Londrina 2016

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO

STHEACE KELLY FERNANDES SZEZERBATY

ANÁLISE DAS ESTRUTURAS CELULARES, CITOTOXICIDADE E MODULAÇÃO DA EXPRESSÃO

GÊNICA EM CÉLULAS FIBROBLÁSTICAS (L929)

SUBMETIDAS À TERAPIA LASER DE BAIXA POTÊNCIA

STHEACE KELLY FERNANDES SZEZERBATY

Cidade ano

AUTOR

Londrina

2016

ANÁLISE DAS ESTRUTURAS CELULARES,

CITOTOXICIDADE E MODULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA EM CÉLULAS FIBROBLÁSTICAS (L929)

SUBMETIDAS À TERAPIA LASER DE BAIXA POTÊNCIA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Reabilitação (UEL/UNOPAR), como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação. Orientador: Prof. Dra. Regina Célia Poli Frederico Coorientador: Prof. Dr. Rodrigo Franco de Oliveira

AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Dados Internacionais de catalogação-na-publicação Universidade Norte do Paraná

Biblioteca Central Setor de Tratamento da Informação

Szezerbaty, Stheace Kelly Fernandes S992aAnálise das estruturas celulares, citotoxidade e modulação da expressão

gênica em células fibroblásticas (L929) submetidas à terapia laser de baixa potência /Stheace Kelly Fernandes Szezerbaty: [s.n], 2016.

64f. Dissertação(MestradoAcadêmico emCiências da Reabilitação). Universidade Norte

doParaná.

Orientador:Profª.Drª.Regina Celia Poli Frederico

1- Reabilitação -dissertação demestrado-UNOPAR 2- Expressão gênica 3-Reparo tecidual4-Terapia laser de baixa potência5-

Viabilidade celularI-Frederico, Regina Célia Poli; orient. II –Universidade Norte do Paraná.

CDU 577.27:616

4

STHEACE KELLY FERNANDES SZEZERBATY

ANÁLISE DAS ESTRUTURAS CELULARES CITOTOXICIDADE E MODULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA EM CÉLULAS

FIBROBLÁSTICAS (L929) SUBMETIDAS À TERAPIA LASER DE BAIXA POTÊNCIA

Dissertação apresentada à UNOPAR, no Programa de Pós Graduação em Ciências

da Reabilitação (UEL/UNOPAR), como requisito parcial para a obtenção do título de

Mestre conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores:

_________________________________________ Prof. Dra. Regina Célia Poli Frederico

(Orientadora) Universidade Norte do Paraná (UNOPAR)

_________________________________________ Prof. Dra. Deise Aparecida de Almeida Pires Oliveira

(Membro Interno) Universidade Norte do Paraná (UNOPAR)

_________________________________________ Prof. Dra. Cristina Pacheco Soares

(Membro Externo) Universidade Vale do Paraíba (UNIVAP)

Londrina, 15 de fevereiro de 2016.

AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus que me permitiu chegar onde cheguei, por

estar sempre ao meu lado, me dado forças quando mais precisei e nunca ter me

permitido desistir.

A minha família por estar sempre presente nos momentos mais díficeis e

cinzentos em mais essa etapa da minha vida. As orações incessantes dos meus

avós paternos (Dalva e Zuardo) para que tudo corresse bem e nada me fizesse

desistir, aos meus avós maternos (Maria do Céu e Luiz - in memoriam) pelo cuidado,

amor e compreensão por nem sempre estarem presente.

Aos meus pais Márcio e Cacilda que as vezes até meio distante, sempre me

incentivaram a continuar construindo um futuro sólido, por estarem sempre ao meu

lado e sempre me incentivando a continuar. Obrigada por sempre acreditarem que

eu era capaz. Amo vocês demais.

As minhas irmãs, Sthephanny, Sthella e Sthaylla por aguentarem meus dias

de estresse e chatice que não foram poucos. Em especial a Sthaylla, por estar

sempre ao meu lado e não ter me abandonado nos dias bons ou ruins, por ter

dividido responsabilidades que seriam quase impossíveis sem ela. Obrigada meu

anjo, te amo muito e agradeço a Deus por ter você ao meu lado.

Aos meus sobrinhos Breno, Mayara, Monike, Eduarda e a minha afilhada

Isabela por serem as alegrias da minha vida. Apesar de serem muito novos, me

deram força para continuar. Amo vocês demais.

Agradeço ao Bruno, que foi a pessoa que mais me motivou e incentivou, e

não desistiu de mim. Obrigada por passar noites e finais de semana estudando

comigo sem questionamentos, por acreditar em mim e por estar sempre ao meu lado

nos momentos bons e nos mais difíceis também. Aos pais dele (Aparecida e

Cláudio) por inúmeras vezes serem meu porto seguro, por me permitirem desabafar

e aconselharem sempre.

A minha orientadora professora Dra. Regina Célia Poli Frederico por ter aceito

ser a minha luz e me guiado por um caminho por mim desconhecido. Pela paciência,

atenção, dedicação, incentivo e por tornar esse meu sonho possível. Agradeço de

coração.

Ao meu coorientador professor Dr. Rodrigo Franco de Oliveira e a professora

Deise Aparecida de Almeida Pires Oliveira que me acompanharam desde a época

da graduação e por nunca terem desistido de mim. Vocês acompanharam as fases

mais importantes da minha vida e não tem como vocês serem menos importantes

pra mim.

A professora Dra. Cristina Pacheco Soares, professor Dr. Newton Soares e as

suas equipes de pesquisa que nos acolheram em seus laboratórios e não mediram

esforços em nos ajudar nos experimentos, por compartilharem todo seu

conhecimento e bom humor.

As minhas companheiras de jornada e amigas Juliana e Nayara, por estarem

sempre presente nas dificuldades, frustrações e nas horas boas também. Vocês

foram muito importantes para que tudo desse certo. Obrigada meninas.

Ao meu amigo e parceiro também de jornada Leandro, sem você muita coisa

seria impossível. Obrigada pela disponibilidade e paciência em nos ensinar muitas

coisas.

A minha amiga Priscila por ter dividido também as frustrações e alegrias, por

ter me permitido fazer parte da sua vida, pelo apoio, conselhos e caronas.

Ao Gleydson da coordenação de Odontologia e a Jéssica do Centro de

Pesquisa por sempre me socorrerem quando mais precisei, pela prontidão em

ajudar.

A todos colegas do mestrado, professores do Programa de Ciências em

Reabilitação e funcionários UEL/UNOPAR por manter sempre a qualidade e

excelência do programa e ao apoio oferecido ao longo dessa jornada.

Por fim, às agências financiadoras Coordenação de Aperfeiçoamento de

Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq), pelo suporte financeiro.

Obrigada a todos!

"E não nos cansemos de fazer o bem,

pois no tempo próprio colheremos, se

não desanimarmos."

Gálatas 6:9

SZEZERBATY, Stheace Kelly Fernandes. "Análise das estruturas celulares, citotoxicidade e modulação da expressão gênica em células fibroblásticas (L929) submetidas à terapia laser de baixa potência". 2016. Número total de folhas: 64 . Dissertação (Mestrado em Ciências da Reabilitação) - Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2016.

RESUMO

Introdução: A Terapia Laser de Baixa Potência é um recurso muito utilizado na prática clínica por apresentar benefícios durante o processo de reparo em lesões. Objetivo: O objetivo deste estudo foi analisar os efeitos da irradiação do laser de baixa potência 660 nm (AlGaInP) nas doses de 1 e 5 J/cm² na viabilidade celular e expressão dos genes Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) e Interleucina (IL6) em células fibroblásticas de camundongo. Metodologia: As células fibroblásticas L929 foram divididas em 3 grupos: G1- Grupo Controle (grupo não irradiado), G2- irradiado a 1 J/cm² e G3- irradiado a 5 J/cm² em placas de 96 poços com laser λ 660 nm. Os grupos receberam irradiação em três tempos (24, 48 e 72 horas após semeadura). Foi selecionada a melhor dose e melhor tempo para realizar a microscopia de fluorescência e expressão gênica após a análise de proliferação celular foi realizado o ensaio de MTT (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol)- 2,5-difeniltetrazólio]) 24 horas após cada irradiação. Ambas análises foram realizadas em triplicata. Para a microscopia de fluorescência foram utilizados os corantes fluorescentes Rodamina-Faloidina (citoesqueleto), DIOC6 (retículo endoplasmático) e DAPI (núcleo), e para a análise da expressão gênica foi realizado o método qRT-PCR. Resultados: A dose de 5 J/cm² promoveu um aumento estatisticamente significativo na proliferação celular quando comparado com a dose 1 J/cm² no tempo 48 horas (p<0,01) e quando comparado também com o grupo controle no tempo 72 horas (p=0,03). Esses valores foram confirmados pela microscopia de fluorescência que evidenciaram atividade reticular intensa e efeito biomodulatório no citoesqueleto nos tempos 48 e 72 horas. Já na análise da expressão gênica foi possível identificar uma diferença estatisticamente significativa na expressão dos genes estudados entre os grupos avaliados. As células irradiadas apresentaram um aumento de 1,98 vezes nos transcritos do gene VEGF e diminuição de 4,05 vezes nos transcritos do gene IL-6 na dose de 5 J/cm² no tempo de 72 horas quando comparados com o grupo controle (G1). Conclusão: Foi concluído que a irradiação a laser de baixa potência estimula tanto a proliferação e metabolismo celular quanto a expressão do gene VEGF e inibe a expressão do gene IL6 em cultura de células fibroblásticas de camundongos (L929). Palavras-chave: Expressão gênica. Reparo tecidual. Terapia laser de baixa potência. Viabilidade celular.

SZEZERBATY, Stheace Kelly Fernandes. "Analysis of cellular structures, cytotoxicity and modulation of gene expression in fibroblast cells (L929) underwent laser therapy of low power." 2016. Total number of sheets: 64 . Dissertation (Master in Reabilitation Science) - Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2016.

ABSTRACT

Introduction: Low Power Laser Therapy is a resource widely used in clinical practice to present benefits during the repair process in injury. Objective: The objective of this study was to analyze the effects of low power laser irradiation 660 nm (AlGaInP) in doses of 1 and 5 J / cm² on cell viability and gene expression factor Vascular Endothelial Growth (VEGF) and interleukin (IL6 ) in mouse fibroblast cells. Methodology: The L929 fibroblast cells were divided into 3 groups: control group G1 (non irradiated group), G2 irradiated at 1 J / cm² and G3 irradiated at 5 J / cm² in 96 well plates with laser λ 660 nm. The three groups received irradiation times (24, 48 and 72 hours after seeding). The best dose and time was selected to best perform fluorescence microscopy and gene expression after cell proliferation analysis was performed using the MTT assay (bromide [3- (4,5-dimethylthiazol) - 2,5-diphenyltetrazolium bromide]) 24 hours after each irradiation. Both analyzes were performed in triplicate. For fluorescence microscopy were used fluorescent dyes Rhodamine-Phalloidin (cytoskeleton), DiOC6 (endoplasmic reticulum) and DAPI (nucleus), and for the analysis of gene expression was performed qRT-PCR method. Results: A dose of 5 J / cm² caused a statistically significant increase in cell proliferation compared with the 1 dose J / cm² time 48 hours (p <0.01) and also when compared with the control group at time 72 hours ( p = 0.03). These values were confirmed by fluorescence microscopy which showed strong reticular activity and biomodulatório effect on the cytoskeleton in time 48 and 72 hours. In the analysis of gene expression it was possible to identify a statistically significant difference in the expression of genes studied between the groups. The irradiated cells showed an 1.98 fold increase in the VEGF gene transcripts and a decrease of 4.05 times on IL-6 gene transcripts in a dose of 5 J / cm² in time of 72 hours when compared to the control group (G1 ). Conclusion: It was concluded that irradiation at low power laser stimulates both proliferation and cell metabolism and expression of the VEGF gene and inhibits expression of the IL-6 gene in cultured mouse fibroblast cells (L929). Key words: Gene expression. Tissue repair. Low-power laser therapy. Cell viability.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AsGa - Arseneto de Gálio

AsGaAl - Arseneto de Gálio Alumínio

AlGaInP - Arseneto Gálio Índio-Fósforo

ATP - Adenosina Trifosfatada

bFGF - Fator de Crescimento de Fibroblasto básico

cDNA - Ácido Desoxirribonucléico complementar

CO2 - Dióxido de Carbono

COL1 - Colágeno tipo 1

COL1α1 - Colágeno tipo 1 alfa 1

DAPI - 4', 6' - diamidino, 2' phenylindole - 5 μM

DIOC6 - Iodeto de 3,3'-dihexyloxacarbocyanine

DMEM/HAM F12 - Meio Eagle Modificado por Dulbecco com Meio de Nutriente F12

DMSO - Dimetilsulfóxido

DNA - Ácido desoxirribonucléico

FBS - Fetal Bovine Serum (Soro Fetal Bovino)

FGF - Fator de Crescimento de Fibroblasto

HeNe - Hélio-Neônio

HIF1 - Fator Indutor de Hipóxia tipo 1

IFN-γ - Interferon gama

IGF - Fator de Crescimento semelhante à Insulina tipo 1

IGFBP3 - Proteína 3 de ligação a Fator de Crescimento semelhante à Insulina

IL-1 - Interleucina 1

IL-10 - Interleucina 10

IL-1β - Interleucina 1 beta

IL-2 - Interleucina 2

IL-6 - Interleucina 6

J - Joules

MCP-1 - Proteína Quimiotática de Monócitos tipo 1

MEC - Matriz Extracelular

mJ - Milijoule

mm - Milímetro

MMP - Metaloproteínase da Matriz

MMP-2 - Metaloproteínase da Matriz tipo 2

mRNA - Ácido Ribonucléico mensageiro

MTT - Brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol)- 2,5-difeniltetrazólio]

nm - Nanômetro

O2 - Oxigênio

PA - Paraformoldeído

PCR - Reação em Cadeia da Polímerase

PDGF - Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas

PGE2 - Prostaglandina E2

qPCR - Reação em Cadeia da Polímerase quantitativa

TGFβ - Fator de Transformação do Crescimento beta

TLBP - Terapia Laser de Baixa Potência

TNFα - Fator de Necrose Tumoral

VEGF - Fator de Crescimento Endotelial

β-actina - Beta actina

λ - Comprimento de onda

μL - Microlitro

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 13

2 REVISÃO DE LITERATURA - CONTEXTUALIZAÇÃO ........................................ 15

2.1 LASER........... ........................................................................................................ 15

2.2 LASER NA REABILITAÇÃO ........................................................................................ 18

2.3 EFEITOS DA TERAPIA LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CULTURA E TECIDOS

BIOLÓGICOS.................................................................................................................20

2.4 TERAPIA LASER DE BAIXA POTÊNCIA E A EXPRESSÃO GÊNICA ................................... 23

3 OBJETIVOS... ........................................................................................................ 25

3.1 GERAL........... ....................................................................................................... 25

3.2 ESPECÍFICOS ......................................................................................................... 25

4 ARTIGO

4.1 EFEITO DA TERAPIA LASER DE BAIXA POTÊNCIA NA BIOMODULAÇÃO E EXPRESSÃO DOS

GENES VEGF E IL-6 EM CÉLULAS FIBROBLÁSTICAS (L929)........... .................................. 26

CONCLUSÃO GERAL .............................................................................................. 43

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 44

ANEXOS ................................................................................................................... 49

ANEXO A – Normas para submissão na revista Laser in Medical Science .............. 50

ANEXO B – Parecer CEP.......................................................................................... 66

13

1. INTRODUÇÃO

A Terapia Laser de Baixa Potência (TLBP) tem sido um recurso muito

utilizado na prática clínica para acelerar processos de reparação de tecidos moles e

duros. Apresenta efeitos biomoduladores nas células e tecidos, ativando ou inibindo

os processos fisiológicos, bioquímicos e metabólicos através dos efeitos fotofísicos

ou fotoquímicos1.

As consequências iniciais da interação entre a TLBP e o tecido biológico são:

liberação de substâncias como histamina, serotonina e bradicinina; alteração da

velocidade das reações enzimáticas normais, podendo proporcionar ainda, um

aumento na produção de ATP, promovendo maior eficiência da bomba de sódio e

potássio.2

Um dos efeitos mais relacionados ao desempenho da TLBP é o aumento da

proliferação celular, porém, os mecanismos celulares ainda não são muitos bem

compreendidos. É possível que a TLBP aumente a celularidade dos tecidos

irradiados acelerando o ciclo mitótico, favorecendo a neovascularização e formação

de tecidos de granulação, desempenhando papel fundamental na reparação

tecidual1.

As lesões de pele têm um grande potencial de morbidade, em decorrência de

eventuais complicações no processo da cicatrização normal. O conhecimento das

fases de reparação tecidual, bem como dos fatores que determinam este processo

normal (hemostasia, inflamação, demolição, proliferação e maturação) são

relevantes para evitar complicações neste processo3.

Estudos sugerem que a fotobiomodulação pelo laser pode ocorrer durante as

fases inflamatórias e proliferativas da cicatrização.4 A capacidade de acelerar o

processo de cicatrização, pode estar relacionado com o fato de que a TLBP

promove a proliferação celular.5 Adicionalmente a TLBP pode estimular a produção

de colágeno e neovascularização6-8.

Segundo Piva et al.², estudos in vivo e in vitro com a TLBP utilizando

comprimentos de onda de 632,8 à 904 nm e doses de 5 à 16 J/cm² exercem efeitos

anti-inflamatórios importantes nos processos iniciais da cicatrização, como a

redução de mediadores químicos (PGE2 e histamina), de citocinas (IL-1, IL2, IL-6,

IL-10 e TNFα), diminuição da migração de células inflamatórias (leucócitos e

14

neutrófilos), redução de edema e incremento de fatores de crescimento (FGF, bFGF,

IGF-1 e IGFBP3), contribuindo diretamente para o processo de reabilitação tecidual.

Martignago et al.6 mostraram que a TLBP (λ 904 nm) com doses de 2 e 3

J/cm² em células fibroblásticas de camundongo (L929) aumentou a proliferação

celular e a expressão dos genes COL1α1 e VEGF quando as células foram

irradiadas a 2 J/cm², concluindo que esta dosagem é a mais indicada para estimular

o reparo tecidual que a dose de 3 J/cm², e através de seu efeito biomodulador.

Porém, há relatos na literatura que demonstram que a irradiação a laser em

determinados comprimentos de onda pode exercer efeito tanto inibitório (10 a 16

J/cm²) na viabilidade e proliferação celular com uma quantidade significante de

danos a membrana celular e ao DNA, quanto estimulatório (2,5 a 5 J/cm²) da

atividade mitocondrial, migração e proliferação de células, mantendo a viabilidade

celular sem causar danos adicionais à célula1. Entretanto, ressalta-se que a TLBP

possui grande importância na area da saude, destacando-se a medicina, odontologia

e fisioterapia. Vários autores frisam que a não padronização na escolha de

parâmetros (λ, pico de potência e densidade de energia) na aplicação clínica e em

estudos é um fator a ser investigado e estabelecido, visando melhorar o rendimento

das células em culturas e nos tecidos1-6.

Pelo fato de a TLBP apresentar uma literatutra escassa em relação a um

comprimento de onda específico referente aos seus efeitos em estudos in vivo e in

vitro1, o objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade celular, a influência da TLBP

sobre as estruturas celulares (citoesqueleto, retículo endoplasmático e núcleo) e a

modulação na expressão dos genes VEGF e IL6 em células fibroblásticas de

camundongo (L929) após irradiação com laser AlGaInP (660 nm) com doses de 1 e

5 J/cm2.

15

2. REVISÃO DE LITERATURA - CONTEXTUALIZAÇÃO

2.1 LASER

O laser originou-se do acrônimo de Light Amplification by Stimulated Emission

of Radiation (Luz Amplificada por Emissão Estimulada por Radiação)4,9,10, sendo

uma fonte de luz monocromática, intensa, coerente e colimada, cuja emissão de

radiação se faz pelo estímulo de campo externo10.

Embora Albert Einstein originalmente tenha esboçado os princípios básicos

da geração deste tipo de luz em 1917 em seu artigo "Zur Quantum Theories der

Strahlung"11, classificando os lasers como de "alta potência" (com efeito destrutivo) e

de "baixa potência" (sem efeito destrutivo)12, foi somente em 1960 que Theodore

Maiman produziu o primeiro disparo de luz laser de rubi nos Estados Unidos13.

Foi a partir de 1960 com Maiman que o laser começou a ser efetivamente

utilizado e, atualmente ele é usado em várias áreas da saúde (oftalmologia,

dermatologia, fisioterapia, odontologia1e biomedicina4)12. Ainda nesta década,

surgiram outros tipos de lasers, entre os mais conhecidos: o laser de rubi seguido

pelo laser de Hélio-Neônio em 1960, o laser de Diodo entre 1962 e 1963, ainda em

1963 surgiu o laser de Dióxido de Carbono. Já em 1964 surgiu o laser de Íons,

seguido pelo laser de Corante orgânico em 1966 e pelo laser de Onda Química

Contínua em 1969. Já na década de 70, foram inventados o laser Excimer em 1970

e o laser de Elétrons livres em 197612,15.

Os primeiros tratamentos experimentais em pacientes iniciaram-se na década

de 1970 após relatos de resultados positivos da irradiação com a terapia a laser de

baixa potência (TLBP) em culturas de células e em experimentos animais10,12.

Alguns dos lasers mais utilizados na medicina são: Laser de Dióxido de

Carbono (CO2) com comprimento de onda em 10.600 nm, Laser de Neodímio-Ítrio

Alumínio Garnet (NdYAG) em 1060 nm, Laser de Argônio (Ar Laser) em 488 nm,

Laser Hélio-Neônio (HeNe) com 632,8 nm e Laser Arseneto de Gálio Aluminio

(AsGaAl) em 780-830 nm13. Já na fisioterapia, os lasers mais utilizados na prática

clínica são: Laser Arseneto Gálio Índio-Fósforo (AlGaInP) e Laser Hélio-Neônio

(HeNe) na faixa de luz vermelha e o Laser Arseneto de Gálio (AsGa) na faixa de luz

invisível 14,16.

16

Figura 01 - Comprimentos de ondas do laser

Fonte: http://ctborracha.com/wp-content/uploads/2011/03/Fig-50---Espectro-da-

ondas-electromagneticas_MC.jpg

Inicialmente a irradiação a laser de baixa potência recebeu o nome de

fotobioestimulação. Mas, atualmente sabe-se que esse termo é inapropriado, pois os

lasers também tem o potencial de inibir os processos celulares. Sendo assim, a

terminologia mais adequada a ser utilizada é fotobiomodulação17.

Entre as principais características do laser estão: uma fonte de luz

monocromática, intensa, coerente e colimada10.

Segundo Genovese13, a luz monocromática é a emissão de uma radiação

com uma linha espectral muito estreita, ou uma emissão de uma radiação com um

comprimento de onda muito bem especifico. Já a coerência tem a idéia de estar

ligada ao "caminhamento" ordenado das ondas em relação ao tempo. Num mesmo

instante uma determinada emissão possui várias ondas justapostas, onde suas

amplitudes têm valores iguais, e a colimação se deve a luz laser emitindo em uma

única direção com uma baixa divergência dos raios.

O comprimento de onda (λ) é a característica mais importante do laser, sendo

definido como a distância percorrida pela onda em uma oscilação completa14,17. Sua

17

importância se deve ao fato de assegurar que a dose necessária penetre no tecido-

alvo.

Figura 02 - Penetração do laser no tecido

Fonte:http://g01.s.alicdn.com/kf/UT83b9cXCtaXXagOFbX7/196340795/UT83b9cXCt

aXXagOFbX7.jpg

Lasers com propriedade de luz invisível (λ entre 790 a 1300nm) como o

Arseneto de Gálio perdem 50% de energia em 4 mm de profundidade, já os lasers

com propriedade de luz visível (Hélio-Neônio, Arseneto de Gálio Índio-Fósforo,

Arseneto de Gálio Alumínio entre outros) perdem 50% de energia em 0,5 mm de

profundidade, tornando-o aplicável na biomodulação superficial, mas não para a

penetração profunda o suficiente para a terapia reumatológica e ortopédica11,12,17.

Os lasers podem ser classificados de várias formas, dentre eles a potência da

emissão de radiação, podendo ser de alta, média e baixa potência4,10,12,16. Ressalta-

se que os de baixa potência são usados na prática clínica para redução da dor e

edema e preservar estruturas adjacentes à lesão2,7-10,16.

18

2.2 LASER NA REABILITAÇÃO

As lesões musculares são muito comuns na área esportiva, afastando atletas

dos treinamentos e competições, sendo estas causadas, principalmente, por

contusões e excessivas forças musculares27. Sabe-se que diversas técnicas

terapêuticas são empregadas na prática clínica na tentativa de promover aceleração

e/ou melhora do processo de reparação óssea e muscular, dentre elas a TLBP28,

porém o maior desafio das pesquisas é definir os parâmetros ideais para uso do

laser29.

A TLBP encontra uma variedade de aplicações na prática clínica como: a)

estimulação da regeneração de diversos tipos de feridas; b) tratamento de várias

condições reumatológicas; c) tratamento de lesões de tecidos moles; d) alívio da

dor; e) redução de edema, entre outros11.

Baroni et al30 observaram a redução dos marcadores de lesão muscular após

a aplicação da TLBP antes do exercício excêntrico. Já Vieira et al.31 inferem uma

redução na fadiga muscular após treinamento de endurance associado à aplicação

da TLBP.

O processo de cicatrização é complexo e envolve três fases: a) a fase

inflamatória, onde ocorre a migração celular de leucócitos e plaquetas, b) a fase

proliferativa, onde há um aumento de células fibroblásticas e c) a fase de

remodelação, onde os fibroblastos participam do processo de reestruturação da

matriz extracelular e do depósito de colágeno. Porém, a dificuldade no processo de

cicatrização ocorre principalmente nos estágios iniciais do processo de reparo, onde

se observa uma acentuação do edema, diminuição da proliferação vascular e uma

redução significativa de leucócitos, macrófagos e fibroblastos32.

Pode-se afirmar que, dentre os recursos físicos existentes, a TLBP é mais

eficaz no que se refere ao estímulo à cicatrização14. Araújo et al.33 demonstraram

que a TLBP pode influenciar a produção de mediadores inflamatórios como as

citocinas, sendo importantes durante o processo de cura por ativar a proliferação

celular após a irradiação de 1 J/cm² com o laser de He-Ne (λ 632,8 nm) nos períodos

de 8, 15 e 22 dias.

Já Rocha Jr et al.3 observaram uma maior quantidade de fibroblastos em

19

células irradiadas, evidenciando um aumento significativo na proliferação

fibroblástica e diminuição de infiltrado inflamatório, concluindo que a TLBP acelera o

processo de reparo tecidual.

Alguns autores trazem o reparo tecidual como um estado dinâmico que

compreende diferentes processos, como: inflamação, proliferação celular e síntese

de elementos que constituem a matriz extracelular (como colágeno, elastina e fibras

reticulares). A síntese de colágeno é processo rápido e harmônico que tem seu

início com a lesão intersticial e se estende até o final da fase de cicatrização, quando

ocorre a remodelação dos tecidos12, 34, 35.

A inflamação representa a reação do tecido vivo vascularizado a uma

agressão local. Esta serve para destruir, diluir ou imobilizar o agente agressor pelo

desencadeamento de uma série de processos biológicos que, tanto quanto possível,

reconstituem o tecido lesado, estando intimamente relacionada com o processo de

reparo16.

Barbosa et al5 e Stein et al36 mostraram que TLBP nos comprimentos de onda

entre 632,8 e 670 nm estimularam o crescimento, a diferenciação e a proliferação de

diferentes tipos de células em cultura, incluindo queratinócitos, fibroblastos, células

endoteliais, mioblástos e osteoblástos, por exercer efeitos biomoduladores positivos.

Busnardo e Biondo-Simões37 avaliaram os efeitos da TLBP (λ = 632,8 nm) na

cicatrização de feridas realizando lesões cirúrgicas em animais e os irradiaram com

4 J/cm2 por 3, 7 e 14 dias. Os autores concluíram que a TLBP não modifica a

qualidade da reação inflamatória, mas diminui sua intensidade e aumenta a

deposição de colágeno no início do processo cicatricial, não interferindo na

maturação da cicatriz.

Embora várias pesquisas sobre os efeitos da TLBP tenham sido publicadas

nos últimos 20 anos, seus resultados ainda não são conclusivos sobre os efeitos da

terapia no reparo tecidual, merecendo uma investigação mais detalhada e

minuciosa1,2,4,5,18.

20

2.3 EFEITOS DA TERAPIA LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CULTURA E

TECIDOS BIOLÓGICOS

A terapia laser de baixa potência (TLBP) provoca modificações bioquímicas,

bioelétricas e bioenergéticas, atuando no aumento do metabolismo, na proliferação

e maturação celular14,16. O laser possui o potencial de acelerar reações bioquímicas,

liberando substâncias pré-formadoras como bradicinina, histamina e serotonina.

Segundo Karu et al18, a irradiação a laser aumenta a síntese de adenosina trifosfato

(ATP), a síntese e consumo de O2 e aumenta o potencial de membrana mitocondrial.

O efeito fotobiomodulador do laser sobre as mitocôndrias desencadeiam a

ativação da produção de ATP por meio de um aumento no processo mitótico devido

à excitação de respiração celular e porfirinas endógenas19. Com o aumento da

produção de ATP, a eficiência da bomba sódio e potássio é melhorada, mantendo

com maior eficácia a diferença do potencial elétrico existente entre o interior e

exterior da célula14,20.

Vários autores evidenciaram aumento da cicatrização das feridas após a

terapia com laser de 632,8 à 904 nm, 50 mJ à 8 J/cm², tanto em estudos in vivo

como in vitro, havendo aumento na atividade mitótica, número de fibroblastos,

síntese de colágeno, proliferação celular, e neovascularização dos tecidos

lesados12,20-23.

Como consequência dos fatores fisiológicos, a irradiação laser de baixa

potência proporciona os seguintes efeitos: estimulo à microcirculação, anti-

inflamatório, analgésico, antiedematoso e indutor da reparação tecidual1, acelerando

e organizando o processo de reparo tecidual4,9.

Segundo Andrade et al10, entende-se que o aumento da produção de

colágeno ocorre através de mecanismos de fotoestimulação, sobre os quais certas

potências/doses podem atuar, modulando assim a proliferação celular e elevando a

quantidade de fatores de crescimento de fibroblastos.

Estudos feito por Alfredo et al24 e Sakurai et al25 observaram uma melhora da

dor, amplitude de movimentos e funcionalidade, sugerindo como possíveis efeitos do

laser a ação anti-inflamatória e analgésica pela modulação endógena da dor via

serotonina, onde a ação anti-inflamatória pode ocorrer por alterações na via da

21

ciclooxigenase do metabolismo do ácido aracdônico, além de promover a

reabsorção de exsudatos inflamatórios, favorecendo, desta forma, a eliminação de

substâncias como bradicinina, histamina e acetilcolina.

Em nível vascular, Lins et al16 e Walsh et al26 observaram que a TLBP

estimula a proliferação das células endoteliais, resultando na formação de

numerosos vasos sanguíneos, assim como na produção aumentada do tecido de

granulação, estimulando o relaxamento da musculatura vascular lisa.

Uma melhora na microcirculação e estímulo nas células fibroblásticas, com

produção de fibras elásticas e colágenas mais ordenadamente, são fatores que

determinam um melhor padrão de cicatrização13.

A técnica de cultivo celular deriva de uma dispersão de células a partir de um

tecido original de uma linhagem celular, cultura primária ou pela degradação

enzimática ou mecânica. Inicialmente, existiam grandes dificuldades com a técnica,

porém foram progressivamente solucionadas com uso de materiais descartáveis e

estéreis, meios de cultura apropriados e métodos de manuseio seguros38.

Pires-Oliveira et al.39 relataram que a TLBP apresentou um efeito benéfico

sobre o crescimento de células fibroblásticas L929 irradiadas com laser 904 nm, 50

mJ e 6 J/cm², onde a taxa de crescimento foi maior em 50 mJ/cm² nos tempos 24 e

48 h.

Houreld et al.40 observaram um aumento significativo na expressão dos genes

envolvidos na produção de colágeno (COL14A1, COL4A1, COL4A3 e COL5A3), de

adesão celular e crescimento (ITGA2, ITGA5, ITGB1, e Atg5), de enzimas de

remodelação (CTSG, CTSL2, F13A1, F3, FGA, MMP7 e MMP9), de proteínas do

citoesqueleto (ACTC1 e RAC1), citocinas inflamatórias e quimiocinas (CD40LG,

CXCL11, CXCL2, IFNg, IL10, IL2 e IL4) utilizando a TLBP (λ 660 nm) com 5 J/cm²

no período de 48 horas após a irradiação.

Diversos estudos têm examinado os efeitos da TLBP em uma variedade de

linhagens celulares e células explantadas para estabelecer as bases fisiológicas do

uso clínico, especialmente para a promoção de regeneração de lesões. Nestes

estudos, têm sido usados possíveis indicadores para avaliar os efeitos

fotobiomoduladores da TLBP, incluindo proliferação celular41, produção de colágeno

e alterações estruturais42.

As alterações nas estruturas celulares e das organelas podem ser

22

evidenciadas por meio da microscopia de fluorescência. Segundo Huang et al.43 esta

técnica tem facilitado na obtenção de informações não só nas estruturas

moleculares do DNA, mas também sobre a organização e a dinâmica das estruturas

celulares como o citoesqueleto das células, especialmente microtúbulos (filamentos

de actina e queratina e neurofilamentos), organelas (retículo endoplasmático,

lisossomo e vesículas) e mitocôndrias.

Para a marcação dos filamentos intermediários do citoesqueleto pode ser

utilizado a Rodamina-Faloidina para a observação da organização e dinâmica do

citoesqueleto. A marcação fluorescente de actina é uma importante ferramenta para

a investigação da dinâmica do citoesqueleto in vitro44.

A condensação da cromatina e a fragmentação do núcleo são estudadas por

meio da coloração de DAPI (4', 6' - diamidino, 2' phenylindole - 5 μM) que é um

marcador fluorescente específico para o núcleo, possibilitando a visualização do

processo mitótico45.

O Iodeto de 3,3'-dihexyloxacarbocyanine (DIOC6) é um corante fluorescente

utilizado para marcação do retículo endoplasmático, membranas de vesículas e

mitocôndrias46.

Vale ressaltar que, devido a importância da TLBP no reparo de feridas,

as células mais utilizadas são os fibroblastos e os macrófagos11. As células

fibroblásticas são as células mais importantes do tecido conjuntivo, sendo

responsáveis pela produção e manutenção da matriz extracelular. Apresentam forma

estrelada e com vários prolongamentos celulares, com grande basofilia devido ao

tamanho de seu núcleo, retículo endoplasmático granular e complexo de Golgi

desenvolvidos, indicando uma produção ativa dos componentes da matriz

extracelular42. São células não vasculares, não-epiteliais e não-inflamatórias do

tecido conjuntivo, sendo incorporadas no interior da matriz fibrilar do tecido conectivo

e, em grande parte, responsável pela sua síntese44.

Entre as funções mais importantes dos fibroblastos estão a deposição de

matriz extracelular (MEC), regulação da diferenciação epitelial, regulação da

inflamação, e envolvimento na cicatrização48. Este tipo celular realiza a síntese de

muitos componentes da matriz extracelular fibrilar, como colágeno tipo I, tipo III e

tipo V (responsáveis por formarem uma rede de fibrilas) e fibronectina, contribuindo

para a formação de membranas basais através da secreção do colágeno tipo IV e

23

laminina. Os fibroblastos são também uma fonte muito importante de proteases

degradadoras de MEC, tais como metaloproteinases de matriz (MMP), que são

importantes para a manutenção da homeostase da MEC, regulando seu volume48.

Além das fases inflamatórias e de proliferação de fibroblastos com

consequente síntese de colágeno, ocorre também a neovascularização que é um

processo de formação de novos vasos sanguíneos, sendo necessária para manter o

ambiente de cicatrização. Em todas as feridas, o suprimento sanguíneo dos

fibroblastos responsáveis pela síntese de colágeno provém de um intenso

crescimento de novos vasos, caracterizando a cicatrização em segunda intenção e o

tecido de granulação. Os novos vasos formam-se a partir de brotos endoteliais

sólidos, que migram da periferia para o centro, sobre uma malha de fibrina

depositada no leito da ferida49. Este processo é promovido pela expressão do gene

de Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF), estimulando a proliferação e

migração de células endoteliais50.

2.4 TERAPIA LASER DE BAIXA POTÊNCIA E A EXPRESSÃO GÊNICA

Nos últimos anos, estudos12,37 têm sido conduzidos a fim de compreender o

processo de cicatrização de feridas, suas complexidades e diversidades7, onde há

relatos de um grande número de proteínas desempenhando funções importantes no

processo de proliferação celular estimuladas pela TLBP, entre elas se destacam o

colágeno tipo 1 (COL1) e o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF)7, 50, 51.

Um estudo realizado por Safavi et al.52 que avaliou a expressão gênica de

mediadores na gengiva de ratos e tecidos da mucosa após a irradiação com TLBP (λ

632,8 nm) com dose de 7,5 J/cm², mostrou que a expressão dos genes IL-1β e IFN-

γ foi significativamente diminuída enquanto a expressão dos genes PDGF e TGF-β

foi significativamente aumentada, sugerindo que a TLBP diminui a quantidade de

inflamação e acelera o processo de cicatrização de feridas, alterando a expressão

dos genes responsáveis pela produção de citocinas inflamatórias.

Bosh et al.53 investigaram os efeitos da TLBP (λ 660 nm) na modulação dos

mediadores pró-inflamatórios e anti-inflamatórios em ratos com pleurisia (inflamação

das pleuras) com doses de 0,9; 2,1 e 4,2 J/cm² e observaram que houve uma

24

redução significativa do volume de exsudato induzindo um efeito inflamatório

caracterizado pela inibição total ou diferencial do influxo de leucócitos, exsudação,

proteínas totais, NO, IL-6, MCP-1, IL-10 e TNFα dose-dependente.

Chen et al. 54 irradiaram células fibroblásticas derivadas do tendão de Aquiles

de porcos com TLBP (λ 635 e 820 nm) nas doses de 1, 2 e 3 J/cm², mostrando que

houve um aumento na expressão do mRNA do gene COL1 após 24 horas de uma

única irradiação em ambos comprimentos de ondas e em todas as doses através da

indução na produção de fatores de crescimento.

Já Cury et al.51 investigaram os efeitos da TLBP (λ 660 e 780 nm) em células

de ratos com doses de 30 e 40 J/cm² na expressão dos genes VEGF, HIF1 e MMP2

que são importantes mediadores angiogênicos. Ambos comprimentos de onda foram

capazes de alterar a expressão do gene VEGF, proporcionando um aumento na

quantidade de novos vasos sanguíneos6.

Embora a bioestimulação promovida pela TLBP ainda não apresentar

parâmetros definidos, a literatura pertinente ao tema parece indicar claramente a

ocorrência de múltiplos efeitos bioestimuladores, entre eles os eventos celulares

(proliferação epitelial, endotelial e fibroblástica, elevada síntese colagênica,

diferenciação dos fibroblastos em miofibroblastos, movimentação celular dos

leucócitos, fibroblastos e células epiteliais e aumento da atividade fagocitária dos

macrófagos) e vasculares (angiogênese e vasodilatação), desempenhando

importante papel na aceleração do processo de reparo de tecidos e

consequenterelevância de seu uso na prática clínica 5,7,10,16.

25

3. OBJETIVOS

3.1 GERAL

Verificar os efeitos biológicos da Terapia Laser de Baixa Potência (λ 660 nm)

nas dosagens de 1 e 5 J/cm² em linhagem celular de fibroblastos L929.

3.2 ESPECÍFICOS

Avaliar os efeitos da Terapia Laser de Baixa Potência sobre a viabilidade

celular de células fibroblásticas L929;

Investigar a influência da Terapia Laser de Baixa Potência sobre estruturas

celulares (citoesqueleto, retículo endoplasmático e núcleo) de fibroblastos

L929;

Determinar o efeito da Terapia Laser de Baixa Potência nas dosagens 1 e 5

J/cm2 na modulação da expressão dos genes relacionados com

neovascularização (VEGF) e inflamação (IL6) em células fibroblásticas L929.

26

ARTIGO

EFEITO DA TERAPIA LASER DE BAIXA POTÊNCIA NA BIOMODULAÇÃO E

EXPRESSÃO DOS GENES VEGF E IL6 EM CÉLULAS FIBROBLÁSTICAS (L929)

(Para submissão na revista Lasers in Medical Science)

Szezerbaty SKF¹, Oliveira RF², Pires-Oliveira DAA², Pacheco-Soares C³, Poli-

Frederico RC².

¹Mestranda em Ciências da Reabilitação, Programa Associado UEL-UNOPAR, Londrina (PR).

²Doutor(a), Docente Mestrado em Ciências da Reabilitação Programa Associado UEL-UNOPAR, Londrina (PR).

³Doutora, Docente do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade Vale do Paraíba UNIVAP, São José dos Campos (SP)

Regina Célia Poli Frederico Laboratório de Biologia Molecular, Universidade Norte do Paraná (UNOPAR) Av. Paris 675, Jd Piza, CEP 86041-140. Cx. P. 401, Londrina, PR, Telefone: 43-3371-7820 Fax: 43-3371-7741 E-mail: regina.frederico@unopar.br; reginafrederico@yahoo.com.br

27

RESUMO

A Terapia Laser de Baixa Potência (TLBP) é um recurso muito utilizado na prática clínica por apresentar benefícios durante o processo de reparo em lesões. O objetivo deste estudo foi analisar os efeitos da TLBP (660 nm) nas doses de 1 e 5 J/cm² na viabilidade celular e expressão dos genes fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e interleucina (IL6) em células fibroblásticas de camundongo. As células foram cultivadas em garrafas com meio MEM e mantidas em estufa com CO2 e irradiadas a cada 24 horas, totalizando três aplicações e divididas em 3 grupos: G1- Grupo não irradiado, G2- 1 J/cm² e G3- 5 J/cm². A análise de proliferação celular foi realizada pelo método de MTT (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol)- 2,5-difeniltetrazólio]) e os efeitos da TLBP no citoesqueleto e retículo endoplasmático foram avaliados pelo uso de sondas fluorescentes e com a microscopia de fluorescência, e para a análise da expressão gênica foi realizado o método qRT-PCR, todos em triplicata. Foi observado que o grupo G3 apresentou um aumento estatisticamente significantivo na proliferação celular comparado ao G2 no tempo 48 horas (p<0,01) e quando comparado ao G1 no tempo 72 horas (p=0,03). No tempo de 72 horas foi verificado uma maior distribuição dos filamentos do citoesqueleto e retículo endolpasmático mais evidente, indicando um aumento na síntese proteíca quando comparado com o grupo controle. Na expressão do gene VEGF foi observado um aumento significativo de 1,98 vezes (p<0,05) e no gene IL6 uma diminuição dos transcritos em 4,05 vezes (p<0,05), ambos no tempo 72 horas. A TLBP (660 nm) na dose de 5 J/cm² modula tanto a proliferação celular quanto a expressão dos genes VEGF e IL6 em cultura de células fibroblásticas L929. Palavras chave: Expressão gênica. Terapia laser de baixa potência. Viabilidade celular. VEGF. IL6.

28

ABSTRACT

Laser Low Power Therapy (LLLT) is a resource widely used in clinical practice to present benefits during the repair process in injury. The aim of this study was to analyze the effects of LLLT (660 nm) at doses of 1 and 5 J / cm² on cell viability and expression of vascular endothelial growth factor gene (VEGF) and interleukin (IL-6) in mouse fibroblast cells. The cells were cultured in flasks with MEM and maintained in oven with CO2 and irradiated every 24 hours, with three applications and divided into 3 groups: Group unirradiated G1, G2 1 J / cm² and G3 5 J / cm² . Cell proliferation analysis was performed by the MTT method (bromide [3- (4,5-dimethylthiazol) - 2,5-diphenyltetrazolium bromide]) and the effects of LLLT the cytoskeleton and the endoplasmic reticulum were evaluated by the use of fluorescent probes and with fluorescence microscopy, and for the analysis of gene expression was performed qRT-PCR method, all in triplicate. It was observed that G3 group had a statistically significantivo increase in cell proliferation compared to G2 at time 48 hours (p <0.01) and compared to the G1 time 72 hours (p = 0.03). At time of 72 hours was observed a greater distribution of cytoskeletal filaments and more evident endolpasmático reticulum, indicating an increase in protein synthesis when compared with the control group. In the expression of the VEGF gene was observed a significant increase of 1.98 times (p <0.05) and IL-6 gene transcripts in a decrease of 4.05 times (p <0.05), both in time 72 hours. The LLLT (660 nm) at a dose of 5 J / cm² modulates both cell proliferation for expression of the VEGF gene and IL6 gene in cultured fibroblast L929 cells. Key words: Gene expression. Low-power laser therapy. Cell viability. VEGF. IL6.

29

INTRODUÇÃO A Terapia Laser de Baixa Potência (TLBP) tem sido um recurso muito

utilizado na prática clínica para acelerar a reparação de tecidos moles e duros,

modulando vários processos biológicos em modelos animais e em humanos[¹].

Estudos sugerem que a fotoestimulação pelo laser pode ocorrer durante as fases

inflamatórias e proliferativas da cicatrização[2-4], pelo fato de que a TLBP promove a

proliferação celular através da neovascularização e redução da quantidade de

infiltrado inflamatório.[3]

Segundo Karu et al [4], a irradiação a laser de baixa potência aumenta a

síntese de adenosina trifosfato (ATP), a síntese e consumo de O2 e eleva o potencial

de membrana mitocondrial. O efeito fotobiomodulador do laser sobre as

mitocôndrias desencadeia a ativação da produção de ATP por meio de um aumento

no processo mitótico devido à excitação de respiração celular e porfirinas

endógenas[5]. Com a elevada produção de ATP, a eficiência da bomba sódio e

potássio aumenta, mantendo com maior eficácia a diferença do potencial elétrico

existente entre o interior e exterior da célula [6]. Em nível vascular, Lins et al [7] e

Walsh et al [8] observaram que a TLBP estimula a proliferação das células

endoteliais, a produção do tecido de granulação, promovendo o relaxamento da

musculatura vascular lisa.

Frigo et al[9] realizaram um estudo in vitro com TLBP (λ 660 nm) com doses de

3 e 21 J/cm² em células fibroblásticas humanas por um período de 72 horas, onde o

grupo irradiado com 3 J/cm³ apresentou uma proliferação celular significativa e o

grupo irradiado com 21 J/cm² apresentou um nível de morte celular significativo. Já

Damante et al [10] ao irradiarem células fibroblásticas humanas (λ 660 nm) duas

vezes com um intervalo de 6 horas entre elas, com doses de 3 e 5 J/cm² observaram

um aumento significativo na produção de fator de crescimento de fibroblasto básico

(bFGF).

A TLBP é um recurso muito utilizado na prática clínica em vários tipos de

lesões por apresentar capacidade bioestimuladora do reparo tecidual, sendo um

recurso rápido, não-invasivo e efetivo [11]. Pesquisadores têm voltado suas atenções

às vias de sinalização celulares envolvidas nos efeitos biológicos da TLBP [12],

assim como, investigam os melhores parâmetros (dose, densidade de energia e

30

comprimento de onda) para sua utilização na prática clinica. Deste modo, o objetivo

deste estudo foi comparar os efeitos da TLBP sobre a viabilidade celular e a

expressão de genes envolvidos em processos de inflamação e neovascularização

no comprimento de onda de 660 nm nas doses de 1 e 5 J/cm² utilizando a linhagem

celular de fibroblastos L929.

MATERIAIS E MÉTODOS

As análises realizadas no presente estudo empregaram como material

biológico as células L929 (Mouse conjunctive tissue - ATCC CCL-1 NCTC) (Instituto

Adolfo Lutz - SP, Brasil). O estudo recebeu aprovação do Comitê de Ética da

Universidade Norte do Paraná (UNOPAR), sob o protocolo de nº 462.478/2013.

CULTURA CELULAR

As células fibroblásticas foram cultivadas em garrafas de 25 cm2 (TPP,

Switzerland, Europe) utilizando meio MEM (Minimum Essencial Medium) (GibcoTM -

Invitrogen Corporation, Grand Island, USA) suplementadas com 5% FBS (Fetal

Bovine Serum) (Cultilab, Brazil) e 1% de antibiótico e antimicótico, mantidos em uma

estufa de CO2 em atmosfera 5% a 37ºC. As células utilizadas foram subcultivadas

sempre que atingiam uma confluência de 80-100%. Células do tecido conjuntivo de

camundongo foram utilizadas neste experimento, conforme a norma ISO 10993-5

que recomenda a utilização desta linhagem de célula in vitro para testes de

citotoxicidade.

IRRADIAÇÃO A LASER

Foi utilizado o laser AlGaInP (Arseneto Gálio Índio-Fósforo) no comprimento

de onda de 660 nm e potência de saída de 35mW da marca e modelo Endophoton –

KLD, modelo LLTO 0107, devidamente calibrado pelo fabricante.

A irradiação das células foi realizada em 24, 48 e 72 horas após o

plaqueamento em placas de 12 poços com densidade de 5x105 células/mL. No

intuito de avaliar a faixa biomoduladora do laser, foram divididos 3 grupos: G1:

31

controle (não houve irradiação), G2: irradiado a 1J/cm2 e G3: irradiado a 5J/cm2. A

irradiação foi realizada em ambiente escuro com a caneta do laser em contato direto

com a tampa da placa. Cada poço foi dividido em 4 quadrantes devido a área do

poço, para que todas as células recebam a mesma dose; no G2 cada quadrante foi

irradiado por 1 segundo (no total de 4 segundos por poço). Já no G3, cada

quadrante foi irradiado por 8 segundos (no total de 32 segundos cada poço). O

experimento foi realizado em triplicata.

TESTE DE CITOTOXICIDADE CELULAR (MTT)

Os experimentos de citotoxicidade foram avaliados pelo método de MTT

Brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol)- 2,5-difeniltetrazólio]. Este método quantitativo é

utilizado para avaliar citotoxicidade, proliferação e ativação de células viáveis com

precisão [13]. As culturas de células L929 receberam irradiação laser nos intervalos

de 24, 48 e 72 horas, sendo que após 24 horas de cada irradiação foi realizado teste

de MTT de acordo com ensaio a seguir: foi retirado o meio de cultura de cada poço,

adicionado 50 l MTT e incubado por 01 hora a 37C em atmosfera de 5% de CO2.

Em seguida foi retirado o MTT e foram adicionados 50 l de DMSO (Dimetil

sulfóxido) em cada poço. As placas foram mantidas em agitação por 15 minutos

para solubilização dos cristais de formazana e sua concentração quantificada

espectroscopicamente por meio de um leitor de microplacas (Leitor ELISA –

SpectraCount – Packards Instrument, Offeburg – Alemanha), em comprimento de

onda de 546 nm.

MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA

Para acompanhar os efeitos da irradiação TLBP por meio de fluorescência, as

células L929 foram subcultivadas sobre lamínulas à densidade de 5 x 105 células/ml,

em placas de 12 poços; 24 horas após a irradiação. Todos os corantes fluorescentes

usados nos estudos fluorimêtricos foram adquiridos da Invitrogen®. As células foram

marcadas com corantes fluorescentes por incubação em meio de cultura contendo

os corantes em temperatura ambiente: Rodamina Faloidina para citoesqueleto, DAPI

– Fluoreshild para núcleo e DioC6 para o retículo endoplasmático. Para completa

32

aderência dos marcadores foi utilizado o fixador PA (Paraformaldeído). Todas as

lamínulas foram marcadas com DAPI e DioC6, porém uma parte recebeu a

marcação com Rodamina Faloidina. Sendo que apenas para as lamínulas marcadas

com Rodamina Faloidina foi necessária a utilização de um fixador especial – Triton x

100 a 0,1%. As lamínulas foram analisadas ao microscópio de fluorescência,

equipado com sistema fotográfico Leica MPS-30.

EXTRAÇÃO DE RNA E SÍNTESE DE cDNA

Para a extração do RNA total foi utilizado o PureLink® RNA Mini Kit

(Invitrogen, Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. Após sua

extração, o RNA foi quantificado em o espectrofotômetro NanoDrop Lite (Thermo

Scientific). O cDNA foi sintetizado a partir de 1 ug do RNA total extraído. O volume

final da reação foi de 20 μL, composto por 10% de tampão de reação (200 mM Tris-

HCl (pH 8.4), 500 mM KCl – Invitrogen), 1,5 mM de MgCl2 (Invitrogen), 0,5 mM de

dNTPs (Invitrogen), 80 pmol de Oligo dT12-18 (Invitrogen), 100 pmol de Random

Primers (Invitrogen), 10 unidades da enzima SuperScript III (Invitrogen) e 2 unidades

da enzima RNase Out (Invitrogen).

Para minimizar variações de desempenho da transcriptase reversa e a

possibilidade do efeito Monte Carlo, três reações distintas de síntese de cDNA foram

realizadas para cada experimento, cujos produtos foram incorporados para obtenção

de uma única mistura referente a cada amostra em sua respectiva condição de

cultivo. Os cDNAs sintetizados também foram quantificados para identificação de

possíveis variações da eficiência de reação da transcriptase reversa entre as

diferentes condições de tratamento, e também verificados quanto à sua qualidade

por espectrofotometria. A concentração final de todas as amostras foi ajustada para

50 ng/μL.

PCR EM TEMPO REAL

As reações em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real foram realizadas

em um termociclador StepOne Plus System (Applied Biosystems) nas seguintes

condições: 10 minutos a 95ºC, 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC e 60 segundos a

33

60ºC seguido pela curva de melting nas seguintes condições: 95ºC por 15 segundos,

60ºC por 60 segundos e para finalizar 95ºC por 15 segundos. A reação final de 20

μL continha 10 μL do TaqMan Universal Master Mix II (Applied Biosystems), 1 μL

do TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems), 8 μL de H2O ultra pura

e 1 μL do cDNA.

Para determinação da expressão relativa dos genes de interesse nas

diferentes condições avaliadas foi utilizado o programa REST – versão 2009

(Relative expression software tool) (QIAGEN), desenvolvido por Pfaffl et al. (2002)

baseado em seu próprio modelo matemático de quantificação relativa de dados

obtidos por PCR em tempo real, com correção de eficiência. Os valores obtidos na

situação controle (ausência de tratamento) foram utilizados como referência para

comparação, e os cálculos foram normalizados a partir do gene de referência β-

Actina. Foram considerados apenas valores de Cq (quantification cycle) com uma

variação de ± 0,5 entre as triplicatas de reação.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados foram expressos em valores de média e desvio padrão, com

avaliação da normalidade verificada pelo teste de Shapiro-Wilk. Para comparação e

verificação das diferenças estatisticamente significantes entre os grupos, utilizou-se

a Análise de Variância (ANOVA) e o teste post hoc de Tukey HSD e, para a

comparação entre as avaliações, ANOVA de Medidas Repetidas. Para análise da

expressão gênica, os dados foram expressos segundo o método Pfaffl13 e

calculados com auxílio do Software Reset 200914, considerando valores de desvio

padrão para o teste estatístico "Pair wise fixed reallocation". Foram considerados

diferencialmente expressos quando comparados à situação controle os genes cuja

alteração foi significativamente diferente considerando o valor de p≤0,001 ou

alterações maiores que 1,5 vezes considerando valor de p<0,05. O intervalo de

confiança adotado foi de 95% e valores de p < 0,05 foram considerados

estatisticamente significativos. Na análise estatística utilizou-se o programa

GraphPadPrism 6.0(GraphPad Software, San Diego, CA, EUA)

34

RESULTADOS

A análise comparativa dos valores de células viáveis pelo teste MTT nos

grupos G1 (Controle), G2 (1 J/cm²) e G3 (5 J/cm²) em relação ao tempo de

irradiação (24, 48 e 72 horas) não apresentou diferença estatística (p = 0.16) como

demonstrado na Tabela 01. Entretanto foi observada uma diferença estatisticamente

significativa no tempo 48 horas quando comparado o G2 (1J/cm²) versus G3 (5

J/cm²) (p=<0.01) e no tempo 72 horas quando comparado o G1 e G3 (p=0.03) (Fig.

01). No tempo 24 horas, não foi observado diferença estatisticamente significativa

(p>0,05). (Tabela 02)

Na análise da marcação de citoesqueleto (Rodamina-Faloidina) e retículo

endoplasmático (DioC6) foi observado no tempo 24 horas no Grupo Controle (Fig. 2A

seta) uma maior distribuição do retículo endoplasmático por todo o citoplasma. Já

no grupo irradiado a 5 J/cm², o retículo endoplasmático (Fig. 2B seta) mostrou um

crescimento e uma maior distribuição citoplasmática do citoesqueleto (Fig. 2B

asterisco) demonstrando um discreto efeito biomodulatório quando comparado com

o Grupo Controle. No tempo 48 horas, foi observado no grupo irradiado a 5 J/cm²

que o retículo endoplasmático (Fig. 2C seta) e o citoesqueleto (Fig. 2C asterisco)

continuaram apresentando um discreto aumento em suas atividades. No tempo 72

horas foi constatado um aumento significativo no número destas vesículas,

indicando um aumento na síntese proteíca (Fig. 2D seta) e uma atividade mais

evidente do citoesqueleto (Fig. 2D asterisco) quando comparado com o Grupo

Controle (Fig. 2A asterisco).

Já na análise da expressão gênica foi possível identificar uma diferença

estatisticamente significativa na expressão dos genes estudados entre os grupos

Controle, 1 e 5 J/cm². As células irradiadas apresentaram um aumento de 1,98

vezes nos transcritos do gene VEGF e diminuição de 4,05 vezes nos transcritos do

gene IL-6 na dose de 5 J/cm² no tempo de 72 horas quando comparados com o

Grupo Controle (G1).

35

DISCUSSÃO

A TLBP é utilizada para acelerar os processos reparativos dos tecidos devido

aos efeitos biomoduladores através de pelo menos dois parâmetros: dose e

comprimento de onda¹, e que as múltiplas combinações destes parâmetros dificulta

sua padronização à serem utilizados na prática clínica[2,14], assim o objetivo deste

estudo foi identificar entre as doses estudadas, qual seria a mais adequada no

aumento da proliferação celular, favorecendo então o processo de reparo tecidual,

verificar o efeito da TLBP sobre as estruturas celulares e a modulação dos genes

relacionados com a neovascularização e inflamação.

Nossos resultados mostraram um aumento significativo na proliferação celular

no grupo irradiado com TLBP (λ 660 nm) na dose de 5 J/cm² no tempo 72 horas.

Eduardo et al [15] encontraram resultados semelhantes ao realizaram um estudo in

vitro irradiando células-tronco humanas (λ 660 nm) com doses de 1, 3 e 5 J/cm² por

um período de 72 horas e observaram um aumento na atividade mitocondrial nas

doses de 3 e 5 J/cm² no tempo 48 horas, porém no tempo 72 horas, o grupo

irradiado à 5 J/cm² apresentou um aumento significativo desta atividade.

Kim et al [16] investigaram a proliferação celular com fibroblastos em linhagens

L929 e HGF-1 submetidas a TLBP em 660 nm com doses de 2,5; 5,5 e 8,5 J/cm²,

expondo-as por um período de 5, 10 e 15 minutos. Após 24 horas de irradiação

houve um aumento significativo na proliferação celular nos dois grupos irradiados,

sendo que nas células HGF-1 a melhor dose foi 2,55 J/cm² e para as células L929 a

melhor dose foi 6,6 J/cm².

Marques et al. [17] irradiaram células fibroblásticas L929 (λ 660 nm) com doses

de 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 20, e 30 J / cm² por um período de 24 horas e

mostraram que entre as doses de 0,1 e 3 J/cm² houve efeito inibitório e acima de 5

J/cm² um efeito estimulatório das células, onde o efeito inibitório foi evidenciado pela

diminuição da densidade de células intactas e o efeito estimulatório se deu devido a

um intenso agrupamento de mitocôndrias na região perinuclear.

Segundo Zanotti et al. [18], as doses excitatórias (até 8 J/cm²) são indicadas

quando o objetivo da intervenção for potencialização da bomba sódio/potássio,

estimular a produção de ATP, reestabelecer o potencial de membrana e aumentar o

metabolismo e proliferação celular. Já as doses mais altas (acima de 8 J/cm²)

36

provocam o efeito inverso, inibindo a produção de colágeno[19]. Já Rocha Júnior et

al. [20] afirmam que a TLBP evidencia um aumento na neovascularização e

proliferação fibroblástica e uma redução da quantidade de infiltrado inflamatório nas

lesões cirúrgicas.

Para melhor entendimento dos efeitos da irradiação do laser sobre as

estruturas celulares, a microscopia de fluorescência foi empregada para investigar o

citoesqueleto celular e o retículo endoplasmático, sendo essas estruturas

importantes para o processo de proliferação celular. No tempo de 72 horas foi

constatado uma maior distribuição dos filamentos do citoesqu veleto e retículo

endoplasplático mais evidente, indicando um aumento na síntese proteíca quando

comparado com o grupo controle. Aumento na proliferação e metabolismo celular

também foi relatado por Carnevalli et al. [21]

No presente estudo também foi observado um aumento na expressão de

transcritos do gene VEGF na dose 5 J/cm² no tempo 72 horas. Pesquisas realizadas

por Cury et al. [22] com TLBP (λ 660 e 780 nm) em ratos com doses de 30 e 40

J/cm², demonstraram um aumento significativo na expressão do gene VEGF após 4

dias de irradiação em todos os grupos avaliados e em ambos os comprimentos de

onda usados, independentemente das densidades de energia.

Chiarotto et al. [23] encontraram resultados semelhantes ao irradiarem lesões

dos ratos com laser λ 660 com doses de 4,48 e 4,93 J/cm², constatando que o laser

influênciou significativa na expressão do gene VEGF, na angiogênese e proliferaão

de novas células fibroblásticas quando comparado com o grupo com o grupo não

irradiado, não encontrando também diferença significativa entre os grupos tratados.

Nossos resultados demonstram uma inibição na expressão do gene IL6 na

dose de 5 J/cm² no tempo de 72 horas. Esses dados estão de acordo com os

achados de Houreld e Abrahamse [24] que ao utilizarem o laser em λ 660 nm e com

dose de 5 J/cm², encontraram uma inibição significativa na expressão da IL-6 em

fibroblastos de pele humana (WS1) quando comparado com o grupo controle.

Após induzirem um processo inflamatório com injeção de carragenina em

ratos, Albertini et al. [25] irradiaram o tecido com TLBP (λ 660 e 684 nm) na dose de

7,5 J/cm², onde ambos os grupos apresentaram uma expressão diminuída em 30 a

40% dos genes TNFα, IL1β e IL6 3 horas após a irradiação quando comparados

com o grupo controle. Resultados semelhantes ao de Boshi et al. [26] que após

37

injeção de carragenina e irradiação com laser (λ 660 nm) 1, 2 e 3 horas com doses

de 0,9, 2,1, e 4,2 J/cm², os grupos foram avaliados 4 horas após a ultima irradiação

onde foi observado que os genes TNFα, IL6, MCP1 e IL10 tiveram sua expressão

diminuída nas doses 0,9 e 4,2 J/cm², porém com maior significância na dose 2,1

J/cm².

O gene VEGF é uma chave reguladora da remodelação de vasos sanguineos

em processos fisiológicos e patológicos, e a irradiação com TLBP ativa a quinase

regulada por sinal extracelular/proteína específica 1 (ERK/Sp1) induzindo sua

expressão e a proliferação de células endoteliais vasculares [28].

Apesar de a bioestimulação promovida pela TLBP ainda não apresentar

eficácia comprovada em comprimentos de onda específicos, estudos e experimentos

realizados mostram a ocorrência de seus múltiplos efeitos positivos como acelerar a

proliferação tecidual, estímulo à neovascularização local, formação de um tecido de

granulação mais organizado [7,21] e na indução de um efeito anti-inflamatório [25,26],

corroborando com os resultados do presente estudo fornece evidências de que a

expressão de RNAm dos genes IL6 e VEGF foi modulada pela laserterapia de baixa

potência (λ 660 nm da dose de 5 J/cm²). Os resultados do presente estudo sugerem

que a TLBP pode ser uma terapia alternativa que inibe o processo inflamatório e

estimula a formação de novos vasos sanguíneos.

CONCLUSÃO

O presente estudo concluiu que a TLBP no comprimento de onda de 660 nm

apresentou um efeito bioestimulatório no tempo 72 horas utilizando a dose de

5J/cm², onde se verificou um aumento da atividade reticular, melhor organização e

distribuição do citoesqueletono citoplasma e maior descondensação da cromatina.

Adicionalmente, estes parâmetros mostram-se mais eficazes no aumento da

expressão do gene Fator de Crescimento Endotelial (VEGF) e diminuição dos

transcritos do gene Interleucina 6 (IL6). Estes efeitos estão relacionados com as

primeiras fases do reparo tecidual, confirmando o efeito fotobiomodulador e assim

indicando sua relevância clínica para o tratamento de lesões teciduais.

38

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41

Tabela 01 - Análise comparativa de tempo e dose nas amostras irradiadas com laser.

Intensidade 24 h 48 h 72 h

G1 (Controle) 107.0± 0.0 108.0 ± 1.0 106.0 ± 1.0

G2 (1 J/cm²) 107.0± 3.4 99.3 ± 7.2 111.3 ± 13.0

G3 (5 J/cm²) 114.3± 5.5 122.3 ± 6.71 125.3 ± 7.1

Valores apresentados em média e desvio-padrão (±).

Tabela 02 - Análise comparativa entre os grupos nos tempo avaliados.

Tempo (h) G1 vs. G2 G1 vs.G3 G2 vs. G3

24 1.00 0.87 0.87

48 0.75 0.19 <0.01*

72 0.97 0.03* 0.21

G1 (Controle); G2 (1 J/cm²); G3 (5 J/cm²). Valores representam o nível de significância da Anova de dois fatores, pós-teste de Tukey. * Diferença estatisticamente significativa.

Figura 01 - Comparação da proliferação celular entre os grupos nos momentos avaliados.

*p=<0,01 (48 horas - 1 vs 5 J/cm²) e *p=0,03 (72 horas - Controle vs. 5 J/cm²)

42

Figura 02 - Análise da marcação da fluorescência com Rodamina-Faloidina (Citoesqueleto - asterisco) e DioC6 (Retículo Endoplasmático - seta) nos tempo avaliados (A- Grupo não irradiado; B- Grupo 5 J/cm² 24 horas; C- Grupo 5 J/cm² 48 horas e D Grupo 5 J/cm² 72 horas).

43

CONCLUSÃO GERAL

Com a realização deste estudo, podemos concluir que:

A TLBP apresentou um efeito bioestimulatório na cultura celular de

fibroblastos nas doses de 1 e 5 J/cm² dos tempos 48 e 72 horas quando

comparados com o grupo não irradiado, sendo maior na dose de 5 J/cm²;

As estruturas celulares observadas (retículo endoplasmático, citoesqueleto e

núcleo) apresentaram uma maior atividade na dose de 5 J/cm² do tempo 72

horas com aumento do número de vesículas, aumento da atividade do

citoesqueleto e maior condensação de cromatina, respectivamente;

Aumento na quantidade de transcritos do gene VEGF de 1,98 vezes e

diminuição na quantidade de transcritos do gene IL6 de 4,05 vezes na dose

de 5 J/cm² no tempo de 72 horas.

44

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sciatic nerve regeneration after vascular endothelial growth factor (VEGF) gene therapy. Neuropathol Appl Neurobiol. 2011; 37(6):600-12.

51. Cury V, Moretti AIS, Assis L, Bossini P, Crusca JS, Benatti Neto C, Fangel R, Souza HP, Hamblin MR, Parizotto NA. Low level laser therapy increases angiogenesis in a model of ischemic skin flap in rats mediated by VEGF, HIF-1a and MMP-2 . J Photochem Photobiol B. 2013;125:164-70. 52. Safavi SM, Kazemi B, Esmaeili M, Fallah A, Modarresi A, Mir M. Effects of low-level He–Ne laser irradiation on the gene expression of IL-1β, TNF-α, IFN-γ, TGF-β, bFGF, and PDGF in rat’s gingival. Lasers Med. Sci. 2007;23:331-5.

53. Boschi ES, Leite CE, Saciura VC, Caberlon E, Lunardelli A, Bitencourt S, et al. Anti-Inflammatory Effects of Low-Level Laser Therapy (660 nm) in the Early Phase in Carrageenan-Induced Pleurisy in Rat. Lasers Surg Med. 2008; 40:500-8.

54. Chen CH, Wang YH, Lee CL, Chen JK, Huang MH. Low-Level Laser Irradiation Promotes Cell Proliferation and mRNA Expression of Type I Collagen and Decorin in Porcine Achilles Tendon Fibroblasts In Vitro. J Orthop Res. 2009; 27(5):646-50.

49

ANEXOS

50

ANEXO A

Normas para submissão na revista Laser in Medical Science

51

Medicine

Medicine | Lasers in Medical Science – incl. option to publish open access

Home > Medicine

SUBDISCIPLINES JOURNALS BOOKS SERIES TEXTBOOKS REFERENCE W ORKS

Lasers in Medical Science

Editor-in-Chief: Keyvan Nouri

ISSN: 0268-8921 (print version)

ISSN: 1435-604X (electronic version)

Journal no. 10103

76,25 € Personal Rate e-only

52

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Immediate Content Access via SpringerLink

1 Volumes with 9 issues per year

Subscription will auto-renew for another year unless duly terminated

FAQ & Policy

ABOUT THIS JOURNAL EDITORIAL BOARD NEWS AND SOCIETIES ETHICS & DISCLOSURES

INSTRUCTIONS FOR AUTHORS

Instructions for Authors

TYPES OF PAPERS

Original Article – limited to 4000 words, 45 references, no more than 5 figures

Review Article – limited to 5000 words, 50 references, no more than 5 figures

Brief Report - limited to 2000 words, 25 references, no more than 4 figures - Case Reports

will not be accepted!

Letter to the Editor – up to 600 words

MANUSCRIPT SUBMISSION

Manuscript Submission

Submission of a manuscript implies: that the work described has not been published before; that

it is not under consideration for publication anywhere else; that its publication has been

approved by all co-authors, if any, as well as by the responsible authorities – tacitly or explicitly –

at the institute where the work has been carried out. The publisher will not be held legally

responsible should there be any claims for compensation.

elsewhere are required to obtain permission from the copyright owner(s) for both the print and

online format and to include evidence that such permission has been granted when submitting

their papers. Any material received without such evidence will be assumed to originate from the

authors.

Online Submission

Please follow the hyperlink “Submit online” on the right and upload all of your manuscript files

following the instructions given on the screen.

TITLE PAGE

Title Page

The title page should include:

The name(s) of the author(s)

A concise and informative title

The affiliation(s) and address(es) of the author(s)

The e-mail address, telephone and fax numbers of the corresponding author

Abstract

Please provide an abstract of 150 to 250 words. The abstract should not contain any undefined

abbreviations or unspecified references.

53

Keywords

Please provide 4 to 6 keywords which can be used for indexing purposes.

TEXT

Text Formatting

Manuscripts should be submitted in Word.

Use a normal, plain font (e.g., 10-point Times Roman) for text.

Use italics for emphasis.

Use the automatic page numbering function to number the pages.

Do not use field functions.

Use tab stops or other commands for indents, not the space bar.

Use the table function, not spreadsheets, to make tables.

Use the equation editor or MathType for equations.

Save your file in docx format (Word 2007 or higher) or doc format (older Word

versions).

Manuscripts with mathematical content can also be submitted in LaTeX.

LaTeX macro package (zip, 182 kB)

Headings

Please use no more than three levels of displayed headings.

Abbreviations

Abbreviations should be defined at first mention and used consistently thereafter.

Footnotes

Footnotes can be used to give additional information, which may include the citation of a

54

and they should never include the bibliographic details of a reference. They should also not

contain any figures or tables.

Footnotes to the text are numbered consecutively; those to tables should be indicated by

superscript lower-case letters (or asterisks for significance values and other statistical data).

Footnotes to the title or the authors of the article are not given reference symbols.

Always use footnotes instead of endnotes.

Acknowledgments

Acknowledgments of people, grants, funds, etc. should be placed in a separate section on the

title page. The names of funding organizations should be written in full.

SCIENTIFIC STYLE

Generic names of drugs and pesticides are preferred; if trade names are used, the generic name

should be given at first mention.

Units and abbreviations

Please adhere to internationally agreed standards such as those adopted by the

commission of the International Union of Pure and Applied Physics (IUPAP) or

defined by the International Organization of Standardization (ISO). Metric SI units

should be used throughout except where non-SI units are more common [e.g. litre (l)

for volume].

Abbreviations (not standardized) should be defined at first mention in the abstract

and again in the main body of the text and used consistently thereafter.

Drugs

When drugs are mentioned, the international (generic) name should be used. The

proprietary name, chemical composition, and manufacturer should be stated in full in

Materials and methods.

REFERENCES

Citation

Reference citations in the text should be identified by numbers in square brackets. Some

examples:

1. Negotiation research spans many disciplines [3].

2. This result was later contradicted by Becker and Seligman [5].

3. This effect has been widely studied [1-3, 7].

Reference list

The list of references should only include works that are cited in the text and that have been

published or accepted for publication. Personal communications and unpublished works should

only be mentioned in the text. Do not use footnotes or endnotes as a substitute for a reference

list.

The entries in the list should be numbered consecutively.

Journal article

Gamelin FX, Baquet G, Berthoin S, Thevenet D, Nourry C, Nottin S, Bosquet L

(2009) Effect of high intensity intermittent training on heart rate variability in

prepubescent children. Eur J Appl Physiol 105:731-738. doi:

10.1007/s00421-008-0955-8

Ideally, the names of all authors should be provided, but the usage of “et al” in long

author lists will also be accepted:

Smith J, Jones M Jr, Houghton L et al (1999) Future of health insurance. N Engl J

55

Med 965:325–329

Article by DOI

Slifka MK, Whitton JL (2000) Clinical implications of dysregulated cytokine

production. J Mol Med. doi:10.1007/s001090000086

Book

South J, Blass B (2001) The future of modern genomics. Blackwell, London

Book chapter

Brown B, Aaron M (2001) The politics of nature. In: Smith J (ed) The rise of modern

genomics, 3rd edn. Wiley, New York, pp 230-257

Online document

Cartwright J (2007) Big stars have weather too. IOP Publishing PhysicsWeb.

http://physicsweb.org/articles/news/11/6/16/1. Accessed 26 June 2007

Dissertation

Trent JW (1975) Experimental acute renal failure. Dissertation, University of

California

Always use the standard abbreviation of a journal’s name according to the ISSN List of Title

Word Abbreviations, see

ISSN.org LTWA

If you are unsure, please use the full journal title.

For authors using EndNote, Springer provides an output style that supports the formatting of

in-text citations and reference list.

EndNote style (zip, 2 kB)

Authors preparing their manuscript in LaTeX can use the bibtex file spbasic.bst which is included

in Springer’s LaTeX macro package.

TABLES

All tables are to be numbered using Arabic numerals.

Tables should always be cited in text in consecutive numerical order.

For each table, please supply a table caption (title) explaining the components of the

table.

Identify any previously published material by giving the original source in the form of

a reference at the end of the table caption.

Footnotes to tables should be indicated by superscript lower-case letters (or

asterisks for significance values and other statistical data) and included beneath the

table body.

ARTW ORK AND ILLUSTRATIONS GUIDELINES

Electronic Figure Submission

Supply all figures electronically.

Indicate what graphics program was used to create the artwork.

For vector graphics, the preferred format is EPS; for halftones, please use TIFF

format. MSOffice files are also acceptable.

Vector graphics containing fonts must have the fonts embedded in the files.

Name your figure files with "Fig" and the figure number, e.g., Fig1.eps.

56

Line Art

Definition: Black and white graphic with no shading.

Do not use faint lines and/or lettering and check that all lines and lettering within the

figures are legible at final size.

All lines should be at least 0.1 mm (0.3 pt) wide.

Scanned line drawings and line drawings in bitmap format should have a minimum

resolution of 1200 dpi.

Vector graphics containing fonts must have the fonts embedded in the files.

Halftone Art

Definition: Photographs, drawings, or paintings with fine shading,

etc.

If any magnification is used in the photographs, indicate this by using

scale bars within the figures themselves.

Halftones should have a minimum resolution of 300 dpi.

Combination Art

57

Definition: a combination of halftone and line art, e.g., halftones containing line

drawing, extensive lettering, color diagrams, etc.

Combination artwork should have a minimum resolution of 600 dpi.

Color Art

Color art is free of charge for online publication.

If black and white will be shown in the print version, make sure that the main

information will still be visible. Many colors are not distinguishable from one another

when converted to black and white. A simple way to check this is to make a

xerographic copy to see if the necessary distinctions between the different colors are

still apparent.

If the figures will be printed in black and white, do not refer to color in the captions.

Color illustrations should be submitted as RGB (8 bits per channel).

Figure Lettering

To add lettering, it is best to use Helvetica or Arial (sans serif fonts).

Keep lettering consistently sized throughout your final-sized artwork, usually about

2–3 mm (8–12 pt).

Variance of type size within an illustration should be minimal, e.g., do not use 8-pt

type on an axis and 20-pt type for the axis label.

Avoid effects such as shading, outline letters, etc.

Do not include titles or captions within your illustrations.

Figure Numbering

All figures are to be numbered using Arabic numerals.

Figures should always be cited in text in consecutive numerical order.

Figure parts should be denoted by lowercase letters (a, b, c, etc.).

If an appendix appears in your article and it contains one or more figures, continue

the consecutive numbering of the main text. Do not number the appendix figures,

"A1, A2, A3, etc." Figures in online appendices (Electronic Supplementary Material)

should, however, be numbered separately.

58

Each figure should have a concise caption describing accurately what the figure

depicts. Include the captions in the text file of the manuscript, not in the figure file.

Figure captions begin with the term Fig. in bold type, followed by the figure number,

also in bold type.

No punctuation is to be included after the number, nor is any punctuation to be

placed at the end of the caption.

Identify all elements found in the figure in the figure caption; and use boxes, circles,

etc., as coordinate points in graphs.

Identify previously published material by giving the original source in the form of a

reference citation at the end of the figure caption.

Figure Placement and Size

Figures should be submitted separately from the text, if possible.

When preparing your figures, size figures to fit in the column width.

For most journals the figures should be 39 mm, 84 mm, 129 mm, or 174 mm wide and

not higher than 234 mm.

For books and book-sized journals, the figures should be 80 mm or 122 mm wide and

not higher than 198 mm.

Permissions

If you include figures that have already been published elsewhere, you must obtain permission

from the copyright owner(s) for both the print and online format. Please be aware that some

publishers do not grant electronic rights for free and that Springer will not be able to refund any

costs that may have occurred to receive these permissions. In such cases, material from other

sources should be used.

Accessibility

In order to give people of all abilities and disabilities access to the content of your figures, please

make sure that

All figures have descriptive captions (blind users could then use a text-to-speech

software or a text-to-Braille hardware)

Patterns are used instead of or in addition to colors for conveying information

(colorblind users would then be able to distinguish the visual elements)

Any figure lettering has a contrast ratio of at least 4.5:1

ELECTRONIC SUPPLEMENTARY MATERIAL

Springer accepts electronic multimedia files (animations, movies, audio, etc.) and other

supplementary files to be published online along with an article or a book chapter. T his feature

can add dimension to the author's article, as certain information cannot be printed or is more

convenient in electronic form.

Submission

Supply all supplementary material in standard file formats.

Please include in each file the following information: article title, journal name, author

names; affiliation and e-mail address of the corresponding author.

To accommodate user downloads, please keep in mind that larger-sized files may

require very long download times and that some users may experience other

problems during downloading.

Audio, Video, and Animations

Resolution: 16:9 or 4:3

59

Minimum video duration: 1 sec

Supported file formats: avi, wmv, mp4, mov, m2p, mp2, mpg, mpeg, flv, mxf, mts, m4v,

3gp

Text and Presentations

Submit your material in PDF format; .doc or .ppt files are not suitable for long-term

viability.

A collection of figures may also be combined in a PDF file.

Spreadsheets

Spreadsheets should be converted to PDF if no interaction with the data is intended.

If the readers should be encouraged to make their own calculations, spreadsheets

should be submitted as .xls files (MS Excel).

Specialized Formats

Specialized format such as .pdb (chemical), .wrl (VRML), .nb (Mathematica

notebook), and .tex can also be supplied.

Collecting Multiple Files

It is possible to collect multiple files in a .zip or .gz file.

Numbering

If supplying any supplementary material, the text must make specific mention of the

material as a citation, similar to that of figures and tables.

Refer to the supplementary files as “Online Resource”, e.g., "... as shown in the

animation (Online Resource 3)", “ ... additional data are given in Online Resource 4” .

Name the files consecutively, e.g. “ ESM_3.mpg” , “ ESM_4.pdf” .

Captions

For each supplementary material, please supply a concise caption describing the

content of the file.

Processing of supplementary files

Electronic supplementary material will be published as received from the author

without any conversion, editing, or reformatting.

Accessibility

In order to give people of all abilities and disabilities access to the content of your supplementary

files, please make sure that

The manuscript contains a descriptive caption for each supplementary material

Video files do not contain anything that flashes more than three times per second (so

that users prone to seizures caused by such effects are not put at risk)

INTEGRITY OF RESEARCH AND REPORTING

Ethical standards

Manuscripts submitted for publication must contain a statement to the effect that all human and

animal studies have been approved by the appropriate ethics committee and have therefore

been performed in accordance with the ethical standards laid down in the 1964 Declaration of

Helsinki and its later amendments.

60

their inclusion in the study. Details that might disclose the identity of the subjects under study

should be omitted.

These statements should be added in a separate section before the reference list. If these

statements are not applicable, authors should state: The manuscript does not contain clinical

studies or patient data.

The editors reserve the right to reject manuscripts that do not comply with the above-mentioned

requirements. The author will be held responsible for false statements or failure to fulfill the

above-mentioned requirements

Conflict of interest

All benefits in any form from a commercial party related directly or indirectly to the subject of this

manuscript or any of the authors must be acknowledged. For each source of funds, both the

research funder and the grant number should be given. This note should be added in a separate

section before the reference list.

If no conflict exists, authors should state: The authors declare that they have no conflict of

interest.

ETHICAL RESPONSIBILITIES OF AUTHORS

This journal is committed to upholding the integrity of the scientific record. As a member of the

Committee on Publication Ethics (COPE) the journal will follow the COPE guidelines on how to

deal with potential acts of misconduct.

Authors should refrain from misrepresenting research results which could damage the trust in

the journal, the professionalism of scientific authorship, and ultimately the entire scientific

endeavour. Maintaining integrity of the research and its presentation can be achieved by

following the rules of good scientific practice, which include:

The manuscript has not been submitted to more than one journal for simultaneous

consideration.

The manuscript has not been published previously (partly or in full), unless the new

work concerns an expansion of previous work (please provide transparency on the

re-use of material to avoid the hint of text-recycling (“self-plagiarism”)).

A single study is not split up into several parts to increase the quantity of

submissions and submitted to various journals or to one journal over time (e.g.

“ salami-publishing” ).

No data have been fabricated or manipulated (including images) to support your

conclusions

No data, text, or theories by others are presented as if they were the author’s own

(“plagiarism” ). Proper acknowledgements to other works must be given (this includes

material that is closely copied (near verbatim), summarized and/or paraphrased),

quotation marks are used for verbatim copying of material, and permissions are

secured for material that is copyrighted.

Important note: the journal may use software to screen for plagiarism.

Consent to submit has been received explicitly from all co-authors, as well as from

the responsible authorities - tacitly or explicitly - at the institute/organization where

the work has been carried out, before the work is submitted.

Authors whose names appear on the submission have contributed sufficiently to the

scientific work and therefore share collective responsibility and accountability for the

results.

In addition:

Changes of authorship or in the order of authors are not accepted after acceptance

of a manuscript.

61

publication is a serious matter and may be considered when justifiably warranted.

Justification for changes in authorship must be compelling and may be considered

only after receipt of written approval from all authors and a convincing, detailed

explanation about the role/deletion of the new/deleted author. In case of changes at

revision stage, a letter must accompany the revised manuscript. In case of changes

after acceptance or publication, the request and documentation must be sent via the

Publisher to the Editor-in-Chief. In all cases, further documentation may be required

to support your request. The decision on accepting the change rests with the Editor-

in-Chief of the journal and may be turned down. Therefore authors are strongly

advised to ensure the correct author group, corresponding author, and order of

authors at submission.

Upon request authors should be prepared to send relevant documentation or data in

order to verify the validity of the results. This could be in the form of raw data,

samples, records, etc.

If there is a suspicion of misconduct, the journal will carry out an investigation following the

COPE guidelines. If, after investigation, the allegation seems to raise valid concerns, the

accused author will be contacted and given an opportunity to address the issue. If misconduct

has been established beyond reasonable doubt, this may result in the Editor-in-Chief’s

implementation of the following measures, including, but not limited to:

If the article is still under consideration, it may be rejected and returned to the author.

If the article has already been published online, depending on the nature and

severity of the infraction, either an erratum will be placed with the article or in severe

cases complete retraction of the article will occur. The reason must be given in the

published erratum or retraction note.

The author’s institution may be informed.

COMPLIANCE WITH ETHICAL STANDARDS

To ensure objectivity and transparency in research and to ensure that accepted principles of

ethical and professional conduct have been followed, authors should include information

regarding sources of funding, potential conflicts of interest (financial or non-financial), informed

consent if the research involved human participants, and a statement on welfare of animals if the

research involved animals.

Authors should include the following statements (if applicable) in a separate section entitled

“ Compliance with Ethical Standards” when submitting a paper:

Disclosure of potential conflicts of interest

Research involving Human Participants and/or Animals

Informed consent

Please note that standards could vary slightly per journal dependent on their peer review

policies (i.e. single or double blind peer review) as well as per journal subject discipline. Before

submitting your article check the instructions following this section carefully.

The corresponding author should be prepared to collect documentation of compliance with

ethical standards and send if requested during peer review or after publication.

The Editors reserve the right to reject manuscripts that do not comply with the above-mentioned

guidelines. The author will be held responsible for false statements or failure to fulfill the above-

mentioned guidelines.

DISCLOSURE OF POTENTIAL CONFLICTS OF INTEREST

Authors must disclose all relationships or interests that could have direct or potential influence or

impart bias on the work. Although an author may not feel there is any conflict, disclosure of

relationships and interests provides a more complete and transparent process, leading to an

accurate and objective assessment of the work. Awareness of a real or perceived conflicts of

interest is a perspective to which the readers are entitled. This is not meant to imply that a

62

financial relationship with an organization that sponsored the research or compensation received

for consultancy work is inappropriate. Examples of potential conflicts of interests that are

directly or indirectly related to the research may include but are not limited to the following:

Research grants from funding agencies (please give the research funder and the

grant number)

Honoraria for speaking at symposia

Financial support for attending symposia

Financial support for educational programs

Employment or consultation

Support from a project sponsor

Position on advisory board or board of directors or other type of management

relationships

Multiple affiliations

Financial relationships, for example equity ownership or investment interest

Intellectual property rights (e.g. patents, copyrights and royalties from such rights)

Holdings of spouse and/or children that may have financial interest in the work

In addition, interests that go beyond financial interests and compensation (non-financial

interests) that may be important to readers should be disclosed. These may include but are not

limited to personal relationships or competing interests directly or indirectly tied to this research,

or professional interests or personal beliefs that may influence your research.

The corresponding author collects the conflict of interest disclosure forms from all authors. In

author collaborations where formal agreements for representation allow it, it is sufficient for the

corresponding author to sign the disclosure form on behalf of all authors. Examples of forms can

be found

here:

The corresponding author will include a summary statement in the text of the manuscript in a

separate section before the reference list, that reflects what is recorded in the potential conflict

of interest disclosure form(s).

See below examples of disclosures:

Funding: This study was funded by X (grant number X).

Conflict of Interest: Author A has received research grants from Company A. Author B has

received a speaker honorarium from Company X and owns stock in Company Y. Author C is a

member of committee Z.

If no conflict exists, the authors should state:

Conflict of Interest: The authors declare that they have no conflict of interest.

RESEARCH INVOLVING HUMAN PARTICIPANTS AND/OR ANIMALS

1) Statement of human rights

When reporting studies that involve human participants, authors should include a statement that

the studies have been approved by the appropriate institutional and/or national research ethics

committee and have been performed in accordance with the ethical standards as laid down in

the 1964 Declaration of Helsinki and its later amendments or comparable ethical standards.

If doubt exists whether the research was conducted in accordance with the 1964 Helsinki

Declaration or comparable standards, the authors must explain the reasons for their approach,

and demonstrate that the independent ethics committee or institutional review board explicitly

approved the doubtful aspects of the study.

The following statements should be included in the text before the References section:

63

Ethical approval: “ All procedures performed in studies involving human participants were in

accordance with the ethical standards of the institutional and/or national research committee and

with the 1964 Helsinki declaration and its later amendments or comparable ethical standards.”

For retrospective studies, please add the following sentence:

“ For this type of study formal consent is not required.”

2) Statement on the welfare of animals

The welfare of animals used for research must be respected. When reporting experiments on

animals, authors should indicate whether the international, national, and/or institutional

guidelines for the care and use of animals have been followed, and that the studies have been

approved by a research ethics committee at the institution or practice at which the studies were

conducted (where such a committee exists).

For studies with animals, the following statement should be included in the text before the

References section:

Ethical approval: “ All applicable international, national, and/or institutional guidelines for the

care and use of animals were followed.”

If applicable (where such a committee exists): “All procedures performed in studies involving

animals were in accordance with the ethical standards of the institution or practice at which the

studies were conducted.”

If articles do not contain studies with human participants or animals by any of the authors,

please select one of the following statements:

“ This article does not contain any studies with human participants performed by any of the

authors.”

“ This article does not contain any studies with animals performed by any of the authors.”

“ This article does not contain any studies with human participants or animals performed by any

of the authors.”

INFORMED CONSENT

All individuals have individual rights that are not to be infringed. Individual participants in studies

have, for example, the right to decide what happens to the (identifiable) personal data gathered,

to what they have said during a study or an interview, as well as to any photograph that was

taken. Hence it is important that all participants gave their informed consent in writing prior to

inclusion in the study. Identifying details (names, dates of birth, identity numbers and other

information) of the participants that were studied should not be published in written descriptions,

photographs, and genetic profiles unless the information is essential for scientific purposes and

the participant (or parent or guardian if the participant is incapable) gave written informed

consent for publication. Complete anonymity is difficult to achieve in some cases, and informed

consent should be obtained if there is any doubt. For example, masking the eye region in

photographs of participants is inadequate protection of anonymity. If identifying characteristics

are altered to protect anonymity, such as in genetic profiles, authors should provide assurance

that alterations do not distort scientific meaning.

The following statement should be included:

Informed consent: “ Informed consent was obtained from all individual participants included in

the study.”

If identifying information about participants is available in the article, the following statement

should be included:

“ Additional informed consent was obtained from all individual participants for whom identifying

information is included in this article.”

AFTER ACCEPTANCE

64

Upon acceptance of your article you will receive a link to the special Author Query Application at

Springer’s web page where you can sign the Copyright Transfer Statement online and indicate

whether you wish to order OpenChoice and offprints.

Once the Author Query Application has been completed, your article will be processed and you

will receive the proofs.

Open Choice

In addition to the normal publication process (whereby an article is submitted to the journal and

access to that article is granted to customers who have purchased a subscription), Springer now

provides an alternative publishing option: Springer Open Choice. A Springer Open Choice article

receives all the benefits of a regular subscription-based article, but in addition is made available

publicly through Springer’s online platform SpringerLink.

Springer Open Choice

Copyright transfer

Authors will be asked to transfer copyright of the article to the Publisher (or grant the Publisher

exclusive publication and dissemination rights). This will ensure the widest possible protection

and dissemination of information under copyright laws.

Open Choice articles do not require transfer of copyright as the copyright remains with the

author. In opting for open access, the author(s) agree to publish the article under the Creative

Commons Attribution License..

Offprints

Offprints can be ordered by the corresponding author.

Color illustrations

Publication of color illustrations is free of charge.

Proof reading

The purpose of the proof is to check for typesetting or conversion errors and the completeness

and accuracy of the text, tables and figures. Substantial changes in content, e.g., new results,

corrected values, title and authorship, are not allowed without the approval of the Editor.

After online publication, further changes can only be made in the form of an Erratum, which will

be hyperlinked to the article.

Online First

The article will be published online after receipt of the corrected proofs. This is the official first

publication citable with the DOI. After release of the printed version, the paper can also be cited

by issue and page numbers.

DOES SPRINGER PROVIDE ENGLISH LANGUAGE SUPPORT?

Manuscripts that are accepted for publication will be checked by our copyeditors for spelling and

formal style. This may not be sufficient if English is not your native language and substantial

editing would be required. In that case, you may want to have your manuscript edited by a native

speaker prior to submission. A clear and concise language will help editors and reviewers

concentrate on the scientific content of your paper and thus smooth the peer review process.

The following editing service provides language editing for scientific articles in all areas Springer

publishes in:

Edanz English editing for scientists

65

Use of an editing service is neither a requirement nor a guarantee of acceptance for publication.

Please contact the editing service directly to make arrangements for editing and payment.

For Authors from China

文章在投稿前进行专业的语言润色将对作者的投稿进程有所帮助。作者可自愿选择使用Sp

ringer

推荐的编辑服务，使用与否并不作为判断文章是否被录用的依据。提高文章的语言质量将有

助于

审稿人理解文章的内容，通过对学术内容的判断来决定文章的取舍，而不会因为语言问题

导致直 接退稿。作者需自行联系Springer推荐的编辑服务公司，协商编辑事宜。

理文编辑

For Authors from Japan

ジャーナルに論文を投稿する前に、ネイティブ・スピーカーによる英文校閲を希望されている

方には、Edanz社をご紹介しています。サービス内容、料金および申込方法など、日本語によ

る詳しい説明はエダンズグループジャパン株式会社の下記サイトをご覧ください。

エダンズグループジャパン

For Authors from Korea

영어 논문 투고에 앞서 원어민에게 영문 교정을 받고자 하시는 분들께

Edanz 회사를 소개해 드립 니다. 서비스 내용, 가격 및

신청 방법 등에 대한 자세한 사항은 저희 Edanz Editing Global 웹사이트를

참조해 주시면 감사하 겠습니다.

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66

ANEXO B Parecer CEP

UNIVERSIDADE NORTE DO PARANÁ - UNOPAR

Página 2 de 03

PARECER CONSUBSTANCIADO DO CEP

DADOS DO PROJETO DE PESQUISA

Título da Pesquisa: Influência dos meios fisicos em cultura celular.

Pesquisador: Rodrigo Franco de Oliveira

Área Temática:

Versão: 1

CAAE: 21458013.4.0000.0108

Instituição Proponente: Universidade Norte do Paraná - UNOPAR

Patrocinador Principal: Universidade Norte do Paraná - UNOPAR

DADOS DO PARECER

Número do Parecer: 462.478

Data da Relatoria: 30/09/2013

Apresentação do Projeto:

Estudos in vitro e in vivo têm demonstrado que a Terapia Laser de Baixa Potência e Ultrassom Pulsado de

Baixa Intensidade exercem uma influência significativa sobre função celular e expressão gênica dos genes

do colágeno e receptor de crescimento endotelial vascular. A proposta do projeto é comparar a expressão

gênica, juntamente com a viabilidade celular, sob ação do laser e do ultrassom em cultura celular

fibroblástica. As culturas fibroblásticas humanas serão submetidas à irradiação laser de baixa potência e

ultrassom pulsado de baixa intensidade. As análises serão realizadas através de

microscopia óptica, MTT método 3 - (4,5-dimethylthiazol-2-il) -2,5 diphenyl tetrazolium bromide, avaliação da

expressão gênica do colágeno e neovascularização por meio da qRT-PCR, 24 horas após cada irradiação,

respeitando os tempos de incubação de 24, 48 e 72 horas. Será observada a morfologia celular juntamente

com suas organelas e atividade celular correspondente a cada tempo de irradiação. Os resultados desse

projeto nortearão para o incremento do processo de estimulação e proliferação de células fibroblásticas a

partir da terapia laser e irradiação ultra-sônica, correlacionando com o processo de cicatrização,

neovascularização e reparo. através de um modelo simples e informativo sob os aspectos significativos do

uso da terapia física no sistema in vivo.

Endereço: Av. Paris 675

Bairro:

UF: PR

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LONDRINA

CEP: 86.041-140

Telefone: (43)3371-7834 E-mail: pesquisa@unopar.br

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Continuação do Parecer: 462.478

Objetivo da Pesquisa:

Analisar a influência da irradiação ultra-sônica de baixa intensidade, da terapia laser de baixa potência em

cultura celular fibroblástica.

Avaliação dos Riscos e Benefícios:

Riscos: não se aplica uma vez que será utilizado sistema in vitro.

Benefícios: mediante a aplicação dos recursos físicos, torna-se necessário conhecer os seus efeitos quando

aplicados aos diversos tecidos, bem como definir uma dosimetria adequada para gerar efeitos benéficos ao

tecido.

Comentários e Considerações sobre a Pesquisa:

A pesquisa é relevante ao propor a análise in vitro de recursos utilizados para estimular a reparação celular

in vivo.

Considerações sobre os Termos de apresentação obrigatória:

A autorização institucional está adequada.

O projeto propõe uma pesquisa in vitro, não havendo sujeitos envolvidos, sendo dispensado o TCLE.

Recomendações:

Sem recomendações adicionais.

Conclusões ou Pendências e Lista de Inadequações:

Sem pendências.

Situação do Parecer:

Aprovado

Necessita Apreciação da CONEP:

Não

Considerações Finais a critério do CEP:

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LONDRINA, 20 de Novembro de 2013

Assinador por: Hélio Hiroshi Suguimoto

(Coordenador)

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