. Andra Mara Macedo Co-orientador: Prof. Srgio Danilo Pena

Slide 3

Trypanosoma cruzi

Slide 4

Apresentaes Clnicas Doena de Chagas CardacaDigestivaIndeterminada ? Cardio-digestiva

Slide 5

Fatores determinantes da variabilidade clnica Caractersticas genticas do hospedeiro Caractersticas genticas do parasita

Slide 6

Estudos Moleculares Correlacionar com formas clnicas da doena de Chagas Caracterizar geneticamente os parasitas

Slide 7

Microssatlites de DNA

Slide 8

AA ABACBBBCCC Amplificao de microssatlites (PCR) alelo A alelo B alelo C

Slide 9

Microssatlites de T. cruzi LocoRepetio MCLE01(CA) 9 MCLE08(CA) 2 AA(CA) 12 SCLE10(GT) 2 (TG) 10 SCLE11(AC) 9 MCLF10(CA) 2 A (CA) 14 MCLG10(CA) 8 MCLE03(CT) 4 (GT) 2 CTAT(GT) 15 MCLE05(TC) 9 (GT) 4

Slide 10

Microssatlites so capazes de traduzir as semelhanas e diferenas entre as cepas de T. cruzi ?

Slide 11

Nomenclatura, 1999 Trypanosoma cruzi T. cruzi T. cruzi I T. cruzi II Tipo III - Andrade, 1974 Linhagem 2 - Souto, 1996 Z1 - Miles, 1977 Grupo 1 - Tibayrenc, 1995 Ribodemas II/III - Clark & Pung, 1994 Tipo II - Andrade, 1974 Linhagem 1 - Souto, 1996 Z2 - Miles, 1977 Grupo 2 - Tibayrenc, 1995 Ribodemas I - Clark & Pung, 1994 ZA - Romanha, 1979 Tipo I - Andrade Z3 - Miles ZB - Romanha Grupo 1/2 - Souto ?

Slide 12

Analisar os 8 locos de microssatlites em um grande nmero de cepas de T. cruzi e investigar as relaes filogenticas entre elas. Objetivo 1

Slide 13

A B CD C - Policlonal D - Policlonal A - Monoclonal (homozigoto) B - Monoclonal (heterozigoto) MonoclonalPoliclonalTotal Humanos 62 (80%)16 (20%)78 No Humanos 28 (67%)14 (33%)42 6 (55%)5 (45%)11 TOTAL 96 (74%)35 (26%)131 Z3 4 (34%)8 (66%)12 ? Anlise 131 cepas

Slide 14

rvore 97 cepas T. Cruzi II T. Cruzi I rDNA 1/2 rDNA 2 rDNA 1 rDNA 2 mini-exon 1

Slide 15

Slide 16

Diferentes parasitas Diferentes formas clnicas

Slide 17

Modelo Histotrpico Clonal da Doena de Chagas Infeco policlonal Manuteno de parasitas in vitro Parasitas disponveis para anlise Nem todos os clones so capazes de estabelecer infeco Isolamento Anlises diretamente dos tecidos REDUO POPULACIONAL

Slide 18

Col1.7G2 Cor Reto Diaf Esof SanJG LSSP-PCR em tecidos de camundongos infectados Capaz de detectar DNA do parasita nos tecidos. Dirigido ao kDNA. Perfil aleatrio complexo que no corresponde a amplificao de 1 nico loco. Vantagens Desvantagens Marcadores unilocais especficos

Slide 19

Microssatlites de DNA

Slide 20

Full-nested PCR ATAATAATAATAATAATA 53 TATTATTATTATTATTAT 53 DNA molde inicial Primer externo F ATAATAATAATAATAATA 53 TATTATTATTATTATTAT 53 Primer externo R 5 3 ATAATAATAATAATAATA 3 TATTATTATTATTATTAT 5 Primer int. F Primer int. R ATAATAATAATAATAATA 53 TATTATTATTATTATTAT 53 1 a amplificao 2 a amplificao Produto final

Slide 21

Isolar e caracterizar novos locos de microssatlites no genoma do T. cruzi. Objetivo 2

Slide 22

Identificao dos locos de microssatlites

Slide 23

8 locos de microssatlites selecionados TcAAT-01TcTAC-01TcAAAT-01TcTAT-01 TcTAC-02 TcAAT-01 TcAAAT-01 TcATA-01TcTAC-02TcATT-01TcTGTC-01

Slide 24

Resultados full-nested PCR 1a amplificao2a amplificaoFull nested 100 fg DNA TcTAT-01

Slide 25

Caracterizao dos novos locos Anlises de 36 cepas de T. cruzi. TcAAT-01 TcTAC-01 TcAAAT-01 TcTAT-01 Nmero de Alelos Desequilbrio de ligao Equilbrio de Hardy-Weinberg

Slide 26

Otimizar a amplificao de locos de microssatlites de T. cruzi diretamente em amostras de tecidos chagsicos. Objetivo 3

Slide 27

6 meses Col1.7G2 + JG (50+50 tripomastigotas) RetoCorao Infeces experimentais

Slide 28

Microssatlites Resultados Amplificao em tecidos de camundongos infectados experimentalmente com T. cruzi. LSSP-PCR

Slide 29

Resultados Perfis dos microsatlites amplificados nos tecidos dos camundongos e analisados no sequenciador automtico ALF. Tamanhos dos alelos detectados nos tecidos X alelos apresentados pelas cepas originais utilizadas na infeco mista inicial.

Slide 30

DNA hum. Tecidos de pacientes (1:10) DNA T.cruzi Resultados preliminares em tecidos humanos TcTAT-01

Slide 31

Slide 32

Como estrutura das populaes de T. cruzi ? Como estrutura das populaes de T. cruzi ?

Slide 33

Ciclo silvestre Ciclo domstico Infeces policlonais de T. cruzi

Slide 34

Anlises populacionais das cepas de T. cruzi Existe possibilidade de recombinao gentica entre os clones? Quantos clones formam uma cepa multiclonal? Estes clones compartilham caractersticas ou so heterogneos?

Slide 35

Isolado de um paciente CEPA (JU24) JU24- Clone1 JU24- Clone2 JU24 Anlises populacionais das cepas de T. cruzi

Slide 36

Otimizar a amplificao de locos de microssatlites em clulas nicas de T. cruzi separadas atravs de FACS Vantage. Objetivo 4

Slide 37

Epimastigotas de T. cruzi Separao das clulas nicas atravs do FACS Fluorescence Activated Cell Sorter

Slide 38

Separao das clulas nicas atravs do FACS Microplacas de 96 wells Epimastigotas de T. cruzi PCR microssatlites Eletroforese Sequenciador automtico de DNA Fluorescence Activated Cell Sorter

Slide 39

Controle da clonagem A - Well programado para conter 5 esferas B - Well programado para conter 1 esfera C - Well programado para conter 2 esferas

Slide 40

Resultados 1 - Well programado para conter 1 clula 2 - Well programado para conter 1 clula 3 - DNA de JG 4 - DNA de Colombiana

Slide 41

PCR Multiplex dos locos de microssatlites em clulas nicas 1 o round TcAAT-01 TcAAAT-01 TcTAT-01 2 o round TcAAT-01 TcAAAT-01 TcTAT-01

Slide 42

PCR Multiplex dos locos de microssatlites em clulas nicas Perfis dos microsatlites amplificados nas clulas nicas de T. cruzi analisados no sequenciador automtico ALF. Tamanhos dos alelos detectados X alelos das cepas originais utilizadas na clonagem mista inicial.

Slide 43

Amplificao da cepa 4176 TcAAAT-01 e TcTAC-02

Slide 44

Anlises de microssatlites foram capazes de discriminar entre as cepas de T. cruzi mas tambm identificaram as semelhanas entre elas, em concordncia com outros marcadores moleculares. Foram padronizadas reaes de PCR nested para os novos locos de microssatlites de T. cruzi que foram sensveis o bastante para detectar DNA do parasita diretamente em tecidos infectados de camundongos e humanos. Principais Concluses Foram identificados 8 novos locos de microssatlites polimrficos no genoma de T. cruzi. Foi padronizada a tcnica capaz de amplificar microssatlites em clulas nicas de T. cruzi separadas por FACS cell sorter.

Slide 45

Colaboradores Dr. Egler Chiari, Afonso e Orlando (Dep. Parasitologia, ICB/UFMG) Dr. Octvio Fernandes e Regina Mangia (FIOCRUZ, RJ) Dra. Bianca Zingales (USP, SP) Dr. Michel Tybairenc (Montpellier, Frana) Dra. Riva de Paula Oliveira e Helder (UFOP) Dra. Santuza Teixeira, Dra. Maria de Ftima Horta, e o pessoal do laboratrio Funcionrios: Neuza, Ktia, Mriam e Cssio Povo do LGB Dra. Eliane Lages (Faculdade de Medicina do Tringulo Mineiro) Dr. Olindo Martins Filho (CPqRR)

Slide 46

Laboratrio de Gentica - Bioqumica, UFMG Grupo dos Cruzi Jorge Simone Renato Prof. Andra Macedo Juliana E o Charles...