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ANDERSON NOGUEIRA MENDES PAPEL DAS LIPOXIGENASES NA VIA DE SINALIZAÇÃO DA APOPTOSE INDUZIDA POR ATP EXTRACELULAR EM MACRÓFAGOS DISSERTAÇÃO SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO À OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOFÍSICA) Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho 2006
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ANDERSON NOGUEIRA MENDES
PAPEL DAS LIPOXIGENASES NA VIA DE
SINALIZAÇÃO DA APOPTOSE INDUZIDA POR ATP
EXTRACELULAR EM MACRÓFAGOS
DISSERTAÇÃO SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE
JANEIRO VISANDO À OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM
CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOFÍSICA)
Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho 2006
Livros Grátis
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ANDERSON NOGUEIRA MENDES
PAPEL DAS LIPOXIGENASES NA VIA DE
SINALIZAÇÃO DA APOPTOSE INDUZIDA POR ATP
EXTRACELULAR EM MACRÓFAGOS
Aprovada em, / /2006
Dr. Célio Geraldo Freire de Lima
___________________________________________________________________________ Dra. Ana Lucia Marques Ventura
Dr. Marcelo Einicker Lamas
___________________________________________________________________________ Dra. Ana Paula Cabral de Araújo Lima
(revisora)
Dr. Pedro Muanis Persechini (orientador)
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MENDES, ANDERSON NOGUEIRA
PAPEL DAS LIPOXIGENASES NA VIA DE SINALIZAÇÃO DA
APOPTOSE INDUZIDA POR ATP EXTRACELULAR EM
MACRÓFAGOS
xvii, 106 fls Tese: Mestrado em Ciências (Biofísica) 1. Receptores P2. 2. P2X7. 3. Macrófago. 4. Apoptose. 5. Eicosanoides 1. Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho II. Título
iv
Toda minha trajetória sempre será dedicada a aqueles que sempre lutam para
que eu tenha força para seguir na vida. Essa homenagem é apenas mais uma que segue como um breve capítulo de muitas outras que dedicarei aos meus pais. Por toda vida sempre guardarei em meu coração o apoio que eles me deram, dão e darão. Afinal, cuidar de um filho é sempre uma grande dificuldade.
Obrigado por terem me apoiado em tantos momentos difíceis e por segurarem todas as aflições e preocupações que tenho. Destacar aqui a admiração que tenho por vocês meus pais seria pouco, perto do valor que vocês possuem em minha vida. Sei que nem sempre traçamos caminhos certos, mas procuro sempre seguir um caminho voltado para honestidade, valorizando todos os ensinamentos que foram passados ao longo dos anos.
Cumpro mais uma etapa de uma vida de batalhas, sabendo que não conseguiria chegar lá se não fosse a persistência e a determinação de vocês. E com grande satisfação que dedico as poucas glórias que tenho a duas pessoas que sempre se sacrificam tanto para que seu filho consiga alcançar sonhos que muitas vezes vocês mesmos não conseguiram.
Aos meus pais, Antônio e Maria Júlia, por sempre me apoiarem e me ajudarem em todas as minhas dificuldades.
v
“Oh tell me Lord how could it be, That though our cells make ATP,
It’s not all used for energy, But sometimes is secreted free. It puzzles you, it puzzles me,
While Geoffrey Burnstock smiles with glee At the many roles of ATP.”
(Samuel C. Silverstein, 1989)
Este poema foi escolhido pelo fato de resumir a amplitude dos efeitos do
ATP em nossas vidas...
“O pulso ainda pulsa...” (Titãs)
vi
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Imunobiofísica do Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação do Dr. Pedro
Muanis Persechini, tendo sido financiado pelas seguintes entidades:
- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq);
- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ).
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AGRADECIMENTOS:
- Agradeço ao meu grande chefe, Pedro Muanis Persechini, pela orientação durante
toda minha iniciação científica e pelo meu desenvolvimento no mestrado.
- Ao Robson Coutinho, pelas dicas e questionamentos da minha tese e principalmente,
por não ter pagado a aposta até hoje....
- À Márcia Attias por ter me ajudado e muito ensinando o pouco que sei de
Microscopia Eletrônica e pelos lindos dados que obtive na microscopia!
- Ao grupo da Lúcia Faccioli e Auro Nomizo de Ribeirão Preto, que nos acolheu
durante uma semana para realizarmos ensaios com os KO 5-LO. Obrigado também pelo clima
descontraído e pela discussão produtiva!
- Ao Célio Freire pela discussão e grande apoio no decorrer da minha tese. E pela
grande amizade!
- À Ana Paula, por ter tido paciência em revisar a minha tese.
- Aos meus companheiros de laboratório Cristiane, Hercules, Fernanda, Helio, Julieta,
Flavia Calmon, Nathalia, Camila, Flavia Sarmento, Carolina pelo ambiente descontraído e
principalmente ao Vandir por me ajudar muitas vezes com todo apoio técnico-científico e pela
sinceridade e amizade.
- Ao Helio velho pelo tempo de convívio e principalmente pelos últimos sete meses
em que passamos a trabalhar juntos e produzimos uma boa discussão cientifica.... Gerando a
minha tese e a tese dele. Enfim duas teses, não?!
- À APG (Associação de Pós-graduandos) e a PR2 por tentarmos lutar em conjunto
por melhorias das condições dos alunos de pós-graduação e por terem gostado da idéia da
criação da agenda e do manual de pós-graduandos. Enfim tantas conquistas felizes que pude
participar nessa minha estada como aluno de pós-graduação da UFRJ.
viii
- À galera 99-2 que tenta manter-se com reuniões esporádicas e um chopinho uma vez
por mês! André Leão- lobo, Murata, Renato Careca, Vanderson, Carlúcio, Vítor Gianechini,
Dada, Cleber Euller, Ricardo Churros, Albert indiano, Rodrigo BA, Brígida, Cristiane e tantos
outros.
- Ao futebol das quintas, altamente necessário para manter a falta de forma que
possuo.
- Aos meus amigos Carlos, Pedro, Afrânio, Cláudio, Pelé, Adriano, Dudão, Vinhaes,
Luke, Fernando... Enfim, à galera Kids, que tem mais de 10 anos de muita história e diversão,
e à Viviane que além de uma grande amiga é minha irmãzinha de consideração.
- À minha querida namorada Renatinha que tem aturado as insanidades do seu
namorado que quase foi à loucura por causa da tese, mas que conseguiu sobreviver. Minha
linda te amo demais! Ah, Deus foi muito bom quando colocou você no meu caminho.....
- Aos meus padrinhos Dina e Valdeli, meus tios e tias, primos e primas pela dedicação
e carinho que têm por mim.
- À tia Aparecida que está do nosso lado sempre disposta a nos ajudar. Com enorme
prazer, eu te chamo de tia.
- Aos esporros da tia Mariza, que sempre cuidou do seu sobrinho quando ia para
Uberlândia. Tia, você sabe que você é uma mãe para mim!
- Aos meus avós maternos (Noé e Zenita) e paternos (Antônio e Maria) pela felicidade
e vontade de viver, principalmente meu vovô Noé. Ainda tenho muito que aprender com os
ensinamentos de vocês, meus queridos avós!
- Às minhas irmãs Elisângela e Julielli que são chatas e pentelhas, mas que eu amo de
paixão.
ix
- Às minhas lindas e afilhadas-sobrinhas Gabi e Bia. Cada dia que passa, eu aprendo
muito com vocês, minhas lindinhas! A minha felicidade é saber que posso ser criança como
vocês.
- Aos meus pais Antônio e Julia, agradecer é pouco. Vocês me deram tudo que um ser
humano pode querer. Vocês me ensinaram o valor da honestidade, da humildade e da
sinceridade. Vocês, com toda dificuldade, criaram três filhos que os admiram muito.
Sinceramente, eu não tenho palavras para descrever o que sinto por vocês e o quanto eu dou
valor a tudo que me ensinaram. Espero, do fundo do coração, pelo menos honrar o nome de
vocês. Obrigado por serem meus pais!
- À Deus por saber que toda existência e toda ciência é fruto tão somente de sua
presença e existência. Acreditem ou não, só. Ele explica toda a natureza!
- Por fim agradeço à minha tese... Eu não fui ao Big Brother e por causa dela perdi um
milhão de reais. Não pude ir ao show do milhão por causa dos experimentos que fazia na
calada da noite. Deixei de ganhar a mega-sena acumulada várias vezes, porque não tinha
tempo para apostar e para piorar a situação ela quase me levou à insanidade, me deixou
barrigudo, com vários cabelos brancos e seqüelas sem fim... Mas nasceu... Pode não ser
bonitinha, afinal todo recém-nascido tem cara de joelho mesmo! Mas quem sabe depois da
defesa não fica charmosinha?! Bem, finalmente ela está aí e como pai de primeira viagem
escrevi aos trancos e barrancos tentando tratá- la com carinho e cuidado para que ela se torne
alguma referência e quem sabe gere frutos! Acho que é isso!
- Obrigado a todos que de alguma forma sempre estiveram ao meu lado apoiando
todos os meus passos!
x
ABREVIATURAS
• J774 Linhagem celular de macrófagos de camundongos
• MDCK Linhagem celular epitelial renal de cachorro (Cocker Spaniel)
• COS-7 Linhagem celular de fibroblastos renais de macaco
• HEK293 Linhagem celular epitelial renal de embriões humanos
• IgE Imunoglobulina do tipo E
• IgG Imunoglobulina do tipo G
• PMSF "Phenylmethane-sulfonyl fluoride"
• SDS Dodecil Sulfato de sódio
• CAPS ácido 3(3-colamidopropil)dimetilamonio)-1-propanosulfônico
• HEPES ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-2-etanosulfônico
• NP 40 óxido de octilfenol-etileno
• Triton X-100 t-octilfenolpolietoxietanol
• AMP 5’-monofosfato de adenosina
• ATP 5’ trifosfato de adenosina
• UTP 5’ trifosfato de uridina
• AMPc adenosina monofofato cíclico
• ADP 5`-difosfato de adenosina
• PKC proteína quinase C
• UDP 5`-difosfato de uridina
• UTP 5’-trifosfato de uridina
xi
• PPADS pirodoxalfosfato-6-azofenil 2’,4’-ácido disulfúrico
• MRS 2179 2`-desoxi-N6-metiadenosina-3`,5`-bifosfato
• Ap4A diadenosina tetrafosfato
• IP3 inositol trifosfato
• BE brometo de etídio
• IL1-β interleucina 1-β
• AR-C67085MX diclorometilenobis (ácido fosfórico)
• BzATP 3`-O-(4-benzoil-)-5`-trifosfato de adenosina
• PBS Tampão salina fosfato
• NDGA Ácido Nordihidroguaiarético
• AA861 2,3,5-trimetil-6-(12-hidroxi-5,10-dodecadinil)-1,4-
benzoquinona
• MK571 Ácido(E)-3-[[[3-[2-(7-Cloro-2-cinolinil)etenil]fenil]-[[3-
dimetilamino)-3-oxopropil]thio]metil]tio]-propanóico
• NS-398 N-(2-Ciclohexiloxi-4-nitrofenil)-Metanosulfonamida
• L-NIL N6-(1-iminoetil)- lisina dihidrocloride
• MK886 Ácido 3-[1-(para-Clorobenzil)-5-(isopropil)-3-t-butiltioindol-2-
il]–2, 2-dimetilpropanóico
xii
RESUMO
Neste trabalho, procuramos estudar mecanismos de sinalização que estão envolvidos
na morte por apoptose através da ativação do receptor P2X7 por ATP extracelular em
macrófagos peritoneais de camundongos elicitados com tioglicolato. Primeiro,
confirmamos o envolvimento do receptor P2X7 mostrando que a morte celular não é
induzida por ATP em animais deficientes para P2X7 (P2X7- / -) e que o BBG e MgCl2, dois
inibidores do receptor P2X7, bloqueiam a morte induzida por ATP. Procuramos verificar
se as enzimas lipoxigenases ou cicloxigenases participam da via de sinalização ativada por
ATP que induz à morte celular por apoptose. Utilizamos os inibidores de biosíntese de
leucotrienos NDGA, um inibidor de lipoxigenases, MK886, um inibidor de FLAP
(proteína adaptadora de 5-LO), Zileuton e AA861, dois inibidores 5-lipoxigenase (5-LO) e
verificamos que todas estas drogas inibiram a apoptose induzida por ATP, enquanto que o
ácido de acetil-salicílico (AAS) e NS-398, dois inibidores de cicloxigenase, não fizeram
efeito inibitório da morte celular por apoptose. O inibidor do óxido nitritico sintase
(iNOS), L-NIL também não fez efeito inibitório na morte celular por apoptose. A morte
das células aparenta não requerer a sinalização pelos receptores de leucotrieno BLT1 ou
CysLT, pois os antagonistas MK-571 ou CP-10591, não preveniram a morte induzida por
ATP. Entretanto, o ATP foi capaz de induzir apoptose em macrófagos de animais
deficientes para o gene da 5-LO (5-LO-/-). Nossos resultados sugerem o envolvimento de
uma ou mais lipoxigenases na apoptose de macrófagos induzida por ATP dependente do
receptor P2X7.
xiii
ABSTRACT
In this work, we studied signaling mechanisms that are involved in the death by apoptosis
through the activation of the receptor P2X7 for ATP extracellular in thioglycollate-elicited
murine intraperitoneal macrophages. We first confirmed the requirement for P2X7 receptors
by showing that cell death is not induced by ATP in P2X7-deficient (P2X7- / -) mice and that
BBG (brilliant Blue G) and MgCl2, two inhibitors of P2X7 receptors, block ATP-induced cell
death. Next we investigated whether lipoxygenases and cicloxygenases participate in the
signaling pathway involved in ATP-induce cell death. The inhibitors of leukotriene
biosynthesis NDGA, a lipoxygenase inhibitor, MK886, a FLAP inhibitor, Zileuton and
AA861, two 5-lipoxygenase (5-LO) inhibitors inhibited the apoptosis induced by ATP, while
acetyl-salicylic acid (AAS) and NS-398, two cycloxygenase inhibitors, had no effect. The
inhibitor of oxide nitritic sinthase (iNOS), L-NIL, also had not effect. Cell death seems not to
require signaling through neither of the leukotriene receptors BLT1 or CysLT since the
antagonists MK-571 and CP-10591, had no inhibitory effect. ATP also induced apoptosis in
macrophages obtained from 5-LO-gene deficient animals (5-LO-/-). Our results suggest the
involvement of one or more lipoxygenases in the ATP-induced P2X7-dependent apoptosis of
macrophages.
xiv
ÍNDICE 1 INTRODUÇÃO............................................................................................................. 1
1.1 Nucleotídeos e nucleosídeos: moléculas de sinalizações extracelulares ............ 1
1.2 Receptores P1 e P2................................................................................................. 5
1.2.1 Receptores P2Y. ..................................................................................................... 6
1.2.2 Receptores P2X. ................................................................................................... 12
1.2.3 Receptores P2X7................................................................................................... 17
1.2.4 Propriedades do poro e canal ativados pelo receptor P2X7 ............................ 20
1.3 Receptores P2 e macrófagos ............................................................................... 25
1.4 ATP e morte celular ............................................................................................ 26
1.5 Eicosanoides e morte celular .............................................................................. 30
1.5.1 Prostaglandinas.................................................................................................... 32
1.5.2 Leucotrienos ......................................................................................................... 32
1.5.3 Regulação da 5-lipoxigenase (5-LO) .................................................................. 36
2 OBJETIVOS ............................................................................................................... 38
3 MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 39
3.1 Reagentes.............................................................................................................. 39
3.2 Células .................................................................................................................. 39
3.3 Indução de morte celular.................................................................................... 40
3.4 Detecção de apoptose por citometria de fluxo: ................................................. 41
3.5 Dosagem de Lactato Desidrogenase: ................................................................. 42
3.6 “Western-blotting” .............................................................................................. 42
3.6.1 Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida 10% (SDS PAGE)........ 43
3.6.2 Tratamento das amostras para utilização no gel desnaturante ...................... 43
xv
3.6.3 Transferência das proteínas para membrana de Nitrocelulose ...................... 43
3.6.4 Imunodetecção e revelação ................................................................................. 44
3.7 Dosagem de proteína ........................................................................................... 44
3.9 Microscopia Eletrônica de Varredura: ............................................................. 45
3.10 Análise estatística................................................................................................. 45
4 RESULTADOS ........................................................................................................... 46
4.1 ATP induz apoptose em macrófagos.................................................................. 46
4.2 ATP induz apoptose em macrófagos via P2X7.................................................. 48
4.3 Eicosanoides e sua participação na morte via ATP: COX vs LOX................ 52
4.3.1 Efeito dos inibidores das cicloxigenases na indução de apoptose via P2X7.... 52
4.3.2 Efeito dos inibidores das lipoxigenases na indução de apoptose via P2X7. .... 56
4.3.3 Efeito dos inibidores dos receptores de membrana LTB1 e cysLT1 .............. 62
4.3.4 A 5-lipoxigenase é essencial para indução de morte por ATP extracelular? . 64
5 DISCUSSÃO ............................................................................................................... 66
6 CONCLUSÕES ........................................................................................................... 73
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ..................................................................................... 75
8 BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................ 78
9 APÊNDICE ................................................................................................................. 91
xvi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 – O ATP e seus derivados participam da modulação celular 3
Figura 2 – Topologia das subunidades dos receptores P2Y e P2X na membrana 12
Figura 3 – Participação dos receptores P2X7 na formação do poro 18
Figura 4– Modelo proposto da regulação do poro associado à indução de permeabilização
por ATP extracelular 21
Figura 5 –Topologia do receptor P2X7 na membrana 24
Figura 6 – Ação de PLA2 sobre fosfolipídio de membrana gerando ácido araquidônico
- 30
Figura 7 – Via de biosíntese de Leucotrienos. 34
Figura 8 – ATP induz morte por apoptose: visualização por microscopia de varredura
(MEV). 46
Figura 9 – A apoptose é inibida por antagonistas do receptor P2X7 48
Figura 10 – A apoptose é dependente do receptor P2X7. 50
Figura 11 – A apoptose não é inibida por inibidores da via de cicloxigenases. 53
Figura 12 – A apoptose não é inibida por inibidores de óxido nítrico sintase. 54
Figura 13 – ATP ativa 15-LO e 5-LO de macrófagos peritoneais? 57
Figura 14 – A apoptose é inibida por inibidores da via de lipoxigenases 58-60
Figura 15 – A apoptose não inibida por inibidores dos receptores de CysLTs e LTB4. 62
Figura 16 – A 5-LO não é essencial na via de sinalização da apoptose mediada por ATP
extracelular 64
Figura 17 – Modelo proposto da participação de outras moléculas na cascata de apoptose induzida por ATP extracelular. 76
xvii
Tabela 1- Características dos receptores P2Y. 11
Tabela 2- Características dos receptores P2X. 16
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Nucleotídeos e nucleosídeos: moléculas de sinalizações extracelulares
Nucleotídeos e nucleosídeos servem de fonte de energia, controlando funções enzimáticas e
contribuem como matéria-prima para síntese de DNA e RNA (Gordon, 1986). Entretanto, muitas
evidências indicam que essas moléculas funcionam como mediadores extracelulares, modulando
diferentes respostas em diversos tipos celulares.
As primeiras abordagens para o estudo da ação extracelular destas moléculas foram propostas
por Drury e Szent-Györgyi em 1929, quando foi demonstrado pela primeira vez que a adenosina
e a 5’ monofosfato de adenosina (AMP) eram capazes de induzir a vasodilatação, inibição da
contração intestinal, diminuir a pressão arterial e bloqueio cardíaco ((Drury e Szent-Györgyi,
1929) Apud (Ralevic e Burnstock, 1998)). Poucos anos depois, Gillespie et al. (1934)
verificaram que o 5’ trifosfato de adenosina (ATP) e a adenosina induziam efeitos distintos na
pressão sangüínea de cobaias, evidenciando a presença de diferentes receptores, bem como o
envolvimento destes no processo de sinalização (Zimmermann, 1999) (Ralevic e Burnstock,
1998).
A partir da década de 50, surgiram sucessivos trabalhos propondo a participação de purinas
como neurotransmissores e cotransmissores. Os trabalhos de Holton (1953) e Holton (1959)
(Apud (Ralevic e Burnstock, 1998)) sugerem que o ATP seria liberado no nervo sensorial e teria
um papel na transmissão química. Em 1978, Burnstock propôs a existência de receptores para
ATP.
A liberação de ATP associada à despolarização que ocorria em tecidos eletricamente
excitados foi demonstrada nos anos sessenta (Bodin e Burnstock, 2001). A associação do ATP
como neurotransmissor foi estabelecida em estudos em que se demonstrou que esta molécula era
2
sintetizada, estocada e liberada por nervos não-adrenérgicos e não-colinérgicos Apud (Novak,
2003). A identificação de corpos granulares fluorescentes na presença de quinacrina em terminais
neurais, a liberação de ATP e catecolaminas por vesículas secretórias (apesar de não ter sido
descrito se a liberação do nucleotídeo ocorre em vesículas independentes ou associadas aos
neurotransmissores) e a liberação dependente de um estímulo, como despolarização da
membrana, possibilitaram caracterizar o ATP como uma molécula neurotransmissora (Bodin e
Burnstock, 2001).
Em 1966, Keller obteve os primeiros relatos da ação biológica de ATP em células do sistema
imune, ao demonstrar que mastócitos de camundongos liberavam histaminas após a adição de
ATP ((Keller et al., 1966) Apud (Michel et al., 2000)). Somente na década de 80, este fenômeno
foi correlacionado aos receptores para nucleotídeos, pois foi demonstrada a existência de um
receptor capaz de tornar mastócitos permeáveis a solutos grandes, após adição de ATP exógeno
(Cockcroft et al., 1980).
Nos últimos anos, os mecanismos de liberação do ATP para o meio extracelular têm sido
elucidados. Acredita-se que mecanismos como secreção de vesículas ricas em ATP,
transportadores e canais iônicos de membrana plasmática, além da morte e injúria celular estejam
associados ao aumento da concentração de ATP no meio extracelular (Illes et al., 2000).
Além do papel exercido na neurotransmissão, a liberação do ATP para o meio extracelular
pode estar associada à imunoregulação (El-Moatassim e Dubyak, 1993; Stikovsky, 1998;
Burnstock e Knight, 2004). Processos de invasão de microorganismos, corpos estranhos,
inflamação e injúria induzem células do sistema imune a secretar agentes quimiotáticos e
anafilotáticos, recrutando e redirecionando células envolvidas na manutenção e monitoramento da
homeostase do organismo. As plaquetas e células endoteliais, quando ativadas, secretam ATP e
outros nucleotídeos que participam do processo de ativação de monócitos circulantes (Detwiler e
3
Feinman, 1973; Milner et al., 1990), além de ter grande importância na diferenciação de células
T, por exemplo, (Stikovsky et al., 1998) (Figura 1).
Figura 1: O ATP e seus derivados participam da modulação celular. Modelo esquemático descrevendo um dos possíveis papéis do ATP extracelular e da adenosina mediando a sinalização na regulação de timócitos para linfócitos T maduros e regulação da expansão de células T periféricas e funções efetoras, como uma pequena abordagem do universo de ação de purinas extracelulares. Adaptado de (Sitkovsky, 1998).
4
Eritrócitos, miócitos cardíacos, fibroblastos e células epiteliais, células endoteliais, plaquetas
e mastócitos, liberam purinas para o meio extracelular em condições fisiológicas e
fisiopatológicas (Di Virgilio et al., 2001b). Quando receptores de nucleotídeos são ativados ou há
engajamento do receptor de IgE, mastócitos de ratos secretam ATP durante a degranulação
(Osipchuk e Cahalan, 1992) (Apud (Dubyak, 2000)). Em cultura, células epiteliais e astrocitomas
liberam uridina 5’-trifosfato (UTP) (Apud (Ralevic e Burnstock, 1998)).
Apesar da faixa de concentração de ATP no plasma ser em torno de 1-10 nM (Di Virgilio,
2005), a concentração livre de ATP no citoplasma é de 1 a 10 mM (Gribble et al., 2000; Di
Virgilio, 2005). Além disso, os estoques intravesiculares podem chegar à concentração de 150
mM (Lazarowski et al., 2003).
Traumas mecânicos, hipóxia, acidose, choque osmótico e estresse são fatores que contribuem
para liberação de ATP para o meio extracelular. Em condições de estresse, culturas de células
epiteliais e ciliadas oculares e culturas primárias de células endoteliais secretam ATP (Mitchell et
al., 1998) (Apud (Bodin e Burnstock, 2001)).
Além de receptores de nucleotídeos e nucleosídeos, existe uma família de nucleotidases na
porção externa das membranas das células. Elas estão associadas ao mecanismo de sinalização
celular responsável pela inativação da ação dos nucleotídeos extracelulares. As ectonucleotidases
hidrolisam nucleotídeos gerando nucleosídeos e fosfato livre (Zimmermann, 2000). Desta fo rma,
elas atuariam como um mecanismo de “feedback” negativo, atuando em conjunto com outros
mecanismos, tais como dessensibilização do receptor, efeito de diminuição do nível de expressão
do receptor, dentre outros.
Basicamente, as ectonucleotidases são distribuídas em quatro famílias: ectonucleosídeo
trifosfato difosfohidrolase (E-NTPDases), subdividida em seis membros (E-NTPDases1-6);
5
ectonucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase (E-NPPs), subdividida em três membros (E-NPPs1-
3); fosfatases alcalina e ecto-5’-nucleotidases (Zimmermann, 2001).
As ectonucleotidases são enzimas extrínsecas de membrana responsáveis pela ação catalítica
na hidrólise de ésteres fosfóricos. A atividade destas enzimas é potencializada pela presença de
cátions divalentes tais como, cálcio, magnésio e zinco. As E-NTPDases e E-NPPs são enzimas
que possuem domínios transmembrana; já as fosfatases alcalinas e ecto-5’-nucleotidases são
ligadas por uma âncora hidrofóbica de fosfatidil inositol, na porção extracelular da membrana
plasmática (Zimmermann, 2001).
As funções das ectonucleotidases são bem abrangentes. Elas estão relacionadas com o
término da sinalização gerada por nucleotídeos, adesão celular e associadas a receptores de
membrana, podendo agir isoladamente ou por complexo multienzimático. Algumas isoformas
destas enzimas podem ser encontradas solúveis no meio extracelular, sendo denominadas de
exonucleotidases (Zimmermann, 2000).
1.2 Receptores P1 e P2
As divisões e classificações dos receptores de membrana plasmática para nucleotídeos
surgiram a partir de 1978. Neste ano, Burnstock propôs a existência de duas famílias (receptores
P1 e P2) baseado na afinidade da ligação com os nucleotídeos ATP, ADP, AMP e adenosina. Os
receptores P1 têm como agonista principal a adenosina, enquanto que os receptores P2 ligam-se
aos demais nucleotídeos (Fredholm et al., 1997; Ralevic et al., 1998).
Os receptores P1 e P2 foram encontrados em muitos tipos celulares, ainda que parte dos
estudos tenha enfoque no sistema cardiovascular e sistema nervoso (Communi et. al. 1997; King
et al. 1998; Burnstock, 1998). No sistema imune, todas células estudadas apresentam pelo menos
um subtipo de receptor P2 (Burnstock e Knight, 2004).
6
Os receptores P1 são subdivididos em A1, A2a, A2b e A3, de acordo com propriedades
farmacológicas, bioquímicas e informações estruturais como seqüência de aminoácidos,
adquiridos através de clonagem dos genes que os codificam (Fredholm et al. 1997; Ralevic et al.
1998). Quando ativados por nucleosídeos, os receptores P1 geram alterações das concentrações
de AMPc intracelular e têm como antagonistas seletivos os alcalóides metilxantinas como a
teofilina (Ralevic et al. 1998).
O mecanismo de transdução de sinal desses receptores está associado às vias da proteína G
estimulatória (Gs) que, ativadas, aumentam a concentração de AMPc no citoplasma através da
ativação da adenilato ciclase, da proteína G inibitória (Gi), inibindo a ativação da adenilato
ciclase e gerando diminuição de AMPc e da proteína G (Gq) envolvida na ativação de fosfolipase
C e produção de fosfatidil- inusitol-trifosfato (IP3). Os receptores A1 estão associados à proteína
Gi (Van Claker et al., 1978; Londos et. Al., 1980), o receptor A2a à proteína Gs (Palmer et al.,
1995), o receptor A2b às proteínas Gs e Gq (Feoktistov e Biaggioni, 1995) e o receptor A3 às
proteínas Gi e Gq (Palmer et al., 1995) (Apud (Ralevic e Burnstock, 1998)).
Os receptores P2 possuem como agonistas nucleotídeos como ATP, UTP, ADP, UDP e AMP
e são divididos em dois grupos: P2X e P2Y. Os receptores P2X são acoplados a canais iônicos
(ionotrópicos) e os P2Y são associados à ativação de proteína G (metabotrópicos). Em células de
mamíferos, foram caracterizados farmacologicamente e clonados oito receptores P2Y (P2Y1,
P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11, P2Y12, P2Y13, P2Y14) e sete P2X (P2X 1-7) (Lazarowski et al., 2003;
Di Virgilio et al., 2001; Burnstock e Knight, 2004).
1.2.1 Receptores P2Y.
Assim como os outros membros da grande família dos GPCRs (receptores acoplados a
proteína G) o domínio aminoterminal dos receptores P2Y encontra-se voltado para o meio
7
extracelular e o carboxiterminal está voltado para o citoplasma da célula, associado à proteína G.
Os receptores P2Y são agrupados em subfamílias de receptores ligados a Gq (P2Y1, P2Y2, P2Y4,
P2Y6, P2Y11), que ativam fosfolipase C-β e na subfamília ligada a Gi (P2Y12, P2Y13, P2Y14), que
inibe adenilato ciclase. Os receptores acoplados a proteína Gq ativam a liberação de Ca2+ dos
estoques intracelulares. A transdução de sinal ocorre pela via relacionada à ativação de
fosfolipase C e estimulação/inibição de adenilato ciclase (Apud (Ralevic e Burnstock,1998)). As
famílias de receptores P2Y possuem sete domínios transmembrana e são compostos de 328 a 538
aminoácidos, com peso molecular em torno de 40 a 70KDa após a glicosilação (Kügelgen e
Wetter, 2000).
Um dos fármacos mais utilizados como antagonista para receptores P2Y é a suramina (droga
desenvolvida para o tratamento de tripanossomíases) (Dunn et al., (1988)). Entretanto, ela não atua
de forma seletiva, pois tem efeito inibitório em receptores nicotínicos (de glutamato e GABA)
(Ralevic e Burnstock, 1998). Outros antagonistas utilizados são o pirodoxal fosfato (P5P) e
pirodoxalfosfato-6-azofenil 2’,4’-ácido disulfúrico (PPADS). Entretanto, ambos também atuam
bloqueando receptores P2X (Burnstock e Knight, 2004).
Os receptores P2Y1 são seletivos para nucleotídeos derivados de adenina. Seu principal
agonista é o 2-metiltio-ADP, mas moléculas como ATP, ADP, 2-metiltio-ATP e ATPγS também
são capazes de ativar o receptor P2Y1 em células de mamíferos e em oócitos de Xenopus. Uma
enorme variedade de tecidos, como musculares lisos, endoteliais e neuronal expressam o receptor
P2Y1 (Burnstock e Knight, 2004). O receptor P2Y1 participa da contração e relaxamento da
musculatura lisa, liberação de prostaglandinas e fatores de relaxamento derivados do endotélio
(Ralevic e Burnstock, 1998). O RNAm é expresso no coração, tecido muscular esquelético,
endotélio da aorta, pâncreas, baço, cérebro e espinha dorsal. Relatos na literatura também
favorecem a participação do receptor P2Y1 na agregação plaquetária (Kügelgen e Wetter, 2000).
8
Seu principal antagonista é o bifosfato derivado do 2`-desoxi-N6-metiadenosina-3`,5`-bifosfato
(MRS 2179) (Camaioni et al., 1998) e sua via de transdução de sinal envolve fosfolipase C
ativada através de uma proteína Gq com variação dos estoques de Ca2+ intracelular e
envolvimento de PKC (Burnstock e Knight, 2004).
Os receptores P2Y2 foram clonados de células de humanos, ratos e camundongos, sendo que
o primeiro gene de P2Y2 foi clonado de um neuroblatoma NG108-15 de camundongos (Kügelgen
e Wetter, 2000). Os nucleotídeos trifosfatos, incluindo UTP, ATP, diadenosina tetrafosfato
(Ap4A), UTPγS e ATPγS são potentes agonistas para tais receptores. Quando esses nucleotídeos
são degradados a UDP ou ADP não há ativação desses receptores, o que indica a seletividade
para nucleotídeos trifosfatos (Nicholas et al., 1996). Esses receptores possuem distribuição em
diversos tecidos como muscular esquelético, coração, pulmão, baço, rim, fígado e epitélio
(Ralevic e Burnstock, 1998).
Os receptores P2Y4 foram clonados de células da placenta humana (Communi et al., 1996) e
de coração de ratos (Bogdanov et al., 1998) e possuem agonista principais nucleotídeos derivados
da uracila. Esses receptores são ativados por UTP, ATP e Ap4A, em ratos. Os receptores P2Y4
são associados a dois tipos distintos de proteína G: a proteína Gi nos estágios iniciais e Gq/11 em
estágios tardios da sinalização para ativar a fosfolipase C, gerando IP3 (Robaye et al., 1997)
(Apud (Ralevic e Burnstock, 1998)).
Os receptores P2Y6 são ativados por nucleotídeos difosfatados. O UDP é o principal agonista.
Já ADP, ATP e outros derivados do 2-metiltio não são ativadores. Estes receptores estão
envolvidos com proteína Gq na estimulação da fosfolipase C e formação de IP3 (Ralevic e
Burnstock, 1998) e são amplamente encontrados em vários tecidos como: trato digestivo,
placenta, timo, cérebro, baço, aorta, coração e pulmão (Kügelgen e Wetter, 2000).
9
Os receptores P2Y11 foram clonados a partir de células da placenta humana (Ralevic e
Burnstock, 1998). Eles são capazes de ativar duas vias: a primeira envolvendo proteína Gq,
fosfolipase C, PKC e variação de Ca2+ intracelular e a da proteína Gs com aumento de AMP
cíclico motivado pela atividade de adenilato ciclase (Lazarowski et al., 2003). O principal
agonista é o ATP, mas podem ser ativados por análogos como ATPγS e o 2-propiltio-β ,γ-
diclorometileno-d-ATP. Os receptores P2Y11 possuem um papel importante na diferenciação de
linfócitos (Communi et al., 1997).
Recentemente clonados, os receptores P2Y12 são acoplados a proteína Gi e possuem papel
importante na agregação plaquetária quando estimulados por ADP e associados ao receptor P2Y1
ligado a Gq (Bordor et al., 2003). A ativação concomitante destes dois receptores resulta em
ativação de um subtipo de PKC e conseqüente agregação plaquetária. Em 2003, Bodor e
colaboradores purificaram um receptor P2Y12 recombinante de bacilovírus em células SF9 de
insetos e reconstituíram em vesículas lipídicas sua funcionalidade, demonstrando que seu
agonista mais potente é o 2MeSADP e que o ATP possui ação inibitória a ação do 2MeSADP.
Sozinho, o ATP não induz resposta (Bordor et al. 2003). O receptor P2Y12 está acoplado a
inativação de adenilato ciclase (Sak e Webb, 2002).
Os receptores P2Y13 possuem alta homologia em sua seqüência com receptores P2Y12
(Marteau et col., 2003). O ADP é o principal ativador dos receptores P2Y13. Quando ativado, eles
associam-se a proteína Gα1, inibindo a atividade de adenilato ciclase (Zhang et al., 2002),
podendo ter como agonista o 2MeSATP (Marteau et col., 2003). Os efeitos estimulatórios do
ADP são inibidos por azul reativo-2, suramina, ácido piridoxal- fosfato-6-azofenil-
2',4'disulfônico, diadenosina tetrafosfato e ácido 2-(propiltio)-5'-adenil, monoanidrido com
diclorometilenobis (ácido fosfórico) (AR-C67085MX), sendo este o mais potente antagonista
10
(Marteau et col. 2003). Tais receptores estão relacionados à regulação de canais iônicos e queda
da concentração de AMP cíclico.
O papel funcional dos receptores P2Y14 ainda não está totalmente claro, mas estudos têm
relacionado o possível envolvimento deles com a quimiotaxia de células-tronco de tecido
hematopoiético bem como, a regulação e maturação destes tipos celulares (Lee et al. 2003).
Clonados recentemente, estes receptores possuem estruturas muito similares aos membros da
família de receptores P2Y, mas sua farmacologia parece bem distinta, pois eles são sensíveis a
UDP-glicose (Abbracchio et al. 2003).
A tabela 1 resume algumas características dos receptores P2Y quanto, aos agonistas,
antagonistas.
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12
1.2.2 Receptores P2X.
Os receptores da família P2X diferem-se da família dos P2Y em sua estrutura molecular e em
suas funções (Figura 2). Esses receptores são compostos por cadeias protéicas de 384 a 595
aminoácidos, dois domínios transmembrana hidrofóbicos, separados por uma região extracelular
com 10 cisteínas e seis sítios de N-glicosilação (Asn-X-Ser/Thr). Estas cisteínas podem estar
envolvidas na formação da estrutura terciária da proteína, permitindo a formação de pontes
disulfeto. As regiões carboxiterminal e amino-terminal estão voltadas para o citoplasma.
Acredita-se que os sítios de glicosilação possuam participação funcional importante em cada
receptor (Di Virgilio et al. 2001).
Além das interações homoméricas, evidências bioquímicas e farmacológicas têm
demonstrado associação heteromérica das subunidades protéicas dos receptores P2X, tais como,
P2X2/P2X3, P2X4/P2X6, P2X1/P2X5 (North, 2002). Estes receptores possuem em comum a
Figura 2: Topologia das subunidades dos receptores P2Y e P2X na membrana. Receptores P2Y (i) são típicos receptores com 7 domínios transmembrana de cadeias polipeptídicas com N- e C- terminais voltados para o meio externo e citoplasmático da membrana, respectivamente. Receptores P2X (ii) são formados de duas subunidades transmembrana com C- e N- terminais voltados para o meio citoplasmático. As subunidades do receptor P2X7 diferem do outros membros da família P2X pela maior cadeia carboxiterminal (iii). (Adaptado de Di Virgilio, 2001)
13
propriedade da formação de canais seletivos para cátions (Na+, K+, e Ca2+), com abertura em
menos de 10 milisegundos após o estímulo, que levam à despolarização da membrana e ao
aumento na concentração de Ca2+ livre no citosol (Abbracchio e Burnstock, 1998).
O agonista natural principal dos receptores P2X é o ATP (Abbracchio e Burnstock, 1998).
Este nucleotídeo pode ser encontrado, em soluções fisiológicas, tanto sob a estrutura de ATP4-
como ligado aos íons magnésio (MgATP2-), cálcio (CaATP2-) ou hidrogênio (HATP3-) (Albert et
al., 2002).
Os receptores P2X são classificados em sete tipos (P2X1-7) de acordo com suas características
estruturais e informações farmacológicas. Os receptores P2X1 foram inicialmente clonados de
preparações de vasos deferente de ratos, de humanos e da bexiga urinária de camundongos e
possuem 399 aminoácidos (Di Virgilio, 2001). Seus agonistas são o 2-metiltioadenosina trifosfato
tetrasódio (2-MeSATP), ATP, α,β-metileno 5`-trifosfato de adenosina dilítio (α,β-meATP) e
adenosina 5´difosfato (ADP). O principal antagonista é o ácido tetrasódio piridoxal- fosfato-6-
azofenil-2`,4`-disulfônico (PPADS) (Apud (North, 2002)).
Os receptores P2X2 foram clonados a partir de células PC12 de ratos e possuem 41% de
homologia com o receptor P2X1 (Brake et al., 1994; Ralevic e Burnstock, 1998). Eles possuem
dois “splices” variantes de 472 e 401 aminoácidos (Di Virgilio, 2001) e as respectivas proteínas
recombinantes são ativadas pelo agonistas eqüipotentes 2MeSATP e 5-Ò-(3-tiotrifosfato)
tetralítio de adenosina (ATPγS). As respostas a pequenos pulsos de ATP são bloqueadas por íons
de cálcio (IC50 = 5 mM ) (North, 2002).
Os receptores P2X3 foram clonados a partir de gânglio dorsal de ratos e possuem 43% de
homologia com o receptor P2X1 e 47% com o receptor P2X2 (Ralevic e Burnstock, 1998).
Possuem 397 aminoácidos em sua composição e seus principais agonistas são 2MeATP, ATP,
α,β-meATP (North, 2002).
14
Os receptores P2X4 foram clonados a partir de células do gânglio superior cervical, cérebro,
hipocampus e células de ilhota pancreática. O DNA complementar foi isolado de humanos,
camundongos, pintos e Xenopus. Sua estrutura é composta de 455 aminoácidos, com dois
“splices” variantes de 388 e 329 aminoácidos e seu principal agonista é o ATP (Di Virgilio,
2001). O receptor P2X5 foi clonado de gânglio celíaco de ratos por Collo et al., (1996). As
correntes de influxo são ativadas pelo 3`-O-(4-benzoil- )-5`-trifosfato de adenosina (BzATP) além
de ATP, 2MeATP e ADP e inibidas por suramina e PPADS (North, 2002).
Os receptores P2X6 foram isolados do gânglio cervical superior de ratos por Collo et al.
(1996) e seus agonistas são o BzATP, ATP, 2MeSATP, ADP e sua estrutura é composta de 379
aminoácidos. As correntes geradas pela ativação do receptor são bloqueadas com a adição de
PPADS ou suramina (Ralevic e Burnstock, 1998; Di Virgilio, 2001; North, 2002).
Os receptores P2X7, por sua vez, foram clonados de cérebro de ratos e são compostos por 595
aminoácidos (Suprenant et al., 1996). Estes receptores apresentam características atribuídas até
então ao receptor P2z e originalmente descritas em macrófagos, mastócitos, fibroblastos,
linfócitos e em outras células do sistema imune. Experimentos de co-imunoprecipitação
demonstraram que os receptores P2X7 são os únicos membros da família dos receptores P2X que
não se associam a outros P2X (Suprenant et al., 1996; Torres et al., 1999).
Além de estarem associados à abertura de um canal catiônico como os demais P2X, os
receptores P2X7 induzem à formação de um poro não seletivo na membrana citoplasmática que
permite a passagem de moléculas até 900Da. Para que haja abertura do poro, são necessárias
concentrações de ATP 10 a 100 vezes maiores que as utilizadas para ativação de outros
receptores (Suprenant et al., 1996; Torres et al., 1999). Entretanto, ainda não foram descobertas
as moléculas que compõem este poro e tampouco as vias de sinalização que induzem a sua
formação.
15
Os receptores P2X ainda podem ser divididos em dois grupos: aqueles que sofrem rápida
dessensibilização (P2X1, P2X3) e os de dessensibilização lenta ou nula (P2X2, P2X4 P2X5, P2X6,
P2X7) (Ralevic e Burstock, 1998). Os receptores P2X1 e P2X3 sofrem dessensibilização quando a
exposição ao agonista ultrapassa 100 milisegundos. Os receptores P2X4 dessensibilizam após 5 a
10 segundos e os demais receptores não apresentam dessensibilização (North, 2002).
A dessensibilização é o processo no qual a resposta celular decai quando o estímulo prolonga-
se por um determinado tempo. Quando receptores de membrana sofrem a ação contínua de um
agonista, as células podem endocitar ou seqüestrar temporariamente seus receptores para o
citoplasma. As ações prolongadas de agonistas podem resultar na destruição dos receptores em
lisossomos ou na inativação rápida do receptor, a partir de fosforilação de resíduos específicos
após a ativação. A dessensibilização pode também ocorrer através da mudança conformacional da
proteína, pela presença de bloqueadores do sítio ativo das proteínas ou por outros mecanismos
(Alberts et al., 2002).
A tabela 2 resume algumas características dos receptores P2X quanto aos agonistas e
antagonistas.
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1.2.3 Receptores P2X7
Os receptores P2X7 estão presentes em diversos tipos celulares de mamíferos, incluindo o
sistema nervoso central, células epiteliais e hematopoiéticas. No sistema imune e hematopoiético,
estão expressos em células dendríticas, monócitos, macrófagos, timócitos, linfócito T e B, células
“natural killer”, neutrófilos e mastócitos (Di Virgilio et al., 2001). Possuem 40-45% de
homologia com os demais P2X, mas em estrutura apresentam uma cadeia carboxiterminal com
100-200 aminoácidos a mais que os demais da sua família (Wilson et al., 2002). Utilizando o
extrato bruto células HEK transfectadas com o P2X7 foram detectadas duas proteínas de 79kDa e
67kDa através da técnica de western-blot em gel denaturante (SDS-PAGE), sendo relacionadas as
possíveis formas glicosilada e não-glicosilada destes receptores (Kim et al., 2001b).
A estrutura dos receptores P2X7 consiste de 13 exons, sendo que os exons 12 e 13 codificam a
cauda carboxi- terminal (Rassendren et al., 1997). Basicamente, os receptores P2X7 diferem dos
outros P2X por possuírem 595 aminoácidos, um domínio C-terminal com 242 resíduos e pela
característica peculiar que consiste na abertura de um poro na membrana plasmática após a
estimulação contínua com ATP, não-seletivo e com tamanho estimado entre 3-5nm (Baraldi et
al., 2003).
A ativação do receptor P2X7 gera um processo de despolarização rápida da membrana da
célula e um influxo de cátions. A contínua ativação do receptor por 1-30 segundos aumenta a
permeabilidade, tanto para o influxo como para efluxo de diversos íons e a moléculas de até
900Da em macrófagos e 200-300Da em linfócitos (Wilson et al. 2002; Ralevic e Burnstock,
1998) (Figura 3A). A ativação de canais catiônicos associados aos receptores P2X7 depende de
concentrações micromolares de ATP extracelular. Somente quando estas concentrações atingem
18
doses milimolares há a formação de um poro, que pode ser resultado de um conjunto de
moléculas que se agregam ou da dilatação do canal formado pelo P2X7 (Figura 3B).
Figura 3: Participação dos receptores P2X7 na formação do poro. (A) A estimulação dos receptores P2X7 com ATP causa inicialmente a rápida abertura do canal e concomitante influxo de Ca2+ e Na+ e efluxo de K+. Contudo, a constante estimulação com [ATP]= mM leva à formação de um poro reversível de membrana, permeável para diversas moléculas hidrofílicas com baixo peso molecular, como, Fura-2 ácido livre, Lúcifer yellow (LY), brometo de etídio (BE) e nucleotídeos. (B) O fenômeno de abertura do poro pode ser fruto da agregação de um número desconhecido de subunidades de P2X7 e/ou outras moléculas ainda não identificadas que interagem entre si por uma via desconhecida (Adaptado de Di Virgilio, 2001; Liang e Schwiebert, 2005).
19
A hipótese de que o poro é um conjunto de moléculas diversas e não o resultado da agregação
do receptor P2X7 nos parece mais consistente. Em 1997, Coutinho-Silva e Persechini
demonstraram, pela primeira vez, a indução de corrente unitária de canais, estimulados por ATP
extracelular em macrófagos e células J774, via receptor P2X7. Através da técnica de pach-clamp
na configuração de “cell-attached”, observaram que a estimulação dos receptores associados a
nucleotídeos com ATP extracelular induzia a abertura de um poro de 400pS na região de
membrana interna à pipeta (Coutinho-Silva e Persechini, 1997). Esses registros permitiram inferir
que o receptor P2X7 ativaria uma cascata de sinalização induzindo a formação de um poro. Até
hoje, a identidade molecular desse poro não foi estabelecida.
A farmacologia dos receptores P2X7 tem sido alvo de muitos estudos. Em 1996, o BzATP foi
identificado como o seu agonista mais potente, seguido por ATP, 2MeSATP, ATPγS e ADP
(Surprenant et al., 1996). Dentre os antagonistas destacam-se o zinco (IC50 = 11 µM), o cobre
(IC50 = 0,5 µM), a suramina (IC50 > 300 µM em ratos) e seu análogo NF279 (IC50 = 10 µM),
PPADS (IC50 = 3 µM, com pré-incubação de 3 minutos em ausência de cálcio) e o azul brilhante
G-250 (IC50 = 10 nM em ratos; 200 nM em humanos). Os derivados de tirosina, como 1-(N,O-bis
(1,5-isoquinolinasulfonil)-N-metil-L-tirosil)-4-fenilpiperasina (KN-62; IC50 = 51nM efeito
antagonista e IC50 = 500nM completa inibição em humanos) e seus análogos, vem sendo
demonstrados como potentes antagonistas para os diversos fenômenos fisiológicos envolvendo o
receptor P2X7, como secreção de citocinas e abertura do poro (Baraldi et al., 2003; Burnstock e
Knight 2004).
O ATP oxidado (2’-3’ Dialdeido derivado do ATP, IC50 = 100µM) foi proposto como
antagonista seletivo para os receptores P2X7 por ser capaz de inibir de forma eficiente o
fenômeno da permeabilização e reagir possivelmente com resíduos de lisina presentes nos
domínios que ligam ATP em diversas proteínas (Murgia et al., 1993). Entretanto, sua forma de
20
ação não é bem conhecida. Sua ação requer longo tempo de incubação de 120 minutos, para
completa inibição dos fenômenos de permeabilização envolvendo os receptores P2X7.
Recentemente, demonstrou-se que esse reagente poderia ser endocitado e atuar em alguma via
intracelular de quinases (Di Virgilio, 2003) e que, em tempos tão curtos quanto 5 min poderia
inibir um receptor de ADP, possivelmente o P2Y1 (Cruz et al., 2006).
1.2.4 Propriedades do poro e canal ativados pelo receptor P2X7
A condutância da abertura do canal unitário é de 5-8pS, enquanto que a do poro chega a
400pS (Persechini et al., 1998). Quando os receptores P2X7 são ativados por seus agonistas, as
concentrações intracelulares de Ca2+ livre aumentam. O aumento das concentrações intracelulares
de Ca2+ podem também gerar um grande efluxo de K+ através da ativação de canais de K+
dependentes de Ca2+, levando a hiperpolarização da membrana e fechamento do poro (Persechini
et al., 1998) (Figura 4). Apesar do influxo de Ca2+ estar associado à despolarização da
membrana, a abertura do poro é independente da presença deste íon tanto no meio intra quanto
extracelular (Monteiro-da-Cruz et al., 2006).
Em macrófagos, a abertura de poros é observada em regiões da membrana celular protegidas
pelo selamento da pipeta de registro e que, portanto, não entraram em contato com ATP
(Persechini et al., 1998; Coutinho-Silva et al., 1997). Estes dados sugerem que os mecanismos
que levam à abertura do poro estão associados a segundos mensageiros. Estudos recentes que
usam os receptores P2X7 recombinantes e transfectados em células que não expressam outros
receptores P2 endógenos demonstraram que os receptores P2X7 seriam intermediários para a
ativação da transdução de sinais extracelulares mediados por quinases (Gendron et. al. 2003;
Amstrup et. al. 2003). Mas a relevância de MAPKs (proteínas quinases ativada por mitógenos)
para a indução da permeabilização da membrana ainda permanece incerta. Apesar de Farias, R.
21
X. et. al. (2004) terem sugerido a participação da via das MAPKs, ERKs e p38 e sinalização de
Ca2+ na formação do poro ativado pelo P2X7, dados de nosso laboratório indicam que nenhuma
dessas vias é essencial para formação de poro, persistindo a questão de quais mecanismos
envolveriam a cascata de sinalização para formação do poro (Monteiro-da-Cruz, C. et. al., 2006).
Figura 4: Modelo proposto da regulação do poro associado à indução de permeabilização por ATP extracelular. A figura mostra uma hipótese para os fenômenos descritos até hoje, sugerindo a participação de uma sinalização intracelular para que ocorra o fenômeno de abertura do poro. (Be = brometo de etídeo e Ly = lucifer yellow). (Adaptado de Persechini et al., 1998)
22
Em 2001, foram criados camundongos deficientes para o receptor P2X7, férteis e viáveis
(Solle et al., 2001). Macrófagos extraídos destes animais, quando tratados com ATP em doses
milimolares, permaneciam com suas membranas impermeáveis ao corante YO-PRO, indicando a
não abertura de poro (Chulé et al., 2001). Células que não expressam o receptor P2X7 são capazes
de formar poro quando são transfectadas com o receptor e posteriormente estimuladas com ATP
(Barden et al., 2003). Entretanto, células transfectadas com o receptor sem o C-terminal, quando
tratadas com ATP, apresentam formação de canais associados ao receptor, mas se mantêm
impermeáveis aos corantes fluorescentes como o YO-PRO, indicando que o domínio C-terminal é
essencial para induzir as cascatas de sinalização que levam a abertura do poro (Surprenant et al.,
1996).
Com a descoberta de alguns mutantes dos receptores P2X7 na natureza, trabalhos recentes têm
discutido a relação entre a posição de alguns aminoácidos da cadeia polipeptídica do receptor e a
permeabilidade celular. Uma das primeiras mutações identificadas foi decorrente de pacientes
com Leucemia Linfocítica Crônica (CLL), atendidos no Hospital Nepean, de julho de 1999 a
dezembro de 2001 (Wiley et al., 2002). Neles foram encontradas as perdas de função dos
receptores P2X7 em linfócitos B, sendo correlacionados a uma anomalia gerada pela substituição
do ácido glutâmico por alanina, na posição 495 da região C-terminal dos receptores,
inviabilizando a abertura do poro (Gu et al., 2001; Wiley et al., 2002) (Figura 5). Esse tipo de
mutação poderia estar correlacionado à progressão dessa leucemia.
Posteriormente, mutantes para algumas regiões da cadeia polipeptídica do receptor P2X7
foram construídos e testados “in situ”, com o objetivo de determinar quais regiões poderiam estar
envolvidas com sua ativação. Receptores onde a prolina 210 do C-teminal foi substituída por
alanina, permaneceram funcionais (Worthington et al., 2002). Entretanto, aqueles em que as
23
lisinas 193 e 311 do C-terminal foram substituídas por alanina, perderam a propriedade de
permitir a entrada do brometo de etídeo para o meio intracelular após estimulação com ATP
(Barden et al., 2003).
Ensaios funcionais demonstraram que na estimulação dos receptores P2X7 ocorre a
defosforilação do aminoácido tirosina da posição 343 da cauda C-terminal ativando a abertura
dos canais iônicos seletivos a cátions (Kim et al., 2001). Outros estudos observaram a interação
do C-terminal dos receptores P2X7 com membro da família de proteínas de membrana epitelial
(EMP-1, EMP-2 e PMP-22) (Wilson et al., 2002).
24
Figura 5: Topologia do receptor P2X7 na membrana. Na porção extracelular observa-se o sítio de ligação do ATP ao receptor P2X7. As setas pretas indicam sítios de glicosilação. Na membrana celular observam-se os dois possíveis domínios transmembrana hidrofóbicos do receptor (M1 e M2). Na porção intracelular encontram-se as regiões N-terminal e C-terminal, estando associada a esta uma cadeia de 240 aminoácidos com o ácido glutâmico substituído por alanina na posição 496 (Adaptado de Wiley et al., 2002).
25
1.3 Receptores P2 e macrófagos
Os macrófagos têm sido utilizados como modelo de estudo para receptores P2 por duas
décadas. Uma das primeiras descrições do ATP induzindo permeabilização em macrófagos data
de 1987, em que receptores ativados por ATP foram observados na linhagem de macrófagos J774
(Steinberg e Silverstein, 1987). A estimulação induzia o aumento da permeabilidade da
membrana plasmática, podendo resultar na morte da célula. Na mesma época, foi demonstrado
que macrófagos J774 também expressavam receptores da família P2Y, induzindo o influxo de
cálcio intracelular por um processo independente do mecanismo de permeabilização celular (Di
Virgilio et al., 2001).
Alguns trabalhos têm focado na caracterização e descrição dos subtipos de receptores P2X e
P2Y existentes em macrófagos de tecidos de mamíferos. Macrófagos derivados de monócitos
humanos são susceptíveis a permeabilização e expressam os receptores P2X7. Linhagens de
monócitos humanos, como U937 e THP-1, expressam outros receptores: P2Y2, P2Y4 e P2Y6 (Di
Virgilio et al., 2001). Na maturação de monócitos para macrófagos, o RNA mensageiro do P2Y2
decai, enquanto que o RNA mensageiro do P2X7 aumenta (Dubyak et al., 1996).
Em macrófagos alveolares de rato foram identificados os receptores P2X1, P2X4 e P2X7,
P2Y1, P2Y2, P2Y4 e P2Y12, sendo que os receptores P2X2, P2X3, P2X5, P2X6 e P2Y6 não foram
detectados pela técnica de RT-PCR (Bowler et al., 2003). Entretanto, os resultados de
imunohistoquímica apresentaram forte expressão para os receptores P2X4 associados à
membrana, e nenhuma imunoreatividade com receptores P2X1 (Bowler et al., 2003).
Coutinho-Silva e colaboradores (Coutinho-Silva et al 2005), mostram a diversidade dos
receptores P2X e P2Y em outros macrófagos de diversos tecidos de ratos e camundongos. Neste
estudo, foi investigada a expressão de P2X e P2Y em baço de rato, macrófagos de peritônio e
26
células J774, através de técnicas como imunofluorescência, citometria de fluxo, “western-blot” e
RT-PCR. Foram utilizadas também as técnicas de eletrofisiologia e medida de cálcio intracelular
para correlacionar a expressão funcional destes receptores com a resposta fisiológica aos
agonistas e aos antagonistas. Foi descrito que os receptores P2X4 e P2X7 são os mais
proeminentes nos macrófagos estudados, enquanto a expressão dos outros membros da família
P2X é variável. Quanto à família dos P2Y, foi demonstrada a presença de RNAm e a proteína de
P2Y1, P2Y2, P2Y4. Para o Somente o receptor P2Y6 somente foi detectado o RNAm. Células da
linhagem J774 possuem os receptores P2X2, P2X4, P2X6, P2X7, P2Y1, P2Y2, P2Y4 enquanto que
os macrófagos de baço de camundongos expressam P2X3, P2X4, P2X5, P2X6, P2X7. Em
macrófagos de peritôneo foi evidenciando a presença de P2X4, P2X6, P2X7 (Coutinho-Silva et al
2005).
Macrófagos de vários tecidos possuem alta expressão e distribuição dos receptores P2X7 na
membrana plasmática. Desta forma, sua utilização como modelo celular de estudo pode permitir a
caracterização do fenômeno de morte celular pelo receptor P2X7, além de possibilitar estudos
sobre a fisiologia pouco conhecida deste receptor em diversos sistemas de regulação da
homeostase celular e tecidual.
1.4 ATP e morte celular
A observação que a presença de ATP no meio extracelular poderia levar à morte celular foi
feita pela primeira vez na década de 80. Apesar de diversos autores terem evidenciado esse
fenômeno em diversos tipos celulares como hepatócitos e linfócitos, não se sabia de fato qual era
o padrão de morte celular (Di Virgilio et al., 1988).
Zanovello e colaboradores (Zanovello et. al, 1990), usando linhagens celulares de origem
linfóide, determinaram que a exposição contínua a doses de 5 mM de ATP pode induzir à morte
27
celular tanto por necrose, quanto por apoptose. Posteriormente, Zheng e colaboradores,
demonstraram que timócitos expostos à faixa de concentração de 0,5 a 5 mM de ATP morriam por
apoptose (Zheng et al., 1991). Somente, ao final da década de 90, foi evidenciado o envolvimento
do receptor P2X7 na morte celular pela exposição ao ATP extracelular, com a utilização de
agonistas e antagonistas, anticorpos e a ferramentas de biologia molecular (Humphreys et al.,
2000, Nagy et al., 2000).
Quando as células são estimuladas com ATP em doses milimolares por alguns minutos, há
alteração na sua morfologia como arredondamento, formação de “blebbing” e morte por apoptose
ou necrose. Estudos mostram que o C-terminal do receptor P2X7, associado a outras proteínas,
estaria envolvido na sinalização culminando na formação de “blebbing” na membrana e morte
celular (Wilson et al., 2002).
As proteínas transmembrana podem estar associadas e/ou interagir com diversas proteínas
extracelulares ou intracelulares sendo elas estruturais ou não estruturais. Em 2001, Kim e
colaboradores demonstraram por imunoprecipitação que o receptor P2X7 está associado a um
complexo protéico constituído pelas proteínas de matriz extracelular laminin α3; proteínas do
citoesqueleto α-actinina 4, β-actina e supervilina, uma subunidade de integrina β2; uma proteína
de suporte celular MAGuK; chaperonas, Hsp90, Hsp70, Hsp71 e proteínas de sinalização celular
tirosina fosfatase-β (RPTPβ) e a fosfatidilinositol 4-cinase (PI4K) (Kim et al., 2001).
Em 1999, Ferrari e colaboradores verificaram que a ativação do receptor P2X7 em linhagem
celular de microglia induz a clivagem das pró-caspases 1, 3 e 8 (Ferrari et al., 1999). Além disso,
foi verificado que laminin B e PARP, substratos para a ação das caspases, eram clivados. A
inibição de caspases levava a uma inibição de morte celular por apoptose, mas levava também à
liberação de LDH (Ferrari et al., 1999). Outro dado interessante foi a detecção do aumento da
expressão da proteína p53 após o tratamento de células mesangliais com ATP e outros agonistas
28
do receptor P2X7 (Schulze-Lohoff et al., 1998). Entretanto não ficou esclarecido qual o papel da
proteína p53 na indução da apoptose induzida pelo ATP.
A adição de ATP no meio extracelular também leva à ativação de JNK (c-Jun N terminal
Kinase – quinase do N-terminal de c-Jun) (Humphreys et al., 2000). JNK é uma quinase ativada
por estresse oxidativo que pode estar envolvida em diversos processos biológicos que vão da
indução de proliferação celular à apoptose. A ativação da JNK acontece após a ligação do ATP
com o receptor P2X7 e é independente de caspase 1 e 3. Ainda é necessário verificar a ativação da
JNK é um fenômeno paralelo, ou se esta proteína quinase está envolvida na indução de apoptose
pelo receptor P2X7 (Humphreys et al., 2000).
Os receptores P2X7 estão associados à secreção e à maturação de lL-1ß e à indução da morte
celular quando estimulados com ATP em doses milimolares (Di Virgilio, 2001). Em mastócitos,
foi evidenciado que o sinal de indução de apoptose via P2X7 por ATP extracelular possui uma via
que também dispara a expressão de diversas citocinas (IL1β , IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-13, IL-15,
IL 18 e TNF-α) estando correlacionado com a fosforilaração de proteínas como as STATs, ERK1
(p44) e ERK2 p42), bem como algumas Jak2 (Bulanova et. al., 2005).
Os efeitos da ativação do receptor P2X7 podem, ainda, serem observados na morte de diversos
parasitas intracelulares. Macrófagos infectados com Mycobacterium bovis conseguem reduzir a
viabilidade do parasita quando são tratados com ATP e BzATP (Molloy et al., 1994; Smith et al.,
2001). Este efeito é bloqueado com a utilização do ATP oxidado e a adição de UTP não altera a
viabilidade da bactéria. Em macrófagos infectados com Mycobacterium tubeculosis, há formação
de fagolisossomos no interior das células tratadas com ATP (Fairbain et al., 2001). O mesmo
acontece com macrófagos infectados com Chlamydia trachomatis, em que o tratamento com ATP
leva à fusão de lisossomos e vacúolos contendo o parasita, ativação de fosfolipase D e à morte do
parasita (Coutinho-Silva et al., 2003).
29
Macrófagos ativados por LPS ou por Pseudomonas aeruginosa secretam ATP para o meio
extracelular (Ferrari et al., 1997). Mas, como defesa das bactérias na indução da morte celular, há
liberação de ectonucleotidases (5`nucleotidases), ATPases e outras enzimas que degradam o ATP
em subprodutos, que não possuem atividade nos fenômenos que culminariam na morte via P2X7.
Os receptores para nucleotídeos podem também participar do processo de involução do timo
induzido pela infecção por Trypanossoma cruzi (Mantuano-Barradas et al., 2003). Durante o
processo de infecção, células duplo-positivas CD4+/CD8+ têm aumento de permeabilidade
induzida por ATP, sugerindo a participação do receptor P2X7.
ATP extracelular é capaz de ativar a fosfolipase D via o receptor P2X7 em linhagem celular
de astrócitos (Sun, et al., 1999). A ativação de PLD inibe a atividade infecciosa e leva à morte de
Chlamydia e de Mycobacterium tuberculosis em macrófagos através da cascata de sinalização
intracelular disparada pela ativação do receptor P2X7 (Coutinho-Silva et al., 2003; Kusner e
Adams, 2000).
Algumas isoformas de fosfolipase A2 também podem ser ativadas a partir da sinalização do
P2X7. Apesar dos poucos estudos relacionando essas enzimas com o receptor P2X7, foi descrita a
ativação de duas isoformas citosólicas de fosfolipases A2 por agonistas de receptores para
nucleotídeos em células de glândulas submandibulares de rato, sendo que a secreção de calicreína
está relacionada com a isoforma independente de Ca2+ (Alzola et al., 1998). Dados recentes de
nosso grupo demonstram a participação de fosfolipases do tipo A2 na indução da morte celular
via ativação do receptor P2X7 por ATP. Temos evidências de que a morte por apoptose via P2X7
é inibida por mepacrina, um inibidor genérico de fosfolipases A2 e por bromoenol lactona (BEL),
um inibidor seletivo para fosfolipase citosólica independente de Ca2+ o que nos permitiu levantar
a hipótese de trabalho do envolvimento de eicosanoides, como lipoxigenases e cicloxigenases na
apoptose induzida por ATP via P2X7 em macrófagos.
30
1.5 Eicosanoides e morte celular
Em macrófagos peritoneais de camundongos o ATP estimula a síntese de eicosanoides,
(Pfeilschifter et al., 1989). A rota dos eicosanóides inicia-se com a liberação do ácido
araquidônico a partir de fosfo lipídios das membranas celulares, por ação de uma fosfolipase A2.
A superfamília das fosfolipases A2 (PLA2) consiste em um grande grupo de enzimas definidas
por catalisar especificamente a hidrólise da ligação éster liberando ácidos graxos da posição sn-2
de fosfolipídios insaturados (Diaz e Arm, 2003) (figura 6). Como conseqüência são também
gerados lisofosfolipídios. Os ácidos graxos liberados pela ação da PLA2, como o ácido oléico
(AO) e o ácido araquidônico (AA), podem ser importantes reservatórios de energia, porém a
função mais importante exercida pelo AA é sua participação na via de sinalização intracelular e
atuando como precursor de eicosanóides, potentes mediadores inflamatórios e transdutores de
sinal (Gaddi et al., 2004).
Em cada tipo de célula ou tecido existe um conjunto de enzimas, que transforma o ácido
araquidônico em seus metabólitos, os eicosanóides, tais como: prostaglandinas, tromboxanos,
lipoxinas e leucotrienos (Gaddi et al., 2004). Duas famílias de enzimas chaves iniciam essas
rotas: as cicloxigenases para as prostaglandinas e os tromboxanos, e as lipoxigenases, para
leucotrienos e lipoxinas (Taketo e Sonoshita, 2002).
31
Figura 6 – Ação de PLA2 sobre fosfolipídio de membrana gerando ácido araquidônico. Na posição (sn-2) do fosfolipídio está ligado o ácido araquidônico (AA) que é liberado pela ação da enzima PLA2 (em azul). O AA é metabolizado por enzimas lipoxigenases e cicloxigenases, gerando leucotrienos, tromboxanas e prostaglandinas.
32
1.5.1 Prostaglandinas
O AA é o precursor de uma grande família de compostos denominados eicosanóides, com um
grande potencial biológico para sinalização nos tecidos onde são produzidos. A prostaglandina-
endoperóxido-sintase, ou cicloxigenase (COX) é a enzima responsável pela conversão de AA,
através da adição de oxigênio, formando o composto PGH2, precursor imediato de tromboxanos e
outras prostaglandinas, dos grupos E e F (Cheng et al., 2003). Como ácido graxo livre (ácido 5, 8,
11, 14-eicosatetraenóico), o AA é encontrado em baixas concentrações no citoplasma devido ao
fato da COX ter avidez em metabolizá- lo. Tais classes de sinalizadores contêm um anel de cinco
ou seis átomos e sua via de síntese pode ser chamada de “cíclica”, diferenciando-a da via “linear”
que dá origem aos leucotrienos. Basicamente, duas isoformas tem sido classicamente
identificadas em diversos conjuntos celulares: COX-1 expressa constitutivamente e COX-2 que é
induzida por fatores de crescimento e citocinas (Cheng et al., 2003).
As prostaglandinas são conhecidas por atuar em diversos tecidos como reguladoras da síntese
do mensageiro intracelular 3’, 5’-AMP cíclico (AMPc). Pelo fato de o AMPc regular a ação de
vários hormônios, as prostaglandinas conseguem afetar funções celulares de muitos tecidos, tais
como o fluxo sanguíneo de alguns órgãos e as respostas de tecidos a estes hormônios.
Prostaglandinas podem ainda elevar a temperatura corpórea, produzindo febre, e causar
inflamação local (Alberts et al., 2002).
1.5.2 Leucotrienos
Inicialmente, a síntese de leucotrienos foi descrita em polimorfonucleares e em monócitos. Os
leucotrienos são uma importante parte da família de eicosanoides e potentes mediadores lipídicos
33
envolvidos em doenças alérgicas e asma. Eles são produzidos em respostas inflamatórias por
leucócitos polimorfonucleares, macrófagos ativados e mastócitos (Peters-Golden e Brock, 2003).
Durante a resposta imune inata e/ou adaptativa as células dendríticas processam o ácido
araquidônico convertendo-o em leucotrienos pró- inflamatórios (Hedi e Norbert, 2004). Taketo e
Sonoshita demonstraram que os leucotrienos também são capazes de ativar a via de caspases,
induzindo, de maneira intrínseca, à apoptose das células (Taketo e Sonoshita, 2002).
A biosíntese de leucotrienos é iniciada através da conversão de ácido araquidônico em
diversos subprodutos, sendo ativado por vários tipos de estímulos, incluindo antígenos,
micróbios, citocinas, complemento, radicais oxidantes, complexos imunes e toxinas (Peters-
Golden e Brock, 2003). Estes estímulos ativam uma cascata de sinalização que gera a formação
dos produtos enzimáticos ativos da via dos leucotrienos. Além disso, uma vez formados, os
leucotrienos ativam seus respectivos receptores extracelulares (Peters-Golden e Brock, 2005).
As fosfolipase A2 (PLA2), sendo do grupo secretório ou citosólico, inicializa as cascatas de
produção dos mediadores lipídicos por catalizar a hidrólise de fosfolipidios de membrana
liberando o ácido araquidônico (AA). O AA livre é oxidado na posição do carbono 5 e
subseqüentemente desidratado pela ação da enzima 5- lipoxigenase (5-LO) que está acoplada à
membrana nuclear ligada à FLAP (proteína ativadora de 5-LO). A oxidação do ácido
araquidônico leva à formação de um metabólito denominado de hidroperóxido (5-HPETE) que
por ação da 5-LO gera um epóxido intermediário, o LTA4 (leucotrieno A4), através da ligação
covalente de dois oxigênios nos carbonos 5 e 6. A ação da 5-LO requer a ativação de uma
proteína ativadora de 5-LO, FLAP, que se encontra constitutivamente na membrana nuclear, o
que a diferencia dos demais membros do grupo da lipoxigenases (Hedi e Norbert, 2004; Peters-
Golden e Brock, 2003).
34
O LTA4 é instável e pode sofrer hidrólise pela LTA4 hidrolase, gerando LTB4 ou conjugar-se
com glutationa reduzida pela LTC4 sintase e gerar o leucotrieno C4 (LTC4). O LTC4 pode ser
modificado extracelularmente e gerar ainda LTD4 ou então LTE4. A retirada enzimática do ácido
glutâmico do LTC4 resulta na formação do LTD4 e a retirada da glicina do LTD4 resulta no
LTE4 (Peters-Golden e Brock, 2003; Peters-Golden et al., 2005).
Os leucotrienos podem ser divididos em duas classes: uma caracterizada pelo grupo CysLTs (
cisteinil leucotrienos) e outra formada pelo LTB4. A classe CysLTs engloba os leucotrienos C4,
D4, E4 (Hedi e Norbert, 2004). A cascata de conversão dos leucotrienos está resumida no quadro
a seguir (figura 7):
35
Figura 7: Via de biosíntese de Leucotrienos. O ácido araquidônico é liberado dos fosfolipídeos de membranas pela ação da fosfolipase citosólica A2 (cPLA2) e é apresentado a enzima 5-LO pela FLAP. A enzima 5-LO converte o ácido araquidônico a um ácido instável intermediário, denominado 5-hidroperoxieicosatetraenoico (5-HPETE). Subseqüentemente, o 5-HPETE é desidratado e convertido a epóxido LTA4, um intermediário pivô na biosíntese de mediadores inflamatórios e anafiláticos. A hidrólise enzimática de LTA4 por LTA4 hidrolase resulta na formação de LTB4. Paralelamente, a LTC4 sintase cataliza a junção de LTA4 com glutationa para formar respectivamente LTC4, que pode ser convertido a LTD4 e LTE4 pelas ações das enzimas transferase e peptidase. (Hedi and Norbert, 2004)
36
1.5.3 Regulação da 5-lipoxigenase (5-LO)
A 5-LO está presente no núcleo e no citosol de células não ativadas. Após a ativação celular e
liberação de ácido araquidônico, a enzima transloca para membrana nuclear. Assim como todas
as lipoxigenases, a 5-LO contém um átomo de ferro acoplado ao seu sítio catalítico que está
diretamente envolvido na catálise do ácido araquidônico. A oxidação do ferro para forma férrica é
crucial para a atividade da 5-LO, tendo uma relação inversa com os níveis de peróxidos. Há
poucos exemplos de inibidores endógenos da atividade da 5-LO. Entretanto, aparentemente,
espécies de oxigênios reativos podem alterar o estado oxidativo do ferro na 5-LO, afetando sua
atividade (Peters-Golden e Brock, 2003). Tem sido mostrado que o óxido nítrico (NO) pode ser
um potente inibidor da síntese de leucotrienos, inibindo a atividade de 5-LO recombinante através
de ações críticas sobre o átomo de ferro (Coffey et al., 2000). O NO pode interagir com espécies
reativas de peroxi-nitrito que pode também inibir a atividade de 5-LO (Peters-Golden e Brock,
2003).
O cálcio também parece ter importância na atividade da enzima. Na ausência do Ca2+ sua
atividade é mínima. Dados da literatura mostram que a 5-LO pode ser ativada por vias
dependentes de cálcio, através de fosforilação de quinases. A atividade da 5-LO pode ser
modulada por proteína quinase A (PKA) (Flamand et al., 2002), proteína quinase C (PKC)
(Hoffman et al., 1991), proteína tirosina quinase (PTK) (Lepley et al., 1996) e proteínas quinases
ativada por mitógenos (MAPK) (Werz et al., 2000). Alguns trabalhos mostram que ao usar
inibidores de fosforilação de MAPK (Werz et al., 2000) ou PKT (Lepley et al., 1996) há redução
na capacidade da síntese de leucotrienos, sugerindo alterações na expressão e atividade da 5-LO.
Recentemente, descobriu-se que o ATP e outros nucleotídeos poderiam aumentar a atividade
da 5-LO em lisados celulares (Ochi et al., 1983 Apud Peters-Golden e Brock, 2003). Mas o
37
aumento da atividade com ATP não envolveria hidrólise de ATP ou formação de fosfato
inorgânico como energia. O ATP poderia se ligar à enzima diretamente, uma vez que 5-LO pode
possuir dois potenciais sítios de ligação. Aparentemente, o aumento da atividade da 5-LO pela
ação de ATP intracelular é dependente da presença de cálcio, mas este mecanismo ainda não foi
esclarecido (Peters-Golden e Brock, 2003). Em contrapartida, a adenosina é um inibidor de
síntese de leucotrienos e seus efeitos supressivos estão correlacionados com o aumento de AMP
cíclico, inibição de fluxo de Ca2+ e da liberação do ácido araquidônico (Flamand et al., 2000).
Os metabólitos dessas vias estão relacionados com diversos processos inflamatórios. A
ativação do receptor P2X7 gera formação e liberação de diversas citocinas, agentes quimiotáticos,
em contextos de inflamação e isquemia (Divilio et al, 2001b). Recentemente, foi demonstrado
que ativando receptores P2X7 em cultura de astrócitos há liberação de cisteinil leucotrienos e
aumento de expressão do RNA mensageiro de FLAP (Ballerini et al., 2005). Paralelamente,
dados de nosso laboratório sugerem o envolvimento de fosfolipases A2 citosólica independente
de Ca+2 e PKCs na morte celular por apoptose induzida por ATP extracelulares macrófagos.
Como ATP extracelular ativa formação e liberação de eicosanoides, resolvemos investigar se
essas vias estariam envolvidas na cascata sinalização de apoptose iniciada com a ativação do
P2X7.
38
2 OBJETIVOS
Objetivo Geral:
Ø Neste trabalho procuramos caracterizar a participação da via formadora de eicosanoides
na indução morte celular pela ativação dos receptores P2X7 através de seu agonista
fisiológico: ATP extracelular.
Objetivos Específicos:
Ø Caracterizar fenômenos morfológicos induzidos por ATP extracelular em macrófagos.
Ø Verificar se a indução de apoptose induzida por ATP extracelular em macrófagos é
dependente de P2X7.
Ø Verificar a possível participação eicosanoides na apoptose induzida pela ativação do
receptor P2X7
Ø Verificar se a via de leucotrienos e a de prostaglandinas participam da morte celular pela
ativação do receptor P2X7
39
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Reagentes
DMEM e RPMI 1640, soro fetal bovino, penicilina e streptomicina foram obtidos de Gibco
BRL (Grand Island, NY, EUA). Brometo de etídeo foi comprado da United States Biochemical
(Cleveland, Ohio, EUA). Adenosina-5-Trifosfato (ATP), Ácido acetil-salicílico, Tioglicolato e
Triton-X 100, EGTA (etilenoglicol-bis (β-aminoetileter)-N, N, N’,N’-ácido tetra acético), foram
obtidos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). MK886 (Ácido 3-[1-(para-Chlorobenzyl)-5-
(isopropil)-3-t-butiltioindol-2-il]–2, 2-dimetilpropanóico), NDGA (Ácido Nordihidroguaiarético),
foram obtidos da Calbiochem (San Diego, CA, EUA). MgCl2 foi comprado da Reagen (Rio de
Janeiro, RJ, Brasil), L-NIL (dihydrochloride) e NS-398 foram comprados da Cayman. Brilliant
Blue G (BBG) foi comprado da SIGMA lot B0770-5G. O AA861 (inibidor de 5-LO); MK571
(antagonista do receptor cysLT1); CP105.696 (antagonista do receptor BLT1) são de origem do
Dr. Henry Showell (Pfizer, Groton, CT) e Zileuton (inibidor 5-LO) laboratórios Abbot, foram
doados pelo Dr. Henrique Serezani.
Foram utilizados os anticorpos primários anti-P2X7 (alomone labs. Current lot. AN-01); anti-
5-LO e 15-LO (Cayman lot.160402 e160704 respectivamente). Os anticorpos secundários foram
anti-sheep IgG (Sigma Lot. A3415) e anti-Rabbit IgG (Santa cruz ref. sc2004)
3.2 Células
Como modelos de estudo foram utilizados macrófagos intraperitoniais elicitados com 1mL
de tioglicolato (Difco) de camundongos SWISS-WEBTERS, C57/Bl6 (selvagens e deficientes de
P2X7) e da linhagem sv129 (selvagem e deficiente de 5-LO), pesando entre 20 e 30g com idade
40
de 6 a 12 semanas. Após o quarto dia do estímulo, as células foram retiradas em 10mL de meio
DMEM (Dulbecco´s Modifed Eagle Medium) através da lavagem da cavidade peritoneal. As
células foram centrifugadas (500 x g) por 5 min, ressuspendidas em meio DMEM.
A determinação do numero de células presente em cada amostra foi realizada através de
contagem em Câmara de Neubauer, com auxilio de microscópio invertido e utilização de filtro de
contraste de fase. As células foram plaqueadas por 30min em meio DMEM (37oC, na estufa com
5% de CO2) de acordo com cada experimento. Em seguida as placas foram lavadas em meio
estéril por 3 vezes em PBS pH 7,4 estéril e mantidas em meio DMEM com 2 g/L de bicarbonato
de sódio, 5% de SFB, 100 U/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina em pH 7,4 na
estufa a 37oC com 5%CO2 por 4 dias.
3.3 Indução de morte celular
Os macrófagos, na concentração de 2x105 células por cada amostra experimental, foram pré-
incubados na presença ou ausência das drogas por 60 minutos a temperatura de 37ºC em DMEM.
Em seguida, as células foram incubadas na presença ou ausência de 5 mM de ATP por 20
minutos a 37ºC em DMEM. Após o período de incubação, os macrófagos foram lavados e
incubados por 6 horas na ausência de ATP e das drogas, em DMEM suplementado com 10% de
soro fetal bovino. Por fim, as células foram centrifugadas a 5585 x g por 60 segundos, o
sobrenadante foi recolhido para dosagem de lactato desidrogenase liberada e o pellet tratado com
200µL de tampão de lise e corante (50µg/mL de brometo de etídeo; 0.1% de citrato de sódio;
0.1% Triton-X 100).
41
3.4 Detecção de apoptose por citometria de fluxo:
Uma das formas de detectarmos a ocorrência de apoptose é através da verificação do
conteúdo de DNA presente nas células. Em citometria de fluxo, este processo pode ser
evidenciado através do emprego de tampões contendo detergentes que permeabilizam a
membrana plasmática, bem como corantes que fluorescem ao se ligarem ao DNA, nos permitindo
avaliar o conteúdo de DNA da célula. Assim, ao analisarmos células somáticas normais por esta
técnica, poderemos detectar o conteúdo de DNA entre 2n e 4n, dependendo da fase do ciclo
celular em que ela se encontre, ou ainda núcleos hipodiplóides apresentando conteúdo de DNA
inferior a 2n: características de células permeabilizadas em processo de apoptose.
As células tratadas com o tampão de lise e corante foram utilizadas para determinação da
porcentagem de núcleos hipodiplóides caracterizando a morte apoptótica. Cinco mil eventos, por
amostra, foram contados usando o citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton-Dickinson). Fazendo
a avaliação do espalhamento de luz frontal (foward scatter), pelo espalhamento de luz lateral
(side scatter), teremos a determinação do tamanho e a homogeneidade nuclear. A emissão de
fluorescência à 575nm na escala logarítmica (FL2) e à 633nm na escala linear (FL3), além da
área sobre a curva de fluorescência à 633nm (FL3 área) também foram parâmetros de análise.
Avaliando a relação entre FL-3, na abscissa, e FL-3 área, na ordenada, foi possível excluir os
eventos não encontrados dentro do espalhamento diagonal, local onde encontramos os
macrófagos que utilizamos. Os eventos dentro desse espalhamento obedecem a uma relação
direta entre tamanho e quantidade de material genético que será analisado. Assim, qualquer
evento fora dessa região não será avaliado, por corresponder a núcleos grumados, tamanho
pequeno e/ou muito material genético. O gráfico formado pela detecção em FL-2 nos dará um
perfil dos núcleos intactos e daqueles fragmentados.
42
3.5 Dosagem de Lactato Desidrogenase:
Com a perda da integridade da membrana citoplasmática que ocorre na morte celular diversas
moléculas encontradas somente no interior da célula passam a ser observadas no meio
extracelular. Assim sendo, podemos utilizar a detecção destas moléculas no meio extracelular
como parâmetro para determinar o grau de morte celular. Dentre as diversas moléculas que
passam a serem encontradas no meio extracelular, uma que se destaca é a enzima lactato
desidrogenase (LDH). A utilização de LDH para determinar lesão membranar tem várias
vantagens: é expressa constitutivamente por todas as células já estudadas; está presente em altas
concentrações; é bastante estável.
Os sobrenadantes recolhidos da centrifugação na última etapa da indução de morte foram
comparados com um controle celular tratado com 0.1% Triton-X 100, representando este a
liberação máxima de LDH obtida. Adicionando-se 100µL da solução de substrato enzimático e
alúmen férrico aos 50µL do sobrenadante colhido, incubando por 3 minutos à temperatura
ambiente e em seguida, adicionando 100µL de NAD e incubando por mais 9 minutos à
temperatura de 37ºC (adaptado de Doles Ltda.) obteremos um valor para a densidade ótica (DO)
após análise por espectrofotometria ajustada para a leitura em ? 490nm. O percentual de
citotoxicidade poderá ser determinado a partir da seguinte fórmula:
3.6 “Western-blotting”
A utilização de tal procedimento permite identificar, de maneira específica, as proteínas
estudadas em nosso trabalho, através de anticorpos específicos. As diversas etapas estão relatadas a
Citotoxicidade = D.O.amostra - D.O.controle negativo (liberação min)
D.O.controle positivo (liberação max) - D.O.controle negativo (liberação min)
) (
43
seguir:
3.6.1 Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida 10% (SDS PAGE)
Toda formulação do gel foi realizada em temperatura ambiente obedecendo ao tempo de
polimerização de 30 a 40 minutos em média, sendo feito primeiro o gel de separação (running
gel) e depois o gel de empacotamento de proteínas (stacking gel).
Para o gel de separação utilizou-se: Tris-base 1,5M pH 8,8; 10% poliacrilamida; SDS 1%,
0,05% de persulfato de amônio e 0,01% de TEMED. Para o gel de empacotamento utilizou-se:
Tris-base 1M pH 6,8; 3,9% de poliacrilamida; 1%SDS, 0,05% de persulfato de amônio e 0,01%
de TEMED.
3.6.2 Tratamento das amostras para utilização no gel desnaturante
Em cada amostra, adicionou-se tampão de amostra (40% β-mercaptoetanol, 4% dodecilsulfato
de sódio (SDS), 24% sacarose, 100mM Na2CO3, 4 mg/mL azul de bromofenol, 10% glicerol),
aquecendo a 98oC por 5 minutos em banho-maria.
A montagem do gel na cuba de eletroforese foi realizada segundo os critérios do fabricante
(Bio-Rad), utilizando-se géis com espessura de 0,5 mM. Em cada poço foram adicionadas 80µg
proteínas de cada amostra, correndo o gel por 3horas a 20mA. Em todo gel correu-se no primeiro
poço um padrão de peso molecular pré-corado.
3.6.3 Transferência das proteínas para membrana de Nitrocelulose
Após o término da corrida, os géis foram mantidos em tampão de transferência CAPS (10mM
CAPS, 10% metanol, pH 11). Concomitamente, a membrana de Nitrocelulose (Millipore) era
submetida ao tampão de transferência 5 minutos. Utilizou-se uma cuba de transferência da Bio-
44
rad, seguindo os critérios do fabricante, mantendo a transferência por 1:15hr, 90V, em
temperatura próxima a 4oC, utilizando um agitador magnético no interior da cuba, a fim de
manter a tampão de transferência homogeneizado.
Com o fim da transferência, a membrana de Nitrocelulose era bloqueada com leite desnatado
5% (Molico) em tampão TBS-T (Tris-borato 0,1% Tween-20 - Sigma) por 1hr e 30 min sob
agitação.
3.6.4 Imunodetecção e revelação
A membrana bloqueada foi incubada com anticorpos primários em tampão TBS-T 0,1%
contendo leite 5% (Molico) por 1 hora a temperatura ambiente. Em seguida, ela foi lavada 3
vezes por 5 minutos com TBS-T 0,1% e incubada com anticorpo secundário anti-IgG-coelho por
1 hora em constante agitação.
Através do kit de quimioluminescência ECL-plus (Amersham Life Science) foi realizada a
imunodetecção, utilizando o aparelho Storm (Amersham Life Science).
3.7 Dosagem de proteína
Para determinar a quantidade de proteínas presente em cada amostra, utilizou-se o método de
Bradford modificado pela Bio-Rad (Bio-Rad Protein Assay). Em uma placa de 96 poços
adicionaram-se 10µL de cada amostra e depois 200µL do reagente previamente diluído 5 vezes.
Simultaneamente, fez-se uma curva padrão de albumina nas concentrações de 1mg/mL até
0,125mg/mL. A reação final foi medida em espectrofotômetro à 595nm. Os valores finais de
proteína de cada amostra foram determinados através da equação obtida pela regressão linear da
curva padrão aplicada aos valores de absorbância das amostras, admitindo-se um coeficiente de
regressão maior que 0.99.
45
3.9 Microscopia Eletrônica de Varredura:
As células foram lavadas 3 vezes em tampão 0,1 M CACO (tampão cacodilato de sódio pH
7,2 ) a 37oC, fixadas 2horas temperatura ambiente com tampão 0,2 M Cacodilato de sódio pH 7,2
glutaraldeído + 4% de paraformoldeído, deixando-as overnight a 4oC. No dia seguinte, foram
lavadas 2 vezes em tampão 0,1 M CACO por 10 minutos e adicionou-se o pós-fixador com
tetróxido de ósmio 2%, em tampão 0,2M Cacodilato de sódio pH 7,2, com 1,6% ferrocianeto de
potássio e 10 mM de CaCl2, durante aproxidamente 1hora no escuro. Após, lavou-se por 3 vezes
em tampão 0,1 M CACO 10minutos, sendo feita posteriormente à desidratação gradativa em
álcool (15%, 30%, 50%, 70%, 90%, 100%) por 10 minutos cada. Em seguida, foram realizados o
ponto crítico e metalização em ouro. A observação foi realizada no microscópio de Varredura
Jeol 5310, 20KV, no laboratório de Ultraestrutura Herta Mayer sob supervisão da Macia Attias.
3.10 Análise estatística
Utilizou-se o programa Prisma versão 3.0 (GraphPad Software Incorporated). A análise
estatística determinada foi analisada segundo o teste de t-student, admitindo-se *** P < 0,001; **
P < 0,01 * P < 0,05.
46
4 RESULTADOS
4.1 ATP induz apoptose em macrófagos.
Como descrito na introdução deste trabalho, o ATP induz morte celular tanto por apoptose,
quanto por necrose. Entretanto, a indução destes fenômenos depende do protocolo utilizado para
indução de morte celular por ATP extracelular (Bissagio et al., 1999).
Em nosso estudo, procuramos descrever situações relacionadas somente à apoptose causada
pelo ATP extracelular. Alguns autores têm descrito que um dos efeitos do ATP extracelular é a
formação de bolhas na membrana de células, observados por microscopia óptica. Procurou-se
investigar esse aspecto avaliando a morfologia do macrófago tratado com ATP, através da
microscopia eletrônica de Varredura (MEV).
Como podemos perceber, os macrófagos não tratados estão bem preservados com filipódios,
corpos alongados íntegros (Figuras 8 A-C). Após o tratamento com 5 mM de ATP por 20
minutos, (Figuras 8 D-F) percebemos que nos macrófagos há uma retração dos pseudópodos, a
formação de bolhas na membrana e o arredondamento celular. Estas observações corroboram
fenômenos descritos na literatura que mostram perturbações na membrana celular, destacando a
formação de regiões com bolhas, induzidas pela adição de ATP no meio extracelular (Wilson et
al., 2002).
Ao fazermos uma análise das figuras 8 (G-I), percebemos que em G, os macrófagos
apresentam aspectos arredondados com várias bolhas na superfície celular, sugerindo o fenômeno
de apoptose. Em maior aumento, percebemos que os macrófagos perderam a estrutura da
membrana uma vez que esta se apresenta com aspectos amorfos, cheio de bolhas e sem a
formação de pseudópodos.
47
Figura 8: ATP induz morte por apoptose: visualização por microscopia de varredura (MEV). A figura mostra a superfície celular de macrófagos intraperitoniais de camundongos plaqueados por 4 dias e submetidos ao tratamento com 5mM de ATP em tempos de 0 minuto (A-C), 20 minutos com 5mM ATP (D-F) e 20 minutos com 5mM ATP + 6 horas de cultivo sem ATP (G-I). Registramos em diferentes aumentos a visualização da superfície celular dos macrófagos na MEV, sendo as figuras A,D, G com aumento de 1500 X; figuras B, E, H 3500 X; figuras C, I aumento de 7500 X; figura F 5000 X
A
B
C
D
E
F
G
H
I
Controle ATP 5mM (20min)
ATP 5mM (20min)
6 horas de cultivo sem ATP
48
4.2 ATP induz apoptose em macrófagos via P2X7.
Sabemos que o receptor P2X7 participa da ativação da via de apoptose induzida por ATP
extracelular e que 5 mM de ATP induz até 50% de morte em macrófagos peritoneais. Os gráficos
foram normalizados considerando como 0% de morte os macrófagos sem tratamento com ATP e
100% de morte os macrófagos tratados com 5 mM de ATP em que se verificaram os efeitos das
drogas na inibição da apoptose. Procuramos confirmar a importância do receptor P2X7 como
molécula que inicia a apoptose, utilizando dois inibidores bastante conhecidos, o cloreto de
magnésio (MgCl2) e o brilliant blue G (BBG) (Dai et al, 2001; Jiang et al., 2001).
O BBG vem sendo descrito na literatura como um antagonista seletivo de receptor P2X7. Ao
utilizar diferentes concentrações do BBG, pré-tratando as células, percebemos uma inibição
significativa da apoptose (p<0,001). A análise do gráfico 9A nos permite inferir que a apoptose
ativada por ATP via P2X7 foi inibida, chegando à reversão total do fenômeno quando usamos
50µM de BBG.
O íon Mg2+ reduz a carga tetravalente do ATP (ATP4-), tornando divalente e formando um
complexo MgATP2-. Esse complexo inibe a ação do ATP , pois a somente a forma tetravalente
liga-se ao receptor P2X7 (Dai et al, 2001). Como podemos perceber (Figura 9B), a adição de
MgCl2 no meio, concomitante com o ATP, inibiu significativamente a indução de apoptose. O
gráfico 9B demonstra que a concentração de 10mM de MgCl2 reduziu a 20% de apoptose. Mas
diferente do BBG, não observamos a inibição total, o que pode ser conseqüência de um ATP
residual não quelado pelo cloreto de magnésio.
49
Figura 9: A apoptose é inibida por antagonistas do receptor P2X7. A: Macrófagos pré-tratados com BBG em diferentes concentrações e tratados com 5mM de ATP por 20 minutos e 6 horas de tempo de recuperação sem ATP, em meio completo. Em doses menores do BBG, como a de 10µM e 5µM chegamos a inibir 50% e 25% da apoptose conseguindo a inibição total somente com 50µM. B: Macrófagos pré-tratado com MgCl2 em diferentes concentrações e tratados com 5mM de ATP por 20 minutos e 6 horas de tempo de recuperação sem ATP, em meio completo. A dose de 1mM de MgCl2 inibiu 25% da apoptose e a dose de 10mM inibiu 75%. Experimento feito em triplicata e análise estatística t-student onde, *** P < 0,001; * P < 0,05. Os gráficos foram normalizados considerando como 0% de morte os macrófagos sem tratamento com ATP e 100% de morte os macrófagos tratados com 5mM de ATP.
ATP 5m
M
ATP +
BBG 5µM
ATP +
BBG 10µM
ATP +
BBG 50µM
BBG 50µM
-25
0
25
50
75
100
125
**
***
% A
popto
se (n
orm
alizad
o)
n = 3
5 mM ATP
5mM ATP
+ 1m
M MgC
l2
5mM ATP
+ 10
mM MgC
l2
0
25
50
75
100
125
***
*
% A
popto
se (N
orm
aliz
ado)
n = 3
50
Para melhor caracterizar o envolvimento dos receptores P2X7 na apoptose, realizamos
experimentos com camundongos deficientes neste receptor (P2X7-/-) (Figura 10). Conforme
podemos ver na figura 10, a presença do receptor P2X7 é essencial para o fenômeno de morte
celular induzido por ATP. Quando tratamos os macrófagos de animais P2X7-/- com ATP em doses
milimolares não somos capazes de detectar a apoptose (Figura 10B), enquanto que os macrófagos
de animais selvagens sofreram a apoptose após exposição à dose de 5 mM de ATP (Figura 10A).
Nesta etapa podemos definir que a deflagração da apoptose induzida por ATP ocorre se o
receptor P2X7 estiver presente na membrana celular, uma vez que nossos animais P2X7-/- não
possuem tal proteína como confirmado na figura 11C.
Dados do nosso laboratório demonstram que a morte celular por ATP ativa fosfolipases A2
citosólicas independentes de cálcio (iPLA2). Esta proposta é baseada em dados experimentais nos
quais são utilizados inibidores farmacológicos de diversas fosfolipases. Procuramos estudar as
vias de sinalização que metabolizam os ácidos graxos liberados pela ação de PLA2 em
fosfolipídeos de membrana. Verificamos se as enzimas formadoras de eicosanoides,
cicloxigenase e lipoxigenase poderiam participar da via de apoptose induzida por ATP.
51
Figura 10: A apoptose é dependente do receptor P2X7. A: Macrófagos de camundongos C57/Bl6 normais (controle) tratados com diferentes concentrações de ATP por 20 minutos e 6 horas de tempo de recuperação sem ATP, em meio completo. Como podemos perceber somente a dose de 5mM de ATP induziu a morte por apoptose (quase 50% de apoptose) B: Macrófagos de camundongos transgênicos C57/Bl6 (P2X7
-/-) seguindo o mesmo protocolo. Podemos perceber que nem a dose de 5mM de ATP foi capaz de induzir a apoptose nos macrófagos. Experimento feito em triplicata e análise estatística t-student onde, *** P < 0,001. C: Western-blot anti-P2X7 onde a linha 1 representa o padrão de banda característico do P2X7 (foram utilizados 90µg de proteínas totais) em macrófagos peritoneais de animais Suiwss Webster. As linhas 2 e 3 são proteínas retiradas da medula de C57/Bl6 como controle para mostrar que o animal controle C57/Bl6 possui a proteína P2X7 (linha 2) e enquanto que os animais transgênicos para P2X7 não possuem realmente o receptor (linha 3) (Para os C57/Bl6 usamos 70µg de proteína). Gráfico não normalizado.
n = 3
0mM 0,1mM 1mM 5mM0
10
20
30
40
50
60
***
[ATP]
% A
popt
ose
A
n = 3
0mM 0,1mM 1mM 5mM0
10
20
30
40
50
60
[ATP]
% A
popt
ose
B
C
Selvagens
P2X7-/-
52
4.3 Eicosanoides e sua participação na morte via ATP: COX vs LOX
Os mediadores lipídicos como leucotrienos, prostaglandinas, tromboxanas e lipoxinas são
gerados após a ativação de fosfolipases intracelulares que processam fosfolipídios de membrana,
levando a liberação de ácido araquidônico e de outros ácidos graxos. Concentraremos nossos
estudos em duas vias que fazem parte do metabolismo do ácido araquidônico. As vias mediadas
pelas lipoxigenases (LOX) e cicloxigenases (COX).
4.3.1 Efeito dos inibidores das cicloxigenases na indução de apoptose via P2X7.
As cicloxigenases são enzimas que participam do processo de biosíntese de prostaglandinas, ao
metabolizar o ácido araquidônico. Basicamente, duas isoformas têm sido classicamente identificadas
em diversos conjuntos celulares: COX-1 expressa constitutivamente e COX-2 que é induzida por
fatores de crescimento e citocinas (Cheng et al., 2003). Para evidenciar se algumas dessas enzimas
estariam envolvidas no processo de apoptose por ATP extracelular utilizamos inibidores como o
ácido acetil salicílico (AAS) e NS-398 (figura 11).
Em todos os experimentos com estes inibidores, procuramos verificar se doses crescentes de
cada droga inibiriam a ação de 5 mM de ATP na indução de morte. A ação do AAS dá-se pelo
bloqueio irreversível das cicloxigenases, impedindo a formação de tromboxanas e protaglandinas. O
AAS não foi capaz de inibir a apoptose induzida por ATP em todas as concentrações testadas (FIG.
11A). Procuramos fazer uma curva do efeito do NS-398 de forma que conseguíssemos bloquear a
atividade preferencialmente de COX-2 (IC50=1,77µM) (Barnett, et al. 1994 Apud Cheng et al.,
2003). A utilização do inibidor NS-398 reforçou os dados obtidos com o AAS uma vez não houve
alteração da morte induzida por ATP extracelular (FIG. 11B). Esses dados sugerem que as
cicloxigenases não participariam da via de apoptose.
53
A seguir, verificamos se o óxido nítrico (NO) poderia participar desta via. Sabemos que ATP
extracelular induz formação e liberação de NO que, em conjunto com as prostaglandinas, está
envolvido em diversos processos inflamatórios. Grande quantidade de NO e prostaglandinas são
formadas durante o processo inflamatório. Diversos estudos indicam que as vias de iNOS e COX-2
são co-induzidas em diferentes modelos de inflamação “in vivo” (Lin et al., 2004). O NO estimula a
atividade de COX-2 com componente do heme em células RAW 264.7, além de regular a expressão
de COX-2 em macrófagos peritoneais de ratos (Pang et al., 1996 Apud Lin et al., 2004). O óxido
nítrico endógeno aumenta a produção de prostaglandinas em modelos de inflamação renal “in vivo”
(Paya et al., 1997 Apud Lin et al., 2004).
Utilizamos um outro inibidor que atua na via de formação de óxido nítrico sintase, o L-NIL
(dihydrochloride). Como podemos verificar (figura 12), o L-NIL não foi capaz de impedir a ação do
ATP na indução de apoptose. Esses dados reforçam a idéia de que a via das cicloxigenases não
participa da cascata de sinalização de morte via P2X7 e sugerem que não há participação do óxido
nítrico sintase.
54
0µM
1µM
10µM
50µM
100µ
M
100µ
M (s/ A
TP)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
[AAS]
n = 3
% A
po
pto
se (
no
rmal
izad
o)
A
0µM
0.01µ
M0.1
µM 1µM
10µM
100µM
100µ
M (s/ ATP
)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
[NS-398]
n = 3
% a
po
pto
se (
no
rmal
izad
o)
B
Figura 11. A apoptose não é inibida por inibidores da via de cicloxigenases. Fig. A: Podemos perceber que a adição de AAS em doses crescentes não altera a apoptose induzida por ATP e adição de 100µM AAS (sem ATP) não induz apoptose. Fig. B: Podemos perceber que a adição de NS-398 em doses crescentes não altera a apoptose induzida por ATP e adição de 100µM NS-398 (sem ATP) não induz apoptose. Experimento feito em triplicata e análise estatística t-student. Os gráficos foram normalizados considerando como 0% de morte os macrófagos sem tratamento com ATP e 100% de morte os macrófagos tratados com 5mM de ATP.
55
0µM
0.01µ
M0.1
µM 1µM
10µM
100µ
M
100µ
M (s/ A
TP)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
[L-NIL]
n = 3
% A
popt
ose
(nor
mal
izad
o)
Figura 12. A apoptose não é inibida por inibidores de óxido nítrico sintase. Podemos perceber que a adição de L-NIL em doses crescentes não altera a apoptose induzida por ATP e adição de 100µM L-NIL (sem ATP) não induz apoptose. Experimento feito em triplicata e análise estatística t-student. O gráfico foi normalizado considerando como 0% de morte os macrófagos sem tratamento com ATP e 100% de morte os macrófagos tratados com 5mM de ATP.
56
4.3.2 Efeito dos inibidores das lipoxigenases na indução de apoptose via P2X7.
A via de lipoxigenases compreende moléculas que estão relacionadas com quimiotaxia,
diferenciação celular, recrutamento e ativação de diversos tipos celulares do sistema imune.
Utilizamos um inibidor genérico do grupo das lipoxigenases, o NDGA (figura 13A) e verificamos
uma redução na apoptose mediada pelo ATP extracelular.
O grupo das lipoxigenases é formado por três enzimas a 5- lipoxigenases (5-LO), 15-
lipoxigenase (15-LO) e 12-lipoxigenases (12-LO). A expressão da 15-LO e 5-LO foi evidenciada
por western-blot de amostras totais de macrófagos (Figura 13). Macrófagos não tratados não
apresentavam a 5-LO e 15-LO, mas após o tratamento com ATP nos 20 minutos iniciais, as duas
proteínas eram expressas, mostrando que o ATP é capaz de induzir a expressão de 5-LO e 15-LO
(Figura 13).
As vias ativadas por ATP extracelular e a via de formadora de leucotrienos, que possui
envolvimento da 5-LO, participam do processo pró- inflamatório. Quando há ativação do P2X7, há
liberação de IL-4 (Bulanova et al., 2005; Lin e Boyle, 2005) e de outras citocinas como IL-2, IL-
5, IL-6, IL-10 de mastócitos (Bulanova et al., 2005; Hedi e Norbert, 2004). A ativação do
receptor P2X7 em cultura de astrócitos de cérebros de ratos leva à biosíntese de cisteinil
leucotrienos e do aumento na expressão de RNA mensageiro de FLAP, a proteína ancoradora da
5-LO (Ballerini et al., 2005).
Como o NDGA não é específico para lipoxigenases, utilizamos outros de inibidores de 5-LO,
para assim tentar dar suporte a nossa hipótese. Utilizamos também o MK886, que atua na
proteína ancoradora da 5-LO, a FLAP (proteína facilitadora de da atividade da 5-LO) e o Zileuton
e o AA861 que agem diretamente no sitio catalítico da enzima, como inibidores mais seletivos. O
tratamento com o MK886 levou à inibição da apoptose em 90% (figura 14B) reiterando a
57
participação da 5-LO na apoptose. Além disso, o Zileuton e o AA886 inibiram 50% da apoptose
(Figura 14C e D). Em todos casos podemos perceber que as drogas na ausência de ATP não
apresentam toxicidade para as células nas condições em que foram usadas.
Paralelamente aos ensaios de apoptose, o sobrenadante de cada grupo de células foi separado.
A partir deste sobrenadante avaliamos a liberação da enzima LDH, no caso de perda de
integridade da membrana, como marcador de necrose. Segundo a literatura, o ATP é capaz de
induzir a necrose em doses de 1 mM, de maneira dose dependente (Bissagio et al., 1999). Tal
enzima pode ser liberada em caso de ocorrência de uma necrose secundária. A necrose secundária
é um processo em que as células que sofreram apoptose e não são fagocitadas começam a perder
a integridade da membrana plasmática, liberando as moléculas do conteúdo citoplasmático para o
meio extracelular.
Ao analisamos os gráficos (figuras 14E e F), os inibidores de 5-LO não foram capazes de
controlar a morte por necrose induzida por 5 mM ATP. Como o ATP é capaz de induzir necrose,
estes dados indicam que a via que induz necrose é diferente da via que induz apoptose. Estes
ensaios nos permitiram inferir que os inibidores de 5-LO (NDGA, MK886, AA861 e Zileuton)
são capazes de inibir a apoptose via P2X7, mas não são capazes de evitar a morte da célula por
necrose. Esses dados sugerem que as vias que sinalizam para indução de necrose e apoptose são
diferentes ou quando inibimos a apoptose podemos direcionar a célula para necrose.
Seguindo a proposta de mapeamento da via de sinalização da apoptose que é ativada pelo
receptor P2X7, fizemos duas perguntas: Os receptores de leucotrienos estariam envolvidos na
apoptose via P2X7? A 5-LO é essencial nessa via?
58
Figura 13: ATP ativa 15-LO e 5-LO de macrófagos peritoneais? A figura 14 mostra que ao tratarmos com 5mM de ATP os macrófagos, fomos capazes de visualizar o aumento das proteínas 15-LO e 5-LO. Os macrófagos em repouso, aparentemente, não possuem a proteína na membrana que surge após os 20minutos com 5mM de ATP, mantendo-se constante após a retirada do ATP do meio, nos tempos de 2, 4, 6 e 8 horas (tempo de recuperação). Em nosso estudo, a dose de 5mM de ATP induz apoptose com 6 horas. O (*) representa o controle positivo em que usamos pré-tratamos macrófagos plaqueados por 4 dias com 500ng/mL de LPS por 18 horas. Em cada linha foi adicionado 80µg de proteína.
59
0µM
10µM
50
µM
50µM
(s/ A
TP)
0
20
40
60
80
100
[NDGA]
**
*
% A
po
pto
se (n
orm
aliz
ado
) A
0µM
0,1µM 1µ
M
1µM (s
/ ATP
)
0102030405060708090
100110120
***
[MK886]
n = 3
% A
po
pto
se(n
orm
aliz
ado
)
B
Figura 14. A apoptose é inibida por inibidores da via de lipoxigenases. A adição do NDGA (A) teve percentual de inibição até 50%, MK886 90% de inibição (B) na apoptose induzida por 5mM de ATP dos macrófagos.Experimento feito em triplicata e análise estatística t-student onde, *** P < 0,001; ** P < 0,01, * P < 0,05. Os gráficos foram normalizados considerando como 0% de morte os macrófagos sem tratamento com ATP e 100% de morte os macrófagos tratados com 5mM de ATP.
60
0µM
1µM
10µM
1µM (s
/ ATP
)
10µM
(s/ ATP
)
0
20
40
60
80
100
***
******
**
[AA861]
% A
po
pto
se (
no
rmal
izad
o)
D
0µM
1µM
10µM
1µM (s
/ ATP
)
10µM
(s/ A
TP)
0
20
40
60
80
100
[Zileuton]
*** ***
*** ***
% A
po
pto
se (
no
rmal
izad
o)
C
Figura 14. A apoptose é inibida por inibidores da via de lipoxigenases. A adição do Zileuton teve percentual de inibição até 50% (C), AA861 50% de inibição (D) na apoptose induzida por 5mM de ATP dos macrófagos. Experimento feito em triplicata e análise estatística t-student onde, *** P < 0,001; ** P < 0,01, * P < 0,05. Os gráficos foram normalizados considerando como 0% de morte os macrófagos sem tratamento com ATP e 100% de morte os macrófagos tratados com 5mM de ATP.
61
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
5mM ATP1µM Zilleuton10µM Zilleuton1µM AA86110µM AA861
+
++
+
++
+
++
+
+++
-
-
- -
----
---
-
---
---
---
---
--
--
--
--
% L
iber
ação
de
LD
H
F
Figura 14. A apoptose é inibida por inibidores da via de lipoxigenases. As figuras E e F são ensaios de necrose medidos por LDH e como podemos perceber apesar do zilleuton aparentemente inibir a necrose parcialmente, as outras drogas não foram capazes do mesmo. Experimento feito em triplicata e análise estatística t-student onde, *** P < 0,001; ** P < 0,01, * P < 0,05.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
+ +5mM ATP10µM NDGA50µM NDGA0.1µM MK8861µM MK886
++
++ +
++
++
--
-
--
--
----
-
---- -
-
--
-- -
-
% li
ber
ação
de
LD
H
E
62
4.3.3 Efeito dos inibidores dos receptores de membrana LTB1 e cysLT1
A sinalização celular induzida pela ação dos leucotrienos ocorre através de seus receptores de
membrana. Existem quatro tipos de receptores celulares para esses mediadores. Os receptores dos
cisteinil leucotrienos (LTC4, LTD4, LTE4) são chamados de CysLT1 e CysLT2, já para o
leucotrieno B4 há dois tipos, BLT1 e BLT2. O BLT1 é descrito como receptor de alta afinidade
para LTB4 e o BLT2 de baixa afinidade (Hedi e Norbert, 2004). No caso dos CysLTs, o CysLT1
possui maior afinidade do que o CysLT2 aos cisteinil leucotrienos.
Como aparentemente a via de leucotrienos está correlacionada com a apoptose induzida por
ATP extracelular, procuramos verificar se algum desses receptores estaria envolvido na
sinalização para morte celular via P2X7, através da utilização de antagonistas para BLTs e
CysLTs. É possível que a 5-LO ativada produza algum tipo de leucotrieno, que liberado para o
meio extracelular, atue por uma via autócrina, ativando algum receptor para leucotrieno, dando
continuidade à cascata de morte por apoptose.
Testamos a hipótese através de dois inibidores farmacológicos de receptores de membrana de
leucotrienos, o MK571 (potente antagonista do receptor CysLT1) e o CP10596 (antagonista de
BLT1). Tais drogas não inibiram a morte celular, tanto apoptose, quanto necrose (Figura 15).
Nossos dados sugerem que os receptores de membrana de leucotrienos não estão envolvidos na
morte celular por ATP.
63
020406080
100120140160180
5mM ATP1µM CP1059610µM CP105961µM MK57110µM MK571
+ + + ++----
---
---
---
---
----+
++
++
+--
-
--
--
--
--
++
-
liber
ação
de
LD
H (
%)
n = 3
B
Figura 15. A apoptose não inibida por inibidores dos reptores de CysLTs e LTB4. Os macrófagos foram pré- incubados com as drogas, CP10596 e MK571. Em A podemos perceber as drogas não inibem a apoptose induzida por ATP, pois as doses de 1µM e 10µM de ambas drogas não inibiram a apoptose. A necrose também não foi inibida em nosso estudo. Experimento feito em triplicata e análise estatística t-student. Os gráficos foram normalizados considerando como 0% de morte os macrófagos sem tratamento com ATP e 100% de morte os macrófagos tratados com 5mM de ATP.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
5mM ATP1µM CP1059610µM CP105961µM MK57110µM MK571
+ + + ++----
---
---
---
---
----+
++
++
+--
-
--
--
--
-
-
++
-
% A
po
pto
se (
no
rmal
izad
o)
A
64
4.3.4 A 5-lipoxigenase é essencial para indução de morte por ATP extracelular?
Outra questão foi gerada em cima da enzima 5-LO como participante da via de sinalização de
morte pela ativação do receptor P2X7, uma vez que nenhum dado da literatura correlaciona tal
enzima com fenômenos de morte celular. Devido a este fato inovador e original, tentamos
responder se indução de morte por ATP extracelular ocorreria na ausência de 5-LO.
Como mostrado neste trabalho, o receptor P2X7 é importante para o fenômeno de morte, fato
verificado com a utilização de animais P2X7-/-. Seguindo a mesma linha de raciocínio procuramos
trabalhar com animais que não possuem a enzima 5-LO (5-LO-/-) e realizamos o mesmo
procedimento de indução de morte com ATP nos macrófagos coletados do peritônio destes
animais e seus controles.
Ao realizarmos uma curva dose resposta de ATP, percebemos que as células dos animais 5-
LO-/- sofrem menos apoptose do que o controle (Figura 16A). A dose de 1 mM de ATP é capaz
de induzir apoptose somente no controle e não no 5-LO-/-. No entanto, nas concentrações 5 mM
de ATP, ambos os tipos celulares morrem por apoptose. O perfil de liberação de LDH (necrose)
(figura 16B) se mantém semelhante. Estes resultados mostram que a cascata de sinalização para
indução de morte via P2X7 ocorre na ausência da 5-LO. Mesmo assim, devemos avaliar as
informações obtidas com esses animais, pois o efeito citotóxico com 1 mM de ATP foi
significativamente maior nos animais controles. Mas ainda não fomos capazes de esclarecer
porque há um sugestivo desvio da curva dose efeito da ação citotóxica do ATP nessa linhagem de
animais.
65
contr
ole
ATP 0.1
mM
ATP 1m
M
ATP 5
mM
0
10
20
30
40
Animais 129 Normais
Animais 129 5-LO-/-
*
n = 5
Apo
ptos
e (%
)
A
contr
ole
ATP 0.1
mM
ATP 1m
M
ATP 5
mM
0
10
20
30
40
50
60
70
80n = 5
Animais 129 normais
Animais 129 5-LO-/-
liber
ação
de
LD
H (%
)
B
Figura 16. A 5-LO não é essencial na via de sinalização da apoptose mediada por ATP extracelular. Foram utilizados macrófagos de animais selvagens e transgênicos sem a enzima 5LO (5-LO-/-). Em A, destacamos a apoptose de macrófagos peritoneais de ambos animais. Como podemos perceber apesar de termos uma certa inibição da apoptose com 1mM de ATP, ao usarmos a concentração de 5mM de ATP, não verificamos redução total da apoptose no macrófagos dos animais transgênicos. Paralelamente, executamos o ensaio de LDH (necrose) e verificamos que o ATP em concentrações milimolares foi capaz de induzir liberação de LDH em ambos conjuntos celulares, o que indica o perfil de indução de necrose. Experimento feito em triplicata e análise estatística t-student onde, * P < 0,05.
66
5 DISCUSSÃO
A morte celular é vital para manutenção da estrutura dos tecidos no desenvolvimento e na
seleção do repertório celular. A deleção de células na atenuação da resposta imune e eliminação
de células que têm funções inapropriadas, incluindo as infectadas por vírus e transformadas,
dependem de uma indução seletiva que a conduza à morte. É possível que o ATP extracelular
faça parte desses mecanismos, principalmente durante o processo inflamatório.
Muitos trabalhos vêm discutindo o papel fisiológico do ATP extracelular e quais seriam as
possíveis fontes deste nucleotídeo. Vários conjuntos celulares podem liberar ATP que atua em
receptores P2X e P2Y gerando respostas diversas, como, por exemplo, a morte celular.
Procuramos focar no estudo da ação do ATP extracelular que vem sendo descrito como molécula
sinalizadora para morte celular, avaliando seu efeito citotóxico em macrófagos intraperitoniais
murinos.
Através da microscopia eletrônica de varredura, mostramos que o ATP induz alterações
morfológicas típicas de apoptose (Figura 8). Esta observação é de grande importância, uma vez
que permitem a visualização da célula em três momentos. No primeiro, observamos a célula em
seu estado normal, com a forma alongada e seus pseudópodos bastante definidos. Ao segundo, o
encolhimento da célula que entra em contato com doses altas de ATP, a retração dos pseudópodos
e surgimento de bolhas na membrana. E por fim, o momento que ela encontra-se apoptótica com
perda da morfologia característica do macrófago e com a superfície cheia de bolhas.
Com o auxílio de ferramentas farmacológicas e o uso de animais deficientes para o receptor
P2X7 (P2X7-/-) (Figuras 9 e 10), inicialmente mostramos que os macrófagos são induzidos à
apoptose quando ativamos o receptor P2X7. O Mg2+ inibiu a apoptose parcialmente, e o BBG
inibiu completamente. Além disso, o ATP não foi capaz de induzir apoptose em macrófagos
67
derivados de camundongos P2X7-/- comprovando a importância do P2X7 como a proteína que
dispara o inicio da cascata que culmina para a apoptose.
Dando prosseguimento ao estudo, procuramos nos concentrar nas possíveis vias de
sinalização que são deflagradas com a ativação do receptor P2X7. Como dito na seção 1.4, o
receptor P2X7 possui um carboxi- terminal alongado que interage com uma série de proteínas do
meio intracelular.
Em células de ductos acinares de glândulas submandibulares de rato, a ativação do P2X7 já foi
relacionada à ativação de PLA2 (Alzola et al., 1998; Kabré et al., 1999) e implicada na ativação
da caspase-3 (Atsumi et al., 2000). A hipótese de que fosfolipases A2 poderiam estar envolvidas
no processo de apoptose pareceu plausível diante de dados da literatura que correlacionam a
ativação do receptor P2X7 e fosfolipases (Alzola et al., 1998; Kabré et al., 1999; Atsumi et al.,
2000). Esta possibilidade foi comprovada através de estudos com inibidores de fosfolipases A2
(PLA2) e vem sendo discutida na tese de doutorado de Costa-Junior e no artigo em fase de
redação. Suspeitando da participação de uma PLA2 no sistema de sinalização, procuramos
investigar se duas vias que metabolizam um dos produtos principais da ação de PLA2, o ácido
araquidônico, estariam também envolvidas na indução de apoptose por ATP em macrófagos.
Sendo assim, procuramos verificar a participação das vias de cicloxigenases e lipoxigenases.
Inibidores das cicloxigenases e da sintase de óxido nítrico não provocaram alterações na
apoptose ativada ATP (Figuras 11 e 12) sugerindo que não há envolvimento da ação de
prostanoides ou tromboxanos ou possível envolvimento da iNOS.
Ao utilizarmos quatro inibidores que atuam em diversos sítios das enzimas lipoxigenases
(particularmente a 5-LO), verificamos que todos eles induziram inibição significativa na apoptose
induzida por ATP (Figura 14). Nossos dados evidenciaram de forma inédita que a 5- lipoxigenase
pertence ao eixo de sinalização que culmina na apoptose de macrófagos. Com a utilização dos
68
inibidores de 5-LO, conseguimos reduzir significantemente a apoptose entre 50-90%. Entretanto,
a necrose celular não foi inibida mostrando que a via de necrose ativada por ATP não é a mesma
que a da apoptose, que existe “um ponto” de sinalização acima das lipoxigenases que pode levar à
morte por necrose.
Partindo do princípio de que a 5-LO estaria envolvida no fenômeno, procuramos checar a
participação de receptores para leucotrienos (Figura 14). Entretanto, observamos que os
inibidores destes receptores não tiveram efeito significativo, sugerindo o não envolvimento de
uma via autócrina.
Mesmo diante deste dado, podemos ainda supor o envolvimento de leucotrienos, pois existe a
possibilidade de que estes mediadores lipídicos atuem através de receptores nucleares para
leucotrieno B4 (Yokomiso et. al., 2001). Um desses possíveis receptores, os PPARs (“peroxime
proliferator-activated receptor”), que são membros de uma superfamília de receptores nucleares
de hormônios que produzem uma variedade de sinais envolvidos em eventos inflamatórios, pode
ligar-se com LTB4 produzido no meio intracelular, ativando alguns fatores pró- inflamatórios
(Yokomiso et. al., 2001; Daynes e Jones, 2002).
Diversos tipos de ácidos graxos podem ativar as três isoformas de PPAR (PPARα, PPAR
β/δ e PPARγ). Alguns eicosanóides derivados do metabolismo de ácido araquidônico, incluindo
leucotrienos e prostaglandinas e HETEs são potentes ativadores de PPARs (Daynes e Jones,
2002). Macrófagos, células dendríticas e células T e B possuem PPARα e PPARγ. Esta família de
moléculas está envolvida com sinais que culminam em regulação da composição da membrana
lipídica, proliferação celular, alguns fatores envolvidos na resposta imune e sensibilidade à
apoptose (Daynes e Jones, 2002). PPARs são conhecidos ligantes de promotores de diversas
enzimas metabolizadoras de lipídios. Estas informações são relevantes à via de sinalização que
estudamos, pois recentemente foi demonstrado que o inibidor MK886, usado como bloqueador de
69
FLAP, também bloqueia PPARs alfa (Yokoyama et al., 2003). Esta informação pode justificar o
fato do MK886 ser mais potente que as outras drogas que bloqueiam lipoxigenases. No momento
não podemos descartar a possibilidade do MK886 estar inibindo PPARα e lipoxigenases.
Recentemente, utilizamos um antagonista para PPAR gama (o GW9662) e observamos que este
inibe a apoptose induzida por ATP em macrófagos (dados não mostrados). Yokoyama e
colaboradores mostraram que inibidores de PPAR gama (BADGE e GW9662) inibem a atividade
pró-apoptótica e a atividade de caspase-3 em células U937 tratadas com mono( 2-etilhexil)ftalato
(MEHP) (Yokoyama el. al., 2003). Essas informações indicam a possibilidade de PPARs
poderem estar envolvidos na apoptose de macrófagos tratados com ATP e abrem novas
perspectivas para projetos futuros que visem entender como lipoxigenases, PLA2 e P2X7 se
comunicam para indução de apoptose.
Apesar dos dados sugerirem que a 5-LO participa das vias que levam à apoptose, macrófagos
obtidos de animais 5-LO-/- entram em apoptose quando tratados com ATP (figura 15). Podemos
então levantar a hipótese de que há outras vias de sinalização que uma vez desencadeadas, levam
os macrófagos à morte celular, compensando a falta da 5-LO. Podemos também sugerir que os
inibidores utilizados para 5-LO podem estar agindo em outras lipoxigenases ou até mesmo
inibindo moléculas que não fomos capazes de identificar. Os inibidores utilizados para a via de
lipoxigenases possuem efeito antioxidante e podem estar atuando em vias que não fomos capazes
de correlacionar ou interferindo na via de 12/15 lipoxigenases.
Para testar a importância da 5-LO poderemos, no futuro, medir a produção de leucotrienos e
usar os inibidores de lipoxigenases em macrófagos obtidos de animais 5-LO-/-, verificando se
leucotrienos são produzidos pela ativação de P2X7 e se tais drogas continuam inibindo a ação do
ATP extracelular em macrófagos 5-LO-/-. Outro procedimento interessante seria a reconstituição
com a adição de leucotrienos em células que foram previamente tratadas com inibidores da 5-LO.
70
Ensaios mostrando que a 5-LO está realmente ativada, também são de grande relevância. A 5-
LO ativa transloca do citosol para o núcleo. Podemos no futuro verificar essa translocação através
da realização de westerns-blot contra 5-LO de núcleos purificados, procurando identificar se há
um aumento desta proteína na membrana nuclear. A utilização de animais deficientes para 15-LO
e 12-LO e o uso da metodologia de RNA de interferência (iRNA) seriam também de grande
utilidade (Dwarakanath et al., 2004). Demos passos iniciais para o desenvolvimento dessas idéias
com os dados mostrados na figura 14 nos quais mostramos que no extrato bruto de macrófago há
tanto a 5-LO, quanto a 15-LO. Esta figura aparentemente mostra que as duas proteínas aumentam
quando tratamos os macrófagos com ATP. Podemos usar essa ferramenta para ver se a 15-LO
também participa do processo de apoptose.
No grupo das lipoxigenases, há três enzimas bastante estudadas, a 5-Lipoxigenase, a 12-
Lipoxigenase e a 15-Lipoxigenase (Gaddi et al., 2004). Todas são candidatas a cooperar na via de
indução de apoptose. As enzimas 15-LO e 12-LO produzem metabólitos denominados lipoxinas
que estão envolvidos em mecanismos antiinflamatórios (McMahon e Godson, 2003). Estudos
com lipoxina A4 (LXA4) mostram que, quando adicionadas em altas doses no meio extracelular,
induzem ativação de caspase 3 e apoptose em fibroblastos de interstício renal (Wu et al., 2005).
Sheng-Hua Wu e colaboradores (Wu et al., 2005) chegam a especular que LXA4 possui um papel
pró-apoptótico.
A adição de ácido araquidônico em doses crescentes induz macrófagos e células do tecido
muscular liso da vasculatura à apoptose (Takano et al., 2001; Pilane e LaBelle, 2004). O
metabolismo de ácido araquidônico, além de gerar leucotrienos e prostaglandinas, pode gerar
espécies reativas de oxigênio (Cadernas et al., 1983 Apud Curtin et al., 2002). Takano e
colaboradores mostram que lipossomas catiônicos induzem a apoptose em macrófagos, sugerindo
o envolvimento de espécies reativas de oxigênio (ROS) (Takano et al., 2001). ROS incluem
71
radicais livres como o ânion superóxido (O2-), radicais hidroxil (OH-), e peróxido de hidrogênio
(H2O2). São espécies transientes que possuem alta reatividade química e podem reagir com DNA,
proteínas, carboidratos e lipídios destruindo-os (Curtin et al., 2002).
Diversos receptores de células do sistema imune, cálcio intracelular, proteínas intracelulares,
vias metabólicas endógenas e exógenas são capazes de gerar ROS no interior das células (Curtin
et al., 2002). Dando suporte aos nossos dados, lipoxigenases poderiam estar envolvidas no
processamento dessas vias, uma vez que utilizando inibidores de lipoxigenases há inibição da
fragmentação do DNA e geração de ROS em macrófagos tratados com lipossomas catiônicos
(Takano et al., 2001).
As mitocôndrias são as maiores geradoras de radicais livres através das NADPH oxidases.
Outras fontes desses radicais incluem enzimas como citocromo P450 no retículo endoplasmático,
lipoxigenases, cicloxigenases e xantina oxidases. A geração ou adição de ROS pode causar morte
celular tanto por necrose como por apoptose, além de ativar caspases. Apesar da dificuldade de
medir a formação de ROS, o papel do estresse oxidativo na apoptose pode ser avaliado com a
utilização de antioxidantes como N-acetilcisteína (NAC) que inibe a apoptose via estresse
oxidativo (Curtin et al., 2002).
Bissagio, em sua tese de doutorado em 2000, mostrou que macrófagos tratados com
inibidores para caspase 3 e 9 apresentam redução significativa da apoptose. Ele também sugeriu a
possibilidade de um receptor P2Y ser ativado após a ativação do P2X7, amplificando a cascata de
sinalização, mas até o presente momento ainda não foi esclarecido qual seria este receptor ou se
mesmo há a necessidade deste na indução de apoptose por ATP em macrófagos. Diante de todo
esse conjunto de informações podemos pontuar que a sinalização via P2X7 desencadeia cascatas
de sinalização que podem se sobrepor ou amplificar o sinal que converge à apoptose.
72
Como já salientamos acima, ácidos graxos podem ser metabolizados por citocromo P450, que
é implicado em estresse oxidativo e sistemas de isquemia (Curtin et al., 2002; Gross et al., 2005).
A via relacionada ao citocromo P450 poderia estar relacionada à degradação de ácido
araquidônico por citocromo P450 em EETs (“epoxyeicosatrienoic acid”) e HETEs
(“hydroxyeicosatetraenoic acid”). Apesar de não temos explorado a via do citocromo P450, não
descartamos a hipótese de que ele possa fazer parte dessa cadeia de comunicação gerada através
do contato do ATP com o P2X7.
Nesse trabalho, descrevemos diversos fatores indutores de morte, bem como os mecanismos
de sinalização intracelular que conduz à apoptose ou à necrose. Em nosso estudo, procuramos não
só confirmar a importância do ATP extracelular como um fator que leva a célula à morte, como
também investigar algumas vias de sinalização que conduz a célula ao seu fim. Desta forma
procuramos destacar de forma inédita um possível envolvimento de enzimas lipoxigenases como
integrantes da via de sinalização ativada por ATP extracelular desencadeada via receptor P2X7.
Nossos dados levantaram novas hipóteses propondo a idéia de que a sinalização para apoptose,
uma vez deflagrada, gera cascatas sinalizadoras comuns em vários sistemas biológicos que
atuando em paralelo ou em conjunto e direcionam cada célula ao seu fim, procurando a
manutenção da homeostasia.
73
6 CONCLUSÕES
• O tratamento com ATP extracelular induz mudanças morfológicas em macrófagos peritoneais
de camundongos como bolhas na membrana, retração de pseudópodos e arredondamento
celular.
• A indução de morte celular (apoptose) por ATP extracelular depende da presença do receptor
P2X7 em macrófagos peritoneais de camundongos.
• Os inibidores de cicloxigenases e óxido nítrico sintase não reduzem a apoptose induzida por
ATP extracelular e a liberação de LDH
• Os macrófagos peritoneais de camundongos possuem as enzimas 5- lipoxigenases e 15
lipoxigenases.
• Os inibidores de lipoxigenases reduzem a apoptose induzida por ATP extracelular, Esses
dados sugerem a participação de lipoxigenases em na via de sinalização de indução de
apoptose.
• Os inibidores de lipoxigenases não reduzem a liberação de LDH. Esses dados sugerem que
lipoxigenases não participam da via de sinalização de indução de necrose.
74
• Os inibidores de receptores de leucotrienos não reduzem a apoptose induzida por ATP
extracelular e a liberação de LDH, sugerindo que os receptores de membrana para
leucotrienos não participam da via de sinalização da apoptose e necrose induzida por ATP.
• O ATP extracelular induz apoptose em macrófagos de peritônio de animais deficientes de 5-
Lipoxigenase (5-LO-/-) e a liberação de LDH, sugerindo a participação de outras vias na
indução de apoptose.
75
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O objetivo desse trabalho foi contribuir para desvendar a cascata de sinalização que envolve a
morte de células que são expostas a ATP extracelular que ativa o receptor P2X7. Em nossas
conclusões, percebemos que o sinal disparado pelo receptor P2X7, além de estar envolvido com
diversos fenômenos fisiológicos (como expressão de moléculas de superfície para adesão,
secreção de citocinas e quimiocinas, diferenciação celular), conduz ao fim da vida da própria
célula. Tal fato remete a questão da dualidade do receptor P2X7 estar envolvido na morte ou vida
da célula.
Apesar desta função contraditória que circunda o P2X7, tal fato pode ser abordado de maneira
consistente se pensarmos que a vida e a morte são apenas fases do ciclo celular. Esta questão tem
sido bastante salientada nos últimos anos por diversos autores. Elena Adinolfi e colaboradores
(Adinolfi et al., 2005) postulam que baixos estímulos de ATP levam a célula a ativar fosfolipase
D, liberação de ATP, fusão celular, proliferação. Já quando há estimulação massiva por ATP, a
célula ativa fatores de transcrição, liberação de citocinas, “shedding” de moléculas de superfície,
morte de parasitas celulares e morte da própria célula. Baseado em nossos dados e no que
encontramos na literatura, enxergamos pontos similares.
Em nosso estudo, fomos capazes de evidenciar a participação de lipoxigenases na sinalização
que culmina na morte da célula. Sabemos que os leucotrienos são potentes ativadores celulares
envolvidos em diversas situações inflamatórias, ativação de fagócitos, na atividade microbicida e
secreção de oxidantes. Mas também podemos entender que a ativação dessa via pelo receptor
P2X7 em células ativadas, como macrófagos, pode significar o desencadeamento de uma cascata
que, após algum tempo, leva também ao fim da célula. Este processo pode nos ajudar a entender
como se comporta o sistema fisiológico da inflamação, em que temos conjuntos celulares que
travam batalhas para controlar uma infecção e devolver a homeostasia ao sistema. Podemos
76
pensar em um nicho inflamatório com concentrações bem altas de ATP extracelular, que ativaria
os receptores P2X7 dos macrófagos. Os macrófagos então produziriam as diversas citocinas,
quimiocinas, além de travar as batalhas que são comuns, como a fagocitose de células apoptóticas
e de parasitas. Entretanto, como em todo sistema homeostático, ele seria “inativado” e conduzido
à morte, uma vez terminado todo processo.
Como conclusões de nosso trabalho, percebemos que as lipoxinas estão envolvidas no
processo de apoptose, excluindo as cicloxigenases. Fomos capazes de mostrar o efeito de
inibidores de 5-LO, mas não de COX, sugerindo que a 5-LO está envolvida nesse processo, mas
ela não é essencial para que a cascata de sinalização continue e abrimos novas perspectivas para
investigações futuras, sugerindo a investigação dos papeis do citocromo P450, PPARs, ROS,
lipoxinas, assim como a própria atividade do leucotrieno B4. Essas possibilidades estão
esquematizadas a seguir (figura 17).
77
Figura 17: Modelo proposto da participação de outras moléculas na cascata de apoptose induzida por ATP extracelular. Em preto, vias estudadas pelo laboratório, em que admitimos que a ativação do receptor P2X7 leva à ativação da iPLA2 e liberação de algum ácido graxo. Em azul, destacamos a continuidade da via que estudamos nessa tese e propomos que não há participação de cicloxigenases e receptores para leucotrienos, mas há envolvimento de lipoxigenases na indução de morte. Por fim, em marrom, são as vias que ainda não estudamos, mas lançamos como hipóteses futuras relacionando-as como participantes da cascata de apoptose via P2X7.
78
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91
9 Apêndice
Artigo I
Com o objetivo de avaliar a expressão de quais receptores P2 os macrófagos possuem em sua
membrana, procuramos avaliar por algumas técnicas como PCR, sinais de cálcio e western-blot,
dados publicados em 2005 (Coutinho-Silva et. al., 2005). Podemos destacar que os macrófagos
possuem uma diversidade de receptores P2X e P2Y. Neste trabalho (ARTIGO I), pudemos
rastrear alguns deles, sendo testado anticorpos contra todos P2X e contra alguns P2Y (P2Y1,
P2Y2, P2Y4 e P2Y6) (Figura 10). Como destacado no artigo e na figura a seguir, percebemos que
macrófagos possuem os receptores P2X1, P2X2, P2X4 e P2X7. Como forma de confirmar a
presença da proteína, usamos peptídeos que ligariam aos anticorpos P2X2, P2X4 e P2X7.
Percebemos que os três peptídeos deslocaram a ligação do anticorpo mostrando que as bandas de
proteína encontradas nos “westerns-blot” são especificas para tais receptores.
Quando utilizamos anticorpos contra os receptores P2Y, não destacamos com clareza os
receptores em questão, uma vez que com os dados que compuseram o artigo não pudemos
afirmar se tais receptores estariam presentes nos macrófagos estudados no trabalho.
Aparentemente, suspeitamos que tanto o receptor P2Y1, P2Y2 e P2Y6 seriam parte do repertório
de receptores P2 dos macrófagos de acordo com os dados que compõe o artigo.
92
Macrófagos da linhagem J774. 50µg de proteínas de macrófagos (J774) foram utilizados por poço em gel SDS-PAGE seguido de transferência e cortados em tiras. Cada tira foi incubada com anticorpos P2X e P2Y (Roche – não comerciais). Como podemos perceber pelo western-blot (WB) tivemos reatividade específica para os receptores P2X1, P2X2, P2X4 e P2X7. Os peptídeos para P2X2, P2X4 e P2X7 deslocaram a interação proteína-anticorpo mostrando especificidade para estes. Quanto aos P2Y testados não pudemos fazer considerações avançadas, pois para o WB os dados não foram satisfatórios.
Multiple P2X and P2Y receptor subtypes in mouse J774,
spleen and peritoneal macrophages
Robson Coutinho-Silvaa,e, David M. Ojciusc, Darek C. Goreckid,Pedro M. Persechinie, Rodrigo C. Bisaggioe, Anderson N. Mendese,
Joanne Marksb, Geoffrey Burnstocka,*, Philip M. Dunna
aAutonomic Neuroscience Institute, Royal Free and University College Medical School, Rowland Hill Street, London NW3 2PF, UKbDepartment of Physiology, Royal Free and University College Medical School, Rowland Hill Street, London NW3 2PF, UK
cDivision of Natural Sciences, University of California, Merced, CA 95344, USAdInstitute of Biomedical and Biomolecular Sciences, School of Pharmacy and Biomedical Sciences,
University of Portsmouth, Portsmouth, UKeInstituto de Biofisica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Rio de Janeiro, Brazil
Received 23 June 2004; accepted 18 November 2004
Abstract
We investigated P2 receptor expression and function in macrophages from mouse, and in the J774 cell line, and revealed a larger
spectrum of P2 receptor subtypes than previously recognised. The nucleotides adenosine triphosphate (ATP), adenosine diphosphate,
uridine triphosphate and uridine diphosphate evoked an increase in intracellular calcium and the activation of a potassium current. The
sensitivity of these responses to the antagonists suramin, PPADS, MRS 2179 and Cibacron blue suggest the presence of at least three
functional P2Y receptor subtypes, most probably P2Y2, P2Y4 and P2Y6. ATP also activated P2X receptors, giving rise to a rapidly
activating cation conductance. This response was insensitive to the antagonists suramin and Cibacron blue, was potentiated by Zn2+ and
inhibited by acidification suggesting involvement of P2X4 receptors. In low divalent cation solution, responses to ATP became larger, and
dibenzoyl-ATP became more potent than ATP, indicating the presence of P2X7 receptors. Immunofluorescence, flow cytometry, Western
blots and RT-PCR show that P2X4 and P2X7 receptors are the most prominent in both macrophage types, while the expression of the other
P2X subunits is variable and sometimes weak or undetectable. These techniques also demonstrated the presence of mRNA for P2Y1,
P2Y2, P2Y4 and P2Y6 receptors along with protein expression for the three subtypes we investigated, namely, P2Y1, P2Y2 and P2Y4.
# 2004 Published by Elsevier Inc.
Keywords: Adenosine triphosphate; Purinergic receptors; Inflammation; Macrophages; Immunohistochemistry; Patch-clamp; Fura-2
1. Introduction
Adenosine 50 triphosphate (ATP) is now recognised as
an important extracellular signalling molecule and evokes
a variety of physiological responses in many different
tissues and cell types [1]. Most of the biological effects
of extracellular ATP are mediated by P2 receptors, of
which, there are two major classes: the nucleotide-gated
ion-channel P2X receptors and G-protein-coupled P2Y
receptors [2]. To date, seven mammalian P2X receptor
subunits (P2X1–P2X7) have been identified, which assem-
ble to form either homomeric or heteromeric receptors.
Eight mammalian P2Y receptor subtypes (P2Y1, P2Y2,
P2Y4, P2Y6, P2Y11, P2Y12 P2Y13, and P2Y14) and a
structurally related but pharmacologically different homo-
logue (at present called P2Y15) have so far been cloned
[3–7]. These receptors have different but overlapping
pharmacological properties, and because many cell types
express multiple P2 receptor subtypes, definitive identifi-
cation of native receptors is often difficult.
Macrophages provide an important defence against
pathogenic infection. Extracellular nucleotides have mul-
www.elsevier.com/locate/biochempharm
Biochemical Pharmacology 69 (2005) 641–655
Abbreviations: BSS, balanced salt solution; NHS, normal horse serum;
NGS, normal goat serum; MFI, mean fluorescence intensity
* Corresponding author. Tel.: +44 2078302948; fax: +44 2078302949.
E-mail address: [email protected] (G. Burnstock).
0006-2952/$ – see front matter # 2004 Published by Elsevier Inc.
doi:10.1016/j.bcp.2004.11.012
tiple effects on these cells, including increasing pino-
cytic vesicle formation [8], superoxide generation [9],
IL-1b release [10,11] and increased killing of infecting
Chlamydia [12]. Early studies of the effects of nucleotides
on mouse J774 macrophages showed that high concentra-
tions of ATP caused a cation flux and permeablization due
to the activation of the P2Z/P2X7 receptor [13], while
lower concentrations of ATP and UTP elevated intracel-
lular calcium through the activation of a P2Y receptor,
thought to be P2Y2 [14]. However, a later study [15] could
only detect mRNA for the P2Y6 receptor in J774 macro-
phage cells. Studies on the effects of nucleotides on
immune and inflammatory cells have concentrated on
these two receptors [16]. However, there is increasing
evidence that P2X7 receptors are expressed in cell types
outside the immune system [17–21], and that other P2
receptors may be expressed with P2X7 and P2Y2 on cells
of the immune system, including B lymphocytes [22],
thymocytes [23], macrophages and human dendritic cells
[24,25].
Although the mRNA for various P2X and P2Y receptors
has been identified in human blood-derived macrophages
[24], the identity of the receptors responsible for functional
responses has not been determined. More recently, a study
of a rat alveolar macrophage cell line has indicated the
involvement of P2X4, P2Y1 and P2Y2 receptors [26].
However, the presence of different P2X and P2Y receptor
subtypes in murine macrophages has not previously been
explored. In this study, we investigated the expression of
P2X and P2Y receptor subtype mRNA and protein in
mouse spleen, and peritoneal macrophages and J774 cells
using immunofluorescence, flow cytometry, and RT-PCR.
We have followed this by looking for functional expression
of these receptors using electrophysiology and measure-
ment of intracellular Ca2+. The significance of P2 receptor
expression and correlations with macrophage physiology
are discussed.
2. Materials and methods
2.1. Culture of J774 cells
Cultures of the J774 murine macrophage cells were grown
in 25 ml tissue culture flasks at 37 8C in a 5% CO2
humidified atmosphere. The culture medium comprised
RPMI-1640 medium (Gibco BRL, Paisley Scotland) sup-
plemented with 5% heat-inactivated FCS, 2 g l�1 sodium
bicarbonate, 100 U ml�1 penicillin, and 100 mg ml�1 strep-
tomycin. Cells were passaged (1:6) when they reached
80–90% confluency.
2.2. Membrane preparation
J774 cells were grown to confluence and harvested
using a rubber cell scraper. Cells were suspended in
PBS and centrifuged at 3000 rpm for 2 min. This
process was repeated a further two times to remove
any trace of growth medium. The resulting cell pellet
was suspended in buffer, containing 10 mM Hepes, 1 mM
EDTA, 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)
and 6.25 � 103 IU/l Aprotinin (pH 7.4) and homogenised
using an Ultra Turrax homogenizer (Janke & Kunkel,
FRG) at half speed for 60 s. Homogenates were centri-
fuged for 10 min at 3000 rpm and the supernatant re-
centrifuged at 13,000 rpm for 30 min. The pellet was
resuspended in the same buffer and high-speed centrifu-
gation repeated. The resulting pellet was resuspended to
give a final protein concentration of 2–3 mg ml�1, deter-
mined using the Bradford method [27]. All steps were
performed at 4 8C.
2.3. Preparation of macrophages from spleen and
peritoneum
Breeding, maintenance and killing of the mice used in
this study followed the principles of good laboratory
animal care and experimentation and complied with British
Home Office and local ethical committee regulations. Mice
were kept at a constant 12 h/12 h light–dark cycle with free
access to food and water. This study was carried out with
adult male Balb/c mice at 20 weeks. Mice were killed by
exposure to an increasing dose of carbon dioxide. Death
was confirmed by cervical dislocation.
Mouse peritoneal macrophages were obtained by lavage
of the intraperitoneal cavity with cold balanced salt solu-
tion (BSS). For splenic macrophages, spleens were col-
lected from mice, cells gently removed by mechanical
dissociation and re-suspended in BSS. The erythrocytes
were removed and mononuclear cells enriched by centri-
fugation on a Ficoll density gradient Histopaque 1083
(Sigma St. Louis, MO, USA). Cell viability following this
procedure was over 95% in all cases, as measured by
Trypan blue exclusion. The enriched mononuclear cells
were adjusted to 5 � 106 cells ml�1 in culture medium (see
above) and plated in 35 mm petri dishes. After 1 h of
incubation at 37 8C in a 5% CO2 humidified atmosphere,
non-adherent cells were removed by vigorous washing and
the adherent cells (approximately 10% of the original
plated suspension) were maintained in culture for 24–
48 h until use.
For flow cytometry experiments, fresh enriched mono-
nuclear populations were used directly prior to the adhe-
sion step.
2.4. Immunofluorescence
Spleen macrophages were prepared as described above
and plated in 8-well LAB-TEC slides (Nalge Nunc Inter,
Naperville, UK) or 12 well plates (Corning USA) for 24–
48 h before immunostaining. Cells were fixed for 10 min at
room temperature in 4% paraformaldehyde (BDH Labora-
R. Coutinho-Silva et al. / Biochemical Pharmacology 69 (2005) 641–655642
tory Supply, UK) prepared in PBS. Blocking of non-
specific binding sites was achieved by preincubation with
normal horse serum (NHS; Harlan Sera-Lab, UK) in PBS,
containing 0.05% Merthiolate (Sigma) at room tempera-
ture for 20 min, as described in detail by Llewellyn-Smith
[28].
An indirect immunofluorescence method with three
layer amplification was used. Antibodies against P2X1–
7, P2Y1, P2Y2, and P2Y4 receptors raised in rabbit were
allowed to react with biotinylated donkey anti-rabbit IgG
secondary antibody (Jackson Immunoresearch, PA, USA)
and detected with either Oregon green- or Texas Red-
coupled avidin (Sigma). The P2X antibodies were
obtained from Roche Bioscience (Palo Alto, CA,
USA). P2X subtype-selective antibodies were each raised
in rabbits against a specific 15 amino acid residue at the
carboxy-terminus of each P2X receptor molecule [29].
The P2Y1, P2Y2, and P2Y4 antibodies were obtained from
Alomone (Alomone Labs. Ltd. Jerusalem, Israel). Briefly,
the sections were incubated overnight with primary anti-
bodies diluted to 5 and 2.5 mg ml�1 (determined as opti-
mal by previous titration) with 10% Normal Horse Serum
(NHS) in PBS, containing 0.05% Merthiolate and 0.1%
saponin. Subsequently, the sections were incubated with
biotinylated donkey anti-rabbit IgG (Jackson Immunore-
search, PA, USA) diluted 1:500 in 1% NHS in PBS,
containing 0.05% Merthiolate and 0.1% saponin for
30 min, followed by a 1 h incubation with ExtrAvidin–
Oregon green or Texas Red (Sigma), both at a concentra-
tion of 1:100. In some experiments, a directly labelled,
donkey anti-rabbit IgG Cy3 (Jackson Immunoresearch,
PA, USA) secondary antibody was applied at a concen-
tration of 1:100 for 1 h. All incubations were carried out at
room temperature and separated by three 5 min washes in
PBS. Control experiments were performed using an
excess of the appropriate homologue peptide antigen to
absorb the primary antibodies, and thus, confirm specific
immunoreaction. The slides were visualised using a Zeiss
Axioplan microscope (Zeiss, Germany), and an Edge
True-View 3D fluorescence microscope (Edge Scientific
Instruments, Santa Monica, CA, USA). Images were
prepared with Zeiss Axioplan microscopes coupled with
a Leica DC 200 image acquisition system (Leica, Cam-
bridge, UK). The figures were prepared using the Adobe
Photoshop 5.0 program.
2.5. Flow cytometry assays
Spleen cells were adjusted to 106 cells/sample, washed
twice with BSS and incubated with BSS, containing 5%
normal goat serum (NGS), on ice, for 20 min. Mouse cells
were then incubated with FITC-conjugated rat anti-mouse
CD3 (1:100; Serotec, UK), FITC-conjugated rat anti-
mouse B220 (1:100; Serotec, UK) or FITC-conjugated
rat anti-mouse F4/80 (10 ml antibody/106 cells; Serotec,
UK) to stain T lymphocytes, B lymphocytes and macro-
phages, respectively, for 30 min. Samples were then
washed and fixed in fresh 4% paraformaldayde (Sigma)
for 10 min on ice and then extensively washed in cold BSS.
The rabbit anti-rat P2X1–7 antibodies (Roche Bioscience,
Palo Alto, CA, USA) and P2Y1, P2Y2, and P2Y4 antibodies
(Alomone Labs. Ltd. Jerusalem, Israel) were diluted in
BSS, 0.1% saponin medium and applied to the samples at a
concentration of 0.1 mg/1 � 106 cells overnight at 4 8C.
The samples were then washed 3 times in BSS and
incubated with PE-goat anti-rabbit monoclonal antibody
(Caltag Lab. Burlingame, CA, USA) at a concentration of
1 mg/106 cells for 30 min. The cells were then washed
three times in BSS, re-suspended in PBS and analyzed on a
Becton Dickinson FACSCalibur flow cytometer (San Jose,
CA, USA). Negative control experiments were performed
by preabsorbing the P2X and P2Y receptor antibodies with
their appropriate homologue peptide antigens and/or by
omission of the primary P2X or P2Yantibodies. Cells were
initially gated by forward and side scatter and then by cell
type-specific antibodies for macrophages (CD11b+)/(F4/
80) or lymphocytes (CD3+) (B220+).
2.6. Western blot analysis
J774 cell membrane preparations (15 mg protein) were
subjected to a variety of denaturing or reducing conditions.
Samples were solubilized in Laemmli sample buffer, con-
taining 2% (w/v) sodium dodecyl sulphate (SDS) and
heated for 5 min at 95 8C or in sample buffer with the
addition of 3% (w/v) DTT or 5% (v/v) mercaptoethanol,
both with and without heating for 5 min at 95 8C. Samples
were then electrophoresed on a 10% SDS polyacrylamide
gel using 25 mM Tris, 192 mM glycine and 0.1% (w/v)
SDS running buffer (pH 8.3) (Biorad, Hertfordshire, UK)
at 20 mAmps per gel. The proteins were transferred to
nitrocellulose membranes by electrophoretic blotting for
1 h at a constant current of 1 mA/cm2 (trans-blot semi-dry
transfer cell, Biorad, Hertfordshire, UK) using transfer
buffer, containing 10% (v/v) methanol, 25 mM Tris,
192 mM glycine and 0.1% (w/v) SDS (pH 8.2–8.4).
Non-specific protein-binding sites were blocked with
PBS-T (phosphate buffered saline (pH7.4), containing
0.1% Tween 20) and 6% (w/v) fat-free milk powder for
1 h at room temperature. The membranes were incubated
with a variety of P2X (Roche Biosciences, Palo Atto, CA)
or P2Y (Alomone Lab. Ltd, Jerusalem, Israel) antibodies
using a 1:1000 dilution in PBS-T for 16 h at 4 8C. The
membranes were then washed (2 min � 15 min) with PBS
and incubated with a swine anti-rabbit IgG antibody con-
jugated to horseradish peroxidase (1:2000 dilution) (Amer-
sham Pharmacia Biotech UK Limited, Bucks, UK) for 1 h
at room temperature and finally washed again with PBS-T
(2 min � 15 min). Bound antibodies were detected using a
Visualiser Western Blot Detection Kit (Upstate Cell Sig-
nalling Solutions, NY) and a Fluor-S MultiImager System
(Biorad, Hertfordshire, UK).
R. Coutinho-Silva et al. / Biochemical Pharmacology 69 (2005) 641–655 643
2.7. RT-PCR analysis
Total cellular RNA was extracted from cells using Total
RNA Isolation System (Promega, Southampton UK)
according to the manufacturer’s instructions. Three micro-
grams of RNA sample were digested with 3 U of ampli-
fication grade deoxyribonuclease I (Life Technologies,
Paisley, UK) for 20 min at room temperature to eliminate
contaminating DNA. Half of each resulting RNA sample
was reverse transcribed at 42 8C using 200 ng of random
primers, 400 U of Superscript II reverse transcriptase (Life
Technologies, Paisley, UK) with 40 U of ribonuclease
inhibitor (Rnasin; Promega, Southampton UK) in a final
volume of 50 ml reaction buffer. The remaining RNA was
used to prepare a control sample where reverse transcrip-
tase was omitted. One 2 ml aliquot of each sample was used
for RT-PCR analysis in a 50 ml reaction volume, containing
200–500 nM primers, 1.5 mM MgCl2, 200 mM of each
dNTP and 2.5 U of Taq polymerase (Qiagen, Crawley,
UK).
Cycling conditions were: 94 8C for 4 min, followed by
35 cycles of 94 8C for 60 s, 58 to 63 8C for 60 s (depending
on the primer set), 72 8C for 60–90 s with a final extension
step of 72 8C for 7 min.
Primer sets were designed based on the available rat and
mouse sequences and published data [30–32]. The
sequences were as follows:
PCR products were resolved by electrophoresis in 2%
agarose gels and visualised by ethidium bromide stain-
ing. The specificity of PCR products was confirmed
by digestion with specific restriction enzymes and/or
sequencing.
2.8. Intracellular calcium measurements
Cells plated on glass cover slips were loaded with 6 mM
Fura-2-AM (Molecular Probes) for 1 h at room tempera-
ture in culture medium. The coverslips were then washed
and mounted in a three-compartment superfusion chamber
whose base was formed by a coverslip, containing the cells.
The central chamber, containing the cells had a volume of
200 ml, and was perfused with PBS supplemented with
1 mM CaCl2 at a rate of 1 ml min�1. Intracellular calcium
concentrations of groups of 20–40 cells were monitored
R. Coutinho-Silva et al. / Biochemical Pharmacology 69 (2005) 641–655644
Receptors Primer sequence Primer position
(relative to rat
sequence)
P2X1 Fwd 50-TGGGTGGGTGTTTGTCTATG-30 344–363
Rev 50-TGAAGTTGAAGCCTGGAGAC-30 1064–1083
P2X2 Fwd 50-TCCATCATCACCAAAGTCAA-30 265–284
Rev 50-TTGGGGTAGTGGATGCTGTT-30 637–656
P2X3 Fwd 50-CTCCTGCCTAACCTCACCGACAAGGACATAAAGAAGTGCCGCTTC-30 571–616
Rev 50-CTAGTGACCAATAGAATAGGCCCCTGAGTCTGTAGACTGCTTCTC-30 1150–1195
P2X4 Fwd 50-ATCCTCCCCAACATCACCACGTCCTACCTCAAATCGTGCATTTACAAT-30 612–657
Rev 50-TCACTCGTTCATCTCCCCCGAAAGACCCTGCTCGTAGTCTTCCAC-30 1122–1167
P2X5 Fwd 50-GTCACTTCAGCTCCACCAATCTCT-30 843–866
Rev 50-CCTCTCCAGTGTCTTGTCCTCTGC-30 1372–1396
P2X6 Fwd 50-GCCTTAGATACCTGGGACAACACCTATTTCAAGTACTGTCTCTAC-30 621–666
Rev 50-TGCACTGTTGGTAGTTGCCTTTGGGGCTCTTGCCTCTTCATACTT-30 1092–1137
P2X7 Fwd 50-ATGCCGGCTTGCTGCAGCTGGAACGATGTCTTTCAGTATGAGACA-30 1–45
Rev 50-CCAAGTCTTGTGAAAGGTACAAGAGATGTTCATACCTGGTAAGAT-30 621–666
P2Y1 Fwd 50-ACGTCAGATGAGTACCTGCG-30 1235–1254
Rev 50-CCCTGTCGTTGAAATCACAC-30 1504–1523
P2Y2 Fwd 50-CTGGTCCGCTTTGCCCGAGATG-30 1417–1438
Rev 50-TATCCTGAGTCCCTGCCAAATGAGA-30 1703–1727
P2Y4 Fwd 50-TGTTCCACCTGGCATTGTCAG-30 1566–1586
Rev 50-AAAGATTGGGCACGAGGCAG-30 1840–1859
P2Y6 Fwd 50-TGCTTGGGTGGTATGTGGAGTC-30 868–889
Rev 50-TGGAAAGGCAGGAAGCTGATAAC-30 1206–1184
continuously at room temperature with the use of a fluor-
escence photometer (Photon Technology, Princeton, NJ).
Fura-2 was excited alternately at 340 and 380 nm, and the
emission at 510 nm was measured. The ratio measurement,
which is proportional to the intracellular calcium concen-
tration, was determined every 100 ms. The drug applica-
tion was via a bolus of nucleotides by introducing 50 mM
of the perfusion saline, containing five times the desired
final concentration of the drug into the pre-chamber [33].
The rapid delivery of drugs as a bolus minimizes the effects
of desensitization mechanisms [34]. The intervals between
drug applications were a minimum of 10 min for increas-
ing concentrations of the same drug and between fifteen to
30 min between different drugs.
2.9. Electrophysiology
Cells were plated at low density in 35 mm plastic culture
dishes (Falcon) and maintained in culture for 2–7 days.
Cultures were visualised using phase contrast at 600�magnification using an inverted microscope (Diaphot,
Nikon). Culture dishes were perfused with ‘extracellular
solution’ at room temperature, at a rate of 0.5 ml min�1,
while solution was applied locally to the cell of interest
using a microperfusion device [35]. Recordings were
carried out using the conventional whole cell patch-clamp
technique [36], or the perforated patch technique [37].
Patch electrodes were fabricated from thin wall borosili-
cate glass capillaries (Clark Electromedical, GC 150TF)
and had a resistance of 2–4 MV when filled with ‘intra-
cellular solution’. Membrane currents were recorded using
an Axopatch 200B amplifier (Axon Instruments), dis-
played on a chart recorder (Gould TA240) and stored on
digital audiotape using a DTR-1204 (Biologic, Claix,
France) recorder for subsequent line analysis. Ramp cur-
rent voltage relationships were recorded on a personal
computer, using pClamp software and a Digidata 1200
interface (Axon Instruments).
Traces were acquired using Fetchex (pClamp software,
Axon Instruments) and plotted using Origin (version 4.0).
2.10. Drugs and solutions
Except where modified as indicated, the extracellular
solution contained (mM): NaCl, 154; KCl, 4.7; HEPES,
10; D-glucose, 5.6; CaCl2 and MgCl2, 1.2, adjusted to pH
7.4 with NaOH. In experiments investigating P2X-
mediated responses, the intracellular (pipette) solution
contained (mM): citric acid, 56; MgCl2, 3; CsCl, 20;
HEPES, 40; EGTA, 0.1; TEA Cl, 10, adjusted to pH 7.2
with CsOH (total Cs+ concentration, 170 mM). To inves-
tigate P2Y-mediated responses, the intracellular solution
contained (mM): tri-potassium citrate, 56; KCl, 25; NaCl,
10; HEPES, 35; K EGTA, 0.1. For perforated patch
recordings, amphotericin B (240 mg ml�1) was added to
the pipette solution.
2.11. Statistical analyses
All data are presented as mean � S.E.M. Statistical
comparisons were made using two-tailed Student’s t-tests
for paired and unpaired samples and ANOVA (Tukey’s
Multiple Comparison Test) as appropriate. Statistical sig-
nificance was taken as P < 0.05.
3. Results
3.1. Nucleotides trigger Ca2+ changes in macrophages
3.1.1. Mouse peritoneal macrophages
We used micro-fluorimetry to investigate nucleotide
receptors on native macrophages. ATP, ADP, UTP and
UDP induced a rapid and concentration-dependent intra-
cellular Ca2+ response in mouse macrophages, with a sharp
increase of basal calcium (Fig. 1a–d). The cells were more
sensitive to UDP treatment, with a response to doses as low
as 100 nM (Fig. 1d). ATP at concentrations 1–100 mM
induced calcium changes with a single peak (Fig. 1a),
while at high concentrations (10–100 mM), UTP and UDP
evoked a biphasic response with a fast peak followed by a
slower second phase (Fig. 1c and d). The least effective
nucleotide tested was ADP, with cells responding only at
100 mM (Fig. 1b). AMP and UMP did not induce any
responses.
3.1.2. J774 macrophage cell line
We also examined the Ca2+ changes induced by nucleo-
tides in the J774 macrophage cell line. We observed that
ATP, ADP, 2Me-S-ATP, UTP, and UDP all elicit Ca2+
response at a concentration of 100 mM. In one of three
experiments the J774 macrophages responded at two con-
centrations of a P2X1 and P2X3 agonist a, b-meATP but
stopped responding when a higher concentration was tested
(Fig. 2a). Concentration-response curves were constructed
for different P2 agonists on the J774 macrophage cell line.
However, in some experiments, the concentration depen-
dence was very steep giving rise to ‘‘all or none’’ type
responses, similar to those observed in rat alveolar macro-
phages [26]. Thus, combining data from different experi-
ments gave rise to either steep concentration-response
curves, or large error bars. The J774 macrophages responded
consistently to a P2Y2 agonist UTP (EC50 = 0.9 mM)
(Fig. 2b), P2Y6 agonist UDP (EC50 = 25 mM) (Fig. 2c),
and P2Y1 agonists ADP (EC50 = 11.5 mM) and 2Me-S-ADP
(EC50 = 3.9 mM) (Fig. 2d and e), respectively.
3.2. Patch-clamp studies in J774 cells
We used whole cell patch-clamp recording to further
characterize the P2 receptors present on J774 cells. This
has the advantage of readily discriminating between
responses mediated by P2X or P2Y receptors. It also
R. Coutinho-Silva et al. / Biochemical Pharmacology 69 (2005) 641–655 645
permits the use of antagonists, such as PPADS and Ciba-
cron blue, which because of their colour, interfere with
fluorimetric measurements.
3.2.1. P2Y receptors
Most cells (24/28) voltage clamped at�45 mV, with a K+
based internal solution, responded to ATP with a slowly
developing outward current (Fig. 3a). When recorded with
the conventional whole cell recording technique, the
response exhibited pronounced run-down, such that only
one or two responses could be obtained from each cell. In
contrast, when the perforated patch technique was
employed, reproducible responses could be obtained.
The reversal potential obtained for this current was
Erev = �78 � 0.35 mV (n = 4) and is compatible with the
activation of a Ca2+-dependent K+ conductance that has
already been described by our group in peritoneal mono-
nuclear and polykaryon macrophages [38]. These outward
currents were little changed by the selective SK1–3 channel
blocker UCL 1648 (100 nM), but were abolished by the
SK4/IK1 channel blocker clotrimazole (1 mM; Fig. 3b and
c). UTP and UDP induced the activation of the same
outward current in concentrations of 1–10 mM (Fig. 3a),
but higher concentrations of ADP (30–100 mM) were
required to evoke consistent responses. We investigated
the concentration-dependence of the activation of this out-
ward current by ATP, ADP, UTP and UDP. For some cells,
the concentration dependence was very steep giving rise to
‘‘all or none’’ type responses. This resulted in large error
bars, and steep curves for the pooled data (Fig. 4). Never-
theless, we have obtained EC50 values of 1.3, 0.9, 10.3 and
33.2 mM for UTP, UDP, ATP and ADP, respectively. We
further characterized the receptors mediating this response
by examining the effect of four different antagonists, which
have varying degrees of selectivity between different P2Y
receptor subtypes. Cibacron blue (10 mM) produced a
reversible inhibition of the response to UDP, UTP and
ADP (Fig. 5a), while suramin (100 mM) blocked the
response to ADP but did not affect the response to UTP
(Fig. 5b). PPADS (30 mM) produced a slowly reversible
block of the response to ADP, and although the response to
UTP was also reduced, the effect was less pronounced than
the effect against ADP (Fig. 5c). The P2Y1 selective
antagonist MRS 2179 at a concentration of 3 mM failed
to alter the response to either ADP or UTP (Fig. 5d).
3.2.2. P2X receptors
In cells voltage, clamped at �60 mV, with a Cs+ based
internal solution (to block K+ currents), ATP (100 mM)
evoked a small (�100 pA), rapidly activating inward cur-
R. Coutinho-Silva et al. / Biochemical Pharmacology 69 (2005) 641–655646
Fig. 1. Effect of extracellular nucleotides on intracellular calcium concentration in mouse peritoneal macrophages. Murine macrophages were loaded with
Fura-2, and nucleotides at a final concentration of 10 nM, 100 nM, 1 mM, 10 mM or 100 mM were added rapidly (arrows). (a) ATP response. (b) ADP response.
(c) UTP response. (d) UDP response. The reagent concentration in the chamber decreased to zero within 1 min due to continuous perfusion of the extracellular
medium. Fluorescence is proportional to the intracellular calcium concentration and was measured as described in Section 2. Representative data of a single
experiment are shown. The experiments were repeated at least three times with similar results.
rent, which declined during the course of a 2 s application
(Fig. 6a). In contrast, the P2X1- and P2X3- selective
agonist a, b-meATP (30 mM) failed to evoke any inward
current, even when cells had been pre-incubated with
apyrase (4 U ml�1) for more than 2 h, to prevent receptor
desensitisation by any endogenously released ATP (data
not shown).
Di-benzoyl-ATP is more potent than ATP on the P2X7
receptor (24). In ‘‘normal’’ divalent cation-containing solu-
tion, this agonist produced a much smaller response than
ATP (Fig. 6a center trace), but when the divalent cation
concentration was reduced (to 0.5 mM Ca2+, 0 mM Mg2+),
the response to BzATP was much greater than that to the
same concentration of ATP (Fig. 6a lower right trace and 6b).
The response to ATP, recorded in normal divalent cation
solution, was concentration-dependent, and fitting the Hill
equation to the data gave an EC50 of 11 mM (Fig. 7a).
The response to 10 mM ATP, recorded in normal divalent
cation solution was potentiated in the presence of 10 mM
Zn2+, but was attenuated when the pH was lowered from
7.4 to 6.8 (Fig. 7b and c).
R. Coutinho-Silva et al. / Biochemical Pharmacology 69 (2005) 641–655 647
Fig. 2. Concentration-dependent elevation of intracellular Ca2+ by nucleo-
tides in J774 macrophages. (a) Calcium mobilization in response to
increasing concentration of a, b-meATP (arrows represent 0.1 mM,
1 mM and 10 mM). Subsequent application of higher concentrations of
agonist failed to evoke responses (not shown). (b–e) Show concentration-
response curves for Ca2+ mobilization in response to the increasing con-
centrations of UTP, UDP, ADP and 2Me-S-ADP respectively. Concentra-
tion-response curves were generated by combining data from at least three
independent experiments.
Fig. 3. Nucleotide activation of outward currents in J774 cells under
voltage clamp. (a) Outward currents evoked by UTP, ATP, ADP and
UDP in the same cell, under voltage clamp at �45 mV, using the perforated
patch technique with a K+ based filling solution. (b) The selective SK
channel blocker UCL 1684 has little effect on the outward current. (c)
recordings from another cell, in which, the response was reversibly abol-
ished by the IK channel blocker clotrimazole (CLOT).
Fig. 4. Concentration-dependence for activation of outward currents in
J774 cells under voltage clamp. Graphs show the concentration-response
curves for UTP, UDP, ATP and ADP. Responses were normalized with
respect to that produced by 3 mM (UDP) or 100 mM (UTP, ATP, ADP)
agonist in the same cell. The Hill equation was then fitted to the pooled
data to determine an EC50 value. Points represent the mean from 4 to 8
cells.
The P2 antagonists suramin (100 mM) and Cibacron
blue (30 mM) failed to antagonise the response to ATP
in normal divalent cation solution (Fig. 7d). In fact,
suramin appeared to produce a small though not statisti-
cally significant potentiation of the response.
3.3. Immunostaining for P2X receptors in the J774
macrophage cell line
We investigated the expression of all seven P2X receptor
subunits in J774 cells using immunofluorescence. Positive
immunostaining was observed for all P2X receptors with
different intensities of staining (Fig. 8a–h). In most experi-
ments, P2X7, P2X4 and P2X3 receptor immunostaining
was stronger than for other P2X receptor subtypes, with
staining intensity varying from weak to strong for all P2X
subtypes. The majority of cells were weakly labelled with
the anti-P2X1 and -P2X2 receptor antibodies (Fig. 8a and
b). The intensity of immunostaining was similar for P2X4,
P2X3 and P2X7 receptors, with the majority of cells
strongly labelled and some with moderate staining inten-
sity (Fig. 1c, d and h). P2X5 and P2X6 immunostaining was
also variable; less than half the cell population examined
showed strong staining, while the majority of cells were
moderate to weakly stained (Fig. 8e and f). The negative
controls (pre-absorption with cognate peptide, or omission
of the primary antibodies) gave no staining for any of the
P2X receptors studied. The negative control for P2X6 is
shown in Fig. 8g. In general, we observed the following
order of staining intensity: P2X4 � P2X7 � P2X3 >P2X6 � P2X5 � P2X2 > P2X1.
3.4. Western blot analysis
Western blotting was performed on membrane samples
subjected to a variety of denaturing or reducing conditions
(Section 2) using antibodies raised against P2X1–7 recep-
tors. J774 cells were found to express P2X4, which was
detectable when the sample was treated with DTT or
mercaptoethanol and P2X7, which was only detectable
following reduction with DTT (Fig. 9). In both instances,
further denaturing of the protein by heating at 95 8Cabolished the ability of the antibody to detect the protein.
These proteins were detected at 60 and 70 kDa for P2X4
and P2X7, respectively, which corresponds to the known
molecular weight of these proteins. No protein for P2X1,
P2X3 P2X5 or P2X6 could be detected, while a weak band
at 70 kD was detected for P2X2. Staining for P2X2, P2X4
R. Coutinho-Silva et al. / Biochemical Pharmacology 69 (2005) 641–655648
Fig. 5. Antagonist sensitivity of nucleotide activated outward currents
under voltage clamp. (a) Comparison of responses to near maximal agonist
concentrations of UDP, UTP and ADP before, during and after application
of Cibacron blue. (b) Comparison of responses to near maximal concentra-
tions of ADP and UTP before, during and after application of 100 mM
suramin. (c) Comparison of responses to ADP and UTP before, during and
after application of 30 mM PPADS. (d) Failure of the P2Y1 selective
antagonist MRS 2179 (3 mM) to affect responses to ADP and UTP.
Responses amplitudes were normalized with respect to the control response
in each cell. Columns represent the mean from six cells.
Fig. 6. Agonist activated inward currents in voltage clamped J774 cells. (a)
Rapid application of ATP evokes an inward current in cells voltage clamped
at �60 mV with a Cs+ based internal solution. In contrast, BzATP evoked a
much smaller response, and no response was evoked by a, b-meATP. When
the divalent cation concentrations in the bathing solution were reduced, the
response to BzATP was greatly increased. (b) Comparison of the amplitude
of the inward current produced by ATP, BzATP and a, b-meATP in normal
bathing solution, and by ATP and BzATP in low divalent cation-containing
solution (0 mM Mg2+, 0.5 mM Ca2+). Columns represent the mean
� S.E.M. from eight cells.
and P2X7 was abolished by pre-absorption with the cog-
nate peptide (not shown).
3.5. Immunostaining for P2Y receptors in the J774
macrophage cell line
We studied the expression of P2Y1, P2Y2 and P2Y4
receptors by immunofluorescence. The J774 macrophages
were positively-immunostained for all of these receptors
(Fig. 10a–d). Immunolabeling was strongest for P2Y1
receptors followed by P2Y2 and P2Y4. The majority of
J774 cells were strongly stained with anti-P2Y1 antibodies
but some cells presented a moderate intensity of labeling
(Fig. 10a). The anti-P2Y2 receptor antibody labeled
approximately half of the J774 macrophage population,
with moderate to strong staining intensity (Fig. 10c). The
majority of cells were moderately stained for P2Y4, with
some strong staining observed (Fig. 10d). In some experi-
ments, P2Y1 receptor immunostaining was more concen-
R. Coutinho-Silva et al. / Biochemical Pharmacology 69 (2005) 641–655 649
Fig. 7. Pharmacological properties of the ATP-activated current (in normal
divalent cation solution) in voltage clamped J774 macrophages. (a) con-
centration-response curve for activation of the inward current by ATP.
Points represent the mean � S.E.M. from four cells. Fitting the Hill
equation to the data gave an EC50 of 11 mM. (b) Inward currents recorded
from the same cell in response to 10 mM ATP alone, in the presence of
10 mM Zn2+, or in solution at pH 6.8 compared with a response to 100 mM
ATP. (c) Comparison of the effects of Zn2+ and low pH on the response to
ATP. Columns represent the mean � S.E.M. from eight cells. (d) Compar-
ison of the effects of suramin (SUR 100 mM) and Cibacron blue (CB
30 mM) on the response to 10 mM ATP. Columns represent the mean
� S.E.M. from four cells.
Fig. 8. Immunolabelling of P2X receptors on J774 macrophages. Immuno-
fluorescent staining of: (a) P2X1 (b) P2X2 (c) P2X3 (d) P2X4 (e) P2X5 (f)
P2X6 (g) pre-absorption of P2X6 antibody with peptide control. (h) P2X7
immunofluorescence. Note that there is less intense immunoreactivity for
P2X1 and P2X2 than for other receptors. (a–h) 200�.
Fig. 9. Detection of P2X4 and P2X7 in J774 membrane preparations by
western blotting. Samples were treated with Laemmli buffer, containing (a)
3% DTT, (b) 3% DTT with heating at 95 8C (c) 5% mercaptoethanol and (d)
5% mercaptoethanol with heating at 95 8C. Proteins of 60 and 70 kDa were
detected for P2X4 and P2X7, respectively.
trated on the plasma membrane than that observed for other
P2Y receptors. The negative controls gave no staining for
any of the P2Y receptors studied.
3.6. P2X receptor expression in mouse spleen
macrophages
Using flow cytometry, we assessed the expression of
P2X receptors in mouse spleen macrophages. No signifi-
cant immunoreactivity for P2X1 or P2X2 was observed. A
weak signal for P2X3 was apparent, while strong immu-
noreactivity for the other four subunits was detected
(Fig. 11; Table 1). All P2X receptor subtypes were identi-
fied in spleen macrophages but the mean fluorescence
intensity (MFI: an index of receptor number per cell)
sometimes showed weaker expression of P2X1 and
P2X2 receptor subtypes (Table 1).
3.7. P2Y receptor expression in mouse spleen
macrophages
Using flow cytometry, we assessed the expression of
P2Y1, P2Y2 and P2Y4 receptors in mouse spleen macro-
phages. All three P2Y receptor subtypes were identified
with little difference in the mean fluorescence intensity
between the subtypes (Table 1). For the established macro-
phage cell line J774, we used conventional immunostain-
ing.
3.8. Molecular analyses of P2X and P2Y receptors
We used RT-PCR to identify mRNA expression corre-
sponding to specific receptors found in mouse spleen
macrophages and in the J774 macrophage cell line. Ampli-
fications were performed with the oligonucleotide primer
pairs specific for cloned P2X and P2Y receptors. Primers
were complementary to regions showing maximal
sequence identity within mouse and rat transcripts (where
both sequences were available). The results are sum-
marised in Fig. 12 and Tables 1 and 2.
Single, specific PCR fragments were detected for P2X4
and P2X7 in spleen and peritoneal macrophages as well as
in J774 cells. In mouse macrophages, two fragments were
amplified for P2X6; a fragment of the expected size and a
smaller, less abundant one. Sub-cloning and sequence
analysis of this smaller product indicated that it arises
from alternative splicing of the mouse P2X6 transcript.
Amplification of P2X3 mRNA resulted in two frag-
ments, one of the expected size and a second smaller band
of higher intensity. However, sequence analysis revealed
that the smaller fragment is a non-specific product of PCR
amplification.
Amplification with primer sets specific for P2X1 and
P2X5 gave specific products of low abundance in isolated
macrophages but were largely undetectable in J774 cells.
P2X2 amplification produced a single band of a much
larger size (800 bp) than expected (392 bp). This fragment
R. Coutinho-Silva et al. / Biochemical Pharmacology 69 (2005) 641–655650
Fig. 10. Immunolabelling of P2Y receptors on J774 macrophages. (a) P2Y1 immunofluorescence staining. (b) Pre-absorption of P2Y1 antibody with peptide
control. (c) P2Y2 immunoreactivity. (d) P2Y4 immunoreactivity. Note: In (a), the presence of a subpopulation of cells that label strongly for P2Y1 receptors. (a–
d) 200�.
corresponded to the published sequence of the genomic
DNA. However, this amplicon was not detected in control
amplifications with mock first strands where reverse tran-
scriptase was omitted, thus excluding genomic DNA con-
tamination. Therefore, we have amplified the unspliced,
primary transcript of the P2X2 receptor, retaining introns
between exon 2 and exon 6. Furthermore, we did not
observe the amplification product of the mature, spliced
mRNA, which indicates that the P2X2 transcript in macro-
phages is alternatively spliced in the region(s) where the
amplification primer(s) anneal. Sequence analysis revealed
that exon 6 (to which our reverse primer should anneal)
undergoes extensive splicing in different tissues. Amplifi-
cation with primer sets specific for P2Y1, P2Y2, P2Y4 and
P2Y6 transcripts resulted in single amplification products
of the expected sizes in isolated macrophages and in the
R. Coutinho-Silva et al. / Biochemical Pharmacology 69 (2005) 641–655 651
Fig. 11. P2X receptor subtype protein expression in spleen macrophages using flow cytometry. Fluorescence histograms of P2X receptors obtained by flow
cytometry. (a) Cells were initially selected for analysis on the basis of the characteristic forward (x-axis) and side (y-axis) scatter profiles; cells in region R3 were
gated to represent the macrophage population (R2 consisted mainly of lymphocytes). These cells were confirmed to be CD11b-positive (a marker for
macrophages). (b) P2X1 (c) P2X2 (d) P2X3 (e) P2X4 (f) P2X5 (g) P2X6 (h) P2X7. Solid line, control; shaded line, P2X subtype antibodies. Traces shown are from
a single experiment but are representative of five independent experiments.
Table 1
Summary of P2X receptor subtypes identified in macrophages by RT-PCR and immunocytochemistry
P2X1 P2X2 P2X3 P2X4 P2X5 P2X6 P2X7
P IS WB P IS WB P IS WB P IS WB P IS WB P IS WB P IS WB
J774 cell line – � – + + + ++ – + +++ ++ � + – + + – + +++ ++
Mouse spleen macrophages NE ++ (var) NE NE ++ (var) NE + ++ NE + +++ NE + + NE + ++ NE + ++ NE
P, RT-PCR; IS, Immunostaining (immunofluorescence or flow cytometry data); WB, Western blot; (–) not detected; (+) staining present; (++) strong staining;
(+++) very strong staining; (var), variable; NE not examined.
J774 cell line. PCR using control first strands (prepared
without reverse transcriptase) invariably gave no amplifi-
cation products.
4. Discussion
In earlier studies, it was thought that P2X7 and P2Y2
were the main P2 receptors expressed by immune cells
([16,38,39]). Subsequent studies, using RT-PCR and
immunohistochemistry, have now identified various other
P2X and P2Y subtypes in immune cells [39], including
lymphocytes [22], dendritic cells [25], eosinophils [40] and
human blood-derived macrophages [24]. In this study, we
demonstrate that mouse macrophages express a number of
functional P2 receptors. Using RT-PCR and immunohis-
tochemical techniques (immunofluorescence and Western
blot for J774 cells, or flow cytometry for native macro-
phages), we show for the first time, both at the mRNA and
protein level, that murine macrophages express both the
mRNA and protein for multiple P2X receptor subunits and
four P2Y receptor subtypes. Furthermore, the presence of a
variety of P2X and P2Y receptor subtypes is confirmed by
our functional studies.
4.1. P2X receptors on J774 cells
Previous studies measuring [Ca2+]i support the view that
P2X and P2Y receptors are present on J774 macrophage
cells [13,14]. Our patch-clamp and RT-PCR experiments
revealed the presence of several P2X receptor subtypes on
J774 macrophage cells. Our results in ‘‘normal’’ divalent
cation-containing solution, revealed BzATP to be a less
potent agonist than ATP, and responses were insensitive to
the antagonists suramin and Cibacron blue. In addition,
although responses were potentiated by micromolar con-
centrations of Zn2+, they were attenuated by acidification.
These findings are consistent with the involvement of P2X4
receptors, which have been identified in a rat alveolar
macrophage cell line [26]. In low divalent cation solution,
BzATP became more potent than ATP indicating the
presence of P2X7 receptors. Our electrophysiological
and pharmacological findings are supported by the strong
immunostaining for P2X4 and P2X7 receptor protein in
these cells, detection of the protein by Western blot, and the
identification of mRNA for these subunits by RT-PCR.
The presence of P2X1 receptor expression in immune
cells is contentious. P2X1 receptor mRNA and positive
immunostaining were first described in thymocytes
[23,41,42], and P2X1 receptor mRNA has been identified
in human blood-derived macrophages and macrophage-
derived dendritic cells as well as in the HL60 promyelocyte
cell line [43,44]. However, these findings are in contrast to
a study where expression of the P2X1 receptor was identi-
fied in human platelets but not in monocytes, neutrophils or
blood lymphocytes [45]. We failed to detect P2X1 mRNA,
in J774 cells, and although low levels of P2X1 immunor-
eactivity were detected, this was not confirmed by Western
blot, so we cannot completely rule out the possibility that
this was non-specific. Although no immunoreactivity was
detected in our negative controls, because of the high levels
R. Coutinho-Silva et al. / Biochemical Pharmacology 69 (2005) 641–655652
Fig. 12. RT-PCR determination of purinergic receptor mRNA expression in mouse macrophages. The figure shows examples of agarose gel analysis (negative
image of the ethidium bromide staining) of 10 ml of amplification products obtained with specific primer sets. J774—mouse macrophage cell line; SM—100 bp
size marker (control; Gibco-BRL). The initial identification of the PCR products was based on the correct predicted size and confirmed by restriction digestion
and/or sequencing. The single, expected size amplification products were obtained for all P2Y receptors studied and for P2X4 and P2X7. Amplification of P2X6
gave an additional smaller band (arrow) proven to be the result of alternative splicing. A larger band in P2X3 (arrowhead) was a non-specific product. The size of
P2X2 amplicon corresponded to the amplification of an unspliced, primary transcript. Although no amplification product for P2X1 and P2X5 could be detected
form J774 cells, amplification of products from mouse brain RNA (M.BR) served as a positive control.
Table 2
Summary of P2Y receptor subtypes identified in macrophages by RT-PCR
and immunocytochemistry
P2Y1 P2Y2 P2Y4 P2Y6
P IS P IS P IS P IS
J774 Cell Line + +++ + ++ + + + NE
Mouse spleen
macrophages
NE + NE + NE + NE NE
P, RT-PCR; IS, immunostaining (immunofluorescence or flow cytometry
data); (–) not detected; (+) staining present; (++) strong staining; (+++) very
strong staining; NE, not examined.
of Fc receptors on macrophages, some non-specific bind-
ing of the primary antibody might still occur. Absence of
P2X1 receptors is also supported by the lack of response to
a, b-meATP in our patch-clamp experiments.
Although we detected low levels of P2X2 receptor
immunoreactivity in J774 cells by immunostaining and
Western blot, our PCR experiments gave ambiguous
results, possibly because of alternative splicing of the
mRNA in the region to which our primers were directed.
Furthermore, in our patch-clamp experiments, ATP
responses were not potentiated by lowering pH, which is
a characteristic of the P2X2 receptor.
The detection of P2X3 mRNA and protein in J774 cells
was an unexpected finding as previous studies have
reported selective expression of P2X3 receptors largely
on sensory neurones of dorsal root, trigeminal and nodose
ganglia [46,47], although more recently P2X3 receptors
have also been identified in endothelial and epithelial cells
[18,23]. Although immunostaining indicated the presence
of P2X3 protein, this was not confirmed by Western blot.
Furthermore, our electrophysiological experiments failed
to reveal the presence of functional P2X3 receptors. It is
possible that the receptor may not be transported to the
surface membrane, as happens with the P2X6 receptor
when expressed in HEK293 cells [48]. Alternatively,
because the P2X3 receptor desensitizes very rapidly, the
lack of electrophysiological response could be due to
endogenous ATP release causing receptor inactivation
prior to experimentation. However, in experiments using
apyrase to degrade any released ATP, we were still unable
to observe responses to a, b-meATP, making this explana-
tion unlikely. Interestingly, we did occasionally see
responses to a, b-meATP in our micro-fluorimetry experi-
ments. Furthermore, human blood-derived macrophages
respond to ATP and a, b-meATP, and this response has a
rapidly desensitizing component, consistent with the invol-
vement of P2X1 or P2X3 receptors [49]. Thus, it may be
that functional P2X3 receptors are only present in macro-
phages under particular conditions.
Although low levels of P2X5 and P2X6 receptor immu-
noreactivity were detected in J774 cells, mRNA for the
P2X5 subunit was not convincingly detected, while for the
P2X6 receptor both the expected size fragment and a
smaller splice variant were observed. However, P2X6 sub-
units may only form functional receptors if appropriately
glycosylated [50] or in combination with other subunits as
part of a heteromeric receptor [51]. Although our functional
studies provide no support for the presence of either of these
receptors, we cannot rule out their existence in J774 cells.
4.2. P2Y receptors on J774 cells
In agreement with previous studies [14], we demon-
strated that nucleotides can cause an elevation of intracel-
lular Ca2+ in J774 cells through the activation of P2Y
receptors, and this in turn leads to the activation of a
calcium-sensitive potassium conductance. Interestingly,
the potassium channels involved appear to be of the IK/
(SK4) rather than the apamin sensitive (SK1–3) subtype.
Our RT-PCR and immunohistochemical experiments
indicate that P2Y1, P2Y2, P2Y4 and P2Y6 receptors are
all present in J774 cells. This conflicts with the observa-
tions of Chen and Lin [15] who detected only P2Y6 mRNA
in J774 cells, and a more recent study of rat alveolar
macrophages, which detected P2Y1, P2Y2, P2Y4 and
P2Y12 but no P2Y6 mRNA [26]. The presence of multiple
P2Y receptors with different levels of receptor reserve, and
the all or none nature of the Ca2+ increase in most J774
cells makes pharmacological identification of the receptor
subtype(s) involved difficult. In addition, pharmacological
characterization of recombinant mouse P2Y receptors is
less complete than for the rat and human orthologues.
Because, it is at present, unclear whether there is much
interspecies variation in the properties of these receptors,
interpretation of our data based on the characteristics of rat
and human P2Y receptors must be treated with caution.
Our functional experiments (electrophysiology and
micro-fluorimetry) show that ADP, ATP, UTP and UDP
are all effective agonists. The rank order of potency
differed in the two sets of experiments. Whether this is
because the cell selection criteria for the two techniques
resulted in an unavoidable bias is not clear.
The low potency of ADP, and the lack of antagonism by
MRS 2179 would suggest that the P2Y1 receptor is not
important for the functional responses. The ability of
suramin and PPADS to abolish responses to ADP, while
leaving the response to UTP unaffected by suramin, or
slightly reduced by PPADS, combined with the resistance
of the response to UTP to both suramin and PPADS, might
suggest the involvement of three P2Y receptor subtypes,
perhaps P2Y2, P2Y4 and P2Y6. Clearly, a more detailed
investigation, using an assay more closely coupled to
receptor activation (e.g. IP3 generation) will be required
to confirm this and to rule out any possible contribution of a
lower expression level of P2Y1 receptors.
4.3. Native macrophages
We examined the expression of P2 receptor mRNA and
protein in mouse spleen macrophages using RT-PCR and
flow cytometry. Although there may be problems in extra-
polating from mRNA to protein, and from protein expres-
sion to functional receptors, our data suggests that purinergic
signalling in native macrophages could involve at least as
many receptor subtypes as we have identified in J774 cells.
4.4. Physiological role
The expression of a variety of different P2 receptors will
enable a cell to respond to a variety of purine and pyrimidine
di- and tri-phosphates over an extended concentration range.
The extent to which the expression of these receptors
R. Coutinho-Silva et al. / Biochemical Pharmacology 69 (2005) 641–655 653
changes during the lifetime of a macrophage has yet to be
investigated. Thus, it may be that some of these receptors
have an important role in the development and differentia-
tion of stem cells in bone marrow, while others are important
for activation of mature macrophages. Further studies will
be required to investigate this possibility.
In conclusion, we have demonstrated the presence of at
least two P2X and three P2Y receptor subtypes in mouse
macrophages. This suggests that the mechanisms by which
nucleotides act on macrophages are more complex than
first described and a re-evaluation of previous data may be
necessary in light of our new findings. Clearly, the devel-
opment of new P2X and P2Y specific antagonist/blocking
drugs and new studies are required to establish fully the
functions of different nucleotides on macrophages and the
role of these receptors in macrophage physiology.
Acknowledgments
The authors are grateful to Dave Blundell and Vandir da
Costa for their excellent technical support and to Dr.
Chrystalla Orphanides for editorial assistance with the
manuscript. This work was partially supported by funds
from the Conselho Nacional de Desenvolvimento Cienti-
fico e Technologico do Brasil (CNPq), Programa de
Nucleos de Excelencia (Pronex), Fundacao de Amparo a
Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), and the
Wellcome Trust. Dr. Coutinho-Silva was a Wellcome Trust
fellow, number 062754/Z00Z.
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