Aplica ção agronômica de bactérias metilotr óficas∗ Rota da ribulose monofosfato (RuMP) Semin...

LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil

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AplicaAplicaçção agronômica deão agronômica de

bactbactéérias rias metilotrmetilotróóficasficas

Aluno: Andréa Cristina BogasOrientador: Dr. Welington Luiz de Araújo

SumSumááriorio

SeminSemináário Prio Póóss--GraduaGraduaçção ão –– AplicaAplicaçção agronômica de bactão agronômica de bactéérias rias metilotrmetilotróóficasficas

∗∗∗∗∗∗∗∗ IntroduIntroduççãoão

- Definição de bactéria metilotrófica

- Taxonomia

- Local na natureza

∗∗∗∗∗∗∗∗ BactBactéérias rias metilotrmetilotróóficasficas em associaem associaçção com plantasão com plantas

- Qual a relação entre bactérias metilotróficas e plantas

∗∗∗∗∗∗∗∗ AplicaAplicaçção de bactão de bactéérias rias metilotrmetilotróóficasficas na Agronomiana Agronomia

BactBactééria ria MetilotrMetilotróóficafica

DefiniDefiniçção:ão:

Bactéria capaz de crescer à custa da redução de compostos de carbono

contendo um ou mais átomos de carbono, mas que não contém ligações C-C (Toyama;

Anthony; Lidstrom, 1998).

IntroduIntroduççãoão



⇒ 1900: descoberta da capacidade de crescer metilotroficamente;

∗Söhngen (1906) : Bacillus methanicus – único representante na literatura capaz de crescer sobre compostos de carbono como fonte de carbono e energia.

⇒ 1960 – 1970: (Whittenbury e cols) compreensão da natureza bioquímica desta capacidade de crescer metilotroficamente começou a emergir – produção de proteínas;

∗ Caracterização de enzimas para a oxidação de substratos de carbono

∗ Descoberta de distintos modos de assimilação de carbono


⇒ 1982: Christopher Anthony - Bioquímica dos Metilotróficos - descrição dos processos bioquímicos envolvidos na metilotrofia – vias metabólicas;

⇒ Melhor compreensão e complementação dos dados metabólicos ocorreram com o advento de estudos genéticos:

∗ tecnologia do DNA recombinante

∗ sequenciamento de genomas combinado à análise funcional dos genes



∗Bioquímica∗Metabolismo∗Regulação gênica ∗Ecologia∗Exploração comercial

Monóxido de carbono CO

Formamida HCONH2

Tetrametilamônia (CH3)4N+Fomaldeído HCHO

Trimetilamina (CH3)3NMetilamina CH2NH2

Dimetilamina (CH3)2NHMetanol CH3OH

Éter dimetil (CH3)2OMetano CH4

Compostos contendo mais de um átomo de carbono

Compostos contendo

um átomo de carbono

Tabela 1. Substratos usados para crescimento de bactérias metilotróficas

Fonte: Anthony, C.(1982)


⇒⇒⇒⇒ Bactérias metilotróficas obrigatórias:

∗ crescem somente sobre compostos de apenas um carbono (C1)

⇒⇒⇒⇒ Bactérias metilotróficas facultativas:

∗ capazes de crescer sobre compostos C1 bem como sobre uma variedade

de outros compostos contendo mais de um átomo de carbono (C2, C3, C4)



⇒⇒⇒⇒ Classificação funcional:

∗ Fonte de carbono utilizada

∗ Rota de assimilação de carbono

⇒⇒⇒⇒ Classificação filogenética:

∗Análise de sequências ribossomais (5S e 16S)



Taxonomia das bactTaxonomia das bactéérias rias metilotrmetilotróóficasficas

⇒⇒⇒⇒⇒⇒⇒⇒ ClassificaClassificaççãoão funcionalfuncional::

1.Fonte de carbono

∗ Bactérias metanotróficas – metilotróficas capazes de oxidar metano

∗ Bactérias metilotróficas - não utilizam metano (metanol, metilamina)





A habilidade de uma bactéria metilotrófica utilizar metano ou metanol como substrato está correlacionada ao fato dela possuir :

∗ enzima para oxidação de metano: metano monooxigenase

CH4 + O2 + NADH + H+ CH3OH + H2O + NAD

∗ enzima para oxidação de metanol: metanol desidrogenase

CH3OH + PPQ(ox) HCHO + PPQ(red)




Figura 1. Eletromicografia de bactéria metanotrófica. A – Methylococcus capsulatus, ilustrando o sistema de membrana Tipo I; B – Methylosinus sp., ilustrando o sistema de membrana Tipo II.

A

Tipo I

B

Tipo II

Madigan et al., 2003

Sistema de membranas internas




2. Rota de assimilação de carbono:

∗ Rota da serina

∗ Rota da ribulose monofosfato (RuMP)





- Domínio Bactéria- Classe das Proteobactérias (bactérias púrpuras): 3 subdivisões

∗ alfa∗ beta∗ gama




∗ Alfa-proteobactéria – Tipo II

∗ Ciclo da serina

∗ Membranas intracelulares emparelhadas

∗ Methylosinus, Methylocystis

∗ Gama-proteobactéria – Tipo I

∗ Ciclo RuMP

∗ Membranas intracelulares discóide visiculares

∗Methylococcus, Methylomonas, Methylobacter,

Methylomicrobium, Methylocaldum


1. Bactérias metilotróficas utilizadoras de metano - metanotróficas:




∗ Alfa-proteobactéria

∗ Ciclo serina

∗ Methylobacterium, Hyphomicrobium


2. Bactérias metilotróficas não utilizadoras de metano

∗ Beta-proteobactéria

∗ Ciclo RuMP

∗Methylobacillus, Methylophilus, Methylophaga




⇒⇒ UbUbííquasquas - refletindo a diversidade fisiológica desses microrganismos

∗ solo

∗ ar

∗ poeira

∗ água doce e salgada

∗ sedimentos

∗ ambientes urbanos (suprimento de água, banheiros e ar condicionado)

(Van Aken et al, 2004)

∗∗∗∗ associação com plantas

(Araújo et al., 2002; Sy et al., 2003)



BactBactéérias rias metilotrmetilotróóficasficas na naturezana natureza


BactBactéérias rias metilotrmetilotróóficasficas em associaem associaçção com plantasão com plantas

Bactérias metilotróficas interagem de forma simbiótica com diferentes espécies de plantas e estudos têm mostrado o gênero MethylobacteriumMethylobacterium

como importante endófito colonizando várias plantas:

∗ Citros (Araújo et al., 2001, 2002);∗ Pinus (Pirttila et al., 2000);∗ Crotalária (Sy et al., 2001);∗ Soja (Kuklinsky-Sobral et al., 2004);∗ Algodão ( Madhaiyan et al., 2006);∗ Arroz (Madhaiyan et al., 2007);∗ Mamão (Pious et al., 2007)



Endófitos:

Microrganismos que habitam o interior de tecidos vegetais, sendo encontrados em órgãos e tecidos vegetais como folhas, ramos e raízes, sem produzir estruturas externas (Azevedo; Araújo, 2007), sem causar prejuízo à planta hospedeira (Neto; Azevedo, Araújo, 2003).

⇒⇒Gênero Gênero MethylobacteriumMethylobacterium

∗ Formam nódulos e promovem a fixação de nitrogênio (Sy et al, 2001; Jourandet al., 2004);

∗ Promovem crescimento vegetal e estimula a germinação de sementes pela produção do fitohormônios (auxinas, citocina, ácido 3 indol acético (AIA), giberelinas) (Madhaiyan et al., 2005);

∗ Induzem resistência sistêmica contra patógenos (Madhaiyan, et al., 2006);

∗ Biorremediação (De Marco, et al., 2004).




AplicaAplicaçção de bactão de bactéérias rias metilotrmetilotróóficasficas na Agronomia na Agronomia

Examinaram a existência de 5 isolados de Methylobacterium como um simbionte com cana-de-açúcar e sua influência sobre o crescimento da cultura.

∗ PPMFs So-77, 78, 79, 80, 81 - isoladas clone de cana-de-açúcar Co86032 (Madhaiyanet al., 2003) - folha, gema germinada, colmo, raíz, rizosfera.

∗ Verificação do crescimentos das PPMFs isoladas sobre metanol – confirmação baseada em PCR gene mxaF – codifica subunidade da metanol-desidrogenase


Figura 1. Produto da amplificação da PCR para o gene mxaF. 1- controle negativo; 2- M. extoquensAM1; 3 a 7- PPMFs isolados de cana-de-açúcar (So-77, 78, 79, 80, 81).

∗ Inoculação de sementes com isolados PPFMs in vitro

- Methylobacterium aumentou a germinação de sementes de cana-de-açúcar comparado com o controle: PPMF-So 78 (24,41%), PPMF-So 80 (18,79%).


Figura 2. Efeito de PPMFs sobre a germinação de sementes de cana-de-açúcar. A-controle; B- Me AM1; C-Me miaA mutante; D- PPMF-So 78.

Tabela 1. Efeito da PPMFs sobre a germinação de sementes de cana-de-açúcar in vitro. Os valores representam todos os tratamentos com uma média de três repetições de 200 sementes cada.


∗ Estabelecimento da eficácia de M. extorquens PPFM-So78 na melhoria do crescimento vegetal, conforme determinado pela área foliar, altura da planta, número de entrenós e rendimento da cana-de-açúcar.

∗ Tratamento combinado: embebição das sementes, aplicação no solo e aplicação de spray na filosfera.


Tabela 2: Efeito da aplicação de PPFM-So78 sobre o clone de cana-de-açúcar Co86032.


Figura 3. Variação da área foliar do clone de cana-de-açúcar Co86032 durante estágio de crescimento precoce sob diferentes métodos de aplicação de Me PPMF-So 78.

SI e Ps – aumento da área foliar;

1- SI+SA+PS

2- SI+PS

3- SI+SA

4- PS+SA

5- SI

6- PS

7- AS

1- SI+SA+PS

2- SI+PS

3- PS+SA

4- PS

5- SI+SA

6- SI

7- SA

90 dias

45 dias

DeterminaDeterminaçção da ão da áárea foliarrea foliar

DeterminaDeterminaçção da qualidade do aão da qualidade do açúçúcarcar

∗∗ ProduProduçção de cana aumentou significativamente com a aplicaão de cana aumentou significativamente com a aplicaçção combinada de ão combinada de MethylobacteriumMethylobacterium por SI+ PS +SApor SI+ PS +SA

Tabela 3: Composição de açúcar do clone Co86032. Cada valor representa média de três repetições por tratamento. CCS – cana-de-açúcar comercial, Brix (%) - Brix da cana-de-açúcar, Pol (%)- Pol da cana-de-açúcar.



A densidade de PPMFs variou de: (3 meses após plantio)

- 33 a 52 ufc/cm2 nas plantas tratadas;

- 18 centímetros ufc/cm2 nas plantas não tratadas

∗ O tamanho da população aumentou significativamente após 6 meses;

∗A população diminuiu após 10 meses em plantas tratadas e não tratadas ;

∗ PPFMs cobriram toda a superfície foliar de plantas tratadas;

∗ Em plantas não tratadas a distribuição de PPFMs foi mais restrita ou a dimensão da população foi baixa, e estas bactérias geralmente estavam abundantes próximo da margem abaxial das superfícies das folhas da cana.

Tamanho da populaTamanho da populaçção de ão de PPMFsPPMFs::∗ A população de PPFMs em geral foi maior na superfície abaxial das folhas

Figura 4. População de PPMFs em folhas de cana-de-açúcar

AnAnáálise de hormôniolise de hormônio

∗ O conteúdo de citocinina aumentou significativamente quando o total da população epifítica aumentou nas folhas;

∗ Folhas jovens tiveram maior conteúdo de citocinina do que folhas mais velhas, mediado pela população de PPMF;

∗ Plantas que receberam uma aplicação combinada de SI+ AS+ PS apresentaram teores máximos de citocinina, seguido pelos tratamentos SI e PS;

∗ O conteúdo citocinina aumentou durante as fases iniciais do crescimento das plantas, atingiu o máximo em 6 meses e diminuiu em 10 meses. Figura 5. Efeito da inoculação de PPMFs

sobre o conteúdo de citocina em folhas de plantas de cana-de-açúcar jovens e maduras.


Conclusões:Conclusões:

Methylobacterium spp. acelerou a germinação de sementes, o

crescimento e aumentou significativamente a qualidade do açúcar nas plantas

de cana-de-açúcar, possivelmente devido à produção de fitohormônios, tal

como a citocina.





∗ Isolados metilotróficos: Methylobacterium sp. CBMB20

Enterobacter sp. CBMB30

Burkholderia sp. CBMB40

(Madhaiyan et al., 2004)

∗ Testaram o potencial de três amostras de bactérias metilotróficas isoladas de arroz durante a germinação, vigor e produção de biomassa.

• M. estorquens miaA- : mutante defectivo para a atividade de citocina

•M. fujisawaense KACC10744: não apresente atividade de nitrogenase


∗ As amostras de bactérias metilotróficas promoveram a germinação, taxa de germinação de sementes e aumento de biomassa em arroz.

Tabela 1. Efeito de bactérias metilotróficas sobre a germinação de sementes e RG de arroz.


Figura 1. Efeito da fixação de N2 por bactérias metilotróficas


Tabela 2. Concentração de t-ZR, iPA e IAA em seedlings com isolados metilotróficos fixadores de N2.


∗ Enterobacter sp. CBMB30 –maior atividade de nitrogenase

Figura 2. Efeito da inoculação de isolados de metilotróficos fixadores de N2 e tamanho da população.

Methylobacterium sp. CBMB20Enterobacter sp. CBMB30Burkholderia sp. CBMB40M. fujisawaense KACC10744


As bactérias metilotróficas promoveram o aumento do crescimento de

sementes de arroz pela produção de fotormônio e fixação de N2;

Devido colonizarem tecidos de plantas e produzirem citocinas, bactérias metilotróficas poderiam ser usadas para inóculo em sementes para aumentar a germinação, durabilidade, ou vigor das sementes.





∗ Promoção de crescimento de amendoim pela inoculação de Methylobacterium sp. ou em combinação com Rhizobium sp.;

∗ Indução de resistência sistêmica por Methylobacterium sp. contra patógenos de raiz de amendoim com observação de proteínas PR e outras enzimas envolvidas na ISR


Tabela 1. Efeito de Methylobacterium sp. PPMF-Ah sozinha ou em combinação com Rhizobium sobre sementes de amendoim


Tabela 2. Efeitos sobre a qualidade das sementes e indução de proteínas PR por Methylobacterium sp. PPMF-Ah sozinha ou em combinação com A. niger e S. rolfsii.

Figura 1. Mudanças no conteúdo de fenilalanina amônia liase - PAL (A), beta 1,3-glucanase (B), peroxidase ( C), e compostos fenólicos (D) em folhas de amendoim.



Methylobacterium promoveu o crescimento de plantas de

amendoim e induziu resistência sistêmica contra patógenos, abrindo a

possiblidade da bactéria metilotófica ser utlitizada no controle biológico

de patógenos.



Biorremediação:

Consiste na utilização de agentes biológicos ou seus componentes na recuperação de áreas contaminadas. Geralmente são processos que empregam microrganismos ou suas enzimas para degradar compostos poluentes/tóxicos (Newman e Reynolds, 2005).

http://www.alken-murray.com





Verificar se amostras de bactérias metilotróficas (Methylobacterium oryzaeCBMC20 e Burkholderia sp. CBMB40) poderiam reduzir a toxidade de metais e promover o crescimento de plantas de tomate na presença de metais pesados no solo.


Figura 1. Acúmulo (ligação) de Ni e Cd em células em crescimento (a, b) e em células em fase estacionária. CBMB20 (a, c); CBMC40 (b, d).

∗ As amostras bacterianas cresceram (toleraram) mesmo na presença de Ni e Cd e acumularam os metais.

∗CBMB20 – acumulou mais Ni e Cd

Ni- após 24h nas células

Cd – após 12 horas nas células

Ni/Cd- com crescimento culturas


Tabela 1. Efeito das bactérias metilotróficas sobre a tolerância do tomate frente a diferentes concentrações de Ni e Cd.

∗ Sementes de tomate inoculadas com as bactérias tiveram TI na presença de diferentes concentrações de metais até certo nível


Tabela 2. Influência das bactérias metilotróficas com diferentes concentrações de Ni e Cd sobre sementes em desenvolvimento.

∗ Inoculação de bactérias elongação das raízes e a biomassa do tomate em comparação ao controle sem inoculação ou com metais pesados

Tabela 3. Influência de bactérias metilotróficas sobre o crescimento das plantas e acúmulo de Ni e Cd em culturas de tomate em vasos, na presença de metais pesados e a população da rizosfera de diferentes tratamentos.


∗A presença das bactérias no solo reduziu a quantidade de metais pesados;

∗ Cd de 6,8 mg kg-1 a 1,8 (CBMB20) e 2,1 mgkg-1 com CBMB40;

∗ Ni de 2,2 mg kg-1 a 0,2 (CBMB20) e 1,8 mgkg-1 com CBMB40;

∗ Em geral: CBMB20 mais eficiente que CBMB40.

Figura 2. Análise de Ni e Cd em plantas de tomate em vasos.

Metais pesados no solo


∗Bactérias metilotróficas reduziram a

quantidade de metais - conferem efeito

protetor à planta.

Figura 3. Metais pesados em cultura de tomate em vasos, na presença ou ausência de bactérias metilotróficas.



As bactérias metilotróficas CBMB20 e CBMB40 foram eficazes em promover um melhor desenvolvimento das plantas de tomate, uma vez que diminuíram a toxicidade causada por concentrações elevadas de Cd e Ni, reduzindo a absorção e translocação desses metais para as plantas.



∗ Campos de cultura de arroz:

• bactérias metanogênicas: produzim CH4• bactérias metanotróficas oxidam parte do CH4 produzido



- Bactérias metanotróficas são consideradas como sendo adequadas para o controlo das emissões de CH4

- Controle do efeito estufa – aquecimento do planeta

∗ Capacidade de manipular geneticamente bactérias metilotróficas têm avançado nos últimos anos;

∗ Tecnologia do DNA recombinante: isolamento e clonagem de genes que codificam para funções específicas; expressão heteróloga.

ManipulaManipulaçção genão genéética de bacttica de bactéérias rias metilotrmetilotróóficasficas


GenêroGenêro MethylobacteriumMethylobacterium

endófito colonizando várias plantas de importância agronômica



colonizam nichos ecológicos ocupados por fitopatógenos

candidatas ao controle simbiótico (competição por espaço e nutrientes na planta hospedeira, produção de compostos antimicorbianos, indução de resistência sistêmica)



∗ Gênero Methylobacterium foi isolado principalmente de plantas afetadas pela CloroseVariegada dos Citros (CVC) - pela primeira vez foi cogitada a possibilidade do controle simbiótico da CVC por meio de tais bactérias (Araújo et al., 2002, Lacava et al., 2004)

∗ CVC: causada pelo fitopatógeno Xylella fastidiosa

- Produtividade

- Prejuízos econômicos à citricultura

A manipulação genética da bactéria metilotrófica é pré-requisito para examinar

seu potencial uso no controle simbiótico de X. fastidiosa.

∗ Methylobacterium mesophilicum SR1.6/6

- Isolada como endofítico de plantas de citros afetadas CVC

- Inoculação do endófito em planta - transformação com o gene GFP (Green

Fluorescence Protein)

- Colonização do xilema pelo endófito – mesmo nicho ocupado por X. fastidiosa



Patentes Patentes


1. United States Patent 20030211082

- Método para alterar a fertilidade de plantas – citocinas (bactéria/sementes)

2. United States Patent 6174837United States Patent 5961687 United States Patent 6329320

– Método para aumentar a produtividade de plantas (spray)

3. United States Patent 5512069

Método para melhorar a germinação de sementes

http://www.freepatentsonline.com

∗ Frente aos benefícios que bactérias metilotróficas podem trazer às plantas, são promissoras para aplicação na Agronomia.

∗ A possibilidade de manipular geneticamente bactérias metilotróficas abre novas perspectivas da sua utilização no controle de fitopatógenos e, eventualmente no melhoramento de características de interesse agronômico.

ConsideraConsideraçções Finaisões Finais

Obrigada pela Obrigada pela atenatençção !!ão !!

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