ANDERSON ROMERIO AZEVEDO CERQUEIRA

Avaliação farmacológica do extrato da glândula salivar de mosquito fêmea Aedes aegypti no prurido agudo e inflamação cutânea

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo. Área de Concentração: Farmacologia Orientadora: Profa. Dra. Soraia Kátia Pereira Costa Versão Original

São Paulo 2017

RESUMO

Cerqueira, ARA. Avaliação farmacológica do extrato da glândula salivar de mosquito fêmea Aedes aegypti no prurido agudo e inflamação cutânea [Dissertação (Mestrado em Farmacologia)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2017.

O prurido (agudo e crônico) é uma sensação desagradável, que provoca o desejo ou o reflexo de coçar-se. Estima-se que 23 a 44 milhões de norte americanos sofrem com prurido, mas os dados epidemiológicos da frequência e as causas do prurido são escassos em vários países, incluindo Brasil. Os anti-histamínicos constituem os principais fármacos para tratar alergias e prurido provocado por picadas de insetos, mas são ineficazes conta o prurido idiopático, crônico e generalizado. Curiosamente, a exposição primária de humanos e animais à picada do mosquito fêmea Aedes aegypti (A. aegypti) não induz prurido, e pouco se sabe sobre este efeito. Neste contexto, este estudo caracterizou, via emprego de abordagens farmacológicas, o efeito do extrato da glândula salivar (EGS) do mosquito A. aegypti sobre o prurido (e inflamação cutânea relacionada) induzido por vias histaminérgicas (ou não) em pele dorsal de camundongos. A indução do prurido agudo (inflamação cutânea) foi feita pela injeção intradérmica (i.d) do composto 48/80 (C48/80), agonistas de Receptores Ativados por Protease -2 (PAR-2 (SLIGRL), receptores acoplados a proteína G do tipo mas (Mrgrp (cloroquina) e de potencial transitório TRPA1 e TRPV1 (allyl isothiocyanate e capsaicina, respectivamente) em Tyrode. O EGS do A. aegypti, (0,3

a 3 g/sitio, i.d.) inibiu o prurido, edema e influxo de células frente ao C48/80 em pele murina, mas não protegeu da desgranulação do mastócito in vitro, indicando que componentes bioativos no EGS inibem o prurido e a inflamação dependentes de vias histaminérgicas. O EGS reduziu parcialmente o prurido (ou inflamação neurogênica) induzido por SLIGRL, cloroquina, AITC ou capsaicina na pele murina, sugerindo que outros componentes bioativos afetam disparos nervosos pruriceptivos de vias não histaminérgicas. O estudo in vitro veio igualmente esclarecer que moléculas conservadas no EGS inibem respostas nervosas aos agonistas TRPV1 e TRPA1 em cultura de células de neurônios ou linhagem HEK293t transfectada (hTRPV1 e hTRPA1). Este estudo mostrou, pela primeira vez, a caracterização farmacológica anti-pruriceptiva (e anti-inflamatória) do EGS do mosquito fêmea A. aegypti, cujo mecanismo inclui vias sensível e resistente a histamina, podendo o EGS representar um nova ferramenta farmacológica com potencial para o controle do prurido.

Palavras-chave: Aedes aegypti. Inflamação. Prurido.

ABSTRACT

Cerqueira, ARA. Pharmacologic evaluation of salivar gand extract from female Aedes aegypti mosquito in acute pruritus and skin inflammation. [Masters thesis (Pharmacology)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2017.

Pruritus (acute and chronic) is an unpleasant sensation, which causes the desire or the reflex of scratching. It is estimated that 23 to 44 million Americans suffer from pruritus, but epidemiological data on pruritus frequency and its causes are scarce in several countries, including Brazil. Antihistamines are the main drugs to treat allergies and pruritus caused by insect bites, but they are ineffective to treat idiopathic, chronic and generalized pruritus. Interestingly, a primary exposure of humans and animals to the bite of the female mosquito Aedes aegypti (A. aegypti) does not induce pruritus, and little is known about this effect. In this context, this study characterized, through the use of pharmacological approaches, the effect of the salivary gland extract (EGS) of the A. aegypti mosquito on pruritus (and related cutaneous inflammation) induced by histaminergic or non histaminergic pathways in the dorsal skin of mice. The induction of acute pruritus (and or cutaneous inflammation) was produced by the intradermal (i.d.) injection of compound 48/80 (C48/80), agonists Protease Activated Receptor -2 (PAR-2 (SLIGRL), mas-related G protein-coupled receptor (Mrgrp (chloroquine) and transient receptor potential TRPA1 and TRPV1 (allyl isothiocyanate and capsaicin, respectively) diluted in Tyrode. The A. aegypti SGE, (0.3 to 3 μg/site, id) significantly inhibited pruritus, edema and neutrophil influx evoked by C48/80 in murine skin, but it did not protect against mast cell degranulation in vivo and in vitro. This suggests that EGS bioactive components inhibit pruritus and inflammation via mechanism dependent on histaminergic pathways. SGE partially reduced SLIGRL, chloroquine, AITC-induced pruritus, or capsaicin-induced neurogenic inflammation in murine skin, suggesting that SGE bioactive components affect pruriceptive nerve firing independently of histaminergic pathways. The in vitro study also clarified that conserved SGE molecules inhibit nerve responses to TRPV1 and TRPA1 agonists in cultured neurons of dorsal root ganglia or transfected HEK293t lineage (hTRPV1 and hTRPA1). This study showed, for the first time, the anti-pruriceptive (and anti-inflammatory) pharmacological characterization of the EGS from the A. aegypti female mosquito, whose mechanism includes sensitive and histamine-resistant pathways. EGS may represents a new pharmacological tool with potential to treat pruritus. Keywords: Aedes aegypti. Inflammation. Pruritus.

1 INTRODUÇÃO

1.1 Saliva de animais hematófagos como ferramenta farmacológica

Existe aproximadamente um milhão de espécies de artrópodes, que

corresponde a 80% de todas as espécies de animais metazoários, incluindo uma

larga variedade de hematófagos. No Brasil já foram registradas 64 espécies

representantes da família Triatominae (Jurberg, 2014), 62 espécies e subespécies

de pulgas, divididas em oito famílias (Linardi, 2011) e 517 membros da família

Culicidae, dividida em 28 espécies diferentes do gênero Aedes (WRBU, 2016),

conhecidos popularmente como pernilongos, muriçocas ou carapanãs (Consoli,

Oliveira, 1998). Em comum, os mosquitos são insetos dípteros alados, com escamas

ao longo das nervuras das asas e uma franja de escamas ao longo da borda

posterior das asas e, em geral, são hematófagos na fase adulta; porém, são

aquáticos na fase imatura (Consoli, Oliveira, 1998; Rey, 2010; Tanaka et al., 2012).

Desde meados do século XVIII encontram-se descrições gerais do ciclo

biológico das diferentes espécies de mosquitos e do inconveniente de suas picadas,

mas muito pouco se conhecia do potencial destes na transmissão (vetores) de

doenças. Foi somente no início do século XX que a família Culicidae despertou

interesse médico, quando se demonstrou o envolvimento de algumas espécies

dessa família na transmissão da malária e da filariose bancroftiana. A partir desse

conhecimento, inúmeras pesquisas vêm atualmente detalhando melhor a biologia e

sistemática das espécies da família Culicidae.

No Brasil, em particular, esses insetos apresentam grande relevância como

vetores de doenças tropicais negligenciadas, tais como a febre amarela, a dengue,

as encefalites e, leishmaniose (Consoli, Oliveira, 1998). Mais recentemente, a febre

do vírus Zika, uma doença atual grave de elevada importância sanitária, cuja

principal consequência descrita é a microcefalia em recém-nascidos, que vem

assolando o país, particularmente, o nordeste brasileiro (Organização Mundial da

Saúde (OMS), 2016). Como consequência, ainda mais as pesquisas vêm

impulsionando, com o auxílio de campanhas contra os mosquitos vetores, as

investigações taxonômicas, ecológicas e biológicas dos insetos da família Culicidae.

Vários dos aspectos morfológicos e funcionais dos mosquitos são conhecidos

há várias décadas. O corpo dos mosquitos apresenta-se de forma segmentada e

revestido por exoesqueleto. Os segmentos endurecidos interligados por membranas

formam uma cavidade (hemocele) preenchida por um líquido (hemolinfa), que banha

todos os órgãos (Figura 1). Na fase adulta o mosquito apresenta uma divisão clara

do corpo, que compreende: i) cabeça globosa, que acomoda os olhos, antenas e os

palpos, ii) tórax, que contempla as patas, asas, esôfago e um par de glândulas

salivar) e, iii) abdome, que compreende os aparelhos reprodutor e digestivo.

Figura 1 - Aspecto morfológico do mosquito na fase adulta.

Principais divisões da família Culicidae, representada pela i) cabeça (olhos, antenas, proboscide e palpos), ii) tórax (patas, asas, esôfago, glândulas salivares) e, iii) abdome (aparelho reprodutor e digestivo). Fonte: adaptada de Consoli, Oliveira (1998).

Vale ressaltar que o aparato digestivo do mosquito hematófogo começa na

cabeça e, assim, para alimentarem-se, introduzem o conjunto de estiletes na pele do

hospedeiro, deixando assim o lábio dobrado. Ocorre a sucção do alimento a partir da

pressão negativa gerada pela bomba cibarial (que possui em sua porção final uma

crista formada por espículas esclerotizados) e bomba faríngea (musculosa). Assim,

ao mesmo tempo que ocorre a sucção, a saliva é bombardeada para o local da

picada pela bomba salivar. Durante esse processo, o sangue passa pelo esôfago e

segue para o estomago, onde se inicia a digestão. A saliva, gerada pelo par de

glândulas localizadas no tórax é drenada por ductos individuas até se unir à bomba

salivar (Consoli, Oliveira, 1998). Os órgãos sensoriais localizados na labela

selecionam o local da picada. Em seguida, ocorre a penetração direta de um capilar,

e a sucção de sangue é feita de modo rápido. É possível que ocorra uma lesão

provocada pelas peças bucais do inseto, causando pequena hemorragia

ii

i

iii

subcutânea, local de sucção mais completo (Griffits e Gordon, 1952; Consoli,

Willians, 1981).

Em geral, uma grande maioria das espécies hematófagos transmitem

doenças e, por conta disto, estudos empregando técnicas bioquímicas, moleculares

e farmacológicas vêm auxiliando no conhecimento da biologia e dos componentes

químicos presentes, em particular, na saliva e intestino da grande maioria das

espécies de mosquitos hematófagos. Devido a grande diversidade de espécies,

mais de 3000 espalhadas pelo mundo, ainda muito se tem de conhecimento sobre a

evolução dessas espécies e os efeitos farmacológicos e deletérios provocados por

suas picadas e das estruturas quimioreceptores e mecanoreceptores localizados na

extremidade das partes bucais ou nas antenas dessas espécies (WRBU, 2016).

Acredita-se que esse conhecimento é relevante, pois é possível inibir ou combater

ações deletérias causadas pela ação da picada da grande maioria desses insetos.

Assim como nos venenos de aranhas, serpentes e vespas, a caracterização

de substâncias ativas (e inativas) na saliva de mosquitos hematófagos, como o

Aedes, vem revelando uma enorme variedade de estruturas e funções com grande

potencial terapêutico ou como ferramentas farmacológicas, capazes de auxiliar nos

estudos de processos inflamatórios e hemostáticos; todavia, pouco se conhece

sobre as ações sensitivas (prurido e dor) e regeneradora (cicatrizante) dos

componentes presentes na saliva dos gêneros Aedes, Anopheles ou Culex,

comumente encontrados no hemisfério sul, incluindo em todo o território brasileiro.

A literatura mostra que na saliva dos mosquitos hematófagos, tais como o

mosquito Aedes aegypti, existem diferentes substâncias com mecanismos anti-

hemostáticos, anti- e pro-inflamatórios e com atividades imunológicas. Tais

substâncias possuem alta especificidade para bloquear, de formas variadas, as

defesas hemostáticas via inibição das enzimas hemostáticas, da agregação

plaquetária e da cascata de coagulação sanguínea (Ribeiro, 2000). Por exemplo, as

proteínas Aed a 1, 2, 3 e 7 regulam mecanismos de anti-agregação plaquetária,

transporte de moléculas hidrofóbicas e contração muscular (Peng et al., 1998; 2001;

2006), que facilitam o processo de alimentação sanguínea mosquito-hospedeiro

(Hudson et al., 1960; James et al., 1991). Outros componentes exercem ações

vasodilatadoras e ativadoras de processos fibrinolíticos (Ribeiro et al., 1984; 1995;

Ribeiro e Francischetti, 2003; Mans et al., 1998; Mans e Neitz, 2004; Tanaka et al.,

2012). Ainda, outras moléculas ainda não caracterizadas/isoladas na saliva

contribuem para a imunomodulação do hospedeiro no local da picada (Wasserman

et al., 2004; Schneider et al., 2010). De fato, experimentos in vitro mostraram que a

administração de extratos de glândula salivar (EGS) de Aedes aegypti inibe a

proliferação de linfócitos T por indução de processo apoptótico dependente das

caspases 3 e 8 (Bizzarro et al., 2013).

A picada de insetos hematófagos, como o Aedes aegypti, espécie oriunda da

África, mas que atualmente difunde-se em toda extensão territorial. Particularmente,

em países tropicais como o Brasil (Barreto, Teixeira, 2008), a picada desses insetos

causa, além da reação local, a transmissão de várias doenças, pois são vetores de

doenças virais conhecidas na atualidade, como a dengue, a febre amarela, zica e

chikungunya; e/ou doenças parasitárias, como a doença de Chagas, filariose,

leishmaniose, malária, dentre outras (Ruppert, Barnes, 1996). Recente

Levantamento Rápido Para Índice de Aedes aegypti (LIRAa) revelou um aumento,

entre os anos de 2014 e 2015, em torno de 176%, para os casos de dengue, sendo

destas 104% notificações consideradas como graves e 79% casos notificados foram

a óbito. Paralelamente, em torno de 17.131 notificações foram realizadas para as

infecções causadas pelo Chikungunya, muito embora somente 6.724 casos foram

confirmados (Ministério da Saúde, 2015).

1.2 Ações farmacológicas e imunológicas da saliva de mosquito Aedes aegypti

Substâncias pruriceptivas podem ser encontradas na natureza,

principalmente, em plantas causadoras de urticaria e na saliva de insetos (Ohtsuka

et al., 2001). A reação causada pela picada de insetos, como os mosquitos, vespas

e abelhas podem exercer respostas sensitivas (prurido e dor) distintas, que

dependem dos alérgenos e componentes químicos presentes na saliva inoculada.

Segundo estudo de Ohtsuka et al., em 2001, a saliva do mosquito Aedes albopictus

induz prurido em camundongos, via mecanismo dependente da reação de

sensibilização entre antígenos presente na saliva e produção de imunoglobulinas E

(IgE), que acontece após exposição a picadas do mosquito. Outros demostraram

que a sensação de coceira induzida pela picada dessa espécie ocorre, via

mecanismo dependente da proliferação de células T CD4+ (Asada et al., 2005;

Assumpção et al., 2012). Corroborando esses achados, a picada do Aedes aegypti

desencadeia respostas alérgicas em alguns indivíduos, que variam de intensidade. A

primeira exposição de humanos e animais à picada do Aedes aegypti não promove

resposta pruritogênica; entretanto, as re-exposições podem causar reações de

hipersensibilidade (resposta imediata), caracterizada por inchaço, rubor e coceira

localizada (Mellanby, 1946; Allen, West, 1966; Bairey et al., 2012).

A saliva de mosquitos, assim como os venenos ofídicos e atrópodos (vespas

e aranhas), compreende um coquetel complexo de substâncias biologicamente

ativas, incluindo o monofosfato de adenosina (AMP), prostaglandinas e oxido nítrico

(NO) (Simon, Peng, 2001; Peng et al., 2001, 2005). No extrato da glândula salivar do

mosquito Aedes aegypti foi detectado a presença de substâncias como apyrase

(Aed a 1) e aegiptina (Aed a 3), ambas com atividades anti-agregantes plaquetários,

trombomiosina (contração muscular) e D7 (Aed a 2) (transportadora de moléculas

hidrofóbicas de baixo peso) (Calvo et al., 2006; Peng et al 2001, 2006; Valenta et al.,

1999).

Os alérgenos presentes na saliva do Aedes aegypti induzem resposta

sensibilizantes / imunológicas, que levam ao aumento, majoritariamente, de IgE,

diferentes subtipos de IgG e de citocinas inflamatórias liberadas por células ativadas,

como os basófilos, mastócitos e eosinófilos (Peng e Simons, 1998).

Tendo em vista a diversidade de mosquitos encontrados na fauna brasileira,

pouco ainda se conhece da bioquímica e farmacologia da saliva de mosquitos

encontrados no Brasil, incluindo do Aedes aegypti. De acordo com Wasserman,

2004, o emprego do Extrato da glândula salivar (EGS) de fêmeas desse mosquito

inibiu a proliferação de linfócitos estimulados com ovalbumina em camundongos

BALB/C. Bizzaro et al., em 2013, observaram que o EGS do Aedes aegypti, na

concentração de 10µg/ml, promoveu apoptose de linfócitos T (CD4 e CD8) e B

(CD19) obtidos de camundongos BALB/C, via ativação das caspases 3 e 8,

respectivamente. Curiosamente, concentrações menores do EGS inibiram a

produção de células helper-1 (Th-1) e das citocinas pró-inflamatórias Th1 (ex.: fator

de necrose tumoral-α (TNF- α), interferon-γ (IFN-γ), interleucina-2 (IL-2), e IL-12

(Wasserman et al., 2004; Bissonnette et al., 1993), quando comparado com a

concentração capaz de inibir as citocinas Th-2. Apesar do EGS do mosquito Aedes

aegypti inibir a liberação do TNF-α de mastócitos, o mesmo não induziu

citotoxicidade e tampouco afetou a liberação de histamina dessas células. O

mecanismo de inibição das células do sistema imunológico no local da picada,

associado à presença de fatores anticoagulantes na saliva parece beneficiar o

mosquito durante a alimentação sanguínea, bem como facilitar o sucesso na

infecção dos patógenos virais que ele pode carregar (Ribeiro, 2000; Sá-Nunes et al.,

2007). Mais recentemente, Sales-Campos et al., em 2015, observaram que o

tratamento endovenoso (e.v.) de camundongos Balb/C com o EGS de Aedes aegypti

reduziu significativamente os sinais clínicos da colite experimental aguda induzida

por dextran nesses animais, reforçando um papel anti-inflamatório importante para

componentes do EGS.

1.3 Prurido e mecanismos relacionados

O prurido é um sintoma comum de diversas doenças, a depender da

intensidade, a sensação gerada pode ser forte o suficiente para provocar coceira e,

assim como na dor, o corpo/indivíduo (seja por reflexo ou desejo) irá reagir na

tentativa de obter alivio (Walhgren, 1995; Savin, 1998). As respostas que podem

levar ao desencadeamento do prurido têm sua origem em diversas causas, do ponto

de vista neurofisiológico. Pode ter origem periférica ou central (Twycross et al.,

2003), sendo ainda classificadas de acordo com a etiologia primaria em: i) doenças

de caráter dermatológico, como psoríase, dermatite atópica e urticarias; ii)

sistêmicas, causadas por anomalias em órgãos que não a pele como cirrose biliar

primária, insuficiência renal crônica e diabetes; iii) neurológicas, causadas por

doenças ou danos ao sistema nervoso central (SNC) ou iv) periférico (SNP), como

compressão ou lesões diretas no SN; psicossomática, tem origem de algum tipo de

desordem psiquiátrica que o indivíduo possa apresentar, sem possuir uma origem

sistêmica estabelecida, urticária nervosa; mistas, quando existe uma sobreposição

entres as causas do prurido; ou outras, quando não é possível determinar a origem

do sintoma. Pacientes nessa condição são classificados em três grupos principais,

(I) prurido causado por doenças dermatológicas; (II) prurido não causado por

alterações cutâneas, origem sistêmica, neurológica ou psiquiátrica; e (III) as

exacerbadas por lesões secundárias na pele, obtidas devido a coceiras crônicas

(Stander et al., 2007).

Em toda a extensão da pele são encontradas terminações nervosas que

transmitem sinais até o SNC (Ikoma et al., 2005), sendo que o corpo celular desses

neurônios aferentes estão localizados nos gânglios da raiz dorsal (DRG) e no

glânglio do trigêmeo (Han, Dong, 2014). Os neurônios aferentes podem ser

classificados em fibras Aα e Aβ, mielinizadas e, portanto, de rápida condução. Estes

são responsavéis por sensações mecânicas de toque ou pressão. As fibras Aδ,

levemente mielinizadas, conduzem sinais mecânicos mais intensos, sendo a

ativação destas, capaz de levar a uma resposta rápida, que gera dor aguda. As

fibras C, finas e desmielinizadas, exercem resposta lenta e difusa, envolvidas na dor

aguda e coceira (Almeida et al., 2004; Hang, Dong, 2014).

Quando estimulado por algum agente pruriceptivo, um grupo especifico de

fibras C, conduz a transmissão da dor (Handwerker at al, 1991), transmite o sinal

pelo corno da raiz dorsal e, então, a informação ascende pela via espinotalâmica

para regiões centrais do hipotálamo, ativando o córtex somatosensorial (Figura 2)

(Andrew, Craig, 2001).

As fibras C, classificadas como mecanicamente insensíveis (CMi), não

respondem a estímulos mecânicos, mas reagem a estímulos térmicos e químicos e,

somente cerca de 20% destas respondem a histamina (CMi[His+]). As fibras C

mecanicamente sensíveis (CMH) respondem a estímulos mecânicos, térmicos e

químicos (ex:. mucunaina), mas são fracamente responsivos a histamina (Figura 2)

(Andrew, craig, 2001; Schmeltz et al 2007).

Figura 2 - Ilustração esquemática das vias de condução para o prurido.

(a) fibras C polimodais ativadas por estímulos não histaminérgicos, mucanaina liberada de tricomas (cowhage), ativa PAR2 no terminal sensorial. (b) ativação das fibras CMi[hist+] por histamina e outros mediadores, como a bradicinina (agindo em receptores B1 e B2) e cloroquina, atuando em receptor MrgpA3. Essa ativação leva a liberação de mediadores pró-inflamatórios, como os neuropeptideos substância P (SP) e o peptídeo do gene da calcitonina (CGRP). (c) fibras aferentes polimodais C e CMi[hist+], estabelecem sinapses no corno da raiz dorsal da medula com os neurônios de projeção, que ascendem para o tálamo. FONTE: Davidson, Giesler (2010).

A histamina é encontrada em grandes quantidades nos grânulos

intracelulares de mastócitos e basófilos, sendo os mastócitos distribuídos

amplamente em todo o corpo. Essa amina atua via quatro diferentes subtipos de

receptores (H1, H2, H3 e H4), membros da família de receptores acoplados à

proteína G (GPCR). As respostas inflamatória e pruritogênica são preferencialmente

reguladas via ativação de receptores H1 (Figura 2) (Hill et al., 1997; Oda et al.,

2000), mas posteriormente evidências mostraram que os receptores H4 também

modula a sensação de coceira (Bell et al 2004). Os receptores H1, quando

estimulados, ativam as proteína Gq (acoplado a H1), os quais as enzimas efetoras

fosfolipase C (PLC) cliva fosfatidilinositol 4,5 bifosfato em inositol trifosfato (IP3) e

diacilglicerol (DAG), se difunde pelo citosol ligando-se receptores que promovem

abertura de canais de Ca+, levando a resposta pruriceptiva (Woo et al., 2008).

Ademais, estudos sugerem que as ações da histamina podem ser moduladas

por receptores de potencial transitório do tipo valinóide 1 (TRPV1). Segundo Shim et

al., (2007), o tratamento de camundongos com o antagonista do TRPV1, a

capsazepina, reduziu o comportamento de coceira dos animais submetidos a injeção

intradérmica (i.d.) de histamina na pele dorsal, assim como foi reduzido o

comportamento de prurido em camundongos nocautes para o receptor TRPV1

quando comparado aos animais selvagens (Shim et al., 2007). Esses achados

sugerem que existe um mecanismo de cross talk entre os receptores TRPV1 e H1,

nas fibras C, visto que estas respondem tanto a histamina quanto ao agonista do

TRPV1, capsaicina (Nicolson et al., 2002), capaz de produzir prurido e,

principalmente, dor (Green, Shaffer, 1993).

Além da importância do TRPV1 na coceira regulada por histamina, dentre

outros mecanismos que conduzem o prurido independentemente da ativação dos

receptores de histamina, estão os receptores de potencial transitório do tipo

anquirina (TRPA1). Vale acrescentar que o protótipo aminoquinolínico, cloroquina,

cujo emprego como fármaco antipalúdico é bastante antigo, produz como efeito

colateral um prurido desagradável, independentemente de resposta alérgica

(histamina), que sugeriu-se ser mediado via ativação do receptor MrgprA3, membro

da família de receptores metabotrópicos Mrgpr (Mas-related G protein–coupled

receptor), localizados em neurônio sensoriais (Wilson et al., 2011). Curiosamente,

camundongos nocautes para os TRPA1 exibiram acentuada redução do prurido

induzido por cloroquina e o BAM8-22, um agonista endógeno do receptor MrgprC11,

quando comparados aos animais selvagens (Liu et al., 2009; Wilson et al., 2011).

Isto sugere o que, segundo Wilson et al (2011) a coceira induzida pelos agonistas

cloroquina e BAM8-22 seja dependente da co-participação de receptores TRPA1

como possível mecanismo de transdução de sinal do prurido em vias independentes

de histamina. Vale acrescentar que, em 1955, Shelley e Arthur, demonstraram que

uma substância ativa, denominada mucunaina, oriunda das espiculas da planta

Mucuna pruriens, membro da família das leguminosas, também conhecida como

café berão ou pó de mico, exerce propriedades pruriceptivas em humanos, que são

inibidas por altas temperaturas (>80 °C; Shelley, Arthur, 1957). Somente em 2008,

Reddy et al (2008) sintetizaram a mucunaina. Tal sustância ativa, mucunaina, é uma

protease de cisteina, que é capaz de clivar e ativar receptores ativados por protease

do tipo 2 e 4 (PAR 2 -4). Tais receptores, em particular o tipo PAR 2, ganharam

destaque como alvos regulatórios da inflamação neurogênica no início dos anos

2000 (Steinhoff et al., 2000) e, posteriormente, na regulação de respostas sensitivas,

tal como o prurido independente de vias histaminérgicas (Steinhoff et al., 2003).

Apesar da mucunaina produzir coceira com formação de eritema via ativação do

PAR2, essa substância não promove extravasamento plasmático (edema; Johanek

et al., 2007).

Existem quatro tipos de receptores ativados por protease (PARs) PAR -1, -2, -

3 e -4, todos membros da família de receptores acoplados a proteína G (GPCRs),

ativados por uma clivagem proteolítica no porção N-terminal. O receptor PAR-1 foi o

primeiro a ser clonado e originalmente identificado como um receptor sensível para

trombina (Ghandi et al., 2011), assim como os receptores PAR-3 e PAR-4. O

receptor PAR-2, envolvido no prurido, é também sensível a uma série de proteases

de serina (Stefansson et al., 2008) e cisteina (Bocheva et al., 2009). A clivagem da

porção N-terminal desse receptor, promove alteração conformacional nessa, que

leva a auto ativação do receptor. Tal processo permite a ativação de segundos

mensageiros, como as proteínas quinases (PKA), PKC e PKD), que fosforilam e

sensibilizam os receptores TRPV1, -4 e TRPA1. Isto resulta no aumento do influxo

de cálcio (Ca2+), liberação de prostaglandina E (PGE) e da substância P (SP) das

fibras sensitivas, que pode resultar, dependendo da quantidade e local, estimulos

doloroso e/ou pruriceptivo (Bao et al., 2014).

Os receptores PAR-2, além de expressos em neurônios (porção terminal de

fibras sensitivas do tipo CMH), encontra-se expresso em uma variedade de células e

tecidos, incluindo os queratinócitos (Tsujii et al., 2009), células endoteliais,

mastócitos, neutrófilos e células dendríticas (Guenther, Melzig, 2015). Por exemplo,

a injeção do agonista PAR-2, SLIGRL, em pele dorsal de camundongos promoveu

prurido nesses animais (Ikoma et al 2005); entretanto achados do nosso grupo por

Coavoy-Sanchez et al (2016) mostraram que, o emprego do antagonista de receptor

TRPA1, HC030031, foi capaz de inibir significativamente o prurido evocado por

SLIGRL nos animais, demonstrando assim que o receptor TRPA1 pode mediar a

coceira induzida pelo agonista PAR -2.

Independentemente da causa do prurido, o ato de coçar-se repetidamente e

com intensidade variada, pode levar ao agravamento do quadro inflamatório local,

pois esse comportamento promove lesão cutânea e ativação de células residentes e

do sistema complemento, levando ao quadro de inflamação local, visto que

mediadores do sistema complemento liberados no local (C3a, C4a e C5a) ativam

mastócitos e basófilos que, subsequentemente, desgranulam e liberam histamina e

outros conteúdos presentes nessas células. Por seu turno, a histamina evoca

também alterações na microcirculação cutânea, tais como aumento da

permeabilidade vascular e, subsequentemente, extravasamento plasmático (edema)

e influxo local de células inflamatórias (Hardman et al., 2006; Majeski et al., 2007).

1.4 Justificativa para o desenvolvimento do projeto

A coceira é definida a mais de 300 anos como “uma sensação cutânea

desagradável que provoca o desejo de se coçar” (Rothman, 1941) que,

diferentemente da dor, que é definida pela Associação Internacional para Estudo da

Dor (International Association for the Study of Pain – IASP) como “uma experiência

sensorial e emocional desagradável associada à lesão ou potencial lesão tecidual”.

A coceira intensa e/ou prolongada é altamente debilitante, podendo afetar

drasticamente a vida social e a saúde mental dos pacientes. O entendimento dos

mecanismos associados ao prurido, bem como o desenvolvimento de novas

estratégias de tratamento, mais específicos e adequados para cada paciente, capaz

de promover melhora na qualidade de vida desses indivíduos (Stander, Weisshaar,

2012).

O emprego terapêutico isolado ou em conjunto de fármacos anti-histamínicos

H1 além dos corticosteroides, constitui um dos tratamentos de escolha para o

controle do prurido agudo ou crônico (Klein et al., 1999; Leslie et al., 2015). Apesar

disto, alguns pacientes são resistentes a essa terapia e, ainda, existe o

inconveniente de efeitos colaterais na terapia de longa duração (Criado et al., 2010;

Hong et al., 2011). Além das terapias clássicas, existe a possibilidade de terapias

menos convencionais, como a injeção de anticorpos monoclonais, que podem

conferir rápido alivio dos sintomas a curto prazo, mas apresentam alto custo, mesmo

quando comparado ao auto custo gerado pelo tratamento convencional por longos

períodos (Weisshaar, Szepietowski, 2012).

Diante do exposto, a busca por novas alternativas terapêuticas, capazes de

promover o alivio da coceira e inflamação cutânea, muitas vezes relacionada, ao

mesmo tempo que não promovam efeitos adversos se faz necessária.

2 OBJETIVO

Investigar, via emprego de abordagens farmacológicas, celulares e

bioquímicas, o efeito do extrato da glândula salivar (EGS) de mosquitos fêmeas da

espécie Aedes aegypti em respostas pruriceptiva e inflamatória aguda frente à

administração de estímulos regulados por vias histaminérgica e não histaminérgica

em pele dorsal de camundongos.

3 CONCLUSÕES E PERPECTIVAS FUTURAS

1. Foi demonstrado que o EGS do mosquito Aedes aegypti, nas doses testadas, em

pele dorsal de camundongos foi capaz de inibir o prurido e a inflamação cutânea

(extravasamento plasmático e aumento da atividade da mieloperoxidase) frente ao

pelo C48/80, indicando que componentes bioativos presentes no EGS podem atuar

em vias histaminérgicas, mas não sobre a estabilidade da membrana de mastócitos,

visto que esse extrato não preveniu a desgranulação dessas céulas;

2. Demonstrou-se ainda que o EGS do mosquito Aedes aegypti reduziu, embora que

parcialmente, as respostas pruriceptivas (ou inflamatória neurogênica) evocadas por

agonistas dos receptores PAR-2 (SLIGRL), Mrgpr (cloroquina), TRPA1 (AITC) e

TRPV1 (capsaicina), sugerindo que outros componentes ativos presentes nesse

EGS atuam bloqueando mecanismos pruriceptivos não histaminérgicos;

3. A caracterização de componentes bioativos presentes no EGS do mosquito fêmea

Aedes aegypti, possui um potencial elevado com a descoberta de novas moléculas

capazes de controlar e / ou tratar os sintomas de prurido em doenças sensíveis e

resistentes aos anti-histamínicos clássicos.

REFERÊNCIAS

Allen JR, West AS. Some properties of oral secretion from Aedes aegypti (L.). Exp Parasitol. 1966 Aug;19(1):124-31. Almeida TF, Roizenblatt S, Tufik S. Afferent pain pathways: a neuroanatomical review. Brain res.2004;1000(1-2):40-56. Alvarez P, Carrillo E, Vélez C. Regulatory systems in bone marrow for hematopoietic stem/progenitor cells mobilization and homing. BioMed Res Int. 2013. Andrade EL, Meotti FC, Calixto JB. TRPA1 antagonists as potential analgesic drugs. Pharmacol Ther. 2012; (v)133:189–204. Andrew D, Craig AD. Spinothalamic lamina I neurons selectively sensitive to histamine: a central neural pathway for itch. Nat Neurosci. 2001 Jan;4(1):72-7. Andrew D, Craig AD. Spinothalamic lamina I neurons selectively sensitive to histamine: a central neural pathway for itch. Nat Neurosci. 2001;4(1):72-7. Arthur RP, Shelley WB. Experimental evidence for an enzymatic basis for itching in man. Nature. 1955;175:901–902 Asada H, Saito-Katsuragi M, Niizeki H. Mosquito salivary gland extracts induce EBV-infected NK cell oncogenesis via CD4 T cells in patients with hypersensitivity to mosquito bites. J Invest Dermatol 2005; 125:956-961. Assumpcao TCF, Ribeiro JMC, Francischetti IMB. Disintegrins from Hematophagous Sources. Toxins (Basel). 2012 May; 4(5): 296–322. Bairey O, Goldschmidt N, Ruchlemer R, Tadmor T, Rahimi-Levene N, Yuklea M, Shvidel L, Berrebi A, Polliack A, Herishanu Y; Israeli Chronic Lymphocytic Leukemia Study Group (ICLLSG). Insect-bite-like reaction in patients with chronic lymphocytic leukemia: a study from the Israeli Chronic Lymphocytic Leukemia Study Group. Eur J Haematol. 2012 Dec;89(6):491-6. Barreto, ML; Teixeira MG. Dengue no Brasil: situação epidemiológica e contribuições para uma agenda de pesquisa. Estud. av. 2008. vol.22 no.64 São Paulo Dec. Barros MS, Gomes E, Gueroni DI, Ramos AD, Mirotti L, Florsheim E, Bizzarro B, Lino CN, Maciel C, Lino-Dos-Santos-Franco A, Tavares-de-Lima W, Capurro ML, Russo M, Sá-Nunes A. Exposure to Aedes aegypti Bites Induces a Mixed-Type Allergic Response following Salivary Antigens Challenge in Mice. PLoS One. 2016 May 20;11(5):e0155454. Bautista DM, Pellegrino M, Tsunozaki M. TRPA1: a gatekeeper for inflammation. Annu Rev Physiol. 2013; (v)75:181–200

Bell JK, McQueen DS, Rees JL. Involvement of histamine H4 and H1 receptors in scratching induced by histamine receptor agonists in Balb C mice. Br J Pharmacol. 2004;142(2):374-80. Bissonnette EY, Rossignol PA and Befus AD. Extracts of mosquito salivary gland inhibit tumour necrosis factor alpha release from mast cells. Parasite Immunol 1993;15:27-33. Bizzarro B, Barros Ms; Maciel C; Gueroni DI; Lino CN; Campopiano J; Kotsyfakis M; Amarante-Mendes, Gustavo P; Calvo E; Capurro ML; Sa-Nunes A. Effects of Aedes aegypti salivary components on dendritic cell and lymphocyte biology. Parasites & Vectors; v. 6, nov 15 2013. Bocheva G, Rattenholl A, Kempkes C. Role of matriptase and proteinase-activated receptor-2 in nonmelanoma skin cancer. J Invest Dermatol. 2009;129((7)):1816–23. Calvo E, Mans BJ, Andersen JF, Ribeiro JM. Function and evolution of a mosquito salivary protein family. J Biol Chem. 2006 Jan 27;281(4):1935-42. Church MK, Levi-Schaffer F. The human mast cell. J Allergy Clin Immunol. 1997; 99(2):155-60. Coavoy-Sánchez SA, Rodrigues L, Teixeira SA, Soares AG, Torregrossa R, Wood ME, Whiteman M, Costa SK, Muscará MN. Hydrogen sulfide donors alleviate itch secondary to the activation of type-2 protease activated receptors (PAR-2) in mice. Pharmacol Res. 2016 Nov;113(Pt A):686-694. Consoli RAGB, Williams P. Aspects of the biology of laboratory-reared female Aedes fluviatilis. Mosquito News. 1981; vol.41(1):30-36 Consoli RAGB, OLIVEIRA RL. Principais mosquitos de importância sanitária no Brasil. Rio de Janeiro: Editora FIOCRUZ, 1994. 228 p. ISBN 85-85676-03-5. Conway MJ, Londono-Renteria B, Troupin A, Watson AM, Klimstra WB, Fikrig E, Colpitts TM. Aedes aegypti D7 Saliva Protein Inhibits Dengue Virus Infection. PLoS Negl Trop Dis. 2016 Sep 15;10(9):e0004941. Cook-Mills JM, Marchese ME, Abdala-Valencia H. Vascular cell adhesion molecule-1 expression and signaling during disease: regulation by reactive oxygen species and antioxidants. Antioxid Redox Signal. 2011 (v)15:1607-38. D’Andrea MR, Derian CK, Leturcq D. et al. Characterization of protease-activated receptor-2 immunoreactivity in normal human tissues. J Histochem Cytochem. 1998; (v)46:157–64 Davidson S, Giesler GJ. The multiple pathways for itch and their interactions with pain. Trends Neurosci. 2010 Dec;33(12):550-8. de Vasconcelos DI, Leite JA, Carneiro LT, Piuvezam MR, de Lima MR, de Morais LC, Rumjanek VM, Rodrigues-Mascarenhas S. Anti-inflammatory and antinociceptive activity of ouabain in mice. Mediators Inflamm. 2011;2011:912925.

Ohtsuka E, Kawai S, Ichikawa T, Nojima H, Kitagawa K, Shirai Y, Kamimura K, Kuraishi Y. Roles of mast cells and histamine in mosquito bite-induced allergic itch-associated responses in mice Jpn J. Pharmacol., 86 (2001), pp. 97–105 Ekundi-Valentim E, Mesquita FP, Santos KT, de Paula MA, Florenzano J, Zanoni CI, Rodrigues L, de Nucci G, Teixeira SA, Ferreira HH, Wallace JL, Costa SK, Muscará MN. A comparative study on the anti-inflammatory effects of single oral doses of naproxen and its hydrogen sulfide (H2S)-releasing derivative ATB-346 in rats with carrageenan-induced synovitis. Med Gas Res. 2013 Nov 16;3(1):24. Franco-Cereceda A, Henke H, Lundberg JM, Petermann JB, H ö kfelt T, Fischer JA. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) in capsaicin-sensitive substance P-immunoreactive sensory neurons in animals and man: distribution and release by capsaicin. Peptides, 1987; (2):399 – 410. Gandhi PS, Chen Z, Appelbaum E, Zapata F, Di Cera E. Structural basis of thrombin-protease-activated receptor interactions. IUBMB Life. 2011;63((6)):375–82. Gokul Sridharan and Akhil A Shankar. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. J Oral Maxillofac Pathol. 2012 May-Aug; 16(2): 251–255. Green BG, Shaffer GS (1993) The sensory response to capsaicin during repeated topical exposures: differential effects on sensations of itching and pungency. Pain 53:323–334. Griffiths RB, Gordon RM. , Ann. Trop. Med. Parasit., 46, 311 (1952). Guenther F, Melzig MF. Protease-activated receptors and their biological role - focused on skin inflammation. J Pharm Pharmacol. 2015 Dec;67(12):1623-33. Halme M, Pesonen M, Salo H, Soderstrom M, Pasanen M, Vahakangas K, Vanninen P. Comparison of in vitro metabolism and cytotoxicity of capsaicin and dihydrocapsaicin. J Chromatogr B. Analyt Technol Biomed Life Sci, 2016;1009 – 1010:17 – 24. Han SK, Mancino V, Simon MI. Phospholipase Cbeta 3 mediates the scratching response activated by the histamine H1 receptor on C-?ber nociceptive neurons. Neuron 2006; 52:691-703. Handwerker HO, Forster C, Kirchhoff C. Discharge patterns of human C-fibers induced by itching and burning stimuli. Neurophysiol 1991; 66:307–15. Hang L, Dong X. Itch mechanisms and circuits. Annu Rev Biophys. 2014;43:331-55. Hill SJ, Ganellin CR, Timmerman H, Schwartz JC, Shankley NP, Young JM, Schunack W, Levi R, Haas HL. International Union of Pharmacology. XIII. Classification of histamine receptors. Pharmacol Rev. 1997;49(3):253-78. Hong J, Buddenkotte J, Berger TG, Steinhoff M. Management of itch in atopic dermatitis. Semin Cutan Med Surg. 2011;30(2):71–86.

Hudson A, Bowman L, Orr CW: Effects of absence of saliva on blood feeding by mosquitoes. Science 1960; 131:1730–1731. Ikoma A, Handwerker H, Miyachi Y, Schmelz M. Electrically evoked itch in humans. Pain. 2005;113(1-2):148-54. Ikoma A, Steinhoff M, Ständer S, Yosipovitch G, Schmelz M. The neurobiology of itch. Nat Rev Neurosci. 2006 Jul;7(7):535-47. James AA, Blackmer K, Marinotti O, Ghosn CR, Racioppi JV: Isolation and characterization of the gene expressing the major salivary gland protein of the female mosquito, Aedes aegypti . Mol Biochem Parasitol 1991; 44:245–253. Johanek LM, Meyer RA, Hartke T, et al. Psychophysical and physiological evidence for parallel afferent pathways mediating the sensation of itch. J Neurosci. 2007;27(28):7490-7. Judith Hong, Joerg Buddenkotte, Timothy G. Berger, Martin Steinhoff. Management of Itch in Atopic Dermatitis. Semin Cutan Med Surg. 2011 Jun; 30(2): 71–86. Juneja HS, Schmalsteig FC, Lee S, et al. Vascular cell adhesion molecule-1 and VLA-4 are obligatory adhesion proteins in the heterotypic adherence between human leukemia/lymphoma cells and marrow stromal cells. Exp Hematol. 1993; (v)21:444–50. Jurberg JR, Juliana MS, Moreira FFF; Dale C; Cordeiro IRS; Lamas-Júnior VD; Galvão C; Rocha DS. Atlas iconográfico dos triatomíneos do Brasil (vetores da doença de Chagas). Rio de Janeiro; IOC; 2014. 52 p. ilus. Kittaka H, Tominaga M. The molecular and cellular mechanisms of itch and the involvement of TRP channels in the peripheral sensory nervous system and skin. Allergol Int. 2017 Jan;66(1):22-30. Klein PA, Clark RA. An evidence-based review of the efficacy of antihistamines in relieving pruritus in atopic dermatitis. Arch Dermatol. 1999;3:1522–1525. Klemke M, Weschenfelder T, Konstandin MH, et al. High affinity interaction of integrin alpha4beta1 (VLA-4) and vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) enhances migration of human melanoma cells across activated endothelial cell layers. J Cell Physiol 2007; (v)212:368–74. Kumar GL, Kiernan JA. 2nd ed. Dako North America, California: 2010. Education guide: Special stains and H & E Leslie TA, Greaves MW, Yosipovitch G. Current topical and systemic therapies for itch. Handb Exp Pharmacol. 2015;226:337-56. Linard PM. Checklist de Siphonaptera (Insecta) do Estado de São Paulo. Biota Neotrop. vol.11 supl.1 Campinas Jan./Dec. 2011.

Liu Q, Tang Z, Surdenikova L, Kim S, Patel KN, Kim A, Ru F, Guan Y, Weng HJ, Geng Y, Undem BJ, Kollarik M, Chen ZF, Anderson DJ, Dong X. Sensory neuron-specific GPCR Mrgprs are itch receptors mediating chloroquine-induced pruritus. Cell. 2009;139(7):1353-65. Majeski CJ, Johnson JA, Davison SN, Lauzon GJ. Itch severity scale: a self-report Instrument for the measurement of pruritus severity. Br J Dermatol 2007;156:667-73 Mans BJ, Gaspar AR, Louw AI, Neitz AW. Apyrase activity and platelet aggregation inhibitors in the tick Ornithodoros savignyi (Acari: Argasidae) Exp Appl Acarol. 1998;22:353–366. Mans BJ, Neitz AW. Adaptation of ticks to a blood-feeding environment: evolution from a functional perspective. Insect Biochem Mol Biol. 2004a;34:1–17. Mellanby K. Man's reaction to mosquito bites. Nature. 1946 Oct 19;158(4016):554. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Levantamento Rápido de Índices para Aedes aegypti LIRAa – para Vigilância Entomológica do Aedes aegypti no Brasil, 2015. Nicolson TA, Bevan S, Richards CD. Characterisation of the calcium responses to histamine in capsaicin-sensitive and capsaicin-insensitive sensory neurones. Neuroscience. 2002;110(2):329-38. Oda T, Morikawa N, Saito Y, Masuho Y, Matsumoto S. Molecular cloning and characterization of a novel type of histamine receptor preferentially expressed in leukocytes. J Biol Chem. 2000;275(47):36781-6. Oh MH, Oh SY, Lu J, Lou H, Myers AC, Zhu Z, Zheng T. TRPA1-dependent pruritus in IL-13-induced chronic atopic dermatitis. J Immunol. 2013; (v)11:5371–5382. Ohtsuka E, Kawai S, Ichikawa T, Nojima H, Kitagawa K, Shirai Y, Kamimura K, Kuraishi Y. Roles of mast cells and histamine in mosquito bite-induced allergic itch-associated responses in mice Jpn J. Pharmacol., 86 (2001), pp. 97–105 OMS(2016). Zika Situation Report. 5 february, 2016. Peng Z, Li H, Simons FE: Immunoblot analysis of salivary allergens in 10 mosquito species with worldwide distribution and the human IgE responses to these allergens. J Allergy Clin. Immunol 1998; 101:498–505. Peng Z, Xu W, James AA, Lam H, Sun D, Cheng L, Simons FE: Expression, purification, characterization and clinical relevance of rAed a 1–a 68-kDa recombinant mosquito Aedes aegypti salivary allergen. Int Immunol 2001; 13:1445–1452. Peng Z, Xu W, Lam H, Cheng L, James AA, Simons FE: A new recombinant mosquito salivary allergen, rAed a 2: allergenicity, clinical relevance, and cross-reactivity. Allergy 2006;61:485–490.

Peng Z, Simons FE. A prospective study of naturally acquired sensitization and subsequent desensitization to mosquito bites and concurrent antibody responses. J Allergy Clin Immunol. 1998 Feb;101(2 Pt 1):284-6. Peng Z, Xu W; James AA; Lam H; Sun D; Cheng L; Simons FE. Expression, purification, characterization and clinical relevance of rAed a 1--a 68-kDa recombinant mosquito Aedes aegypti salivary allergen. Int Immunol. 2001 Dec;13(12):1445-52. Peng Z; Xu WW; Sham Y; Lam H; Sun D; Li C; Rasic NF; Guan Q; James AA; Simons FE. Mosquito salivary allergen Aed a 3: cloning, comprehensive molecular analysis, and clinical evaluation. Allergy, 2016 May;71(5):621-8. Pozsgai G, Payrits M, Sághy É, Sebestyén-Bátai R, Steen E, Szőke É, Sándor Z, Solymár M, Garami A, Orvos P, Tálosi L, Helyes Z, Pintér E. Analgesic effect of dimethyl trisulfide in mice is mediated by TRPA1 and sst(4) receptors. Nitric Oxide. 2017 May 1;65:10-21. Rainsford KD, Parke AL, Clifford-Rashotte M, Kean WF. Therapy and pharmacological properties of hydroxychloroquine and chloroquine in treatment of systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis and related diseases. Inflammopharmacology. 2015 Oct;23(5):231-69. Rajka G. Itch duration in the involved skin of atopic dermatitis (prurigo Besnier). Acta Derm Venereol. 1967; (v)47:154–7. Reddy VB, Iuga AO, Shimada SG, LaMotte RH, Lerner EA. Cowhage-evoked itch is mediated by a novel cysteine protease: A ligand of protease-activated receptors. J. Neurosci. 2008;28:4331–4335. Reddy VB, Sun S, Azimi E, Elmariah SB, Dong X, Lerner EA. Redefining the concept of protease-activated receptors: cathepsin S evokes itch via activation of Mrgprs. Nat Commun. 2015; (v)6:7864. Reunala T, Brummer-Korvenkontio H, Palosuo K, Miyanij M, Ruiz-Maldonado R, Love A, Francois G, Palosuo T: Frequent occurrence of IgE and IgG4 antibodies against saliva of Aedes communis and Aedes aegypti mosquitoes in children. Int Arch Allergy Immunol 1994;104:366-371. Ribeiro JM, Francischetti IM. Role of arthropod saliva in blood feeding: sialome and post-sialome perspectives. Annu Rev Entomol. 2003;48:73-88. Ribeiro JM, Sarkis JJ, Rossignol PA, Spielman A. Salivary apyrase of Aedes aegypti: characterization and secretory fate. Comp Biochem Physiol B. 1984;79(1):81-6. Ribeiro JM. Blood-feeding in mosquitoes: probing time and salivary gland anti-haemostatic activities in representatives of three genera (Aedes, Anopheles, Culex). Med Vet Entomol. 2000 Jun;14(2):142-8.

Ribeiro JMC. 1995. Blood-feeding arthropods: live syringes or invertebrate pharmacologists? Infect. Agents Dis. 4:143–52 Rizzi CT, Carvalho-de-Souza JL, Schiavon E, Cassola AC, Wanke E, Troncone LR. Crotamine inhibits preferentially fast-twitching muscles but is inactive on sodium channels. Toxicon. 2007 Sep 15;50(4):553-62. Epub 2007 May 18. Rodrigues L, Ekundi-Valentim E, Florenzano J, Cerqueira AR, Soares AG, Schmidt TP, Santos KT, Teixeira SA, Ribela MT, Rodrigues SF, de Carvalho MH, De Nucci G, Wood M, Whiteman M, Muscará MN, Costa SK. Protective effects of exogenous and endogenous hydrogen sulfide in mast cell-mediated pruritus and cutaneous acute inflammation in mice. Pharmacol Res. 2017 Jan;115:255-266. Rothman S. Physiology of itch. Physiological Reviews Published 1 April 1941 Vol. 21 no. 2, 357-381 Ruppert EE & Barnes RD. Zoologia dos Invertebrados. 6 ed. São Paulo: Rocca, 1996. Sales-Campos H, de Souza PR, Basso PJ, Ramos AD, Nardini V, Chica JE, Capurro ML, Sá-Nunes A, de Barros Cardoso CR. Aedes aegypti salivary gland extract ameliorates experimental inflammatory bowel disease. Int Immunopharmacol. 2015 May;26(1):13-22. Sá-Nunes A, Bafica A, Lucas DA, Conrads TP, Veenstra TD, Andersen JF, Mather TN, Ribeiro JM, Francischetti IM. Prostaglandin E2 is a major inhibitor of dendritic cell maturation and function in Ixodes scapularis saliva. J Immunol. 2007 Aug 1;179(3):1497-505. Savin JÁ. How we should define itching? J Am Acad Dermatol. 1998;39(2 Pt1)268-9 Schmelz M, Schmidt R, Bickel A, Handwerker HO, Torebjörk HE. Specific C-receptors for itch in human skin. J Neurosci. 1997;17(20):8003-8. Schneider BS, Soong L, Coffey LL, Stevenson HL, McGee CE, Higgs S.. Aedes aegypti saliva alters leukocyte recruitment and cytokine signaling by antigen-presenting cells during West Nile virus infection. PLoS One. 2010 Jul 22;5(7):e11704. Shim WS, Tak MH, Lee MH, Kim M, Kim M, Koo JY, Lee CH, Kim M, Oh U. TRPV1 mediates histamine-induced itching via the activation of phospholipase A2 and 12-lipoxygenase. J Neurosci. 2007;27(9):2331-7. Simons FE; Peng Z. Mosquito allergy: recombinant mosquito salivary antigens for new diagnostic tests. Int Arch Allergy Immunol. 2001 Jan-Mar;124(1-3):403-5. Skaehill PA. Tacrolimus in dermatologic disorders. Ann Pharmacother. 2001; (v)35(5):582-8. Ständer S, Steinhoff M, Schmelz M, Weisshaar E, Metze D, Luger T. Neurophysiology of pruritus: cutaneous elicitation of itch. Arch Dermatol. 2003;139(11): 1463-70

Ständer S, Weisshaar E, Mettang T, Szepietowski JC, Carstens E, Ikoma A,Bergasa NV, Gieler U, Misery L, Wallengren J, Darsow U, Streit M, Metze D, Luger TA, Greaves MW, Schmelz M, Yosipovitch G, Bernhard JD. Clinical classification of itch: a position paper of the International Forum for the Study of Itch. Acta Derm Venereol. 2007;87(4):291-4 Ständer S, Weisshaar E. Medical treatment of pruritus. Expert Opin Emerg Drugs. 2012 Sep;17(3):335-45. Stefansson K, Brattsand M, Roosterman D, Kempkes C. et al. Activation of proteinase-activated receptor-2 by human kallikrein-related peptidases. J Invest Dermatol. 2008;128((1)):18–25. Steinhoff M, Corvera CU, Thoma MS. et al. Proteinase-activated receptor-2 in human skin: Tissue distribution and activation of keratinocytes by mast cell tryptase. Exp Dermatol. 1999; (v)8:282–94. Steinhoff M, Neisius U, Ikoma A. et al. Proteinase-activated receptor-2 mediates itch: A novel pathway for pruritus in human skin. J Neurosci. 2003;23((15)):6176–80 Steinhoff M, Vergnolle N, Young SH. et al. Agonists of proteinase-activated receptor 2 induce inflammation by a neurogenic mechanism. Nat Med. 2000;6((2)):151–8. Stephen Rothman. Physiological Reviews Published 1 April 1941 Vol. 21 no. 2, 357-381. Assumpcao TCF. Disintegrins from Hematophagous Sources. TOXINS, vol. 4, no. 5, 26 April 2012 (2012-04-26), p. 296-322 Tsujii K, Andoh T, Lee JB, Kuraishi Y. Activation of proteinase-activated receptors induces itch-associated response through histamine-dependent and-independent pathways in mice. J Pharmacol Sci. 2008;108(3):385-8. Twycross R, Greaves MW, Handwerker H, Jones EA, Libretto SE, Szepietowski JC, Zylicz Z. Itch: scratching more than the surface. QJM. 2003;96(1):7-26. Valenta R, Lidholm J, Niederberger V, Hayek B, Kraft D, Gronlund H: The recombinant allergen-based concept of component resolved diagnostics and immunotherapy (CRD and CRIT). Clin Exp Allergy 1999; 29:896–904. Wahlgren CF. Measurement of itch. Semin Dermatol. 1995; 14(4):277-84 Walter Reed Biosystematics Unit (WRBU). Systematic Catalog of Culicidae. Disponível em: http://www.mosquitocatalog.org/default.aspx. Acessado em: 12/12/2016. Wasserman HA. Singh S. Champagne DE. Saliva of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, modulates murine lymphocyte function. Parasite Immunol. ;2004;26:295–306.

Weisshaar E, Szepietowski JC,Darsow U, et al. European Guideline on chronic pruritus. Acta Derm Venereol 2012;92:563-81 Wilson SR, Gerhold KA, Bifolck-Fisher A, Liu Q, Patel KN, Dong X, Bautista DM. TRPA1 is required for histamine-independent, Mas-related G protein-coupled receptor-mediated itch. Nat Neurosci. 2011;14(5):595-602. Woo DH, Jung SJ, Zhu MH, Park CK, Kim YH, Oh SB, Lee CJ. Direct activation of transient receptor potential vanilloid 1(TRPV1) by diacylglycerol (DAG). Mol Pain. 2008;4:42. Yang NN, Shi H, Yu G, Wang CM, Zhu C, Yang Y, Yuan XL, Tang M, Wang ZL, Gegen T, He Q, Tang K, Lan L, Wu GY, Tang ZX. Osthole inhibits histamine-dependent itch via modulating TRPV1 activity. Sci Rep. 2016 May 10; v6:256. Yanju Bao, Wei Hou, Baojin Hua. Protease-activated receptor 2 signalling pathways: a role in pain processing. Expert Opin Ther Targets. 2014 Jan;18(1):15-27. Yosipovitch G, David M. The diagnostic and therapeutic approach to idiopathic generalized pruritus. Int J Dermatol. 1999; (v)38: 881–887. Yu Y, Blokhuis BR, Garssen J, Redegeld FA. Non-IgE mediated mast cell activation. Eur J Pharmacol. 2016 May 5;778:33-43.