ANNELISE CASTANHA BARRETO TENÓRIO NUNES · em caprinos e ovinos / Annelise Castanha Barreto...

7

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIA ANIMAL

ANNELISE CASTANHA BARRETO TENÓRIO NUNES

Diagnóstico imunológico, molecular e histopatológico das infecções por Toxoplasma gondii e Neospora caninum em caprinos e ovinos

RECIFE

2014

8




ANNELISE CASTANHA BARRETO TENÓRIO NUNES


Tese apresentada ao Programa de Biociência Animal da Universidade Federal Rural de Pernambuco, como pré-requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Biociência Animal. Orientador: Prof. Dr. Rinaldo Aparecido Mota

RECIFE

2014

9

Ficha catalográfica

N972d Nunes, Annelise Castanha Barreto Tenório Diagnóstico imunológico, molecular e histopatológico das infecções por Toxoplasma gondii e Neospora caninum em caprinos e ovinos / Annelise Castanha Barreto Tenório Nunes. – Recife, 2014. 97 f. : il. Orientador(a): Rinaldo Aparecido Mota. Tese (Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal) – Universidade Federal Rural de Pernambuco, Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Recife, 2014. Inclui anexo(s), apêndice(s) e referências. 1. Ovino 2. Caprino 3. Diagnóstico 4. Neospora caninum 5. Toxoplasma gondii I. Mota, Rinaldo Aparecido, orientador II. Título CDD 591.4

10





Tese elaborada por

Annelise Castanha Barreto Tenório Nunes

Aprovada em 26/02/2014

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________________ Prof. Dr. Rinaldo Aparecido Mota - Orientador

Laboratório de Doenças Infecciosas dos Animais Domésticos- UFRPE

_______________________________________________ Prof. Dr. Wagnner José Nascimento Porto

Campus Arapiraca – Unidade Educacional Viçosa - UFAL

________________________________________________ Prof Dra. Karla Patrícia Chaves da Silva

Campus Arapiraca – Unidade Educacional Viçosa - UFAL

________________________________________________ Prof Dra. Flaviana Santos Wanderley

Universidade Estadual de Ciências da Saúde de Alagoas - UNCISAL

________________________________________________ Dra. Elise Miyuki Yamasaki

Laboratório de Doenças Infecciosas dos Animais Domésticos - UFRPE

11

Dedico este trabalho as pessoas especiais em minha vida: meu marido Kleber e

meus filhos Matheus, Giovanna e João Pedro. Eu amo vocês!

12

AGRADECIMENTOS

A Deus por tudo. Sem Ele muitos obstáculos não seriam possíveis de

atravessar e pela proteção em todas as minhas indas e vindas.

A meu orientador Profº Rinaldo Aparecido Mota, o meu muito obrigado de

coração. Aprendi a admirar o seu conhecimento, a sua consideração e seu carinho

pelas pessoas. Obrigada pela oportunidade.

Ao meu marido Kleber, pelo incentivo, pela paciência, pela compreensão e

pela ajuda durante as coletas. Tudo isso foi fundamental durante este tempo. Te

amo!

Aos meus filhos, Matheus, Giovanna e João Pedro pelo o amor e a paciência

nas horas de ausência.

Aos meus pais Fernando Antônio e Rejane Maria pelo apoio dedicado e ter

sempre acreditado em mim. Mainha obrigado por sempre acreditar que a sua filha

era capaz! Obrigada pela ajuda para cuidar das minhas preciosidades quando tinha

que viajar para cumprir as disciplinas, as coletas e realização dos estes.

A minha irmã Cristiane, meu cunhado Rômulo e meu sobrinho Pedro

Henrique pelas horas de convivência e de apoio durante todos estes anos. A sua

casa foi sempre meu abrigo quando precisei.

A meu irmão Fred Eduardo, minha cunhada Gislaine e o meu sobrinho

Gabriel, que nasceu durante o percusso desta pós-graduação.

As minhas cunhadas Pollyanna, Rossana e Louisianna que torceram por mim

durante a realização desta pós-graduação.

A minha sogra D.Lourdes e a “Tia” Lucinha pelo apoio para cuidar dos meus

filhos quando não estive presente.

A Maria Cleonice, a “Cota”, pela ajuda durante estes anos em casa e com os

meus filhos.

Aos meus amigos da UFAL, Wagnner, Wilson, Karla e Chiara, e Beth, pelo

incentivo e pelo carinho dedicado a mim. Foram tão importantes durante este tempo.

Aos meus colegas de jornada, Flaviana e Mauro, que com suas palavras de

tanto me incentivaram. Obrigada pelo carinho!

A Simone e Vinícius pela ajuda e disposição em parte da execução deste

projeto.

13

Ao pessoal do laboratório de Bacterioses, André Mota, André Santos, Atzel,

Áurea, Bruno, Débora, Érica Moraes, Érica Samico e Luana. Durante este percusso

vocês foram importantes. Obrigada pela convivência! Em especial a Giva, a

Marcela, Pedro Paulo, Orestes e Renatinha.

A Pomy Kim pelo apoio na execução deste projeto e pelas palavras de

carinho. Aprendi a gostar e admirar você!

A Edna Cherias que nos conhecemos há anos e você continua da mesma

maneira, sempre atenciosa e carinhosa.

A Guiomar pelo carinho e atenção. Descobri neste tempo de convivência a

pessoa bondosa que você é.

A Elise Yamasaki o meu obrigado pela grande ajuda durante este

experimento. Você foi peça fundamental na execução deste projeto. Aprendi a

conviver com você e te respeitar.

A Prof. Leonildo obrigada pela convivência.

A Andrea Alice a quem conheço desde a graduação, sempre atenciosa e

carinhosa. Obrigada pela ajuda nesta etapa final.

A Júnior (José Wilton) e a Chiara obrigada pela ajuda na estatística.

Que Deus abençoe sempre todos vocês!

14

“Tu que vives sobre a proteção do altíssimo, que moras à sombra do onipotente, diz

ao senhor: meu refúgio, meu baluarte, meu Deus em que confio.

Porque ele te livrará do laço dos caçadores e da peste perniciosa.

Ele te cobrirá com as suas penas, e te acolherá debaixo das suas asas;

Escudo e broquel é a tua fidelidade.

Não terás medo do terror noturno, nem da seta que voa de dia,

Nem da peste que vagueia nas trevas e nem da calamidade

que devasta em pleno meio-dia.

Caiam mil ao teu lado, e dez mil à tua direita, mas a calamidade não aproximar ti.

Somente com os teus olhos contemplarás, e verás a recompensa dos ímpios.

Porque tu, ó Senhor, és o meu refúgio. No Altíssimo fizeste a tua habitação.

Nenhum mal te sucederá, nem praga alguma chegará à tua tenda.

Porque aos seus anjos dará ordem a teu respeito, para te guardarem em todos os

teus caminhos.

Eles te sustentarão nas suas mãos, para que não tropeces com o teu pé em pedra.

Pisarás o leão e a cobra; calcarás aos pés o filho do leão e a serpente.

Pois tão encarecidamente me amou, também eu o livrarei; pô-lo-ei em alto retiro,

porque conheceu o meu nome.

Ele me invocará, e eu lhe responderei; estarei com ele na angústia; livrá-lo-ei e o

glorificarei.

Dar-lhe-ei abundância de dias, e lhe mostrarei a minha salvação.”

SALMO 91

15

RESUMO Este trabalho teve por objetivo pesquisar a presença de Toxoplasma gondii e Neospora caninum em caprinos e ovinos naturalmente infectados, empregando técnicas imunológicas, molecular e histopatológica. No primeiro experimento, foram utilizadas amostras de soros e tecidos de 100 ovinos abatidos no estado de Alagoas. Para a pesquisa de anticorpos de T. gondii foi utilizada a técnica de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e para a pesquisa do parasito nos tecidos foram utilizadas as técnicas de Reação de Cadeia da Polimerase (PCR) e Imunohistoquímica (IHQ) somente nos animais positivos na sorologia. Para o estudo da concordância entre as técnicas diretas foi empregado o teste Kappa. Na RIFI, 14% (14/100) animais foram positivos sem diferença significativa para machos e fêmeas. Na PCR, 21,43% (03/14) e na IHQ observou-se marcação positiva para T. gondii em tecido cerebral de 7,14% (1/14) dos ovinos. Na histopatologia, o achado predominante foi o infiltrado celular mononuclear no coração, cérebro e cerebelo ao redor dos vasos sanguíneos, seguido de hemorragia na medula e cerebelo. A concordância entre as técnicas diretas de diagnóstico em ovinos naturalmente infectados foi moderada (K= 0,44), portanto é importante associar mais de uma técnica de diagnóstico direto no diagnóstico da toxoplasmose ovina. No segundo experimento, foram utilizadas amostras de soros e tecidos de 100 ovinos abatidos e tecidos de 10 fetos. Para a pesquisa de anticorpos d N. caninum foi utilizada a técnica da RIFI e para a pesquisa do parasito nos tecidos foram utilizadas as técnicas de PCR e IHQ somente nos animais positivos na sorologia. Para o estudo da concordância entre as técnicas diretas foi empregado o teste Kappa. Na RIFI, 13% (13/100) dos animais foram positivos, onde 7,7% (1/13) eram machos e 92,3% (12/13) fêmeas, predominando o título 800, com diferença estatística significativa para entre machos e fêmeas. Na PCR dos ovinos adultos e dos fetos, 38,5% e 30% apresentaram reação positiva, respectivamente, principalmente no cérebro. Na IHQ, dois ovinos adultos apresentaram marcação positiva no cérebro. Os achados histopatológicos revelaram infiltrado mononuclear no coração, cérebro e medula e focos de congestão no cérebro, focos de hemorragia e infiltrado mononuclear no cérebro e medula e nos vasos do cérebro e cerebelo. N. caninum está presente em ovinos abatidos no estado de Alagoas e foi verificada a transmissão vertical na forma natural. A concordância entre as técnicas diretas de diagnóstico em ovinos naturalmente infectados foi moderada (K= 0,44), portanto é importante associar mais de uma técnica de diagnóstico direto no diagnóstico da infecção por este parasito. No terceiro experimento, foram coletadas um total de 78 amostras (cérebro, fígado, pulmão, rim e coração) de 17 fetos abortados de caprinos e ovinos em 10 propriedades rurais no Estado de Pernambuco, Brasil. As amostras foram analisadas por PCR, Histopatologia e IHQ para T. gondii e N. caninum Nenhuma amostra foi positiva para T. gondii na PCR e IHQ. Na PCR para N. caninum onze amostras (14,1%) foram positivas em uma amostra de cérebro, cinco de fígado, uma de pulmão, duas de rim e duas de coração. Na histopatologia foi observada leve infiltração mononuclear no fígado e focos de congestão na região justaglomerular e medular do rim. Na IHQ uma amostra de cérebro de feto caprino apresentou reação positiva para N. caninum. Os resultados confirmam a transmissão vertical de N. caninum em ovinos e caprinos naturalmente infectados na região nordeste do Brasil. Palavras-chaves: ovino, caprino, diagnóstico, Neospora caninum, Toxoplasma gondii

16

ABSTRACT

This study aimed to investigate the presence of Toxoplasma gondii and Neospora caninum in naturally infected sheep and goats, employing immunological, molecular and histopathological techniques. In the first experiment, sera and tissues of 100 slaughtered sheep were used in the state of Alagoas. For the detection of antibodies to T. gondii the immunofluorescent antibody test (IFAT) was used and for the detection of parasites in tissue techniques of Polymerase Chain Reaction (PCR) and Immunohistochemistry (IHC) were used only in positive animals in serology. To study the agreement between the direct techniques we employed the Kappa test. IFAT, 14% (14 /100) were positive animals with no significant difference for males and females. In PCR, 21.43 % (03/14) and IHC - positive staining was observed for T. gondii in brain tissue of 7.14 % (1 /14) of sheep. Histopathologically, the predominant finding was the mononuclear cell infiltrate in the heart, brain and cerebellum around blood vessels, followed by hemorrhage in the medulla and cerebellum. The agreement between the direct diagnosis techniques in sheep naturally infected was moderate (K = 0.44), so it is important to involve a more direct diagnostic technique in the diagnosis of ovine toxoplasmosis. In the second experiment, sera and tissues of 100 slaughtered sheep and tissues of 10 fetuses were used. For the detection of antibodies to N. caninum IFAT technique was used and the detection of parasites in the tissues PCR and IHC were used only in positive serology in animals.To study the agreement between the direct techniques we employed the Kappa test. IFAT, 13 % (13/100) of the animals were positive, where 7.7% (1/13) were male and 92.3 % (12/13) females, predominantly under 800, with a statistically significant difference for between males and females. PCR of adult sheep and fetuses, 38.5 % and 30 % showed a positive reaction, respectively, mainly in the brain. In IHC, two adult sheep showed positive staining in the brain. Histopathologic findings revealed mononuclear infiltrates in the heart, brain and spinal cord and areas of congestion in the brain, foci of hemorrhage and mononuclear infiltrates in the brain and spinal cord and vessels of the brain and cerebellum. N. caninum is present in sheep slaughtered in the state of Alagoas and vertical transmission was observed in the natural way. The agreement between the direct diagnosis techniques in sheep naturally infected was moderate (K = 0.44), so it is important to involve a more direct diagnostic technique in the diagnosis of infection by this parasite. In the third experiment were collected a total of 78 samples (brain, liver, lung, kidney and heart) of 17 aborted fetuses from goats and sheep on 10 farms in the State of Pernambuco, Brazil. Samples were analyzed by PCR, histopathology and immunohistochemistry for T. gondii and N. caninum. No sample was positive for T. gondii by PCR and IHC. In PCR to N. caninum eleven samples (14.1%) were positive in a sample of brain, five of liver, one of lung, two of kidneys and two of heart. Histopathology in the samples that showed no autolysis were evidenced mainly mild mononuclear infiltration in the liver and foci of congestion in the regions juxtaglomerular and medullar of the kidney. IHC on a sample of goat fetal brain showed positive reaction to N. caninum. The results confirm the vertical transmission of N. caninum in naturally infected sheep and goats in northeastern Brazil.

Key-words: sheep, diagnosis, Toxoplasma gondii, Neospora caninum

17

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Revisão de Literatura

Figura 1 - Ciclo biológico de T. gondii 21

Figura 2 - Ciclo biológico de N. caninum 31

Artigos Científicos

Capítulo 1

Figura 1 - A- Infiltrado mononuclear entre os miócitos B- Manguito 60 perivascular no cérebro (HE, objetiva 40X)

Figura 2 - Imunomarcação positiva de cistos de T. gondii em tecido cerebelar 60 de ovino naturalmente infectado (anticorpo VMRD, cat. 210-70, LSAB, DAB, objetiva 100X)

Capítulo 2

Figura 1 - Imunomarcação de cisto para N. caninum no cérebro de ovelha 74 adulta (anticorpo VMRD, cat.210-70-NC, LSAB, AEC, objetiva 100X).

Capítulo 3

Figura - 1 Imunomarcação de cisto de N. caninum em cérebro de feto 91 caprino (anticorpo VMRD, cat.210-70-NC, LSAB, AEC, objetiva 100X)

18

LISTA DE TABELAS

Artigos Científicos

Capítulo 1

Tabela 1 Achados histopatológicos nos tecidos de ovinos positivos 59 na sorologia (RIFI) para Toxoplasma gondii

Capítulo 2

Tabela 1 Achados histopatológicos para os tecidos de ovinos positivos na 74 RIFI para N. caninum.

Capítulo 3

Tabela 1 Resultados da PCR para N. caninum em amostras biológicas 89 de fetos caprinos e ovinos no estado de Pernambuco, Brasil

Tabela 2 Frequência absoluta e relativa (%) de amostras positivas na PCR 90 para N. caninum em órgãos de fetos caprinos e ovinos no estado de Pernambuco, Brasil

Tabela 3 Achados histopatológicos relacionados à infecção por N. caninum 90 em amostras biológicas de fetos caprinos e ovinos no estado de Pernambuco, Brasil

19

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ºC Graus Celsius

Marca Registrada

µL Microlitro

µm Micrômetro

µM Micromolar

% Porcentagem

2 Qui-quadrado

Menor ou igual

2-ME 2-Mercaptoetanol

AEC Aminoethylcarbazole

DAB Diaminobenzidina

DNA Ácido Desoxirribonucléico

ELISA Ensaio Imunoenzimático

et al. Autores colaboradores

FC Fixação de Complemento

Há Hectare

HA Hemaglutinação Direta

HE Hematoxilina-Eosina

HAI Hemaglutinação Indireta

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

IFI Imunofluorescência Indireta

IFN Interferon Gama

IgG Imunoglobulina G

IgM Imunoglobulina M

IHQ Imunohistoquímica

ISAGA Immunosorbent Agglutination Assay

LSAB Labelled Streptavidin Biotin

ml Mililitro

mM Milimolar

N. caninum Neospora caninum

OIE World Organisation for Animal Health

pb Pares de Base

20

PBS Tampão fosfato-salino

PCR Reação em Cadeia de Polimerase

pH Potencial Hidrogeniônico

pM Picomolar

RIFI Reação de Imunofluorescência Indireta

SAS Statitical Analysis System

SNC Sistema Nervoso Central

VP Vacúolo Parasitófor

T. gondii Toxoplasma gondii

US$ Dólares Americanos

21

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 16

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 18

2.1 Toxoplasmose 18

2.1.1 Etiologia, Ciclo Biológico e Epidemiologia 18

2.1.2 Patogenia e Patologia 23

2.1.3 Diagnóstico 25

2.2 Neosporose 27

2.2.1 Etiologia, Ciclo Biológico e Epidemiologia 27

2.2.2 Patogenia e Patologia 34

2.2.3 Diagnóstico 35

3 OBJETIVOS 38

3.1 Geral 38

3.2 Específicos 38

4 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 39

5 ARTIGOS CIENTÍFICOS 54

CAPÍTULO 1 Pesquisa de Toxoplasma gondii em ovinos abatidos no 54 estado de Alagoas empregando diferentes técnicas de diagnóstico

INTRODUÇÃO 56

MATERIAL E MÉTODOS 57

RESULTADOS 59

DISCUSSÃO 61

CONCLUSÃO 63

CAPÍTULO 2 Detecção e comparação de técnicas de diagnóstico para 67 infecção por Neospora caninum em ovinos naturalmente infectados

INTRODUÇÃO 69


RESULTADOS 73

DISCUSSÃO 75

CONCLUSÃO 78

CAPÍTULO 3 Transmissão congênita de Neospora caninum em caprinos 83 e ovinos no estado de Pernambuco, Brasil

INTRODUÇÃO 85


22

RESULTADOS 89

DISCUSSÃO 91

CONCLUSÃO 93

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS 97

16

1 INTRODUÇÃO

A criação de caprinos e ovinos na região nordeste do Brasil é praticada desde

a colonização, principalmente pelo fato dessas espécies serem mais adaptadas às

condições ambientais e climáticas desfavoráveis do que a maioria das outras

espécies (CAVALCANTE; BARROS, 2013).

A caprino-ovinocultura faz parte das atividades rurais mais representativas do

Nordeste brasileiro, tendo importância cultural para a agricultura familiar e para o

agronegócio. Os animais são explorados para produção de carne, pele e leite. A

caprino-ovinocultura pode ser considerada como uma atividade potencial para o

desenvolvimento do semiárido brasileiro.

O efetivo de ovinos no Brasil é de 17,3 milhões de cabeças e o de caprinos de

9,3 milhões, sendo que 9,8 e 8,4 milhões, respectivamente, estão na região

Nordeste do Brasil (IBGE, 2010).

A ausência de um programa voltado para a saúde do rebanho e a

fragmentação dos elos da cadeia são alguns dos entraves que impedem o

crescimento da cadeia de caprinos e ovinos no País (FAEAL, 2013). Segundo

Pinheiro et al. (2000), o baixo índice de utilização das práticas de manejo sanitário

por parte dos criadores de animais contribui, sem dúvida, para a manutenção dos

altos índices de mortalidade observados. A falta de áreas de isolamento e

quarentenário nas fazendas e o trânsito de animais entre rebanhos e regiões podem

ser considerados como os principais responsáveis pela disseminação de doenças.

Estudos determinaram os problemas sanitários dos rebanhos de caprinos e

ovinos e destacaram o aborto entre os principais problemas identificados

(PINHEIRO et al., 2000; MENZIES, 2011).

A toxoplasmose é considerada uma das mais importantes doenças em ovinos

caprinos. Geralmente ocorre na forma assintomática, porém ovelhas e cabras não

imunes e que adquirem a infecção durante a gestação podem desenvolver distúrbios

reprodutivos como abortos, absorção fetal, fetos mumificados, repetição de cio e

neonatos mortos ou fracos, que evoluem para óbito, ocasionando perdas

econômicas consideráveis aos rebanhos (MASALA et al., 2003; PEREIRA-BUENO

et al., 2004).

17

Assim como a toxoplasmose, a neosporose é uma enfermidade parasitária

abortiva causada por Neospora caninum um parasito antigenicamente distinto do

Toxoplasma gondii (DUBEY, 2003). É uma doença parasitária associada a

problemas reprodutivos e distúrbios neurológicos nos animais infectados, com

caráter progressivo, manifestando-se com maior severidade em animais jovens.

Entretanto, a importância de N. caninum como agente envolvido em casos de aborto

em pequenos ruminantes ainda precisa ser determinada. Tradicionalmente, o aborto

causado por protozoários no rebanho ovino e caprino tem sido relacionado

diretamente à infecção por T. gondii. Uma das ferramentas de diagnóstico utilizada é

a avaliação das lesões necróticas e inflamatórias características da infecção por este

protozoário nos tecidos fetais, principalmente no encéfalo.

Os estudos sobre as causas de aborto em caprinos e ovinos apresentam

ainda alguns desafios para as pesquisas futuras. Entre estes, inclui-se a

padronização dos métodos de diagnóstico.

18

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Toxoplasmose

A toxoplasmose é uma doença de caráter zoonótico e cosmopolita, causada

pelo protozoário Toxoplasma gondii (T. gondii), um parasita intracelular obrigatório.

A distribuição do agente ocorre de maneira desigual pelo mundo. São

frequentemente encontrados em regiões úmidas e com temperaturas elevadas que

permitem a sobrevivência dos oocistos no meio ambiente (SAWADOGO et al.,

2005). T. gondii é reconhecido como importante agente causador de abortos em

ovelhas desde 1950 (BERVELEY; WATSON, 1959).

2.1.1 Etiologia, Ciclo Biológico e Epidemiologia

T. gondii é um coccídeo que tem os felídeos com hospedeiros definitivos e

mamíferos de sangue quente como hospedeiros intermediários. Pertence ao Filo

Apicomplexa, classe Sporozoasida, subclasse Coccidiasina, ordem Eimeriorina,

família Toxiplasmatidae, gênero Toxoplasma com apenas uma espécie T. gondii

(DUBEY, 2010).

Foi descrito primeiramente em 1908 por Splendore em São Paulo, no Brasil,

que isolou o parasito em um coelho de laboratório e por Nicole e Manceaux em um

roedor na África do Sul. Inicialmente foi denominado Leishmania gondii, recebendo

posteriormente a nomenclatura atual. Apesar do agente ter sido isolado no início do

século XX, apenas na década de 70 foi descrita a sua natureza coccidiana, bem

como seus hospedeiros definitivos e intermediários (FRENKEL et al., 1970).

O agente acomete várias espécies, incluindo mamíferos, répteis, anfíbios e

aves, sendo considerada uma das parasitoses mais frequentes no homem e nos

animais homeotérmicos (FRENKEL, 1990). Entretanto, entre os animais de

produção, os suínos e ovinos são as espécies mais acometidas, seguidas dos

caprinos e leporinos (DUBEY; THULLIEZ, 1993).

As cepas de T. gondii isoladas em diferentes espécies animais, apesar de

morfologicamente indistinguíveis, variam quanto a sua virulência e patogenicidade.

Com a utilização de métodos de caracterização molecular foram identificadas

19

linhagens bem definidas de T. gondii designadas como tipo I, II e III (DUBEY;

FRENKEL, 1973; HOWE; SIBLEY, 1995).

Em ovinos, a primeira descrição do agente ocorreu em 1942 por Olafson e

Monlux, nos Estados Unidos, e desde então, vários trabalhos demonstraram a

importância econômica da infecção por T. gondii nesta espécie como causa de

abortos e natimortos (FREYRE et al., 1997). A alta prevalência da infecção em

ovinos pode ser explicada pela baixa resistência desta espécie ao parasito e as

próprias condições de exploração da ovinocultura que expõe estes animais a maior

probabilidade de contato com oocistos eliminados pelo gato (DUBEY; HAMIR, 2002).

T. gondii possui três formas evolutivas: Taquizoíto: apresenta forma

arqueada, com aproximadamente 6µm de comprimento e 2 µm de largura

encontrada no processo agudo da infecção. Possui duas regiões bem diferenciadas:

uma extremidade anterior afilada e uma extremidade posterior arredondada. Na

extremidade anterior está localizado o complexo apical (SHEFFIELD; MELTON,

1968). Neste, micronemas, roptrias e grânulos densos são as três principais

organelas secretoras, encontradas predominantemente. Proteínas do micronema

são liberadas muito cedo no processo de invasão, facilitando a ligação à célula

hospedeira. Proteínas das roptrias também são liberadas durante a invasão, e

podem ser detectadas dentro do lúmen e da membrana do vacúolo parasitóforo (VP)

recentemente gerado. Proteínas dos grânulos densos são liberadas durante e após

a formação do vacúolo parasitóforo (VP), modificando o ambiente do VP para a

sobrevivência intracelular e a replicação do parasita (AJIOKA; FITZPATRICK;

REITTER, 2001). No VP eles se multiplicam rapidamente até a ruptura da célula e,

em seguida, são disseminadas as formas livres por meio dos sistemas linfático e

sanguíneo e infectam vários tecidos (DOBROWOLSKI; SIBLEY, 1996). As taxas de

invasão e crescimento variam, dependendo da estirpe de T. gondii e do tipo de

células hospedeiras (APPLEFORD; SMITH, 1997). Os taquizoítos são associados à

fase aguda da toxoplasmose. Bradizoítos: esta forma está presente nos cistos e

são morfologicamente semelhantes aos taquizoítos, mas possuem uma replicação

lenta. É a forma de resistência do T. gondii nos tecidos, encontrada durante a fase

crônica da infecção (FRENKEL, 1973). Os bradizoítos diferem ligeiramente da

estrutura dos taquizoítos. Eles são delgados, tem um tamanho menor e, geralmente,

têm um núcleo situado na extremidade posterior, em relação ao núcleo dos

taquizoítos que está localizado mais centralmente. Biologicamente são menos

20

suscetíveis a destruição por enzimas proteolíticas do que os taquizoítos (DUBEY;

BEATTIE, 1988). O tamanho de cistos é variável, mas, em média, é de 50 a 70 µm e

contém cerca de 1000-2000 bradizoítos em forma de meia-lua (WEISS; KIM, 2000).

Cistos podem ser observados em vários tecidos, mas são mais comuns no sistema

nervoso e muscular esquelético e cardíaco (DUBEY; FRENKEL, 1976). Oocisto: por

ser a forma de resistência, possui uma parede dupla bastante resistente às

condições do meio ambiente. São produzidos nas células intestinais dos felídeos

não imunes e eliminados ainda imaturos nas fezes. Os oocistos maduros contêm

dois esporocistos e oito esporozoítos que são as formas infectantes para os

mamíferos e aves e também para o ser humano (FRENKEL, 1973).

Dubey e Beattie (1988) estabeleceram três vias primárias de transmissão do

T. gondii: congênita, carnivorismo e fecal oral. Alimentos contaminados com oocistos

eliminados nas fezes por gatos, a carne mal cozida apresentando cistos, placenta,

leite não pasteurizado, ovos, transfusões sanguíneas e transplante de órgãos são

outras vias de transmissão citadas principalmente para espécie humana, porém de

menor importância.

No ciclo biológico de T. gondii (Figura 1) (DUBEY; LINDSAY; SPEER, 1998),

o gato doméstico e outros felídeos são os únicos hospedeiros definitivos (FRENKEL

et al., 1970). O homem, outros mamíferos e aves são considerados hospedeiros

intermediários. Após a ingestão dos cistos contidos nos tecidos dos hospedeiros

intermediários, principalmente pequenos mamíferos e pássaros, ocorre uma fase

assexuada (esquizogonia) que culmina com a gametogênese, onde os

microgametas fecundam os macrogametas (fase essa sexuada), denominada de

ciclo enteroepitelial. Nesta fase, o gato elimina no ambiente, cerca de 100.000

oocistos por grama de fezes, entretanto, estes oocistos devem esporular antes de se

tornarem infectantes (1 a 5 dias após a excreção). A esporulação ocorre no

ambiente, sendo dependente da temperatura e umidade; os oocistos são excretados

por apenas uma ou duas semanas, mas podem permanecer viáveis por até dois

anos devido a sua resistência aos agentes físicos e químicos. Os gatos em geral

não voltam a excretar oocistos quando reinfectados, pois desenvolvem imunidade

devido à primeira infecção (FREYRE et al. 1997; DIAS; FREIRE, 2005).

No intestino dos hospedeiros intermediários, os oocistos maduros se rompem,

liberando oito esporozoítos, que se multiplicam nos enterócitos e nódulos linfáticos,

formando os taquizoítos, que se multiplicam rapidamente. Este processo de

21

multiplicação rápida e intensa caracteriza a fase aguda da doença. Após este

período, o sistema imune atua sobre o T. gondii, e este se refugia nos tecidos

formando cistos com bradizoítos em seu interior, caracterizando a fase crônica da

infecção (DUBEY et al., 1998a). Essa forma evolutiva do parasito constitui a principal

via para o homem, que pode se infectar por meio da ingestão de carne ou vísceras

cruas ou mal cozidas contendo cistos de T. gondii (VIDOTTO et al., 1990;

NAVARRO et al., 1992).

Figura 1 - Ciclo biológico de T. gondii

Fonte: DUBEY; LINDSAY; SPEER (1998).

Estudos realizados no Uruguai apontaram a toxoplasmose como um problema

importante para os ovinos, causando prejuízos anuais de US$ 1,4 a 4,7 milhões

(FREYRE et al., 1997). Para os pequenos ruminantes, a principal via de infecção é a

ingestão de oocistos esporulados do parasito, sendo que cerca de 200 oocistos são

suficientes para determinar uma infecção em ovinos (DUBEY; BEATTIE, 1988).

Como consequência, a Nova Zelândia e alguns países europeus empregam uma

22

vacina (cepa atenuada “S48”) de taquizoítos, com o objetivo de minimizar as perdas

econômicas na produção (MONTOYA; LIESENFELD, 2004).

Estudos sorológicos sobre a frequência de anticorpos anti-T. gondii

comprovam a disseminação da toxoplasmose em ovinos e caprinos no mundo com

porcentagens de animais soropositivos que variam de 3% a 95,7%, e 3,2% a 90,9%,

respectivamente (DUBEY, 2010).

As frequências de infecção nos rebanhos de caprinos e ovinos no Brasil

também são variáveis. Segundo Fialho, Teixeira e Araújo (2009) foram observados

prevalências variando de 8% a 92,4% para caprinos, e de 7% a 55,11% para ovinos.

Esta flutuação se deve principalmente ao tipo de teste sorológico empregado, a

região estudada e a idade dos animais (DUBEY, 1990).

A infecção dos ovinos e caprinos ocorre principalmente pela ingestão

de oocistos presentes nos alimentos (pastos e rações) e solos contaminados

(NAVARRO et al., 1992; OGAWA et al., 2003; SAWADOGO et al., 2005). Entretanto,

recentemente sugeriu-se que a transmissão vertical em ovelhas persistentemente

infectadas ocorre mais frequentemente do que se pensava (BUXTON et al., 2006,

DUBEY, 2009; HIDE, 2009). Estudos utilizando PCR para confirmar a transmissão

vertical em ovinos foram realizados por Duncanson et al. (2001) no Reino Unido,

onde examinaram tecidos placentários e de fetos abortados, confirmando a

presença de T. gondii em 61% dos tecidos examinados. Williams et al. (2005)

investigaram a transmissão vertical em ovinos da raça Chaloresa durante um

período de três anos e observaram que 57,4% dos cordeiros adquiriram a infecção

antes do nascimento, onde 46,4% dos cordeiros vivos e 90,0% dos cordeiros mortos

foram positivos para T. gondii, mas não puderam concluir se a toxoplasmose ocorreu

devido à infecção primária durante a gestação ou por reativação infecção crônica

durante a gestação. Lopes et al. (2013) em experimento realizado em São Paulo,

usando PCR, diagnosticaram a presença do parasita em "pool" de tecidos de

cordeiros de uma fêmea submetida à monta natural com macho infectado com

oocistos e taquizoítos. Estes resultados demonstraram a transmissão sexual do T.

gondii na espécie ovina, com consequente transmissão vertical de seus cordeiros.

Os fatores de risco que contribuem para a infecção por T. gondii têm sido

estudados por vários pesquisadores, sendo um dos fatores mais associados à

infecção, a presença de gatos nas propriedades em contato direto com os animais

(MAINAR et al., 1996; ARAÚJO et al., 1998; STACHISSINI, 2005; ANDERLINI,

23

2011a). Entretanto, Machado e Lima (1987) e Pereira et al. (2012) não encontraram

associação significativa entre a presença do gato e a infecção pelo T. gondii.

Paralelamente, outros fatores de risco como manejo intensivo, proximidade do pasto

em relação às instalações, exploração leiteira, política de substituição de animais,

tipo de construção e material das instalações, idade e sexo dos animais

(principalmente fêmeas adultas), condições ambientais e climáticas (umidade alta,

precipitação pluviométrica características topográficas e altitude) e proximidade das

criações com áreas urbanas foram relatados por diversos autores e influenciam

diretamente o aparecimento da infecção (MACHADO; LIMA, 1987; MAINAR et al.,

1996; ALVES et al., 1997; ARAÚJO et al., 1998; SKJERVE et al., 1998; SILVA et al.,

2003; STACHISSINI, 2005; KLUN et al., 2006; ANDERLLINI, 2011a; PEREIRA et al.,

2012).

2.1.2 Patogenia e Patologia

As características da patogenicidade de T. gondii incluem a capacidade de

invadir as células, habilidade de utilizar substratos da célula hospedeira para

sobrevivência e multiplicação, persistência proliferativa ou infectante do cisto

(FRENKEL, 1961).

A manifestação dos sinais clínicos da toxoplasmose animal depende

principalmente, da resposta imune do hospedeiro infectado e da virulência da

amostra de T. gondii (LUFTZ et al.,1984).

Durante a infecção aguda, os taquizoítos podem invadir e proliferar em todas

as células nucleadas por penetração ativa e formar vacúolos parasitóforos. Depois

de repetidas replicações, as células hospedeiras são rompidas e os taquizoítos

disseminados na corrente sanguínea e podem invadir outros tecidos, incluindo o

sistema nervoso central, os olhos, músculo esquelético e cardíaco e placenta. A sua

replicação conduz à morte celular e invasão rápida de células vizinhas. O taquizoíto

provoca uma resposta inflamatória acentuada e a destruição dos tecidos e,

consequentemente, ocorre a manifestação clínica da doença (MONTOYA;

LIESENFELD, 2004).

A toxoplasmose em ovinos e caprinos manifesta-se, de maneira geral, de

forma assintomática, porém ovelhas e cabras não imunes que adquirem a infecção

24

durante a gestação podem desenvolver distúrbios reprodutivos, ocasionando perdas

econômicas consideráveis nos rebanhos como abortos, absorção fetal, fetos

mumificados, repetição de cio e neonatos mortos ou fracos, que evoluem para óbito

(MASALA et al., 2003; PEREIRA-BUENO et al., 2004).

Os índices de aborto ocasionados por T. gondii em ovelhas variam entre 0,7 e

4%, podendo a incidência no decorrer dos anos elevar-se para 12 a 17% (SILVA; LA

RUE, 2006).

O animal infectado desenvolve febre que pode durar até o 10º dia após a

infecção durante a parasitemia. Durante esta fase aguda, os linfonodos produzem

interferon gama (IFN) e há predomínio de linfócitos CD4+ e ao redor do 110º dia

pós-infecção ocorre predomínio de CD8+; nesta fase o IFN não é mais detectado

(INNES; WASTLING, 1995). Focos de necrose placentária são elevados

principalmente com o progresso da gestação. Isto pode ocorrer, devido a uma

resposta imune materna com a liberação de citocinas, podendo de certa forma

explicar a expansão progressiva característica das lesões placentárias, assumindo

um caráter multifocal (ENTRICAN; WHEELHOUSE, 2006; BUXTON et al., 2007).

Embora a infecção transplacentária ocorra em qualquer estágio da gestação,

as alterações são mais severas quando a fêmea se infecta durante a primeira

metade da mesma (DUBEY; TOWLE, 1986).

Nas ovelhas gestantes, a colonização da placenta origina diversos tipos de

manifestações clínicas em função do tempo transcorrido desde a concepção até a

infecção por T. gondii. Quando a infecção ocorre nos primeiros 70 dias de gestação,

o resultado pode ser a morte fetal seguida de reabsorção. A infecção entre 70 e 120

dias pode provocar a morte fetal seguida do aborto ou de mumificação ou permitir a

sobrevivência fetal e o nascimento de animais vivos. A infecção posterior aos 120

dias de gestação pode ocasionar o nascimento de cordeiros assintomáticos

(BARBERAN; MARCO, 1997).

Motta et al. (2008) examinaram um feto ovino abortado no Rio Grande do Sul

e na necropsia observaram focos pálidos na superfície de corte do fígado, os

pulmões estavam congestos e com aspecto marmorizado, coração pálido e severa

congestão no cérebro e cerebelo. Microscopicamente, no cérebro foram observados

cistos e taquizoítos em áreas de malácia com microgliose e infiltração

linfoplasmocitária, sugestivos de encefalite toxoplásmica; pneumonia intersticial,

necrose hepática centrolobular com estruturas compatíveis com taquizoítos;

25

miocardite linfocitária focal e nefrose tubular aguda também foram observadas. A

imunohistoquímica foi positiva para T. gondii. Achados histopatológicos semelhantes

foram relatados por Pescador et al. (2007) também no Rio Grande do Sul, em fetos

caprinos decorrentes de abortos, natimortos e neonatos, onde lesões macroscópicas

foram observadas em dois de seis produtos caprinos, que incluíram linfonodos

mesentéricos pálidos e aumentados e pulmões com consistência firme e áreas

claras intercaladas com vermelhas. Lesões histológicas, especialmente

caracterizadas por infiltrado linfoplasmocitário no cérebro e pulmões; nefrite

intersticial linfoplasmocitária, linfadenite necrosante e hepatite periportal

linfoplasmocitária foram observadas em todos os fetos e apenas um feto foi positivo

na IHQ.

2.1.3 Diagnóstico

O diagnóstico laboratorial da toxoplasmose é fundamental, uma vez que, a

infecção pode assumir quadros clínicos facilmente confundidos com uma gama de

outras enfermidades, dificultando a tomada de medidas específicas de tratamento e

controle (VIDOTTO, 1992). De acordo com revisão realizada por Silva et al. (2002)

inúmeros testes sorológicos têm sido propostos para determinar a presença de

anticorpos anti-T. gondii; Fulton e Turk (1959) foram os primeiros a descrever um

teste de aglutinação, que não logrou sucesso devido baixa especificidade e a

necessidade de grande número de taquizoítos em cada teste. Posteriormente,

Couzineau; Baufineducrocq (1970) e Desmonts, Remington (1980) melhoraram

sensivelmente a reprodutibilidade e a sensibilidade do método (SILVA et al., 2002).

Algumas metodologias são utilizadas preferencialmente no diagnóstico da

toxoplasmose ovina e caprina e consistem na pesquisa de anticorpos das classes

IgM e IgG para determinar a fase da infecção. Dentre as técnicas sorológicas

empregadas no diagnóstico da toxoplasmose com grande eficiência e rapidez pode-

se citar: a técnica de Sabin-Feldman; a Reação de Imunofluorescência Indireta

(RIFI), a hemaglutinação (HA); a Fixação do Complemento (FC), o Ensaio

Imunoenzimático (ELISA) e o “Immunosorbent Agglutination Assay” (ISAGA)

(UCHOA et al., 1999).

26

Na espécie ovina, Ljungström et al. (1994) compararam o teste de aglutinação

direta com a reação de imunofluorescência indireta, encontrando especificidade e

sensibilidade de 100,0%.

A pesquisa de anticorpos IgG e IgM pelo teste de Hemaglutinação Indireta

(HAI), de hemaglutinação indireta/2-mercaptoetanol (HAI/2 ME) e a pesquisa de IgG

pelo método de Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), em análises

sequenciais de amostras de soros, têm sido utilizadas para o diagnóstico de

toxoplasmose congênita. A produção da IgM aparece inicialmente, caracterizando a

fase aguda da enfermidade, seguida de IgG, que aparece mais tardiamente. Os

títulos de IgG se mantêm constantes ou ascendentes se houver a infecção,

decrescendo ou até desaparecendo em prazo de poucos meses, no caso da

transmissão passiva de anticorpos pelo colostro (DUBEY et al., 1987).

O isolamento de T. gondii em fetos de ovinos e caprinos abortados e em

membranas fetais é feito por inoculação em camundongos. Os melhores tecidos

para inoculação são o cérebro fetal e cotilédones da placenta e se obtêm melhores

resultados com amostras e frescas livres de contaminação (OIE, 2008).

Diferentes técnicas têm sido utilizadas para detectar a infecção em fetos

abortados. No diagnóstico de aborto de ovinos induzido por T. gondii, placenta e

cérebro fetal são os tecidos preferidos para exame histológico, embora, em alguns

casos, as lesões associadas com toxoplasmose não são detectadas (UGGLA;

SJÖLAND; DUBEY, 1987; DUBEY et al., 1990a), podendo esta ser combinada ou

não com análise imuno-histoquímica (IHQ) de tecidos positivos (UGGLA; SJÖLAND;

DUBEY, 1987).

A confirmação de estruturas semelhantes a T. gondii em cortes histológicos

pode ser conseguida por IHQ que identifica o parasito ou detritos antigênicos. A IHQ

é um método sensível que pode ser realizada com tecidos já fixados e arquivados ou

com algum grau de decomposição, onde o isolamento poderia não ser apropriado ou

possível (OIE, 2008).

Segundo Uggla, Sjöland e Dubey (1987), a histopatologia para diagnóstico da

toxoplasmose não é um teste decisivo, pois não é adequado para fetos severamente

decompostos devido à autólise que dificulta o diagnóstico quando apenas alguns

protozoários estão presentes. Além disso, os taquizoítos ou cistos são muitas vezes

difíceis de identificar, especialmente quando presentes em número reduzido. Mesmo

em lesões, é difícil avaliar o número de parasitas presentes. A IHQ utilizando

27

anticorpos específicos e imunocoloração identificam os parasitas quando estão

presentes na amostra (WAREE et al., 2007).

Avanços recentes no conhecimento do genoma do T. gondii tornaram

possível a utilização da PCR para a detecção do parasito (KOMPALIC-CRISTO;

BRITTO; FERNANDES, 2005). Burg et al. (1989) demonstraram alta sensibilidade

da PCR na detecção de apenas um parasito presente no lisado celular usando o

gene B1 como alvo de amplificação. Esta combinação de sensibilidade e

especificidade para detectar o gene B1 na PCR é um método muito útil para o

diagnóstico da toxoplasmose tanto em hospedeiros imunocomprometidos como em

fetos congenitamente infectados.

Diferentes técnicas de PCR, também têm sido utilizadas para detectar DNA

de T. gondii em fluidos e tecidos de fetos abortados (OWEN; CLARKSON; TREES,

1998; HURTADO et al., 2001).

2.2 Neosporose

A neosporose é uma enfermidade parasitária abortiva causada pelo Neospora

caninum um parasito antigenicamente distinto do T. gondii (DUBEY, 2003).

2.2.1 Etiologia, Ciclo Biológico e Epidemiologia

O gênero Neospora está incluído no filo Apicomplexa, classe Sporozoasida,

ordem Eucoccidiorida, família Sarcocystidae juntamente com os gêneros

Toxoplasma e Sarcocystis (LEVINE, 1985).

N. caninum foi diagnosticado pela primeira vez em um caso de encefalopatia

em cães que parecia estar associada a um parasito semelhante ao T. gondii. Este

parasito foi isolado em amostras de cérebro e músculo de cães naturalmente

infectados na Noruega (BJERKAS et al., 1984).

Em 1988, nos Estados Unidos foi isolado um parasito similar em amostras

procedentes de dez cães com alterações neurológicas e até então a única forma de

identificação utilizada era a morfologia dos cistos (DUBEY, 1988). Posteriormente,

com a utilização de técnicas sorológicas e imuno-histoquímica foi possível descrever

esse novo parasito que apresentava características distintas do T. gondii. Dubey et

28

al. (1988a) isolaram pela primeira vez N. caninum em cultivo celular e em

camundongos e desenvolveram um teste de Imunofluorescência Indireta para o

diagnóstico sorológico da doença.

Ainda nessa década, a neosporose passou a ser incriminada como causa de

abortos na espécie bovina (THILSTED; DUBEY, 1989) e mais tarde foi considerada

a principal causa de abortos e mortalidade neonatal nessa espécie em algumas

regiões do mundo (ANDERSON et al., 1997). Em todo o mundo, esses abortos são

uma importante causa de perdas econômicas tanto para as indústrias de laticínios,

como para a de carne bovina (LARSON; HARDIN; PIERCE, 2004). A perda

econômica na maioria das fazendas é estimada em 2-5% ao ano, mas,

ocasionalmente, pode chegar a 20% ao ano. Na Austrália, a perda anual é estimada

em US$ 100 milhões (REICHEL; ELLIS, 2006, 2008). Os resultados dos

levantamentos realizados por REICHEL et al. (2013) determinaram que o custo

anual por aborto/infecção por N. caninum é estimado em US$ 1,1 milhões para

indústria de carne na Nova Zelândia e uma estimativa média total de US $546,3

milhões de impacto por ano na produção leiteira nos Estados Unidos.

O ciclo biológico (Figura 2) é representado por três estágios infecciosos:

taquizoítos, cistos teciduais e oocistos (DUBEY, 2003). Os taquizoítos e os cistos

teciduais são os estágios encontrados nos hospedeiros intermediários e ocorrem

intracelularmente (Dubey et al., 2002). Os taquizoítos medem cerca de 6 x 2 µm, têm

forma ovoide, lunar ou globular e dividem-se em dois zoítos por endodiogenia. Nos

animais infectados, os taquizoítos podem ser encontrados em várias células do

sistema nervoso central, em macrófagos, fibroblastos, células endoteliais, miócitos,

células tubulares renais e hepatócitos (DUBEY; LINDSAY, 1996).

Os cistos teciduais apresentam forma arredonda ou oval e medem até 107 µm

de comprimento e são encontrados primariamente no sistema nervoso central

(SNC). A parede do cisto mede até 4 µm de espessura e dentro contêm os

bradizoítos com 7-8 X 2 µm (PETERS et al., 2001). O estágio resistente ambiental

do parasito é o oocisto excretado nas fezes dos hospedeiros definitivos na forma

não esporulada (DUBEY; SCHARES; ORTEGA-MORA, 2007).

Os cães domésticos são os hospedeiros definitivos do parasito e assumem

um papel fundamental no ciclo de transmissão deste agente para outros animais.

Quando infectados, eliminam oocistos nas fezes, contaminando o ambiente, muitas

vezes sem apresentar sinais clínicos da doença (MCALLISTER et al., 1998). Além

29

dos cães, a raposa cinza (Urocyon cinereoargenteus) (BARLING et al., 2001), os

coiotes (Canis latrans) (GONDIM et al., 2004), lobos-guará (Chrysocyon brachyurus)

(SILVA, 2006), dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al., 2010) e lobo cinza

(Canis lupus) (DUBEY et al., 2011), também foram recentemente incriminados como

hospedeiros definitivos do N. caninum.

Várias espécies foram descritas como hospedeiros intermediários do N.

caninum como os bovinos (THILSTED; DUBEY, 1989), caprinos (BARR et al., 1992;

DUBEY; ACLAND; HAMIR, 1992), ovinos (DUBEY; KOESTNER; PIPER, 1990),

cervídeos (WOODS et al., 1994; DUBEY et al., 1996), bubalinos (RODRIGUES et

al., 2004), equinos, (CHEADLE et al., 1999), alpacas, lhamas e vicunha (WOLF et

al., 2005), camelos (HILARI et al., 1998; HOSSEININEJAD; PIRALI-KHEIRABADI;

HOSSEINI, 2009), bisão (CABAJ et al., 2005), caribu e alce (DUBEY; THULLIEZ,

2005), marsupiais (YAI et al., 2003), pardais (GONDIM et al., 2010), javalis

(BÁRTOVÁ; SEDLÁK; LITERÁK, 2006), lagomorfos (ALMERÍA et al., 2007), raposa

vermelha (ALMERÍA et al., 2002; MARCO et al., 2008), raposa cinzenta (LINDSAY;

WESTON; LITTLE., 2001), lobo cinza (BJÖRKMAN et al., 2010), rinoceronte

(SANGSTER et al., 2010), galinha (COSTA et al.,2008), capivara (TRUPPEL et al.,

2010), urubus (DARWICH et al., 2011).

O ciclo biológico de N. caninum compreende duas fases (sexuada e

assexuada). A primeira ocorre no hospedeiro definitivo após a ingestão de tecidos

contendo cistos de N. caninum em restos de placenta e fetos abortados. A segunda

ocorre no hospedeiro intermediário, inclusive no cão, por meio da ingestão de

oocistos esporulados liberados nas fezes do hospedeiro definitivo. Nesta fase, os

taquizoítos, bradizoítos e cistos se localizam em diferentes tecidos e órgãos como

cérebro, medula espinhal, nervos, fígado, músculos cardíacos, esqueléticos e

oculares (DUBEY; LINDSAY, 1996). A destruição das células do hospedeiro pelos

taquizoítos depende da capacidade deste penetrar e se multiplicar dentro delas e a

capacidade do hospedeiro inibir a sua multiplicação (BUXTON et al., 2002).

Nos ovinos, o primeiro relato da neosporose congênita foi feito por Dubey et

al. (1990b) em um cordeiro de sete dias de idade onde foram identificados cistos na

medula espinhal e no cérebro, confirmados com o uso de IHQ e microscopia

eletrônica de transmissão.

Dubey e Lindsay (1990) induziram o aborto em ovelhas experimentalmente

infectadas por N. caninum. As fêmeas não apresentaram lesões microscópicas, mas

30

os cordeiros abortados mostraram lesões no sistema nervoso central e músculo

esquelético, onde se observou: encefalomielite caracterizada por múltiplos focos de

gliose, hemorragia, necrose, manguitos perivasculares e infiltrações de células

mononucleares; miosite com pequenos focos de necrose de miócitos e infiltrações

de células mononucleares no perimísio. Taquizoítos também foram observados no

SNC e nos miócitos; placentite com necrose e mineralização das vilosidades

cotiledonares. As lesões relatadas neste experimento foram idênticas às provocadas

por T. gondii.

Vários estudos com infecções experimentais mostraram a sensibilidade de

ovinos e caprinos ao N. caninum. Ovelhas gestantes foram inoculadas com

taquizoítos de N. caninum e apresentaram aborto, natimorto, nascimento de

cordeiros clinicamente afetados ou saudáveis. Este resultado depende do período

gestacional quando ocorre a infecção e a dose infectante inoculada (MCALLISTER

et al., 1996, BUXTON et al., 1997, BUXTON et al., 1998, BUXTON et al., 2001,

WESTON et al., 2009).

Neospora–like foi encontrada em um cordeiro de uma semana de idade na

Inglaterra por Hartley e Bridge em 1975, constituindo historicamente como o primeiro

caso de infecção em um ruminante. O animal apresentou ataxia, movimentos de

pedalagem e incapacidade para se levantar e morreu uma semana após o

nascimento. À necropsia foram observadas encefalomielite não supurativa e

numerosos cistos de parede espessa associados à lesão neural (DUBEY, 1990b).

31

Figura 2 - Ciclo biológico de N. caninum

Fonte: DUBEY; SCHARES; ORTEGA-MORA (2007).

Kobayashi et al. (2001) descreveram um caso de neosporose natural em

ovelhas no Japão e obtiveram o primeiro isolado do N. caninum em ovelha gestante

neste país. Observaram, em uma fêmea assintomática, cistos no cérebro e gliose

focal com manguitos de células mononucleares e no cérebro dos seus fetos, uma

reação inflamatória envolvendo manguitos perivasculares de células mononucleares

e nódulos gliais. O DNA de N. caninum foi detectado através de PCR no cérebro de

um dos fetos.

Dados da literatura internacional mostraram uma variação na soroprevalência.

Nasir et al. (2012), em diferentes áreas da província de Punjab e Azad Kashmir no

Paquistão realizaram estudo transversal em ovinos e caprinos, utilizando um ELISA

competitivo; 27,7% e 8,6% de ovinos e caprinos foram positivos, respectivamente

com diferença significativa entre os resultados obtidos para as espécies.

32

Anastasia et al. (2013) também estudaram a soroprevalência de N. caninum

em pequenos ruminantes na Grécia em rebanhos mistos de caprinos e ovinos. IgG

contra N. caninum foi observada em 16,8% e 6,9% das ovelhas e cabras,

respectivamente. As ovelhas apresentaram maior soroprevalência em relação às

cabras (p <0,05). De acordo com Dubey e Lindsay (1996), a razão para uma maior

prevalência de infecção nas ovelhas pode ser correlacionada a uma maior

suscetibilidade desta espécie.

No Brasil, Socorras et al. (2002) demonstraram que ovelhas deslanadas são

suscetíveis à infecção experimental por N. caninum e a infecção intrauterina dos

fetos resulta no nascimento de cordeiros clinicamente normais, porém

congenitamente infectados.

Romanelli (2002) realizaram estudo epidemiológico no município de

Guarapuava, Paraná, utilizando a RIFI em 305 amostras de soro de ovino e

observaram 9,5% de reações positivas com ponto de corte de 1:100.

Figliuolo et al. (2004) examinaram na RIFI (ponto de corte 1:50), 597

amostras de soro de ovinos no estado de São Paulo, obtendo reação positiva em

9,2% dos animais estudados.

Na Bahia, a ocorrência de anticorpos IgG anti-N. caninum foi determinada em

282 amostras de ovinos de 10 rebanhos pelo teste de Imunofluorescência Indireta e

se observou 7,4% de reações positivas com ponto de corte de 1:50. Dos rebanhos

estudados, seis apresentaram ovinos sororreagentes com positividade variando de

2,5 a 32,0% (OTERO et al., 2005).

Em Alagoas, Faria et al. (2010) estudaram os fatores de risco associados à

infecção por N. caninum em rebanhos ovinos e identificaram que o tamanho da

propriedade ( 30 ha) e a fonte de água (municipais, poço e cursos de água) foram

os fatores mais significativos. Além disto, observaram soropositividade em 9,6% dos

animais na RIFI e 53,8% dos rebanhos apresentaram pelo menos um animal

positivo.

Anderlini et al. (2011b) investigando a prevalência de anticorpos anti-N.

caninum em caprinos em Alagoas observaram 5,3% das amostras positivas. Embora

não tenham identificado fatores de risco estatisticamente significativos relacionados

à infecção, a existência de focos demonstra que a presença do parasito nos

criatórios.

33

Tembue et al. (2011) realizaram inquérito sorológico para detecção de

anticorpos contra N. caninum em caprinos e ovinos no município de Ibimirim-PE e na

RIFI obteve-se 26,6% (85/319) das cabras e 64,2% (52/81) das ovelhas positivas. A

reatividade sorológica foi associada à idade em caprinos (p <0,01) e ovelhas (p>

0,05), com taxas crescentes em animais mais velhos, indicando a exposição a N.

caninum entre pequenos ruminantes na área de estudo.

Em alguns casos, a neosporose está associada com aborto, mortalidade

neonatal e sinais clínicos em ovinos adultos (DUBEY; SCHARES, 2011). Além disso,

há estudos que indicam a transmissão transplacentária de N. caninum através da

detecção de DNA do parasita no cérebro de fetos abortados (HOWE et al., 2012).

Estudos demonstraram a presença do DNA de N. caninum em 19,5% de 118

abortos ovinos na Nova Zelândia (HOWE et al., 2012); em 2% de 292 abortos ovinos

e em 8,6% de 31 abortos caprinos na Itália (MASALA et al., 2007), sugerindo um

papel importante de N. caninum no aborto em caprinos e ovinos, embora o

envolvimento direto do parasito nos abortos mediante as lesões histológicas não

tenha sido confirmado nestes estudos. Moreno et al. (2012), analisaram 100 abortos

ovinos e caprinos de várias regiões da Espanha e detectaram a presença de N.

caninum em 6,8% dos fetos ovinos e 11,5% de fetos caprinos; a maioria com lesões

características, confirmando a implicação direta de N. caninum no aborto. No

entanto, novos estudos são necessários para averiguar as implicações da infecção

natural por N. caninum em distúrbios reprodutivos em pequenos ruminantes.

Na espécie caprina, cistos teciduais de Neospora-like também foram

identificados em fetos de cabras “anãs” na Califórnia e Pensilvânia com sinais de

encefalite nos fetos examinados onde também foram identificados cistos deste

protozoário (BARR et al., 1992).

As medidas de controle aplicadas para combater a infecção congênita é a

redução do número de animais infectados mediante o descarte e reposição seletiva

(THURMOND; HIETALA, 1995). A água e os alimentos devem ser protegidos da

contaminação com fezes de cães; que os cães sejam impedidos de comer carne

crua e seus produtos, assim como fetos abortados, membranas fetais e animais

mortos é também necessário limitar o acesso dos cães às áreas de pasto e outras

dependências destinadas ao manejo animal (CALIL, 2009).

Fetos abortados e bezerros infectados podem conter cistos viáveis do

parasito em vários tecidos e suas carcaças podem servir como fonte de infecção

34

para cães (MCALLISTER, 1999). Além da transmissão horizontal, também pode

ocorrer à transmissão vertical por via transplacentária (ANDERSON et al., 1997;

BARBER; TREES, 1998).

2.2.2 Patogenia e Patologia

De acordo com dados revisados por Georgieva, Prelezov e Koinarski (2006),

a neosporose em ovinos é inadequadamente estudada, pois os fatores de risco que

influenciam a infecção e abortos relacionados ao nível da exploração ainda não

foram completamente identificados. Os ovinos se infectam com oocistos do N.

caninum e as fêmeas gestantes são mais suscetíveis à infecção experimental com

taquizoítos (DUBEY; LINDSAY, 1990; MCALLISTER et al., 1998; JOLLEY et al.,

1999; BUXTON et al., 2002). Os abortos e as mortes embrionárias ocorrem 25-30

dias após a infecção. Podem ser observadas lesões no cérebro, medula espinhal,

musculatura e placenta. A encefalite se caracteriza por múltiplos focos, hemorragia e

necrose. Nos estágios mais avançados da gestação (65, 90 e 130 dias), as fêmeas

abortam ou dão origem a fetos fracos ou clinicamente normais. Lesões no cérebro,

placenta, coração, fígado e pulmões são observadas e os fetos podem estar

autolisados ou mumificados. Cistos teciduais também são observados no cérebro.

No sistema nervoso central, as lesões macroscópicas podem ocorrer na

substância branca ou cinzenta. Podem iniciar com focos de hemorragia e necrose, e

em alguns casos, a substância branca perivascular pode ser mais afetada. A

superfície de corte apresenta consistência granular e coloração amarelo-

amarronzado a cinza. Na fase crônica, esta área pode apresentar mudanças na

coloração, que frequentemente levam a dificuldade em diferenciar a substância

branca e cinzenta. Na microscopia, as lesões são semelhantes às observadas na

toxoplasmose (MCGAVIN; ZACHARY, 2009).

Estudos sobre os efeitos da neosporose induzida em ovinos foram

conduzidos utilizando isolado do N. caninum de cães (MCALLISTER et al., 1998) e

foi demonstrado que infecções no início da gestação (65 dias) resultaram em aborto

em todos os animais, enquanto que em gestações avançadas (120 dias) resultaram

em animais clinicamente normais. Estes estudos comprovaram que o período da

gestação é importante, indicando uma resposta imune por parte do feto no terço final

35

da gestação. Encontraram cistos do protozoário em 38% dos fetos abortados,

enquanto que 39% dos animais infectados congenitamente apresentaram-se

clinicamente sadios. Semelhante ao que ocorre na infecção natural, os cistos não

foram encontrados fora do sistema nervoso central.

Pena et al. (2007) isolaram o N. caninum de cordeiros naturalmente

infectados com títulos de anticorpos contra o parasito e demonstraram pela primeira

vez no Brasil a infecção de cães com cistos teciduais de cérebro de ovinos.

Os achados histopatológicos variam de acordo com a infecção natural ou

experimental. Sasani et al. (2013) observaram fetos ovinos abortados, gliose

multifocal, infiltrado mononuclear, nódulos gliais múltiplos e dispersos, hiperemia

severa, hemorragias focais, trombos nos vasos cerebrais e meningite com infiltração

de células inflamatórias como linfócitos, monócito e neutrófilos. Bishop et al. (2010)

detectaram na histologia do cérebro e medula espinhal em ovelha com alteração

neurológica, a presença de meningoencefalite não supurativa aguda grave e leve a

moderada mielite não supurativa, mesencéfalo do colículo rostral com edema

multifocal e necrose acompanhada de moderada a severa vasculite multifocal e

gliose; ainda relataram numerosos nódulos gliais no cérebro e ao longo da medula

espinhal.

2.2.3 Diagnóstico

Lesões histopatológicas no feto e placenta devido à infecção por N. caninum

são indistinguíveis daquelas causadas por T. gondii (BUXTON et al., 1997). A partir

do advento de métodos imuno-histoquímicos e moleculares para o diagnóstico, os

dois protozoários puderam ser diferenciados (HARKINS et al., 1998; BASZLER et

al., 1999).

Para bovinos, o cérebro, coração, fígado, placenta e fluidos corporais ou soro

sanguíneo fetal são as melhores amostras para diagnóstico e as taxas de

diagnóstico são mais elevadas se vários tecidos são examinados. A

imunohistoquímica também é necessária, porque geralmente há apenas alguns N.

caninum presente nos tecidos autolisados e estes muitas vezes não são visíveis nas

seções de tecido coradas pelo HE (DUBEY; BUXTON; WOUDA, 2006).

36

O diagnóstico da infecção é realizado utilizando-se mais de uma técnica

(JENKINS et al., 2000). A técnica de referência em fetos abortados é o exame

histopatológico dos tecidos fetais (DUBEY, 2003). A observação de lesões como

encefalite não supurativa, miocardite hepatite, placentite, entre outras permite um

diagnóstico presuntivo do aborto por N. caninum (BARR et al., 1992).

A imunohistoquímica (IHQ) é pouco sensível para detectar o parasito em

tecidos hospedeiros devido ao baixo número de parasitos, e, algumas vezes à baixa

qualidade do tecido fetal que pode estar autolisado, mumificado ou macerado

(BASZLER et al., 1999).

A IHQ é uma técnica específica e sensível que, combinado com o exame

histológico, melhora consideravelmente a precisão do diagnóstico. Em infecções por

protozoários, tais como N. caninum, ensaios de IHC são particularmente úteis

porque os exames histológicos podem falhar na detecção de cistos e taquizoítos. As

lesões histológicas causadas por N. caninum são difíceis de diferenciar daquelas

causadas por T. gondii, e a IHC é necessária para confirmar o diagnóstico. Uma

desvantagem do IHC é que os anticorpos policlonais podem causar reação cruzada

com antígenos não alvos (PINTO et al., 2012).

Uma das técnicas mais utilizadas ultimamente no diagnóstico em estudos

epidemiológicos e filogenéticos é a reação em cadeia da polimerase (PCR) para a

detecção do material genômico do parasito nos tecido fetais (COLLANTES-

FERNANDEZ et al., 2002).

Para a pesquisa de anticorpos nos animais adultos são utilizadas as técnicas

de Imunofluorescência Indireta (RIFI), como prova de referência, o Ensaio

Imunoenzimático (ELISA) (BJÖRKMAN; UGLA, 1999) e o Teste de Aglutinação

(DUBEY; LINDSAY, 2006). A presença de anticorpo de N. caninum no soro fetal

pode confirmar a infecção, mas um resultado negativo não é decisivo, porque a

síntese de anticorpo no feto é dependente da fase de gestação, o nível de exposição

e o tempo entre infecção e aborto (DUBEY, 2003).

Há várias modificações do teste ELISA para detectar anticorpos de N caninum

em soro ou leite usando parasita inteiro, lisado de parasitas inteiros, proteínas

purificadas, proteínas recombinantes e proteínas de taquizoítos absorvidas em

partículas de complexos imunoestimulados; alguns destes ensaios foram

comparados em um estudo multicêntrico em vários laboratórios da Europa

(BLUMRÖDER et al., 2004)

37

Encontrar anticorpos N. caninum no soro do feto pode estabelecer infecção,

mas um resultado negativo não é informativo, porque a síntese de anticorpo no feto

é dependente da fase de gestação, o nível de exposição e o tempo entre a infecção

e o aborto (DUBEY; LINDSAY, 2006).

Além dos testes sorológicos, ainda pode ser realizado o isolamento do

parasito em cultivo celular ou em animais de laboratório (LINDSAY; DUBEY, 1989).

Inoculações em cultivo celular e em camundongos podem ser utilizadas para

recuperar N. caninum de tecidos animais (Dubey et al., 1988b). O sucesso de

isolamento depende do número de parasitos presentes e do estado de autólise da

amostra. Conrad et al. (1993a), usando cultura de células, isolaram N. caninum em

apenas dois dos mais de 100 fetos bovinos examinados, com suspeita de aborto por

N. caninum, demonstrando a dificuldade de diagnóstico de abortos por N. caninum.

38

3 OBJETIVOS

3.1 GERAL

Pesquisar a presença de Toxoplasma gondii e Neospora caninum em

pequenos ruminantes por meio de técnicas imunológicas, molecular e

histopatológica.

3.2 ESPECÍFICOS

1. Verificar a frequência de anticorpos anti-Toxoplasma gondi e anti-Neospora

caninum em pequenos ruminantes através da Reação de Imunofluorescência

Indireta (RIFI);

2. Identificar Toxoplasma gondii e Neospora caninum por meio da Reação em

Cadeia da Polimerase (PCR) e Imunohistoquímica em tecidos de pequenos

ruminantes;

3. Detectar lesões e cistos sugestivos de infecção por Toxoplasma gondii e

Neospora caninum por meio de Histopatologia em tecidos de pequenos ruminantes;

4. Verificar a transmissão vertical de Toxoplasma gondii e Neospora caninum em

fetos ovinos e caprinos;

5. Avaliar a concordância entre as técnicas de diagnóstico direto para identificar a

infecção de Toxoplasma gondii e Neospora caninum em pequenos ruminantes.

39

4 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AJIOKA, J.W.; FITZPATRICK, J.M.; REITTER, C.P. Toxoplasma gondii genomics: shedding light on pathogenesis and chemotherapy. Expert Reviews in Molecular Medicine, v.6, p.1-19, jan., 2001.

ALMERÍA, S. et al. Red foxes (Vulpes vulpes) are a natural intermediate host of

Neospora caninum. Veterinary Parasitology, v. 107, n. 4, p. 287-294, aug., 2002.

ALMERÍA, S. et al. Seroprevalence of Neospora caninum in non-carnivorous wildlife

from Spain. Veterinary Parasitology, v. 143, n. 1, p. 21-28, jan., 2007.

ALVES, C.J. et al. Avaliação dos níveis de aglutininas anti-toxoplasma em soros de caprinos de cinco centros de criação do nordeste do Brasil. Revista Brasileira de Ciência Veterinária, v. 4, n. 2, p. 75-77, 1997.

ANASTASIA, D. et al. Toxoplasma gondii and Neospora caninum seroprevalence in dairy sheep and goats mixed stock farming. Veterinary Parasitology, v. 198, p. 387-

390, 2013.

ANDERLINI, G.A. et al. Occurrence and risk factors associated with infection by Toxoplasma gondii in goats in the State of Alagoas, Brazil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 44, n. 2, p. 157-162, mar.-apr., 2011a.

ANDERLINI, G.A. et al. Prevalência de anticorpos anti-Neospora caninum em caprinos no estado de Alagoas, Brasil. Veterinária e Zootecnia, v. 18, n. 4, p. 583-

590, 2011b.

ANDERSON, M.L. et al. Evidence of vertical transmission of Neospora sp infection in dairy cattle. Journal of the American Veterinary Medical Association, Chicago, v.

210, n. 8, p. 1169-1172, apr., 1997.

APPLEFORD, P.J.; SMITH, J.E. Toxoplasma gondii: the growth characteristics of three virulent strains. Acta Tropical, v. 65, p.97–104, may., 1997.

ARAÚJO, F.R. et al. Levantamento sorológico para Toxoplasma gondii em caprinos na microrregião de Campo Grande, Mato Grosso do Sul. Revista Ensaios e Ciência, v.2, n.2, p.141-148, 1998.

40

BARBER, J.S.; TREES, A.J. Naturally occurring vertical and transmission of Neospora caninum in dogs. International Journal of Parasitology, v. 28, n. 1, p. 57-64, jan., 1998.

BARBERAN, M.; MARCO, J.C. Patogenia, cuadro clínico y lesional. Tratado de Patologia y Produccion Ovina, n.52, p.35-49, 1997.

BARLING, K.S. et al. Ranch-Management factors associated with antibody seropositivity for Neospora caninum in consignments of beef calves in Texas, USA. Preventive Veterinary Med., v. 52, p. 53-61, nov., 2001.

BARR, B.C. et al. Neospora-like protozoal infections associated with abort in goats. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v. 4, n. 3, p. 365-367, 1992.

BÁRTOVÁ, E.; SEDLÁK, K.; LITERÁK, I. Prevalence of Toxoplasma gondii and Neospora caninum antibodies in wild boars in the Czech Republic. Veterinary Parasitology, v. 142, n. 1-2, p.150-153, nov., 2006.

BASZLER,T.V. et al. Detection by PCR of Neospora caninum in foetal tissues from spontaneous bovine abortions. Journal of Clinical Microbiology, v.37, p. 4059–4064, 1999.

BERVELEY, J.K.; WATSON, W.A. Ovine abortion due to toxoplasmosis. Nature,

v.184, p.2041, 1959.

BISHOP, S. et al The first report of ovine cerebral neosporosis and evaluation of Neospora caninum prevalence in sheep in New South Wales. Veterinary Parasitology, v.170, n. 1–2, p. 137–142, 2010.

BJERKAS, I. et al. Unidentified cyst-forming Sporozoon causing encephalomyelitis and myositis in dogs. Zeitschrift für Parasitenkunde, Berlin, v. 70, n. 2, p. 271-274,

1984.

BJÖRKMAN, C.; UGGLA, A. Serologycal diagnosis of Neospora caninum infection. International Journal for Parasitology, v. 29, n. 10, p. 1497-1507, 1999.

BJÖRKMAN, C. et al. Seroprevalence of Neospora caninum in gray wolves in Scandinavia. Veterinary Parasitology, v. 173, n. 1-2, p. 139-142, 2010.

http://www.sciencedirect.com/science/journal/03044017


http://www.sciencedirect.com/science/journal/03044017/170/1

41

BLUMRÖDER, D.V. et al. Comparison and standardisation of serological methods for the diagnosis of Neospora caninum infection in bovines. Veterinary Parasitolology, v.120, n.1-2, p.11-22, 2004.

BURG, J.L. et al. Direct and Sensitive Detection of a Pathogenic Protozoan, Toxoplasma gondii, by Polymerase Chain Reaction. Journal of Clinical Microbiology, v.27, n.8, p. 1787-1792, 1989.

BUXTON, D. et al. Experimental Infection of Non-pregnant and Pregnant Sheep with Neospora caninum. Journal of Comparative Pathology, v.17, p.1-16, 1997.

BUXTON, D. et al.1998 The Pathogenesis of Experimental Neosporosis in Pregnant Sheep. Journal of Comparative Pathology, v.118, p.267-279, 1998.

BUXTON, D. et al. Immunity to experimental neosporosis in pregnant sheep. Parasite Immunology, v.23, p.85-91, 2001.

BUXTON, D. et al. Toxoplasmosis: The possibility of vertical transmission. Small Ruminant Research, v.62, p.43–46, 2006.

BUXTON, D. et al. Toxoplasma gondii and ovine toxoplasmosis: New aspects of an old story. Veterinary Parasitology, v.149, p.25–28, 2007.

BUXTON, D., MCALLISTER, M.M.; DUBEY, J.P. The comparative pathogenesis of neosporosis. Trends in Parasitology, v.18, n.12, p. 546-552, dec., 2002

CABAJ, W. et al. Antibodies to Neospora caninum in the blood of European bison (Bison bonasus bonasus L.) living in Poland. Veterinary Parasitology, v. 128, n. 1-2, p. 163-168, 2005.

CALIL, R. S. Epidemiologia da neosporose canina e suas implicações na clínica médica de pequenos animais Disponível em:<qualittas.com.br/uploads/documentos/Epidemiologia%20da%20Neoporose%20Canina%20-%20Renata%20Shimada%20Calil.PDF >. Acesso em: 01 jan 2009.

CAVALCANTE, A. C. R.; BARROS , N. N. Sistema de Produção de Caprinos e Ovinos de Corte para o Nordeste Brasileiro Disponível em:<

http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/CaprinoseOvinosdeCorte/CaprinosOvinosCorteNEBrasil/index.htm>. Acesso em: 22 dez. de 2013

42

CHEADLE, M. A. et al. Prevalence of antibodies to Neospora sp. in horses from Alabama and characterization of an isolate recovered from a naturally infected horse. International Journal of Parasitology, v. 29, p.1537–1543, 1999.

COLLANTES-FERNÁNDEZ, E. et al. Quantitative Detection of Neospora caninum in Bovine Aborted Fetuses and Experimentally Infected Mice by Real-Time PCR. Journal of Clinical Microbiology, v. 40, n. 4, p. 1194-1198, 2002.

CONRAD, P.A. et al. In vitro isolation and characterization of a Neospora sp. from aborted bovine foetuses. Parasitology, v. 106, p. 239-249, 1993.

COSTA, K.S. et al. Chickens (Gallus domesticus) are natural intermediate hosts of Neospora caninum. International Journal for Parasitology, v.38, n.2, p.157-159,

2008.

DARWICH, L. et al. . Presence of Toxoplasma gondii and Neospora caninum DNA in the brain of wild birds. Veterinary Parasitology, v.183, n.3-4, p.377-381, 2011.

DIAS, R.A.F., FREIRE R.L. Surtos de toxoplasmose em seres humanos e animais. Semina: Ciências Agrárias, v.26, n.2, p.239-247, 2005.

DOBROWOLSKI, J.M.; SIBLEY; L.D. Toxoplasma invasion of mammalian cells is powered by the actin cytoskeleton of the parasite. Cell, v.84, p. 933-939, 1996.

DUBEY, J.P. Toxoplasmosis. Journal of American Veterinary Medical Association, v. 205, n. 11, p. 1593-1598, 1990.

DUBEY, J.P. Review of Neospora caninum and neosporosis in animals. The Korean Journal of Parasitology, Seoul, v. 41, n. 1, p. 1-16, mar., 2003.

DUBEY, J.P. Toxoplasmosis in sheep—The last 20 years. Veterinary Parasitology, v. 163, p. 1–14, 2009

DUBEY, J.P. Toxoplasmosis of animals and humans 2 ed Boca Raton: CRC Press, 2010, 318p.

DUBEY, J.P. et al. Serodiagnosis of postnatally and prenatally induced toxoplasmosis in sheep. American Journal of Veterinary Research, v.48, n.8, p.1239-1243, 1987.

43

DUBEY J.P. et al. Newly recognized fatal protozoan disease of dogs. Journal of the American Veterinary Medical Association, v.192, p.1269-1285, 1988.

DUBEY J.P. et al. Neonatal Neospora caninum infection in dogs: Isolation of the causative agent and experimental transmission. Journal of the American Veterinary Medical Association, v. 193, n. 10, p. 1259-1263, 1988b.

DUBEY, J.P. et al.. Serologic and histologic diagnosis of toxoplasmic abortions in sheep in Oregon. Journal of the American Veterinary Medical Association, v.196,

p.291–294, 1990a.

DUBEY, J.P. et al. Fatal congenital Neospora caninum infection in a lamb. Journal of Parasitology, v.76, n.1, p.127-130, 1990b.

DUBEY, J. P. et al. Fatal transplacental neosporosis in a deer (Cervus eldi siamensis). Journal of Parasitology, v.82, p. 338–339, 1996.

DUBEY, J.P. et al. Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissues cysts. Clinical Microbiology Reviews, v.11, p. 267-299, 1998.

DUBEY, J.P. Redescription of Neospora caninum and its differentiation from related coccidia. International Journal for Parasitology, v.32, p. 929-946, 2002.

DUBEY, J.P. et al. Gray wolf (Canis lupus) is a natural definitive host for Neospora caninum. Veterinary Parasitology, v.181, p. 382–387, 2011.

DUBEY, J. P.; ACLAND, H. M.; HAMIR, A. N. Neospora caninum (apicomplexa) in a stillborn goat. Journal of Parasitology, v.78, p. 532–534, 1992.

DUBEY, J.P.; BEATTIE, C.P. Toxoplasmosis of animals and man. CRC Press.

Boca Raton, Florida, 1988, p. 1-220.

DUBEY, J.P.; BUXTON, D.; WOUDA, W. Pathogenesis of bovine neosporosis. Journal of Comparative Pathology, v. 134, n. 4, p. 267-289, 2006.

DUBEY, J.P.; FRENKEL J.K. Experimental Toxoplasma infection in mice with strains producing oocysts. Journal of Parasitology, v.59, p. 505-502, 1973.

http://www.journals.elsevier.com/journal-of-comparative-pathology/

44

DUBEY, J.P.; FRENKEL J.K. Feline toxoplasmosis from acutely infected mice and the development of Toxoplasma cysts. Journal of Protozoology, v. 23, p. 537-546, 1976.

DUBEY, J.P.; HAMIR, A.N. Experimental toxoplasmosis in budgerigars (Melopsittacus undulatus). Journal of Parasitology, v. 88, n. 3, p. 514-519, 2002.

DUBEY, J. P.; KOESTNER, A.; PIPER, R. C. Repetead transplacental transmission of Neospora caninum in dogs. Journal of the American Veterinary Medical Association, Schaumburg, v.197, n.7, p.857-860, oct., 1990.

DUBEY, J. P.; LINDSAY, D. S. Neospora caninum induced abortion in sheep. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.2, p.230-233, 1990.

DUBEY, J.P.; LYNDSAY, D.S. A review of Neospora caninum and neosporosis. Veterinary Parasitology, Amsterdam, v. 67, n. 1-2, p. 1-59, dec., 1996.

DUBEY, J.P; LYNDSAY, D.S. Neosporosis, Toxoplasmosis and Sarcocystosis in Ruminants. Veterinary Clinics Food Animal Practice, v.22, p. 645–671, 2006.

DUBEY, J.P.; LINDSAY, D.S.; SPEER, C.A. Structures of Toxoplasma gondii Tachyzoites, Bradyzoites, and Sporozoites and Biology and Development of Tissue Cysts. Clinical Microbiology Reviews, v. 11, n. 2, p.267-299, 1998.

DUBEY, J.P., SCHARES, G., Neosporosis in animals-the last five years. Veterinary Parasitology, v. 180, p. 90–108, 2011.

DUBEY, J.P.; SCHARES, G.; ORTEGA-MORA, L.M. Epidemiology and control of neosporosis and Neospora caninum. Clinical Microbiology Reviews, v. 20, n. 2, p. 323-367, 2007.

DUBEY, J.P.; THULLIEZ, P. Persistence of tissue cysts edible tissues of cattle feed Toxoplasma gondii oocysts. American Journal of Veterinary Research, v. 54, n. 2, p. 270- 273, 1993.

DUBEY, J. P.; THULLIEZ, P. Prevalence of Antibodies to Neospora caninum in Wild Animals. The Journal of Parasitology, v. 91, n. 5, p. 1217-1218, 2005.

DUBEY, J.P.; TOWLE, A. Toxoplasmosis in sheep. St Albans: UK, Commonwealth Institute of Parasitology, 1986. 11p.

45

DUNCANSON, P. et al. High levels of congenital transmission of Toxoplasma gondii in a commercial sheep flock. International Journal for Parasitology, v. 31, n. 14, p. 1699-1703, 2001.

ENTRICAN, G.; WHEELHOUSE, N.M. Immunity in the female sheep reproductive tract. Veterinary Research, v. 37, p. 295–309, 2006.

FAEAL (Federação de Agricultura e Pecuária do Estado de Alagoas) CNA/FAEAL - Ovinocaprinocultura: Sanidade é fundamental para alavancar o setor

Disponível em<http://www.faeal.org.br/coluna_faeal_semana.asp?offset=5&id=279> Acesso: 01 dez. 2013.

FARIA, E.B. et al Risk Factors Associated with Neospora caninum Seropositivity in Sheep from the State of Alagoas, in the Northeast Region of Brazil. Journal of Parasitology, v. 96, n. 1, p. 197-199, 2010.

FIALHO, C.G., TEIXEIRA, M.C.; ARAÚJO, A.P. Toxoplasmose animal no Brasil Acta Scientiae Veterinariae, v. 37, n. 1, p. 1-23, 2009.

FIGLIUOLO, L. P. C. et al. Prevalence of anti-Toxoplasma gondii and anti-Neospora caninum antibodies in ovine from São Paulo State, Brazil. Veterinary Parasitology,

v. 123, p. 161-166, 2004.

FRENKEL, J.K. Pathogenesis of toxoplasmosis with a consideration of cyst rupture in besnotia infection. Survey of Ophthalmology, n. 6, p. 799-825, 1961.

FRENKEL, JK. Toxoplasmosis: parasite life cycle pathology and immunology. In: Hammond DM, Long PL, eds. The Coccidia. Baltimore: University Park Press, 1973. p. 343-410.

FRENKEL, J.K. Toxoplasmosis in humans beings. Journal of American Veterinary Association, v. 196, n. 2, p. 240-248, 1990.

FRENKEL, J.K. et al. Toxoplasma gondii in cats: fecal stage identified as coccidia oocists. Science, v. 167, p. 893-896, 1970.

FREYRE, A. et al. The incidence and economic significance of ovine toxoplasmosis in Uruguay. Veterinary Parasitology, v. 73, p. 13-15, 1997.

http://www.faeal.org.br/coluna_faeal_semana.asp?offset=5&id=279

46

GEORGIEVA, D.; PRELEZOV, P. N.; KOINARSKI, V. TS. Neospora caninum and neosporosis in animals. Bulgarian Journal of Veterinary Medicine, v. 9, n. 1, p. 1-26, 2006.

GONDIM, L. F. P. et al. Coyotes (Canis latrans) are definitive hosts of Neospora caninum. International Journal for Parasitology, v.34, p.159-161, 2004.

GONDIM, L.S. et al. Toxoplasma gondii and Neospora caninum in sparrows (Passer domesticus) in the Northeast of Brazil. Veterinary Parasitology, n. 168, n. 1-2, p.

121-124, 2010.

HARKINS, D. et al. Western blot analysis of the IgG responses of ruminants infected with Neospora caninum and with Toxoplasma gondii. Journal of Comparative Patholology, v. 119, p. 45–55, 1998.

HIDE, G. Evidence for high levels of vertical transmission in Toxoplasma gondii. Parasitology, v. 136, n. 14, p. 1877-1885, 2009.

HILARI, M. et al.. Prevalence of Neospora caninum and Toxoplasma gondii antibodies in sera from camels from Egypt. Veterinary Parasitology, v. 75, n. 2-3, p. 269-271, 1998.

HOSSEININEJAD, M.; PIRALI-KHEIRABADI, K; HOSSEINI, F. Seroprevalence of Neospora caninum Infection in Camels (Camelus dromedarius) in Isfahan Province, Center of Iran. Iranian Journal of Parasitology, v. 4, n. 4, p. 61-64, 2009.

HOWE, L. et al. Potential involvement of Neospora caninum in naturally occurring ovine abortions in New Zealand. Veterinary Parasitology, v. 185, p. 64-71, 2012.

HOWE, D.K.; SIBLEY, L.D. Toxoplasma gondii comprises three clonal linages: correlation of parasite genotype with human disease. Journal of Infectious Disease, v. 172, p. 1561-1566, 1995.

HURTADO, A. et al. Single tube nested PCR for the detection of Toxoplasma gondii in fetal tissues from naturally aborted ewes. Veterinary Parasitology, v. 102, p. 17-

27, 2001.

IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Produção Pecuária Municipal 2010, Rio de Janeiro, v. 38, p. 1-65, 2010.

INNES, E.A.; WASTILING, J.M. Analysis of in vivo immune responses during Toxoplasma gondii infection using the technique of lymphatic cannulation. Parasitology Today, v. 11, n. 7, p. 268-271, 1995.

47

JENKINS, M.C. et al. Serological investigation of an outbreak of Neospora caninum-associated abortion in a dairy herd in southeastern United States. Veterinary Parasitology, v. 94, n. 1-2, p. 17-26, dec., 2000.

JOLLEY, W.R. et al. Repetitive abortion in Neospora-infected ewes. Veterinary Parasitology, v. 82, n. 3, p. 251-257, apr., 1999.

KING, J. S. et al. Australian dingoes are definitive hosts of Neospora caninum. International Journal for Parasitology, v. 40, n. 8, p. 945-950, jul., 2010.

KLUN, I. et al. Cross-sectional survey on Toxoplasma gondii infection in cattle, sheep and pigs in Serbia: seroprevalence and risk factors. Veterinary Parasitology, v.135, n. 2, p. 121- 131, 2006.

KOBAYASHI, Y et al. Naturally-occurring Neospora caninum infection in adult sheep and her twin fetuses. Journal of Parasitology, v. 87, n.2, p. 434-436, 2001.

KOMPALIC-CRISTO, A.; BRITO, C.; FERNANDES, O. Diagnóstico molecular da toxoplasmose: revisão. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial, v.

41, n. 4, p. 229-235, 2005.

LARSON, R.L.; HARDIN, D.K.; PIERCE, V.L. Economic considerations for diagnostic and control options for Neospora caninum-induced abortions in endemically infected herds of beef cattle. Journal of the American Veterinary Medical Association, v. 224, n.10, p.1597–1604, may, 2004.

LEVINE, N D. Veterinary Protozoology. Iowa State University Press, Ames, Iowa,

414 p., 1985.

LINDSAY, D.S.; DUBEY, J.P. Immunohitochemical diagnosis of Neospora caninum in tissue sections. American Journal of Veterinary Ressearch, v. 50, n. 11,

p.1981-1983, 1989.

LINDSAY, D. S.; WESTON, J. L.; LITTLE, S. E. Prevalence of antibodies to Neospora caninum and Toxoplasma gondii in gray foxes (Urocyon cinereoargenteus) from South Carolina. Veterinary Parasitology, v. 97, n. 2, p. 159-164, 2001.

LJUNGSTRÖM, B.L. et al. Evaluation of a direct agglutination test for detection of antibodies against Toxoplasma gondii in cat, pig and sheep sera. Acta Veterinaria Scandinavica, v. 35, n. 2, p. 213-216, 1994.

48

LOPES, W.D. Sexual transmission of Toxoplasma gondii in sheep. Veterinary Parasitology, v. 195, n. 1-2, p. 47-56, 2013.

LUFTZ, B.J. et al. Toxoplasmic encephalitis in patients with acquired immune deficiency syndrome. Journal of American Medicine Association, v. 252, p. 913-

917, 1984.

MACHADO, T.M.M.; LIMA, J.D. Freqüência de anticorpos anti-T. gondii em caprinos criados sob diferentes formas de exploração no Estado de Minas Gerais. Arquivos Brasileiros de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 39, n. 2, p. 255-264, 1987.

MAINAR, R.C. et al. Prevalence of agglutinating antibodies to Toxoplasma gondii in small ruminants of the Madrid Region, Spain, and identification of factors influencing seropositivity by multivariate analysis. Veterinary Research Communications, v.

20, n. 2, p. 153-159, 1996.

MARCO, I. High seroprevalence of Neospora caninum in the red fox (Vulpes vulpes) in the Pyrenees (NE Spain). Veterinary Parasitology, v. 152, n. 3-4, p. 321-324,

2008.

MCALLISTER, M.M. Uncovering the biology and epidemiology of Neospora caninum. Parasitology Today, v. 15, n. 6, p. 216-217, 1999.

MCALLISTER, M.M. et al. Experimental Neosporosis in Pregnant Ewes and Their Offspring. Veterinary Patholology, n. 33, p. 647-655, 1996.

MCALLISTER, M.M. et al. Dogs are definitive hosts of Neospora caninum. International Journal for Parasitology, v. 28, n. 9, p. 1473-1478, 1998.

MCGAVIN, M.D.; ZACHARY, J.F. Bases da Patologia em Veterinária 4 ed Rio de

Janeiro: Elsevier, 2009, p. 989.

MASALA, G. et al. Survey of ovine and caprine toxoplasmosis by IFAT and PCR assays in Sardinia, Italy. Veterinary Parasitology, v. 117, n. 1-2, p. 15-21, nov.,

2003.

MASALA, G. et al. Detection of pathogens in ovine and caprine abortion camples from Sardinia, Italy, by PCR. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.

19, n. 1, p. 96-98, jan., 2007.

49

MENZIES P.I. Control of important causes of infectious abortion in sheep and goats. Veterinary Clinics of North America Food Animal Practice, v. 27, n.1, p. 81–93, 2011.

MONTOYA, J.G., LIESENFELD, O. Toxoplasmosis. The Lancet, v. 363, p.1965-

1976, jun., 2004.

MORENO, B. et al. Occurrence of Neospora caninum and Toxoplasma gondii infections in ovine and caprine abortions. Veterinary Parasitology, v. 187, n.1-2, p.

12–318, jun., 2012.

MOTTA, A.C. et al. Aborto em ovinos associado à toxoplasmose: caracterização sorológica, anátomo-patológica e imunoistoquímica. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 17, sup 1, p. 204-208, 2008.

NAVARRO, I.T. et al. Toxoplasma gondii: Isolamento a partir de carne e cérebro de suínos comercializados na região de Londrina, PR. Semina: Ciências Agrária, v.13,

p.15-18, 1992.

NASIR, A. et al. Prevalence of Neospora caninum antibodies in sheep and goats in Pakistan. Journal of Parasitology, v. 98, n. 1, p. 213-215, 2012.

OGAWA, I. et al. Ocorrência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em ovinos da microrregião de Londrina no Estado do Paraná. Semina: Ciências Agrárias, v. 24, n. 1, p. 57-62, 2003.

OIE – World Organization for Animal Health – Toxoplasmosis In: Terrestrial Manual

2008 Disponível em<http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2008/pdf/2.09.10_TOXO.pdf> Acesso em: 02 jan 2014.

OTERO, A.R.S. et al.. Ocorrência de anticorpos IgG anti-Neospora caninum em rebanho de ovinos no Estado da Bahia. In: Fórum Brasileiro de Estudos sobre Neospora caninum, 1, 2005, São Paulo, SP. Anais... São Paulo: Colégio Brasileiro de Parasitologia Veterinária, 2005. CD-ROM.

OWEN, M.R.; CLARKSON, M.J.; TREES, A.J. Diagnosis of toxoplasma abortion in ewes by polymerase chain reaction. Veterinary Research, v. 142, p. 445-448, p.1998.



50

PENA, H.F. et al. Isolation and molecular detection of Neospora caninum from naturally infected sheep from Brazil. Veterinary Parasitology, v.147, n. 1-2, p. 61-66, 2007.

PEREIRA, M.F. et al. Fatores de risco associados à infecção por Toxoplasma gondii em ovinos e caprinos no estado de Pernambuco Pesquisa Veterinária Brasileira v.32,n.2, p.140-146, 2012

PEREIRA-BUENO, J. et al. Evolution of ovine abortion associated with Toxoplasma gondii in Spain by different diagnostic techniques. Veterinary Parasitology, v.121, p.33 - 43, 2004.

PESCADOR, C.A. et al. Perdas reprodutivas associadas com infecção por Toxoplasma gondii em caprinos no sul do Brasil. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.27, n. 4, p. 167-171,2007.

PETERS, M. et al. Immunohistochemical and ultrastructural evidence for Neospora caninum tissue cysts in skeletal muscles of naturally infected dogs and cattle. International Journal for Parasitology,v.31, p.1144-1148, 2001.

PINHEIRO R. R. et al. Aspectos zoo-sanitários da caprinocultura cearense. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.50, n.5, p. 534-543, 2000.

PINTO, A.P. et al. Sheep abortion associated with Neospora caninum in Mato Grosso do Sul, Brazil. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 32, n.8, p. 739-742, 2012.

REICHEL, M.P. et al. What is the global economic impact of Neospora caninum in cattle – The billion dollar question. International Journal for Parasitology, v. 43, p.

133–142, 2013.

REICHEL, M.P.; ELLIS, J.T. If control of Neospora caninum infection is technically feasible does it make economic sense? Veterinary Parasitology, v.142, p.23–34,

2006.

REICHEL, M.P.; ELLIS, J.T. Re-evaluating the economics of neosporosis control. Veterinary Parasitology, v. 156, p. 361–362, 2008.

RODRIGUES, A.A.R. et al. Shedding of Neospora caninum oocysts by dogs fed tissues from naturally infected water buffaloes (Bubalus bubalis) from Brazil. Veterinary Parasitology, v. 124, n. 3-4, p.139–150, 2004.

51

ROMANELLI, P. R. et al. Prevalence of Neospora caninum and Toxoplasma gondii in sheep and dogs from Guarapuava farms, Paraná State, Brazil. Research in Veterinary Science, v.82, n. 2, p. 202–207, 2007.

SANGSTER, C. et al. Neosporosis in an Aborted Southern White Rhinoceros (Ceratotherium simum simum) Fetus. Journal of Zoo and Wildlife Medicine, v. 41, n. 4, p. 725-728, 2010.

SAWADOGO, P. et al. Seroprevalence of T. gondii in sheep from Marrakech, Morocco. Veterinary Parasitology, v.130, p.89–92, 2005.

SASANI et al. Neospora caninum as causative agent of ovine encephalitis in Iran. Pathology Discovery, p.1-5, 2013, http://dx.doi.org/10.7243/2052-7896-1-5.

SHEFFIELD, H.G.; MELTON, M.L. The fine structure and reproduction of Toxoplasma gondii. Journal of Parasitology, v.54, p. 209-226, 1968.

SILVA, A.V. et al. Comparação da reação de imunofluorescência indireta e do método de aglutinação direta na detecção de anticorpos anti-toxoplasma em soros de ovinos, caprinos, caninos e felinos. Arquivos do Instituto Biológico, v.69, n.1,

p.7-11, 2002.

SILVA, A.V. et al. Toxoplasmose em ovinos e caprinos: estudo soroepidemiológico em duas regiões do Estado de Pernambuco, Brasil. Ciência Rural, v.33, n.1, p.115-

119, 2003.

SILVA, D.A.O. Infecção por Toxoplasma gondii e Neospora caninum em cães e lobos-guará: soroepidemiologia e imunodiagnóstico. 2006. 143 f. Tese (Doutorado)-Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2006.

SILVA, K.L.M.V.; LA RUE, M.L. Possibilidade de transmissão congênita de Toxoplasma gondii em ovinos através de segmento sorológico no município de Rosário do Sul, RS, Brasil. Ciência Rural, v.36, n.3, p.892-897, 2006.

SKJERVE, E. et al. Risk factors for the presence of antibodies to Toxoplasma gondii in Norwegian slaughter lambs. Preventive Veterinary Medicine, v.35, p.219-227,

1998.

SOCORRAS, T. O.; GORETTI, R. G.; VARGAS, M. L.; JOAQUIM, I. I.; PATARROYO, Histopatologia da Infecção Experimental em ovelhas deslanadas. In: Congresso Brasileiro de Parasitologia Veterinária, 12, 2002. Rio de Janeiro. Anais... Rio de Janeiro: Colégio Brasileiro Parasitologia Veterinária, 2002.(CD-ROM).

52

STACHISSINI, A. V. M. Toxoplasma gondii e Neospora caninum em caprinos do estado de São Paulo: perfis soro-epidemiológicos e co-infecção com o vírus da artrite-encefalite caprina. 2005 105f.Tese (Doutorado em Medicina Veterinária,

Área de concentração: Vigilância Sanitária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, 2005.

TEMBUE, A. A. et al. Serological survey of Neospora caninum in small ruminants from Pernambuco State, Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v.

20, p. 246-248, 2011.

THILSTED, J.P.; DUBEY, J.P. Neosporosis-like abortions in a herd of dairy cattle. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v. 1, n. 3, p. 205-209, 1989.

THURMOND, M.; HIETALA, S. Strategies to control Neospora infection in cattle. Bovine Practitioner, v.29, p. 60–63, 1995.

TRUPPEL, J. H. et al. Detection of Neospora caninum DNA in capybaras and phylogenetic analysis. Parasitology International, v. 59, n. 3, p. 376-379, 2010.

UGGLA, A.; SJÖLAND, L; DUBEY, JP. Immunohistochemical diagnosis of toxoplasmosis in fetuses and fetal membranes of sheep. American Journal of Veterinary Research, v. 48, n. 3, p. 348-351, mar., 1987.

UCHOA, C.M.A. et al. Padronização de ensaio imunoenzimático para pesquisa de anticorpos das classes IgM e IgG anti-Toxoplasma gondii e comparação com a técnica de imunofluorescência indireta. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 32, n. 6, p. 661-669, 1999.

VIDOTTO, O. Toxoplasmose: epidemiologia e importância da doença na saúde animal. Semina: Ciências Agrárias, v. 13, p. 69-75, 1992.

VIDOTTO, O. et al. Estudos epidemiológicos da toxoplasmose em suínos da região de Londrina-PR. Semina: Ciências Agrárias, v. 11, n. 1, p. 29-33, 1990.

WAREE, P. et al. Immunohistochemical study of acute and chronic toxoplasmosis in experimentally infected mice. Southeast Asian Journal Tropical of Medicine Public Health, v. 38, n. 2, p. 223-231, mar., 2007.

WEISS, L.M.; KIM, K. The development and biology of bradyzoites of Toxoplasma gondii. Frontiers in Bioscience, v. 5, p. 391-405, apr., 2000.

53

WESTON, J.F. et al. Dose-titration challenge of young pregnant sheep with

Neospora caninum tachyzoites. Veterinary Parasitology, v. 164, n. 2-4, p. 183-191,

oct., 2009.

WILLIAMS, R. H. et al. High levels of congenital transmission of Toxoplasma gondii in longitudinal and cross-sectional studies on sheep farms provides evidence of vertical transmission in ovine hosts. Parasitology, v.130, n. 3, p. 301-307, mar., 2005.

WOLF, D. et al. Detection of specific antibodies to Neospora caninum and Toxoplasma gondii in naturally infected alpacas (Lama pacos), llamas (Lama glama) and vicunas (Lama vicugna) from Peru and Germany. Veterinary Parasitology,

v.130, n. 1-2, p. 81-87, jun., 2005.

WOODS, L.W. et al. Systemic neosporosis in a California black-taiked deer (Odocoileus hemionus columbianus). Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v. 6, n. 4, p. 508-510, oct., 1994.

YAI, L.E. et al. Seroprevalence of Neospora caninum and Toxoplasma gondii

antibodies in the South American opossum (Didelphis marsupialis) from the city of

São Paulo, Brazil. The Journal of Parasitology, v. 89, n. 4, p. 870-871, aug., 2003.

54

5 ARTIGOS CIENTÍFICOS

CAPÍTULO 1 Pesquisa de Toxoplasma gondii em ovinos abatidos no estado de Alagoas empregando diferentes técnicas de diagnóstico

55

Pesquisa de Toxoplasma gondii em ovinos abatidos no estado de Alagoas empregando diferentes técnicas de diagnóstico

Search Toxoplasma gondii in sheep slaughtered in the state of Alagoas using

different diagnostic techniques

RESUMO- Objetivou-se neste estudo pesquisar a infecção por Toxoplasma gondii em ovinos abatidos no estado de Alagoas, Brasil, utilizando diferentes técnicas de diagnóstico, além de avaliar a concordância entre as técnicas diretas de diagnóstico em animais naturalmente infectados. Foram utilizadas amostras de soros e tecidos de 100 ovinos abatidos no estado de Alagoas. Para a pesquisa de anticorpos foi utilizada a técnica de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e para a pesquisa do parasito nos tecidos foram utilizadas as técnicas de Reação de Cadeia da Polimerase (PCR) e Imunohistoquímica (IHQ) somente nos animais positivos na sorologia. Para o estudo da concordância entre as técnicas diretas foi empregado o teste Kappa. Na RIFI, 14% (14/100) animais foram positivos sem diferença significativa para machos e fêmeas. Na PCR, 21,43% (03/14) e na IHQ observou-se marcação positiva para T. gondii em tecido cerebral de 7,14% (1/14) dos ovinos. Na histopatologia, o achado predominante foi o infiltrado celular mononuclear no coração, cérebro e cerebelo ao redor dos vasos sanguíneos, seguido de hemorragia na medula e cerebelo. A concordância entre as técnicas diretas de diagnóstico em ovinos naturalmente infectados foi moderada (K= 0,44), portanto é importante associar mais de uma técnica de diagnóstico direto no diagnóstico da toxoplasmose ovina. Palavras-chaves: ovino, Toxoplasma gondii, Reação em Cadeia da Polimerase, Histopatologia, Imunohistoquímica

ABSTRACT- The aimed of this study search the Toxoplasma gondii infection in sheep slaughtered in the state of Alagoas, Brazil, using different diagnostic techniques, and to evaluate the correlation between the direct diagnostic techniques in naturally infected animals. Sera and tissues of 100 slaughtered sheep were used in the state of Alagoas. For the detection of antibodies to immunofluorescent antibody test (IFAT) was used and for the detection of parasites in tissue techniques of Polymerase Chain Reaction (PCR) and immunohistochemistry (IHC) were used only in positive serology in animals . To study the agreement between the direct techniques we employed the Kappa test. IFAT , 14 % (14 /100) were positive animals with no significant difference for males and females . In PCR, 21.43 % (03/14) and IHC - positive staining was observed for T. gondii in brain tissue of 7.14 % (1/14) of sheep. Histopathologically, the predominant finding was the mononuclear cell infiltrate in the heart and perivascular cuff in the brain and cerebellum. The agreement between the direct diagnosis techniques in sheep naturally infected was moderate (K = 0.44), so it is important to involve a more direct diagnostic technique in the diagnosis of ovine toxoplasmosis . Keywords: sheep, Toxoplasma gondii, Polymerase Chain Reaction, Histopathology, Immunohistochemistry

56

INTRODUÇÃO

A toxoplasmose em ovinos pode causar abortos e mortalidade neonatal,

nascimento de cordeiros fracos ou fetos mumificados (DUBEY; JONES, 2008; OIE,

2008). Na forma latente, a maioria dos casos passa despercebida ou confundida

com outras enfermidades semelhantes (BRAGA FILHO; RAMOS; FREITAS, 2010).

O diagnóstico desta parasitose pode ser realizado por meio de métodos

indiretos como a sorologia para a pesquisa de anticorpos ou pesquisa direta de

taquizoítos e cistos nos tecidos em cortes histológicos corados pela Hematoxilina e

Eosina (HE) ou pela técnica de Imunohistoquímica, além do bioensaio em

camundongo (ROSA et al., 2001).

Em cortes histológicos corados pela HE é difícil identificar o Toxoplasma

gondii (T. gondii), pois o parasita pode ser confundido com núcleos ou fragmentos

nucleares que se coram de forma semelhante (TSUNEMATSU; SHIOIRI; KUSANO,

1964; BARBOSA, 1988).

Em fetos abortados por T. gondii são utilizadas diferentes técnicas de

diagnóstico para a detecção do parasito nos tecidos fetais. Uma das técnicas mais

utilizadas é o exame histológico do cérebro fetal e outros órgãos, assim como a

placenta. Neste exame geralmente se pesquisa algumas lesões histológicas

compatíveis com a infecção por este protozoário, associada ou não à técnica de

imunohistoquímica (UGGLA; SJÖLAND; DUBEY, 1987).

Diferentes técnicas de PCR também são empregadas para detectar o DNA do

parasito nos fluídos fetais e tecidos dos fetos abortados (OWEN; CLARKSON;

TREES, 1998; HURTADO et al., 2001). Ainda em fetos, Pereira-Bueno et al. (2004)

indicaram que a utilização de diferentes técnicas de diagnóstico aumenta a

possibilidade de detectar o parasito nos tecidos.

Rosa et al. (2001) compararam duas técnicas de diagnóstico da toxoplasmose

experimental em caprinos e concluíram que o bioensaio em camundongos continua

sendo o melhor método para a detecção do T. gondii quando comparada à

imunohistoquímica.

Objetivou-se neste estudo pesquisar T. gondii em tecidos de ovinos abatidos,

utilizando diferentes técnicas de diagnóstico, além de estudar a concordância entre

as técnicas diretas de diagnóstico.

57

MATERIAL E MÉTODOS

Amostras

Foram coletadas 100 amostras de soro sanguíneo, fragmentos de tecido do

sistema nervoso central (cérebro, cerebelo, ponte e medula espinhal) e fragmentos

de coração de ovinos, sendo 50 machos e 50 fêmeas, abatidos em matadouros no

estado de Alagoas, Brasil.

As amostras de soro sanguíneo foram acondicionadas em tubos de

polipropileno tipo eppendorf e mantidas sob congelamento. As amostras dos órgãos

foram mantidas sobre congelamento para realização da Reação em Cadeia da

Polimerase e em formol tamponado a 10% para os exames histológicos e

imunohistoquímica.

Sorologia

As amostras de soro de todos os animais foram submetidas ao Teste da

Imunofluorescência Indireta (RIFI) para triagem dos animais positivos. A RIFI foi

realizada segundo a metodologia descrita por Camargo (1974), utilizando-se

anticorpos anti-IgG-ovino (Sigma®) conjugado ao isotiocianato de fluoresceína e

como antígeno, taquizoítos da cepa RH; o ponto de corte utilizado foi 1/64 e foram

utilizados controles positivos e negativos em todas as reações.

As amostras positivas na RIFI foram tituladas até a diluição de 1/1024 e os

animais positivos, independente da titulação tiveram seus tecidos submetidos à

PCR, Histopatologia e (IHQ).

Reação em Cadeia da Polimerase

As amostras de tecidos destinadas à PCR foram submetidas à extração de

DNA, utilizando-se Kit comercial Wizard Genomic DNA Purification (Promega®),

seguindo o protocolo do fabricante. Os pares iniciadores utilizados foram TOX4

(CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG) e TOX5

(CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT) segundo Homan et al. (2000),

amplificando uma região de 529 pares de base (pb). As reações de amplificação

foram realizadas em um volume final de 12,5ml contendo: 2,5 μL de DNA genômico;

0,5 μL de cada primer (TOX4 e TOX5) a 10μM; 2,75 μl de H2O Mili-Q ultrapura e

6,25 μL de Top Taq Master Mix (Quiagen), de acordo com o protocolo do fornecedor.

58

Para o perfil térmico das etapas de reações utilizou-se o termociclador XP Thermal

Cycler (Bioxer Technology Co. Ltda), consistindo de uma desnaturação do DNA

inicial a 94°C por 7minutos e seguida de 35 ciclos a 94°C por 1 minuto para a

desnaturação, 60°C por 1 minuto para o anelamento, 72°C por 1 minuto para a

extensão e extensão final de 10 minutos a 72°C. Os produtos amplificados foram

detectados por eletroforese em gel de agarose a 2%, corados com Blue Green

(LGC), visualizados através de luz ultravioleta e fotodocumentados. Foi utilizado

padrão de peso molecular DNA Ladder de 100pb. O controle positivo utilizado na

reação foi obtido por meio de suspensão de lavados intraperitoneais de

camundongos previamente infectados com a cepa RH.

Imunohistoquímica

Foi utilizada a técnica de Labelled Streptavidin Biotin (LSAB) peroxidase

(Dako Corporation). Os cortes histológicos fixados em lâminas silzanizadas foram

desparafinados e hidratados e em seguida realizou-se a inativação da peroxidase

endógena com solução de peróxido de hidrogênio a 3% em água destilada por 30

minutos a temperatura ambiente. Em seguida, foram realizadas lavagens com PBS.

Para a recuperação antigênica, os cortes foram submetidos ao calor em banho-

maria com tampão citrato a 10 mM pH 6.0 e colocados em micro-ondas por 20

minutos em potência alta e a seguir lavados em PBS. As ligações inespecíficas

foram bloqueadas por incubação com leite desnatado a 5% em PBS por 30 minutos

em temperatura ambiente. Após lavagens em água destilada, as lâminas foram

imersas em PBS e em seguida incubadas com o anticorpo primário contra T. gondii

(VMRD, cat. 210-70) na diluição de 1/200 em PBS, durante 16 horas, em câmara

úmida a temperatura de 4ºC. Após este período, as lâminas foram lavadas em PBS

e utilizou-se o kit LSAB peroxidase (Dako Corporation). Posteriormente, os cortes

foram lavados em PBS e utilizou-se o cromógeno DAB (Diaminobenzidina) seguindo

recomendações do fabricante. Para finalizar, as amostras foram contra-coradas com

hematoxilina de Harris, desidratadas, diafanizadas em xilol e montadas com

bálsamo em lamínula.

Histopatologia

Para estudo histológico, diferentes secções de cérebro, cerebelo, medula e

ponte foram cortados e desidratados em alcoóis de diferentes concentrações,

59

incluídos em parafina, utilizando-se o processamento de rotina. De cada bloco,

foram cortadas secções de 4 µm de espessura, desparafinadas, reidratadas e

coradas com hematoxilina-eosina e examinadas a microscopia de luz (JUNQUEIRA;

JUNQUEIRA, 1983)

Análise Estatística

Para verificar diferenças nos resultados da sorologia em relação ao sexo foi

empregado o teste de Qui-quadrado (2) com nível de significância de 5% e teste

Kappa para avaliar o estudo de concordância entre as técnicas de PCR e IHQ.

RESULTADOS

Na sorologia, 14/100 amostras foram positivas para anticorpos contra T.

gondii e destes, seis eram machos e oito fêmeas com títulos 64 (06/14), 128 (01/14),

256 (04/14) e 1024 (03/14). Não foi detectada diferença estatística significativa entre

machos e fêmeas.

Na PCR dos tecidos dos ovinos positivos na RIFI, três ovinos machos foram

positivos. O DNA foi detectado na medula espinhal, cerebelo, cérebro e coração.

Na histopatologia (tabela 1), o achado predominante foi o infiltrado celular

mononuclear no coração e manguito perivascular no cérebro e cerebelo (Figura 1).

Tabela 1 Achados histopatológicos nos tecidos de ovinos positivos na sorologia (RIFI) para Toxoplasma gondii

Tecido Amostras positivas/ Animais

Coração infiltrado mononuclear entre os miócitos

08/14

Cerebelo manguito perivascular cisto

02/14 01/14

Cérebro focos de congestão manguito perivascular

01/14 04/14

Na IHQ, apenas uma amostra de tecido cerebelar apresentou marcação

positiva (Figura 2) entre os 14 animais positivos na RIFI.

60

Figura 1 - A- Infiltrado mononuclear entre os miócitos B- Manguito perivascular no cérebro (HE, objetiva 40X)

Figura 2 - Imunomarcação positiva de cistos de T. gondii em tecido cerebelar de ovino naturalmente infectado (anticorpo VMRD, cat. 210-70, LSAB, DAB, objetiva 100X)

Na análise estatística observou-se correlação moderada entre os resultados

obtidos na PCR e IHQ no teste Kappa com concordância de 0,44.

B

A

A B

61

DISCUSSÃO

O resultado obtido de animais soropositivos (14/100) encontra-se dentro do

limite de variação citado na literatura para ovinos no Brasil (FIALHO; TEIXEIRA;

ARAÚJO, 2009).

A presença de T. gondii em tecidos do sistema nervoso central de ovinos

assintomáticos confirma os achados anteriormente descritos por Rosa et al. (2001)

que relataram que na fase assintomática da infecção em caprinos

experimentalmente infectados, o cérebro e a medula mostraram ser os tecidos mais

adequados para o isolamento do agente. Na infecção natural, o cérebro, cerebelo e

medula também foram os tecidos onde se detectou o DNA do parasito pela PCR e

se observou no cerebelo pela Imunohistoquímica a presença de cisto de T. gondii,

apesar de pouco frequente, principalmente nas técnicas histológicas. É difícil

estabelecer um parâmetro de comparação entre resultados entre animais natural e

experimentalmente infectados, pois no primeiro caso não se conhece a fase da

infecção, a cepa.

Os achados histológicos encontrados neste estudo, apesar de inespecíficos

foram amplamente descritos em infecções por T. gondii (MCGAVIN; ZACHARY,

2007). Estas alterações histológicas podem variar entre os estudos, principalmente

quanto à intensidade do infiltrado mononuclear observado nos tecidos-alvos do

parasita. Silva (2011), por exemplo, relatou congestão, seguido de infiltrado

inflamatório celular mononuclear ou polimorfonuclear focal leve.

O diagnóstico de T. gondii pode ser auxiliado examinando-se o cérebro, onde

podem ocorrer lesões primárias e secundárias. Gliose em torno de um centro

necrótico, às vezes mineralizado, com meningite linfóide leve, representa a resposta

dos danos diretos do parasita no tecido (BUXTON,1990; MCGAVIN; ZACHARY,

2007). A presença de cisto no cerebelo em um ovino macho, confirmado na IHQ e

PCR, ocorreu sem nenhuma reação inflamatória nas adjacências. Dubey, Lindsay e

Speer (1998) citam que cistos teciduais intactos provavelmente não causam

qualquer dano ao tecido e podem persistir sem causar nenhuma resposta

inflamatória do hospedeiro. Provavelmente o cisto observado não apresentava

nenhum dano, por isso a ausência de inflamação. Segundo Weiss e Kim (2000),

quando os cistos teciduais se rompem, induzem uma forte resposta inflamatória que

62

resulta na formação de nódulos gliais nos cérebros dos hospedeiros cronicamente

infectados.

Segundo Esteban-Redondo et al. (1999), T. gondii foi encontrado com maior

frequência em ovelhas nos tecidos do cérebro e coração. De acordo com Silva et al.

(2013), o coração pode ser o órgão mais adequado para detectar infecção por T.

gondii na IHQ. Já para Weissmann et al. (2003), o cérebro foi considerado a melhor

amostra para IHQ e confirmação do diagnóstico de toxoplasmose. Em caso de

tecidos de animais necropsiados ou abatidos é interessante a utilização de tecido

cerebral, coração e outros tecidos onde o parasito se encista com frequência.

Segundo Johnston (1988), a histopatologia é essencial para estabelecer uma

associação de causa-efeito. É difícil identificar parasitas individuais nos cortes

histológicos, pois muitas vezes os taquizoítos ou cistos são difíceis de visualizar,

especialmente quando presentes em número baixo. A imunohistoquímica pode

facilitar a visualização dos parasitas nos tecidos (MCGAVIN; ZACHARY, 2007;

WAREE et al., 2007), mas na infecção natural esta técnica pode apresentar baixa

sensibilidade como observado neste estudo onde a maioria das amostras positivas

na sorologia e PCR foram negativas na IHQ. Também se deve considerar as vias de

inoculação do parasito e a forma infectante utilizada, a espécie do hospedeiro e a

virulência da cepa que podem influenciar na dinâmica da infecção, bem como a

distribuição aleatória do parasita nos diferentes tecidos do hospedeiro. Isto reforça a

necessidade de incluir várias amostras de diferentes tecidos para aumentar a

sensibilidade da IHQ.

Na IHQ, marcação positiva para T. gondii foi observada em tecido cerebral de

1/14 ovinos positivos na sorologia, resultado inferior ao obtido por Silva (2011), em

ovinos naturalmente infectados, que relatou maior percentual de animais positivos

na IHQ. Dos ovinos avaliados na IHC, 52% (12/25) apresentaram marcação positiva

para T. gondii e relataram que animais com titulação mais alta de anticorpos podem

apresentar uma resposta imune mais eficiente (SILVA, 2011). Em ovinos no estado

do Rio de Janeiro, Silva et al. (2013) concluíram que a IHC foi comprovadamente

eficiente no diagnóstico definitivo da toxoplasmose. Isto não foi comprovado no

presente estudo, pois a concordância entre os resultados da PCR e IHQ foi

moderado e quando se trata de diagnóstico, acreditamos que este nível de

concordância não é suficiente para adotar esta técnica nos laboratórios.

Reconhecemos a dificuldade de identificar as formas infectantes de T. gondii nos

63

tecidos de animais naturalmente infectados e desta forma é mais indicado a

associação de técnicas de diagnóstico direto para aumentar as chances de

identificar o parasito.

Segundo Esteban-Redondo e Innes (1998), uma das maiores dificuldades

para detectar T. gondii no tecido de pequenos ruminantes como ovelhas é a

limitação do tamanho da amostra examinada. É possível que o parasita esteja

presente em partes não examinadas de tecidos e um resultado negativo na amostra

examinada, não quer dizer necessariamente que o tecido inteiro esteja livre do

parasita. O problema do erro amostral ao trabalhar com espécies de grandes

animais é inevitável e deve-se ter em mente ao tentar detectar o T. gondii.

Os resultados obtidos na PCR demonstraram que esta é mais sensível para

detectar o DNA do parasito nos tecidos analisados. De acordo com Dubey (2010),

esta técnica detecta apenas um parasito, proporcionando um diagnóstico rápido e

eficiente, contudo o resultado positivo depende da presença do protozoário na

amostra.

Esteban-Redondo e Innes (1998) também empregaram a PCR para detectar

o DNA de T. gondii em ovinos inoculados experimentalmente com oocistos e

observaram que 8/10 animais apresentaram DNA em suas amostras, principalmente

os que receberam dose infectante alta.

A carne e vísceras dos ovinos deste estudo são destinadas ao consumo

humano. Nesta região, a toxoplasmose não é alvo de controle efetivo apesar do

impacto negativo para a produção de ovinos, constatado em outros estudos

realizados na região. Este achado representa um alerta para as autoridades

sanitárias locais, pois tanto a carne como as vísceras fazem parte da dieta diária em

pratos regionais dos sertanejos; muitas vezes são consumidos crus ou mal cozidos e

isto deve ser considerado como um importante fator de risco para a infecção em

humanos.

CONCLUSÃO Conclui-se que T. gondii está presente em tecidos de ovinos abatidos no

estado de Alagoas e que é indicado associar mais de uma técnica direta de

64

diagnóstico para aumentar a possibilidade de detectar a parasito nos tecidos

analisados.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BARBOSA, A.J.A. As técnicas de imunoperoxidase no estudo da etiologia das doenças infectuosas e parasitárias. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 21, n. 1, p.1-6, 1988.

BRAGA FILHO, E.; RAMOS, O.S.; FREITAS, J.A. Inquérito Sorológico de Toxoplasma gondii em Ovinos na Microrregião Castanhal, Pará, Brasil. Arquivo do Instituto Biológico, São Paulo, v. 77, n. 4, p. 707-710, out.-dez., 2010

BUXTON, D. Ovine toxoplasmosis: a review. Journal of the Royal Society of Medicine, v. 83, n., p. 509-511, aug., 1990.

CAMARGO, M. E. Introdução às técnicas de imunofluorescência. Revista Brasileira de Patologia Clínica, v. 10, p. 143-169, 1974.

DUBEY, J.P.; JONES, J.L. Toxoplasma gondii infection in humans and animals in the United States. International Journal for Parasitology, v. 38 , p. 1257–1278, 2008.

DUBEY, J. P. Diagnosis. In: ________ Toxoplasmoses of animals and humans. 2º

ed. Boca Raton: CRC Press, 2010. Session 1.7, p. 52-71.

DUBEY, J.P.; LINDSAY, D.S.; SPEER, C.A. Structures of Toxoplasma gondii Tachyzoites, Bradyzoites, and Sporozoites and Biology and Development of Tissue Cysts. Clinical Microbiology Reviews, v.11, n. 2, p.267-299, 1998.

ESTEBAN-REDONDO, I., INNES, E.A. Detection of Toxoplasma gondii in tissues of sheep orally challenged with different doses of oocysts. International Journal of Parasitology, v. 28, p. 1459–1466, 1998.

ESTEBAN-REDONDO, I. et al. Detection of T. gondii in tissues of sheep and cattle following oral infection Veterinary Parasitology, v.86, n.3, p.155-171, 1999.

FIALHO, C.G.; TEIXEIRA, M.C.; ARAÚJO, A.P. Toxoplasmose animal no Brasil Acta Scientiae Veterinariae. v. 37, n. 1, p. 1-23, 2009.

65

HOMAN, W.L. et al. Identification of a 200- to 300-fold repetitive 529 bp DNA fragment in Toxoplasma gondii, and its use for diagnostic and quantitative PCR. International Journal for Parasitology, v. 30, n.1, p. 69-75, jan., 2000.

HURTADO, A. et al. Single tube nested PCR for the detection of Toxoplasma gondii in fetal tissues from naturally aborted ewes. Veterinary Parasitology, v. 102, n.1-2, p. 17-27, dec., 2001.

JOHNSTON, W.S. An Investigation into toxoplasmosis as a cause of barrenness in ewes. Veterinary Record, v. 122, n. 22, p. 283-284, mar., 1988.

JUNQUEIRA, L.C.U.; JUNQUEIRA, L.M.M.S. Técnicas básicas de citologia e histologia São Paulo: Santos, 123p.

MCGAVIN, M.D.; ZACHARY, J.F. Pathologic Basis of Veterinary Disease. 4 ed

Missouri: Elsevier, 2007, p. 896

OIE – World Organization for Animal Health - Terrestrial Manual 2008 Disponível em <http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.09.10_TOXO.pdf> Acesso em: 09 de nov de 2013.

OWEN, M.R.; CLARKSON, M.J.; TREES, A.J. Diagnosis of toxoplasma abortion in ewes by polymerase chain reaction. Veterinary Research, v. 142, n.17, p. 445-448, apr., 1998.

PEREIRA-BUENO, J. et al. Evolution of ovine abortion associated with Toxoplasma gondii in Spain by different diagnostic techniques. Veterinary Parasitology, v. 121, n.1-2, p. 33-43, 2004.

ROSA, C. et al. Comparação das técnicas de imuno-histoquímica e bioensaio em camundongos para pesquisa de Toxoplasma gondii em tecidos de caprinos, experimentalmente inoculados. Arquivo do Instituto Biológico, São Paulo, v. 68,

n. 1, p. 13-17, jan.-jun., 2001.

SILVA, A.F. Anátomo-Histopatologia, Imuno-Histoquímica e Análises Clínicas de ovinos infectados naturalmente por Toxoplasma gondii e Neospora caninum no estado do Rio de Janeiro. 2011. 134f. Dissertação (Mestrado em Clínica e Reprodução Animal) – Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária. Universidade Federal Fluminense, Rio de Janeiro, 2011.

66

SILVA, A.F. et al. Immunohistochemical identification of Toxoplasma gondii in tissues from Modified Agglutination Test positive sheep. Veterinary Parasitology, v. 191, n. 3-4, p. 347-352, jan., 2013.

TSUNEMATSU, Y.; SHIOIRI, K.; KUSANO, N. Three cases of lymphadenopathy toxoplasmic with special reference to the application of fluorescent antibody technique for detection of Toxoplasma in tissue. The Japanese Journal of Experimental Medicine, v. 34, n. 4, p. 217-230, 1964.

UGGLA, A.; SJÖLAND, L; DUBEY, JP. Immunohistochemical diagnosis of toxoplasmosis in fetuses and fetal membranes of sheep. American Journal of Veterinary Research, v. 48, n.3, p. 348-351, mar.,1987.

WAREE, P. et al. Immunohistochemical Study of Acute and Chronic Toxoplasmosis In Experimentally Infected Mice Southeast Asian. Journal of Tropical Medicine and Public Health , v. 38, n. 2, p. 223-231, 2007.

WEISS, L.M.;KIM, K. The development and biology of bradyzoites of Toxoplasma gondii. Frontiers in Bioscience, v.5, p. 391-405, apr., 2000.

WEISSMANN, J. Presumptive Toxoplasma gondii abortion in a sheep. Canadian Veterinary Journal, v .44, n. 4, p. 322-324, 2003.

67

CAPÍTULO 2 Detecção e comparação de técnicas de diagnóstico para infecção por Neospora caninum em ovinos naturalmente infectados

68

Detecção e comparação de técnicas de diagnóstico para infecção por Neospora caninum em ovinos naturalmente infectados

Detection and comparison of diagnostic techniques for infection with Neospora

caninum in naturally infected sheep RESUMO: Objetivou-se neste estudo pesquisar a infecção e transmissão vertical por Neospora caninum em ovinos abatidos no estado de Alagoas, Brasil, utilizando diferentes técnicas de diagnóstico e avaliar a concordância entre as técnicas diretas de diagnóstico em ovinos naturalmente infectados. Foram utilizadas amostras de soros e tecidos de 100 ovinos abatidos e tecidos de 10 fetos. Para a pesquisa de anticorpos foi utilizada a técnica de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e para a pesquisa do parasito nos tecidos foram utilizadas as técnicas de Reação de Cadeia da Polimerase (PCR) e Imunohistoquímica (IHQ) somente nos animais positivos na sorologia. Para o estudo da concordância entre as técnicas diretas foi empregado o teste Kappa. Na RIFI, 13% (13/100) dos animais foram positivos, onde 7,7% (1/13) eram machos e 92,3% (12/13) fêmeas, predominando o título 800, com diferença estatística significativa entre machos e fêmeas. Na PCR dos ovinos adultos e dos fetos, 38,5% e 30% apresentaram reação positiva, respectivamente, principalmente no cérebro. Na IHQ, dois ovinos adultos apresentaram marcação positiva no cérebro. Os achados histopatológicos revelaram infiltrado mononuclear no coração, cérebro e medula e focos de congestão no cérebro, focos de hemorragia e infiltrado mononuclear no cérebro e medula e nos vasos do cérebro e cerebelo. N. caninum está presente em ovinos abatidos no estado de Alagoas e foi verificada a transmissão vertical na forma natural. A concordância entre as técnicas diretas de diagnóstico em ovinos naturalmente infectados foi moderada (K= 0,44), portanto é importante associar mais de uma técnica de diagnóstico direto no diagnóstico da infecção por este parasito. Palavras-chaves: ovino, Neospora caninum, Reação em Cadeia da Polimerase, Histopatologia, Imunohistoquímica ABSTRACT: This study aimed to search the vertical transmission and infection by Neospora caninum in sheep slaughtered in the state of Alagoas, Brazil, using different diagnostic techniques and to evaluate the correlation between the direct diagnostic techniques in naturally infected sheep. Sera and tissues of 100 slaughtered sheep and tissues of 10 fetuses were used. For the detection of antibodies to Immunofluorescent Antibody Test (IFAT) was used and for the detection of parasites in tissue techniques of Polymerase Chain Reaction (PCR) and Immunohistochemistry (IHC) were used only in positive serology in animals. To study the agreement between the direct techniques we employed the Kappa test. IFAT, 13% (13/100) of the animals were positive, where 7.7% (1/13) were male and 92.3 % (12/13) females, predominantly under 800, with a statistically significant difference for between males and females. PCR of adult sheep and fetuses, 38.5 % and 30 % showed a positive reaction, respectively, mainly in the brain. In IHC, two adult sheep

69

showed positive staining in the brain. Histopathologic findings revealed mononuclear infiltrate in the heart, followed by foci of congestion in the brain, mononuclear infiltrate in the brain and spinal cord and perivascular cuff in the brain and cerebellum. N. caninum is present in sheep slaughtered in the state of Alagoas and vertical transmission was observed in the natural way. The agreement between the direct diagnosis techniques in sheep naturally infected was moderate (K = 0.44), so it is important to involve a more direct diagnostic technique in the diagnosis of infection by this parasite. Keywords: Sheep, Neospora caninum, Polymerase Chain Reaction, Histopathology, Immunohistochemistry

INTRODUÇÃO

Neospora caninum (N. caninum) está bem estabelecido como causa de

aborto em bovinos e doenças neuromusculares em cães. Embora já tenha sido

demonstrado que N. caninum causa mortalidade em cordeiro recém-nascido e

infecção congênita em ovinos naturalmente expostos (FOTI et al., 2014), só

recentemente este parasito foi considerado como causa de aborto em ovelhas

experimental e naturalmente infectadas (KOBAYASHI et al., 2001; HÄSSIG et al.,

2003; MORENO et al., 2012; FOTI et al., 2014).

A ingestão de cistos com bradizoítos pelos hospedeiros definitivos resulta na

diferenciação sexual do parasito nos tecidos intestinais, com formação dos oocistos

que são excretados nas fezes. Os oocistos esporulados são infectantes para

carnívoros e herbívoros e devido à contaminação ambiental são importantes na

epidemiologia da neosporose (DUBEY; SCHARES; ORTEGA-MORA, 2007).

Em herbívoros, N. caninum pode ser transmitido através da ingestão de

oocistos eliminados no ambiente pelos hospedeiros definitivos através da ingestão

de água e alimentos contaminados (DUBEY; SCHARES; ORTEGA-MORA, 2007).

Contudo, a principal via de transmissão de N. caninum é a congênita (FOTI et al.,

2014). Os ovinos infectados também podem, como ocorre com bovinos, permanecer

portadores do parasito e causar problemas reprodutivos posteriores (JOLLEY et al.,

1999).

Em bovinos, na gestação, pode ocorrer a diminuição da imunidade e a

infecção por N. caninum pode ser reativada (BUXTON et al., 2002). O protozoário

invade a placenta, mostrando uma predileção pelo epitélio coriônico e vasos

70

sanguíneos, induzindo a trombose em alguns vasos das carúnculas. N. caninum foi

associado à vasculite fetal, degeneração focal e inflamação do cório-alantóide e

intensa necrose focal do placentoma e lesões características nos cérebros fetais

(BUXTON et al., 1998).

Apesar de N. caninum não ser considerado um dos principais problemas para

a reprodução de ovinos, alguns pesquisadores vêm alertando para os abortamentos

causados em decorrência da infecção pelo parasito em ovelhas infectadas (SILVA;

BRANDÃO; FERREIRA, 2013).

Na Inglaterrra, Dubey et al. (1990) diagnosticaram pela primeira vez a

ocorrência de cistos de N. caninum no cérebro e medula de um cordeiro. Kobayashi

et al. (2001), no Japão, relataram casos de infecção natural em fetos de ovelhas,

demonstrando sua transmissão vertical. Hässig et al. (2003) na Suíça, também

associaram o N. caninum a aborto em ovelhas naturalmente infectadas, através de

reação em cadeia da polimerase (PCR).

São poucos os estudos que relatam os achados histopatológicos e de

diagnóstico molecular e imunohistoquímico em ovinos naturalmente infectados com

N. caninum. Considerando a necessidade de ampliar o conhecimento sobre a

infecção natural por este parasito em ovinos, este trabalho teve como objetivo

principal estudar a ocorrência de anticorpos anti- N. caninum em ovinos e avaliar

diferentes técnicas de diagnóstico em ovinos naturalmente infectados.

MATERIAL E MÉTODOS

Amostras

Foram coletadas 100 amostras de soro sanguíneo e de fragmentos de tecido

do sistema nervoso central (cérebro, cerebelo, ponte e medula espinhal) e de

coração de ovinos, sendo 50 machos e 50 fêmeas, abatidos em matadouros no

estado de Alagoas, Brasil.

As amostras de soro sanguíneo foram acondicionadas em tubos de

polipropileno tipo eppendorf e mantidas sob congelamento. As amostras dos órgãos

foram mantidas sobre congelamento para realização da Reação em Cadeia da

Polimerase e em formol tamponado a 10% para os exames histológicos e

imunohistoquímica.

71

Foram coletados 10 fetos entre 1,5 mês (2/10) e 3,5 meses (8/10) de

gestação. Destes, foram coletados dois fragmentos de cada órgão, sendo um

destinado para a PCR e outro para as técnicas de Histopatologia e

Imunohistoquímica.

Sorologia

Para a triagem dos animais positivos, inicialmente as amostras de soro de

todos os animais foram submetidas à técnica de imunofluorescência indireta (RIFI).

A RIFI foi baseada nos métodos descritos por Conrad et at. (1993) e Barr et al.

(1995) utilizando-se conjugado anticorpos anti-IgG-ovino (Sigma) conjugado ao

isotiocianato de fluoresceína, tendo como ponto de corte 1/50. A reação foi

considerada positiva quando taquizoítos mostrou fluorescência periférica total

(PARÉ; HIETALA; THURMOND, 1995). Foram utilizados controles

comprovadamente positivo e negativo em todas as reações. As amostras positivas

foram tituladas até a diluição de 1:800 e os animais positivos na RIFI, independente

da titulação, além dos tecidos fetais, foram processados e submetidos à PCR,

histopatologia e IHQ.

Reação em Cadeia da Polimerase

As amostras dos tecidos foram submetidas à extração de DNA, utilizando-se

kit comercial DNeasy Blood and Tissue (Qiagen, Hilden, Alemanha), seguindo o

protocolo do fabricante. As amostras para PCR foram preparadas para um volume

final de 12.5 μl contendo: 6,25 μl TopTaq PCR Master Mix (Qiagen - Hilden,

Alemanha), 0,5 μL de cada primer a 10μM; 2,75 μL de água Mili-Q ultrapura e 2,5μL

de DNA. O controle positivo para N. caninum foi obtido por suspensão de células

VERO inoculados com a estirpe NC-1. Foram usados os primers NP6 (5'-

CTCGCCAGTCAACCTACGTCTTCT-3') e NP21 (5'-

GGGTGTGCGTCCAATCCTGTAAC-3') fornecidos pela Integrated DNA

Biotechnology, Inc (Iowa, USA), amplificando uma região de 328 pares de base (pb).

A PCR foi realizada de acordo com o protocolo descrito por Yamage, Flechtner e

Gottstein et al. (1996) com algumas modificações. O protocolo de ciclagem para a

amplificação de DNA consistiu de uma desnaturação do DNA inicial a 95°C (5min) e

seguida de 40 ciclos a 94°C por 1 minuto para a desnaturação, 50°C por 1 minuto

para o anelamento, 74°C por 1 minuto para a extensão e extensão final de 5 minutos

72

a 72°C. O perfil térmico das etapas de reações foi feito em um termociclador XP

Thermal Cycler (Bioxer Technology Co. Ltda). Os produtos amplificados foram

detectados por eletroforese em gel de agarose a 2%, corados com Blue Green

(LGC®), visualizados através de luz ultravioleta e fotodocumentados. Foi utilizado

padrão de peso molecular DNA Ladder (Promega) de 100 pb.

Imunohistoquímica

Foi utilizada a técnica da peroxidase; os cortes histológicos de 5µm foram

aderidos a lâminas de vidro, previamente tratadas com solução de silano (3-

aminopropyl-triethoxysilane, Sigma-Aldrich, cat. A3648) em acetona a 2%; Em

seguida foram desparafinados em xilol, lavados em álcool e hidratados em água

destilada. As lâminas foram tratadas com peróxido de hidrogênio a 3% em solução

aquosa por 30 minutos em temperatura ambiente e posteriormente, lavadas com

água destilada. Na etapa seguinte, foi realizada a reativação antigênica com a

utilização de tampão citrato a 10mM pH 6.0 por 20 minutos no microondas, na

potência alta e lavadas com água destilada. Para minimizar as reações inespecíficas

do anticorpo, as lâminas foram tratadas com leite em pó desnatado a 5% em

solução aquosa, a temperatura ambiente por 30 minutos e lavadas em água

destilada. Posteriormente, os fragmentos foram incubados overnigth a 6ºC (em

geladeira) com anticorpo primário contra N. caninum policlonal (VMRD, cat.210-70-

NC) numa diluição de 1:1000 em PBS (“phosphate buffer saline”). No dia seguinte,

após a lavagem das lâminas em água destilada, utilizou-se a técnica do Complexo

Estreptavidina-Biotina-Peroxidase com o kit comercial LSAB (Labeled Streptavidin

Biotin, Dako, cat. K0679) e a revelação das reações foi realizada com o cromógeno

AEC (Aminoethylcarbazole, Dako, cat. K3461), de acordo com as instruções do

fabricante. As lâminas foram contracoradas com hematoxilina de Harris não alcoólica

e em seguida montadas com lamínulas em meio aquoso (Faramount Aqueous

Mounting Media, Dako cod. S3025). A leitura das lâminas foi realizada em

microscópio óptico (Olympus CX40).

Histopatologia

Os fragmentos de tecidos foram processados utilizando os métodos usuais

para análise histológica. Após a fixação em formol tamponado a 10% foi realizada a

desidratação em banhos de álcool absoluto, seguido de diafanização em xilol, banho

73

de parafina a 60ºC e por último, incluídos em parafina. Os fragmentos foram

cortados a 5µm e corados pela hematoxilina-eosina (HE) (JUNQUEIRA;

JUNQUEIRA, 1983).


Para verificar diferenças nos resultados da sorologia em relação ao sexo foi

empregado o teste de Qui-quadrado (2) com nível de significância de 5% e teste

Kappa para avaliar o estudo de concordância entre as técnicas de PCR e IHQ.

RESULTADOS

Das 100 amostras de soros testadas na RIFI, 13% (13/100) foram positivas

para anticorpos anti-N. caninum. Destes animais, 7,69% (1/13) era macho e 92,31%

(12/13) fêmeas com títulos que variaram de 50 a 800, com maior frequência do título

800 (6/13). Foi detectada diferença estatística significativa entre machos e fêmeas.

Na PCR, cinco ovelhas adultas apresentaram reação positiva em duas

amostras de cérebro, duas de cerebelo e uma de coração. Além disto, (4/10) fetos

apresentaram amostras positivas, sendo três no cérebro, um no cerebelo e um na

medula espinhal (Figura 1). Todos os fetos positivos encontravam-se no terço final

da gestação e suas mães apresentaram títulos de anticorpos 50.

Os resultados da histopatologia encontram-se sumarizados na tabela 1. A

alteração predominante foi infiltrado mononuclear no coração, seguido de focos de

congestão no cérebro, infiltrado mononuclear no cérebro e medula e manguito

perivascular no cérebro e cerebelo.

Na IHQ, 15,38% (2/13) ovelhas adultas apresentaram marcação positiva no

tecido cerebral para N. caninum (Figura 2) e todas as amostras fetais foram

negativas.

Na análise estatística observou-se correlação moderada entre os resultados

obtidos na PCR e IHQ no teste Kappa com concordância de 0,44.

74

Tabela 1 Achados histopatológicos para os tecidos de ovinos positivos na RIFI para

N. caninum

Tecido Amostras positivas/ Animais

Coração

infiltrado mononuclear entre os miócitos

11/13

Cerebelo focos de congestão infiltrado mononuclear manguito perivascular

01/13 01/13 01/13

Cérebro

focos de congestão infiltrado mononuclear manguito perivascular

03/13 01/13 02/13

Medula

focos de congestão infiltrado mononuclear

01/13 01/13

Figura 1- Imunomarcação de cisto para N. caninum no cérebro de ovelha adulta (anticorpo VMRD, cat.210-70-NC, LSAB, AEC, objetiva 100X)

75

DISCUSSÃO

A frequência de ovinos positivos na sorologia encontrada neste estudo é

superior à relatada em alguns estados do Brasil. No estado de Alagoas, mesma

região deste estudo, Faria et al. (2010) realizaram estudo soro-epidemiológico em

ovinos e relataram prevalência de 9,6%. Os resultados indicam a disseminação de

N. caninum em ovinos neste estado do Brasil. A variação observada entre os

diferentes estudos pode estar associada à sensibilidade entre as diferentes técnicas

utilizadas, o ponto de corte empregado, o tipo de microscópio utilizado (UENO,2005)

e o responsável pelas leituras das lâminas (BJÖRKMAN;UGGLA, 1999). Contudo,

quando se compara os resultados aqui obtidos com os de Faria et al. (2010) onde as

amostras foram processadas no mesmo laboratório, empregando a mesma técnica e

ponto de corte, acredita-se que a prevalência está se elevando. Este achado é

preocupante, pois mesmo em condições ambientais pouco favoráveis à

sobrevivência dos oocistos no solo devido a grandes períodos anuais de seca

registradas nos últimos dois anos nesta região, este protozoário está se

disseminando entre as criações. A transmissão congênita pode ter desempenhado

um importante papel na epidemiologia da neosporose em ovinos nesta região. A

diferença no porcentual de soropositivos na RIFI entre machos e fêmeas pode estar

relacionada ao número de animais no rebanho e o manejo. Os machos são em

menor número na criação, e mantidos muitas vezes em regime intensivo, o que

diminui desta forma a probabilidade de contato com N. caninum no meio ambiente.

A patogenia e o significado clínico da neosporose em ovinos ainda é alvo de

estudos e ainda existem muitos aspectos da infecção natural a serem desvendados.

Na infecção experimental com ovelhas prenhes, Mc Allister et al. (1996) observaram

abortamentos, fetos mumificados, natimortos, nascimento de cordeiros fracos e

outros clinicamente normais; nas fêmeas, a única alteração clínica observada foi o

aborto, dependendo da fase da gestação quando estas foram inoculadas com o

parasito.

N. caninum é considerado uma importante causa de aborto em bovinos.

Entretanto, este parasito não é relatado como causa frequente de aborto na espécie

ovina. A infecção experimental é facilmente reproduzida nos ovinos e se for

realizada durante a gestação, os eventos patológicos são semelhantes ao que

ocorre na espécie bovina (BUXTON, 1998). Embora N. caninum já tenha sido

76

descrito como causa de mortalidade em cordeiro recém-nascido (DUBEY et al.,

1990; DUBEY; LINDSAY, 1990) e infecção congênita em ovinos naturalmente

expostos (BUXTON, 1998; BUXTON et al., 1998; KOBAYASHI et al., 2001;

KOYAMA et al., 2001), este protozoário ainda não é considerado uma importante

causa de aborto em ovelhas.

A infecção natural por N. caninum já foi descrita por Kobayashi et al. (2001)

no Japão onde foram identificados cistos do parasito no cérebro e encefalite nos

fetos de ovelha. Hässig et al. (2003), na Suíça, também relataram abortos em

ovelhas, em um rebanho onde quatro dos 20 fetos abortados apresentaram PCR

positiva em tecido cerebral e em um dos fetos foi positivo na IHQ. Howe et al.

(2012), na Nova Zelândia, diagnosticaram a presença de N. caninum em rebanhos

ovino com problemas reprodutivos na sorologia e PCR positiva em tecido cerebral

fetal e sangue das ovelhas.

Para Foti et al. (2014), ainda pouco se sabe sobre a soroprevalência da

neosporose em ovinos naturalmente expostos. No Brasil existem alguns estudos

sorológicos publicados nos últimos anos (AGUIAR et al. 2004; FIGLIUOLO et al.,

2004; OTERO et al., 2005; VOGEL; ARENHART; BAUERMANN, 2006;

ROMANELLI et al., 2007; MUNHÓZ et al., 2010), mas somente um trabalho relatou a

participação do N. caninum em um surto de abortos em ovelhas da raça Santa Inês

onde o diagnóstico foi confirmado por imunohistoquímica (PINTO et al., 2012). Os

dados obtidos ainda são insuficientes para avaliar a magnitude das perdas causadas

e seu impacto nas criações de ovinos no Brasil, mas este agente deve ser

considerado como um agente abortivo em ovinos. Em algumas regiões da Espanha,

Moreno et al. (2012) demonstraram que N. caninum tem um papel significativo no

aborto em pequenos ruminantes, como também observado por Asadpour, Jafari-

Joozani e Salehi (2013) no Irã.

Neste estudo, o cérebro foi o órgão com maior percentual de amostras

positivas na PCR com 38,5% para ovinos adultos e 30% para os fetos. Mesmo nas

amostras positivas na PCR, nenhuma amostra fetal apresentou reação positiva na

IHQ ou lesão histológica compatível com aquelas causadas por este parasito. A

histologia e imunohistoquímica são importantes avaliar as alterações morfológicas

causadas por N. caninum, mas os resultados da PCR são superiores por sua maior

sensibilidade e especificidade atribuída na identificação de N. caninum em fetos

(JENKINS et al., 2002).

77

Dubey e Schares (2006) também acreditam que, entre os diferentes métodos

de diagnóstico para N. caninum, a PCR desempenha um papel importante. Em

experimento para investigar o potencial dos oocistos de N. caninum em infectar

ovelhas e determinar se o DNA do parasito poderia ser detectado por PCR no

sangue e cérebro, observou-se que todos os animais apresentaram PCR positiva em

tecido cerebral aos 49 dias após a infecção, mas nenhuma lesão ou parasito foi

detectado na IHQ (O’HANDLEY, 2002). Aqui observamos uma moderada

concordância a PCR e IHQ. Segundo Dubey et al. (1999a) raramente N. caninum

são numerosos nos tecidos para serem encontrados em todas as secções

histológicas e desta forma a sensibilidade do mais eficiente método de IHQ para

detectar N. caninum em tecidos é baixa (DUBEY, 1999b). Esta deve ser a causa

mais provável do resultado observado neste estudo em relação às técnicas de PCR

e IHQ.

McAllister et al. (1996) relataram que é possível que N. caninum produza

poucos cistos para garantir sua detecção na IHQ em casos de infecção crônica.

Elsheikha et al. (2013) também descreveram que o parasito pode modificar o

ambiente celular, bloqueando a morte ou a via apoptótica no início da infecção para

promover a sua sobrevivência intracelular. Isto também pode justificar a ausência de

lesões no cérebro das duas ovelhas positivas na IHQ.

Na histopatologia dos ovinos adultos foi observado infiltrado mononuclear no

coração, focos de congestão no cérebro, infiltrado mononuclear no cérebro e

medula, e manguito perivascular no cérebro e cerebelo.

As lesões histológicas observadas neste estudo são semelhantes, mas

menos intensas quando comparadas aos resultados obtidos em outros trabalhos.

Em ovinos adultos naturalmente infectados, Kobayashi et al. (2001) relataram a

presença de cistos de N. caninum e gliose focal com manguitos de células

mononucleares e Bishop et al. (2010) identificaram lesões neurológicas graves no

mesencéfalo, vasculite multifocal, hemorragias focais, hiperemia severa e trombos.

As diferenças observadas entre os estudos quanto à intensidade das lesões podem

ser justificadas principalmente pela presença ou ausência de sinais clínicos dos

animais estudados. McAllister (2005) também relatou que as lesões histológicas

induzidas por N. caninum podem variar de acordo com o hospedeiro animal, a via de

infecção e a presença de imunossupressão.

78

CONCLUSÃO

A infecção por N. caninum ocorre em ovinos naturalmente infectados no

estado de Alagoas, sendo verificada a transmissão vertical do parasito. Os

resultados obtidos na histopatologia não são suficientes para caracterizar a infecção

por N. caninum em ovinos naturalmente infectados. Recomenda-se associar mais de

uma técnica de diagnóstico na infecção natural por este parasito.

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Luís Ortega Mora do laboratório SALUVET, Universidade

Complutense de Madrid, Espanha, por ter cedido gentilmente o controle positivo

para a imunohistoquímica.


AGUIAR, D. M. et al. Prevalência de anticorpos anti-Neospora caninum em ovinos do município de Monte Negro, RO, Amazônia ocidental brasileira. Arquivos do Instituto Biológico, v. 71, p. 616-618, 2004.

ASADPOUR, R., JAFARI-JOOZANI, R; SALEHI, N. Detection of Neospora caninum in ovine abortion in Iran. Journal Parasitic Disease, v. 37, n. 1, p. 105-

109, 2013.

BARR, B. C. et al. Diagnosis of bovine fetal Neospora infection with an indirect fluorescent antibody test. Veterinary Record, v. 137, n. 24, p. 611-613, 1995.

BJÖRKMAN, C; UGGLA, A. Serological diagnosis of Neospora caninum infection. International Journal for Parasitology, v.29, n.10, p.1497-507, 1999.

BISHOP, S. et al The first report of ovine cerebral neosporosis and evaluation of Neospora caninum prevalence in sheep in New South Wales. Veterinary Parasitology, v. 170, n. 1-2, p. 137-142, 2010.




79

BUXTON, D. Protozoan infections (Toxoplasma gondii, Neospora caninum and Sarcocystis spp) in sheep and goats: recent advances. Veterinary Research, v. 29, n. 3-4, p. 289-310, 1998.

BUXTON, D. et al. The pathogenesis of experimental neosporosis in pregnant sheep. Journal of Comparative Pathology, v. 118, n. 4, p. 267-279, 1998.

BUXTON, D.; MCALLISTER, M. M.; DUBEY, J. P. The comparative pathogenesis of neosporosis. Trends Parasitalogy, v. 18, n. 12, p. 546-552, 2002.

CONRAD, P. A. et al. Detection of serum antibody responses in cattle with natural or experimental Neospora infections. Journal of the Veterinary Diagnostic Investigation, v. 5, n. 4, p. 572-578, 1993.

DUBEY, J.P. Neosporosis – the first decade of research. International Journal Parasitology, v. 29, n.10, p.1485-1488, 1999a.

DUBEY, J.P. Recent advances in Neospora and neosporosis. Veterinary Parasitology, v.84, n. 3-4, p. 349-367, 1999b.

DUBEY J.P., et al. Fatal congenital Neospora caninum infection in a lamb. Journal Parasitolology, v. 76, n.1, p.127-130, 1990.

DUBEY,J.P.; LINDSAY, D. S. Neospora caninum induced abortion in sheep. Journal Veterinary Diagnostic Investigation, v. 2, p. 230-233, 1990.

DUBEY, J.P.; SCHARES, G. Diagnosis of bovine neosporosis. Veterinary Parasitology, v. 140, n. 1-2, p.1-34, 2006.

DUBEY, J.P.; SCHARES, G.; ORTEGA-MORA, L.M. Epidemiology and Control of Neosporosis and Neospora caninum. Clinical Microbiology Reviews, v. 20, n. 2, p.

323-367, 2007.

ELSHEIKHA, H. M. et al. Effects of Neospora caninum infection on brain microvascular endothelial cells bioenergetics. Parasites & Vectors, v. 6, p. 6-24,

2013.

FARIA, E.B. et al Risk Factors Associated with Neospora caninum Seropositivity in Sheep from the State of Alagoas, in the Northeast Region of Brazil. Journal of Parasitology, v. 96, n.1, p. 197-199, 2010.

80

FIGLIUOLO, L. P. C. et al. Prevalence of anti-Toxoplasma gondii and anti-Neospora caninum antibodies in ovine from São Paulo State, Brazil. Veterinary Parasitology, v. 123, n. 3-4, p. 161-166, 2004.

FOTI, M.A. Toxoplasma gondii and Neospora caninum in sheep: a herd case report in Sicily Disponível em <http://www2.vet.unibo.it/staff/gentile/femesprum/Pdf%20Congressi/XI%20congresso%20Tunisi/Foti.pdf > Acesso em: 02 de jan 2014.

HÄSSIG, M. et al. Neospora caninum in sheep: a herd case report. Veterinary Parasitology, v. 117, n. 3, p. 213-220, 2003.

HOWE, L. et al. Potential involvement of Neospora caninum in naturally occurring ovine abortions in New Zealand. Veterinary Parasitology, v.185, n. 2-4, p. 64-71, 2012.

JENKINS, M. Diagnosis and seroepidemiology of Neospora caninum-associated bovine abortion. International Journal for Parasitology, v. 32, n. 5, p. 631-636, 2002.

JOLLEY, W.R. et al. Repetitive abortion in infected ewes. Veterinary Parasitology, v. 82, n. 3, p.251-257, 1999.


KOBAYASHI,Y. et al Naturally-occurring Neospora caninum infection in an adult sheep and her twin fetuses. Journal of Parasitology, n. 87, v. 2, p. 434-436, 2001.

KOYAMA, T. et al. Isolation of Neospora caninum from the brain of a pregnant sheep. Journal of Parasitology, v.87, n. 6, p. 1486–1488, 2001.

MCALLISTER, M. M. et al. Experimental neosporosis in pregnant ewes and their offspring. Veterinary Pathology, v. 33, n. 6, p. 647-655, 1996.

MCALLISTER, M.M. The comparative pathology of neosporosis Bahia In: “I Fórum Brasileiro de Estudos sobre Neospora caninum” 2005 São Paulo Anais ... São

Paulo Colégio Brasileiro de Parasitologia Veterinária, 2005, p.14-16




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11943234

81

MORENO, B. et al. Occurrence of Neospora caninum and Toxoplasma gondii infections in ovine and caprine abortions. Veterinary Parasitology, v. 187, n. 1-2, p. 12–318, 2012.

MUNHÓZ, K. F. et al. Occurrence of anti-Neospora caninum antibodies in sheep from farms located in northern Parana, Brazil. Semina Ciências Agrárias, v. 31, n. 4, p. 1031-1040, 2010.

O’HANDLEY R. et al. Experimental infection of sheep with Neospora caninum oocysts. Journal of Parasitology, v.88, n. 6, p.1120-1123, 2002.

OTERO, A.R.S. et al. Ocorrência de anticorpos IgG anti-Neospora caninum em rebanho de ovinos no Estado da Bahia In: “I Fórum Brasileiro de Estudos sobre Neospora caninum” 2005 São Paulo Anais ... São Paulo Colégio Brasileiro de Parasitologia Veterinária, 2005, p.68.

PARÉ, J.; HIETALA, S. K.; THURMOND, M. C. Interpretation of an indirect fluorescent antibody test for diagnosis of Neospora sp. infection in cattle. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v. 7, n. 1, p. 273-275, 1995.

PINTO, A.P. et al. Sheep abortion associated with Neospora caninum in Mato Grosso do Sul, Brazil. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 32, n. 8, p. 739-742, 2012.

ROMANELLI, P. R. et al. Prevalence of Neospora caninum and Toxoplasma gondii in sheep and dogs from Guarapuava farms, Paraná State, Brazil. Research in Veterinary Science, v. 82, n. 2, p. 202-207, 2007.

SILVA, A.F.; BRANDÃO, F.Z.; FERREIRA, A.M.R. Neosporose ovina: estado da arte. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 37, n. 1, p. 45-52, 2013.

UENO, T.E.H. Prevalência das Infecções por Toxoplasma gondii e Neospora caninum em matrizes e reprodutores ovinos de rebanhos comerciais do Distrito Federal, Brasil 2005. 107f. Dissertação (Mestrado em Epidemiologia Experimental e Aplicada às Zoonoses) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2005.

VOGEL, F.S.F., ARENHART, S., BAUERMANN, F.V Anticorpos anti-Neospora caninum em bovinos, ovinos e bubalinos no Estado do Rio Grande do Sul. Ciência Rural, v. 36, n. 6, p. 1948-1951, 2006.



82

YAMAGE, M.; FLECHTNER O.; GOTTSTEIN, B. Neospora caninum: specific oligonucleotide primers for the detection of brain “cyst” DNA of experimentally infected nude mice by the polymerase chain reaction (PCR). Journal of Parasitology, v. 82, n. 2, p. 272–279, 1996.

83

CAPÍTULO 3 Transmissão congênita de Neospora caninum em caprinos e ovinos no estado de Pernambuco, Brasil

84

Transmissão congênita de Neospora caninum em caprinos e ovinos no estado de Pernambuco, Brasil

Congenital transmission of Neospora caninum in goats and sheep in the state of

Pernambuco, Brazil

Resumo: O objetivo deste estudo foi relatar a transmissão vertical de Toxoplasma gondii e Neospora caninum em fetos abortados de caprinos e ovinos. Foram coletados um total de 78 amostras (cérebro, fígado, pulmão, rim e coração) de 17 fetos abortados de caprinos e ovinos em 10 propriedades rurais no Estado de Pernambuco, Brasil. As amostras foram analisadas por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), Histopatologia (HP) e Imunohistoquímica (IHQ). Nenhuma amostra foi positiva para T. gondii na PCR e IHQ. Na PCR para N. caninum onze amostras (14,1%) foram positivas em uma amostra de cérebro, cinco de fígado, uma de pulmão, duas de rim e duas de coração. Na histopatologia foi observada leve infiltração mononuclear no fígado e focos de congestão na região justaglomerular e medular do rim. Na IHQ uma amostra de cérebro de feto caprino apresentou reação positiva para N. caninum. Os resultados confirmam a transmissão vertical de N. caninum em ovinos e caprinos naturalmente infectados na região nordeste do Brasil.

Palavras-chaves: feto, neosporose, transmissão Abstract: The aim of this study was to report the vertical transmission of Toxoplasma gondii and Neospora caninum in aborted fetuses from goats and sheep. A total of 78 samples (brain, liver, lung, kidney and heart) of 17 aborted fetuses from goats and sheep on 10 farms in the State of Pernambuco, Brazil, were collected. The samples were analyzed by Polymerase Chain Reaction (PCR), Histopathology (HP) and Immunohistochemistry (IHC). No sample was positive for T. gondii by PCR and IHC. In PCR to N. caninum eleven samples (14.1%) were positive in a sample of brain, five of liver, one of lung, two of kidneys and two of heart. Histopathology in the samples that showed no autolysis were evidenced mainly mild mononuclear infiltration in the liver and foci of congestion in the regions juxtaglomerular and medullar of the kidney. IHC on a sample of goat fetal brain showed positive reaction to N. caninum. The results confirm the vertical transmission of N. caninum in naturally infected sheep and goats in northeastern Brazil. Keywords: fetus, neosporosis, transmission

85

INTRODUÇÃO

Toxoplasma gondii (T. gondii) e Neospora caninum (N. caninum) são dois

protozoários estreitamente relacionados e apresentam ampla disseminação entre a

maioria das espécies animais. Ambos são conhecidos por causar abortos em

ruminantes e possuem ciclos biológicos semelhantes (HEMPHILL; GOTTSTEIN,

2000; DUBEY, 2010), entretanto, são biologicamente distintos (DUBEY; SCHARES,

2011).

T. gondii é descrito desde 1954 como um agente causador de abortos em

ovinos, sendo a toxoplasmose uma das maiores causas de problemas reprodutivos

nesta espécie (UNDERWOOD; ROOK, 1992). Munday e Mason (1979) foram os

primeiros a relatar a toxoplasmose como importante causa de prejuízos reprodutivos

em caprinos, e apesar de ser menos documentada nesta espécie, aparentemente os

danos são maiores (DUBEY, 1987).

No Brasil, estudos têm demonstrado a presença e a importância do T. gondii,

especialmente em pequenos ruminantes (PESCADOR et al., 2007; ANDERLINI,

2011; MORAES et al., 2011; PEREIRA et al., 2012; ANDRADE et al., 2013).

N. caninum é a maior causa de aborto e mortalidade neonatal em bovinos em

alguns países (DUBEY; SCHARES; ORTEGA-MORA, 2007). Em pequenos

ruminantes, a doença está associada com nascimento de crias fracas e prematuras.

Em rebanhos infectados por N. caninum, o aborto pode ocorrer de forma endêmica

ou epidêmica (MODOLO et al., 2008).

A principal sintomatologia de ovelhas natural ou experimentalmente

infectadas por N. caninum é o abortamento (MCALLISTER et al., 1996) e sua

consequência pode trazer grandes prejuízos econômicos aos produtores na

ovinocultura.

Kobayashi et al. (2001) registraram o primeiro caso de infecção natural por N.

caninum em uma a ovelha prenhe e a presença do parasita em seus fetos. Hässig et

al. (2003) reportaram o primeiro caso de aborto em ovinos naturalmente infectados

por N. caninum, onde detectaram o agente no cérebro de quatro de 20 fetos

abortados em Zurique, Suíça.

O objetivo deste estudo foi relatar a transmissão vertical de Toxoplasma

gondii e Neospora caninum em fetos abortados de caprinos e ovinos no Estado de

Pernambuco, Brasil.

86

MATERIAL E MÉTODOS

Amostras de tecidos fetais

Foram utilizados 17 fetos (seis caprinos e 11 ovinos), totalizando 78 amostras

de cérebro, fígado, pulmão, rim e coração. Estes fetos foram provenientes de

propriedades rurais localizadas no estado de Pernambuco com histórico de abortos.

As amostras dos órgãos foram mantidas sobre congelamento para realização da

Reação em Cadeia da Polimerase e em formol tamponado a 10% para os exames

histológicos e imunohistoquímica.

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

O DNA das amostras de tecidos foi extraído utilizando-se Wizard Genomic

DNA Purification kit (Promega) de acordo com o protocolo do fabricante.

Amostras para PCR foram preparadas em um volume final de 12,5μl

contendo: 6,25μl TopTaq PCR Master Mix (Qiagen® - Hilden, Alemanha), 0,5 µl de

cada primer (10pM), 2.,75μl de H2O Milli-Q H2O e 2,5μl de DNA. O controle positivo

para N. caninum foi obtido de suspensão de células VERO inoculadas com a estirpe

NC-1 e para a T. gondii, de suspensão de lavagem intra-peritoneal de camundongos

previamente infectados com a estirpe RH. Para o controle negativo, 2,5μl de H2O

Milli-Q foi adicionada, substituindo o DNA.

Para a PCR de N. caninum foram utilizados os primers NP6 (5'-

CTCGCCAGTCAACCTACGTCTTCT-3') e NP21 (5'-

GGGTGTGCGTCCAATCCTGTAAC-3') e para a PCR de T. gondii foram utilizados

os primers TOX 4 (5'--CGCTGCAGG GAGGAAGACGAAAGTTG-3') e TOX5 (5'-

CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGAT-T-3') fornecidos pela Integrated DNA

Biotechnology, Inc. (Iowa, USA).

A PCR foi realizada de acordo com os protocolos descritos por Yamage,

Flechtner e Gottstein (1996) e Homan et al . (2000) com algumas modificações: o

protocolo de ciclagem para a amplificação de DNA N. caninum consistiu de uma

desnaturação do DNA inicial a 95°C por 5minutos, seguida de 40 ciclos a 94°C por 1

minuto para a desnaturação, 50°C por 1 minuto para o anelamento, 74°C por 1

minuto para a extensão e extensão final de 5 minutos a 72°C. O protocolo de

ciclagem para a amplificação do DNA de T. gondii consistiu de uma desnaturação do

87

DNA inicial a 94°C por 7minutos, seguida de 35 ciclos a 94°C por 1 minuto para a

desnaturação, 60°C por 1 minuto para o anelamento, 72°C por 1 minuto para a

extensão e extensão final de 10 minutos a 72°C. Um fragmento de 328 pb foi obtido

para N. caninum e um fragmento de 529 pb para T. gondii.

Os produtos amplificados foram detectados por eletroforese em gel de

agarose a 2%, corados com Blue Green (LGC®), visualizados através de luz

ultravioleta e fotodocumentados. Foi utilizado padrão de peso molecular DNA Ladder

(Promega®) de 100 pb.

Histopatologia

Para estudo histológico dos tecidos fetais, diferentes secções de cérebro,

fígado, pulmão, rim e coração foram cortados e desidratados em alcoóis de

diferentes concentrações, incluídos em parafina, utilizando processamento de rotina.

De cada bloco, secções de 4 µm de espessura foram cortadas, desparafinadas,

rehidratadas, coradas com hematoxilina-eosina, montadas com bálsamo em

lamínula e examinadas a microscopia de luz (JUNQUEIRA; JUNQUEIRA, 1983).

Devido à autólise, apenas 11 fetos tiveram seus tecidos processados e analisados

na histopatologia, sendo três fetos caprinos e oito fetos ovinos.

Imunohistoquímica

Toxoplasma gondii

Para T. gondii foi utilizada a técnica do Complexo Avidina-Biotina Fosfatase

Alcalina. Os cortes histológicos fixados em lâminas silzanizadas foram

desparafinados e hidratados e em seguida realizou-se a recuperação antigênica. Os

cortes foram submetidos ao calor em banho-maria com tampão citrato a 10 mM pH

6.0 e colocados em micro-ondas por 20 minutos em potência alta e a seguir lavados

em H2O destilada. As ligações inespecíficas foram bloqueadas por incubação com

leite desnatado a 5% em H2O destilada por 30 minutos em temperatura ambiente.

Após lavagens em água destilada, as lâminas foram imersas em PBS e em seguida

incubadas com o anticorpo primário contra T. gondii policlonal (ABCAM) na diluição

de 1/200 em PBS, durante 16 horas, em câmara úmida a temperatura de 6ºC. Após

este período, as lâminas foram lavadas em PBS e utilizou-se o kit LSAB (Labeled

Streptavidin Biotin, Dako Corporation®, cat. 0689). Posteriormente, os cortes foram

88

lavados em H2O destilada e utilizou-se o cromógeno Permanent Red (Dako®, cat.

K0640) seguindo recomendações do fabricante. Para finalizar, as amostras foram

contra-coradas com hematoxilina de Harris, desidratadas, diafanizadas em xilol e

montadas com bálsamo em lamínula.

Neospora caninum

Para N. caninum foi utilizada a técnica da peroxidase. Resumidamente, os

cortes histológicos de 5µm foram aderidos às lâminas de vidro previamente tratadas

com solução de silano (3-aminopropyl-triethoxysilane, Sigma-Aldrich, cat. A3648) em

acetona a 2%; Em seguida foram desparafinados em xilol, lavados em álcool e

hidratados em água destilada. As lâminas foram tratadas com peróxido de

hidrogênio a 3% em solução aquosa por 30 minutos em temperatura ambiente e

posteriormente, lavadas com água destilada. Na etapa seguinte, foi realizada a

reativação antigênica com a utilização de tampão citrato a 10mM pH 6.0 por 20

minutos no microondas em potência alta e lavadas com água destilada. Para

minimizar as reações inespecíficas do anticorpo, as lâminas foram tratadas com leite

em pó desnatado a 5% em solução aquosa, a temperatura ambiente por 30 minutos

e lavadas em água destilada. Posteriormente, os fragmentos foram incubados

overnigth a 6ºC (em geladeira) com anticorpo primário contra N. caninum policlonal

(VMRD, cat.210-70-NC) na diluição de 1:1000 em PBS (“phosphate buffer saline”).

No dia seguinte, após a lavagem das lâminas em água destilada, utilizou-se a

técnica do complexo streptavidina-biotina-peroxidase com o kit comercial LSAB

(LabeledStreptavidinBiotin, Dako, cat. K0679) e a revelação das reações foi

realizada com o cromógeno AEC (aminoethylcarbazole, Dako, cat. K3461) de acordo

com as instruções do fabricante. Posteriormente, as lâminas foram contracoradas

com hematoxilina de Harris não alcoólica e em seguida montadas com lamínulas em

meio aquoso (Faramount Aqueous Mounting Media, Dako cod. S3025). A leitura das

lâminas foi realizada em microscópio óptico (Olympus CX40). Em todas as reações

foram utilizados um controle positivo.


Foi utilizada a análise estatística descritiva para avaliar os resultados das

técnicas de PCR e IHQ.

89

RESULTADOS

Das 78 amostras de tecidos analisados na PCR, nenhuma foi positiva para T.

gondii.

Para N. caninum, 11/78 (14,1%) das amostras analisadas foram positivas

(Tabela 1), sendo uma amostra de cérebro, cinco de fígado, uma de pulmão, duas

de rim e duas de coração (Tabela 2). Estas amostras positivas corresponderam a

33,3% (2/6) dos fetos caprinos e 63,3% (7/11) dos fetos ovinos estudados.

Tabela 1 Resultados da PCR para N. caninum em amostras biológicas de fetos caprinos e ovinos no estado de Pernambuco, Brasil

Espécie Fígado Cérebro Pulmão Coração Rim Total de amostras

PCR (+)

Caprina - - - - - 5 0 Caprina - - - - 4 0 Caprina - - + - - 5 1 Caprina - - - - - 5 0 Caprina + - + 3 2 Caprina - - - - 4 0 Ovina + - - 3 1 Ovina - - - - 4 0 Ovina - - - - + 5 1 Ovina - - - - - 5 0 Ovina - + - - - 5 1 Ovina + - - + - 5 2 Ovina - - - - - 5 0 Ovina - - - + - 5 1 Ovina - - - - - 5 0 Ovina + - - - - 5 1 Ovina + - - - - 5 1

17 17 16 14 14 17 78 11

Obs.: As células em branco correspondem a órgãos que não foram processados devido ao mau estado de conservação.

90

Tabela 2 Frequência absoluta e relativa (%) de amostras positivas na PCR para N.

caninum em órgãos de fetos caprinos e ovinos no estado de Pernambuco, Brasil

ÓRGÃO TOTAL

PCR

% ovino caprino

Cérebro 16 1 0 6,25

Fígado 17 4 1 29,41

Pulmão 14 0 1 7,14

Rim 17 1 1 11,76

Coração 14 2 0 14,28

Na histopatologia observou-se principalmente uma leve infiltração mononuclear

no fígado e focos de congestão na região justaglomerular e medular do rim. Em

algumas amostras fetais não foi possível observar lesões devido à autólise. Os

achados encontram-se na tabela 3.

Tabela 3 Achados histopatológicos relacionados à infecção por N. caninum em amostras biológicas de fetos caprinos e ovinos no estado de Pernambuco, Brasil

Tecido nº de feto com lesões/ nº total de fetos

Cérebro focos de congestão focos de hemorragia

02/11 01/11

Coração

focos de congestão

01/11

Fígado

leve infiltração mononuclear focos de congestão

03/11 01/11

Pulmão

focos de hemorragia

01/11

Rim focos de congestão na região justaglomerular e medular

03/11

91

Na IHQ nenhuma das amostras fetais apresentou marcação positiva para T.

gondii. Para N. caninum, uma amostra de cérebro de um feto caprino foi positiva,

sendo também observado cistos do parasito (Figura 1).

Figura 1 - Imunomarcação de cisto de N. caninum em cérebro de feto caprino

(anticorpo VMRD, cat.210-70-NC, LSAB, AEC, objetiva 100X)

DISCUSSÃO

A identificação do DNA de N. caninum em 33,3% dos fetos caprinos e em

63,6% dos fetos ovinos foi elevada e superior em relação à percentagem encontrada

por Hughes et al. (2006) que foi de 18,9% em fetos ovinos abortados na Inglaterra,

por Masala et al. (2007) que detectaram N. caninum em 2% e 8% dos fetos ovinos e

caprinos abortados, respectivamente, na Sardenha, Itália e por Howe et al. (2008)

que detectaram em 13% dos cérebros de fetos ovinos abortados na Nova Zelândia.

Estas diferenças podem ter ocorrido pela distribuição geográfica, como também pelo

tamanho das amostras empregadas para a detecção do DNA pela PCR.

92

Neste estudo, observou-se a presença de DNA de N. caninum foi confirmada

em mais amostras de hepáticas diferentemente de outros autores que observaram

mais amostras positivas em tecido cerebral (BUXTON et al., 2001).

No exame histopatológico, as lesões observadas no cérebro de um feto

caprino positivo na IHQ para N. caninum foram somente focos de congestão. Estas

lesões não são compatíveis com aquelas provocadas por este parasito que

geralmente são focos de necrose e gliose na substância branca do cérebro como

relatado por Moreno et al. (2012) em feto ovino e caprino. Vale ressaltar que neste

estudo foram analisadas poucas amostras do sistema nervoso central devido à

autólise ocasionada pelo tempo decorrido entre a morte fetal e o aborto, o que pode

ter dificultado a observação de lesões características neste órgão. Diferentemente,

Kobayashi et al. (2001) e Sasani et al. (2013) em fetos ovinos e Moreno et al. (2012)

em fetos caprinos e ovinos observaram lesões histológicas no sistema nervoso

central. Buxton et al. (2001) também relataram que a autólise dificulta muito a

análise histopatológica dos tecidos de fetos abortados.

Este é o primeiro relato da transmissão vertical de N. caninum em fetos na

espécie caprina na região nordeste do Brasil, utilizando técnicas diretas de

diagnóstico (PCR e IHQ). Em outro estudo realizado no Brasil com fetos caprinos

abortados e natimortos positivos, Mesquita et al. (2013) relataram a transmissão

vertical em cabras por N. caninum por meio de sorologia materna e fetal.

Em Mato Grosso do Sul, Pinto et al. (2012) também confirmaram a

transmissão vertical deste parasito em fetos ovinos e observaram leve a moderado

infiltrado mononuclear entre as fibras e em torno dos vasos sanguíneos do miocárdio

e gliose difusa associada a células mononucleares no cérebro. Uma das amostras

de cérebro apresentou cistos, confirmados na IHQ como sendo de N. caninum.

Moreno et al. (2012) relataram a presença de DNA em tecido fetal caprino,

sem lesões histológicas. McAllister et al. (1996) relataram a possibilidade de N.

caninum produzir poucos cistos para garantir sua detecção na IHQ em casos de

infecção crônica. Elsheikha et al. (2013) descreveram que o parasito pode alterar o

ambiente celular, bloqueando a morte ou a via apoptótica no início da infecção para

promover a sua sobrevivência intracelular.

Em cortes histológicos, é difícil identificar os parasitas, pois muitas vezes os

taquizoítos ou cistos são difíceis de visualizar, principalmente quando presentes em

número baixo. A imunohistoquímica pode facilitar a visualização dos parasitas nos

93

tecidos (WAREE et al., 2007), mas na infecção natural esta técnica pode apresentar

baixa sensibilidade como observado neste estudo onde a maioria das amostras

positivas na PCR foram negativas na IHQ.

Os resultados aqui obtidos mostram a importância da inclusão de N. caninum

em investigações de agentes causadores de aborto em rebanhos de caprinos e

ovinos no Brasil, que tem um dos maiores rebanhos do mundo. Até o momento,

apesar de relatos de fetos positivos por PCR, este agente não foi o foco de pesquisa

no campo reprodutivo na área onde o nosso estudo foi realizado. Os resultados

encontrados indicam o envolvimento deste protozoário em distúrbios reprodutivos

em ovinos e caprinos que podem causar sérios prejuízos econômicos aos

produtores, principalmente devido à falta de diagnóstico na região estudada.

Estudos sobre causas de aborto em ovinos e caprinos no Brasil ainda

mostram alguns desafios para futuras pesquisas, incluindo estudos epidemiológicos,

a disponibilidade de laboratórios especializados nesta área e obtenção de mais

informações sobre os agentes infecciosos envolvidos em distúrbios reprodutivos em

diferentes regiões.

CONCLUSÃO

Os resultados confirmam a transmissão vertical de Neospora caninum em

ovinos e caprinos naturalmente infectados na região nordeste do Brasil.


ANDERLINI, G.A. et al. Occurrence and risk factors associated with infection by Toxoplasma gondii in goats in the State of Alagoas, Brazil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 44, n. 2, p.157-162, 2011.

ANDRADE, M.M.C. et al. Seroprevalence and risk factors associated with ovine toxoplasmosis in Northeast Brazil. Parasite, v. 20, n. 20, p. 1-5, 2013.

BUXTON, D. et al. Immunity to experimental neosporosis in pregnant ovino. Parasite Immunology, v. 23, n. 2, p. 85-91, 2001.

94

DUBEY, J.P. Toxoplasmosis in goats. Agripractice, n. 3, v. 8, p. 43-52, 1987.

DUBEY, J.P. Toxoplasmosis of animals and humans 2 ed Boca Raton: CRC

Press, 2010, 318p.

DUBEY, J.P.; SCHARES, G. Neosporosis in animals-the last five years. Veterinary Parasitology, v. 180, n. 1-2, p. 90-108, 2011.

DUBEY, J. P.; SCHARES, G.; ORTEGA-MORA, L. M. Epidemiology and Control of Neosporosis and Neospora caninum. Clinical Microbiology - Reviews, v.20, n.2, p.323–367, 2007.

ELSHEIKHA, H. M. et al. Effects of Neospora caninum infection on brain microvascular endothelial cells bioenergetics. Parasites & Vectors, v .6, p. 6-24, jan., 2013.

HÄSSIG, M. et al. Neospora caninum in sheep: a herd case report. Veterinary Parasitology, v. 117, n. 3, p. 213–220, 2003.

HEMPHILL, A.; GOTTSTEIN, B.A. European perspective on Neospora caninum. International Journal for Parasitology, v.30, p. 877–924, 2000.

HOMAN, W.L. et al. Identification of a 200- to 300-fold repetitive 529 bp DNA fragment in Toxoplasma gondii, and its use for diagnostic and quantitative PCR. International Journal for Parasitology, v. 30, n.1, p. 69-75, jan., 2000.

HOWE, L. et al. The role of Neospora caninum in three cases of unexplained ewe abortions in the southern North Island of New Zealand. Small Ruminant Research, v. 75, n. 2-3, p.115-122, 2008.

HUGHES, J.M. et al. The prevalence of Neospora caninum and co-infection with Toxoplasma gondii by PCR in naturally occurring mammal populations. Parasitology, v. 132, p. 29-36, jan., 2006.


KOBAYASHI, Y. et al. Naturally-occurring Neospora caninum infection in an adult ovino and her twin fetuses. Journal of Parasitalogy, v. 87, n. 2, p. 434-436, 2001.




95

MCALLISTER, M.M. et al. Experimental Neosporosis in Pregnant Ewes and Their Offspring. Veterinary Patholology, v. 33, n. 6, p. 647-655, 1996.

MASALA, G. et al. Detection of pathogens in ovine and caprine abortion samples from Sardinia, Italy, by PCR. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v.19,

n.1, p.96-98, jan., 2007.

MESQUITA, L.P. et al. Antibody kinetics in goats and conceptuses naturally infected with Neospora caninum. Veterinary Parasitology, v.196, n. 3-4, p. 327-333, 2013.

MODOLO, J. R. Freqüência de anticorpos anti Neospora caninum em soros de caprinos do estado de São Paulo e sua relação com o manejo dos animais. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 28, n. 12, p. 597-600, 2008.

MORAES, E.P.B.X. et al. Toxoplasma gondii diagnosis in ovine aborted fetuses and stillborns in the State of Pernambuco, Brazil. Veterinary Parasitology, v. 29, n. 183, n. 1-2, p. 152-155, 2011.

MORENO, B. et al. Occurrence of Neospora caninum and Toxoplasma gondii infections in ovine and caprine abortions. Veterinary Parasitology, v.187, n.1-2, p.312-318, 2012.

MUNDAY, B.L.; MASON, R.W. Toxoplasmosis as a cause of perinatal death in goats. Australian Veterinary Journal, n.10, v.55, p.485-487, 1979.

PEREIRA, M.F. et al. Fatores de risco associados à infecção por Toxoplasma gondii em ovinos e caprinos no estado de Pernambuco Pesquisa Veterinária Brasileira

v.32,n.2, p.140-146, jun., 2012

PESCADOR, C.A. et al. Perdas reprodutivas associadas com infecção por Toxoplasma gondii em caprinos no sul do Brasil. Pesquisa Veterinária Brasileira,

v.27, n. 4, p. 167-171,2007.

PINTO, A.P. et al. Sheep abortion associated with Neospora caninum in Mato Grosso do Sul, Brazil. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 32, n.8, p. 739-742, 2012.

SASANI et al. Neospora caninum as causative agent of ovine encephalitis in Iran. Pathology Discovery, p.1-5, 2013, http://dx.doi.org/10.7243/2052-7896-1-5.

UNDERWOOD, W.J.; ROOK, J.S. Toxoplasmosis infection in sheep. The Compendium on Continued Education in Veterinary Practice, v.14, n. 8 p.1543-1549, 1992.



96

WAREE, P. et al. Immunohistochemical study of acute and chronic toxoplasmosis in experimentally infected mice. Southeast Asian Journal Tropical of Medicine Public Health, v. 38, n. 2, p. 223-231, 2007.

YAMAGE, M.; FLECHTNER O.; GOTTSTEIN, B. Neospora caninum: specific oligonucleotide primers for the detection of brain “cyst” DNA of experimentally infected nude mice by the polymerase chain reaction (PCR). Journal of Parasitology, v. 82, n. 2, p. 272–279, 1996.

97

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Toxoplasma gondii e Neospora caninum estão presentes nos rebanhos ovinos

em Alagoas. A toxoplasmose é uma enfermidade importante para a saúde pública

bem como para a caprinovinocultura pelas perdas econômicas que pode causar. A

identificação de cisto nos tecidos investigados confirma a importância do consumo

de carne e vísceras mal cozidas pelo homem na transmissão desta enfermidade.

A neosporose se apresenta como uma doença que precisa ser melhor

investigada e avaliada em relação ao prejuízo que pode vir causar na produção de

caprinos e ovinos. Para detecção de N. caninum, a PCR mostrou-se mais eficaz do

que a IHQ. A presença de DNA de N. caninum identificado na PCR em tecido fetal

caprino e ovino, e a presença de cisto, confirmada pela IHQ, em tecido fetal caprino,

confirma a sua transmissão vertical por infecção natural.

ANNELISE CASTANHA BARRETO TENÓRIO NUNES · em caprinos e ovinos / Annelise Castanha Barreto...

Documents

Transcript of ANNELISE CASTANHA BARRETO TENÓRIO NUNES · em caprinos e ovinos / Annelise Castanha Barreto...