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FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EXPERIMENTAL

Aniel Luna de Lima Chagas Musa

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE in vitro DE FRAÇÕES DO VENENO DE Bothrops

jararaca CONTRA Plasmodium falciparum

Porto Velho (RO)

2018

Aniel Luna de Lima Chagas Musa

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE in vitro DE FRAÇÕES DO VENENO DE

Bothrops jararaca CONTRA Plasmodium falciparum

Dissertação apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Biologia

Experimental - PGBIOEXP da

Universidade Federal de Rondônia -

UNIR como pré-requisito para a

obtenção do título de Mestre em

Biologia Experimental.

Orientador: Prof. Dr. Andreimar Martins

Soares

Porto Velho (RO)

2018

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AGRADECIMENTOS

À minha família, em especial ao Ian, meu irmão e orgulho.

À minha namorada, Júlia, por ser a melhor parceira de trabalho e um estímulo

para crescer.

Ao meu orientador, Dr. Andreimar Soares, por ser o exemplo de dedicação que

motiva a todos do laboratório.

Ao Dr. Kayano, pelas conversas e orientações durante o desenvolvimento

deste projeto.

À Drª. Carolina Bioni, chefe da Plataforma de Bioensaios de Malária e

Leishmaniose (Fiocruz), por ser uma pessoa atenciosa e gentil com todos ao

seu redor, além de fornecer os dados de atividade biológica deste trabalho.

Aos amigos e colegas integrantes do grupo CEBio. Em especial ao Ygor, Roni,

Ana, Johnny, Clara, Cláudia e Aleff. Mais especialmente ao Anderson e Jorge,

que contribuíram mais diretamente com o trabalho

Ao Passarini, pela amizade sincera e pela ajuda na confecção deste

manuscrito.

Aos amigos antigos, mas não menos importantes em minha caminhada. Os

“Homens do Alabama”: Saíd, João, Dandhi, Júnior, Késid, Paulo, Sony,

Portuga, Jairo e Wesley.

À Paula Azevedo e demais alunos e técnicos da Plataforma de Bioensaios

contra Malária e Leishmaniose, por participarem da produção dos resultados de

atividade antiplasmodial, citotoxicidade e hemólise utilizados neste trabalho.

Ao Dr. Leonardo Calderon, pelos ensinamentos e incentivo na reta final deste

trabalho.

Aos professores do PGBIOEXP, por me proporcionarem acesso às riquezas do

conhecimento.

Aos funcionários da UNIR e Fiocruz, por manterem a estrutura necessária para

o desenvolvimento deste estudo.

Aos órgãos financiadores que possibilitaram o desenvolvimento deste projeto,

Capes, Cnpq, Finep e Fapero.

RESUMO

A malária é uma doença parasitária que afeta grande parte da população mundial. O complexo ciclo de vida do Plasmodium sp. é um fator que dificulta o desenvolvimento de novas terapias e vacinas eficazes contra esta enfermidade. Além disso, o surgimento de resistência aos fármacos antimaláricos ressalta a importância da investigação de novas substâncias antiplasmodiais. Dentro desse contexto, os compostos naturais representam fontes ricas em moléculas bioativas, o que justifica a sua prospecção em busca de agentes terapêuticos. Os venenos ofídicos são produtos da biodiversidade que concentram grande variedade de moléculas com potencial utilização farmacológica. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi testar in vitro o veneno de Bothrops jararaca e frações proteicas deste material contra formas sanguíneas do P. falciparum. Inicialmente, a peçonha foi submetida à separação por cromatografia líquida de exclusão molecular em resina Superdex G-75, o que gerou 10 frações denominadas de P1g – P10g. Os testes biológicos revelaram a presença de atividade sobre P. falciparum (cepa W2) nas frações P2g, P3g, p4g e p5g (com IC50 variando de 0,1 a 0,59 µg/mL), tendo a fração P2g demonstrado a maior atividade antiplasmodial. Esta fração foi novamente fracionada por cromatografia líquida de troca aniônica em resina Capto-Q ImpRes, sendo obtidas mais cinco frações (P1q - P5q). As quatro últimas foram testadas contra o parasito e se mostraram ativas (com IC50 variando de 0,09 a 0,31 µg/mL). A fração mais potente (P3q) apresentou IC50 médio de 0,09 µg/mL; CC50 sobre células HepG2 maior que 10 µg/mL e índice de seletividade >111. Esta fração não se mostrou hemolítica na concentração de 10 µg/mL e a sua caracterização enzimática demonstrou a existência de dois possíveis componentes majoritários, fosfolipases A2 e uma protease, que podem ter atuada contra o parasito de forma isolada, sinérgica ou aditiva. A fração P3q foi submetida a cromatografia de fase reversa em resina C18 – Discovery, que gerou a separação dos dois grupos majoritários que a compunha. Testes antiplasmodias com estes grupos isolados são necessários para elucidar a forma de atuação antiplasmodial da fração P3q. O presente trabalho revelou a potencial atividade antiplasmodial do veneno de B. jararaca, ressaltando a capacidade antiparasitária contida nas classes de PLA2 e proteases testadas.

Palavras-chave: Malária. Bothrops jararaca. Bioprospecção. Fosfolipase A2.

Protease.

ABSTRACT

Malaria is a parasitic disease that affects great part of the world population. The complex life cycle of Plasmodium spp. difficults the development of new therapies and efficient vacines against this illness. Moreover, resistance to antimalarial drugs highlights the importance of investigating new antiplasmodial substances. Within this context, natural compounds represent rich sources of bioactive molecules, justifying its screening in a search for therapeutic agents. Snake venoms are products of the biodiversity which concentrate a wide variety of molecules bearing potential pharmacological activities. Thus, this study aimed at evaluating the in vitro antiplasmodial activity of B. jararaca crude venom and its protein-rich fractions against erythrocytic forms of P. falciparum. Initially, the venom was subjected to separation via molecular exclusion chromatography on a Superdex G-75 column, generating 10 fractions named P1g – P10g. The biological assays showed that the fractions P2g, P3g, P4g and P5g (IC50 ranging from 0.1 to 0.59 µg/mL) were active against the W2 strain of P. falciparum, with P2g being the most actively fraction. This fraction was further partitioned by anion exchange chromatography on a Capto-Q ImpRes column, generating five fractions (P1q - P5q). The latter four fractions were then screened against P. falciparum, with all of them presenting activity (IC50 ranging from 0.09 to 0.31 µg/mL). The most actively fraction (P3q) presented an average IC50 = 0.09 µg/mL; CC50 against HepG2 cells > 10 µg/mL and Selectivity Index >111. This fraction was not found to be hemolytic at 10 µg/mL. Its enzymatic characterization demonstrated the presence of two possible major compounds: phospholipases A2 and a protease, which could have interfered in the parasite’s life cycle additively, sinergystically or separately. The fraction P3q was subjected to reverse phase chromatography on a C18 – Discovery column, which separated the two groups of major compounds that constituted the fraction. Antiplasmodial assays using these two isolated groups are necessary to unravel the antiplasmodial action of fraction P3q. The present study revealed the antiplasmodial activity of the B. jararaca venom, emphasizing the antiparasitic potential of the evaluated PLA2 and protease classes.

Keywords: Malaria. Bothrops jararaca. Screening. Phospholipase A2. Protease.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Ciclo de vida de espécies de Plasmodium causadoras de malária em

humanos ......................................................................................................... 12

Figura 2 - Citoaderência de hemácias infectadas por P. falciparum ................ 16

Figura 3 - Mapa de distribuição da Malária ..................................................... 19

Figura 4 - Bothrops jararaca ............................................................................ 29

Figura 5 - Principais constituintes do veneno da B. jararaca ........................... 33

Figura 6 - Perfil cromatográfico do veneno de B. jararaca por exclusão

molecular Superdex (G-75) ............................................................................. 41

Figura 7 - Perfil eletroforético em SDS-PAGE das frações obtidas a partir da

cromatografia de exclusão molecular do veneno de B. jararaca ..................... 42

Figura 8 - Curvas de dose e resposta das frações P2g, P3g, P4g e P5g ........ 44

Figura 9 - Perfil cromatográfico da fração P2g em coluna de troca anônica

Hitrap Capto- Q ImpRes .................................................................................. 45

Figura 10 - Perfil eletroforético em SDS-PAGE das frações obtidas por

cromatografia de troca aniônica ...................................................................... 46

Figura 11 - Eletroforese SDS Page (15%) das frações P3q, P4q e P5q .......... 47

Figura 12 - Atividade fibrinogenolítica das frações P2q, P3q e P1c................. 48

Figura 13 - Atividade fosfolipásica das frações P2q, P3q, P4q e P5q ............. 49

Figura 14 - Atividade antiplasmodial da fração P3q ........................................ 50

Figura 15 - Atividade antiplasmodial da fração P4q ....................................... 51

Figura 16 - Atividade antiplasmodial da fração P5q ........................................ 52

Figura 17 - Atividade antiplasmodial da artemisinina ...................................... 53

Figura 18 - Teste de hemólise das frações P3q e P5q .................................... 55

Figura 19 - Cromatografia de fase reversa (C18 - Discovery) da fração P3q .. 56

Figura 20 - Cromatografia de fase reversa (C18 – Discovery) da fração P3c .. 57

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Características de parasitemia das cinco espécies causadoras da

malária humana .............................................................................................. 17

Tabela 2 - Principais grupos e exemplos de drogas antimaláricas .................. 21

Tabela 3 – Diversidade funcional de svPLA2 ................................................... 26

Tabela 4 - Fármacos derivados de venenos de serpentes comercializadas e em

fases de teste. ................................................................................................. 28

Tabela 5 - Atividade antiplasmodial em cepas W2 do veneno de B. jararaca e

frações geradas a partir de cromatografia de exclusão molecular, determinada

pelo método de Sybr Green ............................................................................ 43

Tabela 6 - Atividade antiplasmodial das frações obtidas por troca aniônica,

determinada pelo método Sybr Green ............................................................ 50

Tabela 7 - Citotoxicidade de frações do veneno de B. jararaca, determinada

pelo método colorimétrico MTT ....................................................................... 53

Tabela 8 - Índice de Seletividade das frações P3q e P5q ............................... 54

Tabela 9 - Venenos botrópicos testados in vitro contra formas sanguíneas de P.

falciparum ....................................................................................................... 58

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AMBIC – Bicarbonato de amônio

CEBio - Centro de Estudo de Biomoléculas Aplicadas à Saúde

BSA – Soro fetal bovino

NH4HCO3– Bicarbonato de amônia

mM– Milimolar

pH – Potencial hidrogeniônico

nm – Nanomolar

kDa – Quilo-dálton

RPMI – Royal Park Memorial Institute

SYBR Green -SYBR® Green Master Mix

PBS - Phosphate Buffer Solution

HPLC – High Performance Liquid Chromatography

IC50 - Concentração de inibição de 50% do crescimento parasitário

CC50 – Concentração citotóxica para 50% da população de células

IS – Índice de Seletividade

SDS – Sodium Dodecyl Sulfate

MTT - 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil brometo de tetrazolina

PBML – Plataforma de Bioensaios contra Malária e Leishmaniose - Fiocruz

P1g – Fração 1 obtida por cromatografia de exclusão molecular

P2g - Fração 2 obtida por cromatografia de exclusão molecular








http://www.thefreedictionary.com/Phosphate+Buffer+Solution


PM – Padrão molecular

P1q – Fração 1 obtida por troca iônica





PfEMP1 - Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1

PLA2 – Fosfolipase A2

VB - Veneno Bruto

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................ 11

1.1. Malária .................................................................................................. 11

1.1.1. Introdução à malária ....................................................................... 11

1.1.2. Epidemiologia da malária ................................................................ 17

1.2. Quimioterapia da malária ................................................................... 20

1.2.1. Fármacos utilizados no tratamento da malária ................................ 20

1.2.2. Resistência ..................................................................................... 22

1.3. Venenos ofídicos como fonte de novas terapias ............................. 25

1.4. Bothrops jararaca ............................................................................... 29

1.4.1. Biologia de B. jararaca .................................................................... 29

1.4.2. Proteômica do veneno de B. jararaca ............................................. 29

2. OBJETIVOS ............................................................................................... 33

2.1. Objetivo geral ..................................................................................... 33

2.2. Objetivos específicos ......................................................................... 34

3. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................... 34

3.1. Obtenção do veneno........................................................................... 34

3.2. Cromatografia de exclusão molecular - Superdex G-75 .................. 34

3.3. Cromatografia de troca aniônica – CaptoQ ImpRes ........................ 35

3.4. Cromatografia de fase reversa – C18 Discovery .............................. 35

3.5. Dosagem de amostras ........................................................................ 35

3.6. Análise eletroforética monodimensional (sds-page)........................ 36

3.9. Testes antimaláricos in vitro contra P. falciparum ........................... 37

3.9.1. Cultivo contínuo da fase eritrocítica do parasito .............................. 37

3.9.2. Sincronização dos parasitos para utilização nos testes in vitro ....... 38

3.9.3. Preparo das placas para os ensaios de quimioterapia .................... 38

3.9.4. Teste de avaliação da atividade antimalárica por Sybr Green ........ 39

3.9.5. Determinação da concentração inibitória de 50% do crescimento do

parasito (IC50) ........................................................................................... 39

3.10. ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE IN VITRO PELO MÉTODO DO MTT

.................................................................................................................... 39

3.11. Índice de seletividade ....................................................................... 40

3.12. Ensaio de hemólise........................................................................... 40

3.13. Análise estatística ............................................................................. 40

4. RESULTADOS ........................................................................................... 41

4.1. Fracionamento do veneno por cromatografia de exclusão molecular

.................................................................................................................... 41

4.2. Eletroforese monodimensional (SDS - PAGE) das frações de

exclusão molecular.................................................................................... 41

4.3. Atividade antiplasmodial das frações de exclusão molecular do

veneno de B. jararaca ................................................................................ 43

4.4. Cromatografia de troca aniônica – HiTrap Capto Q ImpRes ............ 44

4.5. Perfil eletroforético da cromatografia de troca iônica...................... 45

4.8. Atividade antiplasmodial das frações de troca iônica .................... 49

4.7. Atividade citotóxica das frações de troca iônica .............................. 53

4.8. Índice de seletividade (IS) .................................................................. 54

4.9. Ensaios de hemólise.......................................................................... 54

5. DISCUSSÃO ............................................................................................... 58

6. CONCLUSÃO ............................................................................................. 70

REFERÊNCIAS .............................................................................................. 71

ANEXO 1 – Aprovação do IBAMA para a implantação do banco de

venenos do CEBio. ....................................................................................... 87

ANEXO 2 – Autorização de acesso ao patrimônio genético – CGEN. ....... 88

ANEXO 3 - Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa – CEP. ............... 89

ANEXO 4 – Resultados de atividade in vitro contra Leishmania

amazonenses das frações de exclusão molecular do veneno de B.

jararaca. ......................................................................................................... 90

11

1. INTRODUÇÃO

1.1. Malária

1.1.1. Introdução à malária

A malária é a doença parasitária de maior importância médica nas

regiões tropicais e subtropicais do planeta (WHITE et al., 2014). Esta e as

demais doenças parasitárias afetam grande parte da população mundial e

atuam como limitantes naturais da qualidade de vida e desenvolvimento de

muitos países.

As protozooses são comuns em países subdesenvolvidos, nos quais o

nível de escolaridade e saneamento básico é baixo. Atualmente, a malária

ocorre em mais de 90 países, sendo considerada pela Organização Mundial da

Saúde uma das 10 principais causas de morte no mundo (WHO, 2016).

A malária é transmitida aos humanos por mosquitos que fazem parte da

família Culicidae e se agrupam dentro do gênero Anopheles. Nas Américas

destacam-se An. darlingi; An. aquasalis; An. albimanus; e An.

pseudopunctipennis como principais transmissores da doença aos humanos

(FORATTINI, 2002). Outras dez espécies têm importância médica em

diferentes regiões, como o An. gambiae, o principal vetor do continente africano

(SINKA et al., 2010).

Os protozoários que causam a doença pertencem ao gênero

Plasmodium, que contem aproximadamente 100 espécies (REY, 2008), sendo

que cinco apresentam relevância médica ao infectar humanos: P. falciparum,

considerado o mais virulento, sendo o maior causador de morte por malária

(WHO, 2016); P. vivax, o mais incidente no Brasil; P. malariae; P. ovale, e P.

knowlesi. Este último foi originalmente descrito como parasita exclusivo de

macacos asiáticos, mas recentemente se mostrou relacionado com infecções

em humanos (WHO, 2016).

A biologia destes protozoários é norteada por um intrincado ciclo

heteroxênico de parasitismo, no qual participam: seres humanos, hospedeiros

intermediários (que sustentam a fase de multiplicação assexuada e o início da

multiplicação sexuada); e mosquitos Anopheles fêmeas, hospedeiros

12

definitivos, nos quais o parasito completa seu ciclo sexuado. A figura 1 resume

as formas de vidas e etapas deste ciclo (CDC, 2014).

Figura 1 - Ciclo de vida de espécies de Plasmodium causadoras de malária em humanos

Ciclo do parasito da malária: Esquema destacando o início da infecção por Plasmodium sp. a partir da alimentação de uma fêmea infectada de anofelino, suas diversas fases de desenvolvimento nas células hepáticas durante o ciclo exo-eritrocitário, a instalação do parasita nas células vermelhas do sangue, com suas fases de desenvolvimento durante o ciclo eritrocitário, formação de gametócitos e reinfecção do inseto vetor. Fonte: Adaptado de CDC (2016).

Após a picada do mosquito, as formas infectantes para os humanos

instalam-se no hospedeiro. Estas formas, os esporozoítos, ao entrarem na

corrente sanguínea, levam em média 30 minutos para chegar ao fígado, órgão

no qual o protozoário desenvolve seu ciclo exoeritrocítico (ALY; VAUGHAN;

KAPPE, 2009).

As células hepáticas são parasitadas e utilizadas como fonte de abrigo e

alimento nessa etapa (STANWAY et al., 2011). Nesse ambiente se inicia o

processo de divisão por esquizogonia (hepática), dando origem às formas

merozoíticas, que rompem os hepatócitos e retornam para a corrente

sanguínea.

13

Na etapa hepática, P. vivax e P. ovale são espécies capazes de se transformar

na forma latente hipnozoíta, que se mantém no fígado e, se não combatida,

pode causar reinfecções (CDC, 2014).

Os merozoítos liberados do fígado são adaptados ao parasitismo de

hemácias. Ao invadir os eritrócitos e consumir seu conteúdo, os merozoítos

promovem modificações na estrutura da membrana celular hospedeira, que

facilitam a importação de nutrientes (WHITE, 2014). Depois da invasão, se

diferenciam em formas trofozoíticas, havendo um aumento da quantidade de

ribossomos e da síntese de proteínas. Este processo é dependente do

consumo da hemoglobina da célula parasitada (TILLEY; DIXON; KIRK, 2011).

O processo de divisão por esquizogonia (agora eritrocítica) se inicia,

gerando a forma esquizonte eritrocítica, que ao completar o processo

esquizogônico forma novos merozoítos. Estes rompem a hemácia e infectam

novos eritrócitos (KOCH; BAUM, 2016). A duração e periodicidade do ciclo

eritrocítico do parasito resultará nos quadros clínicos típicos da malária

(GAZZINELLI et al., 2014).

Durante o ciclo eritrocítico também há a geração de formas

gametocíticas. Por estímulos desconhecidos, trofozoítos imaturos diferenciam-

se em macrogametócitos (femininos) e microgametócitos (masculinos). Estas

são as formas infectantes para os mosquitos (KARUNAJEEWA; MUELLER,

2016).

No vetor invertebrado se dá o ciclo sexuado do parasita, que começa

durante o repasto sanguíneo, quando a fêmea anofelina suga formas

gametocíticas junto ao sangue do qual se alimenta (CDC, 2014). As outras

formas parasitárias, que causariam a doença nos humanos, não podem

sobreviver no estômago do mosquito, sendo digeridas com o restante do

sangue.

O gameta masculino passa por exoflagelação, formando de 6 a 8

microgametas, enquanto o gameta feminino transforma-se em um

macrogameta. Os gametas diferenciados fundem-se no interior do intestino do

inseto, dando origem a um zigoto amebóide, o oocineto, que invade o epitélio

intestinal e diferencia-se em oocisto. Este dá origem a inúmeros esporozoítos,

que migrarão para as glândulas salivares do Anopheles à espera do próximo

repasto sanguíneo (KARUNAJEEWA; MUELLER, 2016).

14

Quanto aos aspectos clínicos, muitos sintomas podem ser associados à

malária, que pode gerar desde quadros inespecíficos e pouco aparentes, até

doença grave com risco de morte (TUTEJA, 2007). Os sintomas são, em sua

maioria, associados ao final da divisão esquizogônica eritrocítica do parasito.

Nesta fase, numerosas substâncias residuais e fatores tóxicos presentes nas

hemácias são liberados na corrente sanguínea em razão da hemólise causada

pelos merozoítos (WHITE, 2014).

O acesso malárico caracteriza-se basicamente por três etapas: 1-

Aumento da temperatura corporal seguida da sensação de frio intenso,

geralmente associada à palidez; 2- Estabelecimento de febre alta (39 – 40 ºC),

calor e forte dor de cabeça; 3- Sudorese, decaimento da temperatura corporal e

sensação de alívio pelo paciente. Sintomas menos comuns são diarreias,

náuseas e vômitos. Em casos graves, pode haver anemia, falência renal,

insuficiência respiratória, acidose, estado de coma e até óbito (WHO, 2015).

1.1.2 Malária grave

A malária grave é uma emergência médica de alto risco. Diversas

variáveis influenciam para o desenvolvimento desta forma da doença. Dentre

elas, a espécie do parasito causador da infecção, os níveis de imunidade inata

e adquirida do paciente, tempo e eficácia do tratamento antimalárico, além de

fatores de risco como gravidez, idade menor que cinco anos e doenças

imunossupressoras. Apesar das espécies P. vivax e P. knowlesi também serem

capazes de desencadear formas graves de malária, a grande maioria dos

casos severos da doença são relacionados às infecções por P. falciparum

(WHO, 2014).

A maior virulência nas infecções por P. falciparum se deve a

características peculiares da espécie durante seu ciclo sanguíneo. Uma delas é

que as hemácias parasitadas por P. falciparum não permanecem na circulação

durante todo o ciclo de vida do parasito (ANTINORI et al., 2012). Após cerca de

24 horas da invasão dos eritrócitos, estas células se encontram aderidas aos

endotélios da microcirculação de diversos órgãos (KYES; HORROCKS;

NEWBOLD, 2001).

A fixação no sistema vascular é uma estratégia do parasito de fuga ao

sistema imune. Com a presença de proteínas aderentes com alta variação, as

15

hemácias infectadas aglomeram-se e se prendem na microcirculação,

garantindo a sua não destruição pelo baço (CRANSTON et al., 1984). Além

disso, os aglomerados de hemácias aumentam o contato dos parasitos com

eritrócitos não infectados (ROWE et al., 2012).

A expressão de proteínas de citoaderência em hemácias infectadas por

P. falciparum gera o sequestro das células nos endotélios. Entre proteínas

polimórficas de várias famílias, a família Erythrocyte Membrane Protein-1

(PfEMP1) é uma das principais envolvidas na aderência das hemácias

infectadas (HVIID; JENSEN, 2015).

Cada parasita contém aproximadamente 60 cópias variantes do gene

(Var) que codifica a PfEMP1, sendo uma cópia expressa de cada vez.

Modificações epigenéticas garantem a expressão concomitante de formas

alternativas desta proteína em subpopulações do parasito. Isso garante o

reestabelecimento da infecção à medida que surgem anticorpos para a versão

preponderante da PfEMP1 que é combatida (HVIID; JENSEN, 2015).

Diferentes fenótipos de ligação causam o sequestro das hemácias nas

redes capilares de diferentes órgãos, o que gera os variados quadros de

malária grave, como a malária cerebral e pulmonar, em que órgãos vitais

sofrem com obstruções em sua microvascularização e consequente hipóxia

(WHO, 2014). Além disso, a liberação concentrada de toxinas acumuladas nas

hemácias pode desencadear uma resposta imune focada, com aumento da

presença de mediadores pró-inflamatórios e consequentes danos teciduais

(ROWE et al., 2012).

Além da adesão aos endotélios, hemácias infectadas se aderem a

hemácias não infectadas, gerando aglomerados celulares chamados de

rosetas. Esta aglomeração pode ser mediada unicamente pelas proteínas de

citoaderência ou também com a participação de plaquetas (Figura 2) (ROWE et

al., 2012).

16

Figura 2 - Citoaderência de hemácias infectadas por P. falciparum

(a) Mecanismos de adesão de eritrócitos infectados por P. falciparum a diferentes células do hospedeiro. (B) Citoaderência de eritrócitos infectados por P. falciparum em culturas in vitro de células endoteliais cerebrais. Visualizado por meio de microscopia ótica de lâminas coradas com giemsa. (c) Rosetas detectadas em culturas in vitro de P. falciparum, visualizadas em microscopia óptica de lâminas coradas com giemsa. (d) Agregação de eritrócitos infectados mediada por plaquetas formadas pela incubação in vitro da cultura de parasitas e plaquetas. Visualização em microscopia óptica em lâminas coradas com giemsa. Fonte: adaptado de Rowe et al (2012).

Em P. falciparum, essa estratégia é tão bem desenvolvida que apenas

eritrócitos infectados com formas jovens do parasita são encontrados na

circulação periférica, um fato descoberto há mais de 100 anos

(MARCHIAFAVA, 1894). Isso demonstra que as formas adultas se encontram

todas sequestradas nos capilares de diversos tecidos, para assim completar o

restante das 48 horas do seu ciclo assexuado (MAC PHERSON et al., 1985).

17

Outra característica que torna o P. falciparum a espécie mais virulenta

de seu gênero é sua competência em infectar hemácias de todas as idades

(Tabela 1). Diferente de outras espécies, como o P. vivax, que infecta apenas

hemácias jovens, ou o P. malariae, que parasita apenas as hemácias maduras,

o P. falciparum ataca todos os eritrócitos. Essa aptidão é uma das

responsáveis pela alta densidade de parasitas por μL no sangue dos pacientes,

o que gera parasitemias de até dois milhões de parasitas por μL (ANTINORI et

al., 2012).

Tabela 1 - Características de parasitemia das cinco espécies causadoras da malária humana

Característica P. falciparum P. knowlesi P. malariae P. ovale P. vivax

Hemácias afetadas

Todas Todas Hemácias maduras

Reticulócitos Reticulócitos

Parasitemia por µL

Média Máxima

20.000-500.000 2.000.000

600-10.000 236.000

6000 20.000

9000 30.000

20.000 100.000

Infecções por P. falciparum podem chegar a parasitemia de até dois milhões de parasitas por μL. Fonte:

Adaptado de Antinori et al. (2012).

1.1.2. Epidemiologia da malária

A pobreza é o maior fator de risco para a malária (LUCAS;

MCMICHAEL, 2005). Cerca de 85% dos infectados por malária são analfabetos

ou possuem apenas educação básica. Em regiões afastadas e sem acesso

adequado à saúde pública, a população mais pobre padece com uma doença

infecciosa evitável e curável (SARGOLZAIE; KIANI, 2014).

Praticamente todas as regiões tropicais e subtropicais do planeta

representam áreas de risco para malária (CDC, 2016). Os principais focos da

doença se encontram na região subsaariana da África, na Ásia e América do

Sul. Atualmente, com 91 países endêmicos para a malária (Figura 3), cerca de

40% da população mundial se encontra em áreas de risco.

No levantamento mais atual da OMS, o ano de 2015 registrou 214

milhões de casos no mundo, dos quais 438 mil evoluíram até a morte.

Aproximadamente 80% das mortes por malária concentram-se em apenas 15

países, a maioria africanos. As crianças menores de cinco anos são as

18

principais vítimas e ainda morrem diariamente pela infecção no continente

africano (WHO, 2016).

Os números epidemiológicos alarmantes podem estar sendo

significativamente subestimados devido à dificuldade em coletar e sistematizar

os dados clínicos desta doença (HAY et al., 2010). Porém, apesar da malária

ainda ser uma doença de alta mortalidade e morbidade, o panorama desde

problema mundial de saúde vem melhorando.

O relatório de 2015 da OMS marcou o fim de um ciclo de políticas

públicas de saúde que resultou em um decréscimo de 60% no número de

mortes por malária em 15 anos. Dentro destes 15 anos, houve uma queda

generalizada no número de incidência de malária e até mesmo a erradicação

da doença em alguns países antes endêmicos (WHO, 2015).

Medidas relativamente simples, como o investimento em telas e

mosquiteiros com inseticidas de longa duração e a utilização em massa de

quimioterapias efetivas (terapias baseadas em combinações de derivados de

artemisinina - ACTs) receberam a maior parte do valor arrecadado para o

combate da malária (MARSH, 2016).

Tal melhora demonstra que a malária é uma doença eliminável e que a

meta de erradicação depende de políticas públicas de investimento. Dentro

desta perspectiva, a OMS lançou um programa de erradicação da malária

vigente de 2016 a 2030, que tem como objetivo para a última data reduzir em

90% a incidência global da malária. A empreitada tem como pilares o aumento

de investimento dos países endêmicos no combate à doença e utilização

correta de fármacos efetivos (WHO, 2015).

19

Figura 3 - Mapa de distribuição da Malária

Fonte: Adaptado de WHO (2016a).

No Brasil, a malária é um problema grave de saúde pública que afeta

toda a região da Amazônia legal (Acre, Amazonas, Amapá, Maranhão, Mato

Grosso, Pará, Rondônia, Roraima e Tocantins). Essa região concentra cerca

de 90% dos casos da doença no país. Diferente da África, no Brasil

predominam os casos de malária por P. vivax (cerca de 84%), seguidos pelo P.

falciparum (cerca de 16%) e P. malariae (menos de 0,1% de casos

documentados) (FERREIRA; CASTRO, 2016).

Em 2016 foram registrados cerca de 129 mil casos da doença no Brasil.

Este ano apresentou o menor número de relatos em 37 anos (BRASIL, 2015).

Porém, recentemente uma tendência epidemiológica negativa vem se

estabelecendo no Brasil. O ano de 2017 apresentou um aumento de 51% no

número de casos em relação à 2016. Quando comparados os dados obtidos

até março de 2018, percebe-se que a tendência de aumento dos casos se

preserva (SIVEP, 2018). Esse aumento revela a necessidade contínua de

políticas públicas e ações conjuntas entre governo federal, estadual e municipal

para o combate à malária no Brasil.

Rondônia se encontra na região oeste da bacia amazônica e neste

estado foram relatados 7482 casos de malária em 2015 (BRASIL, 2015). As

áreas mais afetadas pela doença são as situadas aos redores dos rios

20

Madeira, Jamari, Candeias e Machado. Em 2015 foram registrados na capital

3.604 casos (BRASIL, 2015), sendo que nas zonas ribeirinhas o número de

pacientes assintomáticos chega a ser cinco vezes superior aos casos

sintomáticos (TADA et al., 2012).

1.2. Quimioterapia da malária

1.2.1. Fármacos utilizados no tratamento da malária

A quimioterapia da malária é um dos pilares que sustenta o combate à

doença. Junto ao controle do mosquito vetor e diagnóstico adequado, o

tratamento quimioterápico é uma ferramenta indispensável na prevenção e

tratamento da malária (WHO, 2010). Seu arsenal conta com substâncias que

atacam o parasita em uma ou mais fases do seu ciclo de vida (BRASIL, 2010):

i) Fármacos que atacam a forma esquizogônica hepática, inibindo o

ciclo exoeritrocítico do parasita e recaídas da doença;

ii) Fármacos que atacam as formas intraeritrocitárias do parasita,

interrompendo o ciclo sanguíneo e combatendo os sintomas clínicos

da doença;

iii) Fármacos que atuam sobre os gametócitos, interrompendo a

infecção de novos vetores da doença.

Os fármacos que combatem as formas eritrocitárias do parasita são

classificados de acordo com suas funções e grupos químicos em: 4-

aminoquinolinas, endoperóxidos, arilaminoalcoóis, antifolatos, antibióticos e

inibidores da cadeia respiratória (DELVES et al., 2012). A tabela 2 resume os

grupos com seus principais exemplos de fármacos comercializados.

21

Tabela 2 - Principais grupos e exemplos de drogas antimaláricas

Quinina

Cloroquina

Amodiaquina

Fluoroamodiaquina

Piperaquina

4-aminoquinolinas

Mefloquina Arilaminoálcoois

Artemisinina

Diidroartemisinina

Arteméter

Arteéter

Artesunato

Endoperóxidos

Lapachol

Atavaquona Inibidores da cadeia de

transporte de elétrons

Lincomicina

Clindamicina Antibiótico

Eritromicina

Azitromicina Antibiótico

Minociclina

Doxicilina Antibiótico

Fonte: Adaptado de Fernández-Álvaro et al. (2016).

22

A artemisinina e seus derivados compõem as drogas antimaláricas mais

rápidas em diminuir a parasitemia nos pacientes. A ação rápida sobre as

formas sanguíneas torna estas drogas importantes ferramentas no controle dos

sintomas da doença (WOODROW; HAYANES; KRISHNA, 2005). Sua

importância para a quimioterapia da malária é tanta que o prêmio nobel de

medicina de 2015 foi para um dos envolvidos na descoberta deste fármaco

(HANBOONKUNUPAKARN; WHITE, 2016)

Os tratamentos atuais recomendados pela OMS baseiam-se em

combinações de drogas baseadas em artemisinina. Com a combinação, fases

diferentes do ciclo evolutivo do parasito podem ser inibidas e o tratamento mais

efetivo diminui o surgimento de resistência (WHO, 2016). As combinações mais

comuns utilizadas no tratamento de malária não complicada são: lumefantrina e

arteméter (Quartem); artesunato e amodiaquina (Coarsucam); artesunado e

mefloquina; diidroartemisinina e piperaquina (WHO, 2010).

Apesar da aparente diversidade de substâncias disponíveis para o

tratamento da malária, a capacidade dos parasitas de desenvolver resistência

explica o grande desafio presente na terapêutica desta doença. O

desenvolvimento de drogas antimaláricas eficazes e seguras remonta um

histórico de ciclos de esperanças seguidos por desilusão (VALE et al., 2005).

1.2.2. Resistência

O P. falciparum desenvolveu níveis de resistência a todos os fármacos

antimaláricos sintéticos, incluindo, mais recentemente, a artemisinina e seus

derivados (WHO, 2016). O surgimento de resistência a artemisinina gera

grande preocupação aos órgãos mundiais de saúde, já que a utilização de

ACTs (terapias baseadas em combinações de derivados de artemisinina) é um

dos pilares no combate atual à doença (DONDORP et al., 2017).

A utilização dos ACTs foi citada pela OMS (2016) como uma das

principais ferramentas utilizadas na redução de 60% do número de mortes por

malária no mundo. O risco de que as cepas resistentes à artemisinina irradiem-

se pelo globo representa uma ameaça às conquistas alcançadas contra essa

doença.

23

Como exemplo das consequências desta ameaça, tem-se o histórico da

cloroquina, um antimalárico sintético que foi largamente utilizado como primeira

linha de combate à doença, mas que hoje apresenta eficácia reduzida contra P.

falciparum. Em conjunto da utilização indiscriminada do inseticida DDT

(dichloro-diphenyl-trichloroethane), este fármaco foi um dos responsáveis pela

eliminação da malária na Europa, EUAs e outros regiões do planeta na década

de 1970 (BUNNAG; HARINASUTA 1987). Entretanto, a resistência dos

parasitas a esta droga emergiu quase simultaneamente no sudeste asiático

(Tailândia – 1957) (HARINASUTA; MIGASEN; BUNNAG, 1962) e na América

do Sul (Colômbia – 1959) (MOORE; LANIER, 1961).

A resistência se espalhou pelas regiões de origem até chegar ao litoral

leste da África em 1978 (CAMPBELL et al., 1979). Em 14 anos, espalhou-se

por todo o continente, gerando um grande custo à vida humana. O número de

mortes por malária no mundo aumentou nos anos 1980 até alcançar um novo

pico em 2004 (MURRAY et al., 2012). A resistência à cloroquina então se

espalhou por todo o mundo de forma a reproduzir quase fielmente a dispersão

dos parasitas (WERNSDORFER; PAYNE, 1991).

As terapias baseadas em derivados de artemisinina foram introduzidas

em meados dos anos 90 como tentativa de conter a malária em regiões como o

sudeste asiático, onde circulavam cepas multirresistentes. Como são drogas

potentes contra as formas sanguíneas do protozoário, a artemisinina e seus

derivados “limpam” a parasitemia mais rapidamente do que qualquer outro

fármaco antimalárico (ASHLEY et al., 2014).

Em 2005 a OMS recomendou que as combinações baseadas em

artemisinina fossem utilizados como drogas de primeira linha em todos os

países em que a malária fosse endêmica. Em 2008 a resistência do P.

falciparum à artemisinina foi descrita pela primeira vez no ocidente do Camboja

(NOEDL; SOCHEAT; SATIMAI, 2009), onde as taxas de falha dos tratamentos

aumentaram rapidamente (WHO, 2014). Desde então, a resistência a

artemisinina cresceu e se espalhou entre outros países do sudeste asiático

(DONDORP et al., 2017).

Refletindo sobre as possíveis causas e mecanismos que geram

resistência, múltiplos fatores parecem correlacionados (PETERSEN;

EASTMAN; LANZER, 2011):

24

(i) Altas taxas de mutações no parasito.

Altas taxas de mutação são vantajosas em situações com mudanças

rápidas de contexto ecológico (SNIEGOWSKI et al., 2000). Isto é o que

acontece quando os parasitos são expostos a pressão seletiva dos fármacos

(PETERSEN; EASTMAN; LANZER, 2011). Alguns estudos descrevem um

fenótipo mais propenso a desenvolver resistência a múltiplas drogas (ARMD),

presente em regiões da Sudeste asiático. Este fenótipo apresenta taxas

aceleradas de desenvolvimento de resistência (in vitro) quando comparado a

outras cepas. O fenótipo ARMD pode estar associado ao fato da resistência a

novas drogas ter surgido diversas vezes nessa região do planeta (RATHOD;

MCERLEAN; LEE, 1997).

(ii) Alta carga de parasitos.

As altas parasitemias, típicas de P. falciparum, podem propiciar uma

rápida eliminação de mutações deletérias e facilitar a seleção de mutações

com valor adaptativo (HASTINGS; PAGET-MCNICOL; SAUL, 2004).

(iii) A utilização inadequada do tratamento.

O uso inadequado dos fármacos antimaláricos pode resultar no contato

dos parasitas a concentrações sub-ótimas das drogas, o que aumenta a

chance do desenvolvimento da resistência (MÜLLER, 2011). Além do uso

incorreto das drogas, outros eventos podem estar relacionados. Em áreas com

alta transmissão da doença, é comum que pacientes no final do tratamento

antimalárico adquira novamente a doença, o que expõe os novos parasitos a

concentrações baixas do tratamento remanescente (STEPNIEWSKA; WHITE,

2008).

Alguns mecanismos moleculares de resistência foram descritos para P.

falciparum. A resistência a cloroquina e às outras 4-aminoquinolinas se dá pela

mutação no gene K76T. Esta mutação torna uma proteína transportadora do

vacúolo digestivo (PfCRT) capaz de remover seletivamente a cloroquina para o

citosol (SLATER, 1993).

A resistência aos fármacos da classe arilaminoálcoois também parece

estar associada a uma proteína transportadora do vacúolo digestivo.

Amplificações no gene pfmdr1, que codifica a proteína “P. falciparum

multiresistente a drogas 1 – PfMDR1”, está relacionado ao efluxo dos

arilaminoálcoois para o citosol (FAROOQ; MAHAJAN, 2004).

25

A situação atual revela que o monitoramento da resistência representa

um componente fundamental para estratégias de controle e tratamento da

malária. Além disso, a pesquisa de novos compostos antimaláricos se mostra

necessária (WHO, 2016), estratégia em que se enquadra o presente trabalho,

que busca em um veneno ofídico moléculas que possam enriquecer o arsenal

antimalárico.

1.3. Venenos ofídicos como fonte de novas terapias

Os produtos naturais representam a maior fonte de inovação terapêutica

para diversas doenças (CALDERON et al., 2009). As moléculas derivadas de

plantas, animais e microrganismos apresentam rica diversidade estrutural e

uma vasta gama de bioatividade (BASSO et al., 2005; HARVEY; EDRADA-

EBEL; QUINN, 2015)

Mais da metade dos fármacos aprovados desde 1994 são derivados de

compostos naturais. Isso demonstra a importância da biodiversidade no

desenvolvimento de novos fármacos (HARVEY, 2008). No contexto da

quimioterapia da malária, duas importantes drogas são produtos naturais. A

artemisinina é derivada da planta chinesa Artemisia annua (EASTMAN;

FIDOCK, 2009); e a quinina é isolada de espécies de plantas do gênero

Cinchona (DE OLIVEIRA; SZCZERBOWSKI, 2009).

O Brasil acumula uma das maiores reservas de recursos naturais do

planeta, sendo um lugar de grande variedade ecológica e biodiversidade

abundante. O potencial biotecnológico contido nas florestas brasileiras deve ser

explorado sustentavelmente, já que os possíveis produtos gerados agregam

alto valor comercial, revelando um viés de importância econômica pouco

explorada das áreas verdes do país (CALDERON et al., 2009).

Os venenos de muitas serpentes fazem parte das riquezas naturais do

Brasil, que possui 392 espécies de serpentes, sendo que 63 são consideradas

peçonhentas (COSTA; BÉRNILS, 2015). Os venenos ofídicos são substâncias

ricas em biomoléculas. As proteínas e peptídeos compõem mais de 90% do

peso seco destes materiais (CALVETE et al., 2009), que evoluíram com a

função primária de capturar, imobilizar e digerir presas específicas (BARLOW

et al., 2009). Fatores como duplicações, neofuncionalizações gênicas,

mutações pontuais não sinônimas, modificações pós-traducionais e

26

processamentos proteolíticos tornam os venenos de serpente substâncias

complexas e com grande diversidade funcional (CALVETE; JUÁREZ; SANZ,

2007; ZELANIS et al., 2010).

Apesar da função tóxica desempenhada pelos venenos, uma série de

outras atividades são descritas para as moléculas que os compõe. As

fosfolipases A2 de venenos ofídicos (svPLA2), por exemplo, apresentam grande

diversidade funcional. Uma única espécie de serpente pode conter até 15

diferentes tipos de PLA2s, com distintos efeitos tóxicos e farmacológicos

(VALENTIN; LAMBEAU, 2000). Alguns dos efeitos podem ser independentes

da ação enzimática dessas proteínas, como o efeito miotóxico, que é um

importante mecanismo no envenenamento botrópico (GUTIÉRREZ;

LOMONTE, 1995). As diversas atividades descritas para svPLA2 (Tabela 3)

demonstram uma complexa variabilidade funcional destas proteínas, que pode

ser explorada para o desenvolvimento de fármacos e ferramentas moleculares.

Tabela 3 – Diversidade funcional de svPLA2

Fonte: Adaptado de Kini (2003)

Junto à grande diversidade funcional das proteínas que compõem os

venenos de serpentes, a alta seletividade por alvos moleculares torna este

Efeitos farmacológicos de Fosfolipases A2 de venenos ofídicos

Neurotoxicidade Pré-sináptica Pós-sináptica

Miotoxicidade Mionecrose local Miotoxicidade sistêmica

Cardiotoxicidade Efeito Anticoagulante Inibição de agregação plaquetária Estimulação de agregação plaquetária Atividade hemolítica

Atividade indutora de hemoglobinúria Hemorragia interna Atividade convulsivante Atividade hipotensiva Atividade indutora de edema Danos a órgãos e tecidos

Danos ao fígado, rim, pulmão, testículos, hipófise

27

material biológico promissor como fonte de moléculas com aplicações

farmacológicas (UTKIN, 2015). De fato, os venenos ofídicos serviram como

base para o desenvolvimento de fármacos. O exemplo mais conhecido é o do

Captopril, um potente anti-hipertensivo desenvolvido a partir de um peptídeo

potenciador de bradicinida (BPP) isolado do veneno de Bothrops jararaca

(CUSHMAN et al., 1977).

Em 1970, o desenvolvimento deste fármaco marcou a nova era do

desenvolvimento de drogas baseadas em venenos (KING, 2013). O Sucesso

comercial do Captopril exaltou o potencial tecnológico contido nos venenos

ofídicos. Além disso, o desenvolvimento da estrutura química deste fármaco a

partir do modelo molecular de um peptídeo natural tornou-se um paradigma

para o design racional de drogas (VAN DONGEN et al., 2002).

A estrutura dos peptídeos de ação hipotensiva isolados do veneno de B.

jararaca (Bj-BPPs), em sua forma natural, não se mostrava efetiva ao ser

ministrada por via oral (GAVRAS et al., 1978). Essa estrutura serviu como

molde para o desenvolvimento de uma molécula menor, que preservava os

mesmos efeitos biológicos e atendia as propriedades farmacocinéticas exigidas

para um fármaco (CAMARGO et al., 2012). A remodelação foi baseada em

experimentos com modelos de enzimas, substratos e inibidores, que permitiram

a identificação e modificação química da região C-terminal de uma Bj-BPP,

culminando na fórmula do Captopril (CUSHMAN, 1977).

Além do Captopril, diversos outros fármacos foram desenvolvidos a partir

de constituintes de venenos ofídicos. A tabela 4 lista alguns dos remédios

aprovados pela FDA (Food and Drug Administration), órgão de vigilância e

fiscalização do governo norte-americano, e outros que ainda estão em fase de

teste.

28

FDA: Food and Drug Administration. Fonte: adaptado de Chan e colaboradores (2016)

Venenos ofídicos também apresentam atividade microbicida. Estudos in

vitro demonstraram a capacidade destas substâncias em inibir bactérias,

fungos e protozoários (GONÇALVES et al., 2002; STÁBELI et al., 2005;

GOMES et al., 2005). O veneno de B. jararaca, em específico, foi investigado

contra fungos (GOMES et al., 2005) e os protozoários Trypanosoma cruzi e

Leishmania major (GONÇALVES et al., 2002), demonstrando moléculas ativas.

O grupo CEBio, em colaboração com o grupo PBML, publicou trabalhos

que indicam a ação antiplasmodial de venenos botrópicos. Kayano e

colaboradores (2015) revelaram efeito antiplasmodial no veneno de B. brazili e

em uma metaloprotease (BbMP-1). Grabner e colaboradores (2017)

evidenciaram capacidade semelhante no veneno de B. marajoensis e em uma

fosfolipase A2 homóloga (BmajPLA2-II). Estes e outros estudos (GUILLAUME

et al., 2004; CASTILLO et al., 2012; QUINTANA et al., 2012; MALUF et al.,

2016; TERRA et al., 2015) revelam classes de proteínas de venenos ofídicos

com atividade antiplasmodial. Tais achados justificam a prospecção dos

Tabela 4 - Fármacos derivados de venenos de serpentes comercializadas e em fases de teste.

29

venenos ofídicos em busca de modelos químicos para o desenvolvimento de

novos fármacos antimaláricos.

1.4. Bothrops jararaca

1.4.1. Biologia de B. jararaca

A B. jararaca (Wied, 1824) - Figura 4 - é uma serpente peçonhenta

pertencente à família Viperidae e sub-família Crotalinae (MELGAJERO, 2003).

Figura 4 - Bothrops jararaca

Espécime adulto de B. jararaca e sua distribuição geográfica no Brasil.

Fonte: Adaptado de www.ambiente.sp.gov.br/parque-da-cantareira e de Fundação Nacional de

Saúde, 2001.

A B. jararaca distribui-se geograficamente entre o Norte da Argentina e

Nordeste do Paraguai, sendo mais frequente no Brasil, onde é recorrente no

Sul e Sudeste. Sendo a espécie mais encontrada no Sudeste do país, é a

principal causadora de acidentes ofídicos nessa área (cerca de 90% dos

acidentes) (BRASIL, 2001).

Os sintomas do envenenamento por esta serpente devem-se as três

principais atividades deste veneno: proteolítica, que resulta em edema

inflamatório no local da picada; hemorrágica, com danos aos endotélios,

sangramento local e sistêmico; e pró-coagulante, que, in vivo, leva ao consumo

dos fatores de coagulação e gera hemorragia (VARANDA; GIANNINI, 1999).

1.4.2. Proteômica do veneno de B. jararaca

Uma variedade de pelo menos 100 diferentes proteínas é descrita entre

os venenos ofídicos (SERRANO et al., 2005), sendo que estas podem

30

apresentar ou não atividade enzimática. Dentre as enzimaticamente ativas

encontram-se as proteases, fosfolipases, fosfodiesterases, colinesterases,

catalases, ATPases, aminotransferases, L-aminoácido-oxidases,

hialuronidases e NAD nucleosidases (CALVETE; JUÁREZ; SANZ, 2007).

Mesmo sem atividade enzimática, diversas outras proteínas compõem os

venenos ofídicos e demonstram atividades biológicas, como as lectinas do tipo

C, desintegrinas, miotoxinas, neurotoxinas, proteínas secretoras ricas em

cisteína (CRISPs), fatores de crescimento, inibidores de proteases, peptídeos

natriuréticos, peptídeos potenciadores de bradicinina entre outros (MC

CLEARY; KINI, 2013).

Com pelo menos 42 diferentes proteínas constituindo o veneno da B.

jararaca (FOX et al., 2006), as metaloproteases representam boa parte

(aproximadamente 42%) das proteínas expressas nesta peçonha, com as três

classes presentes: PI (3,8%), PII (9,4%) e PIII (29,6%) (SOUSA et al., 2013).

Este grupo de hidrolases depende da ligação a um metal, em geral o

zinco, em seu sítio catalítico para tornarem-se enzimaticamente ativas.

Apresentam massa molecular que varia de 20 a 100 kDa e são divididos, de

forma geral, em três grupos de acordo com a organização e presença de

domínios não catalíticos, que interferem no mecanismo de ação de cada

subgrupo.

A classe PI apresenta em sua estrutura madura apenas o domínio

metaloprotease (M). A classe PII é formada pelo domínio M seguido pelo

domínio desintegrina (D). A classe PIII apresenta, além dos domínios M e D, o

domínio rico em cisteína (C). A subdivisão PIIId ainda conta com um domínio

do tipo lectina (FOX; SERRANO, 2008).

São moléculas responsáveis pelo edema e mionecrose no local da

picada, assim como pelo quadro sistêmico de hemorragia. Os efeitos locais se

devem principalmente à ação sobre componentes proteicos de capilares e

vênulas, gerando a degradação de estruturas de matriz extracelular e lâmina

basal, que mantêm a integridade do sistema vascular (GUTIÉRREZ et al. 2005;

2006).

Do ponto de vista bioquímico, as metaloproteases geram um efeito pró-

coagulante in vitro, já que ativam e consomem fatores de coagulação como o

fibrinogênio (SANTORO et al., 2008). Uma das mais bem estudada

31

metaloproteases isolada do veneno de B. jararaca é a jararagina, uma enzima

de alta massa molecular (PAINE et al., 1992).

Outro grupo de proteases que compõe cerca de 11% do veneno de B.

jararaca são as serinoproteases (SOUSA et al., 2013). Estas enzimas

compreendem uma grande variedade de peptidases que apresentam um

resíduo de serina ativo em sua tríade catalítica (SERRANO; MAUROUN, 2005).

São glicoproteínas expressas como zimogênios de cadeia simples, com massa

molecular variável de 26 a 67 kDa, massa esta que depende da quantidade de

glicosilações da molécula (MATSUI; FUJIMURA; TITANI, 2000).

As serinoproteases apresentam uma grande variedade de substratos. No

envenenamento, estas proteínas afetam diversos sistemas, gerando

principalmente distúrbios hemostáticos, afetando a cascata de coagulação, o

sistema complemento, plaquetas sanguíneas entre outros (SERRANO;

MAROUN, 2005). Um exemplo de serinoprotease isolada do veneno de B.

jararaca é a KN-BJ, um grupo de enzimas ativadoras de fibrinogênio

(SERRANO et al., 1998).

O estudo proteômico do veneno da B. jararaca demonstrou que,

diferente da maioria dos demais venenos botrópicos, as lectinas compõem

grande parte deste veneno (cerca de 20%) (SOUSA et al., 2013). Em especial

as lectinas do tipo C, proteínas homodiméricas de subunidades com

aproximadamente 14 kDa cada ligadas por ponte disulfeto (SARTIM;

SAMPAIO, 2015). A pesar de não demonstrarem atividade catalítica, essas

moléculas são capazes de desempenhar funções biológicas, como ligação

seletiva a carboidratos e aglutinação de hemácias (LEPENIES; LEE;

SONKARIA, 2013).

As L-aminoácido oxidases são componentes importantes deste veneno,

representando cerda de 10% das proteínas avaliadas pelo estudo proteômico

de Sousa e colaboradores (2013). Estas são, em sua maioria, flavoenzimas

homodímeras da classe das oxirredutases, atuando na desaminação de L-

aminoácidos, gerando como subprodutos peróxido de hidrogênio e amônia.

Apresentam como co-fatores o FAD (dinucleotídeo de flavina e adenina) ou

FMN (mononucleotídeo de flavina) ligados de forma covalente a sua estrutura.

Pesquisas sugerem que estas enzimas podem ser citotóxicas, gerar agregação

plaquetária e apoptose celular (GUO et al., 2012).

32

As fosfolipases secretadas do tipo A2 são importantes toxinas dos

venenos botrópicos, apesar de representar apenas 3% das proteínas do

veneno de B. jararaca (SOUSA et al., 2013). Apresentam baixa massa

molecular (13 – 15 kDa), cinco a oito pontes dissulfeto e ação enzimática

dependente de Ca2+ (GUTIÉRREZ; LOMONTE, 1995; STÁBELI et al., 2012). A

ação enzimática catalisa a quebra da ligação éster de fosfolipídeos na posição

sn2, gerando lisofosfolipídeos e ácidos graxos como produtos (DENNIS et al.,

2011).

Os ácidos graxos liberados, como o ácido araquidônico, podem

desempenhar a função de segundo mensageiro. Estes sinalizadores estão

envolvidos em diversas funções celulares, como proliferação, diferenciação e

apoptose. Além disso, são precursores de eicosanoides, que são mediadores

inflamatórios e participam da transdução de sinais celulares (BURKE; DENNIS,

2009). Os lisofosfolipídeos gerados pela ação enzimática das PLA2s também

podem atuar na sinalização celular, no remodelamento de fosfolipídeos, assim

como podem desestabilizar membranas e provocar hemólise (DENNIS et al.,

2011).

As PLA2s que apresentam o aminoácido lisina na posição 49 (ao invés

do aminoácido aspartato, presente em PLA2 enzimaticamente ativas) são

incapazes de estabilizar o Ca2+ em seu sítio ativo. Por isso apresentam baixa

ou inexistente atividade catalítica. Apesar disso, PLA2s Lys49 desempenham

funções biológicas, como efeito miotóxico, atividade edematogênica e

anticoagulante (LOMONTE, 2009).

Devido ao efeito pró-inflamatório e miotóxico, as PLA2s são uma das

principais responsáveis pelos danos no local da picada. No envenenamento por

B. jararaca este efeito é menos pronunciado quando comparado aos efeitos do

veneno de B. moojeni, por exemplo (ZAMUNÉR et al., 2004). Fato que é

relacionado com a baixa presença de PLA2 contido no veneno de B. jararaca.

Outros componentes integram o veneno de B. jararaca em menor escala,

como os peptídeos potenciadores de bradicinina (BPPs), proteínas secretadas

ricas em cisteína (CRISPs), fator de crescimento de endotélio vascular

(CIDADE et al., 2006), fatores de crescimento de nervo, fosfodiesterases entre

outros (SOUSA et al., 2013). A figura 5 representa de forma resumida os

33

principais componentes do veneno de B. jararaca em suas proporções

analisadas por técnicas proteômicas.

Figura 5 - Principais constituintes do veneno da B. jararaca

(SVMPs) Metaloproteases de venenos ofídicos; (SVSPs) Serinoproteases de venenos ofídicos; CLEC (Lectina-de tipo C); (PLA2) Fosfolipase A2; (LAAOs) L-aminoácido oxidases. Fonte: adaptado de Sousa et al. (2013).

Considerando as informações expostas sobre a resistência do P.

falciparum e a necessidade do desenvolvimento de novos fármacos

antiplasmodiais, o veneno de B. jararaca foi escolhido como modelo de estudo

para investigação de proteínas com atividade antiplasmodial.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

Estudar a atividade antimalárica in vitro do veneno de Bothrops jararaca

contra formas sanguíneas de Plasmodium falciparum, realizando um

fracionamento direcionado por atividade antiplasmodial.

SVMPs42%

SVSPs11%

CLEC23%

PLA23%

LAAOs10%

Outros11%

SVMPs

SVSPS

CLECL

PLA2

LAAOs

Outros

34

2.2. Objetivos específicos

• Fracionar compostos proteicos do veneno de Bothrops jararaca,

caracterizando parcialmente os seus aspectos bioquímicos;

• Investigar a atividade in vitro das frações do veneno de B. jararaca

contra P. falciparum;

• Analisar a citotoxicidade in vitro das frações ativas do veneno em cultura

de cepa celular HepG2.

• Avaliar a ação hemolítica das frações ativas em eritrócitos humanos;

• Calcular o índice de seletividade das frações ativas testadas.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Obtenção do veneno

O veneno de Bothrops jararaca foi obtido do banco de venenos do

Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas à Saúde (CEBio) da Fundação

Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), unidade situada na Universidade Federal de

Rondônia (UNIR). O veneno desidratado foi mantido refrigerado no banco de

venenos até o momento do uso. Autorização do IBAMA sob número 27131-3

(Anexo 1). Autorização do CGEN/MMA sob número 010627/2011-1 (Anexo 2).

3.2. Cromatografia de exclusão molecular - Superdex G-75

Replicatas de 10 mg do veneno de B. jararaca foram suspensos em 500

µL de tampão Bicarbonato de amônio (NH4HCO3 – AMBIC) 50 mM, pH 8,0 e

centrifugadas a 9,3x103 g por 10 minutos. O conteúdo solubilizado foi

submetido a fracionamento cromatográfico em resina de exclusão molecular

Superdex G-75 (30 x 1 cm) previamente equilibrada com o tampão de diluição

da amostra. O procedimento foi realizado em sistema de FPLC ÄKTA purifier™

(GE Healthcare Lifescience). A eluição das amostras foi realizada sob

gradiente isocrático com Ambic 50 mM e fluxo de 0,5 mL/minuto. As amostras

foram monitoradas em 215 e 280 nm, coletadas manualmente, secas em um

evaporador centrífugo a vácuo e armazenadas em temperatura de -20°C.

35

3.3. Cromatografia de troca aniônica – CaptoQ ImpRes

A fração de interesse obtida no passo cromatográfico anterior foi diluída

em 1 mL de tampão bicarbonato de amônio (NH4HCO3 – AMBIC) 50 mM, pH

8,0 e centrifugada a 9,3x103 g por 10 minutos. O conteúdo solubilizado foi

submetido a fracionamento cromatográfico em coluna de troca aniônica Capto

Q ImpRes (3 x 1 cm) previamente equilibrada com o tampão de diluição da

amostra e fracionadas sob gradiente linear de Ambic 500 mM pH 8,0 em 10

volumes de coluna. O procedimento foi realizado em sistema de FPLC ÄKTA

purifier™ (GE Healthcare Lifescience). As amostras foram monitoradas em 215

e 280 nm, coletadas manualmente, secas em um evaporador centrífugo a

vácuo e armazenadas em temperatura de -20°C.

3.4. Cromatografia de fase reversa – C18 Discovery

A fração de interesse obtida na cromatografia de troca aniônica foi

solubilizada em 1 mL de solução aquosa de ácido trifluoracético (TFA) 0,1%

(Solução A), e submetida ao fracionamento pela cromatografia de fase reversa

em resina Discovery C18 (25 x 4,6 mm - Supelco), previamente equilibrada

com a solução A (0,1% TFA) e eluída sob gradiente de 0 a 70% de solução B

(99,9% (v/v) de acetonitrila (ACN) e 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA (v/v))

por 10 volumes de coluna, sob fluxo de 1 mL/minuto. O procedimento foi

realizado em sistema de FPLC ÄKTA purifier™ (GE Healthcare Lifescience). As

amostras foram monitoradas em 215 e 280 nm, coletadas manualmente, secas

em um evaporador centrífugo a vácuo e armazenadas em temperatura de -

20°C.

3.5. Dosagem de amostras

Antes de iniciar a quantificação de proteínas presentes nas amostras, foi

realizada a preparação de uma curva padrão de cinco pontos (0,125; 0,25; 0,5;

1,0 e 1,4 mg/mL) utilizando BSA (Albumina de Soro Bovino – Bio-Rad Protein

Assay) 1,4 mg/mL, juntamente com os reagentes A e B presentes no kit DC

Protein Assay da Bio-Rad e conforme as instruções presentes no manual do

36

fabricante. Esta curva foi utilizada como patâmetro de densidade ótica para a

dosagem das amaostras.

Para quantificação de proteínas utilizou-se o DC Protein Assay Kit da

Bio-Rad, composto pelos reagentes A e B. Tal procedimento seguiu o princípio

de Lowry e colaboradores (1951), com modificações. Os ensaios foram

realizados em triplicata em placa de 96 poços, utilizando-se 5 μL da amostra a

ser analisada juntamente com 25 μL do Reagente A e 200 μL do Reagente B.

A placa foi incubada por 15 minutos em ambiente escuro e a leitura realizada

em espectrofotômetro com absorbância de 750 nm.

3.6. Análise eletroforética monodimensional (sds-page)

A eletroforese em gel de poliacrilamida 12,5% (m/v) na presença de

dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) foi realizado em condições redutoras

conforme descrito por Laemmli (1970). Após a corrida eletroforética, o gel foi

fixado em solução aquosa de metanol 40% (v/v) e ácido acético 7% (v/v) por 15

minutos. As bandas de proteínas foram evidenciadas por meio da imersão em

solução contendo Coomassie Brillant Blue G-250® 0,08% (m/v), sulfato de

alumínio 8% (m/v), ácido o-fosfórico 1,6% (m/v) e metanol 20% (v/v) pelo

período de 15 minutos. O excesso de corantes foi retirado por imersão em

solução descorante contendo etanol 4% e ácido acético 7% (v/v) em água.

Várias trocas desta solução foram realizadas até a obtenção do gel com

coloração adequada. O marcador de peso molecular utilizado foi o Precision

Plus Protein™ Unstained Protein Standards (Bio-Rad – 1610363) de 250 a 10

kDa. A imagem do gel foi obtida com uso de equipamento Image scanner® (GE

Healthcare Lifesc).

3.7. Atividade fibrinogenolítica

A atividade foi determinada segundo metodologia descrita por Rodrigues

e colaboradores (2000) com modificações, no qual 10 μL de solução de

fibrinogênio bovino (2,5 mg/mL de fibrinogênio em Tampão fosfato-salino - PBS

pH 8,0) foram incubadas com 20 μg das frações a 37 ˚C por duas horas. A

37

reação foi interrompida pela adição de 20 μL de tampão TRIS-HCl 0,05 M, pH

8,0, contendo 10 % (v/v) 2-mercaptoetanol, 2 % de SDS (v/v) e 0,05 % azul de

bromofenol (m/v). As amostras foram submetidas a eletroforese SDS-PAGE e

separada sob tensão constante de 150V por 75 minutos. O processo de

fixação, coloração e descoloração foram feitos como descrito no tópico 3.6.

3.8. Atividade fosfolipásica

O procedimento foi realizado conforme descrito por Petrovic e

colaboradores (2001), com modificações. A atividade fosfolipásica foi

determinada utilizando como substrato uma solução contendo 5 mg de 4-nitro-

3-(octanoiloxi) benzoico (4N3OBA) diluído em 5,4 mL de acetonitrila (ACN).

Alíquotas de 0,1 mL foram secas e mantidas a -20°C. Cada tubo contendo

4N3OBA foi diluído em 1,2 mL de tampão de amostra (Tris-HCl 10 mM em pH

8,0, CaCl2 10 mM e NaCl 100 mM) e mantido no gelo. Para determinação

da atividade fosfolipásica, foi aplicado 190 μL de reagente 4N3OBA

combinados com 10 μL de amostra ou água (branco) e, imediatamente,

incubados a 37°C. A absorbância (425 nm) foi mensurada em intervalos de 1

minuto por um período de 30 minutos.

3.9. Testes antimaláricos in vitro contra P. falciparum

As frações do veneno de B. jararaca, já dosadas e liofilizadas, foram

solubilizadas em água MiliQ para utilização nos testes biológicos. Os testes de

atividade antiparasitária foram realizados na Plataforma de Quimioterapia da

Malária e Leishmaniose (Fiocruz - RO).

3.9.1. Cultivo contínuo da fase eritrocítica do parasito

Nos ensaios de atividade antimalárica foram utilizadas formas

sanguíneas de um clone de P. falciparum Cloroquina-resistente (W2). Os

parasitos foram cultivados em hemácias humanas sob condições estabelecidas

por Trager e Jensen (1976) com pequenas variações.

As células foram cultivadas em garrafas de cultura, com hematócrito a

2%, diluídos em meio de cultura RPMI 1640 (Sigma-Aldrich) suplementado com

38

25 mM de Hepes (Sigma-Aldrich), 21 mM de bicarbonato de sódio (Sigma-

Aldrich), 11 mM de glicose (Sigma-Aldrich), 40 μg/mL de gentamicina e 10%

(v/v) de AlbuMAX I. As garrafas foram mantidas em dessecadores a 37°C em

mistura gasogênica contendo 5% de O2, 5% de CO2 e 90% de N2.

Diariamente, foram realizadas trocas do meio de cultura e a parasitemia

foi monitorada em esfregaços sanguíneos, fixados com metanol, corados com

Giemsa e visualizados em microscópio óptico com objetiva de imersão

(1.000x). A utilização de sangue humano no projeto foi aprovada pelo CEP

(Comitê de Ética em Pesquisas), sob o nº: CAAE - 44899715.2.0000.0011

(Anexo 3).

3.9.2. Sincronização dos parasitos para utilização nos testes in vitro

Os cultivos com predomínio de anéis utilizados nos ensaios de

quimioterapia foram obtidos por meio de sincronização com sorbitol, conforme

descrito na literatura (LAMBROS; VANDERBERG, 1979). O hematócrito e a

parasitemia, pré-determinados para cada teste, foram ajustados com a adição

de hemácias e meio RPMI completo em quantidades adequadas.

3.9.3. Preparo das placas para os ensaios de quimioterapia

Culturas de parasitos sincronizadas com predomínio de trofozoítos

imaturos de P. falciparum foram distribuídas em microplacas de 96 poços.

Foram adicionados 180 μL/poço de meio de cultura RPMI contendo 0,5% de

parasitemia e 2% de hematócrito para os testes com Sybr Green.

Anteriormente a adição da suspensão dos parasitos, 20 µL dos compostos a

serem testados foram adicionados à placa teste, em triplicatas de diferentes

concentrações seriadas (10 – 0,05 µg/mL ou 0,5 - 0,0009 µg/mL), visando a

avaliação da concentração mínima inibitória para 50% do crescimento dos

parasitas (IC50). Como controle positivo foi usado artemisinina (50 ng/mL), e

como controle negativo foram utilizadas hemácias infectadas sem adição dos

compostos químicos, além de um branco contendo hemácias não infectadas

sem tratamento. As placas foram incubadas a 37 ºC por 48 h.

39

3.9.4. Teste de avaliação da atividade antimalárica por Sybr Green

No ensaio com o intercalante fluorescente de DNA Sybr Green I

(adaptado de SMILKSTEIN et al., 2004), as placas contendo os parasitos e os

compostos testados tiveram o sobrenadante descartado. Para a lavagem das

hemácias foi adicionado 100 µL de PBS 1x por poço e então centrifugado a

700g por 10 min.

Após, o sobrenadante foi novamente descartado e adicionado 100 µL do

tampão de lise (20 mM Tris, pH 7,5; 5 mM EDTA; 0,008%; p/v saponina;

0,08%, v/v Triton X-100) com SYBR Green I (2 µL de Sybr a cada 10 mL de

tampão) homogeneizado e transferido para a placa de 96 poços com 100 µL

de PBS 1x na qual seria realizada a leitura. Após incubar por 30 min a

temperatura ambiente, a fluorescência foi medida em fluorímetro com excitação

de 485 nm e emissão de 590 nm em ganho de 100.

3.9.5. Determinação da concentração inibitória de 50% do crescimento do

parasito (IC50)

A inibição do crescimento de 50% dos parasitos foi determinada a partir

de curvas dose-resposta estimadas em função de regressão não linear. Foi

utilizado o programa Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, EUA),

para estimar o valor de IC50.

3.10. ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE IN VITRO PELO MÉTODO DO MTT

A citotoxicidade foi determinada por meio do método colorimétrico do

MTT (3- 4,5-dimetiltiazol-2-il-2,5-difenil tetrazólio) (MOSMANN, 1983). Após o

período de incubação (48h) das frações com as células de hepatocarcinoma

humano (HepG2), foi adicionado em cada poço 20 μL de MTT a uma

concentração de 5 mg/mL-1 em PBS (p/v) e as placas incubadas por quatro

horas em estufa 37 °C. Ao final desse período, o meio de cultura, juntamente

com o excesso de MTT, foi desprezado e, em seguida, 100 μL de DMSO

(Sigma-Aldrich) adicionados a cada poço. A leitura óptica foi realizada em

espectrofotômetro de microplacas em comprimento de onda de 570 nm.

40

3.11. Índice de seletividade

O índice de seletividade (IS) das amostras testadas foi obtido calculando

a razão entre o valor de CC50 e o de IC50. Valores maiores que 10 foram

considerados indicativos de seletividade contra o parasita, enquanto valores

abaixo de 10 foram consideradas não seletivos (KATSUNO et al., 2015).

3.12. Ensaio de hemólise

Os ensaios foram realizados como descrito por Wang e colaboradores

(2010). As frações foram diluídas em PBS 1X estéril. Após diluição das

frações, 20 µL das amostras foram adicionadas a 180 µL de uma suspensão de

eritrócitos humanos a 1% em microplacas de fundo em “U”. As microplacas

foram incubadas por 30 min a 37 °C em agitação a cada 5 minutos. Após

incubação, as placas foram centrifugadas a 1000g por 10 minutos e o

sobrenadante transferido para microplaca de leitura em fundo chato. O

sobrenadante foi lido em um espectrofotômetro de microplacas (Biochrom

modelo: Expert plus) a 540 nm. Para calcular a porcentagem de hemólise

0,05% de saponina foi usado como controle positivo (100% de hemólise), como

controle negativo foi usado o sobrenadante das hemácias não lisadas (branco).

% hemólise = Absorbância da amostra – absorbância do branco Absorbância do controle com saponina

3.13. Análise estatística

Para a análise estatística dos dados foi utilizado o software Origin.

Todos os testes foram considerados significativos quando apresentaram um

valor de p ≤ 0,05.

41

4. RESULTADOS

4.1. Fracionamento do veneno por cromatografia de exclusão molecular

Por meio do fracionamento em coluna de exclusão molecular (Superdex

G-75), o veneno de B. jararaca foi dividido em 10 frações (Figura 6)

identificadas como P1g – P10g.

Figura 6 - Perfil cromatográfico do veneno de B. jararaca por exclusão molecular Superdex (G-75)

Perfil cromatográfico do veneno de B. jararaca (10 mg) em resina Superdex G-75 (1 x 30 cm), equilibrada previamente com AMBIC 50mM, pH 8,0. As frações foram eluídas em modo isocrático com o mesmo tampão de equilíbrio, em fluxo de 0,5 mL/min. A eluição das amostras foi monitorada na absorbância de 280 nm e a coleta foi manual. A cromatografia gerou 10 frações denominadas de P1g – P10g.

As frações obtidas a partir do primeiro passo cromatográfico foram

dosadas e submetidas à eletroforese monodimensional SDS-PAGE.

4.2. Eletroforese monodimensional (SDS - PAGE) das frações de exclusão

molecular

Após a dosagem das frações cromatográficas, foram utilizados 15 µg de

cada para a eletroforese monodimensional SDS-PAGE. O perfil eletroforético

das frações demonstrou a distribuição de diversas moléculas, que

42

apresentaram massas relativas variando entre < 10 kDa até >75 kDa (Figura

7).

Figura 7 - Perfil eletroforético em SDS-PAGE das frações obtidas a partir da cromatografia de exclusão molecular do veneno de B. jararaca

Eletroforese monodimensional em gel de poliacrilamida 12,5% em condições redutoras e desnaturantes. VB: Veneno de B. jararaca. PM: Padrão molecular. P1g – P8g: Frações obtidas a partir da cromatografia de exclusão molecular (15µg cada, com exceção de P6g, P7g e P8g, com 60 µg cada).

A fração P1g apresentou o grupo de proteínas de maior massa presente

no veneno. Além disso, também apresentou grupos de proteínas com massas

de aproximadamente 30, 35 e 15 kDa. A fração P2g apresentou bandas com

massas relativas próximas a 30 e 15 kDa. A fração P3g aparece no

cromatograma incorporada ao pico P2g (Figura 6). O perfil eletroforético refletiu

este fato, já que ambas apresentaram grupos proteicos semelhantes, mesmo

que também existam bandas exclusivas em cada uma dessas frações.

A fração P4g apresentou duas bandas proteicas mais aparentes com

massa relativa de aproximadamente 25 e 15 kDa. A fração P5g apresentou

uma banda mais aparente na altura relativa a 25 kDa e outras menos

aparentes com massas superiores e inferiores. As frações P6g, P7g e P8g não

foram detectadas quando utilizado 15 µg de cada para o gel. No resultado

apresentado foram adicionados 60 µg dessas amostras no gel, resultando no

aparecimento de bandas na altura de aproximadamente 25 kDa.

43

4.3. Atividade antiplasmodial das frações de exclusão molecular do

veneno de B. jararaca

A atividade antiplasmodial das frações e veneno de B. jararaca foi

mensurada pela técnica fluorimétrica Sybr Green. Dois ou mais testes foram

realizados em datas diferentes e cada um foi feito em triplicata. A média da

triplicata de cada teste foi utilizada para a confecção de uma média final entre

os testes independentes. As médias de inibição, em 50%, do desenvolvimento

da cultura do parasito, assim como seu respectivo desvio padrão, podem ser

observados na Tabela 5.

Tabela 5 - Atividade antiplasmodial em cepas W2 do veneno de B. jararaca e frações geradas a partir de cromatografia de exclusão molecular, determinada pelo método de

Sybr Green

Amostras testadas IC50 (µg/mL) (média ± desvio padrão)

Veneno 0,44 ± 0,05

P1g 8,06 ± 2,2

P2g 0,10 ± 0,01

P3g 0,12 ± 0,01

P4g 0,59 ± 0,02

P5g 0,53 ± 0,04

P6g 12,2 ± 2,7

P7g 14,1 ± 0,04

P8g 6,39 ± 0,5

Artemisinina 0,006 ± 0,001

Os resultados de atividade inibitória contra formas sanguíneas de P. falciparum foram expressos pela média dos valores de IC50 (Concentração Inibitória de 50% dos parasitos) com desvio padrão. A artemisinina foi utilizada como controle positivo para os testes. Veneno: Veneno de B. jararaca. P1g – P10g: frações obtidas por meio de cromatografia de exclusão molecular.

As frações P2g, P3g, P4g e P5g demonstraram-se ativas contra as

cepas W2 de P. falciparum, com IC50 variando de 0,1 – 0,59 µg/mL. O veneno

total atingiu IC50 na concentração média de 0,44 µg/mL. As frações P2g e P3g

foram mais potentes que o veneno total, apresentando perfis de inibição

estatisticamente iguais. O decaimento da população de parasitas em contato

com as frações mais potentes pode ser observado na figura 8.

44

Figura 8 - Curvas de dose e resposta das frações P2g, P3g, P4g e P5g

Decaimento da parasitemia de populações de P. falciparum expostas a diferentes concentrações seriadas das frações. Eixo Y: Inibição da cultura (em %). Eixo X: Concentração da fração em (µg/mL). Parasitemia avaliada com intercalante fluorescente de DNA – Sybr Green. A: Curva de dose-resposta da fração P2g. B: Curva de dose-resposta da fração P3g. C: Curva de dose-resposta da fração P4g. D: Curva de dose-resposta da fração P5g.

Os gráficos demonstram uma relação de dose resposta, em que o

aumento da concentração das frações é acompanhado pelo aumento da

inibição do crescimento parasitário. As frações P2g e P3g apresentam as

curvas com decaimento da parasitemia mais acentuadas, revelando sua alta

capacidade de inibição dos parasitas. A fração P2g foi escolhida para maior

investigação, já que, junto a fração P3g, foi a mais potente contra o parasito e

obteve o melhor rendimento cromatográfico.

4.4. Cromatografia de troca aniônica – HiTrap Capto Q ImpRes

A fração P2g foi recromatografada em coluna de troca aniônica, gerando

cinco frações denominadas de P1Q - P5Q (Figura 9).

45

Figura 9 - Perfil cromatográfico da fração P2g em coluna de troca anônica Hitrap Capto- Q ImpRes

Perfil cromatográfico de P2g (aproximadamente 5 mg) em resina Capto Q ImpRes (1 x 3cm), previamente equilibrada com AMBIC 50 mM, pH 8,0. As frações foram eluídas em gradiente linear de 0 a 75% de AMBIC 500 mM, pH 8,0 (tampão B), com fluxo de 1 mL/min. A eluição das amostras foi monitorada em comprimento de onda de 280 nm e a coleta foi manual. O gradiente de tampão B é representado pela linha verde. A cromatografia gerou cinco frações denominadas de P1Q – P5Q.

A fração P1Q foi a única a ser eluída antes do início do gradiente,

revelando que a grande maioria das proteínas da amostra interagiram

eletrostaticamente com a coluna. Os picos P2Q, P3Q E P4Q foram adsorvidos

com o gradiente superior a 40% de tampão B, enquanto a fração P5Q só foi

eluída após injeção de 100% do tampão B.

4.5. Perfil eletroforético da cromatografia de troca iônica

O perfil eletroforético das frações obtidas pela cromatografia de troca

aniônica pode ser observado na figura 10.

46

Figura 10 - Perfil eletroforético em SDS-PAGE das frações obtidas por cromatografia de troca aniônica

Eletroforese monodimensional em gel de poliacrilamida 12,5% em condições redutoras e desnaturantes. PM: Padrão molecular. P2q – P51: Frações obtidas a partir da cromatografia de troca aniônica. Foram utilizados 15 µg de cada amostra para o gel.

A fração P1Q não apresentou rendimento cromatográfico suficiente para

os testes de caracterização bioquímica e biológica. A fração P2Q apresentou

duas bandas proteicas próximas com massa relativa de 30 kDa e uma banda

de baixa massa molecular. A fração P3Q apresentou uma banda na faixa de

massa relativa a 30 kDa e outra banda na altura de 15 kDa. As frações P4Q e

P5Q apresentaram grupos proteicos de massas muito semelhantes na altura

relativa a 15 kDa e abaixo disso.

Para possibilitar a melhor visualização das frações P3q, P4q e P5q,

novas eletroforeses foram feitas, desta vez com 15% de poliacrilamida (Figura

11).

47

Figura 11 - Eletroforese SDS Page (15%) das frações P3q, P4q e P5q

Eletroforese monodimensional em gel de poliacrilamida 15% em condições redutoras e desnaturantes. A - PM: Padrão molecular. P3q: Fração obtida a partir de cromatografia de troca aniônica. B - PM: Padrão molecular. P4q e P5q: Frações obtidas a partir da cromatografia de troca aniônica. Foram utilizados 15 µg de cada amostra para o gel.

Com o gel de 15% de poliacrilamida, foi possível identificar a presença

de mais uma banda na fração P3q, com massa relativa inferior a 15 kDa. A

melhor visualização das bandas das frações P4q e P5q demonstrou a presença

de possíveis isoformas com massa relativa de aproximadamente 15 kDa.

4.6. Atividade proteolítica das frações de troca iônica

A fim de caracterizar enzimaticamente as frações obtidas a partir do

segundo passo cromatográfico, as frações que apresentaram bandas proteicas

com massa correspondente a proteases (P2q e P3q) foram submetidas ao

teste de atividade proteolítica sobre o fibrinogênio.

48

Figura 12 - Atividade fibrinogenolítica das frações P2q, P3q e P1c

As frações foram incubadas com fibrinogênio a 37ºC durante duas horas. Após o período de incubação, as amostras foram reduzidas e submetidas a SDS-PAGE 12,5%. PM: Padrão molecular. Fibr: Fibrinogênio (cadeias α, β e γ). 1: Veneno de B. jararaca (20 µg) + Fibrinogênio. 2: Fração P2q (20 µg) + Fibrinogênio. 3: Fração P3q (20 µg). 4: Fração P3q (20 µg) + Fibrinogênio. 5: Fração P3q (20 µg) + Fibrinogênio + EDTA. 6: Fração P3q (20 µg) + Fibrinogênio + PMSF. 7: P1c (20 µg) +Fibrinogênio.

O veneno total e as frações P2q, P3q e P1c (Fração P1c – Figura 19)

apresentaram atividade proteolítica. O veneno degradou a cadeia α do

fibrinogênio, enquanto as frações P2q, P3q e P1c foram capazes de degradar

as cadeias α e γ. A fração P3q foi testada na presença de dois inibidores

proteolíticos, o EDTA, inibidor específico de metaloproteases, e o PMSF,

inibidor específico de serinoproteases. Apenas na presença de PMSF a ação

proteolítica da fração P3q foi inibida.

4.7. Atividade fosfolipásica das frações de troca iônica

Para identificar possíveis PLA2 contidas nas frações obtidas da troca

iônica, as amostras P2q, P3q, P4q e P5q foram testadas sobre o substrato

4N3OBA. O perfil de atividade pode ser visto na figura 13.

49

Figura 13 - Atividade fosfolipásica das frações P2q, P3q, P4q e P5q

Atividade fosfolipásica das frações (10 µg de cada) avaliada sobre o substrato 4N3OBA. Absorbância monitorada em 425 nm. *Significante em relação ao branco. **Não significante em relação ao branco. VB Jararaca: Veneno de B. jararaca. BthTx-II: fosfolipase A2 isolada do veneno de Bothrops jararacuçu. P2q – P5q: frações obtidas por meio de cromatografia de troca aniônica. Branco: tampão de amostra.

O veneno de B. jararaca e a fração P3q apresentaram atividade

fosfolipásica, sendo que a fração P3q foi mais ativa do que o veneno total. As

frações P2q, P4q e P5q não apresentaram atividade fosfolipásica sobre o

substrato testado.

4.8. Atividade antiplasmodial das frações de troca iônica

O resultado de atividade antiplasmodial das frações de troca aniônica

(Tabela 6) revelou amostras com atividade antiparasitária

50

Tabela 6 - Atividade antiplasmodial das frações obtidas por troca aniônica, determinada pelo método Sybr Green


P2q >10

P3q 0,09 ± 0,04

P4q 0,31 ± 0,005

P5q 0,25 ± 0,05

Artemisinina 0,006 ± 0,001

Os resultados de atividade inibitória contra formas sanguíneas de P. falciparum foram expressos pela média dos valores de IC50 (Concentração Inibitória de 50% dos parasitos) com desvio padrão. A artemisinina foi utilizada como controle positivo para os testes. P2q – P5q: frações obtidas por meio de cromatografia de troca aniônica.

A fração P2q não se mostrou ativa na concentração máxima utilizada

para o teste. Já a fração P3q apresentou o melhor resultado de inibição deste

estudo, alcançando seu IC50 médio com 0,09 µg/mL. As frações P4q e P5q

também se mostraram potentes e apresentaram perfis de inibição

estatisticamente semelhantes entre si.

Os gráficos a seguir apresentam as curvas estimadas de dose e

resposta de cada fração. Os quadros revelam a inibição (em %) da cultura de

parasitos para cada concentrações seriadas utilizada.

Figura 14 - Atividade antiplasmodial da fração P3q

Figura A - Coluna 1: Concentrações seriadas em µg/mL da fração P3q. Coluna 2: Inibição da parasitemia (em %). Coluna 3- Desvio padrão. Figura B – Curva de dose e resposta da fração P3q. Ic50 em µg/mL. Eixo Y: Inibição da cultura (em %). Eixo X: Concentração da fração em (µg/mL). Parasitemia avaliada com intercalante fluorescente de DNA – Sybr Green.

51

A Fração P3q foi a mais potente em inibir a cultura de P. falciparum. Na

concentração de 10 µg/mL, esta fração gerou uma inibição média de 81,7%. A

curva de dose e resposta demonstra que concentrações inferiores a 0,15

µg/mL são capazes de inibir em 50% o desenvolvimento dos parasitos. Mesmo

a concentração mínima utilizada no teste (0,02 µg/mL) foi capaz de inibir cerca

de 30% do desenvolvimento da cultura.



A fração P4q foi ativa contra o parasita. A inibição máxima (77%) dos

parasitos foi alcançada na concentração de 5 µg/mL desta fração.

52



A fração P5q também se mostrou competente contra o parasita. Apesar

de apresentar um IC50 maior em relação a fração P3q (que obteve o melhor

IC50 deste estudo), a fração P5q foi capaz de promover inibição média de

80,8% na concentração de 5 µg/mL, enquanto a fração P3q, nessa mesma

concentração inibiu 74,9% dos parasitos.

53

Figura 17 - Atividade antiplasmodial da artemisinina

Figura A - Coluna 1: Concentrações seriadas em ng/mL de artemisinina. Coluna 2: Inibição da

parasitemia (em %). Coluna 3- Desvio padrão. Figura B – Curva de dose e resposta da fração

P3q. Ic50 em ng/mL. Eixo Y: Inibição da cultura (em %). Eixo X: Concentração da fração em

(ng/mL). Parasitemia avaliada com intercalante fluorescente de DNA – Sybr Green.

A artemisinina demonstrou um grande poder de inibição dos parasitos. O

IC50 médio de 0,007 µg/mL revela a eficiência deste fármaco em interromper o

ciclo eritrocítico do P. falciparum.

4.7. Atividade citotóxica das frações de troca iônica

A citotoxicidade das amostras foi estimada por meio da avaliação da

inibição de células HepG2 em contato com as frações. A tabela 2 resume as

médias de CC50 (concentração citotóxica para 50% das células) das amostras

estudadas.

Tabela 7 - Citotoxicidade das frações mais potentes obtidas por meio de cromatografia de troca aniônica, determinada pelo método colorimétrico MTT

Os resultados da atividade citotóxica das frações frente à linhagem de células HepG2 foram expressos pela média dos valores de CC50 (Concentração Citotóxica de 50% da linhagem celular).

As frações P3q e P5q não foram citotóxicas com as concentrações

testadas. Na concentração máxima usada nos testes (10 µg/mL), as frações

inibiram apenas 7% da cultura de HepG2.

Amostras testadas CC50 (µg/mL)

P3q >10 P5q >10

54

4.8. Índice de seletividade (IS)

Os resultados de Índice de Seletividade foram calculados a partir da

divisão dos resultados de CC50 pelos de IC50. As frações com IS maiores que

10 foram consideradas seletivas. Os resultados estão resumidos na Tabela 8.

Tabela 8 - Índice de Seletividade das frações P3q e P5q

Amostras

testadas

IC50 (µg/mL) (média ±

desvio padrão) W2

CC50 (µg/mL) (média ±

desvio padrão) HepG2

Índice de Seletividade

IS

Resultado

P3q 0,09 ± 0,04 ≥ 10 ≥111 Ativo–

Seletivo

P5q 0,25 ± 0,05 ≥ 10 ≥40 Ativo-

Seletivo

Resultados da atividade antiplasmodial (IC50); Citotoxicidade contra células HepG2 (CC50) e Índice de seletividade (IS) das frações mais potentes contra formas sanguíneas de P. falciparum. Foram consideradas ativas as frações com IC50 <1 µg/mL. Foram consideradas seletivas as frações com IS > 10.

4.9. Ensaios de hemólise

As frações P3q e P5q foram testadas em relação a sua ação hemolítica.

Ambas não foram hemolíticas na concentração máxima utilizada no teste, 10

µg/mL (Figura 18).

55

Figura 18 - Teste de hemólise das frações P3q e P5q

Avaliação da atividade hemolítica das frações na concentração de 10 µg/mL sobre cultura com 1% de hemácias. A saponina 0,05% foi utilizada como controle positivo (CP) e o sobrenadante de hemácias não lisadas foi o controle negativo (CN). Absorbância medida em 540 nm. A - CP: saponina 0,05%; CN: hemácia 1%; P5q: 10 µg/mL da fração P5q. B - CP: saponina 0,05%; CN: hemácia 1%; P3q: 10 µg/mL da fração P3q.

CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA – C18 (Discovery)

A fração com o menor IC50 (P3q) foi refracionada em cromatografia de

fase reversa – C18 (Discovery 25 x 0,45 cm), podendo o perfil cromatográfica e

eletroforético serem observados na figura 19.

56

Figura 19 - Cromatografia de fase reversa (C18 - Discovery) da fração P3q

A: Perfil cromatográfico da fração P3q (aproximadamente 1 mg) em resina Discovery - C18 (25 x 0,45cm), previamente equilibrada com ácido trifluoracético (TFA) 0,1%. As amostras foram eluídas em gradiente linear de 0 a 70% de acetonitrila (ACN) + TFA 0,1% (tampão B), com fluxo de 1 mL/min. A eluição das amostras foi monitorada em 280 nm e a coleta foi manual. O gradiente de tampão B é representado pela linha verde. A cromatografia gerou três frações denominadas de P1c – P3c. B: Eletroforese monodimensional em gel de poliacrilamida 12,5% em condições redutoras e desnaturantes. PM: Padrão molecular. P3q: Fração obtida por cromatografia de troca aniônica. P1c e P3c: amostras obtidas por cromatografia de fase reversa (C18). Foram utilizados 15 µg de cada amostra para o gel.

O perfil cromatográfico revelou três picos, denominados de P1c – P3c. A

eletroforese dessas frações revelou a presença de uma molécula com alto grau

de pureza na amostra P1c (que apresentou atividade proteolítica no neste

fibrinogenolítico - Figura 12), enquanto a fração P3c apresentou as três bandas

que compõem a fração de origem (P3q). A fração P2c não apresentou

rendimento cromatográfico suficiente para o teste eletroforético.

A fração P3c foi submetida a uma nova cromatografia de fase reversa

(C18 – Discovery), gerando o perfil cromatográfico e eletroforético apresentado

na figura 20.

57

Figura 20 - Cromatografia de fase reversa (C18 – Discovery) da fração P3c

A: Perfil cromatográfico da fração P3c (aproximadamente 1 mg) em resina Discovery - C18 (25 x 0,45cm), previamente equilibrada com ácido trifluoracético (TFA) 0,1%. As amostras foram eluídas em gradiente linear de 0 a 70% de acetonitrila (ACN) + TFA 0,1% (tampão B), com fluxo de 1 mL/min. A eluição das amostras foi monitorada em 280 nm e a coleta foi manual. O gradiente de tampão B é representado pela linha verde. A cromatografia gerou um pico denominado de P1d. B: Eletroforese monodimensional em gel de poliacrilamida 12,5% em condições redutoras e

desnaturantes. PM: Padrão molecular. P1d: amostra obtidas por cromatografia de fase reversa

(C18). Foram utilizados 15 µg de amostra para o gel.

A cromatografia de fase reversa da fração P3c gerou um pico

cromatográfico denominado de P1d. Em eletroforese, esta fração apresenta

duas bandas com massa relativa próxima a 15 kDa como principais

constituintes.

58

5. DISCUSSÃO

Apesar da queda recente de 60% dos casos de morte por malária

(WHO, 2015), o surgimento de resistência aos ACT’s ressalta a importância da

investigação de novas substâncias antimaláricas. Este trabalho se insere no

contexto de busca por novas moléculas antiplasmodiais, com o veneno de B.

jararaca sendo testado pela primeira vez contra formas intraeritrocitárias de P.

falciparum.

Outros venenos botrópicos foram investigados contra o P. falciparum e

exibiram efeito inibitório de crescimento parasitário in vitro, como descrito na

tabela 9.

Tabela 9 - Venenos botrópicos testados in vitro contra formas sanguíneas de P. falciparum

Serpente IC50 médio Autores

B. asper 0,13 μg/mL CASTILLO et al., 2012

B. brazili 0,17 μg/mL KAYANO et al., 2015

B. marajoensis 0,14 μg/mL GRABNER et al., 2017

B. jararaca 0,44 μg/mL Presente trabalho

Venenos de serpentes de outros gêneros e até de outras famílias se

mostraram capazes de inibir o P. falciparum. No estudo de Quintana e

colaboradores (2012) o veneno de Crotalus durissus cumanensis apresentou

IC50 de 0,17 ± 0,03 μg/mL.

A Micrurus spixii, serpente da família Elapidae, teve seu veneno testado

contra formas sanguíneas de P. falciparum, apresentando IC50 < 0,78 μg/mL

(TERRA et al., 2015). Tais achados revelam que a capacidade de inibição in

vitro de formas sanguíneas de P. falciparum é comum entre venenos ofídicos

diferentes.

Além dos resultados antiplasmodias alcançados por outros venenos

botrópicos, a escolha do veneno de B. jararaca foi baseada em estudos que

demonstram a presença de atividade microbicida, incluindo ação antifúngica

(GOMES et al., 2005) e antiparasitária (GONÇALVES et al., 2002; DEOLINDO

et al., 2010) neste veneno. Para investigar o seu potencial antiplasmodial,

buscou-se prospectar suas proteínas, avaliando características bioquímicas,

59

atividade antiplasmodial in vitro e citotoxicidade das amostras obtidas do

veneno.

Como etapa inicial, avaliou-se o efeito do veneno de B. jararaca sobre P.

falciparum resistente à cloroquina (cepa W2). Pelo método fluorimétrico Sybr

Green (SMILKSTEIN et al., 2004), que utiliza um intercalante de DNA, foi

possível mensurar as taxas de inibição de populações de parasitos em contato

com diferentes concentrações do veneno. Conforme a Tabela 1, foi observado

que o veneno apresentou atividade antiplasmodial em concentrações inferiores

a 0,5 µg/mL.

A análise desse resultado pode se dar sob a luz da revisão de Pink e

colaboradores (2005), que propõe critérios quantitativos para triagem in vitro de

substâncias antiparasitárias. Segundo esta revisão, para ser considerada ativa,

uma substância deve apresentar IC50 igual ou inferior a 1 µg/mL. Apesar deste

parâmetro ser baseado em moléculas isoladas, o veneno de B. jararaca se

encaixa como uma substância ativa (IC50 de 0,44 µg/mL), justificando a

investigação da ação antiplasmodial das moléculas que compõem essa

mistura.

Com a ação antiplasmodial confirmada para o veneno de B. jararaca, os

próximos passos desta pesquisa tiveram como objetivo fracionar o veneno de

forma guiada pela atividade antiplasmodial. O intuito desta metodologia foi de

testar todo o conteúdo proteico do veneno e selecionar o grupo de moléculas

mais potentes contra o P. falciparum.

Os métodos cromatográficos são vastamente utilizados para o

fracionamento e isolamento de proteínas de venenos ofídicos (STÁBELI et al.,

2012; LOMONTE et al., 2014). Por se tratar de uma técnica analítica,

preparativa e que garante o fracionamento de misturas complexas

(WIEDERSCHAIN, 2004), a utilização desse sistema foi conveniente com os

objetivos deste estudo.

O primeiro passo cromatográfico foi feito em coluna de exclusão

molecular Superdex G-75. Essa técnica fraciona os constituintes de uma

mistura por diferenças em suas massas moleculares (WIEDERSCHAIN, 2004).

Nesse sistema cromatográfico, as primeiras frações devem conter as proteínas

de maior massa (75 kDa ou mais), já que estas não adentram aos poros e são

eluídas mais rapidamente. As moléculas menores percorrem um caminho

60

maior, já que são capazes de penetrar nos poros e sofrer o processo de

filtragem. Isso faz com que as últimas frações contenham as menores

moléculas da mistura cromatografada (WIEDERSCHAIN, 2004).

A cromatografia de exclusão molecular do veneno de B. jararaca gerou

10 frações (Figura 6), um grau resolutivo próximo do observado no estudo de

De Vieira Santos e colaboradores (2008), em que a exclusão molecular foi

utilizada como primeiro passo no isolamento de uma L-aminoácido-oxidase do

veneno de B. jararaca; e do trabalho de Da Silva e colaboradores (2012), que

utilizou a resina Superdex G-75 como primeiro passo no isolamento de uma

metaloprotease (BJ-PI2) do mesmo veneno.

Analisando o perfil eletroforético das 10 frações (Figura 7), é possível

notar que o primeiro pico, P1g, contém as moléculas de maior massa do

veneno. Também é possível observar a presença de bandas com altura relativa

de média massa (próxima a 35 kDa) e baixa massa (próxima a 15 kDa) nessa

mesma fração. Isso sugere um processo de arraste das proteínas menores

pelas maiores durante o processo cromatográfico, ou a degradação proteolítica

da fração pelas próprias proteases que contem. Esta última hipótese é

levantada pela presença de uma banda de aproximadamente 75 kDa, massa

equivalente à metaloproteases de calasse PIII, e de 30 e 35 kDa, massas

equivalentes a metaloproteases de classe PII e serinoproteases de venenos

ofídicos (SOUSA et al., 2013).

Observando o perfil eletroforético das demais frações, nota-se que o

possível fenômeno de arraste (ou degradação proteolítica) ocorreu de forma

generalizada. Apesar disso, o fracionamento gerou amostras com conteúdo

diferentes que puderam ser testadas contra o P. falciparum.

O teste antiplasmodial feito com as frações provenientes da

cromatografia de exclusão molecular revelou que a atividade inibitória se

concentrou nas frações P2g, P3g, P4g e P5g (Tabela 1), o que indica que as

moléculas responsáveis pela atividade antiparasitária do veneno estão

presentes nessas frações. Considerando o potencial antiparasitário dos

componentes da fração P2q e o seu rendimento cromatográfico, optou-se por

selecionar esta fração para posteriores experimentos, visando identificar as

moléculas responsáveis pela inibição do crescimento do P. falciparum.

61

Para o fracionamento do conteúdo proteico da fração P2g foi realizada

cromatografia de troca aniônica (Capto Q ImpRes). Esta resina apresenta como

ligante um grupamento amina quaternário, que se ioniza adquirindo carga

positiva. Durante a cromatografia, moléculas carregadas negativamente

interagem eletrostaticamente com esta resina. Com a injeção gradual do

tampão B (AMBIC 500 mM), as moléculas acopladas à coluna foram eluídas

diferencialmente (WIEDERSCHAIN, 2004).

Utilizando para esta cromatografia um tampão com pH 8,0 (AMBIC),

criou-se um ambiente em que a maioria das proteínas do veneno estivessem

acima do seu ponto isoelétrico e, portanto, desprotonadas (com carga líquida

negativa), favorecendo assim a interação das proteínas com a resina. Esta

escolha foi feita baseada no estudo de Andrião-Escarso e colaboradores

(2000), que, por meio da comparação de perfis de troca catiônica de venenos

botrópicos, demonstraram que o conteúdo do veneno de B. jararaca é

majoritariamente ácido.

O perfil cromotográfico gerado revelou cinco frações denominadas de

P1q - P5q. Observando o perfil cromatográfico, percebe-se que a grande

maioria das moléculas foram eluídas após a injeção do tampão B, o que indica

que as proteínas cromatografadas tinham pontos isoelétricos ácidos e

interagiram eletrostaticamente com a coluna.

Quatro frações geradas pela cromatografia de troca aniônica (P2q –

P5q) foram submetidas à eletroforese SDS-PAGE. O perfil eletroforético

(Figura 10) revelou a presença de bandas com massa de aproximadamente 30

kDa nas frações P2q e P3q. Nessas mesmas frações também aparecem

bandas de baixa massa, com altura relativa a aproximadamente 15 kDa e 13

kDa. As frações P4q e P5q apresentaram bandas muito próximas na faixa entre

13 e 15 kDa (Figura 11).

Como a massa relativa de 30 kDa é correspondente às proteases, e a de

13 a 15 kDa às fosfolipases (SOUSA et al., 2013), foram feitos testes de

caracterização enzimática para estes grupos de proteínas.

A avaliação da atividade fosfolipásica foi mensurada sobre o substrato 3-

octanoiloxi-benzóico (4N3OAB). O ataque hidrolítico de PLA2 ao substrato gera

um produto cromogênico, o ácido 4-nitro-3-hidroxi-benzóico. Assim sendo, a

medição por espectrofotometria da geração deste produto tornou possível

62

identificar fosfolipases nas frações, assim como o nível de atividade enzimática

destas (HOLZER; MACKESSY, 1996).

Sob esta metodologia, o veneno de B. jararaca apresentou baixa

atividade fosfolipásica, resultado que vai ao encontro do estudo de

caracterização proteômica deste veneno (SOUSA et al., 2013), que revela que

as PLA2s compõem cerca de apenas 3% das proteínas. Além do veneno,

somente a fração P3q demonstrou conter fosfolipases enzimaticamente ativas

(Figura 13). As frações P4q e P5q não apresentaram atividade fosfolipásica, o

que pode indicar que sejam compostas por PLA2s homólogas (Lys49 ou outra

variante sem atividade enzimática). Essa possibilidade é levantada pois a faixa

de massa relativa no gel (13 a 15 kDa) e a presença de possíveis isoformas

(Figura 11 -B) são características de PLA2 (KINI, 2003).

Embora isoformas de PLA2 apresentem massas moleculares, pontos

isoelétricos e sequência primária similares, podem desempenhar ações

farmacológicas diferentes (TAKASAKI; YUTANI; KAJIYASHIKI, 1990; GAO et

al., 2001). As características bioquímicas semelhantes dificultam o isolamento

e purificação de um único grupo de isoformas, requisitando para tal o uso de

técnicas mais sofisticadas, como o emprego de resinas mais resolutivas e

espectrometria de massa (KINI, 2003). Para a confirmação da classe à qual as

proteínas das frações P4q e P5q pertencem, devem ser feitos outros

experimentos, como a investigação da atividade miotóxica, que é comum para

PLA2s homólogas (KINI, 2003) ou sequenciamento de aminoácidos.

A caracterização da atividade proteolítica das frações foi feita sobre o

substrato fibrinogênio (Figura 12). Após as duas horas de incubação, o veneno

de B. jararaca foi capaz de degradar a cadeia α do fibrinogênio, enquanto as

frações P2q, P3q demonstraram a capacidade de degradar as cadeias α e γ. A

fração P3q teve sua atividade proteolítica inibida pelo PMSF, um inibidor

específico de serinoprotease (SERRANO et al., 1995), o que indica que esta

seja a classe de protease presente na fração P3q e que aparece com alto grau

de pureza na amostra P1c (Figura 19).

Do veneno de B. jararaca, foram isoladas serinoproteases com massas

relativas próximas à protease presente na fração P3q e purificada em P1c

(massa de aproximadamente 30 kDa). Nishida e colaboradores (1994) isolaram

a Bothrombin, uma serinoprotease do veneno de B. jararaca ativadora de

63

fibrinogênio, com massa relativa de 35 kDa. A PA-BJ é uma serinoprotease

isolada do veneno de B. jararaca que promove agregação plaquetária, com

massa relativa de 30 kDa (SERRANO et al., 1995). Novos testes de

caracterização bioquímica da amostra P1c são necessários para a confirmação

da hipótese de que contenha um serinoprotease, assim como para a

identificação de qual molécula se trata.

Após os experimentos de caracterização enzimática das frações obtidas

a partir da cromatografia de troca aniônica, o teste antiplasmodial com as

mesmas demonstrou que a fração P2q não apresentou atividade inibitória,

enquanto as frações P3q, P4q e P5q foram potentes contra o parasito (Tabela

6). A fração P3q apresentou o melhor IC50 (0,09 µg/mL) e a fração P5q (IC50 de

0,25 µg/mL) foi capaz de inibir aproximadamente 80% do crescimento

parasitário na concentração de 5 µg/mL (Figura 16 A).

A potente atividade antiplasmodial da fração P3q pode estar relacionada

à ação individual das proteínas que compõem esta fração. Como os

experimentos de caracterização enzimática indicam a existência de PLA2s e

uma serinoprotease na fração P3q, a ação antiplasmodial pode ser relacionada

a estes grupos proteicos.

Outras Fosfolipases A2 de venenos ofídicos foram testadas in vitro contra

o P. falciparum e se mostraram ativas. Do veneno de B. asper, duas

fosfolipases A2 (uma enzimaticamente ativa e outra não) foram testadas contra

formas sanguíneas de P. falciparum. O melhor resultado foi obtido com a PLA2

enzimaticamente ativa, que apresentou IC50 médio de 1,42 µg/mL. A PLA2 sem

atividade enzimática apresentou IC50 de 22,9 µg/mL, indicando que a inibição

do parasita pode depender da atividade hidrolítica das PLA2 (CASTILLO et al.,

2012)

No estudo de Quintana e colaboradores (2012), a Crotoxina B - uma

PLA2 enzimaticamente ativa - isolada do veneno de Crotalus durissus

cumanensis - foi testada contra formas sanguíneas de P. falciparum,

demonstrando IC50 médio de 0,6 µg/mL.

O valor de IC50 alcançado em ambos estudos anteriores é maior que o

apresentado pela fração P3q (0,09 µg/mL), ressaltando a capacidade

antiplasmodial das moléculas que compõem esta fração.

64

Diversos estudos investigaram a ação de PLA2 sobre membranas

celulares, incluindo os possíveis mecanismos de ação destas proteínas contra

o P. falciparum. É reconhecido que o ataque de PLA2 hidrossolúveis a

membranas celulares depende da penetração da enzima na camada lipídica.

Estudos com filmes de monocamadas lipídicas demonstram que as

fosfolipases apresentam perfis de penetração diferentes (DEMEL et al., 1975).

Moll e colaboradores (1990) investigaram a capacidade de penetração

de uma PLA2 modificada em hemácias saudáveis e infectadas por P. knowlesi.

A enzima isolada do pâncreas de porco teve adicionada covalentemente em

sua estrutura uma cadeia lipídica longa. A alteração tornou a PLA2 capaz de

atacar somente os eritrócitos infectados, que apresentam uma permeabilidade

de membrana aumentada em comparação aos eritrócitos saudáveis.

Essa permeabilidade aumentada é consequência das modificações

estimuladas pelo parasita na célula hospedeira. Estudos como o de Hsiao e

colaboradores (1991) mostram que durante a fase de maturação eritrocítica de

P. falciparum, algumas mudanças estruturais na membrana plasmática das

hemácias são evidenciadas, como a modificação da composição dos

fosfolipídeos e expressão de proteínas de citoaderência eletrodensas (ROWE

et al., 2009).

Apesar de PLA2s terem sido utilizadas para o estudo da composição de

membrana de eritrócitos parasitados (JOSHI; GUPTA, 1988; MAGUIRE;

PRUDHOMME; HERMAN, 1991), não havia estudos que investigassem a

influência destas enzimas sobre a fisiologia do parasito. Até que Deregnaucourt

e Schrével (2000) avaliaram a atividade antiplasmodial de PLA2 tóxicas

(obtidas de venenos de abelhas e serpentes) e não tóxicas (obtidas de

pâncreas suíno e bovino). Ambos os tipos de PLA2 inibiram o parasito, mas

com diferenças marcantes.

As PLA2s tóxicas obtiveram IC50 variando entre 1.1 – 200 pM (a PLA2

isolada da abelha Apis mellifera foi a mais potente do estudo). As PLA2s não-

tóxicas foram menos potentes, com IC50 variando de 0,14 – 1 µM. Outra

diferença de atuação foi notada a partir de testes em tempos definidos sobre

culturas sincronizadas. Percebeu-se que as formas trofozoíticas imaturas eram

as únicas sensíveis às PLA2s tóxicas, enquanto as fosfolipases pancreáticas

mataram o parasita em todas as fases do seu desenvolvimento.

65

Ainda nesse estudo, foi demonstrado que os mesmos efeitos

antiplasmodiais são reproduzidos pelo uso de soro humano previamente

incubado com as PLA2s. Lipoproteínas purificadas do soro tratado com a PLA2

de A. mellifera foram capazes de inibir o parasito, indicando a ação indireta das

PLA2.

Em 2004, o mesmo grupo de pesquisa investigou a ação antiplasmodial

de sete PLA2 (GUILLAUME et al., 2004). Além das PLA2s de A. mellifera e de

pâncreas, fosfolipases de escorpião e outras serpentes foram testadas.

Novamente, todas as PLA2 foram ativas contra P. falciparum, sendo a de A.

mellifera a mais potente, enquanto as pancreáticas foram as menos potentes.

O mesmo perfil de inibição foi alcançado com o uso de soro humano tratado

com as respectivas PLA2s. Além disso, testes feitos em culturas com AlbuMAX

II, um meio desprovido de lipoproteínas e com 10 vezes menos fosfolipídeos,

geraram o decaimento em mais de mil vezes do poder antiplasmodial das

PLA2s.

No presente trabalho, o AlbuMAX foi utilizado para suplementar as

culturas de P. falciparum utilizadas nos testes antiplasmodiais. A utilização

deste composto pode ter influenciado os resultados de inibição parasitária da

fração P3q, que demonstra conter PLA2s enzimaticamente ativas. A verificação

desta hipótese pode se dar com a utilização de soro humano em testes

antiplasmodias futuros com esta fração, avaliando se o IC50 irá sofrer

mudanças significativas.

Os experimentos in vitro de Guillaume e colaboradores (2004) indicam

um mecanismo indireto de ação antiplasmodial das PLA2, que dependente da

hidrólise do soro humano. No contexto da quimioterapia da malária, como esse

tipo de ação poderia ser explorada?

Estudos demonstram que PLA2 participam da imunidade inata, ativando

células fagocitárias em resposta imune a bactérias (MADSEN; INADA; WEISS,

1996; BALESTRIERI et al., 2009); além disso, a presença de níveis elevados

de PLA2 circulante foi associada a casos severos de malária (VADAS et al.,

1992; VADAS et al., 1993). Entender o papel dessas moléculas na

fisiopatologia da doença pode gerar novas estratégias quimioterápicas e o

avanço no combate à malária.

66

Em contraponto à hipótese de que a ação antiplasmodial de PLA2 seja

indireta e dependa da ação enzimática, PLA2 homólogas (enzimaticamente

inativas) que são capazes de inibir o parasito possivelmente desempenham um

mecanismo de ação alternativo.

Em estudo de Grabner e colaboradores (2017), uma PLA2 homóloga

(BmajPLA2-II) desempenhou atividade antiplasmodial com IC50 médio de 6,41

µg/mL. No presente trabalho, as frações P4q e P5q apresentaram IC50 de 0,31

µg/mL e 0,25 µg/mL, respectivamente. Se confirmado que o conteúdo destas

frações contem PLA2 homólogas, pode-se deduzir que a ação antiplasmodial

destas moléculas não dependeu da atividade enzimática. Um dos mecanismos

alternativos que pode estar associado ao efeito antiplasmodial é ação da

porção C terminal das PLA2, que desestabiliza membranas fosfolipídicas e

aumenta a permeabilidade celular (LOMONTE; RANGEL, 2012).

Além da PLA2, a presença de uma protease na fração P3q pode estar

relacionada à sua atividade antiplasmodial. Estudos que testem

serinoproteases de venenos ofídicos contra o P. falciparum e outros

protozoários são escassos. Porém, no estudo de Kayano e colaboradores

(2015), a metaloprotease de classe P-I “BbMP-1”, isolada do veneno de B.

brazili, foi testada contra formas sanguíneas de P. falciparum, obtendo um IC50

médio de 3,2 µg/mL. A comparação direta com P3q demonstra um perfil de

atividade antiplasmodial 35 vezes maior da fração em relação à metaloprotease

citada.

Assim como a hipótese de atuação independente das proteínas da

fração P3q sobre o parasito, a possibilidade de ação sinérgica ou aditiva deve

ser considerada. Os venenos de serpente são, de maneira geral, coquetéis de

substâncias que agem de forma conjunta (CALVETE; LOMONTE, 2015).

Sendo assim, o sinergismo entre moléculas de venenos ofídicos é um

fenômeno comum. Esse tipo de interação pode se dar a nível intermolecular e

supramolecular, gerando o aumento da atividade de moléculas que atuam

sobre um mesmo alvo, seja molecular, metabólico ou fisiológico (LAUSTSEN,

2016). Para confirmar a existência ou não da ação sinérgica ou aditiva na

fração P3q, as moléculas que a compõe devem ser testadas de forma isolada.

Se houver diminuição ou ausência da atividade antiplasmodial, o processo

sinérgico pode ser inferido.

67

A fração P3q, que obteve o melhor IC50 do estudo, foi refracionada em

resina C18, a fim de separar as PLA2s e a protease que a compõe,

possibilitando o teste antiplasmodial com estes grupos isolados. A

cromatografia em fase reversa (C18) é uma técnica com maior poder

resolutivo, que tem como princípio a separação de moléculas a partir de

pequenas diferenças de hidrofobicidade. Esse sistema é considerado de fase

reversa, pois apresenta uma resina com alto caráter hidrofóbico. Isso gera

interações hidrofóbicas fortes que, para serem desfeitas, necessitam da

utilização de soluções menos polares (quando comparadas à água) como a

acetonitrila (WIEDERSCHAIN, 2004).

A fração P1c, gerada a partir deste passo cromatográfico, apresentou

em eletroforese uma banda com alto grau de pureza com massa de

aproximadamente 30 KDa. Esta amostra foi testada em relação a sua atividade

fibrinogenolítica e demonstrou atividade proteolítica (Figura 12). Como a fração

(P3q) que deu origem a esta amostra aparenta conter uma serinoprotease,

indica-se que a fração P1c contenha esta classe de molécula. A fração P3c

apresentou perfil eletroforético semelhante ao da fração de origem (Figura 19).

A fração P3c foi submetida a uma segunda cromatografia em fase

reversa, que gerou a amostra P1d (Figura 20). Esta apresenta duas bandas

com massa relativa de 15 e 13 KDa, indicando que seja composto por PLA2s.

As frações P1c e P1d serão testadas contra o P. falciparum, teste que deve

responder quais das classes de proteínas foi a responsável pela atividade

antiplasmodial, ou se houve ação sinérgica entre elas.

Além dos testes antiplasmodiais e a busca pelos valores de IC50, neste

trabalho foi investigado o perfil citotóxico (CC50) das frações em uma linhagem

de hepatócitos humanos. Essa estratégia leva em consideração que

substâncias com poder inibitório contra o parasito devam atuar em

concentrações não tóxicas para o hospedeiro, viabilizando assim o seu uso em

medidas terapêuticas (PINK et al., 2005).

A citotoxicidade das frações foi avaliada sobre células de

hepatocarcinoma humano (HepG2). A escolha desta linhagem se deu por

serem células de manejo facilitado e conservarem características das células

nas quais os fármacos são metabolizados. Além disso, uma etapa importante

do ciclo de vida do parasita se dá em células hepáticas (MATOS et al., 2016),

68

sendo que as próprias HepG2 se mostram capazes de abrigar in vitro o

desenvolvimento de espécies murinas de plasmódio (CALVO-CALLE et al.,

1994).

Após o período de incubação das frações com a cultura de HepG2, a

utilização do sal MTT permitiu a avaliação da viabilidade das células de

hepatocarcinoma. Como o sal MTT é oxidado nas mitocôndrias pela enzima

sucinato desidrogenase, gerando formazam (um cristal de cor arroxeada), foi

possível quantificar a geração do produto por espectrofotometria, relacionando

os níveis de absorbância com a integridade metabólica da célula (STOCKERT

et al., 2012).

As frações P3q e P5q não foram citotóxicas na concentração máxima

testada, 10 µg/mL (Tabela 7), apresentando inibição do crescimento celular

menor que 10% nesta concentração.

Outros compostos de venenos ofídicos foram testados sob a mesma

metodologia. O estudo de Kayano e colaboradores (2015) testou a

metaloprotease BbMP-1 (isolada de B. brazili) contra células HepG2. A

molécula apresentou CC50 maior ou igual a 200 µg/mL. Uma PLA2 homóloga

isolada no trabalho de Grabner e colaboradores (2017) não se mostrou tóxica

na concentração de 150 µg/mL. Terra e colaboradores (2015) testaram o

veneno de Micrurus spixii contra HepG2 sob a mesma metodologia, verificando

que o veneno não desempenhou atividade citotóxica em concentrações de 200

µg/mL. Tais estudos demonstram proteínas de venenos ofídicos com baixa

capacidade de inibir células HepG2.

A partir dos resultados de CC50, foi possível criar uma relação entre

estes valores e os de IC50, possibilitando a indicação de ação seletiva das

frações. O cálculo do índice de seletividade (IS) foi feito com a divisão entre o

valor de CC50 pelo de IC50, sendo que resultados altos indicam ação seletiva

(KATSUNO et al., 2015).

A fração P3q apresentou IS maior ou igual a 111 (Tabela 8). Isso indica

que a concentração necessária para inibir as HepG2 é, no mínimo, 111 vezes

maior que a necessária para inibir o parasito. A fração P5q apresentou IS ≥ 40.

Os trabalhos de Kayano e colaboradores (2015), Grabner e colaboradores

(2017) e Terra e colaboradores (2015) usam um parâmetro que estabelece que

resultados de IS maiores que 10 indicam ação seletiva. Levando esses artigos

69

em consideração, ambas as frações (P3q e P5q) apresentam alta seletividade

contra o parasito.

Porém, os estudos acima referenciam este parâmetro com o trabalho de

Bézivin e colaboradores (2003), um artigo que investiga a ação de extratos de

liquens contra diversas linhagens tumorais. Neste trabalho, não foi proposta a

criação de um parâmetro de seletividade para parasito/célula de mamíferos,

sendo na verdade estabelecido que valores de IS maiores que três são

“interessantes” para screenings que objetivem identificar compostos com

potencial ação anticâncer (i.e., seletivos para linhagens tumorais). Além disso,

o estudo não usou células HepG2, e os extratos que foram testados são de

uma natureza muito diferente à composição dos venenos ofídicos.

Na revisão de Katsuno e colaboradores (2015), são estabelecidos

critérios para direcionar o screening de compostos contra doenças infecciosas,

incluindo a malária. Os critérios para validação de atividade antiplasmodial são:

(i) IC50 < 1 µM contra linhagens multirresistentes do parasito; (ii) Índice de

seletividade >10 (entre ação citotóxica em células de mamíferos/ ação inibitória

do Plasmodium spp).

Além dos parâmetros para a validação de atividade, o estudo indica

características que, se presentes em uma substância, devem torná-la prioritária

no screnning. São elas: (i) IC50 < 100 nM contra linhagens multirresistentes do

parasito; (ii) IS > 100 (entre ação citotóxica em células de mamíferos/ ação

inibitória do Plasmodium spp). (iii) Apresentar, preferencialmente, um novo

mecanismo de ação antiplasmodial; (iv) Ter eficácia in vivo, com utilização oral

e capaz de diminuir a parasitemia em 90% com concentração < 50 mg/Kg

(KATSUNO et al., 2015).

Como no presente estudo não se conhece a massa molecular dos

compostos testados, os resultados não podem ser expressos em molaridade,

impossibilitando a checagem do critério de inibição antiplasmodial indicado.

Apesar disso, a fração P3q apresentou IS > 111, o que se encaixa no padrão

de seletividade mencionado (KATSUNO et al., 2015).

Quando comparado o valor de IC50 da fração P3q (0,09 µg/mL) com o

controle positivo, o fármaco artemisinina (IC50 de 0,006 µg/mL), percebe-se a

droga é 15 vezes mais potente. Porém, deve-se levar em consideração que a

70

quantidade de princípio ativo por µg é diferente entre a fração P3q e a

artemisinina, já que a concentração molar é desigual.

Além das HepG2, hemácias humanas foram testadas frente a

concentrações seriadas das frações P3q e P5q (Figura 18). Este teste visou

verificar se a atividade antiplasmodial não foi consequência de uma ação

hemolítica das frações. A fração P3q não foi hemolítica na concentração

máxima testada (10 µg/mL), indicando que a dose necessária para atingir o

IC50 (0,09 µg/mL) é, no mínimo, 100 vezes menor do que a necessária para

causar hemólise. A fração P5q também não foi hemolítica na concentração de

10 µg/mL, confirmando a hipótese de que ambas não causaram hemólise

durante os testes antiplasmodiais.

6. CONCLUSÃO

✓ O veneno de B. jararaca foi ativo contra formas sanguíneas da cepa W2

de P. falciparum, com IC50 médio de 0,44 µg/mL;

✓ O fracionamento do veneno de B. jararaca gerou 10 frações por

cromatografia de exclusão molecular (P1g – P10g);

✓ As frações P2g, P3g, P4g e P5g foram potentes em inibir o crescimento

parasitário (IC50 variando entre 0,1 – 0,59 µg/mL), com destaque a

fração P2g, de IC50 médio de 0,1 µg/mL;

✓ O refracionamento da fração P2g por cromatografia de troca aniônica

gerou mais cinco frações (P1q - P5q);

✓ A fração P3q apresentou o melhor IC50 deste trabalho (0,09 µg/mL);

✓ A fração P3q demonstrou ser composta majoritariamente por uma

protease e fosfolipases A2, e estes grupos de moléculas podem ter

atuado de forma independente ou sinérgica contra o parasito.

✓ A fração P5q apresentou IC50 de (0,25 µg/mL), o que demonstra que

também contém potencial antiplasmodial.

✓ As frações P3q e P5q não foram citotóxicas contra células HepG2 na

concentração de 10 µg/mL.

✓ As frações P3q e P5q foram seletivas contra o parasito, com IS > 111 e

>40, respectivamente.

✓ As frações P3q e P5q não foram hemolíticas.

71

✓ O alto valor de IS e a ausência de atividade hemolítica indica a potente e

seletiva ação das frações contra o P. falciparum.

✓ O isolamento e caracterização bioquímica das moléculas que compõem

as frações P3q e P5q é essencial para a melhor compreensão da ação

antiplasmodial destas.

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ANEXO 1 – Aprovação do IBAMA para a implantação do banco de

venenos do CEBio.

88

ANEXO 2 – Autorização de acesso ao patrimônio genético – CGEN.

89

ANEXO 3 - Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa – CEP.

90

ANEXO 4 – Resultados de atividade in vitro contra Leishmania

amazonenses das frações de exclusão molecular do veneno de B.

jararaca.


Veneno de B. jararaca 11,9 ±3,7 P1g >100 P2g >100 P3g >100 P4g >100 P5g >100 P6g >100 P7g >100 P8g >100 P9g >100 Pentamidina 0,11 ± 0,01

P1g – P9g: Frações obtidas por meio de cromatografia de exclusão molecular

do veneno de B. jararaca. Avaliação da parasitemia por teste colorimétrico com

Resazurina. Médias obtidas de dois testes em triplicata.

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