Análise de Fitoplâncton, Cianobactérias e Clorofila do... · • Heterogeneidade Espacial:...

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Análise de Fitoplâncton, Cianobactérias e Clorofila Maria do Carmo Carvalho Gerente – Setor de Comunidades Aquáticas [email protected] ou [email protected]
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  • Anlise de Fitoplncton, Cianobactrias eClorofila

    Maria do Carmo Carvalho

    Gerente Setor de Comunidades [email protected] ou [email protected]

  • Importncia na Anlise da Comunidade Fitoplanctnica e Clorofila

    Verificao da causa da colorao, turbidez, odores indesejveis e partculas visveis da gua;

    Subsidiar a interpretao de anlises qumicas, por exemplo, corre-lacionando presena de certas formas com a deficincia ou super-saturao de oxignio na gua;

    Explicar a obstruo de filtros e ajudar no projeto e operao de esta-es de tratamento de gua e esgoto;

    Atendimento legislao (CONAMA 357/2005 e Portaria 2914/2012);

    Fornecer dados sobre o estado trfico de um sistema aqutico;

    Subsidiar a investigao de causas de mortandade de peixes;

    Indicativo de problemas relacionados a toxicidade na gua, comidentificao de espcies potencialmente txicas;

    Estudos ecolgicos.

  • FITOPLNCTONCARACTERSTICAS MORFOLGICAS

  • Requisitos da TcnicosQualidade

    Pessoal; Acomodaes e meio ambiente; Referncias normativas; Amostragem; Instalao e Equipamentos; Mtodos de ensaio e calibrao e validao; Rastreabilidade de medio; Garantia da qualidade de resultados - controles

    internos e externos; Clculo da Incerteza; Apresentao de resultados.

  • PESSOAL

    O pessoal deve ser competente para:

    Operar equipamentos especficos; Realizar os ensaios; Avaliar resultados.

    => Conhecimento tcnico-cientfico atualizado.

  • TREINAMENTO/CAPACITAO

    Profissionais: nvel superior habilitado;

    Especfico sobre o tema;

    Ministrado por especialistas.

  • PLANEJAMENTO AMOSTRAL, COLETA E PRESERVAO

    Heterogeneidade Espacial: -vertical

    - horizontal;

    - Heterogeneidade Temporal.

  • A : Nata na margem e na superfcie;

    B: Populao dispersa no epilmnio e nata no sedimento;

    C e D: florao sub-superficial (metalmnio);

    E: Populao dispersa homogeneamente na coluna - mistura;

    F: nata sob gelo;

    Floraes de Cianobactrias

    Localizao de Floraes em um reservatrio raso

    Adaptado de http://pubs.usgs.gov/sir/2008/5038/pdf/SIR2008-5038.pdf

  • Floraes de Cianobactrias

    Res. Barra Bonita, SP

    Res. Billings, SP

  • Amostragem

    Variveis correlatas: alquotas da mesma tomada

  • EQUIPAMENTOSMicroscpio Invertido

    - Objeto visualizado por baixo, o

    revlver das objetivas est sob a

    platina.

    - Luz transmitida: fonte de luz,

    coletor e condensador

    intercambiveis com longas

    distncias de trabalho.

    Cmara de Utermhl: espessura de lamnula de 0,17 mm.

  • Microscpio Comum

    Limita o aumento do objeto a ser analisado

    Volume limitado

    objetiva de longo alcance

  • Metodologia de Anlise

    3. Calibraes, verificaes, clculos e fatores

    Tanto para Sedgwick-Rafter como para cmara de Utermhl,

    deve ser realizada a calibrao do Retculo de Whipple.

    O Retculo de Whipple importante pois pode ser usado para

    medir organismos e delimitar rea da leitura.

    Lmina Micromtrica (deve ser calibrada ao menos uma

    antes da primeira utilizao )

    Fonte: www.reticles.com

  • Metodologia de AnliseCalibraes, verificaes, clculos e fatores

    10 colunas

    Retculo de Whipple

    5 colunas

    50m

    1 coluna = 50/3 = 16,67mO retculo = 16,67 x 10 = 166,7m1 quadradinho = 16,67/5= 3,3m

  • Cmara de Utermhl: fatores de concentrao

    A = . R2 =

    A = 3,1416 x (1,3)2 = 5,03093 cm2

    onde: F = FatorA = rea da cmara a= rea do(s) transecto(s) lidoV = volume da cmaraR= raio da cmara de Utermhl

    0,0167 cm 2,6cm

    F = A / a = 5,3093 / (0,0167 x 2,6) = v 2

    F = 5,3093 / 0,0434 = 61,172

    F = A / a

    v

    Metodologia de AnliseCalibraes, verificaes, clculos e fatores

    CMARA DE 2 ML

    1,3 cm

  • CMARA DE 5 ML 10 CAMPOS

    3. Calibraes, verificaes, clculos e fatores

    Metodologia de Anlise

    Cmara de Utermhl: fatores de concentrao

    F = A / a = 5,3093 / (0,0192 x 2,6) = v 5

    F = 5,3093 / 0,0499 = 21,275

    onde:

    F = FatorA = rea da cmara a= rea do(s) transecto(s) lidoV = volume da cmara

    onde:

    F = FatorA = rea da cmara a= rea retculo de WhippleV = volume da cmara

    F = A / 10a = 5,3093 / 10 x (0,0192)= v 2

    F = 5,3093 / 0,00368 = 721,372

  • Fitoplncton

    - Preservao da amostra at24h aps a coleta, com lugolou formol;

    - Visualizao da amostra vivaem epifluorescncia.

    - Preparo da CmaraHomogeneizao

  • Metodologia de Anlise

    Contagem em Cmara de Utermhl

    Transectos

    Campo

    No contaesteorganismo

    Conta esteorganismo

    5. Estratgias de Contagem

  • Metodologia de Anlise

    Estratgias de Contagem

    Contagem em Cmara de Utermhl ou Sedgwick Rafter

    Contagem de Organismos em Campos

    Mais rpido ; Nmero de campos

    depende do erro aceitvel. Se no for distribudo

    corretamente pode aumentar efeito

    Contagem de Organismos em Transectos

    Demanda maior tempo, amostra muito densa, h maior esforo (no pode parar o transecto no meio!);

    Minimiza os efeitos da distribuio no homognea.

  • Tempo de Sedimentao Cmaras de Utermohl

    Tempo por centmetro de altura da cmara

    Autor

    1,5 horas Lund et al. (1958)

    3 horas Utermohl

    4 horas Nauwerk (1976)

    4 horas Willen (1976

    3 a 4 horas Lawton et al. (1999)

    Miller, C. 2011

  • Tempo de Sedimentao para cmaras de Sedgwick-Rafter

    Tempo de sedimentao Autor

    7 minutos Woelkerling,Kowal e Gough(1976)

    24 minutos ASTM (2004)

    15 minutos APHA (2012)??

    15 minutos LeGresley e McDermott (2010)

    Miller, C. 2011

  • O QUE FAZER?????

  • Contagem

    Transectos

    Campo

    No contaesteorganismo

    Conta esteorganismo

  • Estratgias de Contagem

    Diluio - Amostra com grande quantidade de organismos variados coloniais e filamentosos;

    Retculo de Whipple Quantas clulas tem em um quadro do retculo e e conta os quadrados e multiplica pelas clulas estabelecidas;

    Hidrxido de Potssio ou Sdio Tcnica utilizada para contagem das cianobactrias coloniais;

  • Metodologia de Anlise

    Colnias

    Filamentos

    Retculo de Whipple

    Estratgias de Contagem

  • Determinao da clorofila a e feofitina a

  • Filtro ou membrana de fibra de vidrode 47mm de dimetro com porosidadeentre 0,45 a 1,0 m.

    Colocar a membrana no porta-filtro (com o vcuo j em funcionamento)

    Homogeneizar delicadamente a amostra

  • HOMEGENEIZAO

  • Este procedimento deve ser realizado minimizando-se a exposio luz.Utiliza-se um sistema de bomba a vcuo e porta filtro.

    Clorofila-a : Filtrao

    Sistema de vcuo

    Kitassato

    Porta filtro

    - Proveta graduada;- Filtro/membrana de fibra de vidro com porosidade entre 0,45 - 1,0 m.- Pina;- Envelope Pardo guardar em recipiente preto ou envolvido em papel alumnio com slica gel.

  • Clorofila-a : Extrao

    Neste procedimento utilizado como solvente orgnico a acetona 90%.Se necessrio acertar o pH da acetona 90% entre 8 a 9 utilizandoHidrxido de amnio 25%. Tempo: mnimo de 2 h mximo 24h

    - Macerador ou homogeneizador de tecidos (com haste de ao para triturar o filtro)

    - Acetona 90%- Tubos de vidro mbar com tampa rosquevel

  • Clorofila a (g/L)= 26,73 . (Dc664-Dc665) . v ( V.L)

    Feofitina a (g/L)= 26,73 . [(1,7. Dc665) Dc664] v

    (V.L)

    Equaes monocromticas

    Onde:V= Volume, em litros, da amostra filtradav= Volume, em mL, de acetona 90% usada para extraoL= Caminho ptico, em cm da cubeta

    espectrofotomtrica usadaDc664= Densidade ptica a 664nm, corrigidaDc665= Densidade ptica a 665nm, corrigida

  • Resultados- Clorofila

    Mtodo Analtico 1 via 2 via 3 via Mdia

    Espectrofotomtrico. 6,94 10,95 - 8,95Espectrofotomtrico. 57,98 61,03 57,98 59,00 Espectrofotomtrico. 63,10 67,40 73,80 68,10 Espectrofotomtrico. 69,69 69,53 72,42 70,55 Espectrofotomtrico. 6,32 13,02 - 9,67Espectrofotomtrico. 50,00 52,00 52,00 51,33 Espectrofotomtrico. 65,68 49,55 - 57,61 Espectrofotomtrico. 24,17 19,54 21,31 21,67 Espectrofotomtrico. 59,70 59,70 57,92 59,11 Espectrofotomtrico. 55,37 46,30 67,00 56,22Espectrofotomtrico. 54,58 54,79 54,13 54,50 Espectrofotomtrico. 58,55 58,71 59,14 58,80 Espectrofotomtrico. 72,17 77,52 74,84 74,84 Espectrofotomtrico. 20,80 22,60 21,70 21,70

  • Resultados de Clorofila IETndice de Estado Trfico

    Resultados

    1 via 2 via 1 via Mdia

    6,94 10,95 - 8,95

    57,98 61,03 57,98 59,00

    63,10 67,40 73,80 68,10

    69,69 69,53 72,42 70,55

    6,32 13,02 - 9,67

    50,00 52,00 52,00 51,33

    65,68 49,55 - 57,61

    24,17 19,54 21,31 21,67

    59,70 59,70 57,92 59,11

    55,37 46,30 67,00 56,22

    54,58 58,71 59,14 54,50

    58,55 58,71 59,14 58,80

    72,17 77,52 74,84 74,84

    20,80 22,60 21,70 21,70

  • Resultados Cianobactrias

    Mtodo Analtico 1 via 2 via 3 via Mdia

    Utermhl. 20.766,00 19.981,00 26.915,00 22.554,00Utermhl. 65.051,00 74.309,00 69.492,00 69.617,33Utermhl. 204.416,00 116.964,00 183.109,00 168.163,00Utermhl. 24.296,00 - - 24.296,00Utermhl. 141.336,00 163.835,00 145.866,00 150.345,67Utermhl. 77.516,00 76.696,00 59.299,00 71.170,33

    Sedgwick-rafter. 239.391,00 227.652,00 212.783,00 226.608,67Sedgwick-rafter. 132.370,00 144.463,00 105.535,00 127.456,00

  • Legislaes CONAMA 357/2005

    VARIVEIS CLASSE I CLASSE II CLASSE III

    CLOROFILA a 10 g/L 30g/L 60g/L

    Densidade deCianobactrias

    20.000cls./mL

    50.000cls./mL

    100.000cls./mL

  • Portaria 2914/2012

    CONTROLE DAS CIANOBACTRIAS E CIANOTOXINAS EM MANANCIAIS DE ABASTECIMENTO PBLICO DEVIDO AO POTENCIAL TXICO

    Freqncia mensal se o nro. Cianobactrias < 10.000 cls./mLsemanal > 10,000 cls.mL

    Proibio do uso de algicidas para o controle de cianobactrias se o nmerode clulas > 20.000 cls./mL

  • Interferncia nos resultados Clorofila

    Armazenamento/transporte da amostra encaminhada pelos laboratrios Homogeneizao Porosidade do filtro Volume filtrado Extrao solvente e macerao Mtodo de determinao (acidificao) Determinao de feofitina?? Clculos (uso do volume errado na equao) Transcrio errada dos dados LQ - recomendao de pelo menos 1g/L mximo

    LQ de

  • Interferncia nos resultados Cianobactrias

    Tcnico sem o treinamento adequado Homogeneizao Equipamento Microscpios (calibrao e clculos) Tempo de sedimentao Estratgia adotada no adequada Variabilidade da amostra (tamanho dos organismos) Transcrio errada dos dados (fatores, diluio, etc)

  • Obrigada a todos pela ateno!