II

Dissertação de Investigação

Artigo de investigação no âmbito das ciências básicas

“Estudo das caraterísticas clínico-patológicas e da expressão

dos elementos da via de sinalização EGFR/HER2-Akt-mTOR

em adenomas pleomórficos e carcinomas ex-adenomas

pleomórficos da glândula salivar – sua relação com o

prognóstico”

Autor:

Ana Cristina Pedrosa Beleza Carvalho

Aluna do 5ºano do Mestrado Integrado em Medicina Dentária

Faculdade de Medicina Dentária da Universidade do Porto

mimd09044@fmd.up.pt

Orientador:

Professora Doutora Catarina Alexandra Pires Eloy

Professora Auxiliar Convidada

Faculdade de Medicina Dentária da Universidade do Porto

celoy@fmd.up.pt

Porto, 2014

III

Lista de abreviaturas

Akt – Proteína cinase B

AP – Adenoma pleomórfico

CAP – Carcinoma ex-adenoma pleomórfico

EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético

EGFR – Epidermal growth factor receptor

HE – Hematoxilina-eosina

HER2 - Human Epidermal growth factor Receptor 2

HMGA2 - High-mobility group AT-hook 2

PI3K - Phosphatidylinositol 3-kinase

PLAG1 – Pleomorphic adenoma gene 1

mTOR – Mammalian target of rapamycin

IV

Índice

Resumo ............................................................................................................................. 1

Abstract ............................................................................................................................. 2

Introdução ......................................................................................................................... 3

Objetivos ........................................................................................................................... 7

Materiais e métodos .......................................................................................................... 8

Resultados ....................................................................................................................... 11

Discussão ........................................................................................................................ 19

Conclusões ...................................................................................................................... 24

Referências bibliográficas .............................................................................................. 25

Agradecimentos .............................................................................................................. 28

Anexos ............................................................................................................................ 29

1

Resumo

Introdução: O adenoma pleomórfico é a neoplasia mais frequente das glândulas

salivares, tem tendência para recidivar e apresenta potencial de transformação maligna.

O carcinoma ex-adenoma pleomórfico resulta da transformação maligna do adenoma

pleomórfico. A via de sinalização EGFR/HER2-Akt-mTOR é uma via intracelular na

qual têm sido descritas alterações na expressão dos seus elementos associadas ao

desenvolvimento de vários tipos de neoplasias.

Objetivos: Estudar, numa série de adenomas pleomórficos e carcinomas ex-adenomas

pleomórficos, a relação das caraterísticas clínico-patológicas e da expressão dos

elementos da via de sinalização EGFR/HER2-Akt-mTOR com o comportamento destes

tumores.

Materiais e Métodos: Numa série de 16 tumores de glândulas salivares (11 adenomas

pleomórfico e 5 carcinomas ex-adenomas pleomórficos) os dados clínicos foram

colhidos das fichas clínicas e os dados histopatológicos foram obtidos através do estudo

das lâminas dos tumores primários ao microscópio ótico. Foi avaliada a expressão

imuno-histoquímica dos elementos da via de sinalização EGFR/HER2-Akt-mTOR nos

tumores primários e nas recidivas tumorais.

Resultados: Verificou-se uma maior tendência para a ocorrência de recidiva do

adenoma pleomórfico em pacientes do sexo feminino e em tumores com tamanho

inferior a 2 cm. Em todos os casos de adenoma pleomórfico que não recidivaram o

componente predominante era o estroma. A presença de cistos e de inflamação no tumor

são caraterísticas de benignidade nestes tumores. Verificou-se a existência de uma

associação estatisticamente significativa entre a expressão de mTOR nos tumores

primários e a ocorrência de transformação maligna. A expressão de HER2 nos

adenomas pleomórfico primários foi significativamente menos que nos recidivantes.

Conclusões: As caraterísticas clínico-patológicas permanecem como bons indicadores

do prognóstico do adenoma pleomórfico. A expressão de mTOR e HER2 em adenomas

pleomórfico está associada a comportamento biológico diferencial nestas neoplasias.

Palavras–chave: adenoma pleomórfico, carcinoma ex-adenoma pleomórfico, glândula

salivar, EGFR, HER2, Akt, mTOR, imuno-histoquímica.

2

Abstract Introduction: Pleomorphic adenoma is the most common salivary gland tumor, it has a

tendency to recur and it can undergo malignant transformation. Carcinoma ex-

pleomorphic adenoma is a malignant neoplasm that arises from pleomorphic adenoma.

The EGFR/HER2-Akt-mTOR pathway is an intracellular pathway in which have been

described changes in the expression of its elements that have been associated with the

development of several types of cancer.

Objectives: To study, in a series of pleomorphic adenomas and carcinomas ex-

pleomorphic adenomas, the relationship between clinico-pathological characteristcs and

immunohistochemical expression of EGFR/HER2-Akt-mTOR pathway with tumor’s

behavior.

Materials and Methods: In a series of 16 salivary gland tumors (11 pleomorphic

adenomas and 5 carcinomas ex-pleomorphic adenomas) the clinical data were obtained

from patients’ medical records and the histopathological data were obtained through the

analysis of primary tumor’s section in the optic microscope. The immunohistochemical

expression of EGFR/HER2-Akt-mTOR pathway was evaluated in primary and recurrent

tumors.

Results: Recurrent pleomorphic adenoma occured more often in female patients and

when the primary tumor had a size smaller than 2 cm. All of the pleomorphic adenomas

that did not recur had stroma as the major component. Presence of cysts and

inflammation in tumor are benign characteristics. mTOR expression in primary tumors

was significantly associated with malignant transformation. HER2 expression was

significantly less intense in primary pleomorphic adenomas than in recurrent ones.

Conclusions: The clinico-pathological characteristics remain good indicators of

prognosis of pleomorphic adenoma. mTOR and HER2 expression in pleomorphic

adenoma is associated with differential biologic behavior in these tumors.

Keywords: pleomorphic adenoma, carcinoma ex-pleomorphic adenoma, salivar gland,

EGFR, HER2, Akt, mTOR, immunohistochemistry.

3

Introdução

As glândulas salivares são órgãos exócrinos responsáveis pela produção e

secreção de saliva, que são classificadas em glândulas major (parótida, submandibular e

sublingual) e minor (intra-orais e extra-orais) [1]. A incidência global anual de

neoplasias das glândulas salivares varia, geograficamente, entre 0,4 e 13,5 casos por

100000 indivíduos [2]. A maioria destas neoplasias é benigna (cerca de 54% a 79%) [1,

3].

O adenoma pleomórfico

(AP) é a neoplasia mais

frequente das glândulas salivares

e representa cerca de 80% das

neoplasias benignas e 60% de

todas as neoplasias destas

glândulas [3-6]. Os AP ocorrem

com mais frequência na glândula

parótida, durante a terceira e

quarta década de vida, e mais

vezes em mulheres do que em

homens [1, 5, 6].

Morfologicamente, o AP caracteriza-se pela presença de três componentes:

epitelial, mioepitelial e estromal (Figura 1) [6]. A variabilidade de proporções e

expressão destes três componentes contribui para o vasto espetro de caraterísticas

histológicas que o AP pode apresentar [6].

O AP tem tendência para recidivar e apresenta potencial de transformação

maligna em 6,2% dos casos [7-9]. O risco de recidiva local do adenoma pleomórfico

após a primeira cirurgia está associado com a presença de variáveis clínico-patológicas

que incluem: idade inferior a 30 anos aquando do diagnóstico, presença de neoplasia

extra-capsular sob a forma de nódulos satélites, variante rica em estroma e excisão

cirúrgica incompleta [1, 5, 6, 10].

A entidade que resulta da transformação maligna do AP (recidiva ou primário)

designa-se por carcinoma ex-adenoma pleomórfico (CAP) e pode ocorrer sob a forma

de vários tipos histológicos [11, 12]. O risco de transformação maligna do AP aumenta

Figura 1 – Adenoma pleomórfico: aspeto morfológico dos

componentes epitelial, mioepitelial e estromal (HE, 400x).

4

com tempo de evolução da

neoplasia desde o diagnóstico e,

provavelmente, resulta da

acumulação de alterações

genéticas [1, 7]. Outros fatores

de risco para a transformação

maligna do AP incluem a origem

da neoplasia na glândula

submandibular, idade mais

avançada (média de 61 anos) do

paciente e maior tamanho da

neoplasia [13].

O CAP representa menos de 4% de todas as neoplasias das glândulas salivares e

12% das neoplasias malignas das glândulas salivares [12, 14, 15]. O seu pico de

incidência etária ocorre na sexta e sétima década de vida, afetando predominantemente

as glândulas major e as minor do palato (Figura 2) [1, 7].

O CAP é uma neoplasia maligna de alto grau de malignidade que é constituída

por áreas de AP e por um componente maligno (Figura 3) [12, 14]. O CAP apresenta,

comparativamente com o AP,

um aumento de frequência das

seguintes caraterísticas

histológicas: hipercromasia e

pleomorfismo nuclear, aumento

da atividade mitótica, necrose,

hialinização da matriz e

infiltração dos tecidos peri-

tumorais [1, 13]. Os locais mais

frequentes de metastização do

CAP são os pulmões e os ossos

[1].

Existem alterações moleculares típicas do AP e do CAP já descritas na literatura,

nomeadamente a sobreexpressão de PLAG1, devido à perda de heterozigotia no

Figura 2 – Imagem de ressonância magnética evidenciando recidiva de

carcinoma ex-adenoma pleomórfico, verificando-se prévia remoção da

parte da mandíbula e osso temporal direito devido à invasão pelo

tumor.

Figura 3 - Transformação maligna do adenoma pleomórfico,

apresentando-se sob a forma de carcinoma mucoepidermóide (HE,

100x)

5

cromossoma 8q, e sobreexpressão de HMGA2, por perda de heterozigotia no

cromossoma 12q [7, 16, 17].

A via de sinalização EGFR/HER2-Akt-

mTOR é uma das vias intracelulares que se

pensa ter importância na regulação do

crescimento, sobrevivência, proliferação,

motilidade e diferenciação celular (Figura 4)

[18-21]. Alterações na expressão dos elementos

desta via de sinalização têm sido associadas ao

desenvolvimento neoplásico, nomeadamente,

em modelos de cancro de mama, cancro colo-

rectal, cancro da bexiga, cancro do ovário, e

carcinoma epidermóide da cabeça e pescoço

[22].

O epidermal growth factor receptor

(EGFR), também conhecido como ErbB1/HER1, é um oncogene que codifica uma

glicoproteína da membrana de 170-kDa, que funciona como um receptor de tirosina

cinase finamente regulado [23]. O gene ErbB2/Neu/HER2 pertence à mesma família do

EGFR e codifica também uma glicoproteína da membrana de 185-kDa [21, 23]. As

neoplasias que apresentam atividade aumentada do EGFR tendem a ter um

comportamento mais agressivo, associado a um pior prognóstico [23]. Quer o EGFR,

quer o HER2, constituem alvos terapêuticos anti-neoplásicos para os fármacos

cetuximab (anticorpo anti-EGFR) e trastuzumab (anticorpo anti-HER2), constituindo

exemplos de terapêutica oncológica dirigida e personalizada [21, 22, 24].

Na via de sinalização EGFR/HER2-Akt-mTOR, o EGFR e o HER2 ligam-se à

PI3K que catalisa reações levando ao recrutamento e ativação da proteína cinase serina-

treonina Akt [19, 22]. A Akt é ativada pela ligação de fatores de crescimento ao recetor

tirosina cinases e adquire capacidade para fosforilar a proteínas mTOR, que intervêm no

desbloqueio da fase G1/S de transição do ciclo celular [20, 22].

Recentemente, um estudo realizado por Ettl et al. [24] mostrou a existência de

uma correlação positiva entre a sobreexpressão e aumento do número de cópias dos

genes EGFR e HER2 e a presença de histologia de alto grau de malignidade em

neoplasias malignas das glândulas salivares. Num outro estudo realizado por Ettl et al.

Figura 4 – Esquema da via celular EGFR/HER2-

Akt-mTOR. (Adaptado de Suzuki et al., 2012

[21] )

6

[20] os autores concluíram que a via PI3K-Akt-mTOR está ativa em neoplasias de

glândulas salivares e que os tumores com sobreexpressão citoplasmática das proteínas

Akt e mTOR apresentavam pior prognóstico. Este é o primeiro estudo que procura

determinar a relação da expressão dos elementos da via EGFR/HER2-Akt-mTOR com

as caraterísticas clínico-patológicas em AP e CAP.

7

Objetivos

Os objetivos deste trabalho de investigação são:

1. Identificar as caraterísticas clínico-patológicas numa série de casos de AP e CAP

que se relacionam com o comportamento e o prognóstico destes tumores.

2. Pesquisar a existência da expressão dos elementos da via de sinalização

EGFR/HER2-Akt-mTOR numa série de tumores de glândulas salivares que

inclui AP e CAP.

3. Identificar, numa série de AP e CAP, a relação entre a expressão dos elementos

da via de sinalização EGFR/HER2-Akt-mTOR, as caraterísticas clínico-

patológicas e com o comportamento destes tumores.

8

Materiais e métodos

Amostra

Trata-se de um estudo retrospetivo com uso de material de arquivo dos Serviços

de Anatomia Patológica do Hospital de São João do Porto e do Instituto Português de

Oncologia do Porto (IPO). A amostra deste estudo engloba 16 tumores de glândulas

salivares minor e major, que incluem 11 AP com mais de 8 anos de vigilância clínica e

5 CAP com mais de 5 anos de vigilância clínica, diagnosticados entre Janeiro de 1999 e

Abril de 2008. Foram registados os seguintes dados das fichas clínicas dos pacientes:

sexo, idade aquando do primeiro diagnóstico, localização do tumor, ocorrência de

recidivas, existência de metástases e estado atual do paciente.

Análise histopatológica

Foram colhidas dos arquivos todas as lâminas coradas com hematoxilina-eosina

(HE) obtidas dos blocos de parafina dos tumores primários e respetivas recidivas

incluídos na amostra em estudo. As lâminas referentes a cada caso foram estudadas ao

microscópico ótico por dois observadores (AC e CE). Para cada caso foram registados

os seguintes dados: tipo histológico, tamanho do tumor, estado da margem cirúrgica,

componente predominante (epitelial, mioepitelial ou estromal), assim como a existência

de cápsula, invasão da cápsula, nódulos satélites, invasão vascular, índice mitótico,

atipia citológica, necrose, inflamação, cistos e metaplasia escamosa. O índice mitótico

foi determinado contando as mitoses presentes em 10 campos de observação do

microscópio ótico (ampliação de 400x). As margens cirúrgicas foram classificadas em

margem com neoplasia e margem sem neoplasia.

Análise imuno-histoquímica

A análise imuno-histoquímica foi realizada nos tumores primários e nas

recidivas tumorais. Para cada caso foram feitos cortes de 3 µm a partir do bloco de

parafina representativo do tumor. Nestas seções foi realizada a coloração imuno-

histoquímica. Em resumo, após a desparafinação das lâminas com EZ prep®, foi

realizada a recuperação antigénica com uma solução à base de EDTA e com um tampão

9

citrato a uma temperatura de

95ºC. Foi utilizado o aparelho

Ventana - Bench Mark Ultra®

(Ventana, Medical Systems,

Tucson, AZ, USA). Os

anticorpos foram usados da

seguinte forma: EGFR

fosforilado (p-EGFRTyr1068

,

policlonal, Cell Signaling

Technology, Beverly, MA,

USA) com uma diluição

1:100 e incubação de 32

minutos, HER2 (PATHWAY anti-HER-2/neu, clone 4B5, Roche, Basel, Switzerland)

pré-diluído e 12 minutos de incubação, mTORser2481

(clone 7C10, Cell Signaling

Technology) com uma diluição 1:50 e incubação de 48 minutos, Akt fosforilado (p-

AktSer473

(clone 736E11, Cell Signaling Technology) com uma diluição 1:50 e

incubação de 48 minutos. Depois da lavagem aplicou-se o Kit DAB de revelação do

Ventana (Ventana, Medical Systems) e hematoxilina para marcação nuclear. Foram

usados os controlos positivos e negativos apropriados.

A expressão imuno-histoquímica de EGFR e HER2 foi membranar e foi avaliada

segundo os seguintes critérios descritos na Tabela I.

Graduação Avaliação da expressão

0 não expresso ou expresso em <10% das células

+1 expressão parcial a fraca em ≥ 10% das células

+2 expressão moderada a fraca em ≥ 10% das

células, e a toda a volta da membrana

+3 expressão forte em todas as células, e a toda a

volta da membrana

Tabela I – Critérios de avaliação da expressão imuno-histoquímica de EGFR e HER2

Figura 5 – Aparelho utilizado para a realização das colorações imuno-

histoquímicas.

10

A expressão imuno-histoquímica de mTOR foi citoplasmática e foi avaliada

segundo os seguintes critérios descritos na Tabela II.

Graduação Avaliação da expressão

0 não expresso ou expresso em <10% das células

+1 expressão fraca em ≥ 10% das células

+2 expressão moderada em ≥ 10% das células

+3 expressão forte em ≥ 10% das células

Tabela II - Critérios de avaliação da expressão imuno-histoquímica de mTOR

A expressão de Akt nas colorações imuno-histoquímicas não foi avaliável

porque, por motivos técnicos, não se conseguiu otimizar a reação do anticorpo para

deteção de expressão da proteína Akt.

Para a análise estatística considerou-se marcação negativa para valores de 0 e

+1, e marcação positiva para valores de +2 e +3.

Análise estatística

Todos os dados registados foram analisados no programa SPSS® para Windows,

versão 20.0 (SPSS, Erkrath, Germany). As relações entre dados dicotómicos clinico-

patológicos e imuno-histoquímicos foram estudados utilizando o teste exato de

probabilidades de Fisher (p<0,050).

11

Resultados

Na Tabela III resumem-se as caraterísticas clinico-patológicas nas neoplasias

estudadas. A amostra de AP compreendia 5 homens e 6 mulheres, com uma média de

idade aquando do diagnóstico de 47,6 anos. Atualmente, os 11 dos pacientes estão vivos

e sem doença. Dos AP estudados, 8 (72,7%) eram da glândula parótida, 1 (9,1%) da

glândula submandibular e 2 (18,2%) de glândulas minor do palato. Recidivaram 6

(54,5%) dos 11 AP, sendo que 5 eram da glândula parótida 1 era do palato.

A amostra de CAP compreendia 2 homens e 3 mulheres, com uma média de

idade aquando do diagnóstico de 46,4 anos. Atualmente, 4 dos pacientes estão vivos e

sem doença e 1 paciente está vivo e com doença. Dos CAP estudados, 2 eram da

glândula submandibular (40%) e 3 eram da glândula parótida (60%). Recidivaram 2

(40%) dos 5 CAP, sendo que era um da glândula parótida e outro da glândula

submandibular. Em nenhum dos casos havia registo de metástases ganglionares

regionais ou à distância. Não se verificou a presença de necrose em nenhum dos casos

de AP e CAP estudados.

Em nenhum dos AP estudados existia invasão vascular, que estava presente em

40% dos CAP. Em nenhum dos CAP analisados se verificou a presença de inflamação

ou cistos, que estavam presentes em 36,4% e 18,2%, respetivamente, dos AP. Todos os

CAP e 81,8% dos AP apresentavam margem cirúrgica com neoplasia.

Figura 6 – Caraterísticas histopatológicas do adenoma pleomórfico. A – Metaplasia escamosa

(HE,200x); B- Cistos (HE, 40x); C – Nódulo satélite (HE,100x); D – Invasão da cápsula

(HE, 40x).

12

Tabela III – Caraterísticas clínico-patológicas das neoplasias estudadas.+ -Presente; - - Ausente; M-Masculino; F-Feminino; VS – Vivo e sem doença; VC – Vivo e com doença; Es- Estromal;

Ep – Epitelial; Mio-Mioepitelial; x – não se aplica; CDuc – Carcinoma Ductal; CMuc – Carcinoma mucoepidermóide; CMio – Carcinoma mioepitelial; * - as caraterísticas descritas

correspondem ao componente benigno.

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o

Casos

AP

1 M 31 Parótida 0 VS 3,5 C/neoplasia Es + - - - 0 - - - - - x

2 F 54 Palato 2 VS 1,5 C/neoplasia Ep - x - - 0 - - + - + x

3 F 48 Parótida 2 VS 0,5 C/neoplasia Mio + - - - 0 - - - - - x

4 M 42 Parótida 0 VS 2,5 S/neoplasia Es - x - - 1 - - - - - x

5 M 58 Palato 0 VS 2,0 C/neoplasia Es - x - - 0 - - - + + x

6 F 36 Parótida 1 VS 0,8 S/neoplasia Es + + - - 0 - - - - - x

7 M 21 Parótida 1 VS 2,7 C/neoplasia Mio - x + - 0 - - + - - x

8 M 64 Submandibular 0 VS 3,0 S/neoplasia Es + + - - 5 - - + + + x

9 F 55 Parótida 1 VS 1,8 S/neoplasia Mio + - - - 3 + - - - - x

10 F 72 Parótida 0 VS 4,5 S/neoplasia Es + - - - 0 - - - - + x

11 F 43 Parótida 2 VS 1,4 C/neoplasia Es + - + - 0 - - + - - x

Casos

CAP *

12 M 40 Submandibular 1 VS 1,2 C/neoplasia Mio - x + + 0 - - - - + CDuc

13 M 65 Submandibular 0 VS 3,5 C/neoplasia Es + + - - 8 + - - - - CDuc

14 F 37 Parótida 0 VS 1,0 C/neoplasia Es + - - - 3 - - - - + CMuc

15 F 29 Parótida 4 VC 2,5 C/neoplasia Mio - x + - 0 - - - - - CMio

16 F 61 Parótida 0 VS 1,7 C/neoplasia Mio - x - + 3 + - - - - CMio

13

Na Tabela IV resume-se a expressão imuno-histoquímica de EGFR, HER2, e

mTOR nas neoplasias. A expressão imuno-histoquímica de EGFR no tecido salivar

peri-tumoral aparentemente normal (Figura 8A), nos casos em que foi possível avaliar,

foi negativa em 85,7% dos casos e positiva em 14,3% dos casos (corresponde apenas

ao caso 9). No tecido neoplásico, dos casos de neoplasia primária e considerando os

AP e o componente benigno dos CAP, a expressão imuno-histoquímica de EGFR

(Figura 8B) foi positiva em 62,5% dos casos e negativa em 37,5% dos casos. Nos

casos de CAP, a expressão de EGFR (Figura 8C) no componente maligno foi

semelhante à do componente benigno. Nos tumores recidivantes, a expressão de

EGFR manteve-se igual à do tumor primário em 62,5% dos casos, diminuiu em 25%

dos casos e aumentou em 12,5% dos casos.

A expressão imuno-histoquímica de HER2 no tecido salivar peri-tumoral

aparentemente normal (Figura 8D), nos casos em que foi possível avaliar, foi negativa

em todos os casos. No tecido neoplásico, dos casos de neoplasia primária e

considerando os AP e o componente benigno dos CAP, a expressão imuno-

histoquímica de HER2 (Figura 8E) foi negativa em 93,7% dos casos e positiva em

6,3% dos casos (corresponde apenas a um caso de CAP - caso 14). A expressão de

HER2 foi negativa em todos os AP que não sofreram transformação maligna. Nos

casos de CAP, a expressão de HER2 no componente maligno foi semelhante à do

componente benigno. Nos tumores recidivantes, a expressão de HER2 (Figura 8F)

manteve-se igual à do tumor primário em 62,5% dos casos e aumentou em 37,5% dos

casos. Comparando a expressão de HER2 nos AP primários e nos AP recidivantes

Figura 7 – Caraterísticas histopatológicas do carcinoma ex-adenoma pleomórfico. A –

anaplasia (HE, 400x); B – Transformação maligna do adenoma pleomórfico, apresentando-se

sob a forma de carcinoma mucoepidermóide (HE, 400x)

14

verifica-se uma diferença estatisticamente significativa (p=0,029), sendo que esta

nunca se verificou nos AP primários.

A expressão imuno-histoquímica de mTOR no tecido salivar peri-tumoral

aparentemente normal (Figura 8G), nos casos em que foi possível avaliar, foi negativa

em 12,5% dos casos e positiva em 87,5% dos casos. No tecido neoplásico, dos casos

de neoplasia primária e considerando os AP e o componente benigno dos CAP, a

expressão imuno-histoquímica de mTOR foi negativa em 50 % dos casos e positiva

em 50 % dos casos. A expressão de mTOR foi positiva no componente benigno de

todos os casos de CAP. Nos casos de CAP, a expressão de mTOR (Figura 9H e I) no

componente maligno foi igual à do componente benigno em 80% dos casos. Nos

tumores recidivantes, a expressão de mTOR manteve-se igual à do tumor primário em

75% dos casos, aumentou em 12,5% dos casos e diminui em 12,5% dos casos.

Figura 8 - A – Expressão de EGFR em parênquima de glândula salivar peritumoral (400x); B- Expressão de EGFR

em adenoma pleomórfico (200x); C- Expressão de EGFR em carcinoma ex- adenoma pleomórfico (200x); D –

Expressão de HER2 em parênquima de glândula salivar peritumoral (200x); E- Expressão de HER2 em adenoma

pleomórfico (100x); F- Expressão de HER2 em recidiva de adenoma pleomórfico (200x); G – Expressão de mTOR

em parênquima de glândula salivar peritumoral (100x); H e I- Expressão de mTOR em carcinoma ex-adenoma

pleomórfico (200x).

15

Caraterísticas

Imuno-histoquímicas

EGFR

peri-tumoral

EGFR

neoplasia

primária

EGFR

recidiva

HER2

peri-tumoral

HER2

neoplasia

primária

HER2

recidiva

mTOR

peri-tumoral

mTOR

neoplasia

primária

mTOR

recidiva

Casos AP

1 NA + x NA - x NA - x

2 NA + + NA - - NA - -

3 NA - + NA - - NA + +

4 - - x - - x + - x

5 - - x - - x + - x

6 - - - - - + + - +

7 NA - - NA - + NA + -

8 NA + x NA - x NA - x

9 + + - - - + + - -

10 - + x - - x - + x

11 NA + - - - - + - -

Casos CAP B M B M B M B M B M B M

12 NA + + + + NA - - - - NA + + - -

13 NA + + x x NA - - x x NA + + x x

14 - + + x x - + + x x + + - x x

15 NA + + + + NA - - - - NA + + - -

16 - - - x x NA - - x x + + + x x

Tabela IV - Caraterísticas imuno-histoquímicas das neoplasias estudadas. + - positivo ; - - negativo; NA- não avaliável por falta de representatividade no bloco da parafina selecionado; B -

componente benigno; M-componente maligno; x – caso sem recidiva.

16

A relação entre as caraterísticas clínico-patológicas e a expressão imuno-

histoquímica de HER2, EGFR e mTOR nos casos de AP, e a ocorrência de recidiva

nestes tumores está descrita na Tabela V. Verificou-se uma maior tendência para a

ocorrência de recidiva do AP em pacientes do sexo feminino (p=0,080) e em tumores

com tamanho inferior a 2 cm (p=0,080). Dos 6 tumores com tamanho inferior a 2 cm, 4

apresentavam margem cirúrgica com neoplasia. Verificou-se também que, em todos os

casos de AP que não recidivaram, o componente predominante era o estroma (p=0,061).

Apenas os casos de AP com recidiva apresentavam nódulos satélites.

Na Tabela VI sumarizam-se as caraterísticas clínico-patológicas e a expressão de

HER2, EGFR e mTOR nos AP e no componente benigno dos CAP e a sua relação com

a transformação maligna. Nenhum dos fatores clínico-patológicos estudados apresentou

associação significativa com a transformação maligna do tumor. Nenhum dos AP que

sofreu transformação maligna apresentava inflamação. Verificou-se a existência de uma

associação estatisticamente significativa entre a expressão de mTOR nos tumores

primários e a ocorrência de transformação maligna (p=0,026). Dos tumores que

sofreram transformação maligna apenas um não apresentava expressão de EGFR.

17

Caraterística Com recidiva (n=6) Sem recidiva (n=5) p

Idade ≤ 47

> 47

3

3

2

3 1,000

Sexo Masculino

Feminino

1

5

4

1 0,080

Margem cirúrgica Margem sem neoplasia

Margem com neoplasia

2

4

3

2 0,567

Tamanho tumor ≤ 2 cm

> 2 cm

5

1

1

4 0,080

Componente

predominante

Epitelial ou Mioepitelial

Estroma

4

2

0

5 0,061

Índice mitótico ≤ 2

> 2

5

1

4

1 1,000

Cápsula Presente

Ausente

3

3

3

2 1,000

Invasão da cápsula

ou nódulos satélites

Presente

Ausente

3

3

1

4 0,545

Metaplasia escamosa Presente

Ausente

1

5

3

2 0,242

Atipia citológica Presente

Ausente

1

5

0

5 1,000

Inflamação Presente

Ausente

3

3

1

4 0,545

Cistos Presente

Ausente

0

6

2

3 0,182

Expressão mTOR no

tumor primário

Presente

Ausente

2

4

1

4 1,000

Expressão EGFR no

tumor primário

Positivo

Negativo

3

3

3

2 1,000

Tabela V – Análise das características clínico-patológicas e expressão imuno-histoquímica de EGFR e mTOR e a sua

relação com a ocorrência de recidiva nos adenomas pleomórficos.

18

Tabela VI - Análise das características clínico-patológicas e a expressão imuno-histoquímica de HER2, EGFR e

mTOR nas áreas de adenoma pleomórfico dos tumores estudados e a sua relação com a ocorrência de transformação

maligna.

Caraterística

AP com

transformação

maligna (n=5)

AP sem

transformação

maligna (n=11)

p

Idade ≤ 40

> 40

3

2

3

8 0,299

Sexo Masculino

Feminino

2

3

5

6 1,000

Tipo de margem

cirúrgica

Margem sem neoplasia

Margem com neoplasia

0

5

5

6 0,119

Componente

predominante

Epitelial ou Mioepitelial

Estroma

3

2

4

7 0,596

Índice mitótico ≤ 2

> 2

9

2

2

3 0,245

Cápsula Presente

Ausente

2

3

6

5 1,000

Invasão da cápsula

ou nódulos satélites

Presente

Ausente

3

2

4

7 0,596

Invasão vascular Presente

Ausente

2

3

0

11 0,083

Metaplasia escamosa Presente

Ausente

2

3

4

7 1,000

Atipia citológica Presente

Ausente

2

3

1

10 0,214

Inflamação Presente

Ausente

0

5

4

7 0,245

Cistos Presente

Ausente

0

5

2

9 1,000

Expressão mTOR Positivo

Negativo

5

0

3

8 0,026

Expressão HER2 Positivo

Negativo

1

4

0

11 0,313

Expressão EGFR Positivo

Negativo

4

1

6

5 0,588

19

Discussão

O AP apresenta uma maior tendência para recidivar do qualquer outro tumor das

glândulas salivares e tem capacidade de malignização, pelo que é relevante perceber o

que influencia a sua recidiva e a sua transformação maligna [5]. Não existem muitos

estudos sobre os fatores de risco clínico-patológicos relacionados com a recidiva do AP.

Alguns estudos realizados evidenciaram que a recidiva do AP é mais frequente

em pacientes mais jovens, pois quanto mais novo for o paciente maior será,

teoricamente, o número de anos que ainda tem de vida [5, 10, 25, 26]. Porém, outros

estudos não verificaram qualquer relação entre a idade e a recidiva do AP [27-29].

Neste estudo, a média de idades aquando do primeiro diagnóstico foi de 47,6 anos, o

que está de acordo com os valores médios encontrados na literatura [5, 27, 30, 31], que

variam entre 41-49, mas não se verificou uma associação significativa ente a idade

aquando do primeiro diagnóstico e a ocorrência de recidiva do AP. Apesar da série

estudada ser limitada em termos de número de casos, estes têm um tempo de vigilância

clínica elevado, o que confere significado a estes resultados.

Verificou-se uma maior tendência para a ocorrência de recidiva do AP em

pacientes do sexo feminino (p=0,080). Resultados semelhantes foram encontrados por

Wittekindt et al. e Friedrich et al. [26, 32]. No entanto, noutros estudos não se verificou

relação significativa entre a ocorrência de recidiva do AP e o sexo [25, 27-29].

A patogénese exata do CAP ainda não está bem estabelecida. Gerughty et al.

[33] apresentaram a hipótese destes tumores serem malignos desde o princípio, visto

que 60% dos pacientes da sua amostra não tinham qualquer registo de um tumor pré-

existente. Por outro lado, Katabi et al. [14] defenderam a ocorrência de transformação

maligna de um tumor benigno, baseando-se na idade média de surgimento dos tumores,

que é menor nos tumores benignos, e na presença prévia de uma massa relatada pela

maioria dos pacientes. No nosso estudo todos os CAP apresentavam, no exame

histológico, um componente benigno, pelo que se tratam de casos de AP que sofreu

transformação maligna.

Alguns dos fatores que têm sido associados com uma maior probabilidade de

ocorrência de transformação maligna do AP são a idade acima de 40 anos aquando do

tratamento inicial e o sexo masculino [5]. No nosso estudo 60% dos apresentavam idade

inferior a 40 anos aquando do diagnóstico de CAP, e não se verificou correlação

significativa entre a idade do paciente e a ocorrência de transformação maligna, nem

20

entre o sexo e a ocorrência de transformação maligna. Estes achados, tais como os

anteriormente descritos, terão de ser enquadrados nas limitações da amostra.

Verificou-se uma relação próxima da significância estatística entre o

componente predominante do AP e a ocorrência de recidiva (p=0,061). Todos os casos

de AP sem recidiva apresentavam como componente predominante o estroma. O

estroma é um elemento importante do AP e pode assumir diversas formas:

mixóide/mucóide, cartilagíneo ou hialino [1]. Este resultado não está de acordo com o

estudo realizado por Stennert et al. [34], que observou uma predominância do tipo

mixóide nas recidivas de AP, sendo que este tipo está associado a um maior risco de

recidiva, pois estes tumores apresentam zonas focais de ausência de encapsulação e

nódulos satélites. Por outro lado, os estudos realizados por Soares et al. e Park et al. [5,

30] não encontraram nenhuma evidência da existência de uma relação entre o estroma

mixóide ser o componente predominante em AP com recidiva. O resultado obtido no

nosso estudo pode ser explicado pelo enviesamento resultante de a amostra ser pequena,

e por não se ter feito uma classificação diferencial do subtipo de estroma.

Também a relação entre o tamanho do AP e a ocorrência da recidiva foi próxima

da significância estatística (p=0,080), tendo verificado que esta era maior nos tumores

mais pequenos. O estudo realizado por Redaelli de Zinis et al. [27] encontrou resultados

semelhantes, mas sem significância estatística. Este resultado pode ser explicado pela

tendência a efetuar cirurgias menos mutilantes nos casos de tumores pequenos, que

depois são complicadas por dificuldades operatórias. Os tumores desta série que eram

pequenos e que se localizavam na parótida (proximidade de estruturas nervosas

derivadas do nervo facial) e no palato (difícil pela localização e caraterísticas da

mucosa), podem eventualmente enquadrar-se neste grupo e ter tido como consequência

desta abordagem a não remoção total do tumor [30, 35, 36]. De facto, dos 6 casos com

tamanho inferior a 2 cm, 4 apresentavam margem cirúrgica com neoplasia, que é um

dos principais fatores de risco para a ocorrência de recidiva do AP [1, 5]. Neste estudo a

ocorrência de recidiva não está significativamente associada ao estado da margem

cirúrgica, no entanto, existe um número muito elevado de casos em que a margem

apresenta neoplasia numa amostra pequena, pelo que pode existir enviesamento dos

resultados.

Apenas os casos de AP com recidiva apresentavam nódulos satélites. O facto dos

nódulos satélites serem pequenos e nem sempre serem detetados nos exames

imagiológicos pode ter como consequência a sua não remoção durante o procedimento

21

cirúrgico, permitindo que estas células tumorais permaneçam no local e se continuem a

dividir, levando à recidiva do tumor [5]. Soares et al. [5] reportaram a presença de

nódulos satélites em todos os casos de AP recidivantes que analisaram. Stennert et al.

[34] num estudo histológico prospetivo, reportaram a existência de nódulos satélites em

cerca de 90% dos AP recidivantes. Park et al. [30] encontraram uma correlação entre a

existência de nódulos satélites e a ocorrência de recidiva.

A invasão vascular é tida uma como uma caraterística típica das neoplasias

malignas, mas alguns estudos mostraram que, excecionalmente, pode ocorrer no AP

[37, 38]. No entanto, pensa-se que é difícil para as células do AP sobreviveram por

muito tempo na corrente sanguínea devido às defesas imunitárias do hospedeiro, o que

justificaria a ausência de desenvolvimento de metástase em AP [37, 38]. Na série

estudada, verificou-se que a invasão vascular foi exclusiva dos tumores com

transformação maligna, o que está de acordo com a maioria das séries descritas na

literatura.

Nenhum dos casos de AP com recidiva ou AP com transformação maligna

apresentava cistos. A degeneração cística é uma caraterística histopatológica que pode

ocorrer nos AP, e por vezes tem como consequência o diagnóstico incorreto de

carcinoma mucoepidermóide [1, 39-41]. Nos casos descritos na literatura não existe

referência à ocorrência de recidiva nem de transformação maligna destes tumores [39-

41], pelo que se deve aprofundar a possibilidade de esta ser uma caraterística indicativa

de não recidiva e não malignidade.

Nenhum dos casos de AP com transformação maligna apresentava inflamação.

De acordo com o estudo realizado por Weichhart et al. [42] em monócitos humanos

isolados e células dendríticas mieloides, a ativação do mTOR inibe a produção de

citocinas pró-inflamatórias e estimula a libertação de citocinas anti-inflamatórias. Nesta

série, nos tumores estudados onde ocorreu transformação maligna verificou-se

sobreexpressão de mTOR, o que pode estar relacionado com esta ausência de

inflamação nestas neoplasias e que pode ser encarada como um fator promotor da

transformação maligna no AP. Resultados semelhantes tinham já sido obtidos por

Murayma et al. [43] no estudo do carcinoma gástrico, que verificaram que a expressão

citoplasmática de mTOR estava positivamente relacionada com a profundidade de

invasão de tumor e envolvimento de gânglios linfáticos, que são marcadores de

malignidade. Sabe-se que o mTOR é responsável pela regulação da proliferação celular

através da fosforilação de p70S6 na fase de transição de G1/S do ciclo celular, pelo que

22

a sua expressão alterada pode conduzir a uma proliferação celular desregulada, que é

caraterística das células malignas [44]. O mTOR é um alvo da rapamicina, um fármaco

antineoplásico cuja eficácia foi já avaliada com bons resultados em vários tumores

sólidos, incluindo neoplasias renais, da mama e do pâncreas [44-47]. Seria útil efetuar

estudos do tipo ensaio clínico para tratamento de CAP da glândula salivar com

inibidores do mTOR.

A amplificação/sobreexpressão do gene EGFR tem sido associada ao

desenvolvimento de várias neoplasias malignas no ser humano [48]. No que respeita aos

carcinomas de glândulas salivares, não existem muitos estudos e estes têm resultados

contraditórios. No estudo realizado por Katori et al. [49] verificou-se uma associação

entre a sobreexpressão do EGFR e o desenvolvimento de CAP. No estudo realizado por

Sugano et al. [50] os AP não apresentavam sobreexpressão de EGFR, mas esta existia

nos CAP estudados em áreas com caraterísticas consideradas transitórias entre

componentes benignos e malignos. No nosso estudo não se verificou nenhuma

associação estatisticamente significativa entre a expressão de EGFR e transformação

maligna do AP, mas nos tumores que sofreram transformação maligna apenas um não

apresentava expressão de EGFR. Estas observações podem indicar que a amplificação

do EGFR constitui uma etapa inicial no processo de transformação neoplásica,

principalmente porque a sua expressão é muito mais frequente em AP e CAP do que no

tecido peri-tumoral aparentemente normal. No caso do carcinoma do pulmão, a

sobreexpressão de EGFR é um dos sinais precoces de transformação neoplásica, estando

presente nos estádios pré-malignos [51].

Verificou-se que a expressão de HER2 era maior nas recidivas de AP quando

comparada com a expressão no AP primários, sendo que esta diferença é

estatisticamente significativa e não está documentada na literatura. A expressão de

HER2 em AP foi apenas estudada por Di Palma et al. [52], que não encontrou

sobreexpressão desta proteína.

Existe uma grande quantidade de evidências científicas que associam a

sobreexpressão de HER2 à malignidade em várias neoplasias humanas, incluindo as

neoplasias de glândulas salivares [21, 24]. No estudo realizado por Suzuki et al.,

verificou-se uma sobreexpressão do HER2 em 43% dos CAP estudados [21]. Também o

estudo realizado por Ettl et al. [24] demonstrou que a sobreexpressão HER2 está

presente em várias neoplasias malignas de glândulas salivares, tendo impacto no

prognóstico. No nosso estudo não foi encontrada nenhuma associação significativa entre

23

a expressão de HER2 e a transformação maligna, nem uma maior expressão deste nos

tumores com componente maligno, mas verificou-se que a expressão de HER2 era

negativa em todos os tumores que não sofreram transformação maligna. Deveria

realizar-se um estudo na população portuguesa com uma amostra maior, para poder

aferir se esta relação, de facto, existe. O estudo da expressão de HER2 reveste-se de

especial importância pois esta proteína é um alvo de terapêutica oncológica dirigida e

personalizada. Na literatura existem já casos descritos da utilização de trastuzumab no

tratamento de CAP com expressão significativa de HER2, tendo-se obtido bons

resultados [53, 54].

O nosso estudo apresenta algumas limitações. Como a amostra estudada é

pequena possíveis relações estatisticamente significativas existentes entre os dados

clínico-patológicos e imuno-histoquímicos, e entre estes e a ocorrência de recidiva e

transformação maligna podem não ser evidentes.

Como na amostra estudada, à exceção de um caso, todos os pacientes se

apresentavam vivos e sem doença, não foi possível calcular curvas de sobrevivência,

nem relacionar fatores clínico-patológicos e imuno-histoquímicos com a sobrevivência

e a presença de doença. Para tal, devem ser realizados estudos que englobem uma

amostra maior.

24

Conclusões

Tal como noutras séries, verificou-se na série estudada que o sexo

feminino, o tamanho dos tumores menor que 2 cm e a presença de nódulos satélites estão

associados a uma maior frequência de recidivas de AP. Nesta série, os casos de AP que

não recidivaram tinham o estroma como componente predominante.

Nenhum dos CAP apresentava inflamação tumoral ou cistos, que

parecem ser caraterísticas patológicas associadas a comportamento benigno.

O EGFR está expresso com mais frequência nos AP e CAP que no tecido

de glândula salivar peri-tumoral aparentemente normal, sugerindo um papel importante

desta proteína na transformação neoplásica.

O HER2 está expresso com mais frequências nas recidivas de AP e nos

CAP do que nos AP primários, indicando um papel desta proteína na progressão

neoplásica deste modelo tumoral. A confirmação desta associação em séries maiores

poderá justificar o uso de terapia dirigida anti-HER2 em CAP resistentes ao tratamento

cirúrgico.

A expressão de mTOR em AP e CAP está associada à ausência de

inflamação tumoral e ao comportamento destas neoplasias, parecendo ser um indicador

de transformação maligna do AP. A confirmação desta associação em séries maiores

poderá justificar o uso de terapia dirigida anti-mTOR em CAP resistentes ao tratamento

cirúrgico.

25

Referências bibliográficas

1. Barnes, L., Eveson J.W., Reichart P., Sidransky D., World Health Organization Classification

of Tumours. Pathology and Genetics of Head and Neck Tumours., 2005, IARC Press: Lyon.

2. Eveson, J.W., Salivary tumours. Periodontol 2000, 2011. 57(1): p. 150-9.

3. Luksic, I., et al., Salivary gland tumours: 25 years of experience from a single institution in

Croatia. J Craniomaxillofac Surg, 2012. 40(3): p. e75-81.

4. Bradley, P.J. and M. McGurk, Incidence of salivary gland neoplasms in a defined UK

population. Br J Oral Maxillofac Surg, 2013. 51(5): p. 399-403.

5. Soares, A.B., A. Altemani, and V.C. de Araujo, Study of histopathological, morphological

and immunohistochemical features of recurrent pleomorphic adenoma: an attempt to predict

recurrence of pleomorphic adenoma. J Oral Pathol Med, 2011. 40(4): p. 352-8.

6. Lingam, R.K., et al., Pleomorphic adenoma (benign mixed tumour) of the salivary glands: its

diverse clinical, radiological, and histopathological presentation. Br J Oral Maxillofac Surg,

2011. 49(1): p. 14-20.

7. Antony, J., et al., Carcinoma ex pleomorphic adenoma: a comprehensive review of clinical,

pathological and molecular data. Head Neck Pathol, 2012. 6(1): p. 1-9.

8. Anand, A. and E.S. Brockie, Cytomorphological features of salivary duct carcinoma ex

pleomorphic adenoma: diagnosis by fine-needle aspiration biopsy with histologic correlation.

Diagn Cytopathol, 1999. 20(6): p. 375-8.

9. Di Palma, S., Carcinoma ex pleomorphic adenoma, with particular emphasis on early lesions.

Head Neck Pathol, 2013. 7 Suppl 1: p. S68-76.

10. McGregor, A.D., M. Burgoyne, and K.C. Tan, Recurrent pleomorphic salivary adenoma--

the relevance of age at first presentation. Br J Plast Surg, 1988. 41(2): p. 177-81.

11. Demasi, A.P., et al., Peroxiredoxin I, platelet-derived growth factor A, and platelet-derived

growth factor receptor alpha are overexpressed in carcinoma ex pleomorphic adenoma:

association with malignant transformation. Hum Pathol, 2009. 40(3): p. 390-7.

12. Mariano, F.V., et al., Carcinoma ex pleomorphic adenoma in a Brazilian population: clinico-

pathological analysis of 38 cases. Int J Oral Maxillofac Surg, 2013. 42(6): p. 685-92.

13. McHugh, J.B., D.W. Visscher, and E.L. Barnes, Update on selected salivary gland

neoplasms. Arch Pathol Lab Med, 2009. 133(11): p. 1763-74.

14. Katabi, N., et al., Prognostic factors of recurrence in salivary carcinoma ex pleomorphic

adenoma, with emphasis on the carcinoma histologic subtype: a clinicopathologic study of 43

cases. Hum Pathol, 2010. 41(7): p. 927-34.

15. Olsen, K.D. and J.E. Lewis, Carcinoma ex pleomorphic adenoma: a clinicopathologic

review. Head Neck, 2001. 23(9): p. 705-12.

16. Martins, C., et al., PLAG1 gene alterations in salivary gland pleomorphic adenoma and

carcinoma ex-pleomorphic adenoma: a combined study using chromosome banding, in situ

hybridization and immunocytochemistry. Mod Pathol, 2005. 18(8): p. 1048-55.

17. Voz, M.L., W.J. Van de Ven, and K. Kas, First insights into the molecular basis of

pleomorphic adenomas of the salivary glands. Adv Dent Res, 2000. 14: p. 81-3.

18. Oda, K., et al., A comprehensive pathway map of epidermal growth factor receptor

signaling. Mol Syst Biol, 2005. 1: p. 2005 0010.

19. Luo, J., B.D. Manning, and L.C. Cantley, Targeting the PI3K-Akt pathway in human

cancer: rationale and promise. Cancer Cell, 2003. 4(4): p. 257-62.

26

20. Ettl, T., et al., The PI3K/AKT/mTOR signalling pathway is active in salivary gland cancer

and implies different functions and prognoses depending on cell localisation. Oral Oncol, 2012.

48(9): p. 822-30.

21. Suzuki, S., et al., EGFR and HER2-Akt-mTOR signaling pathways are activated in

subgroups of salivary gland carcinomas. Virchows Arch, 2012. 461(3): p. 271-82.

22. LoPiccolo, J., et al., Targeting the PI3K/Akt/mTOR pathway: effective combinations and

clinical considerations. Drug Resist Updat, 2008. 11(1-2): p. 32-50.

23. Zandi, R., et al., Mechanisms for oncogenic activation of the epidermal growth factor

receptor. Cell Signal, 2007. 19(10): p. 2013-23.

24. Ettl, T., et al., EGFR, HER2, survivin, and loss of pSTAT3 characterize high-grade

malignancy in salivary gland cancer with impact on prognosis. Hum Pathol, 2012. 43(6): p.

921-31.

25. Malard, O., et al., Prognostic factors for secondary recurrence of pleomorphic adenoma: a

20-year, retrospective study. J Laryngol Otol, 2013. 127(9): p. 902-7.

26. Wittekindt, C., et al., Recurrent pleomorphic adenoma of the parotid gland: analysis of 108

consecutive patients. Head Neck, 2007. 29(9): p. 822-8.

27. Redaelli de Zinis, L.O., et al., Management and prognostic factors of recurrent pleomorphic

adenoma of the parotid gland: personal experience and review of the literature. Eur Arch

Otorhinolaryngol, 2008. 265(4): p. 447-52.

28. Glas, A.S., et al., Surgical treatment of recurrent pleomorphic adenoma of the parotid gland:

a clinical analysis of 52 patients. Head Neck, 2001. 23(4): p. 311-6.

29. Yugueros, P., et al., Treating recurrence of parotid benign pleomorphic adenomas. Ann Plast

Surg, 1998. 40(6): p. 573-6.

30. Park, G.C., et al., Relationship between histopathology of pleomorphic adenoma in the

parotid gland and recurrence after superficial parotidectomy. J Surg Oncol, 2012. 106(8): p.

942-6.

31. Soares, A.B., et al., Angiogenic and lymphangiogenic microvessel density in recurrent

pleomorphic adenoma. J Oral Pathol Med, 2009. 38(8): p. 623-9.

32. Friedrich, R.E., et al., Pleomorphic adenoma of the salivary glands: analysis of 94 patients.

Anticancer Res, 2005. 25(3A): p. 1703-5.

33. Gerughty, R.M., et al., Malignant mixed tumors of salivary gland origin. Cancer, 1969.

24(3): p. 471-86.

34. Stennert, E., et al., Histopathology of pleomorphic adenoma in the parotid gland: a

prospective unselected series of 100 cases. Laryngoscope, 2001. 111(12): p. 2195-200.

35. Aydil, U., et al., Neoplasms of the hard palate. J Oral Maxillofac Surg, 2014. 72(3): p. 619-

26.

36. Villanueva, N.L., et al., Transoral robotic surgery for the management of oropharyngeal

minor salivary gland tumors. Head Neck, 2014. 36(1): p. 28-33.

37. Maruyama, S., et al., Keratinocyte growth factor colocalized with perlecan at the site of

capsular invasion and vascular involvement in salivary pleomorphic adenomas. J Oral Pathol

Med, 2009. 38(4): p. 377-85.

38. Coleman, H. and M. Altini, Intravascular tumour in intra-oral pleomorphic adenomas: a

diagnostic and therapeutic dilemma. Histopathology, 1999. 35(5): p. 439-44.

39. Brachtel, E.F., et al., Fine-needle aspiration biopsy of a cystic pleomorphic adenoma with

extensive adnexa-like differentiation: differential diagnostic pitfall with mucoepidermoid

carcinoma. Diagn Cytopathol, 2003. 28(2): p. 100-3.

40. Takeshita, T., et al., Benign pleomorphic adenoma with extensive cystic degeneration:

unusual MR findings in two cases. Radiat Med, 2004. 22(5): p. 357-61.

27

41. Nishimura, T., M. Furukawa, and E. Kawahara, Pleomorphic adenoma of parotid gland with

cystic degeneration. J Laryngol Otol, 1994. 108(5): p. 446-8.

42. Weichhart, T., et al., The TSC-mTOR signaling pathway regulates the innate inflammatory

response. Immunity, 2008. 29(4): p. 565-77.

43. Murayama, T., et al., Relation between outcomes and localisation of p-mTOR expression in

gastric cancer. Br J Cancer, 2009. 100(5): p. 782-8.

44. Petroulakis, E., et al., mTOR signaling: implications for cancer and anticancer therapy. Br J

Cancer, 2006. 94(2): p. 195-9.

45. Ciruelos Gil, E.M., Targeting the PI3K/AKT/mTOR pathway in estrogen receptor-positive

breast cancer. Cancer Treat Rev, 2014.

46. Kanesvaran, R. and M.H. Tan, Targeted therapy for renal cell carcinoma: The next lap. J

Carcinog, 2014. 13: p. 3.

47. Liu, E., P. Marincola, and K. Oberg, Everolimus in the treatment of patients with advanced

pancreatic neuroendocrine tumors: latest findings and interpretations. Therap Adv

Gastroenterol, 2013. 6(5): p. 412-9.

48. Ciardiello, F. and G. Tortora, EGFR antagonists in cancer treatment. N Engl J Med, 2008.

358(11): p. 1160-74.

49. Katori, H., A. Nozawa, and M. Tsukuda, Expression of epidermal growth factor receptor,

transforming growth factor-alpha and Ki-67 in relationship to malignant transformation of

pleomorphic adenoma. Acta Otolaryngol, 2007. 127(11): p. 1207-13.

50. Sugano, S., et al., Immunohistochemical study of c-erbB-2 oncoprotein overexpression in

human major salivary gland carcinoma: an indicator of aggressiveness. Laryngoscope, 1992.

102(8): p. 923-7.

51. Franklin, W.A., et al., Epidermal growth factor receptor family in lung cancer and

premalignancy. Semin Oncol, 2002. 29(1 Suppl 4): p. 3-14.

52. Di Palma, S., et al., Non-invasive (intracapsular) carcinoma ex pleomorphic adenoma:

recognition of focal carcinoma by HER-2/neu and MIB1 immunohistochemistry.

Histopathology, 2005. 46(2): p. 144-52.

53. Kadowaki, S., et al., Complete Response to Trastuzumab-Based Chemotherapy in a Patient

with Human Epidermal Growth Factor Receptor-2-Positive Metastatic Salivary Duct Carcinoma

ex Pleomorphic Adenoma. Case Rep Oncol, 2013. 6(3): p. 450-5.

54. Sharon, E., R.J. Kelly, and E. Szabo, Sustained response of carcinoma ex pleomorphic

adenoma treated with trastuzumab and capecitabine. Head Neck Oncol, 2010. 2: p. 12.

Imagem capa:

Aspeto histológico de adenoma pleomórfico de glândula parótida (HE, 200x)

28

Agradecimentos

À Professora Doutora Catarina Eloy agradeço pela enorme ajuda e apoio que me

disponibilizou ao longo da realização deste trabalho e pela exigência das suas correções.

Agradeço também tudo o que me ensinou durante este percurso sobre a realização de

investigação científica e por me ter proporcionado a oportunidade de aprender técnicas

que, de outra forma, não teria aprendido.

Às técnicas Sandra Relvas, Salomé Pereira, Bárbara Gomes e Helena Pereira, do

Serviço de Anatomia Patológica do Hospital de S.João, agradeço a amabilidade e

disponibilidade, e a colaboração na preparação das lâminas histológicas e na realização

das colorações imuno-histoquímicas.

Ao Dr. Manuel Jacóme e Dra. Diana Felizardo, do IPO do Porto, agradeço a

colaboração na realização deste trabalho de investigação.

À Novartis Oncoloy, pelo financiamento deste projeto de investigação.

À minha família, por me ter proporcionado as melhores condições para que pudesse

estudar e desenvolver todas as minhas capacidades. Saliento o papel da minha mãe, Dra.

Ana Pedrosa, na escolha da minha profissão e o seu exemplo como Médica Dentista.

Aos meus colegas de curso, em especial o meu binómio Fábio, Carolina e Henrique,

agradeço o apoio, a ajuda e todos os bons momentos que vivemos ao longo do curso.

Às minhas amigas de sempre, Catarina, Andreia e Rita, por todo incentivo e apoio e por

18 anos de amizade verdadeira.

Ao Bruno, o meu melhor amigo, agradeço todo o amor, toda a compreensão, paciência

inesgotável e ajuda ao longo deste percurso. Agradeço também por me incentivar

sempre com otimismo e nunca me deixar desistir ou esmorecer.

29

ANEXOS

30

Anexo 1 – Parecer da Comissão de Ética da FMDUP

31

Anexo 2 – Declaração de autoria

32

Anexo 3 – Parecer do Orientador