ANDREZA NEGRELI SANTOS · Universidade Federal de Mato Grosso do Sul - UFMS Prof. Dr. Jeandre...

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL - UFMS

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS, ALIMENTOS E NUTRIÇÃO

PROGRAMA DE MESTRADO EM FARMÁCIA

ANDREZA NEGRELI SANTOS

Empregabilidade de testes de genética toxicológica no estudo da evolução de danos

genéticos no estadiamento do carcinoma de células escamosas de cavidade oral e no

biomonitoramento de risco ocupacional a medicamentos antineoplásicos

Campo Grande - MS

2018

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Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Farmácia da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Farmácia.

Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Juliano Oliveira

Campo Grande - MS

2018

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Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Farmácia da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Farmácia.

COMISSÃO EXAMINADORA

Prof. Dr. Rodrigo Juliano Oliveira Universidade Federal de Mato Grosso do Sul - UFMS

Prof. Dr. Jeandre Augusto dos Santos Jaques Universidade Federal de Mato Grosso do Sul - UFMS

Profa. Dra. Dayana Doffinger Ramos Faculdade da Alta Paulista - FADAP

Campo Grande - MS

2018

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“Ninguém é suficientemente perfeito que não possa aprender com o outro e, ninguém é totalmente estruído de valores que não possa ensinar algo ao seu irmão”.

São Francisco de Assis.

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Agradecimentos

Senhor nosso Deus, obrigado por tudo, pela saúde e sabedoria no decorrer

desses anos. Cada momento me fez amadurecer e me tornar uma pessoa melhor.

Aos meus pais Agnaldo e Maria, meus irmãos André e Alex por estarem presentes,

pois não há palavras que expressem o meu amor e minha gratidão por tudo que

fizeram por mim.

Ao meu esposo Carlos, por fazer parte da minha vida, por me incentivar, ajudar,

apoiar e comigo resistir aos momentos difíceis, pois em sua dedicação e paciência,

me fez prosseguir.

Ao meu Orientador, professor Dr. Rodrigo Juliano Oliveira, que mesmo com

minhas limitações, me recebeu de forma fraternal, sempre prestativo e de prontidão

para repassar seu conhecimento. Sempre serei grata por me ajudar, por sua gentileza

e amizade.

Ao professor Dr. Roberto da Silva Gomes, por abrir seu laboratório, por contribuir

no experimento, pelas explicações e risadas nos momentos de descontração. À professora Dra. Andréa Luiza Cunha Laura, que me recebeu em momento tão

singular. Obrigado pelas contribuições.

Ao professor Dr. Jeandre Augusto dos Santos Jaques, por toda a sua atenção e

contribuição na correção da dissertação e participações nas bancas.

Ao professor Dr. Wilson de Barros Cantero, por sua contribuição na correção da

dissertação e participações nas bancas.

À minha amiga Dayana, por fazer parte da minha vida, pelos conselhos e palavras

de carinho, por me ajudar a chegar até aqui. Foi com você que tudo começou.

Ao meu amigo Lucas, por sua amizade e pela incomensurável parceria e ajuda

durante todo o mestrado.

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Agradecimentos

Aos Parças Lucas, Edwin, João, Raissa, Ana Paula, Bruno, Luana, Leal, Giovana,

Michel e aos Colegas do CeTroGen que de alguma forma me ajudaram durante o

mestrado, meu muito obrigado.

Aos colegas Farmacêuticos da Oncologia, pela disponibilidade e colaboração

durante as coletas.

A todos os professores que ministraram aulas durante o mestrado.

Ao Luiz da secretaria, pela disposição, apoio e amizade.

A CAPES pela ajuda financeira.

Meus sinceros agradecimentos a todos.

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RESUMO

SANTOS, Andreza Negreli. Empregabilidade de testes de genética toxicológica no estudo da evolução de danos genéticos no estadiamento do carcinoma de células escamosas de cavidade oral e no biomonitoramento de risco ocupacional a medicamentos antineoplásicos. 2018. Dissertação (Mestrado em Farmácia). Universidade Federal de Mato Grosso do Sul. Medicamentos antineoplásicos são cada vez mais utilizados para tratamento do câncer e, na genética toxicológica, a avaliação quantitativa dos riscos de mutação para o ser humano, de uma determinada substância, tem objetivo de desenvolver medidas preventivas, exposição ocupacional e ambiental. Todo o material genético que caracteriza cada espécie está contido na molécula de DNA, no núcleo das células, nos cromossomos. O desenvolvimento da neoplasia tem base genética e pode ocorrer a partir de lesões nos cromossomos, levando a formação dos oncogêneses, e também pode estar associado a falhas nos mecanismos de reparação e nos genes supressores tumorais. Na neoplasia de células escamosas da mucosa oral, que na maioria dos pacientes é tardiamente diagnosticada em estágios avançados (III ou IV), muitas vezes se utiliza antineoplásicos para tratamento. Esta terapia trás o risco de exposição ocupacional aos profissionais envolvidos e pacientes. Este estudo foi planejado com o objetivo de avaliar a empregabilidade de testes de genética toxicológica na pesquisa de danos ao DNA, de profissionais farmacêuticos e enfermeiros; e em pacientes diagnosticados com câncer de cavidade oral em diferentes estágios da doença. Utilizaram-se amostras de sangue para o ensaio do cometa, raspado da mucosa oral para o teste de micronúcleo e urina para pesquisa de ciclofosfamida (CP) por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas de profissionais que manuseiam antineoplásicos e; para pacientes com câncer oral foram utilizados raspado de mucosa oral para o ensaio do cometa, pesquisa de micronúcleo (MN), e apoptose. Foi encontrado um aumento estatisticamente significativo de danos nos linfócitos cultivados dos profissionais para o ensaio cometa; e nas células da mucosa oral dos pacientes com câncer de cavidade oral pelo teste do MN, quando comparados ao grupo controle (p<0,05). Também foi identificada a presença de N-trifluoroacetilado/CP nas amostras de urina no grupo de profissionais farmacêuticos e enfermeiros que manuseiam antineoplásicos (p>0,05). Palavras Chave: Biomonitoramento, Câncer de cavidade oral, Genética toxicológica, Exposição ocupacional.

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ABSTRACT The study of applicability of toxicological genetics tests in the evolution of genetic damage in staging of squamous cell carcinoma of the oral cavity and in biomonitoring of occupational risk to antineoplastic drugs. 2018. Dissertation (Master degree in Pharmacy). Federal University of Mato Grosso do Sul. Antineoplastic drugs are increasingly being used for cancer treatment and, in toxicological genetics, the quantitative assessment of the human mutation risk of a particular substance is intended to develop preventive measures or limits on therapeutic use, occupational and environmental exposure. All the genetic material that characterizes each species is contained in the DNA, in the nucleus of the cells, in the chromosomes. The development of malignant neoplasm is genetic and can occur from chromosome lesions, leading to the formation of oncogenes, and may also be associated with defects in repair mechanisms and in the tumor suppressor genes. In malignant squamous cell neoplasm of the oral mucosa, which in most patients is late diagnosed in advanced stages (III or IV), chemotherapy is often used for treatment. This therapy brings the risk of occupational exposure to the involved professionals and patients. This study was designed with the objective of evaluating the applicability of toxicological genetic tests in DNA damage research, of pharmacists and nurses; and in patients diagnosed with oral cancer at different stages of the disease using blood samples for the comet assay, micronucleus test (MN) in oral mucosa cells, and urine for cyclophosphamide (CP) screening by gas chromatography coupled to spectroscopy masses of professionals who handle antineoplastic and; for mouth cancer patients, oral mucosa scraping was used for the comet assay, micronucleus test, and apoptosis. A statistically significant increase of genetic damage was found in the cultured lymphocytes of professionals for the comet assay; and in the oral mucosa cells of patients with oral cancer by the MN test, when compared to the control group (p <0.05). The presence of N-trifluoroacetylated / CP in urine samples was also identified in the group of professionals who handled antineoplastic agents (p> 0.05). Key words: Biomonitoring, Oral cavity cancer, Toxicological genetics, Occupational exposure.

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SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS............................................................................................... 10

LISTA DE FIGURAS................................................................................................ 11

1. INTRODUÇÃO......................................................................................................... 12

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.................................................................................. 14

2.1. Formação e classificação do câncer........................................................................... 14

2.1.1. Oncogêneses e supressores tumorais......................................................................... 15

2.1.2. Metástases.................................................................................................................. 16

2.2. Câncer de cavidade oral ............................................................................................ 17

2.3. Protocolos de tratamentos.......................................................................................... 19

2.4. Medicamentos antineoplásicos.................................................................................. 21

2.5. Exposição ocupacional.............................................................................................. 22

3. ENSAIOS.................................................................................................................. 23

3.1. Genotoxicidade.......................................................................................................... 23

3.1.1. Ensaio do cometa....................................................................................................... 24

3.1.2. Ensaio de micronúcleo............................................................................................... 24

3.1.3. Morte celular.............................................................................................................. 24

3.2. Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas..................................... 25

3.2.1. Ciclofosfamida.......................................................................................................... 25

4. REFERÊNCIAS......................................................................................................... 27

5. OBJETIVOS............................................................................................................... 33

5.1. Objetivo geral............................................................................................................ 33

5.2. Objetivos específicos.................................................................................................. 33

6. MANUSCRITO I ..................................................................................................... 34

7. MANUSCRITO II ..................................................................................................... 46

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS..................................................................................... 58

ANEXOS.................................................................................................................... 59

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LISTA DE TABELAS

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................... 14

Tabela 1. Classificação do estadiamento do câncer de cavidade oral .................... 18

Tabela 2. Classificação dos estágios do câncer de cavidade oral ........................... 19

MANUSCRITO 1.................................................................................... 34

Tabela 1. Parâmetros dos grupos de estudo............................................................. 43

MANUSCRITO 2.................................................................................... 46

Tabela 1. Dados demográficos de profissionais expostos a antineoplásicos........... 55

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LISTA DE FIGURAS

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA....................................................................... 14

Figura 1. Progressão Tumoral........................................................................................ 14

Figura 2. Oncogenses..................................................................................................... 16

Figura 3. Estrutura da ciclofosfamida/CP........................................................................ 26

MANUSCRITO 1........................................................................................... 34

Figura 1. Resultados câncer cavidade oral..................................................................... 44

MANUSCRITO 2............................................................................................ 46

Figura 1. Estrutura de CP/N-trifluoroacetylated.............................................................. 50

Figura 2. Resultados dos ensaios genéticos.................................................................... 56

Figura 3. Resultados da análise CP na urina................................................................... 57

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1. INTRODUÇÃO

O desenvolvimento da sociedade cada vez mais expõe as pessoas ao contato com

inúmeros fatores capazes de produzirem mutações em células somáticas ou germinativas,

o que pode levar ao aparecimento de doenças como neoplasia maligna e malformações

(KATARKAR et al., 2014). A genética toxicológica, por sua vez, estuda possíveis efeitos

de fatores físicos, químicos, biológicos e ambientais, com o objetivo de contribuir para o

desenvolvimento de medidas de proteção das pessoas e limites de utilização de produtos

(WANG et al., 2017; ZEIGER, 2017) que possam causar danos no DNA e prejuízos para

os organismos (fauna, flora e humanos).

A pesquisa de dano genético é extensa e aplica-se, principalmente, a estudos de

genotoxicidade de produtos, biomonitoramento de populações específicas e

monitoramento ambiental e; ainda aplicações em células de tecidos humanos podem

trazer importantes informações para o diagnóstico, o prognóstico e o tratamento de

doenças, como é o caso do câncer (ZEIGER, 2017), bem como, para monitorar a

segurança de exposições ocupacionais (VYAS et al., 2014).

Na genética toxicológica é possível identificar danos à integridade do DNA e, as

alterações ocorridas podem ser de duas formas; a direta, que impende à duplicação com

incorporação de análogo de base, e a indireta, que bloqueia a duplicação, formando

dímeros, ligação cruzada e quebra em uma ou nas duas hélices do DNA (KATARKAR

et al., 2014). Uma lesão no DNA é seguida do processo de reparação, ocorrendo reparo

isento de erro, assim impedindo a mutação, ou o reparo submisso a erro, originando as

mutações. Quando o reparo não acontece, pode ocasionar o acúmulo de lesões dando

origem a uma célula tumoral (OLIVEIRA et al., 2015).

Alguns métodos de pesquisa de dano genético são utilizados, entre eles o ensaio

do cometa, o teste de micronúcleos e de morte celular por apoptose (BONASSI, 2011a;

SINGH et al., 2015; YADAV, JAGGI, 2015).

O ensaio do cometa baseia-se na avaliação de danos e reparos de DNA em células

individuais. As células são submetidas à solução de lise de membranas celulares, seguida

pela indução da migração eletroforética do DNA liberado em matriz de agarose,

migrando-se para em direção ao polo positivo, fazendo com que o nucleóide da célula

com DNA danificado apareça em forma de cometa, uma cauda. Quando observado ao

microscópio, a célula migrada adquire a forma aparente de um cometa, com cabeça, a

região nuclear, e cauda, que contém fragmentos ou fitas de DNA que migraram na direção

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do ânodo. A análise dos cometas baseia-se no grau de fragmentação do DNA e sua

migração pela eletroforese. Medidas como o comprimento total da "cauda" e a densidade

de DNA fornecem dados indiretos sobre o estado do DNA da amostra (KATARKAR et

al., 2014).

O micronúcleo, quando presente na célula, é um biomarcador de genotoxicidade

formado por fragmentos de cromossomo ou por cromossomos inteiros que sofrem atraso

na migração durante a anáfase e terminam por formar pequenos núcleos (BONASSI et

al., 2011b; KASSHYAP; REDDY, 2012; YADAV, JAGGI, 2015; SINGH et al., 2015).

A apoptose, um processo de morte celular programada para células que não são

mais necessárias ao organismo, é caracterizada pela presença de fragmentação do núcleo,

condensação da cromatina e picnose (SINGH et al., 2015).

O aumento de alterações relacionadas a apoptose pode acontecer em virtude de

danos genotóxicos, e pode relacionar-se ao processo de transformação maligna (WANG

et al., 2014).

O principal fator etiológico no câncer oral é o tabagismo associado ou não ao

alcoolismo (BRAGWATH; CHANDRA, 2014; RAJMOHAN et al., 2015; SINGH et al.,

2015). Os dois fatores parecem agir em sinergismo na gênese do dano celular; mas, nem

todos os indivíduos expostos desenvolvem o carcinoma de células escamosas de cavidade

oral, o que sugere uma predisposição genética ou multifatorial para a ocorrência dessa

neoplasia (SINGH et al., 2015; YADAV; JAGGI, 2015).

A associação do dano genético com falhas nos mecanismos de reparação são os

eventos moleculares que estão envolvidos com o início e a progressão da carcinogênese.

Isso pode ocasionar o aumento do número de pacientes que necessitam de tratamento

quimioterápico e, elevar o número de profissionais expostos durante o manuseio de

medicamentos na terapia oncológica (HON; ABUSITTA, 2016).

O tratamento atual de pacientes com câncer utiliza uma grande variedade de

medicamentos também conhecidos por antineoplásicos e/ou quimioterápicos;

medicamentos que são potencialmente mutagênicos, genotóxicos e teratogênicos para

humanos (BONASSI, 2011a; ZHANG et al., 2016). Portanto, profissionais expostos,

assim como pacientes, podem sofrer danos em genes de células somáticas e/ou células

germinativas, como proto-oncogenes e genes supressores tumorais o que poderia

desencadear o desenvolvimento de tumores (INCA, 2017; BOHLANDT et al., 2017).

Logo, é necessário que os riscos ocupacionais sejam minimizados e biomonitorados

(BOLZAN, 2011).

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Diante do exposto, este estudo teve o objetivo de avaliar a empregabilidade de

testes de genética toxicológica no estudo da evolução de danos genéticos no estadiamento

do carcinoma de células escamosas de cavidade oral e no biomonitoramento de risco

ocupacional de farmacêuticos e equipe de enfermagem que manuseiam medicamentos

antineoplásicos.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Formação e classificação do câncer

As alterações genéticas são a base primária da carcinogênese e esse processo, se

dá lentamente até que uma célula se torne mutada e dê origem ao tumor clinicamente

detectável (ZEIGER et al., 2017).

Os estágios para a alteração genética da célula são três (Figura 1), sendo eles: 1)

estágio de iniciação, onde as células sofrem o efeito de um agente carcinogênico

provocando modificações em alguns de seus genes. Nesta fase as células se encontram

geneticamente alteradas. Porém, ainda não é possível se detectar o tumor; 2) estágio de

promoção, onde as células geneticamente alteradas sofrem o efeito dos agentes

cancerígenos classificados como onco-promotores e a célula é transformada em célula

tumoral, de forma lenta e gradual; e 3) estágio de progressão, o último estágio, que se

caracteriza pela multiplicação descontrolada, sendo esta fase irreversível. Neste último

estágio o câncer já está instalado, evoluindo até o surgimento das primeiras manifestações

clínicas da doença (PANKAU et al., 2015).

Figura 1. Progressão tumoral. Fonte: INCA, 2017.

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Na fase de neoplasia maligna instalada, o tumor é classificado conforme o tecido

que o originou, ou seja, classificação primária. Assim, os principais são: 1) os carcinomas,

os mais comuns, aqueles originados de células de revestimento como a pele ou epitélios

de órgãos internos como a boca, o estômago, o intestino, a bexiga, o útero, os ovários, os

ductos mamários, a próstata e o pâncreas; 2) os sarcomas, originam-se de tecidos de apoio

como o tecido adiposo, ósseo, muscular e conjuntivo; 3) os linfomas, que se originam em

órgãos linfóides; 4) as leucemias, que tem origem mielóide ou linfóide; 5) os mielomas,

que são tumores originados de células plasmáticas ou plasmócitos (um subtipo de

linfócitos B) produzidos na medula óssea; 6) os melanomas, que se originam de células

(melanócitos) produtoras de pigmentos da pele (melanina); 7) os gliomas, que se originam

do tecido cerebral ou da medula espinhal; 8) os neuroblastomas, proveniente de células

neuronais embrionárias; e 9) os cânceres das células germinativas, que ocorre em células

específicas da linhagem reprodutiva dos testículos e ovários (INCA, 2017; MOURA et

al., 2016).

2.1.1. Oncogêneses e genes supressores tumorais

Os proto-oncogenes auxiliam no processo normal de proliferação celular e,

quando um proto-oncogene sofre mutação, se torna um gene deletério, chamado de

oncogene. Quando isso ocorre, as células tem seu crescimento desordenado, formando

um tumor (LIUZZI et al., 2007; PASMA et al., 2009).

Existem tumores que aparecem pela presença de mutações herdadas nos proto-

oncogeneses ocasionando a ativação da oncogênese (Figura 2). Processo que ocorre

lentamente para que uma célula prolifere e dê origem a um tumor aparente (ALMEIDA

et al., 2005; MIGNOGNA et al., 2002).

Genes supressores tumorais envolvem uma série de proteínas relacionadas ao

controle de mecanismos de proliferação celular e/ou apoptose. Quando ocorre algum erro

com esses supressores as células podem se dividir descontroladamente, levando ao câncer

(COLOMBO, RAHAL, 2009; LIUZZI et al., 2007).

A diferença entre oncogeneses e supressores tumorais é que, oncogenes procedem

da alteração e ativação dos proto-oncogene e os genes supressores ocasionam o câncer

quando inativados, pois não retardam a duplicação celular permitindo o reparo.

Normalmente, há necessidade de várias mutações para que uma célula se torne tumoral

(YUKI et al., 2016).

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2.1.2. Metástases

Além da capacidade de invadir por contiguidade os tecidos e órgãos vizinhos, o

tumor maligno pode comprometer outros tecidos e órgãos distantes por meio das

chamadas metástases. Para que uma célula tumoral seja metastática ela precisa adquirir a

capacidade de se desprender do tumor de origem e migrar para outros tecidos,

transportando-se através do interior de vasos sanguíneos ou linfáticos e disseminando-se

para órgãos distantes do tumor de origem, formando assim novas lesões, as metástases à

distância (COLOMBO, RAHAL, 2009; PASMA et al., 2009; YUKI et al., 2015).

Em estágios avançados estas células tumorais se multiplicam tão rápido que vão

substituindo as normais. Os tecidos perdem a capacidade funcional, o que leva à falência

do órgão invadido e a morte do paciente (EL-NAAJ et al., 2011).

No câncer não invasivo ou carcinoma in situ que é o primeiro estágio, a célula está

somente na camada superficial do tecido na qual se desenvolveu, sendo esta fase curável

desde que, tratado antes de se originar a fase do câncer invasivo, ou seja, a fase agressiva

que envolve outras partes do órgão ou do corpo, dando origem ao tumor metastático, que

exige um tratamento complexo e paliativo (PANKAU et al., 2015).

Figura 2. Oncogênese Fonte: Oncologia do Brasil, 2017.

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2.2. Câncer de cavidade oral

O câncer de cavidade oral é uma denominação que inclui os cânceres que afetam

os lábios e o interior da cavidade oral (OLIVEIRA et al., 2015). No Brasil, o câncer oral

representa o quinto tipo de câncer em incidência entre os homens e o sétimo entre as

mulheres (INCA, 2017). O Instituto Nacional do Câncer (INCA) estimou para 2016/2017

15.490 novos casos, sendo 11.140 homens e 4.350 mulheres. Também se estimou o

número de mortes de 5.401, sendo 4.223 homens e 1.178 mulheres (INCA, 2017).

Estudos relacionam a associação entre o câncer oral e a pobreza. Observa-se que

altas taxas de mortalidade e morbidade associam-se às áreas de baixo nível

socioeconômico. Logo, as características culturais do povo e a capacidade de acesso ao

tratamento e à tecnologia nos serviços públicos de saúde são escassas, e isso parece

determinar a variação da incidência do câncer de cavidade oral no mundo. Assim, em

países desenvolvidos, o câncer oral apresenta taxas de incidência e mortalidade menores

quando comparados aos países em desenvolvimento (CARVALHO et al., 2004).

A etiopatogenia do câncer é considerada de causa multifatorial e tem sido bastante

estudada a sua gênese, evolução e resposta à terapêutica. Alguns estudos moleculares têm

se destacado, como a participação da proteína p53, do oncogene H-ras, da proteína p16,

dentre outros, que possibilitaram avançar no conhecimento sobre a carcinogênese

(MIGNOGNA et al., 2002; MONTORO et al., 2008).

O câncer de cavidade oral ocorre, geralmente, em pacientes com idades a partir de

50 anos de vida, embora a incidência em indivíduos mais jovens venha aumentando na

última década. É mais comum em pessoas que utilizam agentes carcinogênicos

conhecidos, como o tabaco e álcool, por tempo suficiente para gerar e acumular mutações

nos tecidos afetados. E, pode se manifestar sob a forma de feridas na cavidade oral ou no

lábio que não cicatrizam, caroços, inchaços, áreas de dormência, sangramentos sem causa

conhecida, dor na garganta que não melhora e manchas esbranquiçadas ou avermelhadas

na parte interna da cavidade oral ou do lábio. Nas fases mais evoluídas, o câncer oral

provoca mau hálito, dificuldade em falar e engolir, caroço no pescoço e perda de peso

(BOFFETTA, et al., 2006; GONÇALVEZ et al., 2014; INCA, 2017).

Para se estabelecer um fator prognóstico, observa-se o caminho da doença nos

diferentes grupos etários de pacientes que desenvolvem câncer oral, principalmente, os

que se encontram fora do padrão esperado, ou seja, pacientes jovens (LLEWELLYN et.

al., 2001; MINICUCCI et al., 2008).

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Esse câncer é classificado em estágios de acordo com a classificação de Tumores

Malignos (TNM) padronizado pela Union for International Cancer Control (UICC), onde

T representa a dimensão do tumor, N o número, tamanho e localização dos linfonodos

cervicais comprometidos; e M representa a presença ou não de metástases à distância

(Tabela 1) (BERNARDO; NUNES, 2010). A primeira estação de drenagem, nível I é a

submandibular; a II, III, IV representam as jugulocarotídeas do terço superior, médio e

inferior respectivamente e, a V trata-se da fossa supraclavicular BERNARDO; NUNES,

2010). Os níveis I e II são os mais frequentemente acometidos pelo câncer oral. O

prognóstico dos pacientes com câncer de cavidade oral depende do estadiamento da área

da cavidade oral comprometida e do estadiamento do sistema TNM que divide os doentes

em estágios I a IV (Tabela 2). As lesões situadas nas porções mais anteriores e as lesões

iniciais (I-II) têm um prognóstico melhor em comparação com as lesões avançadas (III -

IV) (COSTA et al., 2002).

Tabela 1. Classificação do estadiamento do câncer de cavidade oral

TNM Descrição

T Tamanho do tumor primário

Tx Tumor primário não pode ser avaliado

Tis Carcinoma in situ

T1 Tumor 0-2 cm de diâmetro

T2 Tumor 2-4 cm de diâmetro

T3 Tumor > 4 cm de diâmetro

T4a Tumor invadindo estruturas adjacentes (osso, seio maxilar, pele e língua)

T4b Tumor invadindo espaço mastigatório, placa pterigóide, base de crânio ou

revestimento da artéria carótida interna.

N Presença de linfonodos regionais

Nx Linfonodos não podem ser avaliados

N0 Não há disseminação para linfonodos regionais

N1 Um linfonodo < 3 cm, ipsilateral

N2a Um linfonodo > 3 cm e < 6 cm, ipsilateral

N2b Múltiplos linfonodos < 6 cm, ipsilateral

N2c Múltiplos linfonodos < 6 cm, ipsilateral ou contralaterais

N3 Ao menos um linfonodo > 6 cm

M Presença de metástase distante

Mx A presença de disseminação não pode ser avaliada

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M0 Não há metástase distante

M1 Metástase em órgão distante

Fonte: Bernardo; Nunes, 2010.

Tabela 2. Classificação dos estágios do câncer de cavidade oral

Estágio Classificação TNM

Estágio 0 Tis, N0, M0

Estágio I T1, N0, M0

Estágio II T2, N0, M0

Estágio III T3, N0, M0 T1, N1, M0 T2, N1, M0 T3, N1, M0

Estágio IVa T4, N0, M0 T4, N1, M0 Qualquer T, N2, M0

Estágio IVb Qualquer T, N3, M0

Estágio IVc Qualquer T, Qualquer N, M1

Fonte: Bernardo; Nunes, 2010.

2.3. Protocolos de tratamentos

As modalidades terapêuticas para o câncer bucal são cirurgia, radioterapia e

quimioterapia. A mais indicada é a cirurgia, com bons resultados na maioria dos casos. O

tratamento radioterápico pode ser também utilizado em associação com cirurgia nos casos

mais avançados, ou ainda associados à quimioterapia utilizando a cisplatina como agente

único, quando não for possível o tratamento cirúrgico (CONNOR et al., 2010).

Estudos mostram que a associação de radioterapia e quimioterapia pode elevar

para 37% a sobrevida dos pacientes em três anos, quando comparado aos 23% para

aqueles submetidos à radioterapia isolada (RT) (SANTOS et al., 2010). Hoje também já

se utilizam o anticorpo monoclonal cetuximabe em combinação a outros tipos de

tratamento (CONITEC, 2013) e, alguns médicos preconizam a radioterapia concomitante

à quimioterapia no pré-operatório, pela redução do volume tumoral, podendo a cirurgia

ser realizada após este tratamento inicial (cirurgia de resgate); apesar de os efeitos

colaterais serem substanciais e nem sempre toleráveis para os pacientes (GODENY et al.,

2014).

A cirurgia deve permanecer como a primeira escolha como terapia para o câncer

oral, sendo que a modalidade varia de acordo com a extensão clínica ou estadiamento da

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doença, variando de uma excisão local até uma remoção mais ampla incluindo ossos da

face e linfonodos cervicais (MEIRELES et al., 2006).

A quimioterapia é um tratamento sistêmico do câncer onde se utilizam

medicamentos antineoplásicos, administrados em intervalos regulares, que variam de

acordo com os esquemas terapêuticos (RAJMOHAN, 2015).

Quimioterapia precedente, neoadjuvante ou citorredutora são indicadas para a

redução de tumores que são irressecáveis e também para tentar tornar os tumores

ressecáveis e melhorar o prognóstico do paciente (BERNARDO, NUNES, 2010).

Quimioterapia adjuvante ou profilática indicada após o tratamento cirúrgico curativo,

quando o paciente não apresenta qualquer evidência de neoplasia maligna detectável por

exame físico e exames complementares; e na quimioterapia curativa, a finalidade de curar

pacientes com neoplasias malignas estando ou não associada à cirurgia e à radioterapia

(REKHADEVI et al., 2007).

A quimioterapia para controle da doença está indicada para o tratamento de

tumores sólidos, avançados e/ou recidivados, ou neoplasias hematopoiéticas de

desenvolvimento crônico; permitindo aumentar a sobrevida dos pacientes. Porém, sem

possibilidade de cura. A quimioterapia paliativa está indicada para a paliação de sinais e

sintomas que comprometem a capacidade funcional do paciente (doença avançada,

recidivada ou metastática), que tende a evoluir independente do tratamento aplicado

(MOURA et al., 2016).

Outro tratamento disponível é a hormonioterapia, tratamento considerado também

quimioterápico, pois consiste no uso de medicamentos semelhantes ou inibidoras de

hormônios para tratar as neoplasias dependentes destes (INCA, 2017).

Há também tratamento com anticorpos monoclonais associados à antineoplásicos

ou independentes, para aumentar a eficácia dos tratamentos. Nos tipos mais frequentes de

linfomas agressivos, a adição de anticorpos monoclonais tem mostrado aumento na taxa

de cura e sobrevida, em comparação com a quimioterapia convencional (MOURA et al.,

2016).

Anticorpos monoclonais são proteínas produzidas no nosso organismo que

ajudam o sistema imunológico a combater vírus, bactérias e câncer por meio do

reconhecimento de antígenos; e com o avanço da ciência, os anticorpos monoclonais

puderam ser produzidos em laboratório com antígenos específicos (epítopo) (HON et al.,

2014).

21

2.4. Medicamentos antineoplásicos

Medicamentos antineoplásicos são empregados para algumas patologias, como o

câncer, e tem a finalidade de destruir cânceres e/ou células neoplásicas e, tem a finalidade

de impedir ou inibir o crescimento e a disseminação de tumores (HON et al., 2011). E, o

uso de substâncias químicas, isoladas ou em combinação, para destruir ou controlar o

crescimento das células tumorais abrange a quimioterapia combinada, associado com

outros métodos de tratamentos como a radioterapia e cirurgia (MOURA et al., 2016).

Chabner e Calabresi, (2008) apresentaram medicamentos antineoplásicos onde o

critério de classificação se baseia na interferência no mecanismo de ação das diferentes

etapas da síntese do DNA, transcrição e transdução. Mas, outros autores consideram esta

classificação inadequada, pois os agentes hormonais e outros, não são classificáveis desta

forma (JERONIMO et al., 2015).

Os medicamentos utilizados no tratamento do câncer afetam tanto as células

normais como as neoplásicas. Porém, eles acarretam maior dano às células malignas do

que às dos tecidos normais, devido às diferenças quantitativas entre os processos

metabólicos dessas células (HON et al., 2011; SESSINK et al., 1997).

Assim o DNA das células age como modelador na produção de formas específicas

de RNA transportador, RNA ribossômico e RNA mensageiro e, assim determina qual

enzima será sintetizada pela célula. As enzimas são responsáveis pela maioria das funções

celulares, e a interferência nesses processos afetam a função e a proliferação tanto das

células normais como das neoplásicas (KATARKAR et al., 2014; MCKENNA et al.,

2008).

A maioria dos medicamentos utilizados na quimioterapia interfere no mecanismo

celular e a melhor concepção do ciclo celular normal levou à definição dos mecanismos

de ação da maioria dos medicamentos. Assim, Almeida et al., (2005) classificou os

antineoplásicos conforme o ciclo celular, em ciclo inespecífico e ciclo específico.

Quanto à resistência aos antineoplásicos, entende-se que a células desenvolvem

novas codificações genéticas (mutação) e/ou são estimuladas a desenvolver tipos

celulares resistentes quanto expostos aos antineoplásicos, processo de seleção clonal

(SESSINK et al., 2011). Existem classes de medicamentos antineoplásicos para

tratamentos oncológicos como: agentes alquilantes que se ligam ao DNA impedindo a

separação dos dois filamentos do DNA na dupla hélice espiralar (replicação) e, portanto,

22

afeta em todas as fases do ciclo celular, isso inclui a classe terapêutica de mostarda

nitrogenada (ciclofosfamida).

Os antimetabólicos inibem a biossíntese dos componentes de DNA e RNA e,

portanto, impedem a divisão e funções celulares. Esse bloqueio é o principal mecanismo

dos antimetabólicos e agem na fase S do ciclo celular impedindo que as células entrem

em mitose. Os antibióticos antitumorais além de interagir com o DNA, inibem a síntese

de proteínas e, não atuam especificamente sobre uma determinada fase do ciclo celular,

podendo se inserir com outros agentes antineoplásicos. Os inibidores mitóticos podem

estacionar a mitose na fase metáfase, pela ação sobre a proteína α-tubulina e a β-tubulina

que desenvolvem os microtúbulos de onde migram os cromossomos; nesta fase da

metáfase esses cromossomos ficam bloqueados e impedindo de migrar e interrompendo

assim a divisão celular (FAN, 2004).

2.5. Exposição ocupacional

O primeiro serviço a se preocupar com a exposição ocupacional surgiu na

Inglaterra em 1830, e a primeira forma de atuação consistia em medicar o adoecimento

relacionado ao trabalho; e a constituição do entendimento de biossegurança iniciou-se na

década de 1970, a reunião de Asilomar, na Califórnia, onde a sociedade científica iniciou

a discussão sobre os impactos da engenharia genética na sociedade. Ao longo dos anos,

o conceito de biossegurança vem sofrendo alterações (ALMEIDA; ALBUQUERQUE,

2000).

O risco ocupacional é a existência de probabilidade de um profissional sofrer

algum dano, resultante de suas atividades profissionais e dentre os riscos ocupacionais,

pode-se destacar-se o manuseio de medicamentos antineoplásicos; como por exemplo, a

ciclofosfamida (MORETTI et al., 2011).

A ocorrência de alterações nas células sanguíneas é o principal problema

proveniente da manipulação dos antineoplásicos, no entanto, esses medicamentos afetam

principalmente a reprodução humana. Profissionais que manipulam apresentam, com

maior frequência, irregularidades menstruais e amenorreia, e abortos espontâneos podem

ocorrer principalmente no primeiro trimestre de gravidez, além de anormalidades

cromossômicas e malformações congênitas (ENSSLIN et al., 1994; BOUGHATTAS et

al., 2010).

23

Os profissionais da oncologia podem ser expostos aos antineoplásicos durante o

manuseio e a administração, acidentes e derramamentos, e manipulação de excretas do

paciente como, suor, vômitos, fezes e urina. Embora haja o fluxograma sobre os riscos da

exposição, os níveis detectáveis de antineoplásicos ainda são relatados na urina de

profissionais que os manuseiam, o que indica a exposição ocupacional (INCA, 2017).

Além disso, sabe-se que os antineoplásicos têm efeitos genotóxicos e teratogênicos e,

podem sofrer danos em genes, de células somáticas e/ou células germinativas (INCA,

2017). Situação cada vez mais preocupante, considerando o fato de que os profissionais

envolvidos no manuseio desses medicamentos são ocasionalmente expostos a seus efeitos

nocivos (ZHANG et al., 2016).

Esses medicamentos têm o potencial de ocasionar alterações genéticas, que

podem levar ao desenvolvimento de câncer se ocorrem em proto-oncogenes ou genes

supressores tumorais, que estão envolvidos no controle do crescimento ou diferenciação

celular (BOHLANDT et al., 2017).

Na saúde, são apontadas contribuições de conhecimento e um conjunto de

práticas e ações técnicas, com as preocupações sociais e ambientais, destinadas a

conhecer e a controlar os riscos ocupacionais que o trabalho pode oferecer ao ambiente e

à vida de profissionais e pacientes (BOLZAN, 2011).

Possível controle da exposição ocupacional é o biomonitoramento, que pode ser

realizado por métodos não seletivos, como os ensaios de danos celulares e/ou

biomarcadores (VYAS et al., 2014; MONTERO et al., 2016).

Samantha, Dey, (2012) e Kimura et al. (2013), conceituam que, ultimamente, o

biomonitoramento também é aplicado a diversos tipos de células de vários tecidos

humanos, e assim trazem importantes informações para o diagnóstico, prognóstico e

tratamento do câncer e outras doenças; esses ensaios foram primeiramente realizados em

cultura de linfócitos do sangue periférico e, posteriormente, adaptados para outros tipos

celulares.

3. ENSAIOS

3.1. Genotoxicidade

3.1.1. Ensaio do cometa

24

Ensaio do cometa é uma técnica eletroforética sensível, com ampla aplicação na

genética toxicológica. Permite a avaliação de dano e reparo do DNA em células

proliferantes e não proliferantes, sendo aplicado em pequenas amostras individuais in

vitro, in vivo e em humanos (SINGH et al., 1988).

Seu fundamento se baseia na lise das membranas celulares seguida da migração

eletroforética do DNA desprendido da matriz de agarose, o que permite a visualização

em microscópio de fragmentos ou fitas de DNA que migram na direção do íon negativo

(NANDIN et al., 2001).

Kobayashi et al. (1995), descreveu a técnica recomendada na qual são analisadas

100 células por indivíduo classificando-se os cometas em: (classe 0) células não

danificadas que não apresentam cauda; (classe 1) células com cauda menor que o

diâmetro do nucleóide; (classe 2) células com cauda de tamanho entre 1 e 2 vezes o

diâmetro do nucleóide; (classe 3) células com cauda maior que 2 vezes o diâmetro do

nucleóide.

3.1.2. Ensaio de micronúcleos (MN)

Teste de Micronúcleo (MN) resulta na identificação da genotoxicidade em nível

cromossômico (BENEDETTI et al., 2013). São estruturas arredondadas, com

aproximadamente 1/20 a 1/5 do tamanho do núcleo (RABELO-GAY et al., 1991). São

fragmentos cromossômicos e/ou quebra de cromossomos (danos clastogênicos) e a perda

de cromossomos (danos aneugênicos), perdidos durante a ação de divisão celular, mais

especificamente, na anáfase durante a migração das cromátides para os polos da célula

(TORRES-BUGARÍN et al., 2015). Essa técnica permite quantificar os danos

cromossômicos e as falhas existentes nas fibras dos fusos de células de organismos

expostos aos mais variados agentes físicos, químicos e biológicos (OLIVEIRA et al.,

2009; TWEATS et al., 2015).

3.1.3. Morte Celular (Apoptose)

Apoptose é a morte celular programada, que ocorre de forma ordenada e demanda

energia para a sua execução, ao contrário da necrose e está relacionada com a manutenção

da homeostase e com a regulação fisiológica do tamanho dos tecidos (MEIRELES et. al.,

2006).

25

A identificação das células apoptóticas é realizada por análise do padrão de

fragmentação do DNA nuclear após coloração com Alaranjado de Acridina, (OLIVEIRA

et. al., 2015).

3.2. Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas

A cromatografia gasosa (GC) é uma técnica analítica amplamente utilizada para

determinar a composição de uma mistura de produtos químicos ou amostras e, utiliza uma

variedade de gases para o seu funcionamento, de acordo com o analisador e o tipo de

detector específico e seu uso melhora sensivelmente a precisão dos resultados analíticos.

A cromatografia pode ser combinada a diferentes parâmetros de detecção, abordando-se

uma das técnicas analíticas mais utilizadas e de melhor execução (VÉKEY, 2001). O

acoplamento de um cromatógrafo com o espectrômetro de massas acorda os benefícios

da cromatografia (alta seletividade e eficiência de separação) com as vantagens da

espectrometria de massas (obtenção de informação estrutural, massa molar e aumento

adicional da seletividade) (ARDREY, 2003).

Métodos analíticos de identificação de fármacos/medicamentos ou de seus

metabólitos têm sido empregados gerando resultados instantâneos e seguros (SABINO et

al., 2011); assim como na elucidação de propriedades químicas e estruturais de moléculas,

a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas é uma importante ferramenta

de identificação de medicamentos antineoplásicos, para o biomonitoramento da

exposição ocupacional.

3.2.1 Ciclofosfamida

Dentre os antineoplásicos mais manuseados destacam-se à ciclofosfamida (Figura

3), metotrexato e 5-fluoracil (Sessink; Bos, 1999). Partindo desse pressuposto, a

ciclofosfamida é o medicamento mais presente nas rotinas de trabalho desde o século

passado, determinando a escolha do medicamento a ser avaliado nesse estudo.

O uso de ciclofosfamida como agente antineoplásico surgiu na primeira guerra

mundial onde soldados expostos ao gás mostarda evoluíam com aplasia de medula óssea

(aplasia de medular), ou seja, a morte celular. Contudo, a molécula de ciclofosfamida foi

sintetizada a partir da substituição de um anel de oxazafosforina por um grupo metila,

com escopo de se criar uma pró-droga, que seria ativa apenas em células neoplásicas.

26

Como algumas células neoplásicas expressam altos níveis de fosfamidase, que é capaz de

quebrar a ligação fosforo-nitrogênio, obteve-se a síntese desse agente (COLVIN, 1999).

O medicamento antineoplásico ciclofosfamida, é um metabólito da mostarda

nitrogenada, liga-se a muitas estruturas moleculares intracelulares, incluindo os ácidos

nucléicos. Sua ação citotóxica deve-se principalmente ao entrecruzamento da cadeia de

DNA e RNA, assim como à inibição da síntese de proteínas. É bem absorvida no trato

gastrintestinal; sua união às proteínas é muito baixa. Metaboliza-se no fígado e sua meia-

vida é prolongada na insuficiência renal. Sua eliminação é por via renal, com menos de

25% de forma inalterada (ALMEIDA et al., 2005).

A ciclofosfamida é um pó cristalino, fino, branco e inodoro com peso molecular

(PM) de 279,10 g.mol -1, apresenta temperatura de fusão de 49,9 - 53 ºC e passa ao estado

líquido perdendo a água de cristalização. É inflamável em temperatura acima de 110 ºC,

solúvel em água, sendo que a relativa solubilidade em meio aquoso implica em aumento

no tempo de exposição. Sua estrutura (N,N-BIS (2-cloroetila) tetraidro-2H-1,3,2,-amina,

2-óxido monohidratado) é um composto cíclico derivado do agente alquilante mostarda

nitrogenada e consiste de um anel fosforamida ligado a uma molécula bifuncional

contendo dois grupos cloroetila responsáveis pela liberação dos grupamentos alquila

(C7H15CL2N2O2P) (ANDERSON et al., 1995).

Figura 3. Estruturada da Ciclofosfamida/CP (Classe: Mostrada Nitrogenada).

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4. REFERÊNCIAS

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33

5. OBJETIVOS

5.1 Objetivo geral

Empregabilidade de testes de genética toxicológica no estudo da evolução de

danos genéticos no estadiamento do carcinoma de células escamosas de cavidade oral e

no biomonitoramento de risco ocupacional a medicamentos antineoplásicos.

5.2 Objetivos específicos

Avaliar a eficácia dos ensaios de cometa, micronúcleo e apoptose como

biomarcadores clínicos no carcinoma de células escamosas de cavidade oral.

Avaliar a relação entre a intensidade de danos genéticos e os estágios clínicos do

carcinoma de células escamosas de cavidade oral.

Avaliar a intensidade de danos genéticos em pacientes com carcinoma de células

escamosas de cavidade oral nas fases pré e pós-intervenção cirúrgica, quimioterápica e/ou

radioterápica.

Analisar a frequência de danos genéticos em profissionais expostos

ocupacionalmente a drogas antineoplásicas.

Estudar a relação entre a intensidade de danos genéticos e o tempo de exposição

ocupacional.

Avaliar a correlação dos ensaios de cometa e micronúcleo como biomarcadores

clínicos no biomonitoramento de exposição ocupacional a antineoplásicos.

Avaliar a efetividade da biossegurança adotada durante os procedimentos de

manipulação de antineoplásicos.

Avaliar a presença de antineoplásicos e/ou seus metabólitos na urina de

profissionais no risco de exposição.

Correlacionar a frequência de danos genéticos nos ensaios do cometa e MN em

profissionais expostos ocupacionalmente a medicamentos antineoplásicas.

34

6. MANUSCRITO I:

Ensaios de cometa e micronúcleo não se correlacionam com a intensidade do dano

ao DNA e os estágios clínicos do carcinoma de células escamosas de cavidade oral

Rodrigo Juliano Oliveira1,2,3,4,5*, Andreza Negreli Santos1,2*, Lucas Roberto Pessatto1,4,

Albert Schiaveto de Souza5, Andréia Conceição Milan Brochado Antoniolli-Silva1,3,5,

Andréa Luiza Cunha-Laura2, Carlos Alberto Ferreira de Freitas1,3*

1Centro de Estudos em Célula Tronco, Terapia Celular e Genética Toxicológica, Hospital

Universitário Maria Aparecida Pedrossian, Empresa Brasileira de Serviços Hospitalares,

Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS, Brasil. 2Programa de Mestrado em Farmácia, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Alimentos

e Nutrição, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS, Brasil. 3Faculdade de Medicina Dr. Hélio Mandetta, Universidade Federal de Mato Grosso do

Sul, Campo Grande, MS, Brasil. 4Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Centro de Ciências

Biológicas, Universidade Estadual de Londrina, Londrina, Paraná, Brasil. 5Programa de Pós-graduação em Saúde e Desenvolvimento na Região Centro-Oeste,

Faculdade de Medicina Dr. Hélio Mandetta, Universidade Federal de Mato Grosso do

Sul, Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brasil.

*These authors contributed equally to this article.

*Corresponding author: Dr. Carlos Alberto F. Freitas Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Mato Grosso do Sul. Cidade Universitária, S/N. Campo Grande/MS – Brasil. CEP: 79070-900. Phone: 55-67-992213634 Fax: 55-67-3345.3001 Email: [email protected]

35

RESUMO

O carcinoma de células escamosas de cavidade oral (CCECO) é a sexta neoplasia maligna

mais frequente no mundo. Seu prognóstico é limitado e apesar de toda a evolução do

tratamento das neoplasias malignas, a sobrevida global permanece em torno de 50% em

cinco anos com alto índice de recidivas locais, locoregionais e à distância. Isso justifica a

necessidade de monitoramento dessa doença. Assim, a presente pesquisa teve por

objetivo avaliar a empregabilidade e a relação entre a intensidade de danos celulares e os

estágios clínicos do CCECO. Os nossos resultados indicaram que o diagnóstico de

CCECO aumenta a frequência de danos genotóxicos (ensaio do cometa – 3,21x; ensaio

do micronúcleo – 3,93x). No entanto, não foi possível estabelecer uma correlação entre a

frequência de danos no DNA e o estadiamento da doença. O ensaio de morte celular não

se mostrou efetivo para o biomonitoramento proposto. Diante do exposto considera-se

que os ensaios de cometa e micronúcleo são adequados para o biomonitoramento de danos

no DNA. No entanto, no presente delineamento, não se evidenciou empregabilidade

desses ensaios para correlacionar a intensidade de danos no DNA/celulares e os estágios

clínicos do CCECO.

Palavra-Chave: genotoxicidade, cometa, micronúcleo, apoptose, biomonitoramento,

câncer.

1. INTRODUÇÃO

O carcinoma de células escamosas de cavidade oral (CCECO) é a sexta neoplasia

maligna mais frequente no mundo (Ali et al., 2017). Seu principal fator etiológico é o

tabagismo associado ao alcoolismo (OMS, 2005; Da SILVA et al., 2016; NIAZ et al.,

2017; RATNA; MANDREKAR, 2017).

O prognóstico de pacientes com CCECO é limitado e a sobrevida permanece em

torno de 50% (REDDY et al., 2014). As recidivas podem ser locais, locoregionais e à

distância (MOURA et al., 2016). Pacientes curados podem ainda desenvolver uma

segunda lesão primária (YUKI et al., 2015; MOURA et al., 2016). Logo, a identificação

desses indivíduos poderia adiantar o diagnóstico contribuindo na seleção de doentes de

maior risco de recorrências e de segundas lesões (CARVALHO et al., 2004).

36

Diante do exposto a presente pesquisa avaliou a empregabilidade e a relação entre a

intensidade de danos celulares e os estágios clínicos do CCECO.

2. CASUÍSTICA E MÉTODOS

Participaram desta pesquisa 44 indivíduos sendo 24 pacientes, atendidos em

primeira consulta no ambulatório de cirurgia de cabeça e pescoço, no período de agosto

de 2016 a agosto d 2017, no Hospital de Câncer de Campo Grande Alfredo Abrão, e 20

voluntários saudáveis sendo 10 homens (5 não fumantes e 5 fumantes) e 10 mulheres (5

não fumantes e 5 fumantes). Os voluntários foram divididos em grupo controle não

fumante (CNF; n=10) e grupo controle fumante (CF; n=10).

O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos da

Universidade Federal de Mato Grosso do Sul sob o parecer nº 1.671.940. Todos os

indivíduos que concordaram em participar da pesquisa assinaram o Termo de

Consentimento Livre e Esclarecido e, em seguida, fizeram bochecho com água potável e

foram submetidos à coleta de células esfoliadas da cavidade oral com o auxílio de uma

espátula de madeira.

O material da esfoliação foi depositado em solução fisiológica 0,9% (5mL),

centrifugado a 2000rpm por 10 minutos e desprezou-se o sobrenadante.

2.1. Ensaio do cometa

O ensaio do cometa foi realizado segundo Singh et al., (1988) com modificações

de Navarro et al. (2014). As lâminas foram coradas a posteriori (100,0µL de brometo de

etídio - 20x10-3mg/mL) e analisou-se 100 células em microscópio de epifluorescência

(Motic® - BA410). A análise e classificação dos danos foram baseados em Kobayashi et

al., (1995). O escore total foi calculado pela somatória dos valores resultantes da

multiplicação do total de células observadas em cada classe de lesão as quais pertenciam

pelo valor da classe (NAVARRO et al., 2014).

2.2. Ensaio do micronúcleo

Cem microlitros da suspensão celular foram usados para as confecções de extensões

em lâminas de vidro. Posteriormente, as lâminas foram coradas com Giemsa 10% por 5

37

minutos e analisadas em microscópio de campo claro (Nikon® – Eclipse E200).

Analisou-se 1000 células por indivíduo e contabilizou-se a presença de micronúcleos

(BENEDETTI et al., 2013).

2.3. Ensaio de morte celular

O ensaio de morte celular foi realizado segundo a descrição de Oliveira et al.

(2015). Cem microlitros da suspensão celular foram utilizados para fazer uma extensão

em lâmina de vidro. A lâmina foi fixada em Carnoy por 5 minutos, mergulhada

rapidamente em placas contendo concentrações decrescentes de etanol (95% a 25%),

lavada com Tampão McIlvaine por 5 minutos, corada com Alaranjado de Acridina

(0,01%, 5 minutos) e novamente lavada com o tampão. O padrão de análise foi descrito

por Carvalho et al. (2015).

2.4. Análise estatística:

Os ensaios de cometa, micronúcleo e morte celular foram avaliados por ANOVA/

Tukey-Kramer, segundo distribuição paramétrica dos dados, no Software GraphPad

Prism, versão 7.00. As correlações linear de Pearson foram realizada por meio do

programa estatístico SigmaPlot, versão 12.5. O nível de significância adotado foi p<0,05.

3. RESULTADOS

O CCECO teve maior prevalência no sexo masculino (83,33%) e a idade média

dos indivíduos, de ambos os sexos, foi de 64,5 ± 24,74. Já os grupos CNF e CF

apresentaram médias de 41,5 ± 28,99 e de 51,5 ± 20,50, respectivamente (Tabela 1).

Em relação ao estadiamento do CCECO, 25% dos pacientes encontravam-se no

estadiamento I ou II e 75% no estadiamento III ou IV. Desses indivíduos 87,5% possuíam

hábito de vida tabagista. Já o hábito de vida etilista estava presente em 75%, 40% e 20%

dos indivíduos com CCECO, CF e CNF, respectivamente (Tabela 1).

Em relação às doenças crônicas, a única referida pelos indivíduos e confirmada,

foi a hipertensão arterial crônica que acometia 12,5% dos indivíduos com CCECO, 80%

dos CF e 10% dos CNF (Tabela 1).

38

O ensaio do cometa demonstrou que o hábito tabagista aumenta (p<0,05) a

frequência de danos genômicos em 2x e o escore da lesão em 3,10x. Os pacientes com

CCECO, antes da intervenção terapêutica, apresentam 3,21x mais danos genômicos que

o grupo CNF e um escore 4,25x maior (p<0,05). No período pós-intervenção terapêutica

a frequência de danos no DNA reduziu e não diferiu dos indivíduos CNF (p>0,05) (Figura

1A-B).

O ensaio de micronúcleos demonstrou que os indivíduos com diagnóstico de

CCECO possuem uma maior frequência de danos cromossômicos. Em relação ao grupo

CNF houve um aumento (p<0,05) de 3,93x na frequência de células micronucleadas na

avaliação antes do tratamento. Após o tratamento essa frequência reduziu e não

apresentou diferenças em relação ao grupo CNF (p>0,05) (Figura 1C).

Entre os indivíduos dos grupos CNF e CF, observou-se que há diferença

significativa. O grupo fumante apresentou aumento de danos cromossômicos de 3,64x

em relação ao não fumante (Figura 1C).

A frequência de morte celular variou de 0,11 ± 0,33 a 0,80 ± 1,03 entre os

diferentes grupos de estudo e nenhuma diferença estatisticamente significativa foi

encontrada (Figura 1D).

Quando avaliada a correlação entre a frequência de danos no DNA (cometa e

micronúcleo) e o estadiamento da doença, nenhuma relação foi encontrada. Também não

foram encontradas relações entre a redução da frequência de danos no DNA e os

tratamentos (quimioterapia, radioterapia e/ou intervenção cirúrgica). Já quando se

correlacionou a frequência de danos genéticos pelos ensaios cometa e micronúcleo,

evidenciou-se uma correlação positiva, significativa e moderada, independentemente do

tratamento (r=0,662; p<0,001) (Figura 1E).

4. DISCUSSÃO

A mucosa oral representa o primeiro contato com possíveis agentes genotóxicos

na cavidade oral (LORENZONI et al., 2017). Esses agentes, como é o caso do álcool e

de compostos do cigarro, podem desencadear carcinogênese (LÓPEZ-LÁZARO, 2016;

NIAZ et al., 2017) e inclusive o CCECO (HECHT, 2017; RATNA; MANDREKAR,

2017).

Em geral, existe correlação entre a frequência de danos genotóxicos e o

desenvolvimento de carcinogênese (LORENZONI et al., 2017). É por isso que testes

39

genotóxicos são utilizados por agências regulatórias para predizer riscos (ARAVIND;

DHANYA, 2016). Esses ensaios também são aplicados para biomonitoramento clínico

em doenças periodontais e infecções virais (SAHINGUR; YEUDALL, 2015;

RAJENDRA SANTOSH et al., 2017), por exemplo. No entanto, a literatura sobre a

correlação dos danos genotóxicos e o estadiamento do CCECO ainda é limitada o que

motivou a presente pesquisa.

Os nossos dados demonstraram que a frequência de cometa é aumentada nos CF

e a de micronúcleos apresentou tendência ao aumento nesse mesmo grupo. Essa situação

já era esperada uma vez que é bem registrada na literatura a indução de danos

genômicos/genéticos pelo cigarro (De MARINI, 2004; ZHANG et al., 2017).

Em relação ao CCECO a presente pesquisa demonstrou que os pacientes, antes do

tratamento, possuíam frequência aumentada tanto de cometa como de micronúcleos.

Apesar dessa diferença estatisticamente significativa, em relação ao CNF, não foi

possível determinar uma correlação entre a frequência de danos genotóxicos e o

estadiamento do CCECO.

Após a intervenção terapêutica verificou-se redução de danos genotóxicos em

todos os pacientes reavalidados, independentemente da conduta médica. Além disso, não

foi possível estabelecer nenhuma correlação entre a frequência de danos no DNA e os

estadiamentos da doença ou intervenção terapêutica. Mas, foi observada redução

significativa na frequência de danos após os tratamentos.

Ao correlacionar a frequência de danos avaliados pelo ensaio do cometa e de

micronúcleo verificou-se uma relação positiva, significativa e moderada. Esse fato já era

esperado uma vez que a literatura indica que danos avaliados pelo ensaio do cometa são

danos genômicos passíveis de reparo (COLLINS, 2004; OLIVE; BANÁTH, 2006) e os

danos avaliados pelo ensaio do micronúcleo são danos genéticos que foram fixados no

genoma da célula e não estão mais propensos ao reparo (TOLBERT et al., 1992; SHAH

et al., 2015), ou seja, os danos do cometa pode se fixar no genoma celular e se transformar

em danos cromossômicos/genéticos (AVCI et al., 2017).

O ensaio de morte celular não demonstrou aplicabilidade para o monitoramento

proposto visto que a frequência de células contabilizadas era muito baixo.

Diante do exposto considera-se que os ensaios de cometa e micronúcleo são

adequados para o biomonitoramento de danos no DNA, em diferentes extensões do dano

(genômico ou genético), induzido por exposição a agentes e/ou devido a mudanças

endógenas (como é o caso da instabilidade genética induzida pelo câncer). No entanto, o

40

presente delineamento não evidenciou empregabilidade desses ensaios para correlacionar

a intensidade de danos no DNA/celulares e os estágios clínicos do carcinoma de células

escamosas de cavidade oral.

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43

6. RESULTADOS

Tabela 1. Valores absolutos e percentuais, e valores médios ± erro padrão da média relativo ao sexo, idade, estadiamento do câncer e hábitos de vida dos indivíduos controle e diagnosticados com carcinoma de células escamosas de cavidade oral.

Parâmetros

Grupos de estudo

CNF (n=10) CF (n=10) CCECO (n=24)

Valores absolutos (valores percentuais)

Sexo Feminino 5 (50%) 5 (50%) 4 (16,66%) Masculino 5 (50%) 5 (50%) 20 (83,33%)

Idade Mínima 21 37 47 Máxima 62 66 82

Média ± EPM 41,5 ± 28,99 51,5 ± 20,50 64,5 ± 24,74 Estágios do Câncer

I a II - - 6 (25%) III a IV - - 18 (75%)

Doença Crônica (Hipertensão arterial

crônica)

Sim 1 (10%) 8 (80%) 3 (12,5%) Não 9 (90%) 2 (20%) 21 (87,5%)

Tabagismo Sim 0 (0%) 10 (100%) 21 (87,5%) Não 100 (100%) 0 (0%) 3 (12,5%)

Etilismo Sim 2 (20%) 4 (40%) 18 (75%) Não 8 (80%) 6 (60%) 6 (25%)

Legenda: EPM – Erro padrão da média, n – número de indivíduos por grupo, CNF – Controle não fumante, CF – Controle fumante, CCECO – Carcinoma de células escamosas de cavidade oral.

45

Figura 1 – Média ± Erro Padrão da Média (EPM) da frequência de células lesionadas (A)

e do escore (B) no ensaio cometa, da frequência de micronúcleos (C), da frequência de

morte celular (D) e gráfico de dispersão apresentando a correlação linear de Pearson entre

a frequência de danos genotóxicos (escore do ensaio cometa x frequência de

micronúcleo). Cada símbolo representa a frequência de ambas as variáveis para um único

indivíduo. A linha contínua representa a linha de regressão linear (E). CNF – Controle

não fumante, CF – Controle fumante, CCECO – Carcinoma de células escamosas de

cavidade oral, Pré – pré-intervenção terapêutica, Pós – pós-intervenção terapêutica. Teste

Estatístico: A, B, C e D – ANOVA/Tukey, letras diferentes letras indicam diferenças

estatisticamente significativas (p<0,05); Correlação Linear de Pearson (p<0,05).

46

7. MANUSCRITO II:

Biomonitoramento de risco ocupacional de farmacêuticos e de enfermeiros que

manuseiam antineoplásicos

Andreza Negreli Santos1,2, Carlos Alberto Ferreira de Freitas1,3. Lucas Roberto

Pessatto1,4, Roberto da Silva Gomes5,6, Rodrigo Juliano Oliveira1,2,3,4*



Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande, Mato Grosso do Sul,

Brasil. 2Programa de Mestrado em Farmácia, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Alimentos

e Nutrição, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande, Mato Grosso

do Sul, Brasil. 3Faculdade de Medicina Dr. Hélio Mandetta, Universidade Federal de Mato Grosso do

Sul, Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brasil. 4Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Centro de Ciências

Biológicas, Universidade Estadual de Londrina, Londrina, Paraná, Brasil. 5Laboratório de Síntese e Modificação Molecular, Faculdade de Ciências Exatas e

Tecnologias, Universidade Federal da Grande Dourados, Dourados, Mato Grosso do Sul,

Brasil.

6Programa de Pós-graduação em Química, Instituto de Química, Universidade Federal de

Mato Grosso do Sul, Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brazil.

*Corresponding author: Dr. Rodrigo Juliano Oliveira Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Mato Grosso do Sul. Cidade Universitária, S/N. Campo Grande/MS – Brasil. CEP: 79070-900. Phone: 55-67-3345.3068 Fax: 55-67-3345.3001 Email: [email protected]

47

RESUMO

Quimioterápicos são cada vez mais usados para tratamento de câncer e representam um

risco de exposição ocupacional aos profissionais da saúde. Diante do exposto a presente

pesquisa teve por objetivo avaliar a frequência de lesões genéticas em farmacêuticos e

enfermeiros que manipulam e/ou manuseiam antineoplásicos bem como avaliar se há

traços de contaminantes na urina desses profissionais. Participaram desta pesquisa 59

profissionais sendo 10 profissionais não expostos (controle), 25 farmacêuticos e 24

enfermeiros. Foi encontrado um aumento estatisticamente significativo de danos

genéticos nos linfócitos e nas células da mucosa oral tanto de farmacêuticos como de

enfermeiros. Também estavam aumentos os níveis de ciclofosfamida e ifosfamida nas

amostras de urina dos mesmos indivíduos. Esses resultados demonstram a crescente

necessidade de biomonitoramento genético e de traços de antineoplásicos na urina de

profissionais da área da saúde que manipulam e/ou manuseiam antineoplásicos visto que

mesmo usando equipamentos de proteção individual e coletivo a contaminação é

recorrente. O presente estudo ainda sugere que os ensaios de cometa, micronúcleo e

quantificação de ciclofosfamida e ifosfamida na urina são testes importantes para avaliar

o nível de contaminação ocasionada pela exposição ocupacional bem como para tomar

medidas que impeçam malefícios à saúde de tais profissionais.

Palavra-Chave: Exposição ocupacional; ensaio cometa, teste de micronúcleo; genotoxicidade; espectrometria.

48

1. INTRODUÇÃO

Estima-se que no ano de 2020 ocorrerão 17.113.355 novos casos de câncer (WHO,

2012) e mais de 20 milhões de pessoas serão acometidas por essa doença em 2025

(STEWART and WILD, 2014). Esse crescimento em escala global é devido à sua origem

multifatorial (característica genéticas e influência do ambiente) (Wang et al., 2017) sendo

relevante os hábitos de vida e a exposição ocupacional (ZEIGER, 2017).

Os farmacêuticos e enfermeiros que manipulam ou manuseiam os antineoplásicos,

mesmo com a utilização de Equipamentos de Proteção Individuais (EPI’s) e coletivos

estão expostos (MORETTI et al., 2011). Assim, aumenta-se a chance de lesões no DNA

o que pode correlacionar ao risco aumentado de câncer, infertilidade e malformações

congênitas (ENSSLIN et al., 1994; BOHLANDT et al., 2017).

Diante do exposto a presente pesquisa teve por objetivo avaliar a frequência de

lesões genéticas em farmacêuticos e enfermeiros que manipulam e/ou manuseiam

antineoplásicos bem como avaliar se há traços de contaminantes na urina desses

profissionais.

2. CASUÍSTICA E MÉTODOS

2.1. Participantes da pesquisa e coleta de amostras

Participaram desta pesquisa 59 indivíduos, sendo 25 farmacêuticos, 24

enfermeiros e 10 indivíduos de outras áreas que não envolvem risco ocupacional (controle

negativo), da cidade de Campo Grande, Mato Grosso do Sul, avaliados no período de

dezembro de 2016 a fevereiro de 2017.

O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos da

Universidade Federal de Mato Grosso do Sul sob o parecer nº 1.870.703. Todos os

indivíduos que concordaram em participar da pesquisa assinaram o Termo de

Consentimento Livre e Esclarecido.

Os voluntários foram submetidos à coleta de 5 mL de sangue periférico em frasco

contendo heparina (BD ®), 5mL de urina em coletor universal, células da mucosa oral

por raspagem com espátula de madeira.

49

3. ENSAIOS BIOLÓGICOS

3.1. Ensaio do cometa em sangue periférico

O sangue periférico ficou em temperatura ambiente para decantação. O plasma,

contendo a camada de linfócitos, foi aspirado e transferido para um frasco de cultura

contendo 7,5 mL de meio de cultura RPMI 1640 (GIBCO ®, Lote: 1788839), 2,0 mL de

soro bovino fetal (GIBCO ®, Lote: SPBB2353V) e 0,2 mL de fitohemaglutinina (GIBCO

®, Lote: 1776926). As células permaneceram em cultivo por 72h. Em seguida, a

suspensão celular foi centrifugada a 1.200 rpm por 5 minutos e o sobrenadante foi

desprezado. Uma amostra de 20 µL da suspensão celular foi usada para a realização do

ensaio cometa seguindo Singh et al. (1988), com modificações de Navarro et al. (2014).

As lâminas foram coradas (100 µL com brometo de etídio - 20x10 - 3 mg / mL), e 100

células foram analisadas com um microscópio de epifluorescência (Motic ® - BA410). A

análise e classificação dos danos foram baseadas em Kobayashi et al. (1995). O escore

total foi calculado somando os valores resultantes da multiplicação do número total de

células observadas em cada classe de lesão a qual pertenciam ao valor da classe

(NAVARRO et al., 2014).

3.2. Ensaio de micronúcleos em células descamadas da cavidade oral

As células esfoliadas foram colocadas em solução salina a 0,9% (5 mL),

centrifugadas a 2000 rpm por 10 minutos, e o sobrenadante foi descartado. Um volume

de 100 µL de suspensão celular foi usado para preparar os esfregaços em lâminas de vidro.

Em seguida, as lâminas foram coradas com corante Giemsa a 10% por 5 minutos e

analisadas sob microscópio de campo claro (Nikon ® - Eclipse E200). Um total de 1000

células por indivíduo foi analisado e o número de micronúcleos foi determinado conforme

Benedetti et al., 2013.

3.3. Detecção de resíduos de ciclofosfamida na urina por espectrometria de

massas

Para realizar a quantificação de ciclofosfamida (CP) na urina utilizou-se como

padrão a CP N-trifluoracetilada, sintetizada a partir da ciclofosfamida comercial (Genuxal

50

®; Lote 6I139C, Laboratório Baxter), (Figura 1), uma vez que a injeção de ciclofosfamida

ao equipamento de cromatografia gasosa produz tanto ciclofosfamida quanto ifosfamida,

impedindo a quantificação correta do quimioterápico.

Figura 1. Estrutura de CP e N-Trifluoroacetylated/CP.

De uma solução de 2,83 mg / mL de ciclofosfamida em acetato de etila PA,

retirou-se uma alíquota de 7,06 µL e misturou-se a 400 µL de acetato de etila e 400 µL

de anidrido trifluoroacético que foi mantida a 90 ºC durante 30 min. A solução resultante

foi então dissolvida em 100 µL de tolueno, submetidas à sonicação durante 10min e

analisada por cromatografia gasosa (SESSINK e BOS, 1999; MARTINS et al., 2004).

As curvas de calibração foram construídas a partir da análise de amostras de N-

trifluoroacetilado/CP, variando a concentração de 0 a 5 µg / mL. O limite de detecção e

quantificação (relação sinal/ruído 10:1) foi de 0,03 e 0,11 mg / L, respectivamente. O

tempo de retenção para CP foi de aproximadamente 10,5 min. Dos espectros completos,

os fragmentos de íons 307 foram selecionados para análise no modo SIM pelo tempo de

retenção relativo de N-trifluoroacetilado/CP (SESSINK et al., 1994).

3.4. Análise estatística de detecção de resíduos de ciclofosfamida na urina

O cometa, o micronúcleo e a detecção de ciclofosfamida residual em testes de

urina foram avaliados por ANOVA / Tukey-Kramer ou Kruskal-Wallis / Dunn, de acordo

com uma distribuição paramétrica dos dados usando o software GraphPad Prism, versão

7.00. As correlações lineares de Pearson foram obtidas com o programa estatístico

SigmaPlot, versão 12.5. O nível de significância adotado foi p <0,05.

51

4. RESULTADOS

O grupo de profissionais expostos era composto por 71,42% de mulheres e

28,57% de homens. A idade variou de 24 a 57 com média de 35,10±1,14. O tempo de

horas e meses trabalhados foi de 5,60±1,85 horas e 45,41±41,20 meses para os

farmacêuticos e de 7,33±0,96 horas e 41,70±38,96 meses para os enfermeiros,

respectivamente. Em relação ao hábito tabagista a amostra apresentou 4,08% e 10,20%

para homens e mulheres, respectivamente; no grupo exposto. Em relação à ocorrência de

doenças crônicas 6,12% e 4,08% eram hipertensos e nenhum indivíduo apresentava

doenças do trato urinário. Em relação aos indivíduos não expostos (controle negativo não

pareado) registrou-se 50% de cada sexo, idade variando de 21 a 50 anos com média de

33,60±2,89, 20% dos homens eram fumantes e 10% eram hipertensos. Nesse grupo não

foi registrado nenhuma doença do trato urogenital (Tabela 1).

A avaliação de danos genômicos pelo ensaio do cometa (Figura 2A) demonstrou

aumento estatisticamente significativo para o grupo exposto sendo um aumento de 2,94x

e 3,03x para os farmacêuticos e enfermeiros, respectivamente (Figura 2B). A avaliação

do ensaio do micronúcleo (Figura 2C) também demonstrou aumento (p<0,05) de 2,98x e

3,05x para farmacêuticos e enfermeiros, respectivamente (Figura 2D). A regressão linear

de Pearson para cometa e micronúcleos foi significativa (p<0,001), positiva e forte

(r=0,0826), ou seja, à medida que aumentou a frequência de lesões genômicas (ensaio do

comenta) aumentou também a frequência de danos permanentes (ensaio do micronúcleo)

(Figura 2E).

Quando avaliada a presença de ciclofosfamida e/ou metabólitos na urina de

indivíduos expostos e não expostos observou-se aumento (p<0,05) de 6x e 6,5x para

farmacêuticos e enfermeiros, respectivamente (Figura 3).

5. DISCUSSÃO

Os resultados sugerem que a exposição ocupacional a antineoplásicos é uma nova

preocupação para a saúde pública visto que, mesmo usando equipamentos de proteção

individual e/ou coletiva, esse tipo de exposição ocupacional pode causar danos no DNA

que predispõe ao desenvolvimento de câncer (ZHANG et al., 2016). Além disso, é cada

vez maior o número de casos dessa doença e por consequência é crescente o número de

profissionais da saúde que manipulam e/ou manuseiam esses medicamentos diariamente.

52

Assim, essa exposição ocupacional pode contribuir para o aumento da ocorrência de

câncer.

A frequência de danos reparáveis e permanentes no DNA aumentou de forma

significativa no presente estudo quando comparados os farmacêuticos e enfermeiros, que

trabalham na área de oncologia, fazendo a manipulação e a administração dos

antineoplásicos aos pacientes, respectivamente; com indivíduos que não atuam na área de

oncologia. Os nossos resultados corroboram os estudos de Rekhadevi et al. (2007), Izdez

et al. (2009) e Rombaldi et al. (2009) que indicaram o aumento da frequência de danos

reparáveis no DNA (avaliados pelo ensaio de cometa em linfócitos) bem como os estudos

de Rekhadevi et al. (2007), Rombaldi et al. (2009), El-Ebiary et al. (2011), Moretti et al.

(2014) e Rodríguez-Montero et al. (2016) que relataram o aumento de danos permanentes

(avaliados pelos ensaios de micronúcleo em células esfoliadas da mucosa oral). Nosso

estudo ainda demonstrou que o aumento desses danos ocorreram em indivíduos que

também apresentaram aumento da frequência de traços de ciclofosfamida e/ou ifosfamida

na urina como também foi relatado por Burgaz et al. (2002) e Rekhadevi et al. (2007). A

escolha pela análise da ciclofosfamida e seu metabólito se deve ao fato desse

medicamento ser vastamente utilizado em tratamentos oncológicos (SESSINK ; BOS,

1999). Mas, isso não exclui a necessidade de avaliação de outros medicamentos.

Esses resultados demonstram a crescente necessidade de biomonitoramente

genético e de traços de antineoplásicos na urina de profissionais da área da saúde que

manipulam e/ou manuseiam antineoplásicos visto que mesmo usando equipamentos de

proteção individual e coletivo a contaminação é recorrente. O presente estudo ainda

sugere que os ensaios de cometa, micronúcleo e quantificação de ciclofosfamida e

ifosfamida na urina são testes importantes para avaliar o nível de contaminação

ocasionada pela exposição ocupacional bem como para tomar medidas que impeçam

malefícios à saúde de tais profissionais.

53

6. REFERÊNCIAS

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54

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55

7. RESULTADOS

Tabela 1 - Dados demográficos de profissionais expostos a antineoplásicos.

Parâmetros Não Expostos (n=10) Expostos (n=49)

Sexo Feminino 05 (50%) 35 (71.42%) Masculino 05 (50%) 14 (28.57%)

Idade Mínimo 21 24 Máximo 50 57

Horas de trabalho Horas / dia - 6.43±0.25

Meses trabalhados - 43.95±5.78 Horas de exposição diária - Farmacêuticos - 5.60±1.85 Horas de exposição diária - Enfermeiros - 7.33±0.96

Meses de exposição - Farmacêuticos - 45.41±41.20 Meses de exposição - Enfermeiros - 41.70±38.96

Hábito de fumar Feminino 02 (4.08%) Masculino 02 (20%) 05 (10.20%)

Doença crônica Feminino 03 (6.12%) Masculino 01 (10%) 02 (4.08%)

Doença do Trato Urinário 0 0

57

Figura 2 - Figura apresentado o cometa de linfócito de profissional exposto em coloração

alaranjado de acridina (A). Média ± Erro Padrão da Média (EPM) da frequência de

células lesionadas e do escore no ensaio cometa (B), Figura apresentado o micronúcleo

de célula da mucosa oral de profissional exposto em coloração Giemsa (C), e frequência

de micronúcleos em células da mucosa oral (D). Gráfico de dispersão apresentando a

correlação linear de Pearson entre a frequência de danos genotóxicos (escore do ensaio

cometa x frequência de micronúcleo). Cada símbolo representa a frequência de ambas as

variáveis para um único indivíduo. A linha contínua representa a linha de regressão linear

(E). Control – Profissional não exposto, Pharmacy – Farmacêuticos, Nursery –

Enfermeiros. Teste Estatístico: B, D e E – ANOVA/Tukey, letras diferentes letras

indicam diferenças estatisticamente significativas (p<0,05); Correlação Linear de Pearson

(p<0,05).

Contr

ole

Farm

acêu

ticos

Enfe

rmei

ros

0.00

0.05

0.10

0.15

a

b b

An

álise d

e C

P e

m u

rin

a

Figura 3 - Análise de CP em amostras de urina de profissionais que não manuseiam

medicamentos antineoplásicos de profissionais expostos. Média ± Erro Padrão da Média

(EPM) da concentração de ciclofosfamida e seus resíduos na urina dos profissionais

(Teste Estatístico: Kruskal-Wallis/Dunn; p<0,05).

µg/

L

58

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS

A empregabilidade de testes de genética toxicológica no estudo de danos


biomonitoramento de risco ocupacional de farmacêuticos e enfermeiros que manuseiam

medicamentos antineoplásicos, considera-se:

- os ensaios do cometa e de micronúcleo são adequados para o biomonitoramento

de danos no DNA, em diferentes extensões do dano (genômico ou genético), induzido

por exposição a agentes e/ou devido a mudanças endógenas (como é o caso da

instabilidade genética induzida pelo câncer);

- no presente delineamento, não se evidenciou empregabilidade desses ensaios

para correlacionar a intensidade de danos no DNA/celulares e os estágios clínicos do

carcinoma de células escamosas de cavidade oral;

- o ensaio de morte celular (apoptose) proposto para o biomonitoramento em

questão, possuíam número mínimo de células visto que, a quantidade de células

observadas não foi suficiente para validar o teste.

- no biomonitoramento da exposição ocupacional, os ensaios de genotoxicidade

em diferentes grupos de profissionais, tanto para o ensaio do cometa quanto ao teste de

MN, ambos mostraram padrões gerais de danos ao DNA, independentemente da lesão.

- a exposição ocupacional a quimioterápicos podem causar danos genômicos e

genético-cromossômicos em profissionais que manuseiam medicamentos antineoplásicos

no tratamento de pacientes oncológicos.

- na análise da concentração de ciclofosfamida e seus resíduos na urina

demonstraram que há diferença significativa entre os grupos estudados de farmacêuticos

e enfermeiros que manuseiam antineoplásicos.

59

ANEXOS

61

ARTIGO 1.

Comet and micronucleus assays do not correlate with intensity of DNA damage and

the clinical stages of squamous cell carcinoma of the oral cavity

Rodrigo Juliano Oliveira1,2,3,4,5*, Andreza Negreli Santos1,2*, Lucas Roberto Pessatto1,4,

Albert Schiaveto de Souza5, Andréia Conceição Milan Brochado Antoniolli-Silva1,3,5,

Andréa Luiza Cunha-Laura2, Carlos Alberto Ferreira de Freitas1,3*



Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS, Brasil. 2Programa de Mestrado em Farmácia, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Alimentos

e Nutrição, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS, Brasil. 3Faculdade de Medicina Dr. Hélio Mandetta, Universidade Federal de Mato Grosso do

Sul, Campo Grande, MS, Brasil. 4Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Centro de Ciências

Biológicas, Universidade Estadual de Londrina, Londrina, Paraná, Brasil. 5Programa de Pós-graduação em Saúde e Desenvolvimento na Região Centro-Oeste,

Faculdade de Medicina Dr. Hélio Mandetta, Universidade Federal de Mato Grosso do

Sul, Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brasil.

*These authors contributed equally to this article.

*Corresponding author: Dr. Carlos Alberto F. Freitas Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Mato Grosso do Sul. Cidade Universitária, S/N. Campo Grande/MS – Brazil. CEP: 79070-900. Phone: 55-67-992213634 Fax: 55-67-3345.3001 Email: [email protected]

62

Abstract

Objective: This study was conducted with the aim of evaluating relationship between

cell damage intensity and oral cavity squamous cell carcinoma (OCSCC) clinical stages.

Materials and Methods: A total of 44 individuals, 24 oral cancer patients and 20 healthy

volunteers participated in this study. The exfoliated cells from the oral cavity were

collected using a wooden spatula. All samples were analyzed by comet assay,

micronucleus assay and cell death assay.

Results: Our results indicate that the diagnosis of OCSCC increases the frequency of

genotoxic damage (comet assay – 3.21x; micronucleus assay – 3.93x). However, it was

not possible to establish a correlation between frequency of DNA damage and disease

staging. The cell death assay was not effective for the proposed biomonitoring.

Conclusions: Given these findings, we consider the comet and micronucleus assays to be

adequate for biomonitoring DNA damage. However, with the current design, we could

not demonstrate the applicability of these assays to correlate the intensity of DNA/cell

damage and the clinical stages of OCSCC.

Clinical relevance: Oral cavity squamous cell carcinoma (OCSCC) is the sixth most

frequent malignant neoplasm worldwide. Its prognosis is poor, and despite advances in

the treatment of malignant neoplasms, the overall five-year survival is still approximately

50%, with a high rate of local, locoregional, and distant recurrence, justifying the need to

monitor this disease.

Keywords: genotoxicity, comet assay, micronucleus assay, apoptosis, biomonitoring,

oral cancer.

1. Introduction

Oral cavity squamous cell carcinoma (OCSCC) is the sixth most frequent malignant

neoplasm worldwide [1]. Its main etiological factor is smoking associated with alcohol

consumption [2, 3, 4, 5].

The prognosis of patients with OCSCC is poor, and survival remains approximately

50% [6]. Recurrence can be local, locoregional, or distant [7]. Cured patients may still

develop a second primary lesion [7,8]. Therefore, the identification of these individuals

63

(OCSCC) could advance the diagnosis, contributing to the selection of patients at higher

risk of recurrence and second lesions [9].

Given the above findings, this work evaluated the applicability and relationship

between intensity of cell damage and the clinical stages of OCSCC.

2. Materials and methods

A total of 44 individuals, 24 patients who were seen during their first visit to the

outpatient head and neck surgery department between August 2016 and August 2017 at

the Campo Grande Alfredo Abrão Cancer Hospital and 20 healthy volunteers participated

in this study. The healthy volunteer group consisted of 10 men (5 non-smokers and 5

smokers) and 10 women (5 non-smokers and 5 smokers). The volunteers were divided

into a non-smoker control group (NSC; n=10) and a smoker control group (SC; n=10).

The project was approved by the Human Research Ethics Committee at the

Federal University of Mato Grosso do Sul under grant no. 1,671,940. All individuals who

agreed to participate in the research study signed an informed consent form. Each

individual rinsed their mouth with drinking water, and the exfoliated cells from the oral

cavity were collected using a wooden spatula.

The exfoliated cells were placed in 0.9% saline solution (5 mL), centrifuged at

2000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was discarded.

2.1 Comet Assay

The comet assay was performed following Singh et al. [10], with modifications

by Navarro et al. [11]. The slides were stained a posteriori (100 µL with ethidium

bromide – 20x10-3 mg/mL), and 100 cells were analyzed with an epifluorescence

microscope (Motic® - BA410). Damage analysis and classification were based on

Kobayashi et al.[12] (1995). The total score was calculated by adding the values resulting

from multiplying the total number of cells observed in each class of lesion to which they

belonged with the class value [11].

64

2.2 Micronucleus Assay

A volume of 100 µL of cell suspension was used to prepare the smears in glass slides.

Next, the slides were stained with 10% Giemsa stain for 5 minutes and analyzed under a

brightfield microscope (Nikon® – Eclipse E200). A total of 1000 cells per individual was

analyzed, and the number of micronuclei was determined [13].

.

2.3 Cell Death Assay

The cell death assay was performed according to the description by Oliveira et al.

[14]. A volume of 100 µL of the cell suspension was used to prepare a smear on a glass

slide. The slide was fixed in Carnoy’s solution for 5 minutes, quickly dipped into plates

containing decreasing concentrations of ethanol (95% to 25%), washed with McIlvaine

buffer for 5 minutes, stained with Acridine Orange (0.01%, 5 minutes), and washed again

with buffer. The standard analysis was described by Carvalho et al. [15].

2.4 Statistical Analysis

The comet, micronucleus, and cell death assays were evaluated using

ANOVA/Tukey-Kramer according to a parametric distribution of the data using

GraphPad Prism software, version 7.00. Linear Pearson correlations were obtained with

the statistical program SigmaPlot, version 12.5. The level of significance adopted was

p<0.05.

3. Results

OCSCC was more prevalent among men (83.33%), and the mean age of the

individuals for both sexes was 64.5±24.74 years. The NSC and SC groups presented

means of 41.5±28.99 years and 51.5±20.50 years, respectively (Table 1).

In regard to OCSCC staging, 25% of the patients presented stage I or II neoplasms,

and 75% presented stage III or IV neoplasms. Among these individuals, 87.5% were

smokers. Alcohol consumption was present in 75%, 40%, and 20% of the individuals in

the OCSCC, SC, and NSC groups, respectively (Table 1).

65

In regard to chronic disease, only chronic hypertension was mentioned by the

individuals and confirmed, and it affected 12.5% of the individuals with OCSCC, 80% of

the SC group, and 10% of the NSC group (Table 1).

The comet assay showed that smoking increases (p<0.05) the frequency of

genomic (assay comet) damage by 2x and the lesion score by 3.10x. Patients with

OCSCC, before therapeutic intervention, presented 3.21x more genomic damage than did

the NSC group and a score 4.25x higher (p<0.05). In the post-therapeutic intervention

period, the frequency of DNA damage was reduced and did not differ from that for

individuals in the NSC group (p>0.05) (Figure 1A-B).

The micronucleus assay showed that individuals with a diagnosis of OCSCC have

a higher frequency of chromosomal damage. In regard to the NSC group, there was a

3.93x increase (p<0.05) in the frequency of micronucleated cells in the pretreatment

evaluation. After treatment, this frequency was reduced and was not different from that

in the NSC group (p>0.05) (Figure 1C).

Among individuals in the NSC and SC groups, a significant difference was

observed. The group of smokers showed a 3.64x increase in chromosomal damage

compared with non-smokers (Figure 1C).

The frequency of cell death ranged from 0.11±0.33 to 0.80±1.03 across the

different study groups, and no statistically significant difference was found (Figure 1D).

No relationship was found when the correlation between DNA damage frequency

(comet and micronucleus) and disease staging was evaluated. In addition, no relationships

between reduction in the frequency of DNA damage and treatments (chemotherapy,

radiotherapy and/or surgical intervention) were found. However, when the frequency of

genetic damage was correlated using the comet and micronucleus assays, a positive,

significant and moderate correlation was seen, regardless of treatment (r=0.662; p<0.001)

(Figure 1E).

4. Discussion

The oral mucosa is the first to contact potential genotoxic agents in the oral cavity

[16]. Genotoxic agents such as alcohol and cigarette components may trigger

carcinogenesis [17], including OCSCC [18].

66

In general, there is a correlation between the frequency of genotoxic damage and

the occurrence of carcinogenesis [16]. For this reason, genotoxic tests are used by

regulatory agencies to predict carcinogenic risk [19]. These assays are also applied in the

clinical biomonitoring of periodontal diseases and viral infections [20, 21]. However, the

literature on the correlation of genotoxic data and OCSCC staging is still limited, which

prompted this study.

Our data showed that the frequency of DNA damage by comet assay and the

micronucleus frequency were increased in the SC group. This result was expected, as

induction of genomic/genetic damage by cigarettes has been widely reported in the

literature [22, 23].

In regard to OCSCC, this study showed that the patients had increased comet

positivity and micronucleus frequency before treatment. Despite this statistically

significant difference compared to the NSC group, it was not possible to identify a

correlation between frequency of genotoxic damage and OCSCC staging.

Following therapeutic intervention, there was a reduction in genotoxic damage in

all patients who were re-evaluated, regardless of medical strategy. Moreover, it was not

possible to establish a correlation between frequency of DNA damage and disease staging

or therapeutic intervention, but a significant reduction in damage frequency was observed

after treatment.

When correlating the frequency of the damage evaluated by the comet and

micronucleus assays, there was a positive, significant, and moderate relationship. This

facts was already expected because the literature indicates that damage evaluated by the

comet assay is repairable genomic damage [24, 25], and the damage assessed by the

micronucleus assay is irreparable genetic damage that has been introduced in the genome

of the cell [26, 27]; i.e., the damage identified by the comet assay may become

incorporated into the genome and transform into chromosomal/genetic damage [28].

The cell death assay did not show applicability for the proposed monitoring, as

the frequency of the evaluated cells was too low.

5. Conclusions

Given the above findings, we conclude that the comet and micronucleus assays

are adequate for the biomonitoring of DNA damage at different damage levels (genomic

or genetic) induced by exposure to agents and/or due to endogenous changes (such as the

67

case of genetic instability induced by cancer). However, the current experimental design

did not show the utility of these assays for correlating the intensity of DNA/cell damage

with the clinical stages of OCSCC.

Compliance with Ethical Standards:

Conflict of Interest: Authors declare that they have no conflict of interest.

Funding: The work was supported by the Federal University of Mato Grosso do Sul in

Campo Grande, Brazil.

Ethical approval: The project was approved by the Human Research Ethics Committee at

the Federal University of Mato Grosso do Sul under grant no. 1,671,940. All procedures

performed were in accordance with the ethical standards of the institutional and national

research committee and with the 1964 Helsinki declaration and its later amendments or

comparable ethical standards.

Informed consent: Informed consent was obtained from all individual participants

included in the study.

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70

Table 1 - Absolute and relative values, and mean values ± standard error of the mean (SEM), relative to sex, age, cancer staging and life habits of control subjects (NSC – Non smoking control group, SC – Smoking control group) and patients diagnosed with squamous cell carcinoma of the oral cavity (OCSCC).

Parameters

Groups of study

NSC (n=10) SC (n=10) OCSCC (n=24)

Absolute values (percentage values) Sex

Female 5 (50%) 5 (50%) 4 (16,66%) Male 5 (50%) 5 (50%) 20 (83,33%) Age

Minimum 21 37 47 Maximum 62 66 82

Mean ± SEM 41,5 ± 28,99 51,5 ± 20,50 64,5 ± 24,74 Stages of Cancer

I to II - - 6 (25%) III to IV - - 18 (75%)

Chronic Disease (Chronic Hypertension)

Yes 1 (10%) 8 (80%) 3 (12,5%) No 9 (90%) 2 (20%) 21 (87,5%)

Smoking Yes 0 (0%) 10 (100%) 21 (87,5%) No 10 (100%) 0 (0%) 3 (12,5%)

Ethicism Yes 2 (20%) 4 (40%) 18 (75%) No 8 (80%) 6 (60%) 6 (25%)

71

Figure 1 - (A) Mean ± standard error of the mean (SEM) of the frequency of cells with lesions;(B) score of the comet assay; (C) frequency of micronuclei; (D) frequency of apoptotic cells; and (E) scatter plot showing the linear Pearson correlation between frequency of genotoxic damage (comet assay score x micronuclei frequency). Each symbol represents the frequency of both variables for a single individual. The continuous line represents the linear regression line. NSC – non-smoker control, SC – smoker control, OCSCC – oral cavity squamous cell carcinoma, Pre – pre-therapeutic intervention, Post – osttherapeutic intervention. Statistical test: A, B, C, and D – ANOVA/Tukey; different letters indicate statistically significant differences (p<0.05); linear Pearson correlation (p<0.05).

72

ARTIGO 2.

Biomonitoring of pharmacists and nurses at occupational risk from handling

antineoplastic agents

Andreza Negreli Santos1,2, Carlos Alberto Ferreira de Freitas1,3, Lucas Roberto

Pessatto1,4, Roberto da Silva Gomes5,6, Rodrigo Juliano Oliveira1,2,3,4*

1Center for Stem Cell Research, Cell Therapy and Toxicological Genetics, Maria

Aparecida Pedrossian University Hospital, Brazilian Company of Hospital Services,

Federal University of Mato Grosso do Sul, Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brazil. 2Master’s Program in Pharmaceutics, School of Pharmaceutical Sciences, Food and

Nutrition, Federal University of Mato Grosso do Sul, Campo Grande, Mato Grosso do

Sul, Brazil. 3Dr. Hélio Mandetta School of Medicine, Federal University of Mato Grosso do Sul,

Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brazil. 4Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, Biological Sciences Center,

Londrina State University, Londrina, Paraná, Brazil. 5Laboratory of Molecular Synthesis and Modification, School of Exact Sciences and

Technology, Federal University of Grande Dourados, Dourados, Mato Grosso do Sul,

Brazil. 6Chemistry Graduate Program, Institute of Chemistry, Federal University of Mato Grosso

do Sul, Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brazil.

*Corresponding author: Dr. Rodrigo Juliano Oliveira Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Mato Grosso do Sul. Cidade Universitária, S/N. Campo Grande/MS – Brasil. CEP: 79070-900. Phone: 55-67-3345.3068 Fax: 55-67-3345.3001 Email: [email protected]

73

ABSTRACT

Chemotherapy drugs are increasingly used for cancer treatment and pose occupational

exposure risks to health professionals. The objective of this study was to evaluate the

frequency of genetic lesions in pharmacists and nurses who prepare and/or handle

antineoplastic agents and to evaluate whether there are traces of contaminants in the urine

of these professionals. A total of 59 professionals participated in the study, of whom 10

were non-exposed professionals (controls), 25 were pharmacists, and 24 were nurses.

There was a significant increase in genetic damage in lymphocytes and cells of the oral

mucosa in both pharmacists and nurses. The levels of cyclophosphamide and ifosfamide

were also increased in the urine samples from those individuals. These results

demonstrate the growing need for genetic biomonitoring and the biomonitoring of trace

antineoplastic agents in the urine of health professionals who prepare and/or handle

antineoplastic agents. Although these professionals use individual and collective

protection equipment, contamination occurs repeatedly. This study further suggests that

comet and micronucleus assays and quantification of cyclophosphamide and ifosfamide

in urine are important tests to assess the level of contamination caused by occupational

exposure. We recommend that measures be implemented to prevent harm to pharmacists

and nurses.

Keywords: Occupational exposure; comet assay, micronucleus test; genotoxicity; spectrometry. INTRODUCTION

It is estimated that 17,113,355 new cases of cancer will occur in 2020 (WHO,

2012) and more than 20 million people will be affected by cancer in 2025 (Stewart and

Wild, 2014). This growth on a global scale is due to cancer’s multifactorial origins (it is

influenced by genetic traits and environmental factors) (Wang et al., 2017). Lifestyle

habits and occupational exposure are also important (Zeiger, 2017).

Pharmacists and nurses who prepare or handle antineoplastic agents are exposed

to danger, even though they use collective and individual protective equipment (IPE;

Moretti et al., 2011). This exposure increases the chance of DNA damage, which may

74

correlate with increased risk of cancer, fertility and congenital malformations (Ensslin et

al., 1994; Bohlandt et al., 2017).

The objective of the present study was to evaluate the frequency of genetic lesions

in pharmacists and nurses who prepare and/or handle antineoplastics and to evaluate

whether there are traces of contaminants in the urine of these professionals.

SAMPLE AND METHODS

Study participants and sample collection

A total of 59 individuals participated in the study, including 25 pharmacists, 24

nurses and 10 individuals from other fields with no occupational risk (negative controls)

from the city of Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brazil, from December 2016 to

February 2017.

The project was approved by the Human Research Ethics Committee of the

Federal University of Mato Grosso do Sul under opinion no. 1,870,703. All individuals

who agreed to participate in the study signed a free and informed consent form.

The volunteers underwent collection of 5 mL of peripheral blood in vials

containing heparin (BD®) and 5 mL of urine in a universal collector. Oral mucosal cells

were collected by scraping with a wooden spatula.

Biological assays

Comet assay in peripheral blood

Peripheral blood was kept at room temperature for decantation. The plasma layer

containing the lymphocytes was aspirated and transferred to a culture flask containing 7.5

mL of RPMI 1640 culture medium (GIBCO®, Lot 1788839), 2.0 mL foetal bovine serum

(GIBCO®, Lot SPBB2353V) and 0.2 mL of phytohemagglutinin (GIBCO®, Lot

1776926). The cells remained in culture for 72 h. Next, the cell suspension was

centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes, and the supernatant was discarded. A 20 µL sample

of the cell suspension was used for the comet assay, which was performed following

Singh et al. (1988), with modifications by Navarro et al. (2014). The slides were stained

a posteriori (100 µL with ethidium bromide – 20x10-3 mg/mL), and 100 cells were

75

analysed with an epifluorescence microscope (Motic® - BA410). Damage analysis and

classification were based on the work of Kobayashi et al. (1995). The total score was

calculated by adding the values resulting from multiplying the total number of cells

observed in each class of lesion by the class value (Navarro et al., 2014).

Micronucleus assay in cells scraped from the oral cavity

The exfoliated cells were placed in 0.9% saline solution (5 mL) and centrifuged

at 2000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was discarded. A volume of 100 µL of

cell suspension was used to prepare smears on glass slides. Next, the slides were stained

with 10% Giemsa stain for 5 minutes and analysed under a brightfield microscope

(Nikon® – Eclipse E200). A total of 1000 cells per individual were analysed, and the

number of micronuclei was determined (Benedetti et al., 2013).

Detection of cyclophosphamide in urine by mass spectrometry

To quantify cyclophosphamide (CP) in urine, we used N-trifluoroacetylated CP

as a standard, which was synthesized from commercial cyclophosphamide (Genuxal®;

Lot 6I139C Baxter Laboratory; Figure 1). Injecting cyclophosphamide into a gas

chromatograph produces both cyclophosphamide and ifosfamide, preventing correct

quantification of the chemotherapeutic.

Figure 1. Synthesis of cyclophosphamide

From a solution of 2.83 mg/mL of ethyl acetate cyclophosphamide pro analyse

(PA), a 7.06-µL aliquot was removed and mixed with 400 µL of ethyl acetate and 400 µL

of trifluoroacetic anhydride. The mixture was incubated at 90°C for 30 min. The resulting

76

solution was then dissolved in 100 µL of toluene, sonicated for 10 min and analysed by

gas chromatography (Sessink and Bos, 1999; Martins et al., 2004).

Calibration curves were constructed by analysing samples of N-

trifluoroacetylated CP with concentrations ranging from 0 to 5 µg/mL. The limits of

detection and quantification (signal-to-noise ratio 10:1) were 0.03 and 0.11 µg/L,

respectively. The retention time for CP was approximately 10.5 min. The ion fragment

m/z 307 abstracted from the full-scan spectra was selected for analysis in SIM mode based

on the retention time of N- trifluoroacetylated CP (Sessink et al., 1994).

Statistical analysis for the detection of cyclophosphamide residues in urine

The comet assay, micronucleus assay and detection of residual cyclophosphamide

in urine were evaluated using ANOVA/Tukey-Kramer or Kruskal-Wallis/Dunn

according to a parametric distribution of the data using GraphPad Prism software, version

7.00. Linear Pearson correlations were obtained with the statistical program SigmaPlot,

version 12.5. The level of significance considered was p < 0.05.

RESULTS

The group of exposed professionals was composed of 71.42% women and

28.57% men. Their ages ranged from 24 to 57 years with a mean of 35.10 ± 1.14. The

hours and months worked were 5.60 ± 1.85 hours and 45.41 ± 41.20 months for

pharmacists and 7.33 ± 0.96 hours and 41.70 ± 38.96 months for nurses. The sample

contained 4.08% and 10.20% smokers among the men and women, respectively, in the

exposed group. Regarding the occurrence of chronic diseases, 6.12% and 4.08% of the

women and men in the exposed group were hypertensive, respectively, and no individuals

had urinary tract diseases. In the exposed group (unpaired negative controls), there was

50:50 representation of the sexes, with age ranging from 21 to 50 years and a mean age

of 33.60 ± 2.89; 20% of the men were smokers, and 10% were hypertensive. No

urogenital tract disease was recorded in this group (Table 1).

Assessment of DNA damage by the comet assay (Figure 2A) revealed a significant

(p< 0.05) increase for the exposed group, with 2.94- and 3.03-fold increases observed in

pharmacists and nurses, respectively (Figure 2B). The micronucleus assay (Figure 2C)

also showed 2.98- and 3.05-fold increases (p < 0.05) for pharmacists and nurses,

77

respectively (Figure 2D). Pearson's linear regression for the comet and micronucleus

assays was significant (p < 0.001), positive and strong (r = 0.0826); that is, as the

frequency of genomic lesions (comet assay) increased, the frequency of permanent

damage (micronucleus assay) also increased (Figure 2E).

The presence of cyclophosphamide and/or its metabolites was evaluated in the

urine samples of exposed and non-exposed individuals (p < 0.05), and 6- and 6.5-fold

increases were observed for pharmacists and nurses, respectively (Figure 3).

DISCUSSION

The results suggest that occupational exposure to antineoplastic agents is a new

public health concern. Even when using personal and/or collective protective equipment,

this type of occupational exposure can cause DNA damage that puts people at risk of

developing cancer (Zhang et al. al., 2016). In addition, the number of cancer cases is

increasing, and the number of health professionals who prepare and/or handle these

medications on a daily basis is increasing in turn. Thus, this type of occupational exposure

may contribute to an increase in the occurrence of cancer.

The frequencies of reparable and permanent DNA damage were significantly

increased in pharmacists and nurses working in the oncology field, as it is these

professionals who prepare and administer the antineoplastic agent to patients,

respectively. Their frequencies of damage were elevated relative to individuals who do

not work in the field of oncology. Our results corroborate the studies of Rekhadevi et al.

(2007), Izdez et al. (2009) and Rombaldi et al. (2009), who found an increase in the

frequency of reparable DNA damage (assessed by the comet assay in lymphocytes) as

well as the studies of Rekhadevi et al. (2007), Rombaldi et al. (2009), El-Ebiary et al.

(2011), Moretti et al. (2014) and Rodríguez-Montero (2016), who reported increased

permanent damage (assessed by the micronucleus assays in exfoliated cells of the oral

mucosa). Our study also demonstrated an increase in these types of damage, and we

additionally found an increased frequency of traces of cyclophosphamide and/or

ifosfamide in urine, as has been reported by Burgaz et al. (2002) and Rekhadevi et al.

(2007). We chose to analyse cyclophosphamide and its metabolite because this drug is

widely used in cancer treatments (Sessink and Bos, 1999). However, this does not

preclude the need to evaluate other drugs.

78

These results demonstrate the increasing need for genetic biomonitoring and the

detection of trace antineoplastic agents in the urine of health professionals who prepare

and/or handle such agents. Even when individual and collective protection equipment is

used, contamination repeatedly occurs. The present study further suggests that the comet

and micronucleus assays and the quantification of cyclophosphamide and ifosfamide in

urine are important tests to assess the level of contamination caused by occupational

exposure and to establish measures to prevent damage to the health of cancer treatment

professionals.

REFERENCES

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Table 1. Demographic data of professionals exposed to chemotherapeutic agents.

Parameters Not Exposed (n = 10) Exposed (n = 49)

Sex Women 05 (50%) 35 (71.42%)

Men 05 (50%) 14 (28.57%) Age

Minimum 21 24 Maximum 50 57

Working Time Hours / day - 6.43 ± 0.25

Months worked - 43.95 ± 5.78 Hours of daily exposure -

Pharmacists - 5.60 ± 1.85

Hours of daily exposure - Nurses - 7.33 ± 0.96 Months of exhibition - Pharmacists - 45.41 ± 41.20

Months of exhibition - Nurses - 41.70 ± 38.96 Smoking Habit

Women 02 (4.08%) Men 02 (20%) 05 (10.20%)

Chronic disease Women 03 (6.12%)

Men 01 (10%) 02 (4.08%) Urinary Tract Disease 0 0

82

Figure 2. (A) Figure showing comets in lymphocytes of exposed professionals stained

with orange acridine. (B) Mean ± standard error of the mean (SEM) of the frequency of

damaged cells and comet assay score. (C) Figure showing micronuclei in oral mucosal

cell of an exposed professional stained with Giemsa. (D) Micronuclei frequency in oral

mucosa. (E) Scatter plot showing Pearson's linear correlation between the frequency of

genotoxic damage (comet assay score x micronuclei frequency). Each symbol represents

the frequency of both variables for a single individual. The solid line represents the linear

regression line. Control - Non-exposed professionals. Statistical tests: B, D and E -

ANOVA/Tukey; different letters indicate significant differences (p < 0.05); Pearson’s

linear correlation (p < 0.05).

Contr

ol

Phar

mac

y

Nurs

ery

0.00

0.05

0.10

0.15

a

b b

An

aly

sis

of

CP

in

uri

ne

Figure 3. Analysis of CP in urine samples of professionals who do not manipulate

antineoplastic and professional exposed in urine samples. Mean ± standard error of

the mean (EPM) of the concentration of cyclophosphamide and its metabolites in the

urine of professionals (Statistical Test: Kruskal-Wallis / Dunn; p <0.05).

µg

/L

UNIVERSIDADE FEDERAL DOMATO GROSSO DO SUL -

UFMS

PARECER CONSUBSTANCIADO DO CEP

Pesquisador:

Título da Pesquisa:

Instituição Proponente:

Versão:

CAAE:

Biomonitoramento genético da exposição ocupacional de farmacêuticos quemanipulam medicamentos antineoplásicos/quimioterápicos.

Andreza Negreli Santos

Universidade Federal de Mato Grosso do Sul - UFMS

1

62729616.9.0000.0021

Área Temática:

DADOS DO PROJETO DE PESQUISA

Número do Parecer: 1.870.703

DADOS DO PARECER

Biomonitoramento genético da exposição ocupacional de farmacêuticos que manipulam medicamentos

antineoplásicos/quimioterápicos.

Resumo:

A incidência de neoplasia maligna aumentou significativamente nas últimas décadas, tornando-se um grave

problema de saúde pública. O aumento

de pacientes que necessitam de tratamento quimioterápico levou a um maior número de profissionais

expostos durante a manipulação ocupacional e, portanto, se faz necessário cada vez mais o empenho com

os cuidados com a segurança ocupacional dos profissionais expostos diretamente aos agentes em questão

(Sabino; Tirapelli; Fonseca, 2015). Trabalhadores expostos podem sofrer danos em genes, de células

somáticas e/ou células germinativas, como proto-oncogenes e genes supressores tumorais o que pode levar

ao desenvolvimento de tumores (INCA, 2016). A associação

do dano genético com falha nos mecanismos de reparação são os eventos moleculares que estão

envolvidos com o início e progressão da carcinogênese. Assim, infere-se que vários agentes capazes de

provocar mutagenicidade, dentre eles alguns medicamentos, radiações, agrotóxicos e

Apresentação do Projeto:

Financiamento PróprioPatrocinador Principal:

79.070-110

(67)3345-7187 E-mail: [email protected]

Endereço:Bairro: CEP:

Telefone:

Pró Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação/UFMS

Caixa Postal 549

UF: Município:MS CAMPO GRANDE

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UFMS

Continuação do Parecer: 1.870.703

CAMPO GRANDE, 15 de Dezembro de 2016

PAULO ROBERTO HAIDAMUS DE OLIVEIRA BASTOS(Coordenador)

Assinado por:

Manuseio MaterialBiológico /Biorepositório /Biobanco

MaterialBiologico.pdf 16:49:24 Santos Aceito

Declaração deInstituição eInfraestrutura

CartaAnuenciaGEP.pdf 23/11/201616:46:43

Andreza NegreliSantos

Aceito

Cronograma Cronograma.pdf 23/11/201616:44:11

Andreza NegreliSantos

Aceito

Situação do Parecer:Aprovado

Necessita Apreciação da CONEP:Não

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PARECER CONSUBSTANCIADO DO CEP

Pesquisador:

Título da Pesquisa:

Instituição Proponente:

Versão:

CAAE:

Estudo da relação entre a intensidade de danos genéticos e os estágios clínicos docarcinoma de células escamosas de boca: Avaliação pré e pós intervenção cirúrgica,quimioterápica e/ou radioterápica.

Andreza Negreli Santos

Universidade Federal de Mato Grosso do Sul - UFMS

2

57136016.3.0000.0021

Área Temática:

DADOS DO PROJETO DE PESQUISA

Número do Parecer: 1.671.940

DADOS DO PARECER

O carcinoma de células escamosas de boca está entre as dez neoplasias malignas mais frequentes, sendo

o câncer de boca o quinto mais comum

no sexo masculino no Brasil (Colombo; Rahal, 2009 e Bragwath; Chandra, 2014). Estimativas do Instituto

Nacional do Câncer prevê a ocorrência de

15.490 novos casos de câncer de boca em 2016 no país e apesar de todos os avanços na terapêutica, e do

tratamento cada vez mais específico e

multidisciplinar, a taxa de sobrevida em cinco anos ainda é baixa, mantendo se em torno de 60% (Colombo;

Rahal, 2009; Bragwath; Chandra, 2014).

A associação do dano genético com falha nos mecanismos de reparação são os eventos moleculares que

estão envolvidos com o inicio e

progressão da carcinogênese. Vários agentes capazes de provocar mutagenicidade foram descritos, entre

eles alguns medicamentos, radiações,

agrotóxicos e outros (Mackenna et al., 2008). O principal fator etiológico do carcinoma de célula escamosa

de boca é o tabagismo. Mais de 60

substâncias capazes de gerar dano celular já foram identificadas no tabaco. A grande maioria dos

portadores da doença é tabagista, quase sempre

Apresentação do Projeto:

Financiamento PróprioPatrocinador Principal:

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Continuação do Parecer: 1.671.940

CAMPO GRANDE, 10 de Agosto de 2016

PAULO ROBERTO HAIDAMUS DE OLIVEIRA BASTOS(Coordenador)

Assinado por:

Situação do Parecer:Aprovado

Necessita Apreciação da CONEP:Não

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