Aplicação presentes e futuras na Alergologia. Introdução O diagnostico das reacções alérgicas...
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Aplicação presentes e futuras na Alergologia
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Introdução
O diagnostico das reacções alérgicas na prática medicinal resulta tanto do historial clínico como de testes e demonstrações a imunoglobulinas E específicas do soro e dos tecidos do indivíduo.
BAT
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Princípios Basófilos são granulócitos que
representam menos de 1% dos leucócitos.
A activação do basófilo pode seguir dois caminhos principais: a degranulação anafilática (AND) e a degranulação fragmentada (PMD), caracterizada por alterações morfológicas e secreção do conteúdo do grânulo sem exocitose.
Marcadores principais: FcεRI, CD36,CD203c, P38 MAPK
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Colheita e Preservação
Uso até 3H após a recolha, tubo sem endotoxinas, anticoagulante EDTA ou heparina e temperatura ambiente
Uso ate 24H após a recolha, anticoagulante EDTA e temperatura 4ºC
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Sangue Total ou Basófilos Isolados É simples isolar os leucócitos do
sangue total, utilizando técnicas de centrifugação e de gradientes de densidade.
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Condições de Estimulação
Após a estimulação, os basófilos reagem imediatamente, se as condições se encontrarem ideais.
O pré-aquecimento de sangue, bem como o contacto com os reagentes por 15 min a 37ºC melhora significativamente a latência e magnitude de anti-IgE mediada por CD63.
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Marcação com IL-3
Alguns autores têm mostrado que uma curta pré-incubação com IL-3 pode aumentar a sensibilidade dos ensaios baseados em CD63, mas esta medida não parece ser crucial para os potentes alérgenos proteicos e de estimulação com soro de pacientes com urticária auto-imune.
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Estimulação do Controlo Positivo e Negativo Para que haja uma interpretação correcta
da BAT é necessário ter em conta a influência dos estímulos positivo e negativo.
Tradicionalmente, o controlo positivo é um anticorpo policlonal ou monoclonal anti-IgE.
Na ausência de estimulação controle positivo, torna-se impossível interpretar correctamente os resultados negativos das reacções alérgicas.
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Estimulação do Alergénio
A análise de fluxo assistida e quantificação in vitro de basófilos activados geralmente depende da utilização de extractos de alérgenos naturais.
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Experiência de dosagem
As respostas dos basófilos podem ser extremamente heterogéneas entre diferentes indivíduos.
No entanto, a fosforilação de alérgenos específicos de p38 MAPK, de CD63 eCD203c geralmente não é restrita a um único estímulo, mas implica diferentes concentrações de estimulação que se estendem por várias escalas.
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Marcadores de Identificação Na maioria dos estudos correntes foi
aplicado um anticorpo anti-IgE na amostra de sangue periférico com o objectivo de identificar os basófilos.
Como outras células do sangue podem ser apresentar este anticorpo, para o estudo de citometria de fluxo a amostra deve contem CD203c, uma vez que a expressão desta é exclusiva da superfície dos basófilos.
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Marcadores de Activação
No presente, os marcadores de activação mais utilizados são CD63 e CD203c.
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Análise de Basófilos do Paciente Actualmente, a análise de fluxo assistida
e quantificação de basófilos activados in vitro mostrou-se sensível e específica para o diagnóstico de várias alergias mediadas por IgE, incluindo os clássicos alérgenos inalantes (ácaros, epitélio do gato, e pólen), alergia ao veneno de hymenoptera, alergia natural ao látex de borracha, alergias primárias e secundárias a alimentos e medicamentos.
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Análise de Basófilos de dadores atópicos A análise de fluxo assistida e
quantificação de basófilos in vitro activados também pode ser aplicada em células obtidas de indivíduos atópicos
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Aplicações da Pesquisa
A citometria de fluxo pode fornecer resultados referentes à dose de respostas e cinética de fosforilação de p38 MAPKqualitativamente similares aos dados obtidos com a técnica Wesern-blot.
A citometria de fluxo oferece diferentes oportunidades que a tornam maisadequado para aplicação clínica.
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JOANA VINES, CIÈNCIA VIVA, FACULDADE DE CIÈNCIAS MÉDICAS DE LISBOA