UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO ACADÊMICO DE VITÓRIA

CURSO DE GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO

APLICAÇÃO DE QUITOSANA E ÓLEO ESSENCIAL DE ORÉGANO (Origanum

vulgare L.) NA INIBIÇÃO DE Staphylococcus aureus EM HAMBÚRGUER

Vitória de Santo Antão

2010

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO ACADÊMICO DE VITÓRIA

CURSO DE GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO

APLICAÇÃO DE QUITOSANA E ÓLEO ESSENCIAL DE ORÉGANO (Origanum

vulgare L.) NA INIBIÇÃO DE Staphylococcus aureus EM HAMBÚRGUER

Trabalho de Conclusão de Curso

apresentado ao Curso de Graduação em

Nutrição como requisito para conclusão do

Curso de Bacharel em Nutrição.

Aluna: Tacila Mendes da Silva

Orientadora: Profª Drª Roberta de Albuquerque Bento

Vitória de Santo Antão

2010

Dedicatória

A Deus, meu Senhor e Salvador.

A Cacildo e Lourdes, meus pais.

À professora, Roberta Bento, minha orientadora.

A Tulio, meu irmão e a todos os meus amigos.

Agradecimentos

A Deus autor e salvador da minha vida, obrigada por cuidar de mim. “Você não se

esqueceu, você insiste, você mudou a minha história e fez o que ninguém podia

imaginar, você acreditou e isso é tudo, só vivo pra você não sou do mundo não. A

honra, a glória, a força e o louvor a Deus e o levantar das minhas mãos é pra dizer

que te pertenço, Deus” ¹.

À minha mãe, Lourdes e ao meu pai Cacildo por serem minha base e porto seguro, aonde eu chegar e tenha o que eu tiver devo tudo a eles, obrigada por tudo. A minha família por estar sempre presente em todas as minhas realizações.

À minha Orientadora Roberta Bento, por ter me mostrado que é com muita

determinação que se alcança os objetivos, pela ajuda sempre prestada e por toda

assistência. Mostrou-me de uma maneira singular que com competência,

profissionalismo e persistência é possível ir muito além.

Aos meus amigos, Erika, Aninha, Marcela, Márcio, Bruno, Christian, Allison,

Duda, Rafaela, Antony, Waldir, Jonathan, por entenderem minha ausência na

maioria de nossas programações, por acreditarem em mim, amo muito vocês.

À Belinha pela companhia no laboratório, pela ajuda sempre prestada, por cada

troca de conhecimentos. A vivência do laboratório deu-me uma amiga muito especial

que quero levar por toda a vida.

A Rafael, Danúbia, Edilene e Sílvio a melhor equipe de técnicos do mundo,

Rafa, perdia todo o seu tempo me ajudando a pesar minhas amostras, ele foi a

pessoa mais prestativa que conheci, o mundo merecia mais pessoas como ele, Dan,

sempre foi disponível e ajudava em tudo que fosse possível, Dilene, mesmo sendo a

ajudadora oficial de Rapha e de Mari, me ajudou muito, ensinou-me muito sobre as

práticas de laboratório, sou grata por toda sua paciência, Sílvio, obrigada por deixar

eu incomodar mais cedo pela autoclave,ajudou-me de maneira singular.

1 Da música: “Te agradeço”, Kleber Lucas.

A Rapha e Mari, pela troca de material, pelas dicas, pela convivência, pela troca de

experiência.

Aos Professores avaliadores, por compartilharem comigo da finalização dessa

etapa, além do tempo cedido à avaliação deste trabalho.

A todos que me ajudaram direta e indiretamente, MUITO OBRIGADA!

Resumo

A comercialização de produtos cárneos tem experimentado um crescimento contínuo nos últimos anos, sendo dentre seus derivados de grande consumo, o hambúrguer. Entretanto, tais produtos, devido à constituição rica em nutrientes provenientes da carne e vida de prateleira longa, constituem-se como veículos contaminantes de natureza biológica, física ou química. Dessa forma, é obrigatório o uso de estratégias preventivas para a redução dos focos, ou eliminação dos contaminantes alimentares. Mediante as exigências dos consumidores, por produtos de qualidade, as indústrias se vêem obrigadas a restringirem o uso de conservantes químicos em alimentos. Como tentativa de reduzir os níveis dos aditivos químicos utilizados nos produtos cárneos, pesquisas buscam nos compostos naturais um emprego alternativo mais adequado dos conservantes, proporcionando maior qualidade de vida para os consumidores. Nesse contexto o óleo essencial de orégano se apresenta como agente antimicrobiano, pois elimina uma ampla variedade de microorganismos patógenos/deteriorantes. Outro conservante natural é a quitosana, que tem sido proposto como aplicação para usos em diversos alimentos, por se tratar de um polímero natural, biodegradável e atóxico. Assim, este estudo objetivou verificar a ação antimicrobiana da quitosana e do óleo essencial de orégano (Origanum vulgare L.) na inibição de Staphylococcus aureus em hambúrguer. A preparação dos inóculos da cepa utilizada nos ensaios antimicrobianos foram obtidos através de suspensões de tal cepa em solução salina (NaCl a 0.85% p/v) estéril a partir de culturas overnight cultivadas em BHI inclinado a ± 35 °C, sendo a turbidez padronizada de acordo com a escala McFarland correspondendo à concentração de aproximadamente 108 UFC/mL. Os testes para determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) da quitosana e do óleo de orégano, foram realizados através da técnica de macrodiluição em caldo carne. Para os testes em matriz alimentar, foi produzido o hambúrguer em laboratório, e adicionado os antibacterianos e a suspensão bacteriana, realizando o controle concomitantemente, e com posterior contagem de células viáveis nos intervalos em dias (0, 1, 2, 3, 4 e 15). Os resultados demonstraram que a CIM e a CBM do S. aureus em caldo carne, foi 5 mg/ml e 10 µL/ml para quitosana e óleo, respectivamente. Dessa forma, essas concentrações foram utilizadas em matriz alimentar (hambúrguer), onde os melhores resultados foram obtidos nos experimentos que continham óleo e quitosana em associação. Com isso, conclui-se que a aplicação de quitosana e óleo essencial de orégano em hambúrguer pode ser uma alternativa natural no controle de S. aureus, diminuindo assim os riscos de contaminação bacteriana que tanto acometem à saúde dos consumidores.

Descritores: Hambúrguer, Quitosana, Óleo essencial de orégano, Antimicrobiano

Sumário

Introdução com justificativa ....................................................................................... 08

Objetivos ................................................................................................................... 12

Hipóteses ou questões investigativas ....................................................................... 13

Metodologia ............................................................................................................... 14

Resultados e Discussão ............................................................................................ 19

Conclusões ou Considerações Finais ....................................................................... 24

Referências ............................................................................................................... 25

8

Introdução com justificativa

Na produção e industrializações de alimentos, inúmeros avanços ocorreram

nos últimos anos, tanto no desenvolvimento tecnológico, como nas condições

higiênico-sanitárias. Entretanto, apesar da evolução, as doenças transmissíveis por

alimentos (DTAs), ainda classificam-se entre os maiores problemas de saúde pública

do mundo contemporâneo, fato que tem modificado o comportamento do

consumidor, tornado-o mais exigente, o que requer maiores precauções pela

indústria devido a competitividade do mercado.

A comercialização de produtos cárneos tem experimentado um crescimento

contínuo nos últimos anos, sendo dentre seus derivados de grande consumo, o

hambúrguer. Entretanto, tais produtos, devido à constituição rica em nutrientes

provenientes da carne e vida de prateleira longa, constituem-se veículos em

potencial de contaminantes de natureza biológica, física ou química. Dessa forma, é

obrigatório o uso de estratégias preventivas para a redução dos focos, ou eliminação

dos contaminantes alimentares (KASNOWSKI, 2004).

O controle inadequado dos alimentos pode vir a causar alterações, seja do

ponto de vista organoléptico, como microbiano, podendo este último trazer riscos a

saúde dos consumidores. Segundo alguns estudos (BRAGA et al. 2005; BLAIOTTA

et al., 2004), dentre as três maiores causas de DTA de origem bacteriana do mundo,

o agente patogênico que vem se destacando é o Staphylococcus aureus, no qual

encontra na carne e em seus derivados um dos principais veículos de contaminação.

Diante da necessidade de controlar a proliferação microbiana, as indústrias

utilizam quantidades de aditivos artificiais acima do permitido por lei, podendo com

isso ocasionar problemas à saúde humana, devido a possibilidade de originarem

compostos tóxicos, de ação carcinogênica (MELO, 2004). Mediante as exigências

dos consumidores, por produtos de qualidade, as indústrias se vêem obrigadas a

restringirem o uso de conservantes químicos em alimentos (LEUSCHER;

ZAMPARINI, 2002). Como tentativa de reduzir os níveis dos aditivos químicos,

pesquisas buscam nos compostos naturais um emprego alternativo mais adequado

dos conservantes, proporcionando maior qualidade de vida para os consumidores.

9

As técnicas de preservação mais modernas têm demonstrado um interesse

pela segurança microbiológica através do uso de algumas especiarias, pois além de

participarem como ingredientes de inúmeros alimentos, tornando-os mais saborosos

e digestivos, as especiarias também se apresentam como potentes agentes

antimicrobianos devido à presença dos óleos essenciais. (ERNANDES et al., 2007).

Dentre inúmeros óleos essenciais, o de O. vulgare L. (orégano) tem se

destacado devido a sua eficácia na inibição de algumas cepas bacterianas, como

Aeromonas hydrophilla, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Corynebacterium

xerosis, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Micrococcus luteus,

Mycobacterium smegmatis, Staphylococcus aureus, Y. enterocolítica, entre outros

(BAYDAR et al., 2004).

Souza (2006) demonstrou o intenso poder de inibição do óleo essencial de

orégano sob a flora autócne de amostras de carne moída armazenadas sob

refrigeração. Trabalhos (Pereira et al. 2007; Serpa, et al., 2007) ratificaram a ação

inibitória do óleo essencial de orégano contra bactérias contaminantes em carnes e

derivados. Oliveira (2010), recentemente, em seu trabalho faz o uso dos

componentes do óleo essencial de orégano, timol e carvacrol, comprovando sua

eficácia na inibição do S. aureus numa concentração de 1,25 e 0,6 µL/mL,

respectivamente, resultando na diminuição de 2 ciclos logarítmicos.

Pesquisa realizada por Skandamis et al. (2002) demonstrou que ao associar

dois métodos de conservação em filés de carne bovina, neste caso representado

pelo óleo essencial de orégano e a refrigeração, a quantidade do óleo no alimento

pode ser diminuída, sem contanto interferir na ação inibitória, uma vez que resultou

em uma redução inicial da população de bactérias de 1 a 2 ciclos logarítmicos,

partindo-se o ensaio de um inóculo inicial de aproximadamente 5 log10 UFC/g a

uma temperatura de 5°C.

Outro antimicrobiano que tem se mostrado atender as perspectivas de

mercado é a quitosana. Polissacarídeo encontrado na natureza, produzido por

processo de baixo custo através dos exoesqueletos dos insetos, crustáceos, e

parede celular de fungos; Produção esta de grande interesse ambiental por ser

biodegradável. Diante da abundância e atoxicidade da quitosana, o seu potencial de

aplicação tem sido cada vez mais ampliado, indo desde o uso para a terapia

10

genética, até a indústria alimentícia, como base na fabricação de suplementos

nutricionais, emulsificantes, conservantes, fibras em biscoitos dietéticos,

estabilizantes em alimentos em conservas, clarificantes de bebidas (SHAHIDI et al.,

1999; BORGOGNI et al., 2006; LI et al., 2007).

A principal utilização da quitosana está relacionada à sua propriedade

antimicrobiana, que têm como responsável à natureza policatiônica da molécula, a

qual interage com a região superficial da bactéria. Micrografias eletrônicas

realizadas por Lifeng et. al. (2004) de S. aureus (bactéria gram-positiva) e E. coli

(bactéria gram-negativa) na presença de quitosana mostram que a membrana do S.

aureus foi enfraquecida ou até mesmo fragmentada, enquanto o citoplasma da E.

coli foi concentrado e o interstício da célula, ampliado.

Zheng e Zhu (2003) demonstraram que a atividade antimicrobiana contra

bactérias gram-positivas aumenta quanto maior a massa molecular do polímero,

enquanto que, para bactérias gram-negativas, quanto menor a massa molecular da

quitosana, maior a atividade antimicrobiana. Esses resultados sugerem que os

efeitos da quitosana são distintos nos dois tipos de bactérias: no caso das gram-

positivas, a hipótese é que quitosana de alta massa molecular forma películas ao

redor da célula que acabam por inibir a absorção de nutrientes, enquanto que

quitosana de baixa massa molecular penetra mais facilmente em bactérias gram-

negativas, causando distúrbios no metabolismo desses microrganismos.

Alguns estudos já demonstraram a eficiência da quitosana como

antimicrobiano sob microrganismos contaminantes em produtos cárneos, como

Staphylococcus aureus, Escherichia coli (LI et. al., 2007) e Listeria monocytogenes

(COMA et al., 2002). Dentre os produtos cárneos com inclusão da quitosana, podem

ser citadas pesquisas com bacalhau (SHAHIDI et al., 2002), carne de cordeiro

(KANATT et al., 2004), salsicha (DAMIAN, 2005) e mortadela (CHI et al, 2006) e em

patê de carne (BENTO, 2008).

CHI et al., 2006, apontaram em seu trabalho inédito, o efeito combinado de

filmes de quitosana enriquecidos com o óleo essencial de orégano, incorporadas em

fatias de mortadela armazenada a 10ºC/5 dias, observando-se uma redução do

número de células bacterianas de aproximadamente 4 ciclos logarítmicos,

comparada com um redução de 1 a 3 ciclos logarítmicos quando aplicado somente o

11

filme de quitosana, constatando ainda que este tipo de processo foi bem aceito em

termos sensoriais.

Neste contexto das inúmeras vantagens para aplicação dos conservantes

naturais em alimentos, deve-se relatar que o uso do óleo essencial de orégano como

aditivo inibidor de crescimento microbiano em alimentos, é limitado pela alteração no

flavor, visto que a dose antimicrobiana efetiva para utilização exclusiva do óleo

essencial de orégano, não atinge o nível organoléptico aceitável. Sendo assim, a

combinação do óleo de orégano e de outras barreiras antimicrobianas sem sabor,

como a quitosana, podem viabilizar uma possível redução na quantidade de aditivos

artificiais, bem como melhorar a estabilidade da vida de prateleira dos alimentos,

sem contanto influenciar nas características sensoriais. Com isso, pesquisas com

intuito de verificar a bioatividade da combinação destes compostos como aditivo

alimentar na inibição de contaminantes em produtos cárneos é essencial, gerando

assim novos horizontes na área da ciência e da biotecnologia, uma vez que a

quitosana e o óleo de orégano são de fontes naturais, seguras e de baixo custo.

12

Objetivos

Geral

Verificar a aplicação de quitosana e óleo essencial de orégano na inibição de

Staphylococcus aureus em hambúrguer.

Específicos

Determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida

Mínima (CBM) da quitosana e do óleo essencial de orégano, individualmente e

em ação combinada, sobre cepas de S. aureus em caldo carne.

Avaliar a interferência da quitosana e do óleo essencial de orégano sobre a

dinâmica de crescimento do S. aureus em hambúrguer;

13

Hipóteses ou questões investigativas

A quitosana e o óleo essencial de orégano (origanum vulgare l.) têm ação

inibitória sob a cepa de Staphylococcus aureus em hambúrguer.

14

Metodologia

Cepas bacterianas reveladoras de atividade antimicrobianas

Para os ensaios antimicrobianos foi utilizada cepa padrão de Staphylococcus

aureus ATCC 6538, a qual foi cedida pelo Laboratório de Fermentação e

Experimentação em Alimentos, do Departamento de Nutrição (Campus Recife),

Centro de Ciências da Saúde, UFPE (Recife, Pernambuco, Brasil).

Os inóculos foram obtidos através da preparação de suspensões da cepa em

solução salina estéril (NaCl a 0.85% p/v), a partir de culturas overnight cultivada em

BHI a ± 35 °C. Tais suspensões tiveram sua turbidez padronizada de acordo com a

turbidez do tubo 0.5 da escala McFarland correspondendo à concentração de

aproximadamente 108 Unidades Formadoras de Colônia por mL (UFC/mL). Em

seguida, far-se-á diluições seriadas (1:9 v/v) em solução salina (0.85%) estéril para

obtenção do inóculo desejado (aproximadamente 10 -6UFC/mL).

Obtenção do óleo essencial de orégano e da quitosana

O óleo essencial de orégano foi obtido pela Polo produtos químicos LTDA

(Afogados, Recife, PE, Brasil). Por sua vez, a quitosana utilizada será de crustáceos,

obtido da Sigma- Aldrich (Alto de Pinheiros, São Paulo, SP, Brasil).

Elaboração dos substratos para cultivo de S. aureus

Os ensaios de dinâmica de crescimento microbiano foram realizados

utilizando caldo carne como substratos de cultivo. Para preparação do caldo carne,

aproximadamente 500 g de carne bovina livre de gordura aparente, cortadas em

tamanhos uniformes (3 x 3 x 3 cm), foram cozidas em 1000 mL de água destilada

durante 20 minutos. Em seguida, a porção líquida do material de cozimento

separada do material sólido, e submetida à filtração através da utilização de bomba

15

a vácuo utilizando papel de filtro Whartman n°1. O filtrado obtido foi esterilizado

através do uso de sistema de filtração Millipore (0,45 µm).

Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração

Bactericida Mínima (CBM) do óleo essencial e quitosana em caldo carne

Os testes para determinar a Concentração Inibitória Mínima – CIM e

Concentração Bactericida Mínima – CBM, para a cepa de S. aureus com os

antibacterianos (óleo essencial de orégano e quitosana), foram realizados

isoladamente e em combinação, através da técnica de macrodiluição em caldo

(NOSTRO et al., 2001). Foram preparados tubos de ensaio contendo 5 ml de BHI

acrescido de 0,15% de Ágar bacteriológico, acrescentado de diferentes

concentrações dos antimicrobianos, sendo posteriormente adicionado 1 ml do

inoculo das cepas. O sistema foi incubado a 35-37°C por 24 horas. Ao término do

período de incubação, a mais baixa concentração (mais alta diluição) dos

antimicrobianos que não apresentou crescimento visível (turvação) foi considerada

como Concentração Inibitória Mínima. Após esta observação, alíquotas de 100µL

dos tubos que não apresenta crescimento microbiano visível, foram inoculadas em

placas de Baird Parked. A Concentração Bactericida Mínima foi considerada como a

menor concentração dos antimicrobianos capaz de inibir o crescimento das cepas

em Baird Parked após incubação de 35-37°C por 24-48 horas.

Figura 1: Plaqueamento da amostra Figura 2: Diluição do caldo

16

Produção do Hambúrguer de Carne Bovina

Na produção do Hambúrguer, foram utilizados cortes de carne bovina tipo

alcatra, sal (Pirâmide Ltda., Areia Branca, Brasil), açúcar (União, São Paulo, Brasil),

Óleo de Soja (Soya, Bunge, Recife, Brasil), farinha de Trigo (Dona Benta, Recife,

Brasil), cebola e coentro, disponíveis comercialmente em Supermercados da Cidade

de Recife, Pernambuco, Brasil. A pimenta do reino foi obtida seca e moída em casas

de comércio especializado.

A carne foi primeiramente submetida à trituração em moedor doméstico.

Posteriormente, foram adicionados à carne os demais ingredientes do hambúrguer,

nas quantidades conforme consta na tabela 1.

Tabela 1- Ingredientes para produção de hambúrguer

MATÉRIA- PRIMA QUANTIDADES (g.100g-1)

Carne (alcatra) 1000g

sal 15g

óleo 50 mL

açúcar 30g

pimenta do reino 0,1g

cebola triturada 50g

farinha de trigo 100g

coentro picado 25g

O processamento do hambúrguer foi realizado de acordo com o fluxograma

abaixo.

17

Na formulação, houve de dois tipos de hambúrgueres, sendo um padrão e

outro acondicionado de quitosana e óleo essencial de orégano. Ao se formular os

hambúrgueres não foi acrescentado nenhum percentual de gordura, sendo retiradas

às gorduras da peça da carne anteriormente à moagem. O hambúrguer foi

congelado a - 18°C por 24 horas, sendo as quantidades descongeladas apenas no

momento da realização dos experimentos.

Ação antimicrobiana da quitosana e do óleo essencial sob a Staphylococcus

aureus em hambúrguer

Inicialmente, 360g de hambúrgueres estéreis foram descongelados sob

refrigeração a 4° C, sendo em seguida adicionada à solução antimicrobiana

isoladamente (CBM do caldo carne), e em combinação (CBM/2), sendo a amostra

homogeneizada manualmente por pressão durante 10 minutos. Em seguida, 36 mL

do inoculo de Staphylococcus aureus foram adicionados à amostra, e também

homogeneizados por 10 minutos. Em sala asséptica, as amostras foram então

separadas em 36 sacos de polipropileno estéreis contendo 10g do produto cada,

sendo todos armazenados sob congelamento a aproximadamente -18º C. Nos

tempos 0, 24, 48, 72, 96 horas e 15 dias, as amostras em triplicata foram retiradas

Análises microbiológicas

Carne

Higienização e Visceração

Trituração

Mistura da carne bovina triturada com os ingredientes

Moldagem

Armazenamento (-31ºC)

Fritura em óleo

Fluxograma 01.: Processamento do hambúrguer

18

para a realização da contagem da Staphylococcus aureus. Para tal, 10 g de cada

amostra foi seriadamente diluída (1:10 p/v) em solução salina (0,85 % p/v) estéril,

homogenizada por 5 minutos utilizando vortex, e diluída seriadamente (10-1 a 10-6)

em solução salina (0,85 % p/v) estéril. Em seguida, uma alíquota de 100 µL de cada

diluição (10-1 a 10-6) foi uniformemente inoculada em placas de Petri estéreis

contendo Baird parked. As placas foram incubadas a 35 ºC por 48 horas, sendo os

resultados da contagem bacteriana expressos como Log UFC.g-1. Amostras de

hambúrgueres, preparadas e dividas conforme acima, não receberam os

antibacterianos, para serem utilizadas como controle.

19

Resultados e Discussão

Inicialmente foi determinado os valores da CIM (Concentração Inibitória

Mínima) e o CBM (Concentração Bactericida Mínima) em caldo carne de ambos os

antimicrobianos (óleo essencial de orégano e quitosana).

Nas amostras na qual foi adicionado apenas a quitosana, não houve

crescimento microbiano visível nos tubos e placas somente na diluição a 5 mg/ ml, o

que permite atribuir a esta concentração como sendo a CIM e CBM. Resultados

também satisfatórios relacionados com a inibição de S. aureus com quitosana foi

demonstrado por Fai (2008), que encontrou o valor de 1,50 mg/ml para a CIM. No

entanto, Bento (2008), ao avaliar a ação da quitosana sob cepa de Listeria

monocytogenes, encontrou valores superiores (2,5 mg/ml e 5,0 mg/ml) para a CIM e

CBM, respectivamente.

Os resultados contraditórios obtidos nos diferentes estudos podem ser

justificados pelo fato de diferentes meios de cultura utilizados, bem como diferentes

cepas utilizadas.

Resultados similares foram encontrados por Tsai e Hwang (2004), que

examinando a atividade antibacteriana in vitro frente a algumas bactérias patógenas

e probióticas relataram que para a quitosana com grau de desacetilação entre 70 e

95%, apresenta concentração mínima letal para Staphylococcus aureus, entre 50 a

200 ppm.

É importante relatar que o mecanismo de ação da quitosana sobre os

microrganismos não está completamente elucidado, mas várias propostas são

sugeridas. Segundo Kumar (2000) e Okamoto (2003), a atividade inibitória pode ser

explicada pela presença de grupos amínicos, que, em contato com os flúidos

fisiológicos, tornariam-se protonados e se ligariam a grupos aniônicos desses

microorganismos, provocando aglutinação das células e, como conseqüência,

levariam a inibição do seu crescimento.

Nas amostras que foi adicionado apenas o óleo essencial, não houve

crescimento microbiano visível no tubo, nem na placa, somente na diluição a 10

µL/mL, sendo determinada como sendo a CIM e CBM. Os resultados encontrados

20

neste estudo diferem dos encontrados por Souza (2006) e por Serpa (2007), que

determinou o valor de 20 µL/mL e 3,15 µL/mL respectivamente. Similiar ao que

ocorreu com a quitosana, os resultados contraditórios obtidos nos diferentes estudos

podem ser justificados pelo fato de diferentes meios de cultura utilizados, bem como

diferentes cepas utilizadas.

Sagdiç et al. (2002) também avaliando a ação inibitória do hidrossol de

orégano sobre bactérias patogênicas, observou sua efetividade na inibição de

Staphylococcus aureus. Em outro estudo, Marino et al. (2001) analisando o efeito

antimicrobiano de várias especiarias notaram que o óleo essencial de orégano foi o

mais efetivo na inibição de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, causando

um alongamento da fase lag.

Trabalhos realizados por Burt (2004), já apontavam o interesse na realização

de testes que demonstrassem a ação no alimento, visto que este autor relata que

apesar da quitosana possuir grande potencial na inibição de microrganismos, existe

uma barreira para uso como aditivo devido à interação entre agentes

antimicrobianos e os componentes dos alimentos, que poderiam ser responsável por

diferentes resultados.

Assim, o estudo seguinte procedeu para avaliar o poder da quitosana

isoladamente em matriz alimentar (hambúrguer), sendo os resultados expressos no

gráfico abaixo.

Gráfico 1- Efeito da quitosana sobre a concentração de S. aureus em hambúrguer.

Controle

Quitosana0 2 4 15

tempo (dias)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Lo

g u

fc/m

L

21

Conforme observado no gráfico 1, a presença de quitosana a 5 mg/ml, no

hambúrguer, reduziu de forma significativa ao longo do tempo a quantidade de

Sthaphylococcus aureus, sendo a menor contagem de microrganismo ocorrida no 3º

dia, com redução de 5 UFC/mL. Estes resultados foram bastante satisfatórios,

apontando assim como sendo o uso da quitosana de grande poder inibitório sob

cepa de S. aureus, em hambúrgueres bovinos.

Resultados também positivos referentes à inibição de microrganismos por

quitosana também foram achados por Olsen (2001), que também verificou a ação da

quitosana no combate do S. aureus, e por Li (2007) e Zheng. (2003). Aplicação da

quitosana em outros produtos cárneos também apresentou resultados satisfatórios

(SHAHIDI et al., 2002; KANATT et al., 2004; DAMIAN, 2005; CHI et al, 2006;

BENTO, 2008).

É importante ressaltar que diversos estudos apontam a quitosana como um

antimicrobiano em teste “in vitro”, entretanto, vale mencionar que este presente

estudo demonstra a ação da quitosana na inibição do S. aureus em matriz alimentar

(hambúrguer), o que o torna de suma importância para a comunidade científica e

para a indústria de alimentos.

O experimento seguinte foi para avaliar o poder do óleo isoladamente, bem

como o mesmo com a quitosana, em matriz alimentar de hambúrguer, sendo os

resultados expressos abaixo.

22

Gráfico 2- Efeito da quitosana e do óleo isolados e em combinação sobre a

concentração de S. aureus em hambúrguer.

De acordo com o demonstrado no gráfico 2, a presença tanto do óleo

essencial de orégano, bem como a associação do óleo e da quitosana, reduziram de

forma significativa (5 UFC/ mL), ao longo do tempo a contagem de Sthaphylococcus

aureus, quando comparados com o experimento controle. Ao verificar o declínio na

população de S. aureus no produto adicionado apenas do óleo, observa-se que a

menor contagem ocorreu no 4º dia, o que diferiu no produto adicionado de ambos os

antimicrobianos associados, no qual a menor contagem ocorreu logo no 3º dia.

Outro fato que chama atenção foi à eficácia imediata na redução de S. aureus nas

amostras com quitosana e óleo essencial, logo após o 1º dia, diferente do que

ocorreu nas amostras apenas com quitosana (gráfico 1), cuja a queda brusca na

contagem ocorreu somente após o 3º dia. É importante observar também que após o

4º dia de armazenamento, todas as amostras permaneceram com contagem de

cepas constantes, confirmando assim a estabilização do crescimento microbiano em

decorrência do frio (congelamento).

Assim, diante dos resultados relatados acima, esta pesquisa sugere que a

associação de quitosana e óleo essencial de orégano em hambúrguer, podem

reduzir a quantidade de antimicrobianos necessários quando utilizados em

combinação, uma vez que obteve melhores valores do que os antimicrobianos

utilizados isoladamente. Resultados também positivos na associação de ambos os

antimicrobianos, foram encontrados por Chi et al. (2006), ao relatarem que ao

Controle

Óleo

Quitosana + Óleo0 2 4 15

tempo (dias)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

log u

fc/m

L

23

incorporar filmes de quitosana com óleo essencial em orégano em fatias de

mortadela, também obteve uma redução de bactérias que são contaminantes em

carnes e sub-produtos. Dessa forma, a presença do óleo essencial junto à quitosana

representa segundo ambos os trabalhos, como sendo uma alternativa para o

aumento no controle de microrganismos de grande ocorrência em produtos cárneos.

Evidências científicas tem respaldado a inclusão da quitosana em alimentos,

através de sua atuação como base na fabricação de suplementos nutricionais,

emulsificantes, conservantes, fibras em biscoitos dietéticos, estabilizantes em

alimentos em conservas, clarificantes de bebidas (SHAHIDI et al., 1999; BORGOGNI

et al., 2006; LI et al., 2007) atuando ainda diretamente na produção de alimentos

como pães e desacidificadando frutas (DAMIAN, 2005). Além disso, a quitosana é

considerada pela legislação vigente como alimento com característica funcional e

tem apresentado destaque para o crescente consumo decorrente de suas inúmeras

qualidades (Decreto nº 55871/65).

Por fim, tais resultados estimulam a realização de pesquisas

complementarem, que avaliem se a adição destes antimicrobianos influencia nas

características de qualidade (físico-quimica e sensorial), bem como outros estudos

que também averiguem o controle de outros patógenos emergentes, tendo sempre

como objetivo a produção cada vez maior de alimentos com longa vida de prateleira,

seguros, e naturais.

24

Conclusões

Os resultados obtidos nesta pesquisa ratificam a ação dos antimicrobianos

naturais, quitosana e óleo essencial de orégano, isoladamente e em associação, no

controle de Staphylococcus aureus. Outro achado dessa pesquisa de grande

interesse para comunidade científica é a aplicação destes antimicrobianos em matriz

alimentar, neste caso representada pelo hambúrguer bovino, produto este de grande

consumo pela população. Dessa forma, conclui-se que o presente estudo irá

contribuir tanto para a comunidade científica e indústrias de produtos cárneos, como

também para os consumidores, uma vez que irão adquirir alimentos com menor

quantidade de aditivos artificiais, com segurança sanitária e qualidade total.

25

Referências

BARBOSA, L. N.; Propriedade antimicrobiana de óleos essenciais de plantas condimentares

com potencial de uso como conservante em carne e hambúrguer bovino e testes de aceitação.

2010. Dissertação de mestrado em Biologia. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

São paulo, Brasil.

BAYDAR, H.; SAGDIÇ, O.; OZKAN, G.; KARADOGAN, T. Antibacterial activity and composition of

essesntial oils from Origanum. Thymbra and Sartureja species with commercial importance in Turkey.

Food Control, v.15, n. 3, p. 169-172, 2004.

BENTO, R. A. Bioatividade de quitosana produzida por mucor rouxii no controle de listeria

monocytogenes em produto cárneo. 2008. Tese de Doutorado em Nutrição. Universidade Federal

de Pernambuco, Brasil.

BLAIOTTA, G.; ERCOLINI, D.; PENNACCHIA, C.; FUSCO, V.; CASABURI, A.; PEPE, O. PCR

detection of staphylococcal enterotoxin genes in Staphylococcus spp strain isolated from meat and

dairy products.Evidence for new variants of seg and sei in S. aureus AB-8802. Journal of Applied

Microbiology, v.97, p. 719-730, 2004.

BORGOGNI, C. F.; POLAKIEWICZ, B.; PITOMBO, R. N. M. Estabilidade de emulsões de d-limoneno

em quitosana modificada. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 26, n. 3, p. 502-508, 2006.

BRAGA, L. C.; SHUPP, J. W.; CUMMINGS, C.; JETT, M.; TAKAHASHI, J. A.; CARMO, L.S.;

CHATTONE- SOUZA, E.; NASCIMENTO, A. M. A. Pomegrate extract inhibits Staphylococcus aureus

growth and subsequent enterotoxin production. Journal of Ethnopharmacology, v. 96, p. 335-339,

2005.

BURT, S. Essencial oils: their antibacterial properties and potential application in foods – a review.

International Journal of Food Microbiology, v. 94, n. 3, p. 223-253, 2004.

CHI, S.; ZIVANOVIC, S.; PENFIELD, M. P. Application of Chitosan Films Enriched with Oregano

Essential Oil on Bologna – Active Compounds and Sensory Attributes. Food Science and

Technology International, v. 12, n.2, p.111, 2006.

CHIEN, P. J. et al. Quality assessment of low molecular weight chitosan coating on sliced red pitayas.

Journal of Food Engineering, v.79, p. 736-740, 2007.

COMA, V. et al. Edible antimicrobial films based on chitosan matrix. Journal of Food Science, v. 67,

n. 3, p.1162-1169, 2002.

DAMIAN, C. Efeito da quitosana na digestibilidade aparente da gordura e na qualidade de

salsichas frankfurt. 2005. Tese de Doutorado em Nutrição. Universidade Federal de Santa Catarina,

Brasil.

ERNANDES, F. M. P. G.; GARCIA-CRUZ, C. H. Atividade antimicrobiana de diversos óleos

essenciais em microorganismos isolados do ambiente. B. CEPPA, Curitiba v. 25, n. 2, p. 193-206,

2007.

26

Fai, A. E. C.; Potencial do efeito antibacteriano in vitro de quitosana extraída de Mucor

circinelloides UCP 050: uma abordagem para uso em sistemas de conservação de alimentos

Dissertação de mestrado em Biologia. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” São

paulo, Brasil.

KANATT, S. R.; CHANDER, R.; SHARMA, A. Effect of irradiated chitosan on the rancidity of radiation-

processed lamb meat. International Journal of Food Science and Technology, v.39, p. 997-1003,

2004.

KASNOWSKI, M. C. Listeria ssp., Escherichia coli: Isolamento, identificação, estudo sorológico

e antimicrobiano em corte de carne bovina (alcatra) inteira e moída. 111p. 2004. Dissertação de

Mestrado, Universidade Federal Fluminense, Brasil.

KUMAR, M.N.V.R. A review of chitin and chitosan applications. Reactive and Functional Polymers,

v. 46, n. 1, p. 1-27, 2000.

LEUSCHNER, R. G. K.; ZAMPARINI, J. Effects ofspices on growth and survival of Escherichia coli

0157 and Salmonella entérica serovar enteridis broth model systems and mayonnaise. Food Control,

v.13, n. 6-7, p. 339-404, 2002.

LI, Y.; CHEN, X. G.; LIU, N.; LIU, C. S.; LIU, C. G.; MENG, X. H.; YU, L. J.; KENEDY, J. F.

Physicochemical characterization and antibacterial property of chitosan acetates. Carbohydrate

Polymer, v. 67, n. 2, p. 227-232, 2007.

LIFENG, Q.; ZIRONG, X.; JIANG, X.; CAIHONG, H.; XIANGFEI, Z. Preparation and antibacterial

activity of chitosan nanoparticle. Carbohydrate Research, v. 339, n. 16, p.2693-2700, 2004.

MARINO, M.; BERSANI, C.; COMI, GIUSEPPE. Impedance measurements to study the antimicrobial

activity of essential oils from Lamiaceae and Compositae. International Journal of Food

Microbiology. 67: 187-195, 2001.

MELO FILHO, A. B.; BISCONTINI, T. M. B. & ANDRADE, S. A. C. Níveis de Nitrito eNitrato em

salsichas comercializadas na Região Metropolitana do Recife. Revista Ciência e Tecnologia de

Alimentos, v.24, n.3, p.390, 2004.

NOSTRO, A. et al. Effects of Helichrysum italicum extract on growth and enzymatic activity of

Staphylococcus aureus. International Journal of Antimicrobial Agents, v. 17, p. 517-520, 2001.

OKAMOTO, Y.; YANO, R.; MIYTAKE, K.; TOMOHIRO, I.; SHIGEMASA, Y.; MINAMI, S. Effects of

chitin and chitosan on blood coagulation. Carbohydrates polymers, v. 53, n. 3, p. 337- 342, 2003.

OLIVEIRA, C. E. V.; STAMFORD, T. L. M.; GOMES NETO, N. J.; SOUZA, E. L. Inihibition of

Staphylococcus aureus in vroth and meat model using synergies of phenolic compounds and organic

acids. Food Microbiology, v. 19, n. 1, p.97-108, 2010.

OLSEN, R et al. Biomedical applicatons of chitin and its derivatives. In: SKJAK BRACK, G.;

ANTHOSEN, T.; SANDFORD, P. A. (Eds.). Chitin and chitosan: sources, chemistry, biochemistry,

physical properties and applications. Elsevier Applied Sciences, New York, 2001.

PEREIRA, A. A. et al. Caracterização Química e Efeito Inibitório de Óleos esssenciais Sobre o

Crescimento de Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v.32,

n.3, p.887, 2008.

SAGDIÇ, O.; KUSÇU, A.; OZCAN, M.; OZÇELIC, S. Effects of Turkish spices extracts at various

concentrations on the growth of Escherichia coli 0157:H7. Food Microbiology. 19: 473-480, 2002.

27

SERPA, R.; LIMA, M. C.; ZARINI, S.; KRAUSE, L. C.; RODRIGUES, M. R. A.; RIBEIRO, G. A. Perfil

Químico e Avaliação da Atividade Antibacteriana do Óleo Essencial do “Orégano” - Origanum Vulgare

Linnaeus. In: XVI CONGRESSO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA E IX ENCONTRO DE PÓS-

GRADUAÇÃO, Pelotas, 2007.

SHAHIDI F.; ARACHCHI, J. K. V.; JEON, Y. J. Food applications of chitin and chitosans. Trends in

Food Science e Technology, v.10, p. 37-51, 1999.

SHAHIDI, F. KAMIL, J., JEON, Y. -J., KIM, S. K. Antioxidant role of chitosan in a cooked cod (Gadus

Morhua) model system. Journal of Food Lipids, v.9, p.57-65. 2002.

SKANDAMIS, P.;TSIGARIDA, E.; NICHAS, G.J.E. The effect of orégano essential oil on survival/death

of Salmonella typhimurium in meat stored at 5 °C under aerobic, VP/MAP conditions. Food

Microbiology, V. 19, n. 1, p.97-108, 2002.

SOUZA, E. L. Potencial antimicrobiano do óleo essencial de orégano (origanum vulgare L.):

uma abordagem para uso em sistemas de conservação de alimentos. 134p. 2006. Tese de

Doutorado em Nutrição. Universidade Federal de Pernambuco, Brasil.

TSAI, G. –J., HWANG, S. –P. in vitro and in vivo antibacterial activity of shrimp chitosan against some

intestinal bacteria. Fisheries Science, v.70, p. 675-681, 2004.

ZHENG, L. Y.; ZHU, J. F. Study on antimicrobial activity of chitosan with different molecular weights.

Carbohydrate Polymers, v. 54, p. 527-530, 2003.