Métodos de Análise de Expressão Gênica

André F. de CamargoGuilherme M. G. Filho

Leonardo Lima

Os avanços na genética molecular têm aberto novas perspectivas para elucidar a relação entre os genes e seus fenótipos.

Essas tecnologias podem ser utilizadas para o estudo dos mecanismos moleculares envolvidos em processos biológicos importantes.

Introdução

A expressão deve ser medida sob condições experimentais e ambientais

Abordagens

Estresse vs. basal

(Laboratório ou natureza)

In vitro vs. in vivo

Estudo funcional X Análise global

Gene único vs. Múltiplos genes

• Os genes são expressos através da transcrição do DNA em um mRNA simples fita;

O mRNA é posteriormente traduzido em uma proteína;

A expressão do mRNA representa o aspecto dinâmico de uma célula.

Dados importantes

Histórico da Análise da Expressão Gênica

Ano Acontecimento

1965 Sequenciamento da primeira molécula de RNA;

1977 Desenvolvimento da técnica “Northern blotting” e o Método de Sequenciamento de Sanger;

1989 Relatos de experiências de RT-PCR para análise do transcriptoma;

1991 Primeiro estudo de sequenciamento “EST de alto rendimento”;

1992 Introdução da Exibição Diferencial, para a descoberta de genes expressos deferentemente;

1995 Relatos de MICROARRAY e dos Métodos de análise serial da expressão gênica (SAGE);

2001 Projeto do genoma humano concluído;

2005 Tecnologia de sequenciamento de primeira geração introduzido no mercado;

2006 Os primeiros estudos de sequenciamento de Transcriptona usando uma tecnologia de próxima geração (454/ROCHE).

Dentro deste contexto podemos citar as seguintes técnicas:

Northern Blotting; RT (reverse transcriptase) PCR; Microarranjo e Macroarranjo de DNA; Differential Display of RNA; Análise de ESTs; Real Time PCR; SAGE; RNAseq;

Métodos para análise da Expressão Gênica

Northern blotting é uma técnica para detecção de sequências de RNA específicas.

Desenvolvido por James Alwine e George Stark na Universidade de Stanford em

1979.

Northern Blotting

O RNA é isolado a partir de

várias amostras biológicas (por

exemplo, vários tecidos,

diferentes fases de

desenvolvimento do mesmo

tecido, etc)? * RNA é mais

susceptível à degradação do que

o DNA.

Passos envolvidos com Northern blotting

membrana é lavada para remover a sonda não ligada

Agora, os padrões da sequência de

interesse nas diferentes amostras de

expressão podem ser comparados.

A sonda marcada é detectada através de autorradiografia ou através de uma reação de quimioluminescência (se quimicamente uma

sonda marcada é utilizada)

Em ambos os casos, isto resulta na

formação de uma banda escura sobre uma

película de raios-X.

Um padrão para o estudo da expressão de genes ao

nível de RANm (transcrição de RNA mensageiro)

Estudar a degradação do RNA

Estudar o splicing do RNA

Estudar a meia vida do RNA

Aplicações

O método de Northern Blot padrão é relativamente

menos sensível do que outros ensaios

Detecção com sondas múltiplas é um problema

Se as amostras de RNA são ligeiramente degradada por

ARNases, a qualidade dos dados e quantificação de

expressão será afetada negativamente.

Desvantagem do Northern blotting

RT-PCR  é uma de muitas variantes de reação em cadeia da polimerase (PCR);

É o método mais sensível para a detecção e quantificação de mRNA disponível no momento, podendo ser utilizada para quantificar os níveis de mRNA a partir de amostras muito pequenas.

O objetivo dessa técnica é analisar se o gene está ou não sendo expresso.

RT-PCR

Trasncriptase Reversa

Sequenciamento

biologia12c.wordpress.com/2010/01/14/dna-complementar-cdna/

Benefícios:

Maior reprodutibilidade Sensibilidade Análise quantitativa

Acompanhamento da reação de forma mais rápida e precisa

PCR em Tempo Real

Quantificar o número de cópias de um gene (templete/molde)

Amplificação e detecção em um único passo + componentes fluorescentes:

◦ o produto da PCR + a intensidade de fluorescência

Maior a quantidade de DNA alvo inicial = mais rápido mento da fluorescência;

Requer muito menos RNA

PCR em Tempo Real

Fluoróforos

TaqMan®,

Sybr®Green

Baixo custoSensibilidadeFacilidade de

trabalho Inespecificidade

Alta especificidade Caro

Curva de amplificação

Fase Geométric

a

Fase Linear

PCR em Tempo Real

Equipamento e reagentes caros;

É necessário um profundo conhecimento do equipamento e das técnicas de normalização.

Contras...

Essa técnica determina, simultaneamente, os níveis de expressão de milhares de genes (SCHENA et al., 1995)

São utilizados em experimentos de análise de expressão gênica em larga escala

Necessidade de se analisar a grande quantidade de informação gerada pelo sequenciamento genomico

Microarranjos de DNA (Chips de DNA)

Microarranjos de DNA (Chips de DNA)

Arranjo pré-definido de moléculas de DNA

(fragmentos de DNA genômico, cDNAs ou oligonucleotídeos)

quimicamente ligadas à uma superfície sólida

Passos relacionados Células cujo DNA possui os genes

de interesse são cultivadas em duas soluções

distintas: uma correspondendo à situação biológica normal (padrão),

outra correspondendo à situação a ser

estudada;

Recolhe-se o mRNA das duas soluções,

“marcando” os mRNA de cada solução

com uma substância fluorescente. Normalmente são utilizados corantes cy3 (verde) e cy5 (vermelho);

Passos relacionados

Passos relacionados 3. Os mRNA marcados são

misturados e aplicados nos microarranjos de DNA;

4. Ocorre a hibridização dos microarranjos com a

mistura de mRNA.

4. Ocorre a hibridização dos microarranjos com a mistura

de mRNA.

A base de um experimento envolvendo microarranjos de DNA é

o processo de hibridização. Somente os genes que

possuírem seqüências complementares aos mRNA

marcados deverão apresentar algum nível de expressão.

Os spots que contêm amostras marcadas com o fluoróforo cy3 devem aparecer na imagem como círculos verdes intensos, aqueles com amostras marcadas com o fluoróforo cy5 aparecem como círculos vermelhos, no caso de quantidades iguais dos dois corantes os círculos devem aparecer amarelos.

RNAseq Recentemente desenvolvida

◦ perfil de transcriptoma, utilizando tecnologias de deep-sequencing.

TRANSCRIPTOMA: o conjunto completo de transcritos (RNAs) em uma célula, e sua quantidade, para um estágio de desenvolvimento específico ou condição fisiológica.

RNAseq

RNA seq

RNAseq

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