ANALISIS DE LA PRESENCIA DE PUNTOS CALIENTES (HOT SPOTS)

RECOMBINANTES EN EL GENOMA DE LOS ASTROVIRUS

ZULAY ARIZA ESCAMILLA

PROYECTO DE TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR AL TITULO DE:

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

DIRECTOR:

JUAN CARLOS ULLOA, Ph.D

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C

2009

ANALISIS DE LA PRESENCIA DE PUNTOS CALIENTES (HOT SPOTS)

RECOMBINANTES EN EL GENOMA DE LOS ASTROVIRUS

ZULAY ARIZA ESCAMILLA

APROBADO

INGRID SHULLER Ph.D JANETH ARIAS PALACIOS, M.Sc

DECANA ACADEMICA DIRECTOR(A) CARRERAS DE MICROBIOLOGIA

ANALISIS DE LA PRESENCIA DE PUNTOS CALIENTES (HOT SPOTS)

RECOMBINANTES EN EL GENOMA DE LOS ASTROVIRUS

ZULAY ARIZA ESCAMILLA

APROBADO

JUAN CARLOS ULLOA RUBIANO, Ph.D Dr. CLAUDIA CUERVO, M.Sc.,Ph.D(C)

DIRECTOR (A) JURADO

NOTA DE ADVERTENCIA

“LA UNIVERSIDAD NO SE HACE RESPONSABLE POR LOS CONCEPTOS EMITIDOS

POR SUS ALUMNOS EN SUS TRABAJOS DE TESIS. SOLO VELARA PORQUE NO

SE PUBLIQUE NADA CONTRARIO AL DOGMA Y A LA MORAL CATÓLICA Y

PORQUE LAS TESIS NO CONTENGAN ATAQUES PERSONALES CONTRA

PERSONA ALGUNA, ANTES BIEN SE VEA EN ELLAS EL ANHELO DE BUSCAR LA

VERDAD Y LA JUSTICIA”

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

TABLA DE CONTENIDO

1. Resumen.

2. Introducción.

3. Estado del arte.

3.1Generalidades sobre los astrovirus.

3.2 Papel de la recombinación sobre los genomas virales.

3.3Analisis previos que predicen posibles recombinaciones génicas entre astrovirus.

4. Formulación del problema y Justificación.

4.1Pregunta de investigación.

4.2Tipo de estudio.

4.3Población.

4.4 Justificación

5. Objetivos.

5.1General.

5.2Específicos

6. Metodología.

6.1Revision y recolección de secuencias génicas de astrovirus indexados en

Genbank.

6.2 Verificación y clasificación de las secuencias.

6.3 Alineamientos múltiples y edición de las secuencias.

6.4 Análisis de Recombinación génica a partir de los alineamientos.

7. Flujograma.

8. Resultados.

8.1 Revisión y clasificación de secuencias génicas de astrovirus indexados en

GenBank.

8.2 Alineamientos.

8.3 Análisis de recombinación génica.

9. Discusión.

10. Conclusiones.

11. Recomendaciones.

12. Bibliografía.

13. Anexos.

13.1 Análisis de recombinación génica del genoma completo de Avastrovirus

13.2 Análisis de recombinación génica del ORF1a de Avastrovirus

13.3 Análisis de recombinación génica del ORF1b de Avastrovirus

13.4 Análisis de recombinación génica del ORF2 de Avastrovirus.

13.5 Análisis de recombinación génica para secuencias del ORF2 de Mamastrovirus

13.6 Análisis de recombinación génica para secuencias del ORF1a de Mamastrovirus

13.7 Análisis de recombinación génica para secuencias del ORF1b de Mamastrovirus

1. RESUMEN

La recombinación es un fenómeno que ha sido previamente estudiado, principalmente en

virus que poseen como material genómico ARN el cual se caracteriza por realizar un

intercambio de segmentos de ARN que componen el genoma viral, como es el caso de

astrovirus (AstVs). Estudios previos han analizado la recombinación y la estrecha relación

evolutiva que se presenta entre astrovirus humanos (HAstVs) y astrovirus porcinos

(PAstVs). En este estudio se determinó si algunos genomas de los astrovirus que infectan

mamíferos y aves pueden sufrir eventos de recombinación. Para ello se llevó a cabo una

clasificación de secuencias de AstVs disponibles en GenBank, posteriormente se

realizaron alineamientos múltiples y finalmente el análisis de recombinación que

determinó la presencia de puntos calientes “Hot Spots’’ a lo largo del genoma de los

astrovirus en los tres marcos de lectura abierta que lo componen.

2. INTRODUCCIÓN

La bioinformatica como disciplina, ha sido diseñada para analizar de manera más eficiente

toda la información biológica; se utiliza para responder preguntas acerca de los genomas

de los organismos y en nuestro caso de los virus, ayudando en la predicción de cambios

generados por la variación génica de estos.

Los constantes cambios que ocurren sobre los genomas virales pueden ser producidos

por varias fuerzas evolutivas como la recombinación, los cuales han permitido que los

virus expresen características que pueden verse reflejadas en su transmisión entre las

distintas especies ( Lukashov,2002 ;Wang, 2001). En el caso de virus con ARN, las

recombinaciones génicas han sido descritas como un mecanismo significativo envuelto en

la dispersión viral, considerándose en algunos casos benéfico para la perpetuación de

estos ( Lukashov,2002 ;Wang, 2001).

Hoy en día se pueden predecir señales de eventos recombinatorios a partir de genomas

virales.

Los paquetes o software disponibles para ejecutar este tipo de análisis se basan en

cálculos estadísticos que detectan a partir de alineamientos múltiples de secuencias

nucleotídicas, aquellas regiones que potencialmente pueden sufrirlos.

Varios reportes han mostrado que existe una relación evolutiva cercana entre los

astrovirus que infectan humanos, felinos y porcinos, principalmente en el marco de

lectura abierta que codifica para la proteína estructural (Lukashov, 2002; Wang, 2001;

Jonassen, 2001). Por otra parte se ha propuesto que la recombinación génica puede estar

involucrada en una posible transmisión inter-especies.

El presente estudio pretendió analizar si los genomas de los astrovirus que infectan tanto

mamíferos como aves podrían estar sujetos a sufrir recombinación génica, evento que

podría implicar un posible mecanismo de dispersión viral.

3. ESTADO DEL ARTE

3.1 Generalidades sobre los Astrovirus (AstVs).

La familia Astroviridae comprende tanto virus humanos como animales y se encuentra

dividida en dos géneros; aquellos que infectan mamíferos (Mamastrovirus), compuesto

por virus humanos (HAstVs), felinos (FAstVs), ovinos (OAstVs), porcinos (PAstVs),

murciélagos (BAstVs), ratones (MAstVs) y bovinos y aquellos que infectan aves

(Avastrovirus) como los astrovirus de patos (DAstVs), pollos (CAstVs), pavos (TAstVs) y el

virus de la nefritis aviar (ANV).

Los astrovirus fueron descritos por primera vez en el año 1975 por Madeley y Cosgrove;

al ser vistos por microscopia electrónica (ME) (Fig1) a partir de la cual se observaron en

forma de estrella con 5 a 6 puntas (Madeley,1975). Así mismo, se caracterizan por ser

virus desnudos, pequeños y redondos cuyo diámetro se encuentra entre los 28 a 32 nm,

presentan un genoma ARN monocatenario (solo posee una cadena) de polaridad positiva

dividido en tres marcos abiertos de lectura (ORFs: Open Reading Frames) denominados

ORF1a, ORF1b y ORF2 (Wang,et al 2001). Los dos primeros ORFs, se encuentran

localizados en los extremos 5’ y codifican proteínas no estructurales, conteniendo

dominios de serinaproteasa y una ARN polimerasa dependiente de ARN que se

encuentran implicadas en la replicación viral. El ORF2 en cambio, se encuentra localizado

en el extremo 3’ y codifica una poliproteína que compone la estructura capsidica.

FIG1: Microfotografía por Microscopia Electrónica (ME) de Astrovirus humanos (McNulty, 1994)

Dado que es un virus que presenta una aparente morfología en forma de estrella y debido

a su tamaño, se ha hecho difícil su detección y por esto se han desarrollado otros

métodos más específicos, sensibles y accesibles basados en las propiedades genómicas

y antigénicas del virus para su diagnóstico. Los métodos más empleados para la

identificación de este virus incluyen técnicas como ELISA (Enzimed-linked

Immunoabsorbent Assay), inmunofluorescencia indirecta y RT-PCR (Polimerase Chain

Reaction with Reverse Transcriptase) (Bass et al., 2000).

Los AstVs han sido detectados en diferentes especies animales incluyendo seres

humanos y son reconocidos como uno de los principales agentes virales causantes de

gastroenteritis infantil en todo el mundo, siendo esta la segunda causa común de diarrea

viral entre la población. El periodo de incubación del virus es de 3 a 4 días, los principales

síntomas de la enfermedad causada por estos virus son: diarrea, seguida de náuseas,

vómito, fiebre, malestar general, dolor abdominal, y deshidratación y permanecen de 2 a

3 días pero pueden persistir hasta 12 días, sobre todo en individuos

inmunocomprometidos (Méndez et al.,2006), la forma de infección que se presenta por

parte de los AstVs se da por vía oro-fecal y entre las características epidemiológicas

importantes se ha encontrado que afecta principalmente niños con edades inferiores a los

dos años, se encuentra ampliamente distribuido a nivel mundial y pueden llegar a co-

infectar con otros virus (Gutiérrez et al., 2005).

3.2 Papel de la recombinación sobre los genomas virales.

Los cambios generados sobre los genomas virales como por ejemplo las recombinaciones

génicas, están determinadas por fuerzas evolutivas que ejercen presiones selectivas que

pueden favorecer la dispersión viral o por el contrario ejercer un efecto deletéreo sobre

estos (Worobey et al.1999). Las fuerzas evolutivas son procesos que rompen el equilibrio

génico de una población, cambian o modifican su composición genética a través del

tiempo y conllevan, por tanto a la evolución. Las recombinaciones génicas y las

mutaciones son un ejemplo claro de lo que son las fuerzas evolutivas.

La recombinación génica es la formación de nuevas combinaciones de fragmentos de

material genético, procedentes de diferentes genomas o diferentes zonas de un mismo

genoma, de esta forma una molécula de ARN aceptora incluye secuencias de una

molécula de ARN donante y genera una nueva molécula.

En el caso de los virus con ARN, las recombinaciones génicas ocurren con una mayor

frecuencia y les sirve en última instancia para especializarse en diversos mecanismos de

transmisión a través de sus huéspedes, generando a su vez nuevos genotipos a través

del intercambio de material genético entre secuencias homólogas, aumentando entonces

la variabilidad genética de dicha población viral (Worobey et al.1999). La recombinación

desempeña un papel significativo en la evolución de los virus con ARN mediante la

generación de variación genética, al reducir la carga mutacional, y mediante la producción

de nuevos virus.

Inicialmente, las recombinaciones pudieron haber tenido una funcionalidad de poco

impacto y sin daños que llegaran a afectar de manera directa a sus huéspedes, pero solo

con el paso del tiempo fueron tomando fuerza y generaron cambios sobre la funcionalidad

biológica desarrollando formas más complejas de supervivencia y causando daño a sus

hospederos (Speroni et al.,2006).

La recombinación entre virus de ARN se da cuando ocurren co-infecciones donde dos

virus similares (homólogos) o diferentes (heterólogos) se replican y dan lugar a la

formación de nuevos viriones cuyo material genético es compartido y por supuesto, puede

conllevar a cambios fenotípicos que pueden definir la infección de nuevos huéspedes.

Adicionalmente, otros estudios han demostrado que los virus son capaces de incorporar

en sus genomas, secuencias de nucleótidos que se encuentran dentro de los hospederos

y que posiblemente introducirán a otra célula que pertenezca a otro huésped diferente; es

así como los virus van ayudando a la evolución, transmitiendo la información genética

entre las diferentes especies (Turner et al,1999).

Existe tanta diversidad en virus ARN que su propia naturaleza recombinatoria imposibilita

una forma exacta de estudio en cuanto a su taxonomía y filogenia; dicha diversidad se

debe a sus altas tasas de mutación y reproducción, a la capacidad de intercambio de

material genético entre sí, a la adquisición de genes de sus células huéspedes y por la

forma y el tamaño de las partículas víricas que componen los virus, pero los avances

científicos y el acceso a nueva información y datos del genoma de los virus han permitido

que métodos como los filogenéticos faciliten la detección de la recombinación presente en

los virus y de esa manera sea más fácil su caracterización, evidenciando la posible

recombinación no solo entre virus de un solo tipo sino entre varios virus que puedan llegar

a estar relacionados (Lukashov et al., 2002).

A medida que los huéspedes evolucionan, así mismo lo hacen los virus. Es de esta

manera como se crea una co-evolución entre estos y se garantiza que si el huésped es

capaz de sobrevivir y de resistir cambios evolutivos y genéticos, de igual manera los virus

obtendrán su supervivencia (Pantin et al., 2005).

3.3 Análisis previos que predicen posibles recombinaciones génicas entre

astrovirus.

Previos análisis filogenéticos han mostrado una estrecha relación entre los astrovirus que

infectan humanos, gatos y cerdos (Hemert, 2007; Jonassen, 2001)

En general, el gen que codifica para la caside (ORF2), ha sido el gen más utilizado para

realizar análisis filogenéticos que han mostrado una estrecha relación evolutiva entre

astrovirus que infectan humanos, felinos y porcinos. Adicionalmente, se ha visto que los

astrovirus que infectan aves no están tan relacionados con los demás, formando un grupo

filogenético diferente entre todos los astrovirus (Lukashov et al 2002).

Lukashov y col., propusieron que los astrovirus pudieron co-evolucionar con sus

huéspedes desde las aves, pasando por las ovejas, cerdos y gatos, hasta llegar a infectar

a los humanos. Este comportamiento evolutivo fue mostrado cuando se analizaron los tres

genes que componen el genoma de los astrovirus (Lukashov et al 2002).

A partir de estas observaciones se ha propuesto que el ancestro más cercano de los

astrovirus que infectan humanos puede ser el astrovirus de gatos (FAstVs) y/o los de

cerdo (PAstVs). Por esto se podría esperar que ocurrieran eventos recombinatorios

significativos entre las secuencias génicas de estos.

4. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

4.1 Pregunta de investigación

¿Existen puntos calientes (hot spots) recombinantes en el genoma de los astrovirus que

infectan mamíferos y aves?

4.2 Tipo de estudio

Trabajo de tipo descriptivo observacional, de corte transversal prospectivo.

4.3 Población

Se entrará a hablar de una población que consiste de 6200 secuencias parciales y totales

del genoma de los AstVs, disponibles en el banco de genes (GenBank) del NCBI (National

Center for Biotechnology Information).http:// www.ncbi.nclm.nih.gov/GenBank/index.html).

4.4 Justificación

No se conoce si puede haber una transmisión de astrovirus inter-especies, así mismo no

se conoce si el genoma de los astrovirus pueden recombinar y si existen posibles sitios

que tienden a sufrir más estos fenómenos como lo son los “Hot Spots” (sitios específicos

del genoma de diferentes especies que son iguales con otras especies diferentes) por tal

razón es importante realizar el análisis para saber si dichos eventos recombinatorios se

están presentando a nivel del genoma de los astrovirus que infectan mamíferos y aves.

5. OBJETIVOS

5.1General

Detectar puntos calientes (hot spots) recombinantes en el genoma de los astrovirus que

infectan mamíferos y aves.

5.2 Específicos

5.2.1 Recolectar y clasificar secuencias nucleotídicas completas que estén disponibles en

GenBank a partir de cada uno de los genes de los astrovirus que infectan mamíferos y

aves.

5.2.2Detectar señales de recombinación génica entre las secuencias nucleotídicas

recolectadas de astrovirus que infectan mamíferos y aves.

6. METODOLOGÍA

6.1 Recolección de secuencias génicas de astrovirus indexadas en GenBank.

Se recolectaron secuencias génicas completas de cada uno de los tres marcos de lectura

abierta (ORF1a, ORF1b, ORF2) que componen el genoma de los AstVs que infectan

mamíferos como (HAstVs, FAstVs, PAstVs, DogAstVs, BAstVs, OAstVs, SAstVs, MAstVs)

y aves, al igual que secuencias del genoma completo a partir de la base de datos del

GenBank del NCBI (National Center for Biotechnology Information.

(http://www.ncbi.nclm.nih.gov/GenBank/index.html).

6.2 Verificación y clasificación de las secuencias

Todas las secuencias escogidas fueron clasificadas verificando el marco de lectura al que

pertenecían dentro del genoma de los AstVs, teniendo en cuenta la información

proporcionada por la base de datos e igualmente comparadas con otras secuencias

génicas mediante el programa BLAST (Basic Local Aligment Search Tool)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov./blast/Blast.cgi).

6.3 Alineamientos múltiples y edición de las secuencias.

Verificadas las secuencias de AstVs y clasificadas de acuerdo al marco de lectura al que

pertenecen y también si representaban el genoma completo, estas fueron alineadas

usando el programa Clustal W, contenido en el programa MEGA 4.01, el cual se encarga

de alinear las secuencias seleccionadas para poder considerar las semejanzas o

diferencias entre ellas. Posteriormente fueron editadas con base a la distribución

genómica de cada una de ellas.

El genoma de los astrovirus se compone de tres marcos de lectura abierta, donde el

ORF1a comienza desde el nucleótido 200 hasta el nucleótido 2800; el ORF1b que va

desde el nucleótido 2800 hasta 4100 y finalmente el ORF2 que va desde 4200 hasta

6700. Con base en esta división se realizo la edición de las secuencias tomando cada uno

de los genes y cortándolos de acuerdo al rango de la longitud.

6.4 Análisis de recombinación génica a partir de los alineamientos múltiples

realizados.

Cada uno de los alineamientos (ORF1a,ORF1b,ORF2 y secuencias de genoma completo)

fueron incluidos en el programa RDP3 (Recombination Detection Program, versión Beta

3.1) que sirve para detectar señales de recombinación génica basada en la comparación

de tripletas de secuencias de nucleótidos. (Martín et al.,2005). Este a su vez incluye 10

paquetes estadísticos que se pueden aplicar al mismo tiempo (Chimaera, GENECONV,

Bootscanning, LARD, 3Seq, MaxChi Square, Sister Scanning, SiScan, TOPAL DSS y

LDHAT) para la detección de las señales de recombinación, expresando valores

probabilísticos significativos usando un valor máximo de P=0.05 (Martin et al.,2010).

El programa RDP3 utiliza una mezcla de métodos filogenéticos y estadísticos para

identificar la evidencia de los probables sitios de recombinación (Hot Spots) dentro de las

secuencias, de igual forma presenta de forma grafica aquellas regiones que tienen la

mayor probabilidad estadística de sufrir recombinaciones (Heath et al .,2006).

7. DIAGRAMA DE FLUJO

Verificación y clasificación de las secuencias

(http://www.ncbi.nclm.nih.gov/blast/Blast.cgi)

Alineamientos múltiples en clustal W/Mega 4.01

Edición de las secuencias

Análisis de recombinación génica (RDP3)

Recolección de secuencias génicas de astrovirus

(http://www.ncbi.nclm.nih.gov/GenBank/index.html)

8. RESULTADOS

8.1 Recolección y clasificación de secuencias génicas de AstVs indexadas en GenBank. Se recolectaron 15 secuencias del genoma completo de HAstVs, 57 secuencias del ORF2

de HAstVs, 1 secuencia del ORF2 de PAstVs, 1 secuencia del ORF2 de FAstVs, 3

secuencias de DogAstVs,1 secuencia del genoma completo de SAstVs, 1 secuencia del

genoma completo de MAstVs, 4 secuencias del ORF1b de BAstVs, 6 secuencias del

ORF2 de BAstVs, 10 secuencias del genoma completo de BAstVs, 2 secuencias del

ORF2 de TAstVs, 12 secuencias del genoma completo de TAstVs, 2 secuencias del

genoma completo de DAstVs,1 secuencia del genoma completo de CAstVs, una

secuencia del ORF2 de ANV,1 secuencia de genoma completo de ANV. Tabla 1.

Tabla1.Descripcion de las secuencias génicas de Astvs recolectados a partir del GenBank

Tipo de AstVs ORF1a ORF1b ORF2 Genoma Completo

HAstVs(astrovirus Humano)

AY720891, AF141381, AF260508,L23513,Z25771, AB308374, L13745, FJ755402-FJ755405 DQ070852, DQ028633, DQ344027, Y720892.

AB009984,AB009985, AB000283-B000301, EF138823-EF138831, AB025801-AB025812 DQ630763,AB013618,

Z33883, Y08632, Z66541, Z46658, U15136, S68561,

L06802, AB031030, AB031031,AB037273, AB037274, F583300,

AF117209.

FJ755402-FJ755405 DQ070852,DQ028633, DQ344027, Y720892,

AY720891, AF141381, AF260508,L23513,Z25771,

AB308374, L13745.

PAstVs(astrovirus

porcino) Y15938

FAstVs(astrovirus

Felino) AF056197

DogAstVs(astrovirus

de perro) FM213330-FM213332

SAstVs(astrovirus de

oveja) Y15937 Y15937

MAstVs(astrovirus de

raton) AY179509

BAstVs(astrovirus de

murcielago) FJ571065-

FJ571068 FJ571069-FJ571074 EU847146-EU847155

TAstVs(astrovirus de

pavo) Y15936, AF20666,

NC_002470. AY769615, AY769616 EU143843-EU143851,

Y15936, AF20666,NC_002470,

DAstVs(astrovirus de

pato) FJ434664, NC012437

CAstVs(astrovirus de

pollo) NC_00379

ANV(astrovirus de la

nefritis aviar) AB046864 AB033998

8.2 Alineamientos múltiples con las secuencias recolectadas

Todas las secuencias recolectadas fueron alineadas usando Clustal W incluido en el

programa Mega 4.01 y posteriormente fueron editadas, obteniendo así cada uno de los

fragmentos que componen los tres marcos de lectura abierta (ORF1a ORF1b y ORF2) o

la secuencia del genoma completo.

8.3 Análisis de recombinación génica.

Los alineamientos anteriormente realizados se incluyeron en el programa RDP3 y fueron

analizadas utilizando los 10 paquetes disponibles en el programa bajo condiciones por

defecto para cada uno. Se presentan los posibles sitios donde se presentan los “Hots

Spots’’ recombinantes en el genoma de los AstVs tanto en Mamastrovirus como de

Avastrovirus. Anexos 13.1,13.2,13.3,13.4,13.5,13.6 y13.7.

9. DISCUSIÓN

La obtención y revisión de secuencias génicas de los astrovirus fue posible gracias al uso

de la base de datos NCBI lo cual permitió obtener un total de 119 secuencias de los

astrovirus tanto de mamíferos como de aves gracias al acceso que se tuvo al banco de

genes GenBank del NCBI (National Center For Biotechnology Information).

Al realizar los alineamientos múltiples de las secuencias seleccionadas para el estudio se

buscaron porciones de las secuencias que tuvieran zonas de similitud entre ellas y fue

posible realizar comparaciones con base en las identidades presentes en cada una de

ellas.

Así mismo se excluyeron del estudio aquellas secuencias que presentaron un alto grado

de variabilidad con respecto a otras. En este caso 3 secuencias de HAstVs mostraron alta

variabilidad y por esto fueron excluidas (núm. de acceso FJ402983, AB325804,

FJ222451).

La elaboración de los alineamientos permitió identificar regiones altamente conservadas

presentes en cada uno de los genes de interés como lo fue la región conservada del

ORF2 de los astrovirus, teniendo en cuenta que el ORF2 dentro del genoma de los AstVs

comienza alrededor del nucleótido 4100 y se extiende hasta el nucleótido 6700,Ubicando

entonces la región conservada del la cual se ubica desde el nucleótido 4100 y de igual

modo la región variable del ORF2 que comienza con el aminoácido 416 y que va hasta el

carboxiterminal, por ser muy variable es un dominio muy importante para el ensamblaje

del virus.

La recombinación es un fenómeno que ha sido estudiado en virus que poseen tanto

material ARN como ADN. Dos tipos de intercambio genético operan en virus con ARN, el

primero es un reordenamiento de genes (reassortment) que ocurre en los virus ARN

multipartitas y monopartitas cuya polaridad puede ser positiva, particularmente

intercambiando una o más de sus moléculas ARN que componen el genoma viral, los

AstVs se caracterizan por tener un genoma ARN de polaridad positiva, es decir, aquellos

cuyo genoma actúa como ARN mensajero y por lo tanto son capaces de iniciar un nuevo

ciclo replicativo en ausencia de proteínas virales(ejemplo poliovirus, virus hepatitis C),

llevando a cabo la replicación de su genoma en complejos proteínicos asociados en el

interior de estructuras celulares que contienen membranas (Mendez 2002). Dicha

redistribución se aplica como ejemplo al virus de la influenza A, en donde se muestra el

potencial evolutivo del virus y la importancia de que ocurran estos eventos. (Worobey,

1999). Estos cambios se ven reflejados continuamente en este virus sufriendo desde

pequeños cambios antigénicos, hasta la aparición e introducción de nuevos virus en

poblaciones que antes no se consideraban vulnerables y que generan a su vez un

aumento en su eficiencia de trasmisión.

El segundo es un mecanismo de recombinación por el cual los virus con ARN tienden a

combinar su genoma que se explica con un modelo propuesto denominado “copy-choice”;

Hasta la fecha, casi todos los estudios sobre los mecanismos de la recombinación de los

virus de ARN han apoyado este modelo presentado originalmente en el caso del virus del

poli o poliovirus (Cooper et al.,1974), este modelo explica como ocurre un salto de la

polimerasa de una plantilla a otra mientras copia el ARN. Bajo este modelo, las “roturas”

en el ARN estarían obligando a la ARN polimerasa a cambiar de molde o de plantilla

restaurando así la continuidad del genoma. Las características de este modelo es que la

recombinación ocurre sólo durante la síntesis de ARN (Pantin-Jackwood,2006).

Es necesario destacar que es la primera vez que se realiza este tipo de estudio con los

AstVs, aunque análisis previos se realizaron con los Picornavirus en los cuales se

incluyeron también secuencias de HAstVs.

Se ha reportado que el gen que codifica para la capside (ORF2) se caracteriza por tener

una alta variabilidad hacia el extremo 3’ (Pantin-Jackwood, 2006; Wang, 2001) y posee

además dos regiones que codifican principalmente tres proteínas donde la primera está

involucrada en el ciclo replicativo del virus tales proteínas son la (VP34,VP25,VP27),

dichos cambios generados a nivel del genoma ocurren con mayor tendencia en la región

variable del ORF2, puesto que es allí donde se encuentran las puntas o las espículas del

virus (Krishna, 2005).Adicionalmente análisis bioinformaticos realizados previamente a la

capside de los AstVs mostro una relación cercana y una alta similitud entre astrovirus

porcinos y astrovirus humanos (PAstVs –HastVs) (Lukashov, 2002; Wang, 2001).

Según Wang (2005) en la región variable del ORF2 se describe una zona que se

comparte entre astrovirus humanos porcinos y felinos (Wang, 2001).

Así mismo estudios filogenéticos realizados se han basado en observar el grado de

similitud que presentan las secuencias proteicas de la capside de los astrovirus tanto de

humanos como de animales y sugieren la posibilidad de una posible transmisión entre

especies, involucrando a los gatos, cerdos y humanos, hipótesis que fue replanteada por

Lukashov y Goudsmit (2002) quienes atribuyen que la introducción de los astrovirus en la

población humana se produjo por la transmisión de una única especie, y que la suma de

cambios a lo largo de la historia evolutiva de estos virus tuvieron lugar fenómenos de

recombinación entre las diferentes especies (Lukashov & Goudsmit,2002).

Diferentes estudios realizados a partir del genoma de los AstVs reportan secuencias

genómicas completas del virus, pero para el caso de astrovirus porcinos se dispone de

una única secuencia del ORF2, y si bien lo reportado por Lukashov y colaboradores

demuestra que los análisis realizados a esta secuencia describen la relación evolutiva con

HAstVs.

A partir de nuestros análisis de recombinación fue posible deducir que los tres marcos de

lectura pueden presentar recombinación y presentan Hot Spots en porciones específicas

de estos.

De acuerdo a los resultados observados en las recombinaciones de los diferentes marcos

de lectura abierta se observó que los sitios que mostraron una mayor probabilidad de

presentar Hot Spots a lo largo del genoma de los AstVs fueron el ORF1b de los

Mamastrovirus que codifica para la polimerasa viral, al igual que la región variable del

ORF2 tanto de Mamastrovirus como de Avastrovirus, en contraste con la región

conservada del ORF2 la cual presento menos eventos de recombinación. Anexos 13.4,

13.5 y 13.7

Las zonas que presentaron mayor significancia en cuanto a posibles puntos calientes o

Hot Spots, pertenecientes a Mamastrovirus y Avastrovirus se representan mediante los

plots o graficas resultado de la posterior recombinación utilizando el programa de RDP,

fueron las regiones comprendidas éntrelos nucleótidos 1440 y 2160 siendo estas las

zonas que tuvieron mayor identidad, pertenecientes a ORF2 de Mamastrovirus, al igual

que las regiones comprendidas éntrelos nucleótidos 5892 y 7800 para el ORF2 de

Avastrovirus y finalmente la región del ORF1b de Mamastrovirus cuyas zonas se

encontraron en las regiones nucleotidicas comprendidas éntre 390 y 781. Anexos

13.4,13.5,13.7.

Sin embargo, no fue posible determinar las recombinaciones utilizando el genoma

completo de los AstVs que infectan mamíferos, debido a su gran longitud y número de

secuencias, porque el equipo utilizado fue incapaz de desarrollar los cálculos.

10. CONCLUSIONES

Se detectaron señales de recombinación en las secuencias nucleotidicas

analizadas de AstVs en los tres marcos de lectura abierta.

Las zonas que presentan posibles “Hot Spots” recombinantes en el ORF1a,

ORF1b y ORF2 son respectivamente las porciones nucleotidicas 2024, 2333 y 550

respectivamente.

Se observó que hacia el 3’del ORF2 podrían encontrarse con mayor frecuencia

los posibles “Hot Spots” recombinantes en el génoma de los AstVs.

11. RECOMENDACIONES

Para estudios posteriores se recomienda utilizar un equipo con un procesador

más rápido, con el fin de determinar con mayor facilidad los resultados esperados.

Analizar si los sitios donde hay posibles “Hot Spots” a lo largo del genoma de

AstVs corresponden a zonas biológicas funcionales.

Se recomienda estudiar aquellas relaciones evolutivas que se puedan llegar a

presentar entre HAstVs (astrovirus humano) con BAstVs (astrovirus de murciélago)

y los cambios que se puedan generar a nivel del genoma de los AstVs.

12. BIBLIOGRAFÍA

Bass D, Qiu S. Proteolytic Processing of the Astrovirus Capsid Department of Pediatrics.

Journal of virology 2000; 74(4): 1810–1814.

Belliot G, Laveran H, Monroe S. Detection and genetic differentiation of human

astroviruses: phylogenetic grouping varies by coding region. Archives of Virology 1997;

142(7):1323–1334.

Cooper A, Steiner-Pryor D, Scotti P, Delong D. On the Nature o f Poliovirus Genetic

Recombinants. Journal of Virology I974; 23: 4r-49

Gutiérrez M, Matiz A, Ulloa J, Alvarado M. Astrovirus (HAstV) como agente causal de

diarrea en niños Colombianos: Siete años de estudio Laboratorio de Virología, Grupo de

Enfermedades Infecciosas. Nova 2005;120(1):1794-2470.

Heath L, Walt E, Varsani , Martin D. Recombination hotspot test. Recombination patterns

in aphthoviruses mirror those found in other picornaviruses. Journal of Virology 2006; 80,

11827-11832.

Jiang B, Monroe S, Koonin E, Stine S, Glass R. RNA sequence of astrovirus: distinctive

genomic organization and a putative retrovirus-like ribosomal frameshifting signal that

directs the viral replicase synthesis. PubMed 1993; 90(22):10539-43.

Krishna N. Identification of structural domains involved in Astrovirus capsid biology. Vir

Immunol 2005; 18(1):17-26.

Lai M. RNA recombination in animal and plant viruses. Microbiological Reviews 1992;61-

79

Madeley C, Cosgrove B. 28 nm particles in faeces in infantile gastroenteritis. Lancet 1975;

2:451-452.

Martin D, Williamson C, Posada D. RDP2: recombination detection and analysis from

sequence alignments. Bioinformatics 2005; 21: 260-262.

Martin DP, Lemey P, Lott M, Moulton V, Posada D, Lefeuvre P. RDP3: a flexible and fast

computer program for analyzing recombination. Bioinformatics 2010; 26, 2462-2463.

Martos S. Dinámica evolutiva de virus RNA tesis doctoral. Facultad de ciencias.

Departamento de biología molecular, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, 2008,

120p.

Mendez E, Arias C. Clinical Virology Tercera edición. ASM Press. EE.UU.2006;

29(1):981–1000.

Pantin-Jackwood M, Spackman E, Woolcock P. Phylogenetic analysis of turkey

astroviruses reveals evidence of recombination. Virus genes 2005; 32:187-192.

Speroni S, Rohayem J, Nenci S, Bonivento D, Robel I, Barthel J, Luzhkov VB, Coutard B,

Canard B, Mattevi A. Structural and biochemical analysis of human pathogenic astrovirus

serine protease at 2.0 A resolution. Journal of Molecular Biology. 2006; 387(5):1137-52.

Turner P, Burch C, Hanley K, Chao L. Hybrid frequencies confirm limit to coinfection in the

RNA bacteriophage 6. Journal of Virology 1999; 73(3): 2420-2424.

Lukashov V, Goudsmit J. Evolutionary relationships among Astroviridae Journal of General

Virology 2002; 83: 1397-1405.

Wang QH, Kakizawa J, Wen LY, Shimizu M, Nishio O, Fang ZY, Ushijima H. Genetic

analysis of the capsid region of astroviruses. Journal of medical virology 2001;64(3):245-

55.

Worobey M, Holmes E. Evolutionary aspects of recombination in RNA viruses. Journal of

General Virology 1999; 80: 2535–2543.

Consulta páginas web

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ consulta realizada el 1 de Agosto/2009

http://bibliotecadigital.ilce.edu.mx/sites/.../sec_18.htm - / XIV el origen de

los virus /consulta realizada el 1 de Agosto/2009.