Anaplasma platys e Ehrlichia canis em cães: Avaliação de alterações oculares ... ·...
Transcript of Anaplasma platys e Ehrlichia canis em cães: Avaliação de alterações oculares ... ·...
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
Anaplasma platys e Ehrlichia canis em cães: Avaliação de alterações
oculares, desenvolvimento e validação de técnica de diagnóstico molecular
Hérika Xavier da Costa
Orientador: Prof. Dr. Guido Fontgalland Coelho Linhares
GOIÂNIA
2015
HÉRIKA XAVIER DA COSTA
Anaplasma platys e Ehrlichia canis em cães: Avaliação de alterações
oculares, desenvolvimento e validação de técnica de diagnóstico molecular
Tese apresentada para a obtenção do título de
Doutor em Ciência Animal junto à Escola de
Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de
Goiás
Área de Concentração:
Sanidade Animal e Higiene e Tecnologia de
alimentos
Linha de pesquisa:
Parasitos e doenças parasitárias
Orientador:
Prof. Dr. Guido F, Coelho Linhares – EVZ/UFG
Comitê de Orientação:
Dra. Sabrina Castilho Duarte- EMBRAPA/SC
Prof (a). Dra. Valéria de Sá Jayme- EVZ/UFG
GOIÂNIA
2015
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, agradeço a Deus por mais este presente e por tudo que aprendi
nos últimos quatro anos. Aos meus pais, Maria Bernadete e Arcidino, que foram os maiores
responsáveis pela minha formação e desenvolvimento humano. Os senhores são meu orgulho.
Ao meu querido orientador Prof. Dr. Guido F. C. Linhares pela imensa paciência,
incrível competência e por todo apoio, incentivo, ensinamentos e generosidade em repassar
seus conhecimentos.
Á minha amiga Sabrina por ter me oferecido seu apoio quando eu mais precisei. A
sua ajuda foi imprescindível para o desenvolvimento deste trabalho. Você é um dos anjos que
Deus colocou na minha vida. Obrigada por estar ao meu lado mesmo distante, me dando força
e me colocando para cima, sempre com palavras positivas e bom humor, tornando mais leves
os problemas do dia a dia.
Aos meus grandes amigos e familiares pela ajuda, imensa paciência e
compreensão. Agradeço por vocês entenderem o motivo das minhas ausências em diversas
reuniões.
Aos médicos veterinários, todos os funcionários e diretoria do Hospital
Veterinário Pluto pela imensa disponibilidade em ajudar e por disponibilizar as amostras
sanguíneas e os dados dos animais utilizados no presente estudo.
À oftalmologista veterinária, Camila Donatti, por ter realizado exames oftálmicos
minuciosos em todos os cães identificados com alterações oculares.
À FAPEG por conceder o financiamento necessário para o desenvolvimento e
execução da pesquisa que culminou na minha tese de doutorado.
Agradeço a todos os funcionários da UFG por serem tão prestativos e
acolhedores.
À professora Valéria de Sá Jayme por ter fornecido dicas preciosas para o
desenvolvimento desta pesquisa e ao professor Emmanuel Arnhold por ter auxiliado a
aplicação da estatística.
Aos cães que participaram e contribuíram com esta pesquisa, pois sem eles
nenhuma dessas páginas estaria completa.
A todas as pessoas que, direta ou indiretamente, contribuíram para a execução
dessa tese de doutorado.
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 ........................................................................................................................ 1
CONSIDERAÇÕES INICIAIS .......................................................................................... 1
REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 7
CAPÍTULO 2 ...................................................................................................................... 12
DETECÇÃO ESPECÍFICA POR PCR EM TEMPO REAL DE Anaplasma platys E Ehrlichia
canis .................................................................................................................................... 29
RESUMO ........................................................................................................................ 29
ABSTRACT .................................................................................................................... 29
INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 30
MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 31
RESULTADOS ............................................................................................................... 37
DISCUSSÃO ................................................................................................................... 49
CONCLUSÃO ................................................................................................................. 52
REFERENCIAS ............................................................................................................... 54
CAPÍTULO 3 ...................................................................................................................... 12
DETECÇÃO MOLECULAR DE Anaplasma platys E Ehrlichia canis EM CÃES COM E
SEM ALTERAÇÕES OCULARES ................................................................................. 12
RESUMO ........................................................................................................................ 12
ABSTRACT .................................................................................................................... 12
INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 13
MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 15
RESULTADOS ............................................................................................................... 19
DISCUSSÂO ....................................................................................................................... 23
CONCLUSÃO ................................................................................................................. 25
REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 26
CAPÍTULO 4 ...................................................................................................................... 57
CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................... 57
ANEXO A ........................................................................................................................... 60
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 2
FIGURA 1. Uveíte no olho direito de um cão SRD, macho, de quatro anos com PCR
positivo para E. canis....................................................................................................21
FIGURA 2. Uveíte, hipópio e úlcera de córnea no olho esquerdo de um cão Shih Tzu,
macho, de dois anos com PCR positivo para E. canis.........................................................21
FIGURA 3. Úlcera de córnea no olho esquerdo de um cão SRD, macho, de três anos com
PCR positivo para A. platys...........................................................................................23
CAPÍTULO 3
FIGURA 1. Alinhamento da região correspondente ao gene 16S rRNA de A. platys
(AF156784), A. phagocytophilum (U02521), E. canis (AF162860), E. ewingii (U96436), E.
chaffeensis (U86665), E. bovis (AF294789) e E. risticii (M21290) pelo método de Clustal
W, com localização do iniciador senso espécie-específico AXCf (caixa com bordas
marron), iniciador anti-senso gênero-específico AXCr (caixa com bordas laranja) e
sonda AXC SR (caixa com bordas azul). ........................................................................... 38
FIGURA 2. Alinhamento da região correspondente ao gene 16S rRNA de A. platys
(AF156784), A. phagocytophilum (U02521), E. canis (AF162860), E. ewingii (U96436), E.
chaffeensis (U86665), E. bovis (AF294789) e E. risticii (M21290) pelo método de Clustal
W, com localização do iniciador senso espécie-específico EXCf (caixa com bordas
vermelhas), iniciador anti-senso espécie-específico EXCr (caixa com bordas roxa) e
sonda EXC SR (caixa com bordas verde). ........................................................................ 39
FIGURA 3. Curva de amplificação de A. platys utilizando diferentes concentrações dos
iniciadores AXCf e AXCr (A). Interface do software Step One Plus (v. 2.3) mostrando o
resultado (presença e ausência) da qPCR utilizando diferentes concentrações dos
iniciadores AXCf e AXCr para detecção de A. platys (B). ................................................ 40
FIGURA 4. Curva de amplificação de E. canis utilizando diferentes concentrações dos
iniciadores EXCf e EXCr (A). Interface do software Step One Plus (v. 2.3) mostrando o
resultado da qPCR utilizando diferentes concentrações dos iniciadores EXCf e EXCr
para detecção de E. canis (B). ............................................................................................ 40
FIGURA 5. Curva de amplificação de A. platys utilizando diferentes concentrações da
sonda AXC SR (A). Interface do software Step One Plus (v. 2.3) mostrando o resultado
da qPCR utilizando diferentes concentrações da sonda AXC SR para detecção de A.
platys (B). ............................................................................................................................ 41
FIGURA 6. Curva de amplificação de E. canis utilizando diferentes concentrações da
sonda EXC SR (A). Interface do software Step One Plus (v. 2.3) mostrando o resultado
da qPCR utilizando diferentes concentrações da sonda EXC SR para detecção de E.
canis (B). ............................................................................................................................. 42
FIGURA 7. Teste de especificidade utilizando qPCR para detecção de A. platys
utilizando DNA de C. familiaris, R. sanguineus, A. platys, B. vogeli, E. canis, H. canis e M.
haemofelis (A). Resultado positivo com amplificação específica somente de A. platys (B).
............................................................................................................................................ 44
FIGURA 8. Teste de especificidade qPCR para detecção de E. canis utilizando DNA de
C. familiaris, R. sanguineus, A. platys, B. vogeli, E. canis, H. canis e M. haemofelis (A).
Resultado positivo com amplificação específica somente de E. canis (B). ........................ 44
FIGURA 9. Produtos amplificados através da PCR convencional com Primer PLATYS
F/ EHR16SR. Avaliação da sensibilidade da PCR convencional utilizando 4 diluições de
DNA extraído de cão com exame parasitológico positivo para A. platys e 10 diluições do
DNA de A. platys com diferentes concentrações. Eletrofores em gel de agarose (1,2%)
corado com brometo de etídio. Na canaleta 1 está o marcador de peso molecular de 100
pb (Invitrogen). Nas canaletas de 2 a 5 estão indicadas as amostras com DNA alvo de A.
platys nas diferentes concentrações: 4 fg (16 ng de DNA extraído); 0,9 fg (1,6 ng de DNA
extraído); DNA alvo não quantificado (0,2 ng de DNA extraído) e DNA alvo não
quantificado (0,02 ng de DNA extraído). E nas canaletas 6 a 14 estão o DNA de E. canis
em diluições seriadas na base 10 (14000 fg a 14 x 10-6
fg/2 µL), respectivamente.
Canaleta 16: controle negativo. ......................................................................................... 45
FIGURA 10. Interface do software Step One Plus (v. 2.3) mostrando a curva-padrão do
ensaio de quantificação absoluta. Os pontos vermelhos representam os Cts gerados pelo
Log de cada concentração de DNA padrão. Os pontos azuis representam os Cts gerados
pelo Log de cada concentração de A. platys contidas no DNA extraído do sangue de cão
positivo para A. platys no exame parasitologico direto (A). DNA diluído obtido da
extração de DNA do sangue de cão positivo no exame parasitologico direto para para A.
platys (B). ............................................................................................................................ 45
FIGURA 11. Curva de amplificação de avaliação do limiar e detecção. As linhas
coloridas representam quantidades decrescentes de DNA alvo (14000 fg a 14 x 10-6
fg/2
µL) quanto maior a quantidade de DNA (primeira linha azul), menor o valor de Ct
(menos ciclos de amplificação são necessários para atingir o limiar de detecção). A linha
amarela mostra a boa performance do sistema em detectar até 0,9 fg de A. platys (A).
Resultado da diluição seriada do DNA de A. platys (B). ................................................... 46
FIGURA 12. Produtos amplificados através da PCR convencional com Primer EBR1/
EBR5. Avaliação da sensibilidade da PCR convencional utilizando 4 diluições de DNA
extraído de cão com exame parasitológico positivo para E. canis e 10 diluições do DNA
de E. canis com diferentes concentrações. Eletroforese em gel de agarose (1,2%) corado
com brometo de etídio. Na canaleta 1 está o marcador de peso molecular de 100 pb
(Invitrogen). Nas canaletas de 2 a 5 estão indicadas as amostras com DNA alvo de E.
canis nas diferentes concentrações: 7,48 fg (20 ng de DNA extraído); 1,15 fg (2 ng de
DNA extraído); 0,25 fg (0,2 ng de DNA extraído) e DNA alvo não quantificado (0,02 ng
de DNA extraído). E nas canaletas 6 a 14 estão o DNA de E. canis em diluições seriadas
na base 10 (14000 fg a 14 x 10-6
fg/2 µL), respectivamente. Canaleta 16: controle
negativo. ............................................................................................................................. 47
FIGURA 13. Interface do software Step One Plus (v. 2.3) mostrando a curva-padrão do
ensaio de quantificação absoluta. Os pontos vermelhos representam os Cts gerados pelo
Log de cada concentração de DNA padrão. Os pontos azuis representam os Cts gerados
pelo Log de cada concentração de E. canis contidas no DNA extraído do sangue de cão
positivo para E. canis no exame parasitologico direto (A). DNA diluído obtido da
extração de DNA do sangue de cão positivo no exame parasitologico direto para E. canis
(B). ...................................................................................................................................... 47
FIGURA 14. Curva de amplificação de avaliação do limiar e detecção. As linhas
coloridas representam quantidades decrescentes de DNA alvo (14000 fg a 14 x 10-6
fg/2
µL) quanto maior a quantidade de DNA (primeira linha azul), menor o valor de Ct
(menos ciclos de amplificação são necessários para atingir o limiar de detecção). A linha
cinza mostra a boa performance do sistema em detectar até 0,14 fg de E. canis (A).
Resultado da diluição seriada do DNA de E. canis (B). .................................................... 48
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2
TABELA 1. Resultados dos testes de PCR para detecção de E. canis e A. platys em
amostras de sangue de cães com alterações oculares (CAO) e sem alterações oculares
(SAO) atendidos na cidade de Goiânia- GO, Brasil. ......................................................... 19
TABELA 2. Tipos de manifestações oculares identificadas nos 100 cães pertencentes ao
grupo (CAO). ..................................................................................................................... 22
CAPÍTULO 3
TABELA 1. Valor preditivo (resultado positivo de teste) e valor preditivo (resultado
negativo de teste) do ensaio de qPCR para detecção de E. canis e A. platys. ................... 49
LISTA DE QUADROS
CAPÍTULO 2
QUADRO 1. Tipos de manifestação ocular em cães PCR positivo para A. platys. .......... 23
CAPÍTULO 3
QUADRO 1. Sequências de iniciadores e sondas selecionados para amplificação
específica de fragmentos dos genes 16S rRNA de A. platys e E. canis por qPCR. ........... 43
QUADRO 2- Valores do método de qPCR (TaqMan) para detecção de A. platys e E.
canis. ................................................................................................................................... 52
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
°C Graus Celsius
CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais
Ct Cicle threshold
DNA Deoxyribonucleic acid (ácido desoxirribonucléico)
EDTA Ethylenediaminetetracetic acid
ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
fg Fentogramas
IC Intervalo de confiança
Kit Conjunto diagnóstico
Log Logaritmo
mL Mililitro
ng Nanograma
pb Pares de base
PCR Polymerase chain reaction (Reação em Cadeia da Polimerase)
pmoles Picomoles
qPCR Quantitativa PCR
R2 Coeficiente de correlação
Slope Coeficiente angular
μl Microlitro
RESUMO
Anaplasma platys e Ehrlichia canis são riquétsias intracelulares obrigatórias de cães. A. platys
parasita plaquetas causando a trombocitopenia cíclica infecciosa canina (TCIC), enquanto que
E. canis possui tropismo por células mononucleares circulantes, causando a erliquiose
monocítica canina (EMC). Os sinais clínicos da EMC e TCIC são inespecíficos e comuns a
inúmeras outras enfermidades transmitidas por carrapatos. O diagnóstico definitivo de E.
canis e A. platys é firmado através do emprego de testes de diagnóstico específicos. Dessa
forma, dois novos protocolos de ensaios de PCR em tempo real (qPCR) para o detecção de A.
platys e E. canis foram desenvolvidos a partir de sequências de referência para o gene 16S
rRNA de A. platys e E. canis. Os novos iniciadores e sondas desenhados foram capazes de
detectar A. platys e E. canis. Identificação de infecções naturais em cães por A. platys e E.
canis, previamente confirmada por PCR convencional demonstrou alta correlação na
sensibilidade (100% para A. platys e E. canis) e especificidade epidemiológicas (100% para
A. platys e 98,41% para E. canis) com os novos protocolos de qPCR utilizando sondas de
hidrólise TaqMan. Os testes de especificidade analítica produziram resultado espécie
específicos, não ocorrendo amplificação de DNA dos seguintes hemoparasitos: Babesia
vogeli, Hepatozoon canis e Mycoplasma haemofelis. DNA de Rhipicephalus sanguineus
também não foi amplificado. Os dois novos protocolos de qPCR descritos aqui foram capazes
de detectar até 0,14 fg de DNA de E. canis e 0,9 fg de DNA de A. platys e representam
alternativas como ferramenta de diagnóstico para a detecção específica de A. platys e E. canis,
sendo útil para o diagnóstico dessas hemoparasitoses em cães. As alterações oculares estão
entre os sinais clínicos encontrados em cães infectados com Ehrlichia canis e casos de uveítes
já foram atribuídos a infecção por A. platys, porém a frequência de lesões oculares em casos
de infecção por A. platys ainda é desconhecida. Após pesquisar a frequência de infecções por
E. canis e A. platys em 100 cães com alterações oculares (CAO) e 100 cães sem alterações
oculares (SAO), utilizando-se a PCR como método de diagnóstico, verificou-se que dentre os
hemoparasitos, E. canis e A. platys, detectados e identificados por PCR, E. canis foi o de
maior frequência, tanto no grupo de cães CAO (33%; 33/100) quanto no grupo de cães SAO
(24%; 24/100). A frequência de A. platys foi de 5% (5/100) para o grupo de cães CAO e 4%
(4/100) para o grupo de cães SAO. As alterações oculares que apresentaram relação com a
infecção por E. canis foram uveíte bilateral e descolamento de retina. Não foi possível
verificar a relação das alterações oculares com a infecção por A. platys devido ao baixo
número de cães com alterações oculares infectados com esta riquétsia.
Palavras-chave: hemoparasitoses canina, cães, diagnóstico molecular, PCR.
ABSTRACT
Anaplasma platys and Ehrlichia canis are obligate intracellular rickettsial organisms of dogs.
A. platys appear to parasitize only platelets causing canine infectious cyclic thrombocytopenia
(CICT), whereas E. canis has tropism for circulating mononuclear cells causing canine
monocytic ehrlichiosis (CME). Clinical signs of CME and CICT are nonspecific and common
to many other diseases transmitted by ticks. Definitive diagnosis of A. platys and E. canis is
made by specific diagnostic tests; however, two new real time PCR protocols (qPCR) for the
detection of A. platys and E. canis were developed from reference sequences for the 16S
rRNA gene of A. platys and E. canis. New primers and probes were able to detect A. platys
and E. canis. Identification of natural infections in dogs by A. platys and E. canis, previously
confirmed by conventional PCR, showed high correlation sensitivity (100% for A. platys and
E. canis) and epidemiological specificity (100% for A. platys and 98,41% for E. canis) with
new qPCR using hydrolyses probe (TaqMan) protocols Analytical specificity tests produced
species-specific results, not occurring DNA amplification of the following blood parasites
Babesia vogeli, Hepatozoon canis and Mycoplasma haemofelis. R. sanguineus DNA. Two
new qPCR protocols described were able to detect 0,14 fg of E. canis DNA and 0,9 fg of A.
platys DNA and represent alternative as a diagnostic tool for the specific detection of A.
platys and E. canis being useful for diagnosis of these canine hemoparasitosis. Ocular
abnormalities are among the clinical signs found in dogs infected with E. canis and cases of
uveitis have been attributed to infection with A. platys, but the frequency of eye injuries in
cases of infection with A. platys is still unknown. After searching the frequency of infections
by A. platys and E. canis in 100 dogs with ocular (OA) and 100 dogs without ocular
alterations (WOA), using the PCR as a diagnostic method, we found that among the
hemoparasites, A. platys and E. canis detected and identified by PCR, E. canis was the most
frequent, both in the group of OA dogs (33%; 33/100) and in the group of WOA dogs (24%;
24 / 100). The frequency of A. platys was 5% (5/100) for the group of OA dogs and 4%
(4/100) for the group of WOA dogs. Ocular changes associated with infection by E. canis
were bilateral uveitis and retinal detachment. It was not possible to verify the relationship of
ocular manifestations with infection by A. platys due to the low number of dogs with ocular
abnormalities infected with this rickettsia.
Keywords: Canine hemoparasitosis, dogs, molecular diagnosis, PCR.
1
CAPÍTULO 1
CONSIDERAÇÕES INICIAIS
As hemoparasitoses são de grande importância na clínica médica, pois são
enfermidades frequentes, levando ao adoecimento dos animais infectados e em casos mais
graves, à morte. Os animais infectados também podem atuar como reservatórios de patógenos
com potencial de infecção para os seres humanos, desenvolvendo um importante papel no
contexto da saúde pública (1, 2)
.
No Brasil, os principais hemoparasitos de cães são: Anaplasma platys, Ehrlichia
canis, Babesia vogeli, Hepatozoon canis e Mycoplasma spp. (3, 4)
. Os carrapatos são os
principais vetores dos hemoparasitos, sendo o carrapato marrom do cão, Rhipicephalus
sanguineus, o principal vetor de E. canis, M. haemocanis, M. haemofelis, B. vogeli e H. canis
em áreas urbanas das regiões de clima tropical e subtropical, principalmente devido à sua
maior abundância nessas regiões (1, 5)
. R. sanguineus também é incriminado como potencial
vetor de A. platys, pois o DNA de A. platys tem sido detectado em carrapatos desta espécie (6-
8). Entretanto, a transmissão experimental de A. platys utilizando R. sanguineus como vetor
não foi comprovada (9)
.
A. platys, agente etiológico da trombocitopenia cíclica infecciosa canina (TCIC), é
uma bactéria Gram-negativa que infecta especificamente as plaquetas determinando episódios
cíclicos de trombocitopenia, característica esta que dá origem ao nome da enfermidade,
pertence à ordem Rickettssiales, família Anaplasmataceae e gênero Anaplasma (10)
.
Casos clínicos da TCIC têm sido reportados por todo o mundo, incluindo os
Estados Unidos, Grécia, Taiwan, Espanha, Sul da China, Austrália, Tailândia e Venezuela (11)
.
A. platys também causa trombocitopenia em cães nas várias regiões do Brasil, não sendo rara
a coinfecção com E. canis e B. vogeli, podendo o carrapato R. sanguineus ser o mesmo vetor
destas três espécies (10, 12-15)
.
A frequência de infecção por A. platys no Brasil varia de 5,1% (16)
a 18,8% (14)
. E
os cães com TCIC frequentemente apresentam sinais clínicos mais brandos ou são
assintomáticos (17)
, exceto em casos de coinfecção com B. vogeli, E. canis e outros
microrganismos (18)
. Pouco se sabe sobre fatores de risco associados à doença no Brasil.
No entanto, co-infecções com A. platys e E. canis foram relatadas em cães do
Brasil, o que leva ao agravamento do quadro clínico destes animais (4, 19, 20)
.
2
A. platys causa parasitemia e trombocitopenia cíclica a intervalos de 10 a 14 dias e
alguns dias após a infecção ocorrem diminuições bruscas no número de plaquetas e A. platys
desaparece da circulação. Em seu ponto mais baixo, a trombocitopenia pode ser grave (20.000
a 50.000 plaquetas/µL), e a agregação plaquetária fica diminuída (21)
.
Os sinais clínicos começam após um período de incubação de oito a 15 dias, com
alguns sinais sugestivos, como anorexia e distúrbios hemostáticos (22)
. Cães infectados
frequentemente são assintomáticos (23)
. Hiperplasia folicular de nódulos linfáticos e
plasmocitose têm sido observadas na fase aguda da infecção, e alguns órgãos, tal como baço,
podem desenvolver hemorragia (11)
. Uveíte também pode ser associada com infecção por A.
platys em cães (22, 24)
.
A trombocitopenia é um achado comum em infecções por A. platys, entretanto
não é patognomônico da TCIC ou de outras hemoparasitoses (10)
. Anemia arregenerativa
normocítica normocrômica, associada à anemia de inflamação, leucopenia, hipoalbuminemia,
e hiperglobulinemia foi descrita em associação com a infecção experimental por A. platys (25)
.
E. canis, agente etiológico da erliquiose monocítica canina (EMC), é uma bactéria
estritamente intracelular, Gram-negativa, pertencente à ordem Rickettsiales, família
Anaplasmataceae e gênero Ehrlichia (26)
. A EMC é considerada uma das mais importantes
doenças que acometem os cães, sendo potencialmente fatal, tanto para os cães domésticos,
quanto para os demais membros da família Canidae (27)
.
No Brasil, o primeiro caso da EMC foi relatado em cão domiciliado em Belo
Horizonte, Minais Gerais na década de 70 (28)
. Apesar da existência de relatos da EMC
acometendo cães em todo o País, dados precisos sobre a prevalência da doença nas diferentes
áreas do Brasil ainda são escassos. Atualmente, é considerada endêmica em diversas regiões
brasileiras, sendo a doença infecciosa transmitida por carrapatos com maior frequência em
cães (29)
.
E. canis foi relatada em aproximadamente 20% a 30% dos cães atendidos em
hospitais e clínicas veterinárias de Estados das regiões Nordeste, Sudeste, Sul e Centro-Oeste
(12, 13, 30-32). O risco de infecção por E. canis é maior em cães mais expostos a áreas com
intensa infestação por carrapatos (16, 33)
.
A transmissão de E. canis geralmente ocorre durante o parasitismo por ninfas e/
ou adultos do carrapato R. sanguineus, o qual mantém a bactéria por transmissão transestadial
(34). O período de incubação da EMC é de oito a 20 dias, e os sinais clínicos da doença são
bastante variados. As fases da EMC do ponto de vista clínico são: aguda, subclínica e crônica,
e acomete cães de idades variadas (27)
.
3
As principais alterações clínicas observadas são apatia, anorexia/ hiporexia,
vômito, secreção óculo nasal, esplenomegalia, mucosas pálidas, hemorragias (petéquias,
equimoses e epistaxe) e uveíte (27, 35)
. Os sinais oculares podem estar presentes em todas as
fases da EMC (24, 36)
.
O exame ocular de animais com doenças sistêmicas é um componente diagnóstico
essencial do exame físico completo, o qual pode auxiliar o diagnóstico da EMC e TCIC em
cães. Alterações oculares podem estar presentes em todas as fases da EMC e casos de uveíte
já foram atribuídos à infecção por A. platys (24)
. As alterações oculares relacionadas à EMC
incluem uveíte anterior, coriorretinite, hemorragias da retina e conjuntivais, congestão
episcleral, opacidade de córnea, hipópio e hifema (37)
.
A prevalência de lesões oculares em casos de infecção natural por E. canis é
muito variável e a patogênese das lesões oculares associada à EMC não está totalmente
elucidada. De acordo com MARTIN (38)
, 50% dos cães infectados experimentalmente
apresentaram lesões oculares durante a fase aguda. ORIÁ et al. (39)
encontraram uma
frequência para E. canis de 86,27% (44/51) ao analisar 51 cães com uveíte utilizando testes
sorológicos como métodos de diagnóstico. Já KOMNENOU et al. (40)
ao analisarem cães com
uveítes, detectaram que 100% dos animais apresentaram-se sorologicamente positivos para E.
canis, sugerindo a inclusão da EMC como diagnóstico diferencial para cães com uveítes em
áreas endêmicas.
Os achados laboratoriais mais comuns são trombocitopenia e anemia.
Trombocitopenia grave provoca hemorragias retinianas e hifema, e petéquias conjuntivais
podem ser vistas na fase crônica da doença (22)
. Hiperviscosidade devido à hiperproteinemia
intensifica ainda mais a disfunção plaquetária e pode resultar em anormalidades oculares e no
sistema nervoso central (1)
.
Em virtude da gravidade da EMC e do seu caráter endêmico em regiões tropicais
e subtropicais, a detecção precoce da infecção é extremamente importante. Dessa forma, há
grande preocupação com o desenvolvimento e uso cada vez maior de novas técnicas para o
diagnóstico da infecção por E. canis (37)
.
As técnicas tradicionais de diagnóstico laboratorial dos hemoparasitos, A. platys e
E. canis, incluem os métodos diretos, como a identificação direta do microrganismo com base
na morfologia, pela avaliação por meio da microscopia ótica dos parâmetros e formas
intracelulares observadas nos esfregaços sanguíneos dos animais, e métodos indiretos, como a
quantificação de anticorpos e/ou antígenos em espécimes clínicos (12)
, os quais são valiosas
ferramentas de diagnóstico para TCIC e EMC. No entanto, o diagnóstico definitivo de
4
infecção por A. platys e E. canis de forma mais eficaz e rápida requer a identificação do
agente etiológico por meio do uso de técnicas moleculares.
Historicamente, o exame parasitológico direto por meio da microscopia ótica tem
sido bastante utilizado na detecção de A. platys e E. canis por ser um método simples,
específico e que não necessita de reagentes e equipamentos sofisticados, porém, é pouco
sensível, principalmente nos casos de infecções de fase crônica onde a parasitemia é baixa (22)
.
A detecção de mórulas de E. canis ocorre por um curto período de tempo (geralmente na fase
aguda da EMC) nos monócitos e a visualização durante as fases subclínicas e crônicas da
doença é rara, conduzindo a resultados falso-negativos. Inclusões de E. canis já foram
descritas parasitando plaquetas e quando ocorre, não é possível identificá-los apenas pela
morfologia. Já na TCIC, este método de diagnóstico não é o mais indicado para detecção de
A. platys em virtude da parasitemia cíclica do agente (24)
.
O exame parasitológico direto nem sempre é conclusivo para a diferenciação entre
espécies ou subespécies morfologicamente semelhantes, sendo em alguns casos imprecisos,
principalmente em decorrência da parasitemia cíclica dos microrganismos e da semelhança
morfológica entre as diferentes espécies de hemoparasitos (10, 35, 41)
. Além disso, a ausência de
parasitos em esfregaços de sangue ou creme leucocitário não exclui a possibilidade de
infecção (27)
.
A identificação de mórulas de E. canis no esfregaço sanguíneo ocorre apenas nas
duas primeiras semanas da infecção e em pequenas quantidades, devido à baixa parasitemia, e
a porcentagem de células infectadas raramente ultrapassar 1% (37)
. OLIVEIRA et al. (42)
, ao
analisarem através do exame parasitológico direto, 48 amostras de sangue de cães em
Jaboticabal-SP positivas no dot-ELISA, verificaram a presença de mórulas de E. canis em
uma das amostras avaliadas, obtendo uma frequência de 2% (1/48). Resultados semelhantes
foram observados por FARIA et al. (43)
, os quais verificaram pelo exame parasitológico direto
uma frequência de E. canis de 5,7% (2/35) em cães sintomáticos em Jaboticabal-SP.
Entre as técnicas de diagnóstico utilizando biologia molecular, a mais usada na
detecção de A. platys e E. canis é a reação em cadeia da polimerase (PCR). Esta é uma técnica
que apresenta especificidade e sensibilidade elevadas, sendo capaz de detectar fragmentos-
alvo do agente em amostras de sangue ou em outro tipo de amostra clínica, estando ou não os
parasitos viáveis, sendo considerada uma ferramenta promissora para o diagnóstico de muitas
doenças parasitárias (44)
.
A PCR convencional é considerada um dos métodos de diagnóstico direto mais
sensível, específico e rápido, atualmente disponível para a detecção de espécies de Ehrlichia e
5
Anaplasma em cães (41, 45)
. No Brasil, têm sido realizados estudos avaliando a prevalência de
A. platys e E. canis em cães, e infecções concomitantes entre estes dois hemoparasitos têm
sido confirmadas usando PCR (3, 4)
.
A PCR é o método apropriado para a confirmação do diagnóstico de infecções na
fase crônica da EMC. Além disso, é capaz de identificar o agente envolvido na infecção por
espécie ou mesmo subespécie (45)
. Dessa forma, são ferramentas que suprem as limitações das
técnicas convencionais de diagnóstico, identificação e diferenciação de microrganismos (46)
.
Outras técnicas resultantes de modificações da PCR têm sido desenvolvidas com
o objetivo de aumentar a sensibilidade desta metodologia, como por exemplo, a PCR em
tempo real (qPCR), a qual vem ganhando espaço nos diagnósticos clínicos e nos laboratórios
de pesquisa por apresentar a capacidade de gerar resultados quantitativos (15, 47, 48)
.
Protocolos de ensaios de PCR convencional, nested-PCR e qPCR têm sido
amplamente empregados na detecção e discriminação de hemoparasitos em cães (4, 19, 31, 41, 45,
49-52). Entre as vantagens da PCR, destaca-se sua elevada sensibilidade, especificidade e
capacidade de amplificar uma sequência precisa de DNA. Contudo, a PCR também apresenta
limitações, como a necessidade de conhecer a sequência de DNA a amplificar para que
possam ser sintetizados iniciadores específicos. Além disso, a PCR convencional e nested-
PCR não apresentam valores quantitativos, não são automatizadas e precisam passar por
padronização mais meticulosa, apresentando tempo maior de execução. Os géis de agarose
apresentam precisão ruim, baixa sensibilidade e baixa resolução. E as chances de
contaminação do ambiente são maiores ( 41, 45, 49-52)
.
As desvantagens comumente observadas na PCR convencional e nested-PCR
podem ser minimizadas ou até mesmo evitadas com o uso da qPCR. As características
relevantes da qPCR são rapidez de resultados, alta especificidade, alta sensibilidade e
capacidade de quantificação de DNA, permitindo um aumento na velocidade da tomada de
decisões, além de possuir menor risco de contaminação, pois o processo de amplificação do
DNA ocorre em um sistema fechado (50)
. A qPCR permite o acompanhamento da reação e a
apresentação dos resultados de forma mais precisa e rápida em relação à PCR que apresenta
somente resultados qualitativos. Outra vantagem além do acompanhamento da reação em
tempo real é a eliminação da etapa de eletroforese em gel de agarose diminuindo o tempo de
obtenção do diagnóstico (53)
.
Os métodos indiretos baseiam-se principalmente em exames sorológicos para
pesquisa de anticorpos. Vários métodos sorológicos têm sido desenvolvidos para o
diagnóstico da TCIC e EMC, sendo consideradas valiosas ferramentas de triagem. A
6
propagação de E. canis em cultura celular tem sido a base para produção de antígenos a serem
aplicados em testes sorológicos, havendo detecção de anticorpos precoces em até sete dias
pós-infecção, embora a maioria dos cães se tornem soropositivos somente após 28 dias da
infecção (54)
.
A reação de imunofluorescência indireta (RIFI) é utilizada no diagnóstico das
erliquioses, sendo aplicável tanto para estudos de infecções experimentais quanto naturais.
Embora o emprego de testes sorológicos para o diagnóstico da erliquiose seja frequente, sabe-
se que as várias espécies de erlíquias compartilham determinados antígenos, gerando reações
cruzadas entre espécies do mesmo gênero. Além disso, os anticorpos chegam a níveis
máximos após 80 dias da infecção e persistem, a menos que se efetue o tratamento (55)
. Dessa
forma, os testes sorológicos não são capazes de distinguir uma infecção corrente de uma
exposição prévia sem estabelecimento ou persistência de infecção (56)
.
A RIFI para detecção de anticorpos contra A. platys pode ser utilizada, não sendo
detectadas reações cruzadas entre A. platys e E. canis. Porém, é provável que ocorra reação
cruzada entre A. platys e A. phagocytophilum neste tipo de teste (22)
. Além da RIFI, testes
imuno enzimáticos (ELISA) têm sido desenvolvidos e utilizados no diagnóstico da TCIC e
EMC.
O diagnóstico clínico da EMC e TCIC é quase sempre inconclusivo quanto à
doença específica, e frequentemente constitui um desafio para o clínico veterinário devido à
característica multissistêmica da EMC e ausência de sinais clínicos específicos destas doenças
(22).
Novos estudos a respeito das manifestações clínicas oculares decorrentes da TCIC
e EMC empregando técnicas de detecção rápida, altamente sensíveis e específicas capazes de
detectar A. platys e E. canis, incluindo co-infecções com outros hemoparasitos são
extremamente valiosos para o diagnóstico eficaz e precoce, contribuindo para sustentar o
emprego da terapêutica adequada e um melhor prognóstico para essas doenças. Assim, diante
do exposto, buscou-se com este estudo detectar infecções por A. platys e E. canis em cães
com alterações oculares e desenvolver e validar novos protocolos de qPCR para detecção
rápida destes hemoparasitos.
7
REFERÊNCIAS
1. Shaw SE, Day MJ, Birtles RJ, Breitschwerdt EB. Tick-borne infectious diseases of
dogs. Trends in Parasitology. 2001 2/1/;17(2):74-80.
2. Dantas-Torres F, Chomel BB, Otranto D. Ticks and tick-borne diseases: a One Health
perspective. Trends in Parasitology. 2012;28(10):437-46.
3. Ramos R, Ramos C, Araujo F, Oliveira R, Souza I, Pimentel D, et al. Molecular
survey and genetic characterization of tick-borne pathogens in dogs in metropolitan Recife
(north-eastern Brazil). Parasitology research. 2010 Oct;107(5):1115-20. PubMed PMID:
20680344.
4. Santos F, Coppede JS, Pereira AL, Oliveira LP, Roberto PG, Benedetti RB, et al.
Molecular evaluation of the incidence of Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Babesia spp.
in dogs from Ribeirao Preto, Brazil. Veterinary journal. 2009 Jan;179(1):145-8. PubMed
PMID: 17920967.
5. Stich RW, Schaefer JJ, Bremer WG, Needham GR, Jittapalapong S. Host surveys,
ixodid tick biology and transmission scenarios as related to the tick-borne pathogen, Ehrlichia
canis. Veterinary parasitology. 2008 Dec 20;158(4):256-73. PubMed PMID: 18963493.
Pubmed Central PMCID: 3053144.
6. Sanogo YO, Davoust B, Inokuma H, Camicas JL, Parola P, Brouqui P. First evidence
of Anaplasma platys in Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodida) collected from dogs in
Africa. The Onderstepoort journal of veterinary research. 2003 Sep;70(3):205-12. PubMed
PMID: 14621316.
7. Abarca K, Lopez J, Perret C, Guerrero J, Godoy P, Veloz A, et al. Anaplasma platys in
dogs, Chile. Emerging infectious diseases. 2007 Sep;13(9):1392-5. PubMed PMID:
18252119. Pubmed Central PMCID: 2857280.
8. Almeida AdBPFd, Paula DAJd, Dahroug MAA, Freitas AGd. Ehrlichia canis and
Anaplasma platys in ticks of dogs in Cuiabá, Mato Grosso. Semina : Ciências Agrárias.
2012;33(3):4.
9. Ramos RA, Latrofa MS, Giannelli A, Lacasella V, Campbell BE, Dantas-Torres F,
Otranto D. Detection of Anaplasma platys in dogs and Rhipicephalus sanguineus group ticks
by a quantitative real-time PCR. Veterinary parasitology. 2014 Sep 15;205(1-2):285-8.
PubMed PMID: 25027609.
10. Ferreira RF, Cerqueira Ade M, Pereira AM, Velho PB, Azevedo RR, Rodrigues IL,
Almosny NRP. Cross-reaction evaluation of PCR-Anaplasma platys positive dogs tested to
Anaplasma phagocytophilum antibodies by commercial ELISA. Rev Bras Parasitol Vet. 2008
Sep;17 Suppl 1:5-8. Portuguese.
11. Huang H, Unver A, Perez MJ, Orellana NG, Rikihisa Y. Prevalence and molecular
analysis of Anaplasma platys in dogs in Lara, Venezuela. Brazilian Journal of Microbiology.
Braz. J. Microbiol. [Internet]. 2005 Sep [cited 2015 July 06] ; 36( 3 ): 211-216. Available
from:http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S151783822005000300002&ln
g=en. http://dx.doi.org/10.1590/S1517-83822005000300002.
12. Dagnone AS, de Morais HSA, Vidotto MC, Jojima FS, Vidotto O. Ehrlichiosis in
anemic, thrombocytopenic, or tick-infested dogs from a hospital population in South Brazil.
Veterinary parasitology. 2003 11/28/;117(4):285-90.
8
13. Moreira SM, Bastos, CV, Araújo RB, Santos M, Passos LMF. Retrospective study
(1998-2001) on canine ehrlichiosis in Belo Horizonte, MG, Brazil. Arq Bras Med Vet Zoot
2003;55(2):141-147. http://dx.doi.org/10.1590/S0102-09352003000200003.
14. Ferreira RF, Cerqueira AMF, Pereira AM, Guimaraes CM, Sa AG, Abreu FS, Massard
CL, Almosny NRP. Anaplasma platys diagnosis in dogs: comparison between morphological
and molecular tests. International Journal of Applied Research in Veterinary Medicine.
2007;5(3):113-119.
15. Labruna MB, McBride JW, Camargo LMA, Aguiar DM, Yabsley MJ, Davidson WR,
et al. A preliminary investigation of Ehrlichia species in ticks, humans, dogs, and capybaras
from Brazil. Veterinary parasitology. 2007 1/31/;143(2):189-95.
16. Costa-Junior LM, Rembeck K, Passos LM, Ribeiro MF. Factors associated with
epidemiology of Anaplasma platys in dogs in rural and urban areas of Minas Gerais State,
Brazil. Preventive veterinary medicine. 2013 May 1;109(3-4):321-6.
17. Cardozo GP, Oliveira LP, Mansur MA, Santos EV, Roberto PG, Marins M. Molecular
characterisation of two strains of Anaplasma platys in Brazil. The Veterinary record. 2009
Mar 14;164(11):338-40.
18. Dantas-Torres F. Canine vector-borne diseases in Brazil. Parasites & vectors.
2008;1:25. doi:10.1186/1756-3305-1-25
19. Macieira DdB, Messick JB, Cerqueira AdM, Freire IM, Linhares GF, Almeida NK,
Almosny NRP. Prevalence of Ehrlichia canis infection in thrombocytopenic dogs from Rio
de Janeiro, Brazil. Veterinary clinical pathology. 2005;34(1):44-8.
20. Ramos CAN, Ramos RAN, Araújo FR, Guedes Jr DS, Souza IIF, Ono TM, Vieira
AS, Pimentel DS, Rosas
EO, Faustino
MAG, Alves, LC. Comparison of nested-PCR with
blood smear examination in detection of Ehrlichia canis and Anaplasma platys in dogs.
Revista brasileira de parasitologia veterinaria (Online) [Internet]. 2009; 18( Suppl 1 ): 58-62.
Available from: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1984-
29612009000500011&lng=en. http://dx.doi.org/10.4322/rbpv.018e1011.
21. Greene CE. Infectious diseases of the dog and cat. 3. ed. St. Louis, Mo.: Elsevier
Saunders; 2006. 1387 p.
22. Neer TMH, S. Ehrlichiosis, Neorickettsiosis, Anaplasmosis, and Wolbachia Infection.
Chapter 28, 203-232 p. In: Elsevier S, editor. IN: GREENE, CE Infectious Diseases of the
dog and cat Saunders Elsevier, 3 Ed, St Louis, Elsevier, 2006, 1387 p.
23. Cardozo GP, Oliveira LP, Zissou VG, Donini IAN, Roberto PG, Marins M. Analysis
of the 16S rRNA gene of Anaplasma platys detected in dogs from Brazil. Brazilian Journal of
Microbiology. 2007;38:478-9.
24. Cullen CLW, AA. Ocular manifestations of systemic diseases. Part 1: The dogs.
Chapter 30., p.1470-1537. In: GELATT, KN Veterinary Ophtalmology. 2. Flórida: Blackwell
publishing; 2007. 1644 p.
25. Harvey J. Thrombocytitropic Anaplasmosis (A. platys [E. platys] Infection). 229-231
p. IN: GREENE, CE Infectious Diseases of the dog and cat Saunders Elsevier, 3 Ed, St
Louis, Elsevier, 2006. 1387 p.
26. Dumler JS, Barbet AF, Bekker CP, Dasch GA, Palmer GH, Ray SC, et al.
Reorganization of genera in the families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in the order
Rickettsiales: unification of some species of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with
Ehrlichia and Ehrlichia with Neorickettsia, descriptions of six new species combinations and
9
designation of Ehrlichia equi and 'HGE agent' as subjective synonyms of Ehrlichia
phagocytophila. International journal of systematic and evolutionary microbiology. 2001
Nov;51(Pt 6):2145-65.
27. Borin S, Crivelenti LZ, FERREIRA, FA. Epidemiological, clinical, and hematological
aspects of 251 dogs naturally infected with Ehrlichia spp. morulae. Arq Bras Med Vet
Zootec. 2009;61(3):566-71.
28. Costa JO, Batista-Júnior JA, Silva M, Guimarães MP. Ehrlichia canis infection in dog
in Belo Horizonte, Brazil. Arquivo da Escola de Veterinária da Universidade Federal de
Minas Gerais. 1973;25:199-200.
29. Vieira RF, Biondo AW, Guimaraes AM, Dos Santos AP, Dos Santos RP, Dutra LH, et
al. Ehrlichiosis in Brazil. Revista brasileira de parasitologia veterinaria. 2011 Jan-
Mar;20(1):1-12.
30. Labarthe N, de Campos Pereira M, Barbarini O, McKee W, Coimbra CA, Hoskins J.
Serologic prevalence of Dirofilaria immitis, Ehrlichia canis, and Borrelia burgdorferi
infections in Brazil. Veterinary therapeutics : research in applied veterinary medicine. 2003
Spring;4(1):67-75.
31. Bulla C, Kiomi Takahira R, Pessoa Araujo J, Jr., AparecidaTrinca L, Souza Lopes R,
Wiedmeyer CE. The relationship between the degree of thrombocytopenia and infection with
Ehrlichia canis in an endemic area. Veterinary research. 2004 Jan-Feb;35(1):141-6.
32. Trapp SM, Dagnone AS, Vidotto O, Freire RL, Amude AM, de Morais HS.
Seroepidemiology of canine babesiosis and ehrlichiosis in a hospital population. Veterinary
parasitology. 2006 Sep 10;140(3-4):223-30.
33. Soares AO, Souza AD, Feliciano EA, Rodrigues AF, D'Agosto M, Daemon E.
Evaluation of ectoparasites and hemoparasites in dogs kept in apartments and houses with
yards in the city of Juiz de Fora, Minas Gerais, Brazil. Revista brasileira de parasitologia
veterinaria. 2006 Jan-Mar;15(1):13-6.
34. Ueno TE, Aguiar DM, Pacheco RC, Richtzenhain LJ, Ribeiro MG, Paes AC, et al.
Ehrlichia canis in dogs attended in a veterinary hospital from Botucatu, São Paulo State,
Brazil. Revista brasileira de parasitologia veterinaria. 2009 Jul-Sep;18(3):57-61.
35. Nakaghi ACH, Machado RZ, Costa MT, André MR, Baldani CD. Canine ehrlichiosis:
clinical, hematological, serological and molecular aspects. Ciência Rural. 2008;38:766-70.
36. Oriá AP, Pereira PM, Laus JL. Uveitis in dogs infected with Ehrlichia canis. Ciência
Rural. 2004;34:1289-95.
37. Harrus S, Waner T. Diagnosis of canine monocytotropic ehrlichiosis (Ehrlichia canis):
an overview. Veterinary journal. 2011 Mar;187(3):292-6.
38. Martin CL. Ocular manifestations of systemic disease. Cap.37, p.1408-1409.
In:GELATT, KN Veterinary ophthalmology Philadelphia : Lippincott Williams & Wilkins,
1999.
39. Oriá APea. Ophthalmic, hematologic and serologic findings in dogs with suspected
Ehrlichia canis infections. Revista Brasileira de Ciência Veterinaria. 2008;15(2):94-7.
40. Komnenou AA, Mylonakis ME, Kouti V, Tendoma L, Leontides L, Skountzou E, et
al. Ocular manifestations of natural canine monocytic ehrlichiosis (Ehrlichia canis): a
retrospective study of 90 cases. Veterinary ophthalmology. 2007 May-Jun;10(3):137-42.
10
41. Alves LM, Linhares GFC, Chaves NST, Monteiro LC, Linhares DCL. Avaliação de
iniciadores e protocolo para o diagnóstico de pancitopenia tropical canina por PCR. 2005.
Ciência Animal Brasileira. Goiânia;6(1):6.
42. Oliveira DN CT, Costa MT, Machado RZ, Castro MB. Anti- Ehrlichia canis
antibodies detection by “Dot- ELISA” in naturally infected dogs. Revista Brasileira de
Parasitologia Veterinária. 2000;9(1):1-5.
43. Faria JL, Dagnone AS, Munhoz TD, Joao CF, Pereira WA, Machado RZ, et al.
Ehrlichia canis morulae and DNA detection in whole blood and spleen aspiration samples.
Revista brasileira de parasitologia veterinaria = Brazilian journal of veterinary parasitology:
Orgao Oficial do Colegio Brasileiro de Parasitologia Veterinaria. 2010 Apr-Jun;19(2):98-102.
PubMed PMID: 20624346.
44. Lauerman LH. Nucleic acid amplification assays for diagnosis of animal diseases.
Washington: Ed Library of Congress Cataloging-in- Publication Data. 1998:152.
45. Martin AR, Brown GK, Dunstan RH, Roberts TK. Anaplasma platys: an improved
PCR for its detection in dogs. Experimental parasitology. 2005 Mar;109(3):176-80. PubMed
PMID: 15713449.
46. Gasser RB. Molecular tools—advances, opportunities and prospects. Veterinary
Parasitology. 2006;136:69-89.
47. Teglas M, Matern E, Lein S, Foley P, Mahan SM, Foley J. Ticks and tick-borne
disease in Guatemalan cattle and horses. Veterinary parasitology. 2005 7/15/;131(1–2):119-
27.
48. Sirigireddy KR, Ganta RR. Multiplex detection of Ehrlichia and Anaplasma species
pathogens in peripheral blood by real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction.
The Journal of molecular diagnostics : JMD. 2005 May;7(2):308-16. PubMed PMID:
15858156. Pubmed Central PMCID: 1867522.
49. Baneth G, Harrus S, Ohnona FS, Schlesinger Y. Longitudinal quantification of
Ehrlichia canis in experimental infection with comparison to natural infection. Veterinary
microbiology. 2009 May 12;136(3-4):321-5. PubMed PMID: 19128893.
50. Doyle CK, Labruna MB, Breitschwerdt EB, Tang YW, Corstvet RE, Hegarty BC, et
al. Detection of medically important Ehrlichia by quantitative multicolor TaqMan real-time
polymerase chain reaction of the dsb gene. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 2005
Oct;7(4):504-10. PubMed PMID: 16237220. Pubmed Central PMCID: 1888493.
51. Peleg O, Baneth G, Eyal O, Inbar J, Harrus S. Multiplex real-time qPCR for the
detection of Ehrlichia canis and Babesia canis vogeli. Veterinary parasitology. 2010 Oct
29;173(3-4):292-9. PubMed PMID: 20674177.
52. Nakaghi AC, Machado RZ, Ferro JA, Labruna MB, Chryssafidis AL, Andre MR, et al.
Sensitivity evaluation of a single-step PCR assay using Ehrlichia canis p28 gene as a target
and its application in diagnosis of canine ehrlichiosis. Revista brasileira de parasitologia
veterinaria = Brazilian journal of veterinary parasitology : Orgão Oficial do Colégio
Brasileiro de Parasitologia Veterinária. 2010 Apr-Jun;19(2):75-9. PubMed PMID: 20624341.
53. Novais CMP-A, M. PCR em tempo real. Revista Biotecnologia Ciência e
Desenvolvimento. 2004 (33):10-3.
54. Harrus SW, T.; Bark, H. Canine monocytic ehrlichiosis update. Compendium for
Continuing Education for the Practicing Veterinarian. 1997;19:431-44.
11
55. Almosny NRPM, C.L. . Erliquiose em pequenos animais e como zoonose. p. 14-56.
In: ALMOSNY, NRP Hemoparasitoses em Pequenos Animais Domésticos e como Zoonoses
1 ed Rio de Janeiro: LF Livros Ltda2002.
56. Aguiar DMS, T.B.; Hagiwara, M.K.; Machado, R.Z.; Labruna, M.B. Diagnóstico
sorológico de erliquiose canina com antígeno brasileiro de Ehrlichia canis. Ciência Rural.
2007;37:p. 796-802.
12
CAPÍTULO 2
DETECÇÃO MOLECULAR DE Anaplasma platys E Ehrlichia canis EM
CÃES COM E SEM ALTERAÇÕES OCULARES
MOLECULAR DETECTION OF Anaplasma platys and Ehrlichia canis in dogs with and
without OCULAR DISEASES
Herika Xavier da Costa1, Sabrina C. Duarte
2, Camila Donati
3, Osvaldo José da Silveira Neto
4,
Guido F. C. Linhares5.
1 Doutoranda em Ciência Animal, Universidade Federal de Goiás-UFG, Goiânia-GO, Brasil. Email: [email protected]
2 Pesquisadora da EMBRAPA, Concórdia-SC, Brasil. 3 Médica veterinária com atendimento especializado em Oftalmologia Veterinária, Goiânia-GO, Brasil
4. Professor efetivo do curso de zootecnia da UEG e professor titular da Faculdade Objetivo- IUESO
5. Professor titular de Doenças parasitárias da Escola de Veterinária e Zootecnia (EVZ)- UFG.
RESUMO
As doenças oculares em cães são diagnosticadas com frequência na clínica de pequenos animais e estão entre os sinais clínicos encontrados em cães infectados com Ehrlichia canis. Já a frequência de
lesões oculares em casos de infecção por Anaplasma platys ainda é desconhecida. O objetivo com este
estudo foi verificar a frequência de infecções por E. canis e A. platys em cães com alterações oculares,
utilizando-se a PCR como método de diagnóstico. Para o estudo, foram utilizados 100 cães com alterações oculares (CAO) e 100 cães sem alterações oculares (SAO). Dentre os hemoparasitos, E.
canis e A. platys, detectados e identificados por PCR, E. canis foi o de maior frequência, tanto no
grupo de cães CAO (33%; 33/100) quanto no grupo de cães SAO (24%; 24/100). A frequência de A. platys foi de 5% (5/100) para o grupo de cães CAO e 4% (4/100) para o grupo de cães SAO. As
alterações oculares que apresentaram relação com a infecção por E. canis foram uveíte bilateral e
descolamento de retina. Não foi possível verificar a relação das alterações oculares com a infecção por
A. platys devido ao baixo número de cães com alterações oculares infectados com esta riquétsia.
PALAVRAS-CHAVE: Canino, hemoparasitos, lesões oftálmicas, PCR.
ABSTRACT Ocular diseases are diagnosed in dogs often in clinical small animal and are found between the clinical
signs in dogs infected with Ehrlichia canis. Have the frequency of ocular lesions in cases of infection
with Anaplasma platys is still unknown. The objective of this study was to verify the frequency of
infections by E. canis and A. platys in dogs with ocular changes, using the PCR as a diagnostic method. For the study, we used 100 dogs with ocular abnormalities (OA) and 100 dogs without ocular
abnormalities (WOA). Among the blood parasites, E. canis and A. platys detected and identified by
PCR, E. canis was the most frequent in both dogs group OA (33%; 33/100) and in the group of dogs WOA (24%, 24/100). The frequency of A. platys was 5% (5/100) for the group of dogs OA and 4%
(4/100) for the group of dogs WOA. Ocular changes were associated with infection by E. canis were
bilateral uveitis and retinal detachment. It was not possible to verify the relationship of ocular manifestations with infection by A. platys due to the low number of dogs with ocular abnormalities
infected with this rickettsia.
KEYWORDS: Blood parasites, canine, ophthalmic injuries, PCR.
13
INTRODUÇÃO
A erliquiose monocítica canina (EMC) é uma doença causada por bactérias
estritamente intracelulares, Gram-negativas, pertencentes à Ordem Rickettsiales, Família
Anaplasmataceae, gênero Ehrlichia (1)
e espécie Ehrlichia canis (2)
. É considerada uma das
mais importantes doenças que acometem os cães (3)
.
No Brasil, o primeiro caso da EMC foi relatado em cão domiciliado em Belo
Horizonte, Estado de Minais Gerais em 1973 (4)
. Posteriormente, foi relatada acometendo
aproximadamente 20% a 30% dos cães atendidos em hospitais e clínicas veterinárias de
Estados das regiões Nordeste, Sudeste, Sul e Centro-Oeste (5-8)
.
A transmissão de E. canis geralmente ocorre durante o parasitismo por ninfas e/
ou adultos do carrapato Rhipicephalus sanguineus, o qual mantém a bactéria por transmissão
transestadial (9)
. Acomete cães de idades variadas (10)
, e as manifestações clínicas da EMC são
inespecíficas. As fases da EMC do ponto de vista clínico são: aguda, subclínica e crônica (11)
,
embora seja difícil esta classificação dos casos clínicos em fases tão distintas nos países em
que a doença ocorre de forma endêmica.
As principais alterações clínicas observadas são apatia, anorexia/ hiporexia,
vômito, secreção oculonasal, esplenomegalia, mucosas pálidas, hemorragias (petéquias e
epistaxe) e uveíte (3, 12)
.
Os sinais oculares envolvem a maioria das estruturas oculares e são achados
comuns nos casos de EMC, podendo estar presentes em todas as fases da doença. As lesões
oculares podem variar na gravidade e não ocorrem em todos os casos de EMC (13)
. Lesões
oculares subclínicas ou ostensivas são características comuns em infecções naturais e
experimentais por E. canis, possuindo frequência variada. Estudos anteriores relatam
ocorrência de manifestações oculares desde 6,86% a 86,27% em cães com EMC utilizando a
sorologia como método de diagnóstico (14-17)
. De acordo com MARTIN (14)
, 50% dos cães
infectados experimentalmente apresentaram lesões oculares durante a fase aguda. Já ORIÁ et
al. (18)
encontraram uma frequência para E. canis de 86,27% (44/51) ao analisar 51 cães com
uveíte utilizando testes sorológicos como métodos de diagnóstico.
A frequência de lesões oculares em casos de infecção natural por E. canis é muito
variável e a patogênese das lesões oculares associada a EMC não está totalmente elucidada.
As lesões oftalmológicas incluem uveíte, coriorretinite, hemorragias da retina e conjuntivais,
congestão episcleral, opacidade de córnea, hipópio e hifema (11, 18)
. A hiperviscosidade
sanguínea, secundária a gamopatia monoclonal, elevação da pressão oncótica, vasculite e
14
disfunção plaquetária são fatores importantes na patogênese da hemorragia ocular nos casos
de EMC. Efeitos oculares de hiperviscosidade incluem dilatação dos vasos sanguíneos da
retina e tortuosidade e hemorragias na retina. A elevação da pressão oncótica, bem como
alterações isquémicas secundárias de hiperviscosidade, pode causar retinopatia hipertensiva e
hifema (19)
.
No processo inflamatório, as vasculites na EMC são causadas pela deposição de
imunocomplexos nas paredes vasculares, caracterizada por infiltrados linfoplasmáticos
perivasculares. Tendo em vista que a EMC possui a característica de associação com a
formação generalizada de imunocomplexos, é possível que as uveítes induzidas pela EMC
tenham uma base imunopatogênica (15, 19-21)
.
Os achados laboratoriais mais comuns são trombocitopenia e anemia.
Trombocitopenia grave provoca hemorragias retinianas e hifema e petéquias conjuntivais
podem ser vistas na fase crônica da doença (22)
.
A trombocitopenia cíclica infecciosa canina (TCIC) é uma doença causada por
uma bactéria Gram-negativa, pertencente à ordem Rickettssiales, família Anaplasmataceae e
gênero Anaplasma. O agente etiológico da TCIC é denominado de Anaplasma platys e infecta
as plaquetas do cão (23)
. Casos clínicos da TCIC têm sido reportados por todo o mundo,
incluindo os Estados Unidos, Grécia, Taiwan, Espanha, Sul da China, Austrália, Tailândia e
Venezuela (24)
.
A. platys também causa trombocitopenia em cães nas várias regiões do Brasil,
não sendo rara a coinfecção com E. canis e Babesia vogeli, podendo o carrapato R.
sanguineus ser o mesmo vetor destas três espécies (23)
. A prevalência de infecção por A. platys
no Brasil varia de 5,1% (25)
a 18,8% (26)
. Pouco se sabe sobre fatores de risco associados à
doença no Brasil. A infecção por A. platys raramente é associada à doença clínica (27)
. Há
diferentes cepas de A. platys circulantes em cães no Brasil, como revelada pela análise de
seqüências parciais do gene 16S rRNA (28)
.
A. platys causa parasitemia e trombocitopenias cíclicas a intervalos de 10 a 14
dias. Alguns dias após a infecção ocorrem diminuição brusca no número de plaquetas e o
desaparecimento de A. platys da circulação. Em seu ponto mais baixo, a trombocitopenia pode
ser grave (20.000 a 50.000 plaquetas/µL) e a agregação plaquetária fica diminuída (29)
.
A. platys é considerada de menor importância patogênica que E. canis e cães com
TCIC frequentemente apresentam sinais clínicos mais brandos ou são assintomáticos (24)
. No
entanto, co-infecções com A. platys e E. canis foram relatadas em cães do Brasil, o que leva
ao agravamento do quadro clínico destes animais (30-32)
.
15
Os sinais clínicos quando presentes começam após um período de incubação de
oito a 15 dias, com alguns sinais sugestivos, como anorexia e distúrbios hemostáticos (33)
.
Casos de uveíte já foram atribuídos à infecção por A. platys (34, 35)
. Hiperplasia folicular de
nódulos linfáticos e plasmocitose têm sido observadas na fase aguda da infecção e em alguns
órgãos, tal como baço, pode ocorrer hemorragia (24)
.
A trombocitopenia é um achado comum em infecções por A. platys, entretanto
não é patognomônica desta rickettsiose (23)
. Anemia arregenerativa normocítica
normocrômica, associada à anemia de inflamação, leucopenia, hipoalbuminemia, e
hiperglobulinemia foi descrita em associação com a infecção experimental por A. platys (29)
.
Dentre os métodos de diagnóstico para hemoparasitos, os mais utilizados são a
pesquisa de mórulas em esfregaço sanguíneo para E. canis e pesquisa de inclusões em
plaquetas para A. platys, detecção de anticorpos por imunofluorescência indireta, ou
amplificação de DNA através da reação em cadeia da polimerase (PCR) (23)
.
O uso de técnicas moleculares para o estabelecimento do diagnóstico é necessário
para a detecção específica de infecções por E. canis e A. platys, permitindo melhor
compreensão sobre a enfermidade e sua relação com as alterações oculares observadas. O
exame ocular minucioso de animais com doenças sistêmicas é um componente essencial do
exame físico dos animais, o qual pode auxiliar o diagnóstico da EMC e TCIC em cães. Diante
do exposto, buscou-se com este estudo verificar a frequência de infecções por E. canis e A.
platys em cães com alterações oculares na cidade de Goiânia, Estado de Goiás, utilizando
como método de diagnóstico, a PCR.
MATERIAL E MÉTODOS
Grupo de cães utilizados
Foram avaliados os cães atendidos entre junho de 2013 e abril de 2014 por
médicos veterinários no Hospital Veterinário Pluto (HVP), localizado em Goiânia-GO, Brasil,
selecionando-se previamente os cães que atenderam ao critério de presença ou ausência de
lesões oculares. Os animais que apresentaram manifestações oculares foram incluídos no
estudo após atenderam os seguintes critérios: (1) Não apresentar nenhuma evidência histórica
de trauma ocular ou exposição a medicamentos pelo menos 30 dias antes da consulta
veterinária e (2) apresentarem prévio exame oftalmológico com a inspeção das pálpebras e do
16
bulbo ocular utilizando uma fonte de luz focal, cujas informações clínicas sobre a presença de
alterações oculares foram registradas no momento da consulta veterinária.
Após a triagem dos animais, obedecendo como único critério de seleção a
presença ou ausência de alterações oculares, os cães foram separados em dois grupos: Grupo
caso (cães com alterações oculares (CAO), n=100) e grupo controle (cães sem alterações
oculares (SAO), n=100). Todos os cães que apresentaram alterações oculares foram
submetidos a um exame oftalmológico mais completo e minucioso. O protocolo experimental
com cães foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFG
sob protocolo n. 025/13.
Exame oftalmológico
Exame ocular foi realizado em todos os cães que apresentavam alterações
oculares, visualizando os reflexos oculares e empregando-se teste da lágrima de Schirmer
(Schirmer strips®, Ophthalmos, São Paulo-SP), prova da fluoresceína (Fluoresceína
sódica
1%, Ophthalmos, São Paulo-SP), anestesia ocular (Colírio Anestésico®, Allergan Produtos
Farmacêuticos Ltda), tonometria de aplanação (TonoPen XL®
, Mentor, Norwell, MA, USA),
exame do bulbo, midríase farmacológica e oftalmoscopia (Welch Allyn, Skaneateles, NY,
EUA). A identificação e classificação do tipo de anormalidades oculares observadas nos cães
foram registradas.
Coleta de amostras
Foram coletados de cada um dos 200 cães selecionados, 0,5 mL de sangue da veia
cefálica ou jugular, em tubo esterilizado contendo anticoagulante universal EDTA
(Anticoagulante Universal, Doles). Após a coleta, as 200 amostras sanguíneas (100 amostras
sanguíneas de cães com alterações oculares e 100 amostras sanguíneas de cães sem alterações
oculares) foram encaminhadas ao Laboratório de Diagnóstico de Doenças Parasitárias da
Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás (LDDP/ EVZ/UFG) para
a execução de testes moleculares (PCR) para detecção de A. platys e E. canis.
17
Extração do DNA genômico das amostras
Após a coleta das amostras de sangue com EDTA dos 200 cães selecionados
foram realizados os testes de PCR para detecção dos hemoparasitos: A. platys e E. canis. O
DNA genômico das 200 amostras de sangue colhidas dos animais selecionados para o estudo
foi extraído utilizando o Kit GFX (Genomic Blood DNA Purification Kit, Pharmacia, Biotech
®) seguindo protocolo convencional de extração de DNA de acordo com instruções do
fabricante para um volume de 200µL de sangue total. As amostras obtidas foram
posteriormente utilizadas para a realização das reações de PCR para detecção de A. platys e E.
canis.
Amplificação do DNA por meio da PCR Convencional
As amostras de DNA genômico extraído dos 200 cães selecionados foram
submetidas à reação de PCR convencional para a identificação espécie-específica de A. platys
(36) e E. canis
(37).
Amplificação do DNA de Anaplasma platys por meio da PCR Convencional
O protocolo para o preparo da mistura de reagentes utilizados para a execução da
técnica de PCR convencional para a identificação espécie-específica de A. platys seguiu o
protocolo publicado por MARTIN et al. (36)
, com adaptações: 35,75µL de água ultrapura; 5
µL de 10X PCR Buffer (Invitrogen); 1 µL de dNTP 10 µM; 2 µL de MgCl2; 0,5 µL do primer
foward PLATYSF (5’-GAT TTT TGT CGT AGC TTG CTA GT-3’); 0,5 µL do primer
reverse EHR16SR (5’- TAG CAC TCA TCG TTT ACA GC -3’); 0,25 µL de TaqDNA
polymerase (5U/µL) (Invitrogen) e 5 µL do DNA extraído da amostra testada, alcançando-se
assim o volume total de 50 µL para o mix.
O programa de amplificação empregado nesta etapa constou de um passo inicial
de desnaturação a 94 ºC por dois minutos, seguido de 40 ciclos repetidos com as temperaturas
de 94 ºC por 30 segundos, anelamento a 58 °C por 30 segundos, extensão a 72 °C por um
minuto, finalizando-se com o adicional de extensão de 72 ºC por cinco minutos. O produto
final esperado para a reação de amplificação era um fragmento de 678pb do gene 16S rRNA
de A. platys.
18
Como controle positivo foi utilizado um isolado de referência para A. platys do
LDDP/EVZ/UFG e como controle negativo utilizou-se a água ultra-pura.
Amplificação do DNA de Ehrlichia canis por meio da PCR Convencional
O protocolo utilizado para a detecção de E. canis foi previamente estabelecido por
ALVES et al. (37)
com pequenas modificações para manter o volume total do mix da reação
em 50 µL: 37,75µL de água ultrapura (Invitrogen); 5 µL de 10X PCR Buffer; 1 µL de dNTP
10µM; 0,5 µL de EBR-1 forward primer (20 pmole/µL) (5’-CCT CTG GCT ATA GGA AAT
TG- 3’); 0,5 µL de EBR-5 reverse primer (20 pmole/µL) (5’-GGA GTG CTT AAC GCG
TTA G- 3’); 0,25 µL de TaqDNA polymerase (5U/µL) (Invitrogen) e 5 µL de DNA extraído
da amostra a ser testada. Como controle positivo, foi utilizada amostra de referência de E.
canis procedentes do LDDP/EVZ/UFG e como controle negativo do mix, utilizou-se água
ultra-pura.
Para o processo de amplificação por PCR, os ciclos e as temperaturas foram
definidos de acordo com adaptações do protocolo desenvolvido por ALVES et al. (37)
,
estabelecendo-se as seguintes condições: desnaturação inicial a 94 ºC por dois minutos,
seguido de 40 ciclos repetidos com as temperaturas de 94 ºC por 30 segundos, 53 ºC por 30
segundos e 72 ºC por um minuto, finalizando-se com um ciclo extra de extensão a 72 ºC por
cinco minutos. O produto alvo esperado para a reação foi um fragmento de 765 pb do gene
16S RNAr de E. canis.
Leitura e documentação das reações de PCR Convencional
Os amplicons obtidos da reação de PCR para detecção de E. canis e A. platys
foram inoculados em gel de agarose a 1,2% e corados por imersão em solução com brometo
de etídio (Life Technologies) a 0,4mg/mL. As leituras foram realizadas por visualização sob
luz ultravioleta, em transiluminador, como previamente descrito (38)
. Para a determinação do
tamanho dos fragmentos amplificados, utilizaram-se 1 µL de marcador de peso molecular de
100pb (Invitrogen) para cada corrida de eletroforese e 2,5 µL de corante para cada amostra.
Os resultados obtidos foram capturados e gravados utilizando um sistema de imagem digital
(Doc Print, Vilber Lourmat).
19
Análise estatística
Os dados referentes aos resultados dos exames laboratoriais foram organizados e
submetidos às avaliações quantitativas, analisados em tabelas de contingência 2x2, segundo
os tratamentos utilizados. A dispersão de frequência obtida foi testada pelo Teste exato de
Fisher para verificação de possíveis associações entre a presença e ausência de alterações
oculares observadas com as infecções por A. platys e E. canis em cães. As análises estatísticas
foram realizadas com o auxílio do programa Bioestat 5.0.
RESULTADOS
Dos 200 cães incluídos no estudo, 28,5% (57/200) e 4,5% (9/200) foram PCR-
positivos, respectivamente, para E. canis e A. platys (FIGURA 1). Foram identificadas
infecções mistas entre E. canis e A. platys em apenas 2% (4/200) do total de cães do estudo.
A população canina do estudo incluiu cães com alterações oculares (CAO;
n=100), dos quais 33 foram PCR- positivos para E. canis (33%) e cinco foram PCR-
positivos para A. platys (5%), e cães sem alterações oculares (SAO; n=100), dos quais 24
cães foram PCR- positivos para E. canis (24%) e quatro cães foram PCR- positivos para A.
platys (4%) (TABELA 1).
TABELA 1. Resultados dos testes de PCR para detecção de E. canis e A. platys em amostras
de sangue de cães com alterações oculares (CAO) e sem alterações oculares (SAO) atendidos
na cidade de Goiânia- GO, Brasil.
Grupos de
estudo
PCR para detecção de Ehrlichia
canis Total Exato de Fisher
Positivo Negativo
Alteração ocular
Sim 33 67 100 p = 0,1634
Não 24 76 100
Grupos de
estudo
PCR para detecção de A. platys Total Exato de Fisher
Positivo Negativo
Alteração ocular
Sim 5 95 100 p = 0,7488
Não 4 96 100
Dentre os hemoparasitos, E. canis e A. platys, detectados e identificados por PCR,
E. canis foi o de maior frequência, tanto no grupo de cães com alterações oculares (33%;
20
33/100) quanto no grupo de cães sem alterações oculares (24%; 24/100). A frequência de A.
platys foi de 5% (5/100) para o grupo de cães com alterações oculares e 4% (4/100) para o
grupo de cães sem alterações oculares. As co-infecções de E. canis com A. platys foram
observadas em proporções iguais para o grupo de cães com alterações oculares e o grupo de
cães sem alterações oculares, com frequência de infecções mistas de 2% (2/100) para ambos
os grupos.
Relação entre infecções por Ehrlichia canis e alterações oculares
Foram detectados 57 cães PCR-positivos para E. canis, sendo 33 cães (58%;
33/57) pertencentes ao grupo de cães com alterações oculares (CAO) e 24 cães (42%; 24/57)
pertencentes ao grupo de cães sem alterações oculares (SAO).
No grupo de cães com alterações oculares e PCR positivos para E. canis (n=33),
uveíte bilateral, uveíte unilateral e panuveíte foram identificadas, respectivamente, em 70%
(23/33), 6% (2/33) e 3% (1/33) destes cães. No grupo de cães com alterações oculares (CAO),
o complexo panuveíte, uveíte unilateral e uveíte bilateral corresponderam às lesões oculares
mais frequentes, sendo identificados em 79% (26/33) dos cães PCR positivos para E. canis
(n=33) (TABELA 2). As alterações oculares que apresentaram associação estatística com a
infecção por E. canis foram uveíte bilateral e descolamento de retina.
21
FIGURA 2. Uveíte, hipópio e úlcera de córnea no olho esquerdo
de um cão Shih tzu, macho, de dois anos com PCR positivo para
E. canis.
FIGURA 1. Uveíte no olho direito de um cão SRD, macho, de
quatro anos com PCR positivo para E. canis
22
Todos os cães que apresentaram descolamento de retina (5/5) foram PCR positivos
para E. canis. Alterações oculares como úlcera de córnea, ceratoconjuntivite seca,
conjuntivite, glaucoma e entrópio foram identificados em cães PCR-positivos para E. canis,
porém não houve relação estatística significativa entre a infecção por E. canis e estas
alterações oculares. Os três cães que apresentaram catarata como lesão ocular foram PCR-
negativo para E. canis (TABELA 2).
TABELA 2. Tipos de manifestações oculares identificadas nos 100 cães pertencentes ao
grupo (CAO).
ALTERAÇÃO OCULAR
PCR para detecção de
Ehrlichia canis
Total
n=100
Exato de
Fisher
Positivo Negativo
Panuveíte, uveíte unilateral ou
uveíte bilateral
Sim 26 22 48 p < 0,0001
Não 7 45 52
Descolamento de retina
Sim 5 0 5 p = 0,0032
Não 28 67 95
Ulcera de córnea
Sim 6 23 29 p = 0,1069
Não 27 44 71
Catarata
Sim 0 3 3 p = 0,5488
Não 33 64 97
Ceratoconjuntivite seca
Sim 1 12 13 p = 0,0551
Não 32 55 87
Glaucoma
Sim 1 7 8 p = 0,2651
Não 32 60 92
Conjuntivite
Sim 7 17 24 p = 0,8044
Não 26 50 76
Entrópio
Sim 1 4 5 p = 0,6640
Não 32 63 95
Relação entre infecções por Anaplasma platys e alterações oculares
Dos nove cães (4,5%; 9/200) PCR positivo para A. platys, 55,55% (5/9)
apresentaram alterações oculares. Dos cinco cães PCR positivo para A. platys com lesões
oculares, 40% (2/5) apresentaram-se coinfectados com E. canis. Dessa forma, não foi possível
23
verificar a relação das alterações oculares com a infecção por A. platys devido ao baixo
número de cães com alterações oculares infectados com esta riquétsia (QUADRO 1).
QUADRO 1. Tipos de manifestação ocular em cães PCR positivo para A. platys.
Caso
No. Raça Sinal ocular
Doenças
concomitantes
1 SRD Conjuntivite bilateral + úlcera de córnea no olho direito E. canis
2 SRD Uveíte bilateral E. canis
3 Poodle Uveíte bilateral + conjuntivite -
4 SRD Úlcera de córnea no olho esquerdo -
5 Shih Tzu Conjuntivite -
DISCUSSÂO
Lesões oculares são comumente relatadas em cães com E. canis, podendo estar
presentes em todas as fases da doença. E os resultados deste estudo indicaram que uveíte e
descolamento de retina pode ser associada à EMC.
A frequência de alterações oculares em cães diagnosticados com EMC (58%) no
presente estudo foi maior que os valores reportados anteriormente por Oriá et al. (13)
para
casos de infecção natural por E. canis (10-15%), entretanto, a prevalência de lesões oculares
em casos de infecção natural por E. canis é muito variável e a patogênese das lesões oculares
FIGURA 3. Úlcera de córnea no olho esquerdo de um cão SRD,
macho, de três anos com PCR positivo para A. platys.
24
associada a EMC não está totalmente elucidada. Resultados semelhantes aos descritos aqui
foram relatados por Martin (14)
, em que 50% dos cães infectados experimentalmente
apresentaram lesões oculares durante a fase aguda da EMC, porém como o presente estudo
avaliou cães naturalmente infectados por E. canis, não foi possível determinar o dia da
infecção e estabelecer uma associação entre as manifestações oculares e a fase clínica da
EMC.
Frequência de lesões oculares um pouco menor (37%) foi relatada em cães
sorologicamente positivos para E. canis, sendo panuveítes com descolamento de retina as
lesões oculares mais frequentes (15)
.
O complexo panuveíte, uveíte unilateral e uveíte bilateral corresponderam às
lesões oculares mais frequentes nos cães deste estudo, sendo identificados em 79% (26/33)
dos cães PCR positivos para E. canis (n=33), o que permite sugerir que estas alterações
oculares sejam decorrentes da infecção por E. canis. Esta frequência foi menor que a
reportada por ORIÁ et al. (18)
, os quais verificaram uma frequência para E. canis de 86,27%
(44/51) ao analisarem 51 cães com uveíte utilizando testes sorológicos como métodos de
diagnóstico. Já KOMNENOU et al. (16)
, ao analisarem somente cães com sorologia positiva
para E. canis, encontraram uveíte em 100% (90/90) destes cães. Em um estudo, realizado no
ano de 2002, E. canis foi o organismo infeccioso com maior associação com os casos de
uveíte em 102 cães (17)
. O exame histológico dos olhos de 27 cães infectados
experimentalmente com E. canis, E. ewingii ou E. chaffeensis revelou uveíte em 100% (n=14)
dos cães infectados experimentalmente apenas com E. canis, não sendo observadas em cães
infectados com E. ewingii ou E. chaffeensis (39)
.
A maioria dos estudos realizados anteriormente realizou o diagnóstico da EMC
com base em testes sorológicos para detecção de anticorpos específicos contra E. canis. No
entanto, estes métodos são, muitas vezes, inconclusivos devido à baixa produção de
anticorpos na fase aguda da doença, reação cruzada entre organismos relacionados, e
persistência de anticorpos pós-infecção (11)
. Dessa forma, a detecção direta do agente
infeccioso, utilizando como método de diagnóstico a PCR descrita neste trabalho, oferece a
vantagem de que uma infecção pode ser diferenciada de uma possível presença de anticorpos
residuais sem infecção.
Conjuntivite já foi observada nos casos de EMC e a presença de DNA de E. canis
foi identificada em secreções da conjuntiva de cães naturalmente e experimentalmente
infectados (20)
. Neste estudo, a conjuntivite foi observada em 21,21% (7/33) dos cães com
alterações oculares e PCR positivos para E. canis.
25
Verificou-se que 18,18% (6/33) dos cães com alterações oculares e PCR positivos
para E. canis apresentaram úlcera de córnea, a qual já foi reportada anteriormente nos casos
de EMC (16)
, porém sem diferença estatística significativa.
A. platys é considerada de menor importância patogênica que E. canis, e cães com
TCIC frequentemente apresentam sinais clínicos mais brandos ou são assintomáticos. No
entanto, co-infecções com A. platys e E. canis foram relatados em cães do Brasil, o que leva
ao agravamento do quadro clínico destes animais (30-32)
. Dentre os cães com manifestação
ocular e PCR positivos para A. platys, 40% (2/5) apresentaram infecção concomitante com E.
canis, não permitindo atribuir a lesão ocular a infecção específica por A. platys. Não foi
possível verificar a relação das manifestações oculares com a infecção por A. platys devido ao
baixo número de cães com manifestações oculares infectados com esta riquétsia.
Alterações oculares podem estar presentes em todas as fases da EMC e casos de
uveíte já foram atribuídos à infecção por A. platys (34, 35)
. Assim, o exame ocular de animais
com doenças sistêmicas é um componente diagnóstico essencial do exame físico completo, o
qual pode auxiliar o diagnóstico da EMC e TCIC em cães. Porém, novos estudos a respeito
das manifestações clínicas oculares decorrentes da EMC se fazem necessários.
CONCLUSÃO
A. platys e E. canis foram detectados por PCR tanto no grupo de cães com
alterações oculares como nos cães sem alterações oculares. Verificou-se alta correlação entre
a presença de uveíte e descolamento de retina e resultados PCR positivos para E. canis. Foram
observadas conjuntivite, uveíte e úlcera de córnea em cães naturalmente infectados por A.
platys.
26
REFERÊNCIAS
1. Dumler JS, Barbet AF, Bekker CP, Dasch GA, Palmer GH, Ray SC, et al.
Reorganization of genera in the families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in the order
Rickettsiales: unification of some species of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with
Ehrlichia and Ehrlichia with Neorickettsia, descriptions of six new species combinations and
designation of Ehrlichia equi and 'HGE agent' as subjective synonyms of Ehrlichia
phagocytophila. International journal of systematic and evolutionary microbiology. 2001
Nov;51(Pt 6):2145-65. PubMed PMID: 11760958.
2. Donatien A LF. Existence en Algére d´une Rickettsia du chien. . Bull Soc Pathol Exot
1935;28: :408-9.
3. BORIN SC, L.Z; FERREIRA, F.A. Aspectos epidemiológicos, clínicos e
hematológicos de 251 cães portadores de mórula de Ehrlichia spp. naturalmente infectados. .
Arq Bras Med Vet Zootec. 2009;61(3):566-71.
4. Costa JO, Batista-Júnior JA, Silva M, Guimarães MP. Ehrlichia canis infection in dog
in Belo Horizonte, Brazil. Arquivo da Escola de Veterinária da Universidade Federal de
Minas Gerais. 1973;25:199-200.
5. Bulla C, Kiomi Takahira R, Pessoa Araujo J, Jr., AparecidaTrinca L, Souza Lopes R,
Wiedmeyer CE. The relationship between the degree of thrombocytopenia and infection with
Ehrlichia canis in an endemic area. Veterinary research. 2004 Jan-Feb;35(1):141-6. PubMed
PMID: 15099511.
6. Dagnone AS, de Morais HSA, Vidotto MC, Jojima FS, Vidotto O. Ehrlichiosis in
anemic, thrombocytopenic, or tick-infested dogs from a hospital population in South Brazil.
Veterinary parasitology. 2003 11/28/;117(4):285-90.
7. Labarthe N, de Campos Pereira M, Barbarini O, McKee W, Coimbra CA, Hoskins J.
Serologic prevalence of Dirofilaria immitis, Ehrlichia canis, and Borrelia burgdorferi
infections in Brazil. Veterinary therapeutics : research in applied veterinary medicine. 2003
Spring;4(1):67-75. PubMed PMID: 12756637.
8. Moreira SM BC, Araújo RB, Santos M, and Passos LMF. . Estudo retrospectivo (1998
a 2001) da erliquiose canina em Belo Horizonte. . Arq Bras Med Vet Zoot 2003;55(2):7.
9. Costa LM, Jr., Rembeck K, Ribeiro MF, Beelitz P, Pfister K, Passos LM. Sero-
prevalence and risk indicators for canine ehrlichiosis in three rural areas of Brazil. Veterinary
journal. 2007 Nov;174(3):673-6. PubMed PMID: 17204439.
10. Ueno TE, Aguiar DM, Pacheco RC, Richtzenhain LJ, Ribeiro MG, Paes AC, et al.
Ehrlichia canis in dogs attended in a veterinary hospital from Botucatu, São Paulo State,
Brazil. Brazilian journal of veterinary parasitology : Orgão Oficial do Colégio Brasileiro de
Parasitologia Veterinaria. 2009 Jul-Sep;18(3):57-61. PubMed PMID: 19772777.
11. Harrus S, Waner T. Diagnosis of canine monocytotropic ehrlichiosis (Ehrlichia canis):
an overview. Veterinary journal. 2011 Mar;187(3):292-6. PubMed PMID: 20226700.
12. Nakaghi ACH, Machado RZ, Costa MT, André MR, Baldani CD. Canine ehrlichiosis:
clinical, hematological, serological and molecular aspects. Ciência Rural. 2008;38:766-70.
13. Oriá AP, Pereira PM, Laus JL. Uveitis in dogs infected with Ehrlichia canis. Ciência
Rural. 2004. 34:1289-95.
27
14. MARTIN CL. Ocular manifestations of systemic disease. Cap.37, p.1408-1409.
In:GELATT, KN Veterinary ophthalmology Philadelphia : Lippincott Williams & Wilkins,
1999.
15. Leiva M, Naranjo C, Pena MT. Ocular signs of canine monocytic ehrlichiosis: a
retrospective study in dogs from Barcelona, Spain. Veterinary ophthalmology. 2005. Nov-
Dec;8(6):387-93. PubMed PMID: 16359361.
16. Komnenou AA, Mylonakis ME, Kouti V, Tendoma L, Leontides L, Skountzou E, et
al. Ocular manifestations of natural canine monocytic ehrlichiosis (Ehrlichia canis): a
retrospective study of 90 cases. Veterinary ophthalmology. 2007 May-Jun;10(3):137-42.
PubMed PMID: 17445073.
17. Massa KL, Gilger BC, Miller TL, Davidson MG. Causes of uveitis in dogs: 102 cases
(1989-2000). Veterinary ophthalmology. 2002. Jun;5(2):93-8. PubMed PMID: 12071865.
18. ORIÁ APea. Ophthalmic, hematologic and serologic findings in dogs with suspected
Ehrlichia canis infections. . Revista Brasileira de Ciência Veterinaria. 2008;15(2):94-7.
19. Harrus S, Ofri R, Aizenberg I, Waner T. Acute blindness associated with monoclonal
gammopathy induced by Ehrlichia canis infection. Veterinary parasitology. 1998 Jul
31;78(2):155-60. PubMed PMID: 9735920.
20. Baneth G, Harrus S, Ohnona FS, Schlesinger Y. Longitudinal quantification of
Ehrlichia canis in experimental infection with comparison to natural infection. Veterinary
microbiology. 2009 May 12;136(3-4):321-5. PubMed PMID: 19128893.
21. Walser-Reinhardt Lea. Direct detection of Ehrlichia canis by PCR in the conjunctiva
of a dog with bilateral anterior uveitis. . Schweizer Archiv für Tierheilkunde. 2012.154:149-
52.
22. ALMOSNY NRP. Ehrlichia canis (Donatien & Lestoquard, 1935): Avaliação
parasitológica, hematológica e bioquímica sérica da fase aguda de cães e gatos
experimentalmente infectados.: Tese (Doutorado em medicina veterinária) –Universidade
Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica; 1998. p. 202f.
23. Ferreira RF, Cerqueira Ade M, Pereira AM, Velho PB, Azevedo RR, Rodrigues IL, et
al. Cross-reaction evaluation of PCR-Anaplasma platys positive dogs tested to Anaplasma
phagocytophilum antibodies by commercial ELISA. Brazilian Journal of Veterinary
Parasitology : Orgão Oficial do Colégio Brasileiro de Parasitologia Veterinária. 2008 Sep;17
Suppl 1:5-8. PubMed PMID: 20059806.
24. Huang, Haibin, Unver, Ahmet, Perez, J. M, et al. Prevalence and molecular analysis of
Anaplasma platys in dogs in Lara, Venezuela. Brazilian Journal of Microbiology. 2005.
25. Costa-Junior LM, Rembeck K, Passos LM, Ribeiro MF. Factors associated with
epidemiology of Anaplasma platys in dogs in rural and urban areas of Minas Gerais State,
Brazil. Preventive veterinary medicine. 2013 May 1;109(3-4):321-6. PubMed PMID:
23157927.
26. Ferreira RF, de Mello Figueiredo Cerqueira A, Pereira AM, Guimaraes CM, de Sa
AG, da Silva Abreu F, et al. Anaplasma platys diagnosis in dogs: comparison between
morphological and molecular tests. International Journal of Applied Research in Veterinary
Medicine. 2007;5(3):7.
27. Dantas-Torres F. Canine vector-borne diseases in Brazil. Parasites & vectors.
2008;1(1):25. PubMed PMID: 18691408. Pubmed Central PMCID: 2533296.
28
28. Cardozo GP, Oliveira LP, Zissou VG, Donini IAN, Roberto PG, Marins M. Analysis
of the 16S rRNA gene of Anaplasma platys detected in dogs from Brazil. Brazilian Journal of
Microbiology. 2007;38:478-9.
29. Greene CE. Infectious diseases of the dog and cat. 3. ed. St. Louis, Mo.: Elsevier
Saunders; 2006. 1387 p.
30. Macieira DdB, Messick JB, Cerqueira AdM, Freire IM, Linhares GF, Almeida NK, et
al. Prevalence of Ehrlichia canis infection in thrombocytopenic dogs from Rio de Janeiro,
Brazil. Veterinary clinical pathology / American Society for Veterinary Clinical Pathology.
2005;34(1):44-8. PubMed PMID: 15732017.
31. Santos F, Coppede JS, Pereira ALA, Oliveira LP, Roberto PG, Benedetti RBR, et al.
Molecular evaluation of the incidence of Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Babesia spp.
in dogs from Ribeirão Preto, Brazil. The Veterinary Journal. 2009 1//;179(1):145-8.
32. Ramos CA, Ramos RA, Araujo FR, Guedes DS, Jr., Souza, II, Ono TM, et al.
Comparison of nested-PCR with blood smear examination in detection of Ehrlichia canis and
Anaplasma platys in dogs. Revista brasileira de parasitologia veterinaria = Brazilian journal
of veterinary parasitology : Orgão Oficial do Colégio Brasileiro de Parasitologia Veterinária.
2009 Dec;18 Suppl 1:58-62. PubMed PMID: 20040193.
33. Dagnone AS, de Morais HS, Vidotto MC, Jojima FS, Vidotto O. Ehrlichiosis in
anemic, thrombocytopenic, or tick-infested dogs from a hospital population in South Brazil.
Veterinary parasitology. 2003 Nov 28;117(4):285-90. PubMed PMID: 14637030.
34. Glaze MBG, S.D. . Uveitis associated with Ehrlichia platys infection in a dog. . J Am
Vet Med Assoc. 1986;189(8):916-7.
35. Gaunt S, Beall M, Stillman B, Lorentzen L, Diniz P, Chandrashekar R, et al.
Experimental infection and co-infection of dogs with Anaplasma platys and Ehrlichia canis:
hematologic, serologic and molecular findings. Parasites & vectors. 2010;3(1):33. PubMed
PMID: 20377870. Pubmed Central PMCID: 2859368.
36. Martin AR, Brown GK, Dunstan RH, Roberts TK. Anaplasma platys: an improved
PCR for its detection in dogs. Experimental parasitology. 2005 Mar;109(3):176-80. PubMed
PMID: 15713449.
37. Alves LM, Linhares GFC, Chaves NST, Monteiro LC, Linhares DCL. Avaliação de
iniciadores e protocolo para o diagnóstico de pancitopenia tropical canina por PCR. 2005.
2005 2005-03-28Avaliação de iniciadores e protocolo para o diagnóstico da pancitopenia
tropical canina por PCR. Ciên Animal Bras. Goiânia;6(1):6. Epub 2005-01-01.
38. Sambrook JF, E.F.; Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring
harbor laboratory press, . 2 ed. New York1989.
39. Pancieira RJE, S.A.; Confer, A.W. . Ocular histopathology of ehrlichial infections in
the dog. . Veterinary Pathology. 2001;38:43-6.
29
CAPÍTULO 3
DETECÇÃO ESPECÍFICA POR PCR EM TEMPO REAL DE Anaplasma
platys E Ehrlichia canis
SPECIFIC DETECTION BY REAL-TIME PCR OF Anaplasma platys AND Ehrlichia canis
Herika Xavier da Costa
1, Sabrina Castilho Duarte
2, Mauricio Egídio Cantão
2, Valéria de Sá Jayme
3,
Osvaldo José da Silveira Neto4, Guido F. C. Linhares
5.
1. Doutoranda em Ciência Animal, Universidade Federal de Goiás-UFG, Goiânia-GO, Brasil. Email: [email protected]
2. Pesquisador da EMBRAPA, Concórdia-SC, Brasil. 3. Professora de Epidemiologia e Saúde Pública da Escola de Veterinária e Zootecnia (EVZ)- UFG
4. Professor efetivo do curso de zootecnia da UEG e professor titular da Faculdade Objetivo- IUESO
5. Professor de Doenças Parasitárias da Escola de Veterinária e Zootecnia (EVZ)- UFG.
RESUMO
Anaplasma platys e Ehrlichia canis são riquétsias intracelulares obrigatórias de cães. A. platys parasita plaquetas causando a trombocitopenia cíclica infecciosa canina (TCIC), enquanto que E. canis possui
tropismo por células mononucleares circulantes causando a erliquiose monocítica canina (EMC). O
diagnóstico definitivo é firmado através do emprego de testes de diagnóstico específicos. Dois novos
protocolos de ensaios de PCR em tempo real (qPCR) para o detecção de A. platys e E. canis foram desenvolvidos a partir de sequências de referência para o gene 16S rRNA de A. platys e E. canis. Os
novos iniciadores e sondas desenhados foram capazes de detectar A. platys e E. canis. Identificação de
infecções naturais em cães por A. platys e E. canis, previamente confirmada por PCR convencional demonstrou alta correlação na sensibilidade (100% para A. platys e E. canis) e especificidade
epidemiológicas (100% para A. platys e 98,41% para E. canis) com os novos protocolos de qPCR
(sondas de hidrólise TaqMan). Os testes de especificidade analítica produziram resultado espécie
específicos, não ocorrendo amplificação de DNA dos seguintes hemoparasitos: Babesia vogeli, Hepatozoon canis e Mycoplasma haemofelis. DNA de R. sanguineus também não foi amplificado. Os
dois novos protocolos de qPCR descritos aqui foram capazes de detectar até 0,14 fg de DNA de E.
canis e 0,9 fg de DNA de A. platys e representam alternativas como ferramenta de diagnóstico para a detecção específica de A. platys e E. canis, sendo útil para o diagnóstico destas hemoparasitoses em
cães.
PALAVRAS-CHAVE: Cães, diagnóstico molecular, hemoparasitoses caninas, PCR.
ABSTRACT
Anaplasma platys and Ehrlichia canis are obligate intracellular rickettsial organisms of dogs. A. platys
appears to parasitize only platelets causing canine infectious cyclic thrombocytopenia (CICT) in dogs, whereas E. canis has tropism for circulating mononuclear cells causing canine monocytic ehrlichiosis
(CME). Definitive diagnosis is made by specific diagnostic tests. Two new real time PCR protocols
(qPCR) for the detection of A. platys and E. canis were developed from reference sequences for the 16S rRNA gene of A. platys and E. canis. New primers and probes were able to detecting A. platys and
E. canis. Identification of natural infections in dogs by A. platys and E. canis, previously confirmed by
conventional PCR showed high correlation sensitivity (100% for A. platys and E. canis) and epidemiological specificity (100% for A. platys and 98, 41% for E. canis) with new qPCR (hydrolysis
probe TaqMan) protocols. Analytical specificity tests results an specific species not occurring DNA
amplification of the following blood parasites Babesia vogeli, Hepatozoon canis and Mycoplasma
haemofelis. R. sanguineus DNA was not amplified. Two new qPCR protocols described was able to
detect 0,14 fg of E. canis DNA and 0,9 fg of A. platys DNA and represent alternative as a diagnostic
tool for the specific detection of A. platys and E. canis and is useful for diagnosis of these canine
hemoparasitosis. KEYWORDS: Canine hemoparasitosis, dogs, molecular diagnosis, PCR.
30
INTRODUÇÃO
Anaplasma platys e Ehrlichia canis são patógenos de canídeos, com importância
mundial, transmitidos por carrapatos. São riquétsias intracelulares obrigatórias, sendo que a
primeira parasita plaqueta no curso da doença conhecida por trombocitopenia cíclica
infecciosa canina (TCIC), enquanto a segunda apresenta tropismo por células mononucleares
circulantes, causando a erliquiose monocítica canina (EMC). Ambos os organismos são
encontrados em todos os continentes do mundo, no entanto, as maiores prevalências são
observadas nas regiões de clima tropical e subtropical (1-3)
, como China (4)
, Caribe (3)
,
Venezuela (5)
e Brasil (6-8)
.
O diagnóstico desses patógenos é geralmente realizado por detecção das riquétsias
em esfregaços sanguíneos corados e por métodos sorológicos (9, 10)
. No entanto, em virtude
das semelhanças clínicas com outras enfermidades, baixa parasitemia nas infecções por E.
canis (11)
, parasitemia cíclica nas infecções por A. platys (12)
, baixa resposta de anticorpos na
fase aguda da doença, reação cruzada entre organismos relacionados, e persistência de
anticorpos pós-infecção (11)
, esses métodos são, muitas vezes, inconclusivos. Outro fator que
dificulta o diagnóstico de A. platys por meio de observação de esfregaços sanguíneos é que
têm sido descritos casos de inclusões em plaquetas nas infecções por E. canis (13, 14)
. Dessa
forma, há grande preocupação com o desenvolvimento e uso cada vez maior de novas técnicas
para o diagnóstico da infecção por E. canis e A. platys.
As tradicionais técnicas de diagnóstico, como o exame parasitológico direto e a
sorologia, são valiosas ferramentas de diagnóstico, no entanto, a discriminação e identificação
precisa em nível de espécie requer o uso de técnicas moleculares. Assim, os métodos
moleculares, como a nested-PCR, PCR e PCR em tempo real (qPCR), têm sido desenvolvidos
e otimizados para o diagnóstico eficiente desses hemoparasitos e, mais recentemente,
utilizados para o diagnóstico e detecção específica dessas bactérias (7, 12-22)
. Além disso, a
identificação precisa do estado de infecção dos cães torna-se cada vez mais importante em
virtude do crescente aumento nos estudos dessas riquétsias como potenciais agentes causais
de infecções em humanos (23-26)
.
Recentemente, no ano de 2014, identificaram-se através da PCR dois casos de A.
platys acometendo mulheres na Venezuela, inclusive com a amplificação e sequenciamento
do DNA de A. platys (25)
e um caso de erliquiose humana por E. canis no México (26)
. Dessa
forma, é importante enfatizar a necessidade de avaliar o potencial zoonótico de A. platys e E.
31
canis, bem como implementar técnicas específicas e moleculares para o diagnóstico precoce
destas hemoparasitoses.
Alguns protocolos de qPCR encontram-se disponíveis para a detecção de diversos patógenos.
Porém, protocolos de qPCR para a detecção específica de A. platys (27, 28)
e E. canis (16, 19, 20, 27)
ainda são muito escassos. Diante do exposto, a presente pesquisa teve como objetivos
principais: padronização e otimização de novos protocolos de ensaios de qPCR utilizando
sonda de hidrólise TaqMan para detecção específica de A. platys e E. canis.
MATERIAL E MÉTODOS
Local e período de realização
A presente pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Diagnóstico de Doenças
Parasitárias (L.D.D.P.) e Laboratório de Biologia Molecular (LBM) do Setor de Medicina
Veterinária Preventiva (SMVP) da Escola de Veterinária e Zootecnia (EVZ) da Universidade
Federal de Goiás (UFG), durante o período de setembro de 2013 a fevereiro de 2015.
Obtenção de amostras de DNA referência
Para a realização dos ensaios experimentais de qPCR foram utilizadas amostras de
DNA genômico de Canis familiaris, Rhipicephalus sanguineus e dos hemoparasitos: E. canis,
A. platys, Babesia vogeli, Hepatozoon canis e Mycoplasma haemofelis.
As amostras de DNA genômico de R. sanguineus utilizadas foram provenientes
do Centro de Parasitologia Veterinária (CPV) da EVZ/UFG, e as amostras de DNA genômico
de C. familiaris, E. canis, A. platys, B. vogeli, H. canis e M. haemofelis foram procedentes do
LDDP/EVZ/UFG.
Sequenciamento e análise das sequências de referência
Os produtos de PCR das cinco amostras de DNA genômico dos hemoparasitos
obtidos foram purificados utilizando-se kit comercial (QIAquick Gel Extraction Kit
Protocol, Qiagen), conforme recomendações do fabricante. Após a identificação, as amostras
foram refrigeradas e imediatamente encaminhadas para a realização do sequenciamento no
Centro de Pesquisas sobre o Genoma Humano e Células-tronco (CEGH_CEL), ligado ao
Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (USP) e as análises de Bioinformática
para comprovar a identidade filogenética das amostras utilizadas como referência para os
testes de PCR foram realizadas na Embrapa Suínos e Aves (CNPSA). As cinco amostras
32
foram sequenciadas utilizando o Applied Biosystems ABI 3730 DNA Analyser com o
BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. As sequências Forward e Reverse de cada
amostra foram analisadas e montadas utilizando o pacote phred/phrap/consed. A sequência
consenso (Contig) das referências relativas às bactérias foram classificadas utilizando o banco
de sequências de 16S RDP Database (Versão 11.3 – http://rdp.cme.msu.edu). A sequência
referência de protozoário foi classificada utilizando o banco Silva Database (http://www.arb-
silva.de).
Grupo de cães utilizados no estudo
Foram utilizadas 500 amostras de sangue de cães obtidas dos experimentos
aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFG sob Protocolo n.
002/11 e 025/13 e mantidas no LDDP do Setor de Medicina Veterinária Preventiva (EVZ/
UFG) para a realização dos ensaios moleculares de PCR convencional e qPCR para a
detecção específica de E. canis e A. platys.
Extração do DNA genômico das amostras
O processo de extração do DNA genômico das amostras utilizadas neste
experimento foi realizado empregando-se o Kit Illustra Blood (GenomicPrep Mini Spin Kit,
GE healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) seguindo instruções do fabricante para
um volume de 200 µL de sangue total da amostra. Os eluatos obtidos no final das extrações de
DNAs foram devidamente identificados, alíquotados e armazenados a -20 ºC para
posteriormente serem submetidos aos testes moleculares.
Quantificação do DNA
Após a amplificação por PCR convencional dos fragmentos alvos de DNA
genômico de C. familiaris, R. sanguineus e dos hemoparasitos: E. canis, A. platys, B.vogeli,
H. canis e M. haemofelis, uma alíquota de 2 μL do amplicon obtido de cada reação foi
submetida à análise de concentração do DNA pelo método fluorométrico, empregando-se o
aparelho Qubit® 2.0 Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
As amostras de amplicons específicos que apresentaram concentração de DNA
acima de 10ng/μL, foram submetidas a 10 diluições na base 10 (1:10) com água ultra pura
para realização do teste de sensibilidade analítica e quantificação absoluta pela curva padrão
do qPCR, considerando-se a fórmula C1. V1 = C2.V2, onde:
C1 = concentração do DNA obtida na quantificação;
33
V1 = volume inicial do DNA concentrado
C2 = concentração de trabalho correspondente a 10ng/μL;
V2 = volume final, sendo que o volume da água ultra pura a ser adicionada
equivale à fórmula (V2- V1).
Amostras de sangue com anticoagulante EDTA de dois cães com exame
parasitológico direto positivo para A. platys e dois cães com exame parasitológico direto
positivo para E. canis também foram submetidas ao processo de extração e quantificação de
DNA pelo método de fluorometria empregando-se o aparelho Qubit® 2.0 Fluorometer a fim
de auxiliar a realização do teste de sensibilidade analítica e quantificação absoluta pela curva
padrão.
O DNA extraído do sangue de cães positivos para A. platys e E. canis foi diluído
quatro vezes na base 10 (10-1;
10-2;
10-3;
10-4
). Para minimizar riscos de contaminação, os
procedimentos como extração de DNA, preparação do mix de PCR e amplificação foram
realizados em salas separadas, empregando-se diferentes jogos de pipetas e capelas de fluxo
laminar.
Desenvolvimento dos ensaios de PCR em tempo real para A. platys e E. canis
Desenho dos iniciadores e sondas
Os desenhos de iniciadores e sondas utilizadas para a amplificação e detecção
espécie-específica de A. platys e E. canis foram realizados tendo como base os registros sobre
sequências de genes depositados no banco de dados do Genbank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Foram selecionados iniciadores e sondas para amplificação e
detecção espécie-específicos de A. platys e E. canis, com o objetivo de se obter produtos da
amplificação de uma sequência alvo do gene 16S rRNA por qPCR utilizando sonda de
hidrólise TaqMan.
Os iniciadores e sondas foram selecionados a partir de sequências de referência
para o gene 16S rRNA das espécies do gênero Anaplasma e Ehrlichia. Foram, portanto,
utilizadas sequências de referência para as seguintes espécies, com correspondentes números
de acesso no GenBank: A. bovis (AF294789), A. phagocytophilum (U02521), A. platys
(AF156784), E. canis (AF162860), E. chaffeensis (U86665), E. ewingii (U96436) e
Neorickettsia risticii (M21290).
34
Em seguida, as sequências foram identificadas, copiadas em arquivo digital,
editadas no modelo fasta e submetidas ao alinhamento pelo método de Clustal W 30
, através
do software Meglign (LaserGene, DNAStar, Inc.).
A partir dos alinhamentos obtidos, os iniciadores e sondas de hidrólise para
detecção específica de A. platys e E. canis foram selecionados, dando-se preferência para
regiões de menor consenso na identidade entre as diferentes espécies. Iniciadores e sondas
também foram selecionados de regiões conservadas do gene 16S rRNA quanto à identidade
entre as espécies do gênero Ehrlichia e Anaplasma, a partir dos mesmos alinhamentos.
As especificações técnicas utilizadas para desenhar os novos iniciadores e sondas
foram retiradas do guia de introdução do Primer Express ® Software Version 3.0 relativas ao
tamanho, temperaturas de melting e composição de bases guanina/citosina dos iniciadores,
sondas e amplicons.
Após a seleção e antes da síntese, os iniciadores e sondas de hidrólise foram
submetidos à avaliação de similaridade com as sequências do GenBank, utilizando-se o
algoritmo BLASTN® (Basic Local Alignment Search Tool- Nucleotides) e primer-BLAST-
NCBI.
Foram construídos sondas e iniciadores senso e anti-senso do gene 16S rRNA
para A. platys e E. canis. As sequências dos iniciadores senso e anti-senso que, em conjunto,
apresentaram percentual de identidade específico para A. platys e E. canis, foram
encaminhadas à companhia comercial especializada para a síntese dos oligonucleotídeos
(Invitrogen, Life Technologies Brasil, São Paulo/SP). As sequências das sondas de hidrólise
Taqman (FAM™/MGB) foram sintetizadas pela Life Technologies (Carlsbad, California).
Ensaios de PCR convencional
As amostras de DNA obtidas da extração de DNA das 500 amostras sanguíneas
de cães foram submetidas a ensaios de PCR convencional para detecção espécie-específicas
de E. canis (15)
e A. platys (12)
.
O DNA extraído de cada amostra foi testado por técnica de PCR convencional
para a presença de E. canis e A. platys. Para tal fim, utilizaram-se as seguintes sequências de
iniciadores para detecção específica do gene 16S rRNA de E. canis (15)
: EBR1 (5’-CCT CTG
GCTATA GGA AAT TG- 3’) e EBR5 (5’-GGA GTG CTT AAC GCG TTA G- 3’), para a
amplificação de fragmento de 765pb do gene 16S rRNA. Para A. platys empregou-se as
sequências dos iniciadores: PLATYSF (5’-GAT TTT TGT CGT AGC TTG CTA TG-3’) e
35
EHR16SR (5’- TAG CAC TCA TCG TTT ACA GC -3’) para a detecção específica de um
fragmento de 678pb do gene 16S rRNA de A. platys (12)
.
Os testes de PCR convencional para as hemoparasitoses estudadas foram
realizados adotando-se as seguintes concentrações de reagentes em um volume total de 50 µL:
35,75µL água ultrapura; 5 µL 10X PCR Buffer; 1 µL dNTP 10Mm; 2 µL MgCl2; 0,5 µL de
cada iniciador (10 µM); 0,25 µL TaqDNA polymerase (5U/µL) (Invitrogen) e 5 µL da
amostra teste de DNA.
Para o processo de amplificação por PCR, os ciclos e as temperaturas foram
definidos de acordo com ALVES et al.(15)
e MARTIN et al. (12)
, com pequenas adaptações
estabelecendo-se as seguintes condições: etapa inicial de 94 °C por dois minutos, seguido de
40 ciclos repetidos com as temperaturas de 94 °C por 30 segundos (desnaturação), 53 °C por
30 segundos (anelamento) e 72 °C por um minuto (extensão). As reações foram finalizadas
com um tempo adicional de extensão de cinco minutos a 72 °C.
Como controle positivo para os testes de PCR foram empregados amostras de
referência de E. canis e A. platys procedentes do LDDP/EVZ/UFG. Água ultra-pura foi
utilizada como controle negativo.
Ensaios de PCR em tempo real
Todas as reações de qPCR foram realizadas em triplicata no instrumento
StepOnePlus™ Real-time PCR System (Applied Biosystems, Foster, EUA) para amplificação
do fragmento do DNA alvo com valor de confiança de 95%. A padronização da técnica de
qPCR baseou-se no protocolo “Sequence Detection Systems- Chemistry Guide” (Applied
Biosystems, Foster, EUA) fornecido pelo fabricante, que inclui um roteiro de medidas a
serem tomadas durante a elaboração de uma técnica de qPCR. O protocolo de qPCR padrão
foi calculado para um volume final de 20µL, sendo 10µL de Master mix (2x), 0,4µL de
iniciador senso (50µM), 0,4µL de iniciador anti-senso (50µM), 0,5µL de sonda (10µM), 2µL
de 10x IPC Mix, 0,4µL de 50x IPC DNA, 4,3µL de água ultra pura e 2µL de DNA da amostra
testada.
Os tubos contendo as amostras e a mistura de reagentes foram submetidas à etapa
inicial de 95 °C por 10 minutos, seguido de 40 ciclos repetidos com as temperaturas de 95 °C
por 15 segundos (desnaturação), 60 °C por 1 minuto (anelamento) e extensão final a 60 ºC por
30 segundos.
36
Otimização dos ensaios de qPCR
A partir do protocolo de qPCR definido como padrão para um volume final de
20µL, condições ótimas de amplificação foram determinadas através da variação na:
temperatura de anelamento (48 a 63ºC); concentração dos iniciadores (5 a 60 µM) e
concentração da sonda (2 a 24 µM), conforme indicado pelo “Sequence Detection Systems-
Chemistry Guide” (Applied Biosystems, Foster, EUA). E o threshold foi definido
automaticamente pelo programa StepOne Plus v2.3.
Avaliação da especificidade analítica dos iniciadores
Os novos iniciadores foram avaliados quanto à eficácia e especificidade para a
amplificação de fragmentos do gene 16S rRNA de A. platys e E. canis pela técnica de qPCR,
utilizando-se DNA genômico de cão não infectado, DNA de R. sanguineus e dos
hemoparasitos: E. canis, A. platys, B. vogeli, H. canis e M. haemofelis.
Determinação e avaliação da sensibilidade analítica das reações
Para determinar o limiar de detecção de A. platys e E. canis dos protocolos de
PCR convencional e qPCR, foram realizadas dez diluições seriadas a partir de amplicons de
E. canis e A. platys obtidos dos testes de PCR convencional e submetidos ao processo de
purificação usando o kit QIAquick Gel ® Extraction (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha). Os
amplicons purificados foram sequenciados e a concentração dos mesmos foi determinada pelo
método fluorométrico, empregando-se o aparelho Qubit® 2.0 Fluorometer. As diluições
seriadas foram realizadas na base 10 (14 x 103 fg a 14 x 10
-6 fg/2 µL) para quantificação de
DNA e determinação da curva de regressão padrão. Cada diluição foi testada em triplicata.
O DNA extraído do sangue periférico de cães com exame parasitológico positivo
para A. platys e E. canis também foi utilizado no teste de sensibilidade analítica das técnicas
moleculares desenvolvidas, sendo realizadas quatro diluições seriadas de 1:10, a partir da
concentração de DNA extraído de 10 ng/µL oriundo do sangue de cão positivo para E. canis e
8 ng/ µL obtido do sangue de cão positivo para A. platys. Todas as diluições dos amplicons de
A. platys e E. canis e diluições do DNA extraído de sangue total de cães positivos para A.
platys e E. canis foram testadas em paralelo pelas técnicas de PCR convencional e qPCR.
37
Sensibilidade e especificidade epidemiológicas e valores preditivos positivo e negativo da
PCR em tempo real
Os testes moleculares de PCR convencional para amplificação de fragmento do
gene 16S rRNA de E. canis e A. platys foram utilizadas como padrão ouro para definir o real
estado da doença de um animal. Os cálculos da sensibilidade e especificidade epidemiológicas
e dos valores preditivos positivo e negativo da qPCR foram realizados utilizando as fórmulas:
Sensibilidade = a / (a+c) x 100;
Especificidade = d / (b+d) x 100;
VPP= valor preditivo positivo = a / (a+b) e
VPN= valor preditivo negativo= d / (c+d).
Onde: (a) = verdadeiro positivo; (b) = falso positivo; (c) = falso negativo e
(d) = verdadeiro negativo.
500 amostras de sangue de cães foi analisado em paralelo por ensaio de qPCR e
PCR convencional para detecção de A. platys (12)
e E. canis (15).
Análise estatística
Os resultados dos exames laboratoriais foram organizados em tabelas para serem
utilizadas como banco de dados na análise estatística. Os resultados obtidos pelos diferentes
métodos de diagnóstico empregados (PCR convencional e PCR em tempo real) foram
dispostos em tabela de contingência 2 x 2 para a avaliação da intensidade de concordância
entre os resultados obtidos. Empregou-se a análise de concordância Kappa do programa
Bioestat versão 5.3. O teste Kappa foi utilizado como um teste estatístico não paramétrico
destinado a comparar as proporções da mesma variável mensurada a nível nominal em duas
ocasiões distintas. Os resultados foram interpretados para os diferentes valores de Kappa
obtidos, com intervalo de confiança de 95% conforme avaliação de concordância de LANDIS
& KOCH (29)
.
RESULTADOS
Sequenciamento e análise das sequências de referência
Após o sequenciamento dos cinco produtos de PCR purificados, foi verificado
com base na análise de similaridade fornecida pelo algoritmo BLASTn que as sequências
38
deste estudo eram correspondentes a A. platys, E. canis, Babesia vogeli, Hepatozoon canis
e Mycoplasma haemofelis.
Desenho de iniciadores e sondas
Do alinhamento das sequências do gene 16S rRNA, correspondentes às espécies
A. platys (AF156784), A. phagocytophilum (U02521), E. canis (AF162860), E. ewingii
(U96436), E. chaffeensis (U86665), E. bovis (AF294789) e E. risticii (M21290), foram
selecionados para detecção de A. platys os iniciadores: senso espécie-específico AXCf (5'-
GGATTTTTGTCGTAGCTTGCTATG-3´), anti-senso gênero-específico AXCr (5'-
CACCATTTCTAGTGGCTATCCCA-3') e a sonda AXC SR (5'-FAM-
CTACTAGGTAGATTCCTATGCA-MGB-3') (FIGURA 1).
FIGURA 1. Alinhamento da região correspondente ao gene 16S rRNA de A. platys
(AF156784), A. phagocytophilum (U02521), E. canis (AF162860), E. ewingii (U96436), E.
chaffeensis (U86665), E. bovis (AF294789) e E. risticii (M21290) pelo método de Clustal W,
com localização do iniciador senso espécie-específico AXCf (caixa com bordas marron),
iniciador anti-senso gênero-específico AXCr (caixa com bordas laranja) e sonda AXC SR
(caixa com bordas azul).
Do alinhamento das sequências do gene 16S rRNA, correspondentes às espécies
A. platys (AF156784), A. phagocytophilum (U02521), E. canis (AF162860), E. ewingii
(U96436), E. chaffeensis (U86665), E. bovis (AF294789) e E. risticii (M21290) foram
selecionados para detecção de E. canis os iniciadores espécie-específicos: senso EXCf (5'-
GCCTCTGGCTATAGGAAATTGTTAGT-3') e anti-senso EXCr (5'-
39
ACAGTATTACCCACCATTTCTAATGG-3'), e a sonda EXC SR (5'-FAM-
CGTACTACTAGGTAGATTC-MGB-3') (FIGURA 2).
FIGURA 2. Alinhamento da região correspondente ao gene 16S rRNA de A. platys
(AF156784), A. phagocytophilum (U02521), E. canis (AF162860), E. ewingii (U96436), E.
chaffeensis (U86665), E. bovis (AF294789) e E. risticii (M21290) pelo método de Clustal W,
com localização do iniciador senso espécie-específico EXCf (caixa com bordas vermelhas),
iniciador anti-senso espécie-específico EXCr (caixa com bordas roxa) e sonda EXC SR (caixa
com bordas verde).
Otimização do protocolo de qPCR para detecção de A. platys e E. canis
O desempenho das reações de qPCR para detecção de A. platys e E. canis foram
avaliados a partir de modificações na concentração dos inciadores, sondas e temperatura de
anelamento do protocolo de qPCR definido como padrão para um volume final de 20µL.
O threshold, que é definido como o ponto de corte entre amostras positivas e
negativas de acordo com a emissão de fluorescência por amostra, foi definido
automaticamente pelo equipamento StepOne Plus em um valor de 0.2 para detecção de A.
platys e E. canis. Já o ciclo threshold (Ct) é o ciclo da qPCR na qual cada amostra passou o
threshold e se tornou positiva.
Amostras de referência para A. platys e E. canis foram submetidas a reações de
qPCR para detecção espécie-específica de A. platys e E. canis com modificações nas
concentrações de iniciadores, sonda e temperatura de anelamento a partir do protocolo
definido como padrão.
40
Os valores de Ct das reações utilizando os iniciadores AXCf/AXCr nas
concentrações de 10 µM a 60µM para detecção de A. platys variaram de 20 a 28 ciclos. A
reação de qPCR utilizando os iniciadores AXCf/AXCr na concentração de 5µM apresentou Ct
de 40 ciclos (FIGURA 3).
O menor Ct (=20) foi observado nas reações que utilizaram os iniciadores AXCf e
AXCr na concentração de 50µM e 60µM, e a emissão de fluorescência foi maior quando
utilizados os iniciadores na concentração de 60µM (FIGURA 3).
FIGURA 3. Curva de amplificação de A. platys utilizando diferentes concentrações dos
iniciadores AXCf e AXCr (A). Interface do software Step One Plus (v. 2.3) mostrando o
resultado (presença e ausência) da qPCR utilizando diferentes concentrações dos iniciadores
AXCf e AXCr para detecção de A. platys (B).
Os valores de Ct das reações utilizando os iniciadores EXCf/EXCr nas
concentrações de 10 µM a 60µM para detecção de E. canis não demonstraram variação no Ct,
o qual permaneceu no ciclo 16 para todas as concentrações dos iniciadores avaliadas. No
entanto, a intensidade de fluorescência detectada pelo equipamento de qPCR foi maior ao se
utilizarem os iniciadores EXCf e EXCr na concentração de 50µM (FIGURA 4).
FIGURA 4. Curva de amplificação de E. canis utilizando diferentes concentrações dos
iniciadores EXCf e EXCr (A). Interface do software Step One Plus (v. 2.3) mostrando o
A B
B A
41
resultado da qPCR utilizando diferentes concentrações dos iniciadores EXCf e EXCr para
detecção de E. canis (B).
Na análise das reações utilizando diferentes concentrações da sonda de hidrólise
AXC SR, verificou-se que a intensidade de fluorescência emitida foi diretamente proporcional
a concentração da sonda de hidrólise AXC SR (Taqman). Os Cts variaram de 21 a 24 ciclos,
sendo o Ct de 21 ciclos, menor, para a sonda de hidrólise AXC SR utilizada nas
concentrações de 10 µM e 12µM (FIGURA 4). A utilização da sonda de hidrólise em uma
concentração maior permitiu o resultado positivo para A. platys mais precocemente (Ct 21). Já
a sonda de hidrólise utilizada em uma concentração menor (2 µM), demonstrou menor
emissão de fluorescência, indicando resultado positivo em um ciclo posterior (Ct 24). Mesmo
assim, todas as concentrações da sonda de hidrólise testada demonstraram resultado positivo
pela técnica de qPCR, conforme consta na FIGURA 5.
FIGURA 5. Curva de amplificação de A. platys utilizando diferentes concentrações da sonda
de hidrólise AXC SR (A). Interface do software Step One Plus (v. 2.3) mostrando o resultado
da qPCR utilizando diferentes concentrações da sonda de hidrólise AXC SR para detecção de
A. platys (B).
Verificou-se que a intensidade de fluorescência emitida foi diretamente
proporcional à concentração da sonda de hidrólise EXC SR (Taqman). Os Ct variaram de 16 a
20 ciclos com a variação na concentração de sonda, sendo o Ct de 16 ciclos, mais baixo, para
a sonda de hidrólise EXC SR utilizada na concentração de 12µM (FIGURA 2-6). Com a
utilização da sonda de hidrólise em uma concentração maior (12µM) obteve-se resultado
positivo com um Ct menor (Ct 16). Já a sonda de hidrólise utilizada em uma concentração
menor (2µM) demandou maior tempo para emissão de fluorescência (Ct 20), indicando
resultado positivo em um ciclo posterior. Mesmo assim, todas as concentrações da sonda de
hidrólise testada demonstraram resultado positivo para E. canis pela técnica de qPCR,
conforme consta na FIGURA 6.
A B
42
Após a otimização do protocolo de qPCR para detecção de E. canis, verificou-se
que condições ótimas para amplificação foram obtidas com sonda de hidrólise AXC SR e
EXC SR na concentração de 12µM (FIGURA 5; FIGURA 6).
FIGURA 6. Curva de amplificação de E. canis utilizando diferentes concentrações da sonda
de hidrólise EXC SR (A). Interface do software Step One Plus (v. 2.3) mostrando o resultado
da qPCR utilizando diferentes concentrações da sonda de hidrólise EXC SR para detecção de
E. canis (B).
Após a realização de reações com modificação na temperatura de anelamento da
reação, verificou-se que a intensidade de fluorescência foi maior quando a reação foi
submetida a uma temperatura de anelamento de 60ºC para A. platys e 55 ºC para E. canis.
Análise de similaridade dos oligonucleotídeos e especificidade analítica dos protocolos de
qPCR para detecção de A. platys e E. canis
O iniciador AXCf senso, espécie-específico, contendo 24 bases, foi selecionado
em uma região semi conservada do gene 16S rRNA, localizado na posição 46-69 da sequência
(AF156784), com temperatura de anelamento de 58 ºC (QUADRO 1), calculada pelo
software Primer Express® (Applied Biosystems, Foster, CA, USA). Através da operação de
BLAST (GenBank), o iniciador apresentou resultados de 100% de similaridade apenas para A.
platys. O iniciador AXCr anti-senso, com 23 bases, localizado na posição 145-123 do
alinhamento das sequências do mesmo gene das espécies acima (QUADRO 1) foi identificado
como sendo gênero- específico.
A sonda de hidrólise AXC SR (Taqman), com 19 bases, foi selecionada em uma
região conservada do gene 16S rRNA, localizada na posição 120-99 do alinhamento das
A B
43
sequências do mesmo gene das espécies acima (QUADRO 1). Através da operação BLAST
(Genbank), a sonda de hidrólise foi caracterizada como sendo gênero-específica.
Os iniciadores EXCf senso e EXCr anti-senso, espécie-específicos, contendo 26
bases cada, foram selecionados em uma região semi conservada do gene (AF162860),
localizados, respectivamente, nas posições 61-86 e 161-136 da sequência, ambos com
temperatura de anelamento de 58 ºC (QUADRO 1), calculada pelo software Primer Express®
(Applied Biosystems, Foster, CA USA). Através da operação de BLAST (GenBank), os
iniciadores apresentaram resultados de 100% na análise de similaridade apenas para E. canis.
A sonda de hidrólise EXC SR (Taqman), com 19 bases, foi selecionada em uma
região semi-conservada para o gênero Ehrlichia, localizada na posição 129-111 do
alinhamento das sequências do mesmo gene das espécies acima (QUADRO 1). Através da
operação BLAST (Genbank), a sonda de hidrólise foi caracterizada como sendo gênero-
específica.
QUADRO 1. Sequências de iniciadores e sondas de hidrólise (Taqman) selecionados para
amplificação específica de fragmentos dos genes 16S rRNA de A. platys e E. canis por qPCR. Gene e nº de acesso no
GenBank Iniciadores Sequências
Posição no
gene %GC
Tm
(ºC)
Tamanho
(nt)
16S rRNA
(AF156784) Senso AXCf 5'-GGATTTTTGTCGTAGCTTGCTATG-3´ 46-69 42 58 24
16S rRNA
(AF156784)
Anti-senso
AXCr 5'-CACCATTTCTAGTGGCTATCCCA-3' 145-123 48 59 23
16S rRNA
(AF156784) Probe AXC SR
5'-FAM-CTACTAGGTAGATTCCTATGCA-
MGB-3' 120-99 41 68 22
16S rRNA
(AF162860) Senso EXCf 5'-GCCTCTGGCTATAGGAAATTGTTAGT-3' 61-86 42 58 26
16S rRNA
(AF162860)
Anti-senso
EXCr 5'-ACAGTATTACCCACCATTTCTAATGG-3' 161-136 38 58 26
16S rRNA
(AF162860) Probe EXC SR 5'-FAM-CGTACTACTAGGTAGATTC-MGB-3' 129-111 42 68 19
Os iniciadores AXCf e AXCr, avaliados em conjunto com a sonda de hidrólise
AXC SR (Taqman) através da reação de qPCR, demonstraram uma especificidade de 100%
na amplificação do gene 16S rRNA de A. platys. Não houve resultado positivo inespecífico
para amostras de DNA genômico de C. familiaris, R. sanguineus e dos seguintes
hemoparasitos: E. canis, B. vogeli, H. canis e M. haemofelis (FIGURA 7).
44
FIGURA 7. Teste de especificidade utilizando qPCR para detecção de A. platys utilizando
DNA de C. familiaris, R. sanguineus, A. platys, B. vogeli, E. canis, H. canis e M. haemofelis
(A). Resultado positivo com amplificação específica somente de A. platys (B).
O par de iniciadores EXCf e EXCr, avaliados em conjunto com a sonda de
hidrólise EXC SR (Taqman) através da reação de qPCR, demonstraram uma especificidade de
100% na amplificação do gene 16S rRNA de E. canis. Não houve resultado positivo
inespecífico para amostras de DNA genômico de C. familiaris, R. sanguineus e dos seguintes
hemoparasitos: A. platys, B. vogeli, H. canis e M. haemofelis (FIGURA 8).
FIGURA 8. Teste de especificidade qPCR para detecção de E. canis utilizando DNA de C.
familiaris, R. sanguineus, A. platys, B. vogeli, E. canis, H. canis e M. haemofelis (A).
Resultado positivo com amplificação específica somente de E. canis (B).
Sensibilidade analítica dos testes de detecção de A. platys
O limiar de detecção foi avaliado por meio da realização de dez diluições
decimais seriadas e sucessivas a partir de alíquotas de DNA de concentração conhecida para
A. platys, variando entre 14000 fg a 14 x 10-6
fg/ 2 µL.
Os resultados do teste de sensibilidade dos testes de PCR convencional
demonstraram resultados positivos em amostras de A. platys com concentrações de 14000 fg
até 4 fg do DNA alvo. As amostras com concentrações menores foram negativas, como pode
ser observado na FIGURA 9.
B A
A B
45
FIGURA 9. Produtos amplificados através da PCR convencional com Primer PLATYS F/
EHR16SR. Avaliação da sensibilidade da PCR convencional utilizando quatro diluições de
DNA extraído de cão com exame parasitológico positivo para A. platys e 10 diluições do
DNA de A. platys com diferentes concentrações. Eletrofores em gel de agarose (1,2%) corado
com brometo de etídio. Canaleta 1: marcador de peso molecular de 100 pb. Canaletas 2-5:
amostras com DNA alvo de A. platys nas diferentes concentrações: 4 fg (16 ng de DNA
extraído); 0,9 fg (1,6 ng de DNA extraído); DNA alvo não quantificado (0,2 ng de DNA
extraído) e DNA alvo não quantificado (0,02 ng de DNA extraído). E nas canaletas 6 a 14
estão o DNA de A. platys em diluições seriadas na base 10 (14000 fg a 14 x 10-6
fg/2 µL),
respectivamente. Canaleta 16: controle negativo.
A sensibilidade analítica do protocolo de qPCR para detecção de A. platys foi
avaliada utilizando amostras de DNA extraído de cão com exame parasitológico positivo para
A. platys e amplicons de A. platys em diferentes concentrações. Os valores de Ct da reação
variaram de 19 a 39 ciclos. As amostras com maior concentração (= 14000 fg/2 µL)
obtiveram um Ct mais baixo, indicando que o resultado positivo aconteceu mais
precocemente (Ct=19). Nas amostras com menor concentração (0,9 fg/2 µL) a emissão de
fluorescência foi mais tardia, indicando resultado positivo em um ciclo posterior (Ct= 39)
(FIGURA 10).
FIGURA 10. Interface do software Step One Plus (v. 2.3) mostrando a curva-padrão do
ensaio de quantificação absoluta. Os pontos vermelhos representam os Cts gerados pelo Log
de cada concentração de DNA padrão. Os pontos azuis representam os Cts gerados pelo Log
B
A
46
de cada concentração de A. platys contidas no DNA extraído do sangue de cão positivo para
A. platys no exame parasitologico direto (A). DNA diluído obtido da extração de DNA do
sangue de cão positivo no exame parasitologico direto para para A. platys (B).
Foi realizada a curva padrão para quantificar a concentração de DNA de A. platys
contido no DNA extraído de sangue periférico de um cão com exame parasitológico direto
positivo para A. platys cuja concentração de DNA obtida foi de 8 ng/µL. Verificou-se pelos
resultados da curva padrão a existência de aproximadamente 4 fg de A. platys nos 16 ng (2
µL) de DNA extraído de sangue periférico de um cão com exame parasitológico direto
positivo para A. platys (FIGURA 10). Foram feitas quatro diluições seriadas de 1:10 no DNA
extraído e o protocolo de qPCR foi capaz de detectar até 0,9 fg de DNA de A. platys em 1,6
ng (2 µL) de DNA extraído de sangue periférico de um cão com exame parasitológico direto
positivo para A. platys (FIGURA 11).
FIGURA 11. Curva de amplificação de avaliação do limiar e detecção. As linhas coloridas
representam quantidades decrescentes de DNA alvo (14000 fg a 14 x 10-6
fg/2 µL) quanto
maior a quantidade de DNA (primeira linha azul), menor o valor de Ct (menos ciclos de
amplificação são necessários para atingir o limiar de detecção). A linha amarela mostra a boa
performance do sistema em detectar até 0,9 fg de A. platys (A). Resultado da diluição seriada
do DNA de A. platys (B).
Sensibilidade analítica dos testes de detecção de E. canis
O limiar de detecção foi avaliado por meio da realização de dez diluições
decimais seriadas e sucessivas a partir de alíquotas de DNA de concentração conhecida para
E. canis, variando entre 14000 fg a 14 x 10-6
fg/ 2 µL.
Os resultados do teste de sensibilidade feitos pela técnica de PCR convencional
demonstraram que foi possível obter diagnóstico positivo em amostras de E. canis em
concentrações de 14000 fg até 7,48 fg do DNA alvo. As amostras com concentrações menores
foram negativas, como pode ser observado na FIGURA 12.
A B
47
FIGURA 12. Produtos amplificados através da PCR convencional com Primer EBR1/ EBR5.
Avaliação da sensibilidade da PCR convencional utilizando quatro diluições de DNA extraído
de cão com exame parasitológico positivo para E. canis e 10 diluições do DNA de E. canis
com diferentes concentrações. Eletroforese em gel de agarose (1,2%) corado com brometo de
etídio. Canaleta 1: marcador de peso molecular de 100 pb; canaletas de 2-5: amostras com
DNA alvo de E. canis nas diferentes concentrações: 7,48 fg (20 ng de DNA extraído); 1,15 fg
(2 ng de DNA extraído); 0,25 fg (0,2 ng de DNA extraído) e DNA alvo não quantificado
(0,02 ng de DNA extraído). E nas canaletas 6 a 14 estão o DNA de E. canis em diluições
seriadas na base 10 (14000 fg a 14 x 10-6
fg/2 µL), respectivamente. Canaleta 16: controle
negativo.
O limiar de detecção do protocolo de qPCR para detecção de E. canis foi avaliado
com DNA extraído de cão com exame parasitológico positivo para E. canis e amplicons de E.
canis em diferentes concentrações. Os valores de Ct obtidos na reação variaram de 18 a 38
ciclos. As amostras com maior concentração (= 14000 fg/2 µL) obtiveram um Ct mais baixo,
indicando que o resultado positivo aconteceu em um ciclo menor (Ct=18). E as amostras com
menor concentração (0,14 fg/2 µL) demandaram maior tempo para emissão de fluorescência,
indicando resultado positivo em um ciclo posterior (Ct= 38) (FIGURA 13).
FIGURA 13. Interface do software Step One Plus (v. 2.3) mostrando a curva-padrão do
ensaio de quantificação absoluta. Os pontos vermelhos representam os Cts gerados pelo Log
de cada concentração de DNA padrão. Os pontos azuis representam os Cts gerados pelo Log
de cada concentração de E. canis contidas no DNA extraído do sangue de cão positivo para E.
B A
48
canis no exame parasitologico direto (A). DNA diluído obtido da extração de DNA do sangue
de cão positivo no exame parasitologico direto para E. canis (B).
Verificou-se a existência de 7,48 fg de E. canis nos 20 ng (2 µL) de DNA extraído
de sangue periférico de um cão com exame parasitológico direto positivo para E. canis
(FIGURA 13). Foram feitas quatro diluições seriadas de 1:10 (20 ng a 0,02 ng/ 2 µL) no DNA
extraído e o protocolo de qPCR foi capaz de detectar até 0,25 fg de DNA de E. canis em 0,2
ng (2 µL) de DNA extraído de sangue periférico de um cão com exame parasitológico direto
positivo para E. canis (FIGURA 14).
FIGURA 14. Curva de amplificação de avaliação do limiar e detecção. As linhas coloridas
representam quantidades decrescentes de DNA alvo (14000 fg a 14 x 10-6
fg/2 µL) quanto
maior a quantidade de DNA (primeira linha azul), menor o valor de Ct (menos ciclos de
amplificação são necessários para atingir o limiar de detecção). A linha cinza mostra a boa
performance do sistema em detectar até 0,14 fg de E. canis (A). Resultado da diluição seriada
do DNA de E. canis (B).
Eficácia do novo protocolo de qPCR para A. platys e E. canis e análise de concordância
Kappa entre os testes de diagnóstico empregados
A sensibilidade, proporção de positivos verdadeiros detectados, e a especificidade,
proporção de negativos verdadeiros detectados, foram utilizadas como indicadores da
validade do teste de diagnóstico de A. platys e E. canis por qPCR. A variável medida foi
nominal e dicotômica: positiva e negativa.
Entre as 500 amostras de cães analisadas, 185 (37%; 185/500) foram positivas
para E. canis por ambas as técnicas (qPCR e PCR convencional), cinco (1%; 5/500) amostras
foram positivas apenas por testes de qPCR e 310 (62%; 315/500) amostras foram negativas
em ambos os testes de diagnóstico (TABELA 1). Para A. platys, verificou-se que 30 (6 %;
30/500) foram positivas para A. platys por ambas as técnicas (qPCR e PCR convencional) e
B A
49
470 (94%; 470/500) amostras foram negativas em ambos os testes de diagnóstico. Não foi
verificada nenhuma discordância no resultado das amostras entre os testes de diagnóstico
empregados.
A concordância entre as técnicas de PCR convencional e qPCR foi calculada de
acordo com a medida KAPPA. O índice Kappa geral calculado para a concordância entre os
testes empregados para a detecção de E. canis foi de 0.9787 (p<0,0001) com intervalo de
confiança de 95%, sendo verificada excelente concordância entre os resultados dos testes de
qPCR e PCR convencional para detecção de E. canis.
A qPCR para detecção de A. platys demonstrou sensibilidade e especificidade de
100%, e os ensaios de qPCR para detecção de E. canis demonstraram sensibilidade de 100% e
especificidade de 98,41%. O valor preditivo positivo e valor preditivo negativo calculados para
o diagnóstico por qPCR para detecção de E. canis e A. platys estão demonstrados na
TABELA 1.
TABELA 1. Valor preditivo (resultado positivo de teste) e valor preditivo (resultado negativo
de teste) do ensaio de qPCR para detecção de E. canis e A. platys.
Resultado do teste
PCR em tempo real
Estado verdadeiro
(PCR convencional) Padrão-ouro Total
E. canis positivo E. canis negativo
Prevalência de E. canis: 30%
E. canis positivo 185 (a) 5 (b) 190
E. canis negativo 0 (c) 310 (d) 310
Total 185 315 500
Valor preditivo positivo: 97,36%
Valor preditivo negativo: 100%
Prevalência de A. platys: 5%
A. platys positivo A. platys negativo
A. platys positivo 30 (a) 0 (b) 30
A. platys negativo 0 (c) 470 (d) 470
Total 30 470 500
Valor preditivo positivo: 100%
Valor preditivo negativo: 100%
DISCUSSÃO
Avanços na área de biologia molecular têm proporcionado métodos altamente
específicos e sensíveis, para identificação direta do agente etiológico da EMC e TCIC, e o
emprego de técnicas de diagnóstico utilizando PCR para a detecção de A. platys e E. canis
vem aumentando gradativamente, servindo para sustentar o emprego da terapêutica adequada.
50
A prática das aplicações das técnicas de PCR e suas técnicas derivadas em diagnósticos
moleculares tem se mostrado de grande efetividade, especialmente no diagnóstico de doenças
cujo diagnóstico precoce é crucial no sucesso do tratamento. Porém, protocolos de PCR em
tempo real para a detecção específica de A. platys e E. canis ainda são muito escassos.
Os resultados alcançados com os testes de especificidade e sensibilidade para os
iniciadores PLATYSF/EHR16SR e EBR1/EBR5 dos protocolos de PCR convencional,
serviram como padrão-ouro e deram suporte para validar os ensaios de qPCR com os pares de
iniciadores e sondas desenhados neste estudo como protocolos confiáveis e de detecção rápida
e específica de A. platys e E. canis.
A qPCR para detecção de E. canis desenvolvida neste estudo demonstrou limiar
de detecção para E. canis menor do que o da PCR convencional (15)
. O menor limiar de
detecção da qPCR aliada a inclusão de uma sonda de hidrólise para detecção de E. canis,
além do uso de dois iniciadores, contribuíram para elevar a sensibilidade analítica do teste, o
que pode ter sido a causa da detecção de E. canis em cinco cães que foram negativos no teste
de PCR convencional. Em muitos casos, ensaios qPCR são mais específicos devido à
exigência de três oligonucleotídeos para emparelhar o DNA alvo (28)
.
A qPCR associa a metodologia de PCR a um sistema de detecção e quantificação
de fluorescência produzida durante os ciclos de amplificação, sendo uma técnica descrita
como quantitativa porque consegue realizar a avaliação do número de moléculas produzidas a
cada ciclo. A possibilidade de monitorar, ao longo da reação, a quantidade de produto
formado a cada ciclo de amplificação e de quantificar este produto durante a sua fase ótima de
formação, confere maior precisão e reprodutibilidade à qPCR quando comparada com a PCR
convencional.
O primeiro ensaio de qPCR capaz de detectar e discriminar três espécies de
Ehrlichia clinicamente importantes em uma única reação de amplificação do gene da proteína
(dsb) foi descrito por DOYLE et al.(16)
. Posteriormente, BANETH et al.(19)
desenvolveram um
protocolo de qPCR usando a subunidade 16S rRNA de E. canis, em que as sondas e
iniciadores desenhados foram espécie-específicos para E. canis. E mais recentemente,
PELEG et al. (20)
descreveram um protocolo de qPCR capaz de detectar simultaneamente E.
canis e B. vogeli, dois importantes patógenos de cães transmitidos por carrapatos.
A qPCR vem se tornando rapidamente o método preferencial para o diagnóstico
de A. platys e E. canis. O gene 16S rRNA é o mais utilizado como alvo molecular para a
detecção de Anaplasma e Ehrlichia e foi o gene de escolha para o desenvolvimento de ensaios
de qPCR para a detecção específica de A. platys e E. canis. Apesar das sequências do gene
51
16S rRNA serem altamente conservadas entre os membros do gênero Anaplasma e Ehrlichia,
buscou-se a identificação de sequências heterogênicas para realizar o desenho dos
oligonucleotídeos e sondas espécie-especificas para A. platys e E. canis.
As sequências de iniciadores e sondas desenhados respeitaram os parâmetros
indicados pelo sistema da TaqmanR/MGB
R (Applied Biosystems, Inc., EUA). A escolha do
sistema de detecção da TaqManR e da sonda MGB
R (Applied Biosystems, Inc., EUA)
baseou-se na sensibilidade e especificidade superiores as do sistema SBYR GreenR
(Applied
Biosystems, Inc., EUA) (20)
.
O sistema utilizando sonda de hidrólise da Taqman, por ser mais específico que o
SYBR Green é o mais empregado no desenvolvimento de protocolos de qPCR para o
diagnóstico da EMC (16, 19, 20)
e TCIC (27, 28)
. O método de quantificação da TaqMan utiliza
sondas de hidrólise altamente específicas a sequência alvo, liberando fluorescência apenas na
presença do produto de PCR de interesse. Quanto maior o número de cópias iniciais do ácido
nucléico alvo, mais rápido será observado o aumento significativo na fluorescência.
EDDLESTONE et al.(28)
desenvolveram um protocolo de qPCR utilizando o
sistema da TaqMan capaz de detectar A. phagocytophilum, E. canis, E. chaffeensis e A. platys,
porém sem diferenciar as espécies detectadas. Já os novos protocolos de qPCR para detecção
de E. canis e A. platys desenvolvidos neste estudo demonstraram ser espécie-específicos com
amplificação específica da sequência alvo de interesse.
Em relação à análise custo-benefício, o resultado dos cálculos indicaram que a
mecanização do processo verificada na qPCR, diminui o risco de contaminação entre
amostras e também a torna mais ágil, possibilitando, dessa maneira, um aumento no número
de amostras testadas em um mesmo período, além do teste ser mais específico e dispensar
procedimentos adicionais como a corrida eletroforética dos produtos em gel de agarose e foto
documentação, tudo isso aliado a maior sensibilidade analítica encontrada no presente
trabalho. Além disso, a qPCR possui a capacidade de quantificar a amostra e apresenta maior
confiança e chances de acerto, devido a menor manipulação humana. Esse conjunto de fatores
evidencia as vantagens reais dessa técnica.
O custo dos reagentes necessários para a realização de uma reação em unicata de
qPCR foi semelhante ao custo da PCR convencional. Porém, como a recomendação do
sistema de qPCR é de realizar as reações em triplicata, a reação por amostra acaba sendo mais
onerosa, o que eleva o custo da técnica. Os outros fatores que influenciam nos custos da
qPCR são os gastos com mão de obra especializada, aquisição dos equipamentos e criação da
infra-estrutura laboratorial.
52
Os novos ensaios de qPCR desenvolvidos e descritos no presente estudo
apresentaram um custo de R$ 8,80 por reação e um custo total de R$26,40 por amostra do
ensaio realizado em triplicata (QUADRO 2). Ressalta-se, no entanto, que a análise de custos
se referiu apenas ao material de consumo, não sendo considerados, nos cálculos, os custos
com a extração do DNA, as despesas com equipamentos, vidrarias, mão-de-obra, custos
indiretos entre outros. De forma geral, o custo da qPCR é maior que a PCR convencional,
porém esse valor é compensado quando se considera que essa técnica tem o dobro da
capacidade de realização de exames em comparação à técnica convencional. Dessa maneira,
se a qPCR for utilizada em sua capacidade máxima e em larga escala, os custos tendem a
igualar ou até mesmo serem menores que os da PCR convencional, podendo ser aplicada ao
uso comercial.
QUADRO 2- Valores do método de qPCR utilizando sonda de hidrólise (TaqMan) para
detecção de A. platys e E. canis.
Reagentes ou insumos Valor unitário (R$)
Master mix 4,35
Iniciadores 0,30
Sonda de hidrólise Taqman 0,96
Kit exogenous IPC 1,98
Água ultra pura 0,01
Placa 0,25
Adesivo para selar a placa 0,15
Ponteiras 0,80
Total 8,80
CONCLUSÃO
A análise do alinhamento múltiplo das sequências das várias espécies de
Anaplasma e Ehrlichia permitiu informações para o desenho dos iniciadores e sondas para
detecção específica de A. platys e E. canis, os quais foram aplicáveis para o desenvolvimento
de sistemas de diagnóstico utilizando sondas de hidrólise Taqman para detecção espécie-
específica de A. platys e E. canis.
Os métodos padronizados de PCR em tempo real para detecção e quantificação de
A. platys e E. canis apresentaram:
Excelente limiar de detecção para a A. platys e E. canis
Excelente precisão
53
Com relação ao desempenho do método frente a amostras clínicas, os novos
protocolos de qPCR demonstraram boa performance e eficácia, podendo ser considerados
uma ferramenta útil na detecção de A. platys e E. canis.
54
REFERENCIAS
1. Shaw SE, Day MJ, Birtles RJ, Breitschwerdt EB. Tick-borne infectious diseases of
dogs. Trends in Parasitology. 2001 2/1/;17(2):74-80.
2. Stich RW, Schaefer JJ, Bremer WG, Needham GR, Jittapalapong S. Host surveys,
ixodid tick biology and transmission scenarios as related to the tick-borne pathogen, Ehrlichia
canis. Veterinary parasitology. 2008 Dec 20;158(4):256-73. PubMed PMID: 18963493.
Pubmed Central PMCID: 3053144.
3. Yabsley MJ, McKibben J, Macpherson CN, Cattan PF, Cherry NA, Hegarty BC, et al.
Prevalence of Ehrlichia canis, Anaplasma platys, Babesia canis vogeli, Hepatozoon canis,
Bartonella vinsonii berkhoffii, and Rickettsia spp. in dogs from Grenada. Veterinary
parasitology. 2008 Feb 14;151(2-4):279-85. PubMed PMID: 18160223.
4. Hua P, Yuhai M, Shide T, Yang S, Bohai W, Xiangrui C. Canine ehrlichiosis caused
simultaneously by Ehrlichia canis and Ehrlichia platys. Microbiology and immunology.
2000;44(9):737-9. PubMed PMID: 11092236.
5. Huang, Haibin, Unver, Ahmet, Perez, J. M, et al. Prevalence and molecular analysis of
Anaplasma platys in dogs in Lara, Venezuela. Brazilian Journal of Microbiology. 2005.
6. Santos F, Coppede JS, Pereira ALA, Oliveira LP, Roberto PG, Benedetti RBR, et al.
Molecular evaluation of the incidence of Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Babesia spp.
in dogs from Ribeirão Preto, Brazil. The Veterinary Journal. 2009 1//;179(1):145-8.
7. Ramos R, Ramos C, Araujo F, Oliveira R, Souza I, Pimentel D, et al. Molecular
survey and genetic characterization of tick-borne pathogens in dogs in metropolitan Recife
(north-eastern Brazil). Parasitology research. 2010 Oct;107(5):1115-20. PubMed PMID:
20680344.
8. Souza BM, Leal DC, Barboza DC, Uzeda RS, De Alcantara AC, Ferreira F, et al.
Prevalence of ehrlichial infection among dogs and ticks in Northeastern Brazil. Revista
brasileira de parasitologia veterinaria = Brazilian journal of veterinary parasitology : Orgão
Oficial do Colegio Brasileiro de Parasitologia Veterinaria. 2010 Apr-Jun;19(2):89-93.
PubMed PMID: 20624344.
9. Dagnone AS, de Morais HSA, Vidotto MC, Jojima FS, Vidotto O. Ehrlichiosis in
anemic, thrombocytopenic, or tick-infested dogs from a hospital population in South Brazil.
Veterinary parasitology. 2003 11/28/;117(4):285-90.
10. Ferreira RF, Cerqueira Ade M, Pereira AM, Velho PB, Azevedo RR, Rodrigues IL, et
al. Cross-reaction evaluation of PCR-Anaplasma platys positive dogs tested to Anaplasma
phagocytophilum antibodies by commercial ELISA. Revista brasileira de parasitologia
veterinaria = Brazilian journal of veterinary parasitology : Orgão Oficial do Colégio
Brasileiro de Parasitologia Veterinária. 2008 Sep;17 Suppl 1:5-8. PubMed PMID: 20059806.
11. Harrus S, Waner T. Diagnosis of canine monocytotropic ehrlichiosis (Ehrlichia canis):
an overview. Veterinary journal. 2011 Mar;187(3):292-6. PubMed PMID: 20226700.
12. Martin AR, Brown GK, Dunstan RH, Roberts TK. Anaplasma platys: an improved
PCR for its detection in dogs. Experimental parasitology. 2005 Mar;109(3):176-80. PubMed
PMID: 15713449.
13. Dagnone AS, Souza AI, Andre MR, Machado RZ. Molecular diagnosis of
Anaplasmataceae organisms in dogs with clinical and microscopical signs of ehrlichiosis.
Revista brasileira de parasitologia veterinaria = Brazilian journal of veterinary parasitology :
55
Orgao Oficial do Colegio Brasileiro de Parasitologia Veterinaria. 2009 Oct-Dec;18(4):20-5.
PubMed PMID: 20040204.
14. Ramos CA, Ramos RA, Araujo FR, Guedes DS, Jr., Souza, II, Ono TM, et al.
Comparison of nested-PCR with blood smear examination in detection of Ehrlichia canis and
Anaplasma platys in dogs. Revista brasileira de parasitologia veterinaria = Brazilian journal
of veterinary parasitology : Orgão Oficial do Colégio Brasileiro de Parasitologia Veterinária.
2009 Dec;18 Suppl 1:58-62. PubMed PMID: 20040193.
15. Alves LM, Linhares GFC, Chaves NST, Monteiro LC, Linhares DCL. Avaliação de
iniciadores e protocolo para o diagnóstico de pancitopenia tropical canina por PCR. 2005.
2005 2005-03-28Avaliação de iniciadores e protocolo para o diagnóstico da pancitopenia
tropical canina por PCR. Ciên Animal Bras. Goiânia;6(1):6. Epub 2005-01-01.
16. Doyle CK, Labruna MB, Breitschwerdt EB, Tang YW, Corstvet RE, Hegarty BC, et
al. Detection of medically important Ehrlichia by quantitative multicolor TaqMan real-time
polymerase chain reaction of the dsb gene. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 2005
Oct;7(4):504-10. PubMed PMID: 16237220. Pubmed Central PMCID: 1888493.
17. Cardozo GP, Oliveira LP, Zissou VG, Donini IAN, Roberto PG, Marins M. Analysis
of the 16S rRNA gene of Anaplasma platys detected in dogs from Brazil. Brazilian Journal of
Microbiology. 2007;38:478-9.
18. Nakaghi ACH, Machado RZ, Costa MT, André MR, Baldani CD. Canine ehrlichiosis:
clinical, hematological, serological and molecular aspects. Ciência Rural. 2008;38:766-70.
19. Baneth G, Harrus S, Ohnona FS, Schlesinger Y. Longitudinal quantification of
Ehrlichia canis in experimental infection with comparison to natural infection. Veterinary
microbiology. 2009 May 12;136(3-4):321-5. PubMed PMID: 19128893.
20. Peleg O, Baneth G, Eyal O, Inbar J, Harrus S. Multiplex real-time qPCR for the
detection of Ehrlichia canis and Babesia canis vogeli. Veterinary parasitology. 2010 Oct
29;173(3-4):292-9. PubMed PMID: 20674177.
21. Rufino CP, Moraes PH, Reis T, Campos R, Aguiar DC, McCulloch JA, et al.
Detection of Ehrlichia canis and Anaplasma platys DNA using multiplex PCR. Vector borne
and zoonotic diseases. 2013 Dec;13(12):846-50. PubMed PMID: 24107211.
22. Ramos RA, Latrofa MS, Giannelli A, Lacasella V, Campbell BE, Dantas-Torres F, et
al. Detection of Anaplasma platys in dogs and Rhipicephalus sanguineus group ticks by a
quantitative real-time PCR. Veterinary parasitology. 2014 Sep 15;205(1-2):285-8. PubMed
PMID: 25027609.
23. Tamí IdCd, Tamí-Maury IM. Identificación morfológica de Ehrlichia sp. en las
plaquetas de pacientes con infección por virus de la inmunodeficiencia humana, en
Venezuela. Revista Panamericana de Salud Pública. 2004;16:345-9.
24. Perez M, Bodor M, Zhang C, Xiong Q, Rikihisa Y. Human infection with Ehrlichia
Canis accompanied by clinical signs in Venezuela. Annals of the New York Academy of
Sciences. 2006;1078(1):110-7.
25. Arraga-Alvarado CM, Qurollo BA, Parra OC, Berrueta MA, Hegarty BC,
Breitschwerdt EB. Case report: Molecular evidence of Anaplasma platys infection in two
women from Venezuela. The American journal of tropical medicine and hygiene. 2014
Dec;91(6):1161-5. PubMed PMID: 25266347. Pubmed Central PMCID: 4257640.
26. Beatriz Silva A, Pina Canseco S, Gabriel de la Torre Mdel P, Mayoral Silva A,
Mayoral MA, Perez-Campos Mayoral L, et al. Asymptomatic human infection from contact
56
with dogs: a case of human ehrlichiosis. Gaceta medica de Mexico. 2014 Mar-
Apr;150(2):171-4. PubMed PMID: 24603998. Infeccion humana asintomatica por contacto
con perros. Un caso de ehrlichiosis humana.
27. Sirigireddy KR, Ganta RR. Multiplex detection of Ehrlichia and Anaplasma species
pathogens in peripheral blood by real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction.
The Journal of molecular diagnostics : JMD. 2005 May;7(2):308-16. PubMed PMID:
15858156. Pubmed Central PMCID: 1867522.
28. Eddlestone SM, Gaunt SD, Neer TM, Boudreaux CM, Gill A, Haschke E, et al. PCR
detection of Anaplasma platys in blood and tissue of dogs during acute phase of experimental
infection. Experimental parasitology. 2007 Feb;115(2):205-10. PubMed PMID: 17034792.
29. Landis JR, Koch GG. The Measurement of Observer Agreement for Categorical Data.
Biometrics. 1977;33(1):159-74.
30. Thompson, JD, Higgins DG, Gibson, TJ. CLUSTAL W: improving the sensitivity of
progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap
penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 1994. Nov 11; 22(22): 4673–4680.
PMCID: PMC308517
57
CAPÍTULO 4
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Em virtude da gravidade das erliquioses, potencial zoonótico e caráter endêmico
em regiões tropicais e subtropicais, a detecção precoce da infecção é extremamente
importante. Porém, a identificação dos hemoparasitos é complexa e trabalhosa e requer o uso
em conjunto de várias técnicas de diagnóstico. Assim, a disponibilidade de testes de detecção
rápida viabiliza o diagnóstico precoce, minimizando o potencial para disseminação da
infecção, tornando relevante a discussão das indicações de cada teste a partir de sua
sensibilidade e especificidade. Além disso, a identificação do agente etiológico contribui com
o monitoramento da interação homem-animal auxiliando na detecção oportuna de zoonoses
que podem ser graves para seres humanos.
Nos últimos anos, verifica-se que a incidência das erliquioses vem aumentando
gradativamente tanto nos animais como no homem, destacando-se a importância do
diagnóstico etiológico para o monitoramento epidemiológico das hemoparasitoses, porém a
maioria dos testes usados rotineiramente apresenta limitações. As recentes introduções de
técnicas diagnósticas que empregam biologia molecular permitem caracterizar quais espécies
de erlíquias estão infectando o paciente. Avanços na área de biologia molecular têm
proporcionado métodos altamente específicos e sensíveis para identificação direta do agente
etiológico da EMC e TCIC, e as técnicas moleculares, como a PCR, surgem como
metodologias alternativas que sobrepõem às limitações dos métodos rotineiros de diagnóstico,
identificação e diferenciação de microrganismos, possibilitando um diagnóstico preciso e
seguro.
Vários protocolos de PCR têm sido desenvolvidos para o diagnóstico da infecção
por A. platys e E. canis em cães, sendo capazes de indicar uma infecção ativa e identificar a
espécie infectante, constituindo importantes ferramentas de diagnóstico da doença.
Diferentemente dos métodos imunológicos, nos quais se identifica a doença por meio dos
anticorpos dirigidos aos microrganismos, os métodos moleculares evidenciam a molécula do
DNA na amostra do paciente.
Mesmo decorridos mais de vinte anos desde os primeiros relatos do emprego da PCR para o
diagnóstico molecular terem sido publicados, tais testes ainda não foram disponibilizados
comercialmente e não são usados além do ambiente de pesquisa. Além do custo, pode ser
citada a necessidade de sua execução em laboratórios com elevada tecnologia
58
e com espaço exclusivo para a sua realização, como os principais fatores
limitantes no que diz respeito ao emprego do teste de PCR e suas técnicas derivadas em
situação ambulatorial ou hospitalar. Porém, a rapidez diagnóstica da técnica proporciona
economia em relação aos gastos com medicações desnecessárias e redução da disseminação
da enfermidade com a descoberta precoce da doença.
Outras técnicas resultantes de modificações da PCR têm sido desenvolvidas com
o objetivo de aumentar a sensibilidade desta metodologia, como por exemplo, a PCR em
tempo real (qPCR), a qual vem ganhando espaço nos diagnósticos clínicos e nos laboratórios
de pesquisa por apresentar a capacidade de gerar resultados quantitativos. As vantagens da
qPCR em relação à PCR convencional são inúmeras e incluem: velocidade, reprodutibilidade
e capacidade de quantificação. A qPCR é uma técnica inovadora, capaz de promover a
quantificação acurada e o monitoramento em tempo real do produto amplificado. Outra
vantagem da qPCR é a eliminação da etapa laboriosa pós-amplificação (preparo do gel para
eletroforese), convencionalmente necessária para visualização do produto amplificado.
Existem poucas publicações utilizando protocolos de qPCR para detecção de E.
canis e A. platys. Assim, os novos protocolos de qPCR desenvolvidos neste estudo para
detecção de A. platys e E. canis que apresentaram alta sensibilidade e especificidade analítica,
surgem como uma ótima alternativa para a detecção rápida desses hemoparasitos.
Diagnósticos baseados no DNA estão em crescimento no estudo de patógenos, e
as características de especificidade e sensibilidade da qPCR abrirão novas oportunidades para
pesquisa sobre interações patógeno-hospedeiro e diagnósticos pré-sintomáticos. A
combinação de uma excelente sensibilidade e especificidade, baixo risco de contaminação,
facilidade de desempenho e velocidade de reação, fez da qPCR uma ótima alternativa para
diagnóstico das hemoparasitoses. Por suas vantagens, a qPCR tende a substituir a PCR
convencional como método molecular de diagnóstico.
Atualmente a utilização das tecnologias de amplificações por qPCR ainda
permanecem com uso limitado devido aos elevados custos relacionados aos sistemas de
detecção empregados e, principalmente, às despesas iniciais de aquisição dos equipamentos.
Entretanto, tal viés possui a tendência de resolução em curto prazo com a ampliação e
divulgação da importância das aplicações multidisciplinares do uso rotineiro da qPCR.
A avaliação das manifestações clínicas é importante e necessária para avaliar o
prognóstico das hemoparasitoses, e o exame ocular de animais com doenças sistêmicas
também pode auxiliar no diagnóstico da EMC e TCIC em cães, entretanto, a confirmação de
E. canis e A. platys requer o uso de testes de diagnóstico específicos.
59
Alterações oculares podem estar presentes em todas as fases da EMC e uma alta
correlação entre a presença de uveíte e descolamento de retina e resultados PCR positivos
para E. canis foram observadas neste estudo, o que permite sugerir que estas alterações
oculares sejam decorrentes da infecção por E. canis. Casos de uveíte já foram relacionados
com a infecção por A. platys em estudos anteriores. Porém, devido ao baixo número de cães
com manifestações oculares infectados por A. platys neste estudo não foi possível verificar a
relação das manifestações oculares com esta riquétsia.
É inegável a contribuição dos ensaios de qPCR para o diagnóstico precoce da
EMC e TCIC, bem como para o desenvolvimento de estudos epidemiológicos na
identificação de agentes infecciosos potencialmente letais e de difícil cultivo. A necessidade
de desenvolvimento de métodos de diagnóstico altamente sensível é cada vez maior, em
decorrência da importância da agilidade no diagnóstico.
O desenvolvimento da presente pesquisa promoveu a ampliação da adoção de
técnicas moleculares para fins de pesquisa e extensão no âmbito da Escola de Veterinária e
Zootecnia da UFG, o que também possibilitará a transferência de tecnologia a outros alunos,
laboratórios de diagnóstico e parceiros de outras instituições, estreitando a relação com
pesquisadores externos.
Os dois novos ensaios de qPCR desenvolvidos e validados neste estudo,
preencheram as expectativas iniciais do trabalho, e contribuirão como ferramenta de
diagnóstico para a detecção específica de A. platys e E. canis de forma rápida, atendendo as
necessidades clínicas e minimizando o uso indiscriminado de antibióticos. Já as limitações do
uso da qPCR devido ao seu alto custo com a aquisição dos equipamentos podem ser
compensadas com a ampliação das aplicações multidisciplinares do uso rotineiro da qPCR.
Assim, as ferramentas moleculares devem ser consideradas como complementares
à microscopia direta e sorologia, pois sua fundamental importância se dá pela rapidez,
praticidade na execução e capacidade em detectar e identificar precisamente as espécies de
hemoparasitos, especialmente em condições de baixa parasitemia ou em situações onde a
morfologia não é conclusiva.
60
ANEXO A