Aplicações da eletroforese capilar na determinação de...

1

Miguel Bentes Mocherniuk

Aplicações da eletroforese capilar na determinação de princípio

ativo de fármacos e ácidos orgânicos em amostras de água

fortemente salina

Orientador: Prof. Dr. Aderval Severino Luna (PPGEQ/IQ/UERJ)

Rio de Janeiro 2008

Dissertação apresentada, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre, ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, da Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Área de concentração: Bioprocessos e Tecnologia Ambiental.

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

2

CATALOGAÇÃO NA FONTE UERJ/REDE SIRIUS/NPROTEC

Autorizo, apenas para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total desta tese.

_____________________________________________ ________________ Assinatura Data

M688 Mocherniuk, Miguel Bentes. Aplicações da eletroforese capilar na determinação de princípio ativo de fármacos e ácidos orgânicos em amostras de água fortemente salina / Miguel Bentes Mocherniuk. – 2008.

94 f. Orientador : Aderval Severino Luna. Dissertação (mestrado) – Universidade do Estado do Rio

de Janeiro, Instituto de Química. 1. Eletroforese capilar – Teses. 2. Produtos farmacêuticos

– Teses. 3. Ácidos orgânicos – Teses. I. Luna, Aderval Severino. II. Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Instituto de Química. III. Título.

CDU 543.545.2

3

Aplicações da eletroforese capilar na determinação de princípio

ativo de fármacos e ácidos orgânicos em amostras de água

fortemente salina

Aprovado em__________________________________________________ Banca Examinadora:___________________________________________

______________________________________________________ Prof. Dr Aderval Severino Luna (Orientador) PPGEQ/ Instituto de Química da UERJ

__________________________________________________________ Prof. Dr Antonio Carlos Augusto da Costa PPGEQ/ Instituto de Química da UERJ

___________________________________________________________ Prof . Dr. Ayres Guimarães Dias

Instituto de Química da UERJ

___________________________________________________________ Prof a. Dra Fátima Maria Zanon Zotin PPGEQ/ Instituto de Química da UERJ

Rio de Janeiro 2008

Dissertação apresentada, como requisito para obtenção do título de Mestre, ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, da Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Área de concentração: Bioprocessos e Tecnologia Ambiental.

4

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, irmão e minha noiva que sempre me apoiaram e me deram força nas horas

difíceis quando pensei em desistir;

Ao Prof. Dr. Aderval Severino Luna, pela competência, dedicação e paciência na orientação

deste trabalho e pelo conhecimento transmitido;

Ao Corpo Docente do Curso de Mestrado em Engenharia Química da Universidade do Estado

do Rio de Janeiro;

Aos amigos do laboratório da UERJ, Jéssica Pinho, Diego Barros, Fernanda Almeida,

Arnaldo Peixoto, Igor Lima, André Matassoli, Thaís Malcher, Marcelo Reis e Otavio

Bernardes pelo apoio e colaboração no laboratório;

A todos os colegas da turma do Curso de Mestrado em Engenharia Química da Universidade

do Estado do Rio de Janeiro;

Ao Instituto de Química da UERJ, por ter fornecido toda a estrutura para realização deste

trabalho;

Enfim, todos que de alguma forma, direta ou indiretamente, contribuíram para realização

deste trabalho.

5

RESUMO

MOCHERNIUK, Miguel Bentes Aplicações de eletroforese capilar na determinação de princípio ativo de fármacos e ácidos orgânicos em amostras de água fortemente salina, Brasil, 2008. 91f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) – Instituto de Química, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2008.

RESUMO

Desde as duas últimas décadas, a eletroforese capilar emergiu como um método

alternativo para separação e quantificação de uma variedade de analitos de importância

industrial, clínica, biomédica e ambiental. Aspectos relevantes desta técnica, como alta

eficiência, alto poder de resolução, maior rapidez, total automação e uma diversidade de

esquemas de injeção e detecção foram discutidos intensamente na literatura. Neste trabalho,

dois métodos diferentes foram desenvolvidos por eletroforese capilar.

O primeiro método foi desenvolvido para determinação simultânea de ácido

acetilsalicílico (AAS) e paracetamol (PAR) em comprimidos por eletroforese capilar por zona

(CZE). Uma solução de 25 mmol/L de tetraborato de sódio (BGE) foi a mais adequada para a

separação dos analitos. Um capilar de sílica fundida com comprimento total de 50 cm,

diâmetro interno de 50 µm e comprimento efetivo de 40 cm foi usado para a separação. Os os

analitos foram completamente separados em 8 min com um potencial aplicado de 25 kV, e a

detecção foi feita em 226 nm com detector UV. Usou-se ácido benzóico como padrão interno

(HBz) para a quantificação das drogas. A validação do método foi feita em termos de

linearidade, exatidão, precisão, limite de detecção (LD) e de quantificação (LQ). A

linearidade das curvas de calibração para o AAS e PAR foram 100 – 500 mg/L (R2ajustado =

0,9904), 50 – 300 mg/L (R2ajustado = 0,9906), respectivamente. O método proposto é simples e

adequado para a análise simultânea dos princípios ativos dos comprimidos.

O segundo método foi desenvolvido para a determinação simultânea dos ácidos

fórmico, acético e propiônico em água natural fortemente salina por cromatografia

eletrocinética micelar ou eletrocromatografia micelar. Um eletrólito de fundo composto por

solução de 5 mL de ácido benzóico 10 mmol/L, 0,5 mL de brometo de cetiltrimetil amônio

(CTAB) 0,5 mmol/L, 0,1 mL de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L, 3.5

mL de água, e 0,9 mL dietanolamina (DEA) 9 mmol/L foi o mais adequado para a separação

de todos os analitos. Um tubo capilar de sílica fundida com comprimento total de 50 cm,

diâmetro interno de 50 µm e comprimento efetivo de 40 cm foi usado para a separação. Todos

6

analitos foram completamente separados em 10 min com a diferença de potencial de -20 kV, e

a detecção indireta foi feita em 229 nm com detector UV. A validação do método foi feita em

termos de linearidade, exatidão, precisão, limite de detecção (LD) e de quantificação (LQ). A

linearidade das curvas de calibração para os ácidos fórmico, acético e propiônico foram 10 –

100 mg/L (R2adjustado > 0,992), para todos eles. Portanto, o método proposto é simples e

adequado para análise simultânea de ácidos orgânicos de baixo peso molecular em água

natural fortemente salina.

7

ABSTRACT

Over the past two decades, capillary electrophoresis has emerged as a very resourceful

alternative method for the separation and quantification of a variety of solutes of industrial,

clinical, biomedical and environmental importance. Relevant aspects of the technique such as

high efficiency, high resolving power, high speed, full automation, and a diversity of injection

and detection schemes have been extensively discussed in the literature. In this work, two

different methods were developed by capillary electrophoresis.

The first method has been developed for the simultaneous determination of

acetylsalicylic acid (AAS) and paracetamol (PAR) in tablets by capillary zone eletrophoresis

(CZE). A 25 mmol/L sodium tetraborate background electrolyte (BGE) solution was found to

be suitable for the separation of all the analytes. An uncoated fused-capillary of a total length

50 cm (effective length 40 cm) with internal diameter of 50 µm was used for separation. All

the analytes were completely separated within 8 min at the applied voltage of 25 kV, and

detection was performed at 226 nm with an UV detector. Benzoic acid was used as internal

standard (I. S.) for the quantification of the drugs. Validation of the method was performed in

terms of linearity, accuracy, precision, limit of detection (LOD), and quantification (LOQ).

The linearity of the calibration curves for AAS, and PAR were 100 – 500 mg/L (R2adjusted =

0,9904), 50 – 300 mg/L (R2adjusted = 0,9906), respectively. Thus, the proposed method is

simple and suitable for the simultaneous analysis of active ingredients in tablets dosage forms.

The second method has been developed for the simultaneous determination of formic,

acetic, and propionic acids in highly saline natural water by micelar electrokinetic capillary

chromatography (MEKC or MECC). An background electrolyte composed of 5 mL of

benzoic acid 10 mmol/L, 0.5 mL of cetyltrimethylammonium bromide 0.5 mmol/L, 0.1 mL of

EDTA 0.1 mmol/L, 3.5 mL water, and 0.9 mL diethanolamine 9 mmol/L solution was found

to be suitable for the separation of all the analytes. An uncoated fused-capillary of a total

length 50 cm (effective length 40 cm) was used for separation. All the analytes were

completely separated within 10 min at the applied voltage of - 20 kV, and indirect detection

was performed at 229 nm with an UV detector. Validation of the method was performed in

terms of linearity, accuracy, precision, limit of detection (LOD), and quantification (LOQ).

The linearity of the calibration curves for formic, acetic and propionic acids were 10 – 100

mg/L (R2adjusted > 0.992), for all of them. Therefore, the proposed method is simple and

8

suitable for the simultaneous analysis of low-molecular mass organic acids in highly saline

natural water.

9

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Soluções tamponadas para eletroforese capilar.............................................34

Tabela 2 - Aditivos de eletrólito usados em eletroforese capilar....................................35

Tabela 3 - Aplicações da eletroforese capilar por zona (CZE)........................................37

Tabela 4 - Tipos e propriedades dos agentes tensoativos................................................39

Tabela 5 - Aplicações da cromatografia eletrocinética micelar (MECC)........................42

Tabela 6 – Seleção do modo de eletroforese capilar.......................................................42

Tabela 7 - Concentração das misturas para a curva de calibração dos fármacos............64

Tabela 8 - Concentração das misturas para a curva de calibração dos ácidos

orgânicos..........................................................................................................................65

Tabela 9 - Parâmetros da curva de calibração do AAS e PAR por CZE.........................71

Tabela 10 - Análise estatística da curva de calibração do AAS e PAR por

CZE..................................................................................................................................71

Tabela 11 - Análise da variância dos dados da curva de calibração do AAS..................71

Tabela 12 - Análise da variância dos dados da curva de calibração do PAR..................71

Tabela 13 - Estudo da precisão intra-corridas do método desenvolvido para determinar AAS e

PAR por CZE.......................................................................................................73

Tabela 14 - Parâmetros da curva de calibração dos ácidos orgânicos por MKCE..........79

Tabela 15 - Análise estatística da curva de calibração dos ácidos orgânicos por

MKCE..............................................................................................................................79

Tabela 16 - Análise da variância dos dados da curva de calibração do ácido

fórmico.............................................................................................................................79

Tabela 17 - Análise da variância dos dados da curva de calibração do ácido acético.....79

Tabela 18 - Análise da variância dos dados da curva de calibração do ácido

propiônico........................................................................................................................80

Tabela 19 – Resultados da medida da precisão ..............................................................82

Tabela 20 - Figuras analíticas de mérito .........................................................................83

10

LISTAS DE FIGURAS

Figura 1 - Sistema de eletroforese capilar, Capel 105M, Lumex, Rússia.......................18

Figura 2 - Foto do sistema de eletroforese capilar, Capel 105M, Lumex, Rússia...........19

Figura 3 - Cassete utilizado no sistema de eletroforese capilar da Lumex, Rússia

modelo.............................................................................................................................19

Figura 4 - Seqüência de eventos na separação de dois solutos pelos quatro modos da

eletroforese......................................................................................................................22

Figura 5 - Efeito de pH no fluxo eletroosmótico.............................................................25

Figura 6 - Perfis de fluxos capilares................................................................................26

Figura 7 - Seção transversal do gradiente de temperatura e o perfil da velocidade

eletroforética....................................................................................................................29

Figura 8 - Eletroforese capilar por zona..........................................................................31

Figura 9 - Cromatografia eletrocinética micelar..............................................................38

Figura 10 - Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH =

8,0....................................................................................................................................66


9,2....................................................................................................................................66


10,4..................................................................................................................................67


9,2....................................................................................................................................68


9,2....................................................................................................................................68

Figura 15 – Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 9,2, potencial

aplicado = 15 kV………………………………………………………..........69


aplicado = 20 kV..............................................................................................69


aplicado = 25 kV..............................................................................................70

Figura 18 – Curva de calibração do AAS por eletroforese capilar por zona...................72

Figura 19 – Curva de calibração do PAR por eletroforese capilar por zona...................72

11

Figura 20 – Eletrólito de corrida: solução constituída de 5 mL de solução de ácido benzóico

10 mmol/L, 0,5 mL de solução de brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB) 0,5 mM, 0,1 mL

de solução de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L, 3,5 mL de água

purificada e 0,9 mL de solução de dietanolamina (DEA) 9 mmol/L; pH =

4,8.................................................................................................................................75





5,3.................................................................................................................................76





5,8.................................................................................................................................76




purificada e 0,9 mL de solução de dietanolamina (DEA) 9 mmol/L; pH = 5,3.Potencial

aplicado = -15 kV...................................................................................77




purificada e 0,9 mL de solução de dietanolamina (DEA) 9 mmol/L; pH = 5,3.Potencial

aplicado = -20 kV...................................................................................78

Figura 25 – Curva de calibração do ácido fórmico por eletroforese capilar por

MECK..............................................................................................................................80

Figura 26 – Curva de calibração do ácido acético por eletroforese capilar por

MECK..............................................................................................................................80

Figura 27 – Curva de calibração do ácido propiônico por eletroforese capilar por

MECK..............................................................................................................................81

12

LISTAS DE ABREVIATURAS E SIGLAS

BSA Albumina de soro bovina CAPS Ácido 3-(ciclohexilamino)-1- propanosulfônico CE Eletroforese capilar CGE Eletroforese capilar em gel CIEF Eletroforese capilar por focalização isoelétrica CITP Isotacoforese capilar CMC Concentração micelar crítica CTAB Brometo de cetiltrimetil amônio CZE Eletroforese capilar por zona DMF Dimetilformamida DMSO Sulfóxido de dimetila E Força do campo elétrico EDTA Ácido etilenodiaminetetraacético EOF Fluxo electroosmótico EPF Fluxo eletroforético HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência LC Cromatografia líquida Ld Comprimento do tubo capilar até o detector Lt Comprimento capilar total MECC/MEKC Cromatografia eletrocinética micelar ou eletrocromatografia micelar MES Ácido 2-(N-morfolino)etanosulfônico µep Mobilidade eletroforética PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida PCR Reação da polimerase em cadeia pI Ponto isoelétrico SDS Dodecilsulfato de sódio THF Tetrahidrofurano Tris Tris(hidroximetil) amino metano UV Ultravioleta V volt V Potencial elétrico Veo Velocidade do fluxo electroosmótico Vep Velocidade eletroforética

13

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO.............................................................................................................16

1 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................................17

1.1 - Eletroforese capilar...............................................................................................17

1.1.1 Modos de injeção da amostra…………………………………………………….19

1.1.2 Sistemas de detecção……………………………………………………………..20

1.1.3 Modos de separação por eletroforese…………………………………………….21

1.1.4 Terminologia da eletroforese capilar……………………………………………..22

1.1.5 Eletroosmose……………………………………………………………………..23

1.1.6 Dinâmica do fluxo, eficiência e resolução……………………………………….25

1.1.7 O diâmetro capilar e o aquecimento Joule……………………………………….28

1.1.8 Efeito do potencial elétrico e da temperatura…………………………………….30

1.1.9 Modos de eletroforese capilar…………………………………………………….30

1.1.10 Eletroforese capilar de zona…………………………………………………….31

1.1.10.1 Tubos capilares………………………………………………………………..31

1.1.10.2 Efeito do pH…………………………………………………………………...32

1.1.10.3 Solução tampão………………………………………………………………..33

1.1.10.4 Ligação de espécies químicas na parede do tubo capilar……………………..35

1.1.10.5 Revestimento do capilar………………………………………………………36

1.1.10.6 Aplicações da CZE……………………………………………………………36

1.1.11 Cromatografia eletrocinética micelar (MECC ou MEKC)……………………...37

1.1.11.1 Micelas………………………………………………………………………..38

1.1.11.2 Mecanismo de separação……………………………………………………...40

1.1.11.3 Ordem de migração...........................................................................................41

1.1.11.4 Uso de modificadores orgânicos……………………………………………...41

1.1.11.5 Aplicações da MECC........................................................................................42

1.1.12 Selecão do tipo de eletroforese capilar………………………………………….42

1.2 Métodos de determinação de ácido acetilsalicílico (AAS)…...………………….43

1.3 Métodos de determinação do paracetamol (PAR)………………………………43

1.4 Métodos de determinação de ácidos orgânicos………………………………….44

1.5 Validação de métodos analíticos univariados …………………………………...46

1.5.1 Linearidade: o ajuste da curva de calibração……………………………………..47

1.5.1.1 A qualidade do ajuste da curva de calibração…………………………………. 47

14

1.5.2 Teste de linearidade………………………………………………………………48

1.5.3 Sensibilidade do método: o limite de detecção e o limite de quantificação ……..49

1.5.3.1 Limite de detecção: método visual……………………………………………..49

1.5.3.2 Limite de detecção: método da razão sinal-ruído………………………………50

1.5.3.3 Limite de detecção: método baseado em parâmetros da curva analítica……….50

1.5.4.1 Limite de quantificação: método visual...............................................................51

1.5.4.2 Limite de quantificação: método da razão sinal-ruído…………………………51

1.5.4.3 Limite de quantificação: método baseado em parâmetros da curva analítica….51

1.5.5 Precisão …………………………………………………………………………..51

1.5.6 Exatidão …………………………………………………………………………..52

1.5.7 Robustez………………………………………………………………………….53

1.6 Validação de métodos eletroforéticos para análise de produtos farmacêuticos

………………………………………………………………………………………….53

1.6.1 Especificidade.........................................................................................................53

1.6.2 Linearidade e faixa da curva analítica……………………………………………55

1.6.3 Exatidão e estudo de recuperação………………………………………………...55

1.6.4 Precisão…………………………………………………………………………...56

1.6.4.1 Repetibilidade …………………………………………………………………..56

1.6.4.2 Precisão intermediária………………………………………………………….57

1.6.4.3 Reprodutibilidade………………………………………………………………57

1.6.5 Estabilidade das soluções………………………………………………………...57

1.6.6 Robustez………………………………………………………………………….58

1.6.7 Limites de detecção e quantificação……………………………………………...58

2. METODOLOGIA EXPERIMENTAL……………………………………………60

2.1 Instrumentação……………………………………………………………………60

2.2 Soluções, reagentes e materiais …………………………………………………..60

2.2.1 Solução estoque de ácido acetilsalicílico 1000 mg/L…………………………….61

2.2.2 Solução estoque de paracetamol 1000 mg/L……………………………………..61

2.2.3 Solução estoque de ácido benzóico 500 mg/L …………………………………..61

2.2.4 Solução tampão de borato 25 mmol/L (pH = 9,20)………………………………61

2.2.5 Solução tampão de borato 50 mmol/L (pH = 9,20)………………………………61

2.2.6 Solução estoque de aspirina 5000 mg/L………………………………………….61

2.2.7 Solução estoque de paracetamol 7500 mg/L……………………………………..63

2.2.8 Solução estoque de ácido fórmico 1000 mg/L …………………………………...63

15

2.2.9 Solução estoque de ácido acético 1000 mg/L…………………………………….63

2.2.10 Solução estoque de ácido propiônico 1000 mg/L……………………………….63

2.2.11 Solução tampão pH = 5,3……………………………………………………….63

2.3 Lavagem e condicionamento do tubo capilar para a determinação por CZE...63

2.4 Lavagem e condicionamento do tubo capilar para a determinação por MECC

………………………………………………………………………………………….64

2.5 Curvas de calibração dos fármacos para a determinação por CZE...................64

2.6 Curvas de calibração dos ácidos orgânicos para a determinação por

MEKC.............................................................................................................................65

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO …………………………………………………..66

3.1 Estudo univariado do método de determinação de AAS e PAR por CZE…….66

3.1.1 Efeito do pH da solução tampão…...……………………………………………..66

3.1.2 Efeito da concentração do eletrólito suporte……………………………………..67

3.1.3 Efeito do potencial aplicado……………………………………………………...69

3.1.4 Robustez………………………………………………………………………….70

3.1.5 Curvas de calibração……………………………………………………………...70

3.1.6 Precisão…………………………………………………………………………...72


3.1.8 Calibração pelo método do padrão interno……………………………………….73

3.2 Estudo univariado do método de determinação de ácidos orgânicos por

MEKC………………………………………………………………………………….74

3.2.1 Efeito do pH da solução tampão………………………………………………….74

3.2.2 Efeito do potencial aplicado……………………………………………………...77

3.2.3 Curvas de calibração dos ácidos orgânicos………………………………………78

3.2.4 Precisão…………………………………………………………………………...81


4. CONCLUSÕES……………………………………………………………………..84

5. SUGESTÕES DE TRABALHOS FUTUROS.........................................................85

6. REFERÊNCIAS…………………………………………………………………….86

16

INTRODUÇÃO

A química exerce um papel preponderante no meio ambiente. É comum o

público atribuir às substâncias químicas sintéticas os principais problemas de poluição,

responsabilizando seus criadores por isso. Porém, passam despercebido, especialmente

para o grande público, que muitos dos problemas ambientais somente foram resolvidos

quando utilizados os conhecimentos da ciência, em particular da química (LUNA,

2003).

Quando o meio ambiente é abordado, torna-se cada vez mais claro a necessidade

de se aprofundar os estudos nessa área. Interdisciplinar por excelência, esse campo

demanda conhecimentos e técnicas de diferentes fontes, entre as quais se destaca a

química analítica. Neste contexto, a química analítica exerce um papel fundamental,

pois oferece uma pletora de métodos e técnicas para identificação e quantificação de

analitos em uma gama imensa de matrizes (LUNA, 2003).

Acontece que nem sempre os conteúdos mais refinados dessa área do

conhecimento são disponibilizados. Além disso, os profissionais das ciências ambientais

provêm de diversas áreas, portanto costumam ter familiaridade com laboratório

analítico, mas não detêm necessariamente uma formação que lhes possibilite atentar

para as particularidades deste campo (LUNA, 2003).

Mesmo o químico precisa receber uma preparação adequada nesse domínio. A

importância de se empenhar nesse sentido fica patente quando pensamos que, a despeito

de todo o desenvolvimento instrumental, o fator determinante da confiabilidade dos

dados levantados continua sendo a formação do pesquisador (LUNA, 2003).

Para a separação de misturas e quantificação dos componentes são empregadas

técnicas clássicas de separação, tais como: cromatografia em suas diversas modalidades

e a eletroforese. Neste contexto, a eletroforese capilar surge como um técnica alternativa

promissora, esta pode ser empregada como substituinte de cromatografia líquida e, em

muitos casos, como a única alternativa possível (LUNA, 2003).

Neste trabalho, utilizaram-se duas técnicas da família eletroforese capilar:

eletroforese capilar por zona (CZE) e cromatografia eletrocinética micelar (MEKC) ou

eletrocromatografia micelar como técnicas de quantificação de princípios ativos de

preparações farmacêuticas, e ácidos orgânicos de massa molecular baixa em amostras

de águas naturais fortemente salinas. A literatura relata a cromatografia líquida de alta

eficiência (HPLC) como uma técnica de grande aceitação na indústria farmacêutica,

porém somente recentemente a eletroforese capilar foi introduzida nas farmacopéias

17

americana (USP, 2000), francesa (PHARMACOPÉE EUROPÉENNE, 2001) e japonesa

(JP FORUM 1999). Esta técnica surgiu como uma técnica alternativa ou complementar

para aplicação na área de insumos e preparações farmacêuticas. Portanto, o uso de

eletroforese capilar na indústria farmacêutica surgiu a menos uma década, o que

significa uma nova área de pesquisa e desenvolvimento. A determinação de ácidos

orgânicos de massa molar baixa é usualmente feita por cromatografia gasosa (GC),

porém o fato destes analitos se encontrarem em meio aquoso fortemente salino,

inviabiliza a sua determinação direta por esta técnica. Tal surgiu, a oportunidade de se

explorar a cromatografia eletrocinética micelar para esta finalidade.

Portanto, o objetivo desse trabalho foi desenvolver um método de análise para a

quantificação dos princípios ativos de fármacos (ácido acetilsalicílico e paracetamol)

por CZE e outro método de análise para a quantificação dos ácidos: fórmico, acético e

propiônico por MEKC em amostras de águas naturais fortemente salinas.

18

1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1.1 Eletroforese capilar

A eletroforese capilar (CE) é uma família de técnicas relacionadas que

empregam tubos capilares finos (d.i. = 20-200 µm) para realizar separações de

moléculas grandes e pequenas com elevada eficiência. Nestas separações são

empregados potenciais elétricos elevados que podem gerar fluxos eletroosmótico e

eletroforético de soluções tamponadas e de espécies iônicas, respectivamente, dentro do

tubo capilar (BAKER, 1995).

As propriedades da separação e o eletroferograma resultante têm características

que se assemelham a um cruzamento da eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)

tradicional com a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (BAKER, 1995).

A CE oferece um formato inovador para as técnicas de separação, pois:

• emprega tubos capilares onde ocorre a separação eletroforética;

• utiliza um campo elétrico muito alto, freqüentemente mais alto que 500 V/cm;

• usa a tecnologia de um detector moderno e faz com que o eletroferograma seja

semelhante ao de um cromatograma;

• tem eficiência igual ou superior ao da cromatografia em fase gasosa capilar;

• requer uma quantidade mínima de amostra;

• é facilmente automatizado para uma análise quantitativa precisa e tem facilidade de

uso;

• consume uma quantidade limitada de reagentes, com volumes tipicamente da ordem

de 1 a 10 nL;

• é aplicável para uma seleção ampla de analitos quando comparada com outras técnicas

analíticas de separação (TAVARES, 1997).

A configuração instrumental básica para CE consiste de um tubo de sílica

fundida com uma janela óptica, uma fonte controlada com potencial elevado, dois

elétrodos, dois reservatórios com solução tampão e um detector que pode ser:

ultravioleta, fluorescência, quimiluminescência, espectrometria de massas ou

eletroquímico (BAKER, 1995).

As extremidades do tubo capilar são colocadas em dois reservatórios, um

contendo a solução tampão com a janela óptica alinhada com o detector e o outro

contendo a amostra. Depois de encher o tubo capilar com a solução tampão, a amostra

pode ser introduzida imergindo a extremidade do tubo capilar no recipiente da solução

19

amostra e elevando o tubo capilar submerso cerca de 30 cm acima do reservatório da

solução tampão colocado do lado do detector. Virtualmente todo o trabalho antes de

1988 em CE era executado em instrumentos com esta configuração básica. Apesar de

relativamente fáceis de usar, estes primeiros sistemas eram inconvenientes para análise

de rotina e muito imprecisos para análise quantitativa (BAKER, 1995).

Um diagrama de um instrumento moderno, o sistema de eletroforese capilar,

modelo Capel 105M (Lumex, Rússia), é ilustrado na Figura 1.

Figura 1 – Sistema de eletroforese capilar, Capel 105M, Lumex, Rússia.

Quando comparados aos primeiros instrumentos desenvolvidos, este instrumento

é completamente automatizado, pois oferece o controle computadorizado de todas as

operações como a injeção hidrodinâmica da amostra, o uso de um amostrador

automático e de um coletor de fração, o controle preciso da temperatura e um sistema de

dissipação de calor avançado. A automatização é crítica para CE, pois uma operação

repetível é exigida para uma análise quantitativa precisa (BAKER, 1995).

As figuras 2 e 3 mostram o sistema de eletroforese capilar empregado e a janela

ótica do sistema de detecção, respectivamente.

20

Figura 2 – Foto do sistema de eletroforese capilar, Capel 105M, Lumex, Rússia.

Figura 3 – Cassete utilizado no sistema de eletroforese capilar da Lumex, Rússia

modelo Capel 105 M, em destaque a janela de detecção.

1.1.1 Modos de injeção da amostra

Os resultados das análises podem ser diretamente influenciados pelo tipo de

injeção realizada na eletroforese capilar. Existem duas maneiras de se introduzir

amostras do CE no tubo capilar: injeção eletrocinética (onde um gradiente de potencial

é estabelecido ao longo do capilar) ou injeção hidrodinâmica (no qual utiliza-se um

gradiente de pressão).

Durante a injeção eletrocinética o potencial é aplicado por um tempo já

estipulado anteriormente, sendo a amostra introduzida a partir do resultado da

combinação da velocidade eletroosmótica e eletroforética. No método hidrodinâmico a

pressão pode ser através de pressurização ou vácuo em um dos reservatórios de solução,

21

ou por gravidade onde se eleva um dos reservatórios de amostras em relação ao outro e

é introduzido por sifonagem. Neste caso o volume da amostra irá depender de vários

fatores tais como: tempo de injeção, viscosidade da solução tampão, diferença da

pressão estabelecida etc.

Comparando-se os dois tipos de injeção a hidrodinâmica é mais precisa que a

eletrocinética, porém um aumento significativo pode ocorrer na zona da amostra

resultando um perfil parabólico o qual é característico em casos de fluxos induzidos por

pressão (TAVARES, 1996).

1.1.2 Sistemas de detecção

Existem diversos tipos de detectores utilizados em eletroforese capilar. Um dos

mais comuns é o espectrofotométrico de absorção no UV/Vis que permitem seleção do

comprimento de onda na faixa de 190 a 700 nm (QUEIROZ & JARDIM, 2001). Vários

critérios devem ser observados na escolha de um detector adequado para que um

experimento tenha êxito, tais como: versatilidade, alta sensibilidade, baixo nível de

ruído, vasta linearidade de respostas, linha de base estável, insensibildade ao fluxo e

mudanças de temperatura e respostas a todo o tipo de substâncias utilizando um

pequeno volume de amostra. Para que não se tenha dúvida em relação aos resultados,

procura-se utilizar um detector com uma relação conhecida e reprodutível garantindo

assim uma análise mais precisa dos resultados (WESTON & BROWN, 1997).

Basicamente os detectores podem ser classificados em dois tipos: universais e

específicos. O modo de funcionamento dos detectores universais é feito através da

medição entre a diferença de alguma propriedade do soluto em relação à solução. A

desvantagem desse tipo de detector em relação ao específico é apresentar menor

sensibilidade e intervalo dinâmico.

No caso dos detectores específicos a medição é realizada através de alguma

propriedade específica do soluto, estando incluídos como exemplos os fotodetectores

(baseados na absorção do UV/Vis), os espectrômetros de massa, os detectores

amperométricos e radiométricos, etc.

A grande vantagem do uso desse tipo de detector ocorre quando a matriz da

amostra é complexa e principalmente quando se deseja minimizar algum tipo de

interferência do fundo. Além disso é mais sensível do que os detectores universais,

fornece intervalos mais amplos de resposta linear e melhor relação sinal/ruído

(TAVARES, 1996).

22

Dentre os diversos tipos de detectores em CE, estão incluídos os de fluorescência,

espectrômetro de massa, fluorescência por laser-induzido, condutividade,

amperométrico, radiométrico, refratométrico, etc. (BAKER, 1995). Na figura 3 pode-se

observar um cassete utilizado no sistema de eletroforese capilar da Lumex, Rússia

modelo Capel 105 M.

1.1.3 Modos de separação por eletroforese

Os modos de separação por eletroforese são classificados como: fronteira móvel,

zona, isotacoforese e focalização isoelétrica.

Na eletroforese por fronteira móvel, uma quantidade razoável da amostra é

colocada em um tubo, preenchido com uma solução tampão. Após a aplicação do

campo elétrico, os componentes da amostra migram em determinada direção com uma

velocidade característica que depende da mobilidade do componente. A separação

completa nunca é atingida, pois apenas os componentes de maior mobilidade podem ser

parcialmente purificados, enquanto que as bandas dos outros componentes sofrem

diversos graus de sobreposição (TAVARES, 1996).

A eletroforese de zona é também uma técnica de fronteira móvel, pois a amostra

é introduzida no meio tamponado, como uma banda de espessura pequena. Quando o

campo elétrico é aplicado, cada zona migra de forma independente, com velocidade

constante, mas diferenciada em função de sua própria mobilidade. As modalidades da

eletroforese em solução livre, gel e micelar pertencem a essa categoria (TAVARES,

1996).

Em isatocoforese, a amostra é inserida entre soluções, o eletrólito líder e o

eletrólito terminador. Ambos, cátions e ânions podem ser determinados por esse modo,

entretanto em misturas distintas. A Figura 4 ilustra a separação isotacoforética de uma

mistura de cátions. Nesse exemplo, o eletrólito líder deve conter um cátion cuja

mobilidade é maior que a mobilidade de qualquer componente catiônico da amostra. Por

outro lado, o eletrólito terminador deve conter o cátion de menor mobilidade. Quando o

campo elétrico é estabelecido, gradientes diferentes de potencial evolvem cada banda,

de tal forma que todos os cátions migram com velocidade constante e única. Em regiões

onde cátions de menor mobilidade estão presentes, o campo elétrico é mais intenso.

Entretanto, estes solutos movem-se com a mesma velocidade que os solutos de maior

mobilidade, estes últimos submetidos a campo elétrico mais fraco. Consequentemente,

as velocidades das bandas individuais são auto-normalizadas (TAVARES, 1996).

23

A focalização isoelétrica envolve a separação de solutos anfotéricos em um

gradiente de pH. Sob a influência do campo elétrico, um soluto carregado

negativamente migra em direção ao anodo. Durante a migração, o soluto atravessa

regiões de pH progressivamente menor. Assim, uma fração cada vez maior do maior do

soluto torna-se protonada, e dessa forma, a carga elétrica é alterada durante a migração.

Naturalmente, a carga total do soluto é nula e sua migração é interrompida. Cada

componente da amostra migra para uma região de pH igual ao seu ponto isoelétrico e

permanece nessa posição enquanto o campo elétrico estiver atuando (TAVARES,

1996).

Figura 4 – Seqüência de eventos na separação de dois solutos pelos quatro modos da

eletroforese. Adaptado de TAVARES,1996.

1.1.4 Terminologia da eletroforese capilar

Existem algumas diferenças significantes entre a nomenclatura usada na

cromatografia e na eletroforese capilar. Por exemplo, um termo fundamental na

cromatografia é o tempo de retenção. Em eletroforese, em condições ideais quando nada

é retido, o termo análogo se torna tempo de migração. O tempo de migração (tm) é o

tempo que um soluto leva para se mover do início do tubo capilar até a janela de

24

detecção. Outros termos fundamentais são definidos a seguir, nos quais se incluem a

mobilidade eletroforética, µep (cm2/Vs), a velocidade eletroforética, Vep (cm/s), e a força

de campo elétrico, E (V/cm) (TAVARES, 1996). As relações entre estes fatores são

mostradas na Equação 1.

t

mdep

epLV

tL

E

V==µ (1)

Várias características importantes podem ser retiradas desta equação:

1) A velocidade eletroforética é calculada dividindo-se o comprimento do tubo capilar

até o detector (Ld) pelo tempo de migração, tm.

2) A mobilidade eletroforética é obtida pela divisão da velocidade eletroforética pela

força do campo elétrico aplicado. A mobilidade é independente do potencial aplicado e

do comprimento do tubo capilar, mas é altamente dependente no tipo de tampão usado,

do pH, assim como da temperatura.

3) Dois comprimentos capilares são importantes: O comprimento do tubo capilar para o

detector, Ld, e o comprimento total, LT. Enquanto a separação mensurável ocorre no

segmento capilar, Ld, a força de campo elétrico é calculada dividindo o potencial

elétrico pelo comprimento do tubo capilar inteiro, Lt. O comprimento do tubo em

excesso, Lt - Ld, é exigido para fazer a conexão com o reservatório da solução tampão.

A Equação 1 só é útil na determinação da mobilidade aparente. Para calcular a

mobilidade real, o fenômeno do fluxo electroosmótico deve ser levado em consideração.

Para apresentar um eletroferograma reprodutível, o fluxo electroosmótico deve estar

cuidadosamente controlado (TAVARES, 1996).

1.1.5 Eletroosmose

Um dos fundamentais processos que dirigem a CE é a eletroosmose. Este

fenômeno é uma conseqüência da carga superficial na parede do tubo capilar. Os tubos

de sílica fundidos, que são tipicamente usados nas separações eletroforéticas, têm

grupos silanóis ionizáveis em contato com a solução tampão contida dentro do tubo

capilar. O pI da sílica fundida é aproximadamente 1,5. O grau de ionização é controlado

principalmente pelo pH da solução tampão (BAKER, 1995).

O fluxo eletroosmótico (EOF) é definido pela Equação (2):

25

EVep πηεξ4

= (2)

onde ∈ é a constante dielétrica, η é a viscosidade do tampão, e ξ é o potencial zeta

medido na camada plana próximo da interface líquido-sólido. A parede do tubo capilar

carregada negativamente atrai íons positivos do tampão, criando-se assim uma dupla

camada elétrica. Quando um potencial é aplicado no tubo capilar, os cátions da porção

difusa da camada dupla migram na direção do cátodo, carreando água. O resultado

desse processo é um fluxo líquido da solução tampão na direção do elétrodo negativo.

Esse fluxo eletroosmótico (EOF) pode ser bastante robusto, com uma velocidade linear

ao redor de 2 mm/s em pH = 9 em tampão de borato 20 mM. Para um tubo capilar de 50

µm de diâmetro interno, isto se traduz em uma vazão de cerca de 4 nL/s. Em pH = 3, o

EOF é muito menor, cerca de 0,5 nL/s. O potencial zeta é relacionado ao inverso da

carga por unidade da área da superfície do tubo capilar, do número de elétrons de

valência e da raiz quadrada da concentração do eletrólito. Como isto é uma relação

inversa, aumentando-se a concentração do eletrólito diminui-se o EOF. Como será

mostrado posteriormente, o fluxo eletroosmótico deve ser controlado ou até suprimido

para viabilizar certos modos de eletroforese capilar. Por outro lado, o EOF torna

possível uma determinação simultânea de cátions, ânions e espécies neutras em uma

única corrida. Em pH neutro ou alcalino, o EOF suficientemente é mais forte que a

migração eletroforética fazendo com que todas as espécies migrem para o elétrodo

negativo. A ordem de migração processa-se na seguinte ordem: cátions, espécies neutras

e ânions (TAVARES, 1996).

O efeito do pH no EOF é ilustrado na Figura 5. Imagine que um sal interno

como um peptídeo está sendo separado nas condições descritas na Figura 5. Em pH alto,

EOF é grande e o peptídeo está negativamente carregado. Apesar da migração

eletroforética do peptídeo para o elétrodo positivo (anodo), o EOF é superior, fazendo

com que o peptídeo migre para o elétrodo negativo (cátodo). Em pH baixo, o peptídeo

está positivamente carregado e EOF é muito pequeno. Deste modo, a migração

eletroforética do peptídeo e do EOF são para o elétrodo negativo. Em tubos capilares

não tratados, a maioria dos solutos migra para o elétrodo negativo não importando a

carga quando a solução tampão tiver um pH acima de 7,0. Em tampão de pH ácido, a

26

maioria dos sais internos e cátions também migrarão para o eletrodo negativo (BAKER,

1995).

Figura 5. Efeito do pH no fluxo eletroosmótico. Adaptado de QUEIROZ, 2007.

Para assegurar que um sistema está corretamente controlado, é freqüentemente

necessário medir o EOF. Isto é feito injetando-se um soluto neutro e medindo-se o

tempo que leva para alcançar o detector. Solutos como o metanol, acetona, e óxido de

mesitila são freqüentemente empregados. Na cromatografia eletrocinética micelar

(MECC) técnica que será discutida posteriormente, um requisito adicional imposto é

que o soluto marcador não se particione na micela. Para técnicas como eletroforese

capilar por focalização isoelétrica (CIEF) ou isotacoforese capilar (CITP), o EOF deve

ser suprimido. Isto é possível recobrindo-se o tubo capilar com teflon. Aditivos como a

metilcelulose também são efetivos na supressão do EOF (BAKER, 1995).

1.1.6 Dinâmica do fluxo, eficiência e resolução

Quando se emprega um sistema pressurizado como na cromatografia líquida, as

forças de fricção na interface sólido-líquido nas paredes da coluna provocam uma queda

de pressão substancial. Até em sistemas abertos, as forças de fricção, mesmo com vazão

baixa, são severas o suficiente para resultar em perfis de fluxo laminar ou parabólico.

Como conseqüência do fluxo parabólico, a seção transversal do fluxo, vista na Figura 6,

mostra o que ocorre no tubo capilar, o que provoca um fluxo mais alto no meio e

próximo à zero na parede de tubo capilar. Este variação no fluxo resulta em um

significativo alargamento do pico (BAKER, 1995).

27

Figure 6. Perfis de fluxos capilares.

Em sistemas eletricamente dirigidos, a força motriz do EOF é uniformemente

distribuída ao longo do comprimento inteiro do tubo capilar. Como resultado, não existe

queda de pressão e o fluxo é uniforme através do tubo capilar, exceto muito perto da

parede onde a velocidade novamente se aproxima de zero (BAKER, 1995).

A eficiência de um sistema pode ser derivada dos princípios fundamentais

(TAVARES, 1995).

A velocidade de migração, vep, é simplesmente definida por:

L

VEV epepep µµ == (3)

O tempo de migração, tm, é definido como:

V

L

V

Lt

epep

m µ

2

== (4)

Durante a migração pelo tubo capilar, ocorre uma difusão molecular levando a

dispersão do pico, σ2:

V

LDtD

ep

mmm µ

σ2

2 22 == (5)

onde Dm é o coeficiente de difusão do soluto cm2/s. O número de pratos teóricos é dado

pela expressão seguinte:

2

2

σL

N = (6)

Seção transversal de um fluxo eletroosmótico

Seção transversal de um fluxo hidrodinâmico

28

Substituindo-se a Equação (5) na Equação (6):

m

ep

D

VN

2

µ= (7)

A dispersão do pico, σ2, neste sistema simples é assumida ser uma difusão

relacionada com o tempo. A equação (7) indica que macromoléculas de proteínas e

DNA, que possuem coeficientes de difusão pequenos, Dm, fornecem um número de

pratos teóricos elevados. Além de com o uso de potenciais elevados promove-se uma

maior eficiência e diminui-se o tempo de separação. O limite de potencial aplicado com

a tecnologia existente é próximo a 30 kV. O limite prático da força do campo (pode-se

usar tubos capilares muito pequenos para gerar uma força de campo alto) é o

aquecimento Joule. Esse aquecimento é uma conseqüência da resistência do tampão

para seguir o fluxo de corrente. Pode-se estimar o número de pratos teóricos, tomando-

se como exemplo a proteína do coração do cavalo, a mioglobina (massa molar = 13.900

g/mol) como ilustração, onde µep = 0.65 x 10-4 cm2/Vs (tampão de bicina/TEA 20 mM,

pH = 8,5) e Dm = 1 x 10-6 cm2/s com 30 KV, obtém-se um número de pratos teóricos

igual a 975.000 (BAKER, 1995).

O conceito de pratos teóricos pode ser melhor compreendido adotando-se o

seguinte modelo: em uma coluna cromatográfica contendo finas secções ou pratos, irá

ocorrer um equilíbrio do soluto entre a fase móvel e a estacionária. Com o movimento

do soluto através da coluna (de um prato teórico a outro), a eficiência vai aumentando,

com isso, quanto maior for o número de pratos teóricos maior será a eficiência da

coluna (Weston, Brown, 1997).

Apesar da limitação difusional, a CE é ainda útil para moléculas pequenas

porque nas separações µep é uma função da relação carga/íon. As moléculas pequenas

tendem a ser mais móveis. Por exemplo, a mobilidade do sulfato de quinina é 4 x 10-4

cm2/Vs. Apesar do coeficiente de difusão deste analito ser alto, Dm = 0.7 x 10-5 cm2/s, o

número de pratos teóricos é igual a 857.000 quando o potencial aplicado é de 15 KV

(BAKER, 1995).

A resolução, Rs, entre duas espécies é dada pela expressão:

NRep

ep

s µ

µ∆=4

1 (8)

29

onde ∆µep é a diferença em mobilidade eletroforética entre as duas espécies, epµ é a

mobilidade eletroforética média das duas espécies e N é o número de pratos teóricos.

Substituindo-se o número de pratos teóricos na Equação (8):

( )mep

ep

sD

VR

µ

µ177,0= (9)

A Equação (9) indica que se pode melhorar a resolução aumentando-se o potencial

aplicado. Para duplicar a resolução, o potencial aplicado deve ser quadruplicado. A

chave para se melhorar a resolução é aumentar a ∆µep. O controle da mobilidade é

realizado pela seleção do tipo adequado de eletroforese capilar concomitante com a

seleção do tampão mais conveniente (TAVARES, 1996).

1.1.7 O diâmetro capilar e o aquecimento Joule

A produção de calor em CE é o resultado inevitável da aplicação de um campo

de força alto. Dois problemas importantes surgem da produção de calor: gradientes de

temperatura através do tubo capilar e mudanças de temperatura com o tempo devido à

dissipação de calor ineficaz. A taxa de geração de calor em um tubo capilar pode ser

expressa como:

LA

iV

dt

dH= (10)

onde L é o comprimento do tubo capilar e A é área da seção transversal. Como i = V/R

e R = L/kA onde k é a condutividade térmica.

2

2

L

kV

dt

dH= (11)

A quantidade de calor gerado é proporcional ao quadrado da força do campo

elétrico. Assim, a diminuição do potencial aplicado e o aumento do comprimento do

tubo capilar provocam um efeito dramático no calor gerado. O uso de solução tampão

com baixa condutividade é útil, porém o carregamento da amostra pode ser prejudicado.

Gradientes de temperatura dentro do tubo capilar são conseqüência da dissipação de

calor. Como o calor é dissipado por difusão, a temperatura no centro é superior à das

paredes do tubo capilar (BAKER, 1995).

30

Figura 7 – Seção transversal do gradiente de temperatura e o perfil da velocidade

eletroforética.

Como a viscosidade é mais baixa em temperaturas mais altas, isto ocasiona um

aumento no EOF, assim como na mobilidade eletroforética. A mobilidade eletroforética,

para a maioria dos íons, aumenta cerca de 2% por grau Kelvin. A resultante deste fato é

um perfil de fluxo que se assemelha a um fluxo hidrodinâmico, como o conseqüente

alargamento do pico. Trabalhando-se com tubos capilares de diâmetro pequeno

melhora-se a situação por duas razões: a corrente que passa pelo tubo capilar é reduzida

pelo quadrado do raio do tubo capilar e o calor é mais prontamente dissipado através do

percurso radial mais estreito (BAKER, 1995). O gradiente térmico resultante é

proporcional ao quadrado do diâmetro do tubo capilar, o qual pode ser obtido da

seguinte equação abaixo:

K

WrT

424,0

2

=∆ (12)

onde W é a potência, r é o raio do tubo capilar, e K, a condutividade térmica.

O segundo problema é dissipação de calor ineficaz. Se calor não é removido em

uma taxa equiparada à sua produção, um gradual aumento de temperatura irá ocorrer até

que o equilíbrio seja alcançado. Dependendo das condições específicas experimentais,

uma flutuação no tempo de migração resultará em variações no EOF e na velocidade

eletroforética. Os tubos capilares, com diâmetro estreito, ajudam na dissipação de calor,

mas sistemas de refrigeração efetivos são necessários. Líquidos são usados na remoção

de calor e no controle de temperatura do tubo capilar. O diâmetro interno do tubo

capilar varia de 20-200 µm. Do ponto de vista de resolução, o tubo capilar com menor

diâmetro interno produz a melhor a separação, porém reduz drasticamente o limite de

detecção em virtude da pequena quantidade de amostra introduzida e do estreito

caminho ótico (TAVARES, 1996).

Os tubos capilares estreitos são também os mais propensos a entupir. Como as

soluções são filtradas com filtros de porosidade pequena (<0,45 µm), o entupimento

31

raramente ocorre na faixa mencionada. Quando a filtração for impraticável para

amostras com partículas em suspensão, recomenda-se fazer uma centrifugação com

6000 rpm por 5 minutos (BAKER, 1995).

1.1.8 Efeito do potencial elétrico e da temperatura

As velocidades electroosmótica e eletroforética são diretamente proporcionais à

força do campo, portanto o uso de um potencial mais alto permite uma redução nos

tempo de separação. A teoria prediz que tempos de separação pequenos darão as

eficiências mais altas, pois a difusão é a característica mais importante que contribui

para o alargamento dos picos. O fator limitante é o aquecimento Joule.

Experimentalmente, o potencial elétrico mais favorável é determinado fazendo-se

corridas com potenciais crescentes até que a deterioração na resolução seja observada.

As expressões da mobilidade eletroforética (Eq. 13) e do fluxo electroosmótico (eq. 2)

contêm um termo de viscosidade no denominador. A viscosidade é uma função de

temperatura; portanto torna-se necessário um controle eficiente da temperatura. Com o

aumento da temperatura, a viscosidade diminui; deste modo a mobilidade eletroforética

aumenta também. Algumas soluções tampão, como Tris tem o pH fortemente

dependente da temperatura. A maioria de separações são realizadas à 25°C (temperatura

ambiente). Com um líquido refrigerante no tubo capilar é possível manter excelente

controle de temperatura, até com solução tampão de concentração alta e tubos capilares

com diâmetros maiores. Sempre que o controle de temperatura começa a se tornar um

problema, a estratégia habitual é para usar um tubo capilar com diâmetro menor (menor

corrente reduz o aquecimento produzido) ou um tubo capilar mais longo (maior área de

superfície para dissipar o calor gerado). O controle de temperatura é a razão principal

para usar uma concentração baixa (por exemplo, 20 mM) da solução tampão ou

trabalhar em temperaturas elevadas (BAKER, 1995).

1.1.9 Modos de eletroforese capilar

A eletroforese capilar (CE) inclui uma família de técnicas que têm operações

consideravelmente diferentes e separações características. Nesta revisão, somente serão

discutidas as seguintes técnicas:

• Eletroforese capilar de zona (CZE)

• Cromatografia eletrocinética micelar (MECC ou MEKC)

32

1.1.10 Eletroforese capilar de zona

A eletroforese capilar de zona (CZE), também conhecida como eletroforese

capilar em solução livre é a forma mais simples de CE. O mecanismo de separação é

baseado nas diferenças da razão de massa/carga. A homogeneidade da solução tampão e

a força de campo constante ao longo do comprimento do tubo capilar são fundamentais

para a CZE (BAKER, 1995).

Após a injeção e a aplicação do potencial elétrico, os componentes da mistura se

separam em zonas discretas como mostradas na Figura 8.

Figura 8 – Eletroforese capilar por zona

O parâmetro fundamental, a mobilidade eletroforética, µep, pode ser obtida da

teoria de Debye-Hückel-Henry

R

qep πη

µ6

= (13)

onde q é a carga líquida, R é o raio de Stokes e η é a viscosidade. A carga líquida é

normalmente dependente do pH. Por exemplo, dentro do faixa de pH de 4-10, a carga

líquida do sódio é constante, assim como a sua mobilidade. Outras espécies como o

acetato ou o glutamato estão negativamente carregados dentro daquela faixa de pH e

deste modo têm mobilidades negativas (eles migram para o eletrodo positivo). Em pH

alcalino, sua migração ainda será para o eletrodo negativo por causa do EOF. “sais

internos” de aminoácidos, proteínas e peptídeos exibem cargas inversas ao do seu pI e,

igualmente, migram na direção da mobilidade eletroforética. As separações de

moléculas grandes e pequenas podem ser realizadas por CZE. Até moléculas pequenas,

onde as diferenças na razão carga/massa não são grandes, podem ainda ser separáveis

(BAKER, 1995).

33

1.1.10.1 Tubos capilares.

Os tubos capilares com um diâmetro interno de 25-75 µm são normalmente

empregados. Sílica fundida é o material de escolha devido à sua transparência no UV,

durabilidade (quando recoberto com poliimida) e o potencial zeta. Um tubo capilar novo

deve ser condicionado antes de poder ser usado. O pré-tratamento do tubo capilar

consiste na passagem de uma solução de NaOH 0,1 mol/L por 10 minutos, 5 minutos

com a água e 10 minutos com a solução tampão de corrida. Este procedimento de

condicionamento é importante para assegurar que a superfície do tubo capilar esteja

completamente e uniformemente carregada. Para alguns métodos é necessário regenerar

a superfície do tubo capilar entre corridas com a solução de NaOH 0,1 mol/L, e em

casos extremos, com uma solução de NaOH 1 M. O procedimento de regeneração é

freqüentemente necessário se ocorre mudanças nos tempos de migração de uma corrida

para outra. Isto é mais comum quando se usa solução tampão na faixa de pH = 2-6. A

regeneração é raramente necessária quando se trabalha em pH>9. Deve-se fazer esse

procedimento de descontaminação diariamente no início dos experimentos a menos que

a amostra ou os componentes de matriz estejam aderindo nas paredes do tubo capilar.

Enquanto isso não é muito sério com tubos capilares de sílica, prejuízos podem ser

significativos quando se faz a descontaminação de tubos capilares quimicamente

modificados (BAKER, 1995).

O procedimento seguinte maximizará as chances de sucesso ao armazenar um

tubo capilar.

1) Enxagüar o tubo capilar com solução de NaOH 0,1 mol/L por alguns minutos.

(Não faça esse tratamento com tubos capilares quimicamente modificados)

2) Enxagüar por 5 minutos com a água destilada e deionizada.

3) Colocar um frasco vazio sem tampa, na saída e introduza N2 pelo tubo capilar por 5

minutos.

4) Remover o cartucho capilar do instrumento (BAKER, 1995).

1.1.10.2 Efeito do pH.

Em um pH elevado onde o EOF é significativo, a ordem de migração das

espécies é dada por cátions, espécies neutras e ânions. Nenhumas das espécies neutras

serão separadas, pois a carga líquida é zero. Os ânions ainda migrarão em direção ao

cátodo porque o EOF é maior que a migração eletroforética. Em pH mais baixo, onde o

EOF é muito reduzido, os cátions e ânions podem ser medidos, embora não seja

34

possível em uma única corrida. Para medir ânions, o ânodo deve estar além da janela de

detecção. Igualmente, para medir os cátions, o cátodo deve estar além da janela de

detecção. A configuração adequada é obtida simplesmente invertendo a polaridade dos

elétrodos. O impacto do pH no analito também pode ser significativo, particularmente

para sais internos complexos como os peptídeos. A carga nestas combinações é

dependente do pH e a seletividade da separação é afetada substancialmente pelo pH.

Como uma regra geral, selecione um pH que seja pelo menos duas unidades acima do

pKa do analito para assegurar uma ionização completa. Em pH altamente alcalino, o

EOF pode ser tão rápido que separações incompletas podem ocorrer. Certas separações

de proteína podem ocorrer em pH ácido. Nessas condições, a parede do tubo capilar está

descarregada. As proteínas nessas condições estarão positivamente carregadas e não

irâo interagir eletrostaticamente com a parede do tubo capilar, embora uma interação

hidrofóbica possa ainda acontecer. A limitação desta técnica é a precipitação da

proteína. No pI da proteína, a simetria do pico tende a ser pobre (BAKER, 1995).

1.1.10.3 Solução tampão.

Quando a separação envolve solutos com caráter ácido-base, a mobilidade

eletroforética do soluto depende do pH do eletrólito. Nesse caso, emprega-se o termo

mobilidade efetiva a qual incorpora o produto das mobilidades eletroforéticas das

espécies em equilíbrio e a distribuição das concentrações relativas de cada espécie no

pH considerado (TAVARES, 1997).

Uma variedade grande de soluções tampão pode ser empregada em CZE. Um

tampão é mais efetivo na faixa de uma ou duas unidades de pH do seu pKa. Por

exemplo, o fosfato é usado ao redor pH = 2,5 e pH = 7, e borato ao redor pH = 9,O. A

concentração de tampão típica é de 50-100 mM. Soluções tamponadas de sais internos

como bicina, tricina, CAPS, MES e Tris são comuns na separação de proteínas e

peptídeos. A vantagem do tampão de sal interno é sua condutividade baixa quando este

for empregado em torno do pI. A vantagem nisso é a baixa corrente líquida e a redução

do aquecimento Joule. Em certas soluções tamponadas, particularmente aquelas

direcionadas para separações de proteína, sais como cloreto, fosfato, e sulfato são

adicionados ao meio do tampão. Esses sais adicionados afetam a conformação da

proteína, que por sua vez impactam na separação. A concentração do sal também

pressiona o EOF devido em parte ao rompimento da dupla camada elétrica nas camadas

35

próximas das paredes do tubo capilar. Uma limitação importante na quantidade de sal

adicionado na preparação do tampão é o aquecimento Joule (BAKER, 1995).

Tabela 1. Soluções tamponadas para eletroforese capilar (TAVARES, 1997).

Solução tampão Faixa de pH útil

Fosfato 1,14 – 3,14

Acetato 3,76 – 5,76

Fosfato 6,20 – 8,20

Borato 8,14 – 10,14

Soluções tamponadas de sais internos

MES 5,15 – 7,15

PIPES 5,80 – 7,80

HEPES 6,55 – 8,55

TRICINA 7,15 – 9,15

TRIS 7,30 – 9,30

Vários aditivos de solução tampão podem ser empregados para mudar a

seletividade da separação. O uso de aditivos é indicado em quatro situações: para alterar

a mobilidade do soluto, modificar o fluxo eletroosmótico, solubilizar os solutos ou

componentes da matriz da amostra e reduzir a interação de certos solutos com a parede

do capilar, ou minimizar a adsorção. Ou seja, os aditivos de tampão alteram, entre

outras coisas, as mobilidades eletroforéticas. Em outras palavras, duas combinações que

têm as mobilidades idênticas em um sistema de tampão simples podem ser

diferenciadas com aditivos. Outros aditivos, como agentes tensoativos ou

ciclodextrinas, formam um ambiente heterogêneo que define uma nova classe de CE

que será visto posteriormente. Todas as soluções tamponadas devem ser filtradas através

de uma membrana filtrante de 0,45 µm antes do uso (BAKER, 1995).

36

Tabela 2 – Aditivos de eletrólito usados em eletroforese capilar (BAKER, 1995).

Aditivo Função e/ou Efeito

Ácidos sulfônicos Agente formador de pares iônicos e modificadores da carga

superficial

Aminas Bloqueiam os sítios ativos na superfície do capilar,

recobrindo os grupos silanóis livres. Reduzem adsorção e

assimetria do pico.

Anfólitos Reduzem a interação soluto-capilar, melhoram a resolução e

simetria do pico.

Ciclodextrinas Usados nas separações quirais e como complexantes

auxiliares na separação de espécies neutras.

Éter de coroa Usados nas separações quirais e como complexantes

auxiliares na separação de íons metálicos.

Glicóis Reduzem a interação soluto-capilar, auxiliam na solubilidade

de solutos orgânicos e reduzem o EOF.

Íons de metais de

transição

Modificam a mobilidade de certos solutos e afetam a

resolução.

Polímeros de celulose Agentes modificadores de EOF

Sais inorgânicos Reduzem o EOF, alteram a conformação da proteína e

previnem a adsorção soluto-capilar.

Solventes orgânicos Aumentam a solubilidade de solutos orgânicos. Reduzem a

interação soluto-capilar. Agentes modificadores do EOF.

Agentes tensoativos

catiônicos

Revertem a carga da parede do tubo capilar. Revertem o fluxo

EOF.

Uréia Solubiliza proteína e desnatura oligonucleotídeos

1.1.10.4 Ligação de espécies químicas na parede do tubo capilar

Um problema na CZE é de natureza eletrostática, o qual permite a ligação de

espécies catiônicas nas paredes do tubo capilar. Este efeito é observado com proteínas

quando se trabalha em um tampão que tem um pH abaixo do pKa do analito. Esse

problema pode ser superado trabalhando-se com, pelo menos duas pH unidades acima

do pKa da proteína, mas em alguns casos, o pH mais alto pode não pode ser favorável

37

para a separação. Apesar destes problemas, proteínas, especialmente aquelas de

tamanho semelhante, podem ser melhor separadas em solução livre. O uso de tubos

capilares quimicamente modificados é um de vários modos que podem servir para

reduzir a ligação nas paredes do tubo capilar (BAKER, 1995).

1.1.10.5 Revestimento do capilar.

A redução ou eliminação de EOF pode ser útil nas separações eletroforéticas. No

entanto, o fato mais interessante é a habilidade para eliminar a adsorção do soluto. Uma

grande variedade de revestimentos é possível, inclusive com o uso de algumas fases

usadas na cromatografia em fase gasosa capilar. O uso de camadas hidrofílicas tem

grande utilidade na supressão da adsorção de substâncias hidrofóbicas. Ligações

eletrostáticas também podem ser suprimidas. O revestimento hidrofóbico e o uso de

tensoativos não-iônicos como os aditivos de tampão surgem também como iniciativas

promissoras. Muitas companhias estão começando a introduzir tubos capilares de fase

ligada. Esses tubos capilares devem estender a faixa de substâncias capazes de serem

separadas por CZE (BAKER, 1995).

1.1.10.6 Aplicações da CZE

CZE é muito útil na separação de proteínas e peptídeos onde a resolução

completa pode ser freqüentemente obtida para analitos que diferem por um aminoácido

substituinte. Outras aplicações, onde o CZE pode ser útil inclui a determinação de

ânions inorgânicos e cátions como aqueles tipicamente separados por cromatografia de

troca iônica. Moléculas pequenas de insumos e produtos farmacêuticos podem ser

freqüentemente separadas desde que elas possuam cargas. Na maioria dos casos, a

técnica de cromatografia eletrocinética micelar dá resultados superiores para espécies

carregadas como também para moléculas pequenas neutras. Este modo de CE será

discutido mais tarde. Um resumo de aplicações, inclusive com indicativo da solução

tampão usada, é dado na Tabela 3.

38

Tabela 3 – Aplicações da eletroforese capilar por zona (CZE)

Analito Tampão Referência

Dipeptídeos/proteínas H3PO4 150 mM, pH = 1,5 MCCORMICK (1988)

β – Lactoglobulinas Borato 50 mM, KCl 50

mM

DONALD &. JORGENSON

(1988)

Endorfinas Citrato 20 mM, pH = 2,5 GROSSMAN, COLBURN,

LAUER et al. (1989)

Ribonucleases CAPS 20 mM, pH = 11,0 GROSSMAN, COLBURN,

LAUER et al. (1989)

Hormônios de crescimento

humano

Fosfato 100 mM, pH =

2,6 e pH = 8,0

FRENS,WU E HANCOCK,

(1989)

Ânions Salicilato 25 mM, pH = 4 GROSS & YEUNG (1989)

Fármacos (paracetamol et

all.)

Borato 10 mM, pH = 9 AZHAGVUEL & SEKAR

(2007)

Fármacos (paracetamol et

all.)

Borato 40 mM SDS 0,5

mM, pH = 6.2

MARÍN & BARBAS (2004)

Ânions BTA 3 mM, TEPA 1,5

mM e Tris 15 mM, pH =

8,4

YING & KAP (2003)

1.1.11 Cromatografia eletrocinética micelar (MECC ou MEKC)

A limitação primária da eletroforese capilar em solução livre é a impossibilidade

de separar espécies neutras a menos que existam diferenças significativas de massa

molar. Geralmente, as espécies neutras migram no capilar por ação exclusiva do EOF,

não havendo discriminação espacial e/ou temporal dos solutos na chegada ao detector

(TAVARES, 1997). No entanto, Terabe e colaboradores introduziram uma versão

modificada da eletroforese capilar, a eletrocromatografia micelar ou cromatografia

eletrocinética micelar (MECC). Nesta técnica, adicionam-se agentes tensoativos ao

eletrólito de corrida, em condições adequadas para a formação de micelas, formando

assim um sistema cromatográfico de duas fases. O eletrólito representa a fase primária,

a qual é transportada eletroosmoticamente sob ação do campo elétrico, enquanto que as

micelas representam a fase secundária, ou pseudo-estacionária, a qual é transportada por

uma combinação de eletroforese e eletroosmose. A partição diferenciada de solutos

39

neutros entre estas duas fases é responsável pela seletividade da separação. A adição de

um complexante auxiliar minimiza os problemas de co-eluição em MECC (TAVARES,

1997; TERABE et all., 1984).

1.1.11.1 Micelas.

As micelas são agregados anfifílicos (compostos que se caracterizam por possuir

em sua estrutura uma região polar iônica ou não, e uma região apolar a qual pode ser

representada por uma ou mais cadeias hidrocarbônicas), conhecidos como agentes

tensoativos. Essas substâncias são moléculas de cadeia longa (10 – 50 unidades de

carbono) e se caracterizam por ter uma cauda hidrofóbica longa e um grupo hidrófilo na

cabeça. As micelas normais são formadas em solução aquosa com a cauda hidrofóbica,

com a cauda apontando para dentro e a cabeça hidrófila apontando para fora da solução

aquosa. Um desenho esquemático é mostrado na Figura 9. As micelas são formadas

como uma conseqüência do efeito hidrofóbico, isto é, elas se formam para reduzir a

energia livre do sistema. A cauda hidrofóbica do tensoativo não pode ser solvatada em

solução aquosa. Acima da concentração do tensoativo conhecida como concentração

micelar crítica (CMC), o agregado está completamente formado. Mudanças físicas na

tensão da superfície, viscosidade e na capacidade de espalhamento de luz acompanham

a formação da micela. Micelas reversas, que se formam em solventes orgânicos, ainda

não foram estudadas em MECC (BAKER, 1995).

Figura 9. Cromatografia eletrocinética micelar

40

Existem quatro tipos importantes de agentes tensoativos: aniônico, catiônico,

anfotérico e neutro. Na Tabela 4 são mostrados alguns exemplos destes tipos de

substâncias e alguns tipos de agentes tensoativos empregados. Destes tipos, os dois

primeiro dois são mais úteis em MECC. Os agentes tensoativos sintéticos e naturais têm

sido empregados em MECC. Dentre os tensoativos sintéticos, destacam-se o SDS e o

CTAB na cromatografia eletrocinética micelar (MECC).

Tabela 4 – Tipos e propriedades dos agentes tensoativos (BAKER, 1995) Tensoativo Tipo CMC (mol/L) Agregação

SDS(1) Aniônico 8,1 x 10-3 62

CTAB(2) Catiônico 9,2 x 10-4 170

Brj-35(3) Neutro 1,0 x 10-4 40

Sulfobetaína(4) Anfotérico 3,3 x 10-3 55

Obs. (1) SDS = dodecil sulfato de sódio; (2) CTAB = brometo de cetiltrimetil amônio; (3)

Brj-35 = éter de polioxietileno-23-laurila; (4) Sulfobetaína = ácido N-dodecil-N,N-

dimetilamônio-3-propano-1-sulfônico.

O SDS é um tensoativo extensamente usado em MECC. Encontra-se disponível

no mercado e tem preço relativamente baixo. Sua massa molar é igual a 288 g/mol, a

concentração molar crítica é aproximadamente 8 mM e seu número de agregação é 62

(número de moléculas/micela). As micelas têm a capacidade de organizar os analitos,

em nível molecular, em virtude das interações hidrofóbicas e eletrostáticas. Mesmo as

moléculas neutras podem se ligar às micelas, pois estas micelas possuem um alta

capacidade de solubilização. Soluções de agentes tensoativos têm sido empregadas em

espectroscopia e cromatografia em virtude das propriedades micelares. Por exemplo, a

fosforescência à temperatura ambiente é facilmente observável em meio micelar, pois

reduz o mecanismo de supressão fosforescente. Mais especificamente relacionado à

MECC, estas soluções de tensoativos podem servir como modificadores da fase móvel.

Estes modificadores de fase móvel da MECC assemelham-se àqueles empregados na

cromatografia líquida de fase reversa, pois um incremento na concentração do

tensoativo provoca um aumento na capacidade de eluição da fase móvel. O analito é

particionado entre a micela e a fase móvel (meio da solução), ou entre a micela e a fase

estacionária ou entre a fase móvel (meio da solução) e a fase estacionária. Deste modo,

41

a pseudo-fase ou LC micelar é um equilíbrio mais complexo que a LC convencional.

Em muitos aspectos, este equilíbrio de três fases pode ser comparado ao da

cromatografia líquida de troca iônica. O mecanismo da MECC, por causa de um

equilíbrio de duas fases, é mais simples que o da cromatografia micelar. O fator que

dificulta a MECC é a mobilidade eletroforética do analito que contribui fortemente para

a separação global (BAKER, 1995).

1.1.11.2 Mecanismo de separação

Em pH neutro ou alcalino, o EOF tem um movimento forte na direção do

cátodo. Se o SDS for empregado como tensoativo, a migração eletroforética da micela

aniônica é na direção do ânodo (Figura 9). Como resultado global, a velocidade de

migração da micela é menor que a velocidade de migração do solvente. Quando um

analito sem carga está no meio da fase móvel, sua velocidade de migração é igual ao do

EOF. Portanto, quando um analito tem uma grande afinidade com a micela, sua

velocidade de migração é inferior à do analito que se encontra no meio da fase móvel.

Examinando-se as Equações (14 e 15) que descrevem os fundamentos da MECC,

observe que k´ (fator de capacidade) e Rs (resolução) são formas simplificadas da

cromatografia líquida para uma concentração micelar tendendo ao infinito. A MECC é

um processo cromatográfico ou pseudo-cromatográfico.

−

−=

m

R

R

t

tt

ttk

1

´

0

0

(14)

+

−

+

−=

1

0

0

2

2

1

1

1

1

4

kt

t

t

t

k

kNR

mc

m

s αα

(15)

Agentes tensoativos catiônicos e aniônicos podem ser empregados em MECC.

Quando se usa o primeiro tipo, o EOF é invertido, portanto a polaridade do eletrodo

deve ser invertida para se detectar o analito.

42

1.1.11.3 Ordem de migração

Quando se empregam micelas de SDS, a ordem de migração deve ser: ânions,

espécies neutras e cátions. Os ânions levam mais tempo no meio da solução devido a

repulsão eletrostática da micela. Quanto maior for a carga iônica, mais rápida será a

eluição. As espécies neutras são separadas exclusivamente pelo caráter hidrofílico. Os

cátions são eluídos posteriormente devido a forte atração eletrostática através da

formação de pares iônicos com a micela. Apesar disto ser uma generalização útil, a forte

interação hidrofóbica pode superar as atrações e repulsões eletrostáticas. De forma

similar, a migração eletroforética do analito pode afetar a ordem de eluição. A

separação de espécies neutras é um exemplo de aplicações da técnica de MECC

(BAKER, 1995).

1.1.11.4 Uso de modificadores orgânicos.

Enquanto modificadores orgânicos foram usados livremente nas separações para

superar problemas de solubilidade, seu uso em MECC deve ser investigado com

profundidade, pois o modificador orgânico reduz EOF e aumenta a capacidade de

separação dos picos devido a maior diferença entre to e tmc. O papel mais importante do

modificador é o impacto no coeficiente de partição de soluto entre a micela e o meio da

fase móvel. De forma clara, o modificador torna o meio da fase móvel favorável para

analitos hidrofóbicos. Sem o modificador, o soluto hidrofóbico elui em um tempo igual

ou próximo a tmc. A adição do modificador geralmente aumenta a velocidade de

migração de espécies hidrofóbicas, pois elas ficam mais tempo no meio da fase móvel.

Muitos modificadores orgânicos são úteis em MECC. Metanol e acetonitrila são os

modificadores mais empregados em concentrações de 5 – 25%. Metanol e outros

álcoois tendem a apresentar um EOF mais lento que a acetonitrila. Para certas

separações, solventes apróticos como tetrahidrofurano (THF), sulfóxido de dimetila

(DMSO) e dimetilformamida (DMF) podem ser úteis. O DMF é um bom solvente para

MECC, porque seu ponto de ebulição é alto, assim minimizando emissão de vapor do

solvente, um problema comum quando temperaturas elevadas são empregadas. A

porcentagem do modificador orgânico é limitada pelo efeito do solvente no número de

agregação e o número de ionização da micela (BAKER, 1995).

43

1.1.11.5 Aplicações da MECC

A Tabela 5 apresenta algumas aplicações da MECC e demonstra a enorme

capacidade desta técnica na resolução de problemas de separação e quantificação

envolvendo espécies neutras.

Tabela 5 – Aplicações da cromatografia eletrocinética micelar (MECC)

Analito Tampão Referência

Vitaminas Borato 50 mM, NaCl 20

mM e SDS 50 mM, pH =

9,1

Applied Biosystems Divison, Perkin-

Elmer, Application note CEPH14

Corticoesteróides Borato 100 mM, Sal de

bile (colato) 100 mM, pH =

8,45

WEINBERGER (1993)

Pesticidas Fosfato 12 mM, Borato 8


8,9

HEIGER,HEROLD, GRIMM.

(1994)

Hidrocarbonetos

aromáticos policíclicos

(HPA)

Borato 100 mM, Uréia 20

mM, γ-Ciclodextrina 20


9

TERABE, MIYASHITA, ISHIHAMA,

et al. (1993)

1.1.12 Seleção do tipo de eletroforese capilar

A Tabela 6 pode auxiliar na seleção do modo de eletroforese capilar como uma

etapa de partida no desenvolvimento de um método.

Tabela 6 – Seleção do modo de eletroforese capilar

Íons pequenos

Moléculas pequenas

Peptídeos Proteínas Oligonucleotídeos DNA

CZE MEKC CZE CZE CGE CGE CITP CZE MECC CGE MECC CITP CIEF CIEF CGE CITP CITP

44

1.2 Métodos de determinação de ácido acetilsalicílico (AAS)

O ácido acetilsalicílico foi sintetizado pela primeira vez em 1893, a partir do

ácido salicílico, um analgésico extraído da casca do salgueiro, pelo químico alemão

Felix Hoffman que buscava um remédio alternativo para seu pai que sofria de

reumatismo (LUCAS, 2000).

Quando Hoffman iniciou suas pesquisas, já era conhecido que o princípio ativo

das folhas do salgueiro era a salicina, a qual ao entrar no corpo humano converte-se no

ácido salicílico. O problema em questão era a minimização dos efeitos colaterais

causados por este ácido, inicialmente usado para aliviar dores e edemas de doenças

como artrite. Um dos efeitos indesejáveis eram as dores estomacais, podendo inclusive

ocorrer sangramentos no trato digestivo (LUCAS, 2000).

Pensando nisso, Hoffman buscou uma maneira de contornar esse problema

utilizando uma substância capaz de inibir a ação do ácido salicílico e descobriu que o

grupo acetil anulava um sítio ácido, convertendo-o em ácido acetilsalicílico (AAS)

(LUCAS, 2000).

O ácido acetilsalicílico (AAS) pertence à classe das drogas anti-inflamatórias

não esteroidais. O AAS é uma droga valiosa no tratamento da dor, inflamação e febre.

Dentre os NSAIDs, o ácido acetilsalicílico é a droga mais largamente empregada, em

função do custo, ampla disponibilidade e por ser a mais indicada para dores de cabeça e

resfriados comuns (KARIM et all., 2006).

Os métodos de determinação do ácido acetilsalicílico (AAS) podem ser

classificados em: métodos óticos (RAMOS MARTOS et all., 2001; JOVICIC et all,

1995; ǗSTǗN et all., 1992); métodos cromatográficos (BLONDINO & BYRON,

1995; SHERMA et all., 1985; ALTUN et all., 2001; DI PIETRA et all., 1996; RAMOS

MARTOS et all., 2001) e métodos eletroforéticos (ALTRIA et all., 1998; MARDONES

et all., 2001).

1.3 Métodos de determinação do paracetamol (PAR)

Paracetamol (PAR) é uma amida aromática acilada, que inicialmente foi

introduzida na medicina como antipirético/analgésico em 1948. Ela tem sido usada

como analgésico na medicação caseira por mais de 30 anos, sendo aceita como uma

droga eficiente no tratamento das dores e febre em adultos e crianças. Ela é a segunda

droga mais usada como uma alternativa a aspirina e a fenacetina. PAR é conhecida

como acetaminofen (N-acetil-p-aminofenol, 4-acetamidofenol); ela é o princípio ativo

45

de inúmeros fármacos usados nas prescrições para gripes e resfriados, e como

analgésicos. Esta droga é excepcionalmente segura nas doses recomendadas, mas em

função de sua grande disponibilidade casos de doses excessivas, acidentais ou

deliberadas são comuns. PAR diferentemente da aspirina e do ibuprofeno não tem

propriedades anti-inflamatórias. Em doses normais, o PAR não irrita as paredes do

estômago, não afeta a coagulação do sangue ou ataca os rins (ESPINOSA BOSCH, M.

et al., 2006).

No entanto, estudos recentes mostram que o PAR está associado com a toxidez

hepática e falha renal apesar do seu caráter aparentemente inócuo. A toxidez hepática

inicia-se com níveis no plasma sangüíneo de 120 µg/L após 4 horas de ingestão,

levando-se a um dano agudo se o nível atingir 200 µg/L após o mesmo período de

ingestão. Em doses terapêuticas normais, o PAR é metabolisado muito rapidamente e

produz metabólitos inativos que são eliminados na urina. Se o PAR for administrado em

altas doses, ele produz uma acumulação de metabólitos tóxicos que causam a falência

hepática, este fato é freqüente na Europa e nos Estados Unidos da América (ESPINOSA

BOSCH, M. et al., 2006).

Diversos métodos têm sido utilizados na determinação de paracetamol quer seja

na forma pura, em formulação ou em combinação com outras substâncias. De acordo

com os trabalhos publicados na literatura podemos classificá-los em quatro principais

categorias: (1) métodos óticos (British Pharmacopoeia, 1998; European Pharmacopoeia,

1997; United States Pharmacopeia, 2000) (2) métodos eletroanalíticos (ALKAYER et

al. 1981; WALASH et all. 1994; NAVARRO et all. 1988; CRUZ VIEIRA et all. 2003;

LAU et all. 1989; CHRISTIE et all. 1993); (3) métodos cromatográficos (MAMOLO et

all. 1985; SISCO et all. 1986; RAVISANKAR et all. 1998; PATIL et all,. 1999); (4)

métodos eletroforéticos (STEINMANN & THORMANN, 1996; KUNKEL et all., 1997;

BOHNENSTENGEL et all. 1999; SCHEWITZ & LINDON, 1998; HEITMEIER &

BLASCHKE, 1999; ZHANG et all., 2000).

1.4 Métodos de determinação de ácidos orgânicos

Os ácidos orgânicos de cadeia curta pequena são metabólitos intermediários ou

finais de vários ciclos bioquímicos de organismos vivos, tais como o ciclo do ácido

cítrico, a fermentação dos polissacarídeos, a oxidação do etanol, assim como produtos

de certas indústrias e sua medida pode servir de subsídio de um indicador da extensão

de inúmeros processos e controle da qualidade. Em outras palavras, os ácidos orgânicos

46

de cadeia curta são intermediários ou produtos finais de processos metabólitos de

degradação de aminoácidos, de lipídeos e polissacarídeos (LEHOTAY, 1991). Diversas

doenças em seres humanos, especialmente aquelas relacionadas com as desordens

metabólicas podem levar à acumulação destes componentes nos fluidos corporais, os

quais incluem os esteróides, os polissacarídeos, os aminoácidos, as bases como purina e

pirimidinas, e ácidos orgânicos (PRESTO ELGSTOEN et all. 2001). Nas desordens

metabólicas, a identificação e quantificação deste metabólitos combinadas com a

informação clínica podem auxiliar no diagnóstico da doença. Os ácidos orgânicos têm

sido determinados em urina e no soro sangüíneo para o diagnóstico de um distúrbio no

metabolismo conhecido como acidúria orgânica. Doenças no sistema nervoso central e

outras patologias como neuroblastoma estão relacionadas com o aumento de ácidos

orgânicos nos fluídos corporais (GALLI et all. 2003).

Os métodos usuais para a determinação de ácidos orgânicos incluem a

cromatografia capilar em fase gasosa com ou sem a espectrometria de massas, após a

extração com solvente e derivatização. GC-MS tem sido usada como técnica de rotina

na determinação destes analitos em pacientes com desordens metabólitas. Apesar de sua

inquestionável sensibilidade, seletividade e capacidade de identificação, a GC-MS

apresenta duas grandes desvantagens: o longo tempo de preparação da amostra e a

necessidade de pessoal altamente especializado (SEYMOUR et all. 1997).

Outras técnicas de análise de rotina dos ácidos orgânicos de cadeia curta é a

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Os ácidos orgânicos têm sido

analisados por esta técnica sem derivatização ou com derivatização em fase reversa. A

cromatografia líquida de troca iônica com detector de condutividade é uma técnica

estabelecida para a determinação destes componentes em várias matrizes. No entanto,

em muitos casos torna-se necessário a preparação da amostra e certos ácidos

carboxílicos podem ser co-eluídos (GALLI et all. 2003).

Entretanto, existe uma diferença considerável entre as matrizes biológicas e as

de águas fortemente salinas em virtude do seu alto teor de salinidade e os níveis

díspares entre os íons cloreto, sódio, etc. e os componentes menores. Por exemplo, na

água do mar a concentração de cloreto é aproximadamente 0,5 mol/L, o que significa

que este teor é, no mínimo, mil vezes superior aos dos componentes menores

(TIMERBAEV & FUKUSHI, 2003). Portanto, o desenvolvimento de um método

analítico rápido e robusto para a quantificação de ácidos orgânicos de cadeia curta em

amostras fortemente salinas tornou-se uma tarefa de rara complexidade analítica.

47

1.5 Validação de métodos analíticos univariados

Os resultados analíticos dependem fundamentalmente de dois parâmetros: a

qualidade das medidas instrumentais e a confiabilidade estatística dos cálculos

envolvidos no seu processamento. Para assegurar a aplicabilidade e o alcance de um

método estabelecem-se os limites destes parâmetros através da estimativa das figuras de

mérito, numa etapa denominada de validação.

As figuras de mérito representam os indicadores quantitativos do escopo e do

bom desempenho das técnicas, e são descritas na literatura como: seletividade, ajuste da

curva analítica e determinação da sua faixa de linearidade, sensibilidade do método,

representada pelos limites de detecção (LD) e quantificação (LQ), precisão, exatidão e

robustez (ANVISA, 2003; ICH, 1995; ICH 1996; Danzer, K.; Currie, L. A., 1998;

INMETRO, 2003)..

A estimativa destes parâmetros pode variar de acordo com a técnica analítica

empregada, ou com o protocolo de validação a ser seguido. Com a finalidade de

padronizar estes procedimentos, a IUPAC (“International Union of Pure and Applied

Chemistry”) publicou no final da década de 90 um guia para calibração em Química

Analítica. Em 1990, as agências de regulamentação dos Estados Unidos (“Food and

Drug Agency”), Japão (“Ministry of Health, Labour and Welfare”) e União Européia

(“European Medicine Agency”) passaram a organizar a Conferência Internacional sobre

Harmonização (“International Conference on Harmonisation”), para estabelecer padrões

para os procedimentos de pesquisa e desenvolvimento na área de fármacos. Para isto, o

ICH elaborou um guia sobre validação de métodos que tem sido utilizado também em

outras áreas de estudo além da farmacêutica. Na área de Química Ambiental, os

métodos padrões para análise de contaminantes publicados pela Agência de Proteção

Ambiental Americana (“Environmental Protection Agency”) contêm orientações a

respeito da validação destes métodos. No Brasil, os dois órgãos que regulamentam a

validação de métodos analíticos são: a Agência Nacional de Vigilância Sanitária

(ANVISA) e o Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade

Instrumental (INMETRO).

Validar um método é um procedimento lento, pois requer um grande número de

experimentos analíticos e cálculos estatísticos. Estabelecer um procedimento de

validação requer um compromisso entre validar rápido, e com um número adequado de

análises, sem perder a qualidade das estimativas, o que é um desafio na rotina de um

48

laboratório devido às restrições de tempo, custo e potencial instrumental (RIBEIRO et

all. 2008).

1.5.1 Linearidade: o ajuste da curva de calibração

A linearidade de um método expressa a faixa na qual o sinal analítico,

denominado variável dependente yi, é linearmente proporcional à sua concentração,

denominada variável independente xi, e a equação matemática que descreve esta

dependência é conhecida como curva analítica ou curva de calibração. O ajuste do

modelo é feito pelo método dos mínimos quadrados, no qual a melhor curva será aquela

que fornecerá o menor valor para a soma quadrática dos resíduos (Q) obtidos entre o

sinal analítico medido (yi) e o sinal analítico predito, para um conjunto de N pontos

experimentais (CUSTÓDIO et all., 1997; DRAPER & SMITH, 1981). O ajuste da curva

pelo método dos quadrados mínimos fornecerá os regressores, que no caso de um ajuste

linear (yi = a0 + a1xi) são os coeficientes linear ( xaya 10 −= ) e angular

( ( )( )[ ] ( )∑ ∑ −−−= 21 / xxyyxxa iii ), em que x é o valor médio ( ∑

=

=n

i

i

N

xx

1

) da

concentração (xi) para o número total de amostras (N) utilizadas como padrões de

calibração.

A análise do gráfico dos resíduos permitirá detectar problemas no ajuste da

curva como, por exemplo, desvios da linearidade, presença de amostras atípicas,

heterocedasticidade e dependência entre os erros. Uma curva bem ajustada deverá

apresentar erros com distribuição uniforme, média zero e variância constante

(homocedasticidade), e ausência de amostras atípicas (DANKER & CURRIE, 1998;

PIMENTEL & BARROS NETO, 1996; MILLER, 1991).

1.5.1.1 A qualidade do ajuste da curva de calibração

O método mais empregado para se avaliar numericamente a qualidade do ajuste

de um modelo é a ANOVA (Análise da Variância). Inicialmente deve-se fazer uma

decomposição algébrica dos desvios das respostas observadas em relação à resposta

média global representado pela equação

( ) ( ) ( )iiii yyyyyy ˆˆˆ −+−=− (16)

onde a primeira parcela representa o desvio da precisão em relação à média global. A

segunda parcela é a diferença entre o valor observado e o valor predito. Elevando-se a

49

expressão ao quadrado e fazendo-se o somatório de todos os pontos obtém-se a soma

quadrática SQT.

22 )]ˆ()ˆ[()( iiii yyyyyy −+−=− ∑∑ (17)

222 )ˆ()ˆ)(ˆ(2)ˆ()( iiiiiii yyyyyyyyyy −+−−+−=− ∑∑∑∑ (18)

Do lado direito temos as somas quadráticas da regressão e dos resíduos, pois o

somatório dos termos cruzados se anula, com isso pode-se escrever a seguinte equação:

222 )ˆ()ˆ()( iiii yyyyyy −+−=− ∑∑∑ (19)

A equação (19) pode ser reescrita de uma forma mais simples, como mostrado

abaixo:

SQTotal = SQRegressão + SQresíduos (20)

A montagem da tabela da ANOVA é sumarizada a seguir:

Modelo Soma

Quadrática

Graus de

liberdade

Média

Quadrática

Teste F

Regressão SQRegressão p - 1 MQRegressão =

SQReg./(p – 1)

F =

MQReg/MQres

Resíduos SQresíduos n - p MQresíduos =

SQresíduos/(n –

p)

Total SQTotal n-1

onde n é o número de soluções padrão e p é o número de regressores ou de parâmetros

da curva de calibração. No caso de uma equação linear, o valor de p = 2 (coeficientes

linear e angular). A análise da variância (ANOVA) foi realizada para se testar a

significância da regressão utilizando o teste F e comparando-se o valor obtido com o

valor de Fcrítico.

1.5.2 Teste de linearidade

As fontes de variação são caracterizadas pela soma quadrática dos resíduos e o

melhor modelo de regressão será aquele que minimiza esta soma quadrática. O teste de

linearidade proposto é feito pela comparação dos resíduos do ajuste linear

50

( xaay 10ˆ += ) e do ajuste quadrático ( 2210ˆ xaxaay ++= ) utilizando-se um teste F de

significância.

Esta comparação é feita estimando-se as somas quadráticas dos resíduos no sinal

analítico a partir dos desvios padrões obtidos em cada ajuste. Considerando-se que o

desvio padrão do modelo linear (Sy1) e o desvio padrão do modelo quadrático (Sy2) são

dados pelas equações abaixo:

( )2

ˆ 2

1 −

−= ∑

N

yyS

ii

y ( )

3

ˆ 2

2 −

−= ∑

N

yyS

ii

y

A partir destes desvios estima-se a diferença entre as somas quadráticas dos dois

ajustes (∆S2), em que N é o número de padrões de calibração utilizados na construção da

curva e estima-se a significância desta diferença em relação à 22yS com o auxílio do

teste F:

( ) ( ) 22

21

2 32 yy SNSNS −−−=∆ 3,122

2

−≤∆

n

y

FS

S (21)

Portanto, se a razão 3,122

2 )( −≤∆ ny FSS , o ajuste linear é o mais adequado ou se

3,122

2 )( −>∆ ny FSS , considera-se que o ajuste quadrático é o mais apropriado (FUNK et

all., 1985).

1.5.3 Sensibilidade do método: o limite de detecção e o limite de quantificação

A sensibilidade de um método é definida pelos limites de detecção (LD) e de

quantificação (LQ). O limite de detecção é a menor concentração da espécie de interesse

que pode ser detectada pela técnica instrumental, enquanto que o limite de quantificação

é a mais baixa concentração do analito que pode ser quantificada dentro dos limites de

precisão e exatidão do método durante as operações de rotina do laboratório (ANVISA,

2003). Há três formas de estimar os limites de detecção e quantificação, e a escolha de

uma delas deve levar em consideração a técnica analítica utilizada e o grau de

confiabilidade estatística necessária: método visual, método da razão sinal-ruído, e

método baseado em parâmetros da curva analítica (ICH, 1996; DANKER & CURRIE,

1998).

1.5.3.1 Limite de detecção: método visual

Nesse método, realiza-se a análise de amostras contendo baixas concentrações

conhecidas da espécie de interesse. Considera-se o LD como sendo a menor

51

concentração que pode ser detectada e que seja diferente do sinal analítico do ruído

(ICH, 1996).

1.5.3.2 Limite de detecção: método da razão sinal-ruído

Este método pode ser aplicado em metodologias analíticas que apresentam ruído

da linha de base e é estimado a partir da comparação do sinal analítico obtido para uma

amostra contendo baixas concentrações da espécie de interesse com o sinal de uma

amostra do branco. Considera-se aceitável uma relação sinal-ruído de 3:1 (ICH, 1995).

1.5.3.3 Limite de detecção: método baseado em parâmetros da curva analítica

Os métodos descritos anteriormente são muito utilizados pela sua rapidez, mas

apresentam como desvantagem o fato de se basearem em parâmetros qualitativos. O

método de estimativa do limite de detecção baseando-se em parâmetros da curva

analítica apresenta maior confiabilidade estatística, pois leva em consideração o

intervalo de confiança da regressão. O LD neste caso é definido como a concentração

mínima que pode ser medida e informada com 99% ou 95% de confiança (ICH, 1996;

BACCAN et all., 1998). No entanto, devido à complexidade dos cálculos envolvidos

nesta estimativa, este método tem sido menos utilizado que os anteriores.

A estimativa do sinal analítico a partir da equação de regressão apresenta um

erro padrão, e o produto deste erro pelo valor apropriado de t da distribuição de Student

permite calcular o intervalo de confiança da curva analítica que tem a forma de duas

curvas hiperbólicas ao redor da curva. O intercepto do limite superior do intervalo de

confiança é conhecido como y crítico (yc) e a sua projeção no limite inferior é uma

estimativa da concentração mínima que pode ser medida com um grau de confiança

comprovado estatisticamente, ou seja, o limite de detecção do método (LD). As

equações, abaixo relacionadas, descrevem o yc e o LD (ICH, 1996; DANKER &

CURRIE, 1998; FUNK et all., 1985).

( )∑=

−++

+=n

i

i

yc

xx

x

Ntsay

1

2

2

0 11

(22)

( )

( )∑=

−

−++

=n

i

i

cy

xxa

yy

Na

tsLD

1

221

2

1

11

2 (23)

52

1.5.4.1 Limite de quantificação: método visual

O LQ é determinado pela análise de amostra com concentrações conhecidas da

espécie de interesse, e corresponde à menor concentração que pode ser quantificada

dentro dos limites de exatidão e precisão do método (ANVISA, 2003; ICH, 1996).

1.5.4.2 Limite de quantificação: método da razão sinal-ruído

Este método pode ser aplicado em metodologias analíticas que apresentam ruído

da linha de base e é estimado a partir da comparação do sinal analítico obtido para uma

amostra contendo baixas concentrações da espécie de interesse com o sinal de uma

amostra do branco e estabelecendo a concentração mínima em que a espécie de

interesse pode ser quantificada com confiabilidade. Considera-se aceitável uma relação

sinal-ruído de 10:1 (ICH, 1995; ICH, 1996).

1.5.4.3 Limite de quantificação: método baseado em parâmetros da curva analítica

O LQ é calculado a partir do intervalo de confiança da curva analítica e sua

estimativa pode ser obtida no ponto em que xc é o valor da concentração (x) no ponto

em que o valor de a0 intercepta a reta de regressão, e yh é o valor de y para a projeção de

xc no limite de controle superior. As estimativas de yh, xc e LQ podem ser realizadas pela

utilização das equações abaixo.

( )

( )∑=

−

−++

+=n

i

i

c

yh

xx

xx

Ntsay

1

2

2

0 11

2 (24)

( )∑=

−++

=

n

i

i

y

c

xx

x

Na

tsx

1

2

2

1

11

(25)

( )

( )∑ −

−++

+

−=

221

2

11

0 11

xxa

yy

Na

ts

a

ayLQ

i

hyh (26)

1.5.5 Precisão

A precisão fornece a dispersão dos valores medidos em torno de um valor médio

e seu valor numérico é estimado pelo desvio padrão relativo, DPR, para análises de

amostras contendo a mesma quantidade das espécies de interesse (ANVISA 2003; ICH

53

1995; ICH 1996). O DPR é ainda conhecido como coeficiente de variação (CV) e seu

cálculo é descrito pela equação abaixo:

( )

11

2

−

−=∑=

N

xx

s

n

i

i

x

sDPR

100=

onde s é o desvio padrão, x é o valor médio e N é o número total de medidas.

A precisão pode ser estimada em três níveis: repetibilidade, precisão

intermediária e reprodutibilidade. O termo repetibilidade ou precisão intra-corridas

define a precisão dos resultados obtidos dentro do próprio laboratório, por um mesmo

analista e com a mesma instrumentação (RIBEIRO et all., 2008). O guia ICH

recomenda que sejam realizadas nove determinações contemplando toda a faixa de

calibração, ou seja, três concentrações (baixa, média e alta) com amostras em triplicata,

ou um mínimo de seis determinações em amostras contendo uma concentração

equivalente à média da faixa de calibração (ICH 1996). A resolução 899 da ANVISA

segue o guia ICH e determina que sejam realizadas nove determinações contemplando

toda a faixa de calibração (ANVISA 2003). O INMETRO recomenda que sejam

realizadas de sete a nove replicatas para o cálculo do DPR (INMETRO 2003).

Deve-se ressaltar que o termo utilizado em inglês é “repeatability”. No Brasil, o

INMETRO adota o termo repetitividade e a ANVISA adota o termo repetibilidade.

A precisão intermediária define a precisão dentro de um mesmo laboratório para

medidas obtidas por analistas diferentes, ou em dias diferentes, ou por equipamentos

diferentes. A ANVISA recomenda um mínimo de dois dias distintos com analistas

diferentes e o ICH incentiva o uso de técnicas de planejamento fatorial para este teste

(ICH 1995; ICH 1996).

A reprodutibilidade define a precisão dos resultados obtidos para uma

determinada análise realizada por laboratórios diferentes, mas seguindo a mesma

metodologia (ANVISA 2003, INMETRO 2003).

1.5.6 Exatidão

A exatidão reflete a proximidade entre o valor medido e o valor de referência

considerado verdadeiro. Este termo está relacionado com o erro absoluto da medida e

pode ser estimado de duas formas: aplicando-se a metodologia proposta em uma

substância de pureza conhecida, como por exemplo, padrões certificados; ou pela

comparação com os resultados obtidos utilizando-se uma segunda metodologia, que seja

54

bem estabelecida e com exatidão e precisão conhecidas. A “Environmental Protection

Agency” recomenda que a exatidão seja fornecida como a diferença entre o valor

predito e o valor considerado verdadeiro, enquanto que a ANVISA recomenda que este

parâmetro seja estimado como a razão destas duas concentrações.

100xx

xxExatidão

v

vi

−= 100x

x

xExatidão

v

i

=

O guia ICH recomenda que a exatidão deverá ser estabelecida ao longo de toda a

faixa de calibração especificada para o procedimento analítico somente após a precisão

e a linearidade terem sido estimadas (ICH 1996). A ANVISA estabelece que a exatidão

deve ser verificada em três níveis de concentração, alta, intermediária e baixa, e no

mínimo com determinação em triplicata (ANVISA 2003).

1.5.7 Robustez

A robustez de um método é a sua capacidade de resistir a pequenas mudanças

dos parâmetros analíticos sem alterar de forma significativa sua exatidão e precisão,

sendo portanto uma medida da quantidade de variabilidade que o método pode suportar,

sem perder a confiabilidade, e sua estimativa depende do tipo de metodologia analítica

utilizada (ANVISA 2003; ICH 1996).

A robustez de um método pode ser estimada, variando-se os parâmetros

analíticos e comparando a precisão obtida em cada determinação. A ANVISA e o ICH

indicam uma lista de parâmetros a serem avaliados nos testes de robustez de

metodologias analíticas para as técnicas de preparo de amostras, espectrofotometria,

cromatografia líquida e cromatografia gasosa (ANVISA 2003). O INMETRO indica o

teste de Youden (INMETRO 2003).

1.6 Validação de métodos eletroforéticos para análise de produtos farmacêuticos

A eletroforese capilar tornou-se uma das técnicas mais avançadas para a análise

farmacêutica. Ela tem demonstrado ser uma técnica útil e uma alternativa confiável

quando comparada com a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) em várias

áreas incluindo na determinação dos componentes principais, das impurezas e mesmo

na separação de enantiômeros. A determinação dos resíduos nos processos de validação

de limpeza e nos testes de dissolução dos comprimidos por eletroforese capilar são as

outras áreas de interesse da indústria farmacêutica (FABRE & ALTRIA, 2001).

55

O principal avanço da eletroforese capilar foi o reconhecimento pelas agências

reguladoras. Uma monografia sobre eletroforese capilar foi incluída na farmacopéia

americana (USP, 2000), sendo também publicada nas farmacopéias européia

(PHARMACOPÉE EUROPÉENNE, 2001) e japonesa (JP FORUM 1999). A

eletroforese capilar surgiu na farmacopéia européia com a determinação das impurezas

do cloridrato de levocabastina e uma monografia da aplicação da eletroforese capilar na

análise da solução concentrada de eritropoietina foi apresentada na Pharmeuropa

(1999).

Neste item, serão enfatizados os principais parâmetros de mérito da validação

analítica dos métodos de análise de moléculas pequenas por eletroforese capilar no

contexto da indústria farmacêutica. O principal guia para a validação de métodos em

química analítica é o Eurachem Guide(1998), que discute quando e porque os métodos

analíticos devem ser validados. No entanto, na indústria farmacêutica a principal fonte

de referência é o International Conference on Harmonization (ICH) Guidelines (1996),

que fornece as recomendações para as várias características a serem testadas nos

procedimentos analíticos desenvolvidos nos laboratórios farmacêuticos, a saber: teste de

identificação, testes quantitativos para o controle da quiralidade e impurezas não-

quirais, ensaio para o componente principal de uma droga, ou produto retirado de uma

solução obtida em um banho para dissolução (FABRE & ALTRIA, 2001).

Nesta revisão serão examinadas as características específicas a serem testadas

(especifidade, linearidade, exatidão, precisão, estabilidade da solução, limites de

detecção e quantificação e robustez) e outros aspectos específicos que devem ser

considerados para a metodologia por eletroforese capilar.

1.6.1 Especificidade

A especificidade é descrito como a capacidade de um método analítico de

discriminar o analito de outras substâncias potencialmente interferentes. Este parâmetro

confirma que o sinal analítico medido é causado somente pelo analito (FABRE &

ALTRIA, 2001).

Para um teste de identificação, a especificidade é geralmente obtida

comparando-se a resposta de amostras de referência contendo somente o analito com a

resposta de amostras enriquecidas com substâncias potencialmente interferentes. È

possível também comparar os resultados obtidos por CE com aqueles obtidos por outros

56

métodos/técnicas independentes, preferencialmente naqueles baseados nos princípios de

separação diferentes (FABRE & ALTRIA, 2001).

1.6.2 Linearidade e faixa da curva analítica

A linearidade da resposta como uma função da concentração do analito deve ser

assegurada na faixa de interesse da determinação analítica. Para um princípio ativo em

uma formulação, a linearidade deve ser assegurada na faixa de 50 – 150%, 80 – 120%

ou ainda 60 – 140% da concentração do analito em questão (BENNANI & FABRE,

2001).

Para uma impureza, a linearidade deve ser testada na presença do principal

componente até o máximo do nível de tolerância da impureza (por exemplo, do limite

de quantificação até 200% do nível de tolerância máximo da impureza). Para os testes

de dissolução, a faixa deve cobrir ± 20% da faixa especificada para a batelada. A

linearidade, os resíduos do modelo e o coeficiente linear devem ser avaliados pela

análise da variância (ANOVA). Um gráfico dos resíduos versus valores preditos ou

valores experimentais pode indicar alguma curvatura do modelo, assim como a

tendência dos dados (BLANCHIN, M. D. et all, 2000).

Tipicamente, a linearidade é assegurada pela injeção de um mesmo volume de

soluções padrão com concentrações diferentes (usualmente cinco concentrações). A

faixa linear dos detectores de UV-Vis é mais restrita do que daqueles usados em HPLC

em função da geometria circular do tubo capilar, o que aumenta a quantidade de

radiação eletromagnética espalhada, entretanto a faixa linear é ainda suficientemente

extensa para muitas aplicações (FABRE & ALTRIA, 2001).

A resposta em CE é usualmente expressa em área do pico ao invés da altura do

pico, pois este último é afetado pela distorção que ocorre em concentrações elevadas do

analito. Adicionalmente, a área do pico pode ser corrigida dividindo-a pelo seu tempo

de migração respectivo, o que pode minimizar qualquer deriva do tempo de migração

(FABRE & ALTRIA, 2001).

1.6.3 Exatidão e estudo de recuperação

A exatidão expressa a proximidade entre o valor encontrado e o valor aceito

como referência. A exatidão mede os erros sistemáticos e aleatórios do procedimento

analítico, entretanto ela depende do número de determinações (FABRE & ALTRIA,

2001).

57

É muito comum quando se analisa uma formulação avaliar a exatidão com um

estudo de recuperação. Esse estudo é realizado enriquecendo-se um placebo com uma

quantidade conhecida do analito na faixa de interesse. A exatidão é útil nas medidas de

perdas causadas por ligação do soluto com os excipientes da formulação e da

solubilidade em concentrações elevadas. Os resultados são comparados com as

concentrações adicionadas e a recuperação é calculada, sendo expressa na forma

percentual (FABRE & ALTRIA, 2001).

A faixa de enriquecimento do analito pode ser, por exemplo, de 80 – 120%, de

50 – 150% ou 60 – 140% da concentração alvo e do limite de quantificação até 150%

ou 200% do nível máximo tolerado da impureza. Recomenda-se fazer três

determinações independentes com níveis distintos do analito (BENNANI & FABRE,

2001; FABRE et all., 1999).

A exatidão pode ser feita pela comparação dos resultados de um mesmo

conjunto de amostras testadas pelo método em validação com um método considerado

como referência. Quando possível, métodos com diferentes princípios de separação

devem ser usados na determinação deste parâmetro (FABRE & ALTRIA, 2001).

1.6.4 Precisão

A precisão expressa o grau de espalhamento das medidas e pode ser expressa de

três modos: repetibilidade, precisão intermediária e reprodutibilidade.

1.6.4.1 Repetibilidade

A repetibilidade refere-se à variabilidade das medidas quando o método é

realizado pelo mesmo analista, no mesmo equipamento durante um pequeno intervalo

de tempo. A repetibilidade de um sistema de eletroforese capilar deve ser assegurada em

um ou mais níveis de concentração do analito. Fatores importantes devem ser

considerados na otimização de um método analítico, mas o fato mais relevante consiste

no emprego do padrão interno para a redução da variabilidade. O desvio padrão relativo

do tempo de migração é inferior a 1% quando a composição do eletrólito e as etapas de

lavagens forem cuidadosamente otimizadas (FABRE & ALTRIA, 2001).

A repetibilidade do procedimento analítico deve ser realizada com

determinações independentes (n = 10) de amostras reais ou, no mínimo, com a

concentração alvo da determinação ou ainda em diferentes níveis do analito dependendo

do uso do método (BLANCHIN, M. D. et all, 2000).

58

1.6.4.2 Precisão intermediária

Esse parâmetro relaciona-se com a precisão quando um ou vários fatores são

mudados no método analítico dentro de um mesmo laboratório. Os fatores que podem

ser mudados incluem:

a) o tubo capilar: a separação pode ser repetida em tubos capilares de bateladas

diferentes e de fornecedores distintos em um mesmo dia;

b) o dia da medição: eletrólito recentemente preparado amostra e soluções padrão

devem ser avaliados nos diferentes dias de operação;

c) o analista: analistas diferentes devem preparar amostra e soluções padrão próprias e

devem ter seu tubo capilar e eletrólito de corrida.

d) as fontes dos reagentes (soluções padrão e eletrólito de corrida): é importante se

assegurar que o método desenvolvido possa ser transferido para outro equipamento

(transferência de calibração) (FABRE & ALTRIA, 2001).

Os fatores mudados devem ser analisados simultaneamente, isto é o estudo de

recuperação pode ser realizado em três dias diferentes por três analistas, onde cada um

prepara as soluções de forma independente. As variações entre os dias e os fornecedores

de consumíveis podem ser testadas juntas. A análise da variância (ANOVA) deve ser

usada para determinar se o fabricante ou a variabilidade entre os dias podem influenciar

no ensaio realizado (BENNANI & FABRE, 2001).

1.6.4.3 Reprodutibilidade

A reprodutibilidade refere-se à precisão inter-laboratorial e ocorre quando a

mesma amostra é analisada por diferentes laboratórios para fins de comparação, isto é

chamado de exercício inter-laboratorial. Ela é recomendada para os métodos oficiais

(FABRE & ALTRIA, 2001).

1.6.5 Estabilidade das soluções

Esse critério não está listado no ICH Guidelines (1996), mas ele é incluído nos

testes de robustez. É importante notificar no protocolo de operação (POP) o tempo de

vida útil da solução. É de grande interesse na eletroforese capilar testar a estabilidade da

solução do eletrólito, pois diferentemente da HPLC onde um grande volume de solução

da fase móvel é preparado diariamente, na CE ocorre um pequeno consumo de solução

do eletrólito, cerca de 10 – 20 mL/dia. Entretanto, o tempo de vida útil da solução do

59

eletrólito é muito variável, por exemplo, uma solução tampão de fosfato pode ser

armazenada em recipiente plástico por, no mínimo, três meses, enquanto que o eletrólito

de cromato e bromato de tetradeciltrimetilamônio usados na determinações de ânions

devem ser preparados diariamente (ALTRIA & BRYANT, 1997).

1.6.6 Robustez

A robustez está relacionada com a capacidade do método de permanecer

inalterado quando pequenas variações são introduzidas de forma deliberada nos

parâmetros de análise. A robustez não está listada no ICH Guidelines (1996) como um

critério de validação analítica, no entanto é mencionado que ele deve ser testado no

desenvolvimento de um método analítico para demonstrar a confiabilidade/durabilidade

do método. A robustez testada na eletroforese capilar é feita de forma a detectar os

fatores que podem influenciar o ensaio, a sensibilidade ou a seletividade.

Os fatores mais importantes que devem ser investigados na eletroforese capilar

com detecção UV/Vis são: a composição do eletrólito, o volume injetado, o

comprimento de onda de detecção, a temperatura de separação, o tempo de lavagem,

etc. Esses fatores são estudados próximos aos valores otimizados para o método e

devem refletir as modificações em diferentes ambientes. O planejamento fatorial

fracionário ou o planejamento Plackett-Burmann podem ser usados na identificação dos

fatores mais críticos do método (FABRE & MESPLET, 2000).

1.6.7 Limites de detecção e quantificação

O limite de detecção (LD) corresponde a mais baixa concentração ou quantidade

do analito que pode ser detectada pelo método. O limite de quantificação (LQ)

corresponde a mais baixa concentração ou quantidade do analito que pode ser

determinada com exatidão e precisão adequadas (ALTRIA et all. 1998).

Existem duas abordagens para se avaliar LD e LQ. A mais largamente

empregada é baseada na razão sinal/ruído (S/N) obtida da amostra enriquecida com o

analito. Uma razão (S/N) igual a três é considerada, do ponto de vista estatístico,

aceitável para o LD. O LQ pode ser avaliado através de injeções sucessivas de uma

solução padrão no nível baixo de concentração (aquela que forneça uma razão S/N igual

a 10 pode ser útil). Baseando-se no desvio padrão relativo, o LQ é validado por análise

de réplicas autênticas (n ≥ 6) de amostras preparadas próximas a esta concentração. Um

60

erro relativo de ± 10% e uma repetibilidade próxima a 10% são aceitáveis para

concentrações próximas do LQ (FABRE & ALTRIA, 2001).

Na eletroforese capilar com detector UV/Vis, os LD e LQ são geralmente

superiores (em concentração) do que em HPLC em função do pequeno percurso ótico

(50 – 100 µm) usado na detecção e do reduzido volume injetado (2 – 20 nL). No

entanto, vários fatores podem ser otimizados para melhorar os limites de detecção e

quantificação:

a) o solvente da amostra: o uso de um solvente com baixa condutividade em relação ao

eletrólito produz um efeito de empacotamento e aumenta o sinal analítico;

b) o percurso ótico: o aumento do percurso ótico produz uma célula de alta

sensibilidade;

c) o diâmetro do capilar: aumentando-se o diâmetro do capilar resulta no aumento do

percurso ótico e do volume de amostra injetado provoca um incremento da intensidade

de corrente e do efeito Joule, o que causa um alargamento indesejável da banda

eletroforética;

d) o volume de injeção: aumentando-se o volume injetado de amostra resulta no

aumento do sinal analítico, mas pode haver um efeito deletério na resolução;

e) o comprimento de onda de detecção: a detecção em baixo comprimento de onda (λ ≤

200 nm) é muito comum em eletroforese capilar em virtude da transparência do

eletrólito, o que pode ser usada para melhorar o LD.

61

2. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

2.1 Instrumentação

Os experimentos foram realizados em um sistema de eletroforese capilar,

modelo Capel 105M, Lumex, Rússia com detector UV/Vis. Foram utilizados dois

cassetes contendo tubos capilares de sílica fundida com as seguintes dimensões: o

primeiro com 50 µm de diâmetro interno, 50 cm de de comprimento total e 40 cm de

comprimento efetivo, e o segundo com 75 µm de diâmetro interno, 60 cm de

comprimento total e 50 cm de comprimento efetivo. O instrumento é totalmente

controlado por um micro computador tipo IBM e opera com um software Elforun

desenvolvido pelo fabricante.

Antes de cada determinação, todas as soluções foram centrifugadas em tubos

Eppendorf, de 1,5 a 2 mL de capacidade, a 6000 rpm (Centrífuga MCD 2000, HT,

China) durante três minutos. Esse procedimento é necessário para evitar a formação de

microbolhas ou entupimento do tubo capilar, o que pode acarretar resultados erráticos

nas determinações.

Os valores dos pHs das soluções foram obtidos no medidor de pH, modelo 300,

Analyser, Brasil após calibração prévia do instrumento com soluções tamponadas em

pH = 4,0 e pH = 7,0. Esse acompanhamento é de extrema importância em virtude da

influência do pH da solução tampão na resposta da determinação eletroforética.

2.2 Soluções, reagentes e materiais

A pesagem dos sólidos foram realizadas em balança analítica elétrica, Bioprecisa

modelo FA2104 N, Itália, e a água (18 MΩ x cm) utilizada na preparação das soluções

foi destilada e purificada em um sistema de troca iônica e osmose reversa

(Ultrapurificador, modelo Master System, Gehaka, Brasil). Toda a vidraria e utensílios

laboratoriais foram imersos em solução de Extran neutro (Merck, Darmsdadt,

Alemanha) por, no mínimo, 24 horas, seguido da imersão em solução de HNO3 10% v/v

por igual período. Em seguida, todo o material foi lavado com água destilada e

deionizada, em abundância, seguido de secagem em estufa elétrica (Icamo, modelo 4

São Paulo, Brasil) a 600C.

Na preparação das soluções, quando necessário, utilizou-se uma placa de

aquecimento (Quimis Aparelhos Científicos, Brasil) e um aparelho de ultra-som

(Ultrasonic Cleaner, modelo Branson 200, Taiwan) na dissolução dos sólidos.

62

Todas as soluções foram filtradas com membrana de acetato de celulose (Toyo

Roshi Kaisha, Japão) com diâmetro de poro 0,2 µm e diâmetro externo de 25 mm.

2.2.1 Solução estoque de ácido acetilsalicílico 1000 mg/L

Pesou-se 100,0 mg do sólido acetilsalicílico (Merck, Darmstadt, Alemanha),

dissolveu-se em água e avolumou-se para 100 mL em balão volumétrico.

2.2.2 Solução estoque de paracetamol 1000 mg/L

Pesou-se 100,0 mg do sólido paracetamol (Merck, Darmstadt, Alemanha),

dissolveu-se em água e avolumou-se para 100 mL em balão volumétrico.

2.2.3 Solução estoque de ácido benzóico 500 mg/L

Pesou-se 50,0 mg do sólido benzóico (Merck, Darmstadt, Alemanha), dissolveu-

se em água e avolumou-se para 100 mL em balão volumétrico. Esta solução foi usada

como padrão interno na determinação dos fármacos.

2.2.4 Solução tampão de borato 25 mmol/L (pH = 9,20)

Pesou-se 95,3 mg do tetraborato de sódio decahidratado (Vetec Química Fina

Ltda. Rio de Janeiro, Brasil), dissolveu-se em água e avolumou-se para 10 mL em balão

volumétrico. Adicionou-se solução de HCl 0,1 mol/L ou NaOH 0,1 mol/L para ajuste

do pH quando necessário. Esta solução foi preparada diariamente.

2.2.5 Solução tampão de borato 50 mmol/L (pH = 9,20)

Pesou-se 190,6 mg do tetraborato de sódio decahidratado (Vetec Química Fina

Ltda. Rio de Janeiro, Brasil), dissolveu-se em água e avolumou-se para 10 mL em balão

volumétrico. Adicionou-se solução de HCl 0,1 mol/L ou NaOH 0,1 mol/L para ajuste

do pH quando necessário. Esta solução foi preparada diariamente.

2.2.6 Solução estoque de aspirina 5000 mg/L

Foram triturados quatro comprimidos de aspirina (AAS 500 mg, Bayer, Brasil) e

retirados uma massa equivalente a um comprimido para a preparação da solução

estoque. Dissolveu-se em água em seguida foram filtradas e avolumadas para 100 mL

em balão volumétrico. A trituração dos comprimidos foi realizada para homogeneizar o

processo de amostragem.

63

2.2.7 Solução estoque de paracetamol 7500 mg/L

Foram triturados quatro comprimidos de paracetamol (Tylenol 750 mg, Janssen-

Cilag Pharmaceutica, Brasil) e retirada a massa equivalente a um comprimido para a

preparação da solução estoque. Dissolveu-se em água e em seguida foram filtradas e

avolumadas para100 mL em balão volumétrico. Mais uma vez, a trituração dos

comprimidos foi realizada para homogeneizar o processo de amostragem.

2.2.8 Solução estoque de ácido fórmico 1000 mg/L

Pesou-se 102,0 mg da solução de ácido fórmico 98%m/v (Vetec Química Fina

Ltda. Rio de Janeiro, Brasil), dissolveu-se em água e avolumou-se para 100 mL em

balão volumétrico.

2.2.9 Solução estoque de ácido acético 1000 mg/L

Pesou-se 100,3 mg da solução de ácido acético 99,7%m/v (Vetec Química Fina

Ltda. Rio de Janeiro, Brasil), dissolveu-se em água e avolumou-se para 100 mL em


2.2.10 Solução estoque de ácido propiônico 1000 mg/L

Pesou-se 100,5 mg da solução de ácido propiônico 99,5%m/v (Vetec Química

Fina Ltda. Rio de Janeiro, Brasil), dissolveu-se em água e avolumou-se para 100 mL em


2.2.11 Solução tampão pH = 5,3

Foram misturados 5 mL de solução de ácido benzóico 10 mmol/L, 0,5 mL de

solução de brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB) 0,5 mM, 0,1 mL de solução de

ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L, 3,5 mL de água purificada e 0,9

mL de solução de dietanolamina (DEA) 9 mmol/L. Na preparação da solução de DEA,

recomenda-se que o reagente seja mantido sob refrigeração.

2.3 Lavagem e condicionamento do tubo capilar para a determinação por CZE

O condicionamento do tubo capilar foi realizado, no início de cada semana, e

consistiu incialmente de sua percolação com uma solução de NaOH 1 mol/L durante 10

minutos, seguido da imersão das extremidades do tubo capilar na solução por 30

64

minutos. Uma segunda etapa de lavagem do tubo capilar era realizada, percolando o

tubo com uma solução de NaOH 0,1 mol/L, seguido da imersão das extremidades do

tubo capilar por 60 minutos. Finalmente, deixava-se o tubo capilar ser percolado por

água purificada por 20 minutos.

Após cada determinação, foram realizadas três operações de lavagens: a primeira

com solução de NaOH 0,1 mol/L por 2 minutos; a segunda com água purificada por 1

minuto e, finalmente a última com a solução do tampão usada no método por 2 minutos.

2.4 Lavagem e condicionamento do tubo capilar para a determinação por MEKC

O procedimento do condicionamento do tubo capilar é semelhante àquele usado

na CZE, porém a lavagem com a solução de NaOH 1 mol/L é realizada somente uma

vez, pois a repetição desse procedimento influencia de forma significativa a superfície

do tubo capilar, podendo alterar o fluxo eletroosmótico.

Para ambas as técnicas, ao término das determinações realizadas durante o dia

realizava-se o procedimento recomendado no protocolo do fabricante (Lumex, Rússia):

deixava-se percolar uma solução de NaOH 0,1 mol/L através do tubo capilar, seguido

de água purificada por 5 minutos.

Para se evitar entupimento é recomendado manter as extremidades do tubo

capilar imerso em água.

2.5 Curvas de calibração dos fármacos para a determinação por CZE

Foram feitas diluições adequadas das soluções estoque de ácido acetilsalicílico e

paracetamol para a preparação das seguintes misturas descritas na Tabela 7:

Tabela 7 - Concentração das misturas para a curva de calibração dos fármacos

Misturas AAS (mg/L) PAR (mg/L) HBz (mg/L)

A 50 25 100

B 100 50 100

C 200 100 100

D 300 200 100

E 500 300 100

65

As condições operacionais para a obtenção dos eletroferogramas estão descritas

a seguir. Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 9,2; potencial

aplicado = 25 kV, injeção hidrodinâmica = 250 mbar x s, comprimento total do tubo

capilar = 50 cm (comprimento efetivo do tubo capilar = 40 cm), diâmetro interno do

tubo capilar = 50 µm, comprimento de onda de detecção = 226 nm e temperatura =

200C.

2.6 Curvas de calibração dos ácidos orgânicos para a determinação por MEKC

Foram feitas diluições adequadas das soluções estoque dos ácidos fórmico,

acético e propiônico para a preparação das seguintes misturas descritas na Tabela 8:

Tabela 8 - Concentração das misturas para a curva de calibração dos ácidos orgânicos

Ácido fórmico (mg/L) Ácido acético (mg/L) Ácido propiônico (mg/L)

10 10 10

20 20 20

50 50 50

80 80 80

100 100 100

As condições operacionais para a obtenção dos eletroferogramas estão descritas a

seguir. Eletrólito de corrida: solução tampão constituída de 5 mL de solução de ácido

benzóico 10 mmol/L, 0,5 mL de solução de brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB)

0,5 mM, 0,1 mL de solução de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L,

3,5 mL de água purificada e 0,9 mL de solução de dietanolamina (DEA) 9 mmol/L; pH

= 5,3; potencial aplicado = - 20 kV, injeção hidrodinâmica = 150 mbar x s;

comprimento total do tubo capilar = 50 cm (comprimento efetivo do tubo capilar = 40

cm); diâmetro interno do tubo capilar = 50 µm; comprimento de onda de detecção = 229

nm e temperatura = 200C.

66

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Estudo univariado do método de determinação de AAS e PAR por CZE

3.1.1 Efeito do pH da solução tampão

O pH da solução tampão tem um efeito significante no fluxo eletroosmótico

porque ele muda o potencial zeta. Quando o pH aumenta, ocorre um incremento no

fluxo eletroosmótico, porque aumenta a dissociação do grupo Si-OH na parede interna

do tubo capilar. O potencial zeta é proporcional à carga na superfície da parede do tubo

capilar e isto provoca um aumento na velocidade eletroosmótica. O pH da solução

tampão influencia também o grau de ionização dos solutos e, portanto as suas

mobilidades eletroosmóticas. Em geral, a solução tampão escolhida é aquela que

fornece a melhor separação e não necessariamente uma velocidade eletroosmótica ótima

(BAKER, 1995). As figuras 10 - 12 mostram os eletroferogramas da mistura dos

fármacos no intervalo de pH de 8,0 a 10,4.

Figura 10 – Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 8,0


67

Figura 12 - Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 10,4

Legenda das Figuras 10, 11 e 12 – Eletroferogramas da mistura de paracetamol 50

mg/L, ácido acetilsalicílico 250 mg/L e ácido benzóico 50 mg/L (padrão interno).

Potencial aplicado = 25 kV, injeção hidrodinâmica = 250 mbar x s, comprimento total

do tubo capilar = 50 cm (comprimento efetivo do tubo capilar = 40 cm), diâmetro

interno do tubo capilar = 50 µm, comprimento de onda de detecção = 226 nm e

temperatura = 200C.

Como esperado, não houve uma diferença significativa nos tempos de migração

dos analitos em virtude do pH das soluções tamponadas (eletrólito de corrida) estar

contido no intervalo de mais ou menos uma unidade de pH do pKa da solução tampão, o

que garante uma eficiência elevada do índice tamponante (β = dC/dpH). Por

conveniência, manteve-se o pH da solução tampão igual a 9,2 (pKa ácido bórico = 9,2).

3.1.2 Efeito da concentração do eletrólito suporte

Quando a temperatura é mantida sob controle, o aumento da concentração da

solução tampão ou da força iônica irá diminuir o fluxo eletroosmótico, porque ocorre

uma redução no potencial zeta. Enquanto o uso de uma solução tampão diluída reduz o

tempo de análise, uma concentração excessivamente baixa deve ser evitada porque ela

causa a forma de picos assimétricos e largos. Como uma regra geral, a concentração da

solução tampão (eletrólito de corrida) deve ser, no mínimo, cem vezes superior à do

analito. Uma faixa típica de concentração da solução tampão é de 10 – 100 mmol/L

(BAKER, 1995). As figuras 13 e 14 mostram o efeito da concentração do eletrólito

suporte nos eletroferogramas dos fármacos.

68



Legenda das Figuras 13 e 14 – Eletroferograma da mistura de paracetamol 50 mg/L,

ácido acetilsalicílico 250 mg/L e ácido benzóico 50 mg/L (padrão interno). Potencial

aplicado = 25 kV, injeção hidrodinâmica = 250 mbar x s, comprimento total do tubo

capilar = 60 cm (comprimento efetivo do tubo capilar = 50 cm), diâmetro interno do

tubo capilar = 75 µm, comprimento de onda de detecção = 226 nm e temperatura =

200C.

Nesta etapa dos experimentos, o sistema eletroforético usado deixou-se

reconhecer o cassete anterior e para não interromper o trabalho, optamos por usar o

cassete com tubo capilar maior. Avaliando-se os eletroferogramas obtidos (Figuras 13 e

14), observa-se claramente o aparecimento de picos fantasmas, a que atribuímos a uma

possível contaminação da solução tampão. Deste modo, escolheu-se a concentração da

solução tampão borato 25 mmol/L para a continuação dos experimentos.

69

3.1.3 Efeito do potencial aplicado

Como o campo elétrico (E) é dado pela razão potencial/comprimento do tubo

capilar, uma mudança no potencial aplicado é uma maneira fácil de modificar o fluxo

eletroosmótico. Portanto, um aumento no potencial aplicado produz um incremento no

fluxo eletroosmótico e uma redução no tempo de migração e, consequentemente no

tempo de análise. No entanto, o emprego de potencial aplicado muito elevado provoca

aumento na intensidade de corrente e no aquecimento pelo efeito Joule. Caso o

instrumento usado não possua um sistema de dissipação de calor eficiente, a

temperatura dentro do tubo capilar aumenta causando um decréscimo na viscosidade da

solução tampão, o que provoca um alargamento dos picos e tempos de migração

erráticos (BAKER, 1995). As figuras 15 a 17 mostram o efeito do potencial aplicado

nos eletroferogramas dos fármacos.

Figura 15 – Eletrólito de corrida: solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 9,2,

potencial aplicado = 15 kV



70



Legenda das figuras 15, 16 e 17 – Eletroferograma da mistura de paracetamol 50 mg/L,

ácido acetilsalicílico 250 mg/L e ácido benzóico 50 mg/L (padrão interno). Injeção

hidrodinâmica = 250 mbar x s, comprimento total do tubo capilar = 60 cm

(comprimento efetivo do tubo capilar = 50 cm), diâmetro interno do tubo capilar = 75

µm, comprimento de onda de detecção = 226 nm e temperatura = 200C.

Como discutido anteriormente, o potencial aplicado de 25 kV reduziu de

maneira significativa o tempo de análise sem provocar os efeitos deletérios de distorção

dos picos. Portanto, este foi o potencial aplicado escolhido para a otimização dos

experimentos.

3.1.4 Robustez

Foram feitas várias mudanças nos parâmetros otimizados para se avaliar a

robustez da metodologia desenvolvida, porém estas modificações se mostraram críticas

alterando de forma significativa a eficiência da separação eletroforética, a precisão e

exatidão dos resultados. Portanto, recomenda-se aplicar exatamente os valores

encontrados nesta otimização univariada para a determinação dos fármacos em questão.

3.1.5 Curvas de calibração

De cada solução mistura foram obtidos cinco eletroferogramas para a construção

da curva de calibração dos analitos e posterior análise estatística.

71

As Tabelas 9 - 12 mostram de forma resumida os parâmetros, a análise

estatística e análise da variância dos dados da curva de calibração do AAS e PAR por

CZE. As figuras 18 e 19 mostram as curvas de calibração para os dois analitos.

Tabela 9 - Parâmetros da curva de calibração do AAS e PAR por CZE.

AAS PAR Variável

dependente

Parâmetro

Valor Erro padrão Valor Erro padrão

Coef. linear - 0,109 2,534 16,98 4,64 Área do

pico Coef. angular 0,379 0,008 1,366 0,028

Tabela 10 – Análise estatística da curva de calibração do AAS e PAR por CZE.

AAS PAR

Número de pontos 20 24

Graus de liberdade 18 22

Soma quadrática dos resíduos 832,2 4302,8

Coeficiente de determinação ajustado 0,99045 0,99065

Tabela 11 – Análise da variância dos dados da curva de calibração do AAS

Graus de

liberdade

Soma

quadrática

Média

quadrática

Teste F p-Valor

Modelo 1 91195,7 91195,7 1972,5 0

Erro 18 832,2 46,2

Total 19 92027,9

Tabela 12 – Análise da variância dos dados da curva de calibração do PAR

Graus de

liberdade

Soma

quadrática

Média

quadrática

Teste F p-Valor

Modelo 1 477044,7 477044,7 2439,1 0

Erro 22 4302,8 195,6

Total 23 481347,5

72

0 100 200 300 400 500 6000

50

100

150

200

Áre

a d

o p

ico (

u. a

.)

AAS (mg/L)

Figura 18 – Curva de calibração do AAS por eletroforese capilar por zona.

0 100 200 300 4000

100

200

300

400

500

Áre

a d

o p

ico (

u. a.)

PAR (mg/L)

Figura 19 – Curva de calibração do PAR por eletroforese capilar por zona.

3.1.6 Precisão

A repetibilidade ou precisão intra-corridas definem a precisão dos resultados

obtidos dentro do próprio laboratório, por um mesmo analista e com a mesma

instrumentação (RIBEIRO et all., 2008). O guia ICH recomenda que sejam realizadas

)64,498,16()028,0366,1(ˆ ±+±= PARCy

AASCy )008,0379,0(ˆ ±=

73

nove determinações contemplando toda a faixa de calibração, ou seja, três

concentrações (baixa, média e alta) com amostras em triplicata, ou um mínimo de seis

determinações em amostras contendo uma concentração equivalente à média da faixa de

calibração (ICH 1996). Neste experimento, foram realizadas cinco replicatas de cada

solução abrangendo toda a faixa de calibração do analito, inclusive com medida de

concentração de solução padrão abaixo do limite de detecção, o que pode explicar

porque a solução de AAS tenha apresentado um desvio padrão relativo, DPR (%) bem

superior aos demais.

Tabela 13 – Estudo da precisão intra-corridas do método desenvolvido para determinar

AAS e PAR por CZE.

AAS (mg/L) DPR (%) PAR (mg/L) DPR (%)

50 8,0 25 1,4

100 1,6 50 1,7

200 1,5 100 1,5

300 1,5 200 0,8

500 0,9 300 0,4


O LD neste caso é definido como a concentração mínima que pode ser medida e

informada com 95% de confiança (ICH, 1996; BACCAN et all., 1998). O limite de

quantificação é a mais baixa concentração do analito que pode ser quantificada dentro

dos limites de precisão e exatidão do método durante as operações de rotina do

laboratório (ANVISA, 2003). O método de estimativa dos limites de detecção e

quantificação utilizado foi baseado nos parâmetros da curva analítica, pois este

apresenta maior confiabilidade estatística e leva em consideração o intervalo de

confiança da regressão. Os valores obtidos dos limites de detecção e quantificação

foram 79 e 118 mg/L para o ácido acetilsalicílico e 36 e 53 mg/L para o paracetamol,

respectivamente, com um nível de confiança de 95%.

3.1.8 Calibração pelo método do padrão interno

Utilizou-se uma solução de ácido benzóico 100 mg/L como padrão interno. A

escolha desta substância deve-se ao fato de que a mesma não se encontra presente nas

74

formulações farmacêuticas disponíveis no mercado. No entanto, os resultados

encontrados para esta metodologia foram sempre inferiores aos da curva analítica para

os dois analitos. Portanto, desaconselha-se o emprego do padrão interno para esta

determinação.

Método de determinação de AAS e PAR por CZE

Eletrólito de corrida Solução tampão de borato 25 mmol/L, pH = 9,2

Potencial aplicado 25 Kv Injeção hidrodinâmica 250 mbar x s Tubos capilar

• comprimento total • comprimento efetivo • diâmetro interno

• 50 cm • 40 cm • 50 µm

Comprimento de onde (detecção direta) 226 nm Temperatura 20ºC

Figuras analíticas de mérito

AAS PAR Faixa de calibração (mg/L) 100-500 50-300 LD (mg/L) 79 36 LQ (mg/L) 118 53 Coeficiente linear -0,109 ± 2,534 16,98 ± 4,64 Coeficiente angular 0,379 ± 0,008 1,366 ± 0,028 Coeficiente de determinação ajustado

0,99045 0,99065

Precisão intra-corridas ≤ 1,6 % ≤ 1,7 %

3.2 Estudo univariado do método de determinação de ácidos orgânicos por MEKC

3.2.1 Efeito do pH da solução tampão

A composição, o pH e a concentração da solução tampão são fatores importantes

na separação eletroforética. A escolha do eletrólito de corrida é dependente do tipo de

eletroforese capilar. No MEKC, um agente tensoativo é adicionado a solução tampão

em uma concentração superior à da concentração micelar crítica (CMC). O agente

tensoativo forma micelas no eletrólito de corrida e o soluto se distribui entre a fase

aquosa do tampão e as micelas. O grau de partição é dependente da hidrofobicidade do

soluto. Quando se analisa uma amostra com moléculas neutras, o pH da solução tampão

75

tem pouca influência na separação eletroforética por MEKC. A separação ocorre devido

à diferença de hidrofobicidade dos solutos e, para espécies neutras ela independe do pH.

As micelas migram no tubo capilar sob a influência da sua mobilidade eletroforética,

enquanto que o pH do eletrólito de corrida deve ser controlado para permitir a ionização

das micelas (BAKER, 1995).

No MEKC, os solutos iônicos ou ionizáveis migram no tubo capilar devido à sua

mobilidade eletroforética tal como na eletroforese capilar por zona. Para solutos

ionizados, o pH da solução tampão associado com a micela afeta a retenção e a

seletividade porque ele muda o grau de ionização e, consequentemente a

hidrofobicidade do soluto (BAKER, 1995).

As figuras 20-22 mostram o efeito do pH da solução tampão nos

eletroferogramas dos ácidos orgânicos.

Figura 20 – Eletrólito de corrida: solução constituída de 5 mL de solução de ácido




= 4,8

76





= 5,3





= 5,8

Legenda das figuras 20, 21 e 22 – Eletroferograma da mistura de ácido fórmico 50 mg/L

ácido acético 50 mg/L e ácido propiônico 50 mg/L. Potencial aplicado = - 20 kV,

injeção hidrodinâmica = 150 mbar x s; comprimento total do tubo capilar = 50 cm

(comprimento efetivo do tubo capilar = 40 cm); diâmetro interno do tubo capilar = 50

µm; comprimento de onda de detecção = 229 nm e temperatura = 200C.

77

Foi observado que é possível a determinação dos ácidos orgânicos no intervalo

de pH entre 4,8 e 5,8. No entanto, quando se utilizou o eletrólito de corrida com pH

igual a 5,3 o tempo de análise foi inferior a 4 minutos. Consequentemente, este valor de

pH foi mantido nos estudos posteriores.

3.2.2 Efeito do potencial aplicado

Quando se utiliza um potencial aplicado elevado, a separação é mais eficiente e

reduz-se o tempo de análise. No entanto, ocorre um aumento no aquecimento Joule em

função do calor gerado no tubo capilar, o que provoca efeitos danosos na separação e

pode causar um alargamento dos picos. Existe ainda a possibilidade da decomposição

da amostra, da formação de bolhas no tubo capilar que resulta na descontinuidade

elétrica causando a interrupção da análise, pois o instrumento se desliga. Caso o

instrumento tenha um bom sistema de refrigeração, pode-se optar por trabalhar com

potenciais elevados (BAKER, 1995).

As figuras 23 e 24 mostram o efeito do potencial aplicado nos eletroferogramas

dos ácidos orgânicos por MEKC.





= 5,3.Potencial aplicado = -15 kV

78





= 5,3.Potencial aplicado = -20 kV

Legenda das figuras 23 e 24 – Eletroferograma da mistura de ácido fórmico 50 mg/L,

ácido acético 50 mg/L e ácido propiônico 50 mg/L. Injeção hidrodinâmica = 150 mbar x

s; comprimento total do tubo capilar = 50 cm (comprimento efetivo do tubo capilar = 40

cm); diâmetro interno do tubo capilar = 50 µm; comprimento de onda de detecção = 229

nm e temperatura = 200C.

Quando se utilizou um potencial de – 20 kV, a corrida eletroforética se realizou

em menos de 4 minutos, porém o sistema eletroforético não permitiu a análise com

potencial de – 25 kV. Portanto, utilizou-se doravante um potencial aplicado de – 20 kV.

3.2.3 Curvas de calibração dos ácidos orgânicos

De cada solução mistura foram obtidos três eletroferogramas para a construção

da curva de calibração dos analitos e posterior análise estatística.

As Tabelas 14 - 18 mostram de forma resumida os parâmetros, a análise

estatística e análise da variância dos dados da curva de calibração dos ácidos orgânicos

por MEKC. As figuras 25-27 mostram as curvas de calibração para os analitos.

79

Tabela 14 - Parâmetros da curva de calibração dos ácidos orgânicos por MKCE.

Ácido fórmico Ácido acético Ácido propiônico Parâmetro

Valor Erro

padrão

Valor Erro

padrão

Valor Erro

padrão

Coef.

Linear

- 0,214 0,900 1,869 0,435 0,616 0,591

Coef.

Angular

0,710 0,019 0,849 0,009 0,920 0,012

Tabela 15 - Análise estatística da curva de calibração dos ácidos orgânicos por MKCE.

Ácido fórmico Ácido acético Ácido propiônico

Número de pontos 12 12 11

Graus de liberdade 10 10 9

Soma quadrática

dos resíduos

31,003 7,251 11,98

Coeficiente de

determinação

ajustado

0,9925 0,9988 0,9982

Tabela 16 – Análise da variância dos dados da curva de calibração do ácido fórmico

Graus de

liberdade

Soma

quadrática

Média

quadrática

Teste F p-Valor

Modelo 1 4536,7 4536,7 1463,3 3,6 x 10-12

Erro 10 31,0 3,10

Total 11 4767,7

Tabela 17 – Análise da variância dos dados da curva de calibração do ácido acético

Graus de

liberdade

Soma

quadrática

Média

quadrática

Teste F p-Valor

Modelo 1 6479,7 6479,7 8936,4 4,4 x 10-16

Erro 10 7,3 0,73

Total 11 6487,0

80

Tabela 18 – Análise da variância dos dados da curva de calibração do ácido propiônico

Graus de

liberdade

Soma

quadrática

Média

quadrática

Teste F p-Valor

Modelo 1 7532,3 7532,3 5658,8 6,6 x 10-14

Erro 9 12,0 1,3

Total 10 7544,3

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

Áre

a d

o p

ico (

u. a.)

Ácido fórmico (mg/L)

Figura 25 – Curva de calibração do ácido fórmico por eletroforese capilar por MECK.

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

Áre

a d

o p

ico

(u

.a.)

Ácido acético (mg/L)

Figura 26 – Curva de calibração do ácido acético por eletroforese capilar por MECK.

fórmicoácCy .)019,0710,0(ˆ ±=

acéticoácCy .)435,0869,1()009,0849,0(ˆ ±+±=

81

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

Áre

a d

o p

ico (

u. a.)

Ácido propiônico (mg/L)

Figura 27 – Curva de calibração do ácido propiônico por eletroforese capilar por

MEKC.

3.2.4 Precisão

A repetibilidade ou precisão intra-corridas define a precisão dos resultados

obtidos dentro do próprio laboratório, por um mesmo analista e com a mesma

instrumentação (RIBEIRO et all., 2008). O guia ICH recomenda que sejam realizadas

nove determinações contemplando toda a faixa de calibração, ou seja, três

concentrações (baixa, média e alta) com amostras em triplicata (ICH 1996). Neste

experimento, foram realizadas três replicatas de cada solução abrangendo toda a faixa

de calibração do analito, inclusive com medidas abaixo do limite de detecção para os

ácidos fórmico e propiônico, o que pode justificar um desvio padrão relativo superior

nesta região de concentração.

propiônicoácCy .)591,0616,0()012,0920,0(ˆ ±+±=

82

Tabela 19 – Resultados da medida da precisão

DPR (%) C (mg/L)

Ácido fórmico Ácido acético Ácido propiônico

10 3,4 2,8 1,8

20 2,6 2,2 2,7

50 2,3 2,2 1,7

80 0,9 0,8 0,9

100 1,1 1,3 1,9


Mais uma vez, foi usado o método de estimativa dos limites de detecção e

quantificação que se baseia nos parâmetros da curva analítica, pois este apresenta maior

confiabilidade estatística e leva em consideração o intervalo de confiança da regressão.

Os valores obtidos dos limites de detecção e quantificação foram 12,2 e 17,9 mg/L para

o ácido fórmico, 5,0 e 7,3 mg/L para o ácido acético e 19,2 e 28,4 mg/L para o ácido

propiônico, respectivamente, com um nível de confiança de 95%.

Método de determinação dos ácidos fórmico, acético e propiônico por MEKC

Eletrólito de corrida Solução tampão constituída de 5 mL de sol. de ácido benzóico 10 mmol/L, 0,5 mL de sol. de brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB) 0,5 mM, 0,1 mL de sol. de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mmol/L, 3,5 mL de água purificada e 0,9 mL de sol. de dietanolamina (DEA) 9 mmol/L

Potencial aplicado -20 kV Injeção hidrodinâmica 150 mbar x s Tubos capilar

• comprimento total • comprimento efetivo • diâmetro interno

• 50 cm • 40 cm • 50 µm

Comprimento de onda (detecção direta) 229 nm Temperatura 20ºC

83

Tabela 20 - Figuras analíticas de mérito

Parâmetro Ác. Fórmico Ác.acético Ác. Propiônico Faixa de calibração (mg/L)

LD (mg/L) 12,2 5,0 19,2 LQ (mg/L) 17,9 7,3 28,4 Coeficiente linear -0,214 ± 0,900 1,896 ± 0,435 0,616 ± 0,591 Coeficiente angular 0,710 ± 0,019 0,849 ± 0,009 0,920 ± 0,012 Coeficiente de determinação ajustado

0,9925 0,9988 0,9982

Precisão intra-corridas ≤ 3,4 % ≤ 2,8 % ≤ 2,7 %

84

4. CONCLUSÕES

As análises por eletroforese capilar estão fundamentadas em mecanismos

diversos de separação. A implicação direta desta versatilidade define o aspecto mais

impressionante desta técnica: a possibilidade de analisar ácidos orgânicos de massa

molar pequena em águas naturais fortemente salinas até princípios ativos utilizados nas

formulações farmacêuticas, em uma única coluna, desde que o eletrólito de corrida seja

cuidadosamente escolhido. O sucesso desta técnica advém da sua simplicidade, da

eficiência, do baixo custo na separação e do pequeno consumo de reagentes.

Neste trabalho foi desenvolvida uma metodologia analítica rápida, simples e

confiável na determinação dos princípios ativos (ácido acetilsalicílico e paracetamol)

em formulações farmacêuticas por eletroforese capilar por zona (CZE). Utilizou-se um

eletrólito de corrida de borato 25 mmol/L (pH = 9,2) e detecção direta em 226 nm. O

tempo de análise da mistura contendo os fármacos foi inferior a 6 minutos. Nas

condições otimizadas, obteve-se uma faixa linear de 100 – 500 mg/L para o AAS e de

50 – 300 mg/L para o PAR, com uma precisão intra-corridas inferior a 2% para os dois

analitos investigados.

Posteriormente, foi utilizado um novo eletrólito de corrida constituído de 5 mL

de solução de ácido benzóico 10 mmol/L, 0,5 mL de solução de CTAB 0,5 mM, 0,1 mL

de solução EDTA 0,1 mmol/L, 3,5 mL de água purificada e 0,9 mL de solução de DEA

9 mmol/L com pH = 5,3 na determinação de ácidos orgânicos de massa molar baixa em

amostras de água natural fortemente salina por cromatografia eletrocinética micelar ou

eletrocromatografia micelar (MEKC / MECC). A quantificação foi feita com medidas

de área do pico, o ácido benzóico foi usado como cromóforo aniônico, o CTAB como

agente tensoativo, o DEA para ajuste do pH e o EDTA como modificador do fluxo

eletroosmótico para permitir uma separação adequada em menos de 4 minutos com

detecção indireta em 229 nm. Problemas de co-migração puderam ser evitados com o

emprego do EDTA como aditivo, pois é conhecido o forte efeito que o mesmo produz

na mobilidade eletroforética dos ácidos orgânicos. Nas condições otimizadas, obteve-se

uma faixa linear de 20 – 100 mg/L com uma precisão intra-corridas inferior a 3% para

os três analitos investigados.

Os resultados obtidos no presente estudo demonstram a exeqüibilidade e as

vantagens do emprego da eletroforese capilar nas análises de ácidos orgânicos em águas

naturais salinas e na determinação de princípios ativos em formulações farmacêuticas.

85

5. SUGESTÕES DE TRABALHOS FUTUROS

A eletroforese capilar com detecção por UV/Vis não é muito sensível em função

da pequena amostra no feixe ótico e da própria espessura do capilar. O uso de janela de

detecção com maior percurso ótico poderia aumentar a sensibilidade do método, mas ela

produz um espalhamento, o que deteriora a precisão das medidas.

Os limites de detecção e quantificação podem ser melhorados com o emprego de

agentes de derivação, portadores de grupos cromóforos com elevada absortividade

molar. Adicionalmente, sugere-se o uso da técnica de empilhamento no próprio tubo

capilar como uma forma de pré-concentração em linha dos analitos.

Sugere-se ainda o emprego desta técnica na análise de amostras de fluídos

biológicos como uma maneira de auxiliar o diagnóstico clínico de várias doenças

provocadas por distúrbios metabólicos.

86

6. REFERÊNCIAS Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA); Resolução 899 de 29 de maio de

2003 – Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos.

ALKAYER, M.; VALLON, J.J.; PEGON, Y.; BICHON, C., Dosage direct du

paracetamol dans les milieux biologiques par polarographie sinusoidale, Analytica

Chimica Acta 124, 113–119 (1981).

ALTRIA, K. D.; BRYANT, S. M., in: Quantitative Analysis of Small Anions by

Capillary Electrophoresis, Beckman, 1997.

ALTRIA, K. D.; CREASEY, E.; HOWELLS, J. S., Routine Capillary Electrophoresis

Trace Level Determinations of Pharmaceutical and Detergent Residues on

Pharmaceutical Manufacturing Equipment, Journal of Liquid Chromatography &

Related Technologies 21, 1093 – 1105 (1998).

ALTRIA, K. D.; SMITH, N. W.; TURNBULL, C. H., Analysis of acidic compounds

using capillary electrochromatography, Journal of Chromatography B 717, 341 –

353 (1998).

ALTUN, M. L.; CEYHAN, T.; KARTAL, M.; ATAY, T.; ÖZDEMIR, N.;

CEVHEROĞLU, S., LC., Method for the analysis of acetylsalicylic acid, caffeine

and codeine phosphate in pharmaceutical preparations, Journal of Pharmaceutical

and Biomedical Analysis 25, 93 – 101 (2001).

AZHAGVUEL, S & SEKAR, R., Method development and validation for the

simultaneous determination of cetirizine dihydrochloride, paracetamol, and

phenylpropanolamine hydrochloride in tablets by capillary zone electrophoresis,

Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 43, 873-878 (2007).

BACCAN, N.; ANDRADE, J. C.; GODINHO, O. E. S.; BARONE, J. S., Química

Analítica Quantitativa Elementar, Ed. Edgard Blücher Ltda, 3ª. ed., 1998.

87

BAKER, D. R., Capillary Electrophoresis, John Wiley, New York, 1995.

BENNANI, N.; FABRE, H., Performances of a capillary electrophoresis method for

the determination of meso-inositol in a tablet formulation, Analytica Chimica Acta

434, 67 – 73 (2001).

BLANCHIN, M. D.; BAALBAKI, B.; BOSC, N.; FABRE, H., Short-end injection

technique in capillary electrophoresis for dissolution testing of tablets, Analytica

Chimica Acta 415, 67 – 73, (2000).

BLONDINO, F. E.; BYRON, P. R., The quantitative determination of aspirin and

its degradation products in a model aerosol, Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis 13, 111 – 119 (1995).

BOHNENSTENGEL, F.; KROEMER, H.K.; SPERKER, B., In vitro cleavage of

paracetamol glucuronide by human liver and kidney β-glucuronidase:

determination of paracetamol by capillary electrophoresis, Journal of

Chromatography B 721, 295–299 (1999).

British Pharmacopoeia CD, Version 2, The Stationery Office Ltd., Norwich, 1998.

CHRISTIE, I.; LEEDS, S.; BAKER, M.; KEEDY, F.; VADGAMA, P., Direct

electrochemical determination of paracetamol in plasma, Analytica Chimica Acta

272, 145–150 (1993).

CRUZ VIEIRA, I.; OMURO LUPETTI, K.; FATIBELLO FILHO, O., Determination

of paracetamol in pharmaceutical products using a carbon paste biosensor

modified with crude extract of zucchini (Cucurbita pepo), Química Nova 26, 39 – 43

(2003).

CUSTÓDIO, R.; ANDRADE, J. C.; AUGUSTO, F., Curve fitting of mathematical

functions to experimental data, Química Nova 20, 219 – 225 (1997).

88

DANZER, K.; CURRIE, L. A.; Guidelines for Calibration in Analytical Chemistry,

Pure and Applied Chemistry 70, 993 – 1014 (1998).

DI PIETRA, A. M.; GATTI, R.; ANDRISANO, V.; CAVRINI, V., Application of

high-performance liquid chromatography with diode-array detection and on-line

post column photochemical derivatization to the determination of analgesics,

Journal of Chromatography A 729, 355 – 361 (1996).

DONALD J. ROSE, JR. AND JAMES W. JORGENSON, Post-capillary fluorescence

detection in capillary zone electrophoresis using o-phthaldialdehyde, Journal of

Chromatography 447, 117-131 (1988).

DRAPER, N. R.; SMITH, H., Applied Regression Analysis, 2nd ed., Ed. John Wiley &

Sons: New York, 1981, Chapters 1 and 2.

ESPINOSA BOSCH, M.; RUIZ SANCHEZ, A. J.; SANCHEZ ROJAS, F.; BOSCH

OJEDA, C., Determination of paracetamol: Historical evolution, Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis 42 (2006) 291–321

European Pharmacopoeia, 1997, Convention on the Elaboration of a European

Pharmacopoeia, third ed., European Treaty Series No. 50, Strasbourg, 1996, pp. 748–

749.

FABRE, H.; ALTRIA, K. D., Validating CE Methods for Pharmaceutical Analysis,

LG-GC Europe, AR 8962A, 2001.

FABRE, H.; MESPLET, N., Robustness testing for a capillary electrophoresis

method using the “short-end injection” technique, Journal of Chromatography A

897, 329 – 338 (2000).

FABRE, H.; PERRIN, C.; BOSC, N., Determination of homotaurine as impurity in

calcium acamprosate by capillary zone electrophoresis, Journal of Chromatography

A 853, 421 – 430 (1999).

89

FRENS, J.;WU,SHIAW-LIN E HANCOCK, Characterization of human growth hormone by capillary electrophoresis, Journal of Chromatography A. 480, 379-391 (1989).

FUNK, W.; DAMMANN, V.; VONDERHEID, C.; OEHLMANN, G., eds.; Statistische

Methoden in der Wasseranalytik, VCH, 1985.

GALLI, V.; GARCÍA, A.; SAAVEDRA, L.; BARBAS, C., Capillary electrophoresis

for short-chain organic acids and inorganics anions in different samples,

Electrophoresis 24, 1951 – 1981 (2003).

GROSS, L. & YEUNG, E.S, Indirect fluorimetric detection and quantification in

capillary zone electrophoresis of inorganic anions and necleotides, Journal of

Chromatography A. 480, 169-178 (1989).

GROSSMAN, D.P, COLBURN C.J; LAUER, H.H; NIELSEN, G.R; RALPH M.

RIGGIN, M.R; SITTAMPALAM, S.G e RICKARD C.E, Application of free-solution

capillary electrophoresis to the analytical scale separation of proteins and peptides,

61, 1186-1194 (1989).

HEIGER, D. N.; HEROLD, M.; GRIMM, R.; Applications of the HP 3D capillary

electrophoresis system, vol.1, p.51 (1994) France.

HEITMEIER, S., BLASCHKE, G., Direct determination of paracetamol and its

metabolites in urine and serum by capillary electrophoresis with ultraviolet and

mass spectrometric detection, Journal of Chromatography B 721, 93–108 (1999).

http://www.anvisa.gov.br, acessada em Janeiro 2008.

http://www.epa.gov, acessada em Janeiro 2008.

http://www.inmetro.gov.br, acessada em Janeiro 2008.

International Conference on Harmonisation (ICH); Guidance for Industry Q2A: Text on

Validation of Analytical Procedures, March 1995.

90

International Conference on Harmonisation (ICH); Guidance for Industry Q2B: Text on

Validation of Analytical Procedures, November 1996.

Instituto Nacional de Metrologia. Normatização e Qualidade Industrial (INMETRO);

Orientações sobre Validação de Métodos de Ensaios Químicos; DOQ-CGCRE-008,

Revisão: 01 de março de 2003.

Japanese Pharmacopeia Forum 178 – 201 (1999).

JOVICIC, G.; NIKOLIC, L.; RAJIC, K. K.; AFBABA, D.; JOVANOVIC, M.;

DJURIC, Z., Third-order derivative UV spectrophotometry and densitometry for

the simultaneous assay of acetylsalicylic acid and salicylic acid in tablet

formulations, II Farmaco 50, 285 – 288 (1995).

KARIM, M. M.; JEON, C. W.; LEE, H. S.; ALAM,; LEE, S. H.; CHOI, J. H.; JIN, S.

O.; DAS, A. K., Simultaneous determination of acetylsalicylic acid and caffeine in

pharmaceutical formulation by first derivative synchronous fluorimetric method,

Journal of Fluorescence 16, 713 – 721 (2006).

KUNKEL, A.; GÜNTER, S.; WÄTZIG, H., Quantitation of acetaminophen and

salicylic acid in plasma using capillary electrophoresis without sample

pretreatment improvement of precision, Journal of Chromatography A 768, 125 –

133 (1997).

LAU, O.W.; LUK, S.F.; CHEUNG, Y.M., Simultaneous determination of ascorbic

acid, caffeine and paracetamol in drug formulations by differential-pulse

voltammetry using a glassy carbon electrode, Analyst 114, 1047–1051 (1989).

LEHOTAY, D. C., Chromatographic techniques in inborn errors of metabolism,

Biomedical Chromatography 5, 113 – 121 (1991).

LUCAS, H., “How Stuff works – Como funciona a aspirina”, publicado em abril de

2000 e atualizado em 20 de dezembro de 2007. http://saude.hsw.com.br/aspirina.html

acessado em janeiro de 2008.

91

LUNA, A. S., Química Analítica Ambiental, Editora da UERJ, Rio de Janeiro, 2003.

MAMOLO, M.G.; VIO, L.; MAURICH, V., Simultaneous quantitation of

paracetamol, caffeine and propyphenazone by high-pressure liquid

chromatography, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 3, 157–164

(1985).

MCCORMICK, M.R, Capillary zone electrophoretic separation of peptides and

proteins using low pH buffers in modified silica capillaries, Anaytical Chemistry, 60,

2322-2328 (1988).

MARDONES, C.; RIOS, A.; VALCÁRCEL, M., Determination of nonsteroidal anti-

inflammatory drugs in biological fluids by automatic on-line integration of solid-

phase extraction and capillary eletrophoresis, Electrophoresis 22, 484 – 490 (2001).

MARÍN, A & BARBAS, C, CE versus HPLC for the dissolution test in a

pharmaceutical formulation containing acetaminophen, phenylephrine and

chlorpheniramine, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 35, 769-777

(2004).

MILLER, J. N., Basic statistical methods for Analytical Chemistry. Part 2.

Calibration and regression methods. A review, Analyst 116, 3 – 14 (1991).

NAVARRO, I.; GONZALEZ-ARJONA, D.; ROLDAN, E.; RUEDA, M.,

Determination of paracetamol in tablets and blood plasma by differential pulse

voltammetry, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 6, 969–976 (1988).

PATIL, S.T.; SUNDARESAN, M.; BHOIR, I.C.; BHAGWAT, A.M., Determination

of paracetamol in dosage forms by non-suppressed ion chromatography, Talanta

48, 1199–1202 (1999).

Pharmocopée Européenne, 3rd ed., 2001 addendum, 35 – 40, 1061 – 1063 (2001).

92

Pharmeuropa 11-2, 411 – 412 (1999).

PIMENTEL, M. F.; BARROS NETO, B., Calibração: uma Revisão para Químicos

Analíticos, Química Nova 19, 268 – 277 (1996).

PRESTO ELGSTOEN, K. B.; ZHAO, J. Y.; ANACLETO, J. F.; JELLUM, E.,

Potential of capillary electrophoresis, tandem mass spectrometry and coupled

capillary electrophoresis–tandem mass spectrometry as diagnostic tools, Journal of

Chromatography A 914, 265 – 275 (2001).

QUEIROZ, S.C.N; JARDIM, I.C.S, Universidade Estadual de Campinas, Instituto

de Química retirado do site

http://www.chemkeys.com/bra/md/mds_11/elecap_4/elecap_4.htm# 2001 em

20/12/2007.

RAMOS MARTOS, N.; AGUIRRE-GÓMEZ, F.; MOLINA DÍAZ, A.; CAPITÁN-

VALLVEY, L. F., Application of liquid chromatography to the simultaneous

determination of acetilsalicylic acid, caffeine, codeine, paracetamol, pyridoxine,

and thiamine in pharmaceutical preparations, Journal of AOAC International 84,

676 – 683 (2001).

RAMOS MARTOS, N.; MOLINA DÍAZ, A.; NAVALÓN, A.; CAPITÁN-VALLVEY,

L. F., Spectrofluorimetric determination of acetylsalicylic acid and codeine

mixtures in pharmaceuticals, Analytical Letters 34, 579 – 595 (2001).

RAVISANKAR, S.; VASUDEVAN, M.; GANDHIMATHI, M.; SURESH, B.,

Reversed-phase HPLC method for the estimation of acetaminophen, ibuprofen

and chlorzoxazone in formulations, Talanta 46, 1577 – 1581 (1998).

RIBEIRO, F. A. L.; FERREIRA, M. C. F.; MORANO, S. C.; SILVA, L. R.;

SCHNEIDER, R. P., Planilha de validação: uma nova ferramenta para estimar

figuras de mérito na validação de métodos analíticos univariados, Química Nova 31,

164 – 171 (2008).

93

SCHEWITZ, J.; LINDON, J.C., Directly coupled CZE-NMR and CEC-NMR

spectroscopy for metabolite analysis: paracetamol metabolites in human urine

Analyst 123, 2835–2837 (1998).

SEYMOUR, C. A.; THOMASON, M. J.; CHALMERS, R. A.; ADDISON, G. M.;

BAIN, M. D.; COCKBURN, F.; LITTLEJOHNS. P.; LORD, J.; WILCOX, A. H.,

Health Technology Assessment Handbook 1, 1 – 95 (1997).

SHERMA, J.; STELLMACHER, S.; WHITE, T. J., Analysis of analgesic tablets by

quantitative high-performance reversed phase TLC, Journal of Liquid

Chromatography & Related Technologies 8, 2961 – 2967 (1985).

SISCO, W.R.; RITTENHOUSE, C.T.; EVERHART, L.A.; McLAUGHLIN, A.M.,

Simultaneous high-performance liquid chromatographic stability-indicating

analysis of acetaminophen, codeine phosphate, and sodium benzoate in elixirs,

Journal of Chromatography A 354, 355–366 (1986).

STEINMANN, L.; THORMANN, W., Characterization of competitive binding,

fluorescent drug immunoassays based on micellar electrokinetic capillary

chromatography, Electrophoresis 17, 1348 – 1356 (1996).

TAVARES, M. F. M., Eletroforese capilar: conceitos básicos, Química Nova 19, 173

– 181 (1996).

TAVARES, M. F. M., Mecanismos de separação em eletroforese capilar, Química

Nova 20, 493 – 511 (1997).

TERABE, S.; OTSUKA, K.; ICHIKAWA, K.; TSUCHIYA, A.; ANDO, T.,

Electrokinetic separations with micellar solutions and open-tubular capillaries

Analytical Chemistry 56, 111 - 113 (1984).

TERABE, S.; MIYASHITA, Y.; ISHIHAMA, Y.; SHIBATA, O, Cyclodextrin-

modified micellar electrokinetic chromatography: Separation of hydrophobic and

enantiomeric compounds, Journal of Chromatography A, 636, 47-55 (1993).

94

TIMERBAEV, A.; FUKUSHI, K., Analysis of seawater and different highly saline

natural waters by capillary zone electrophoresis, Marine Chemistry 82, 221 – 238

(2003).

United States Pharmacopeia, 24th revision, United States Pharmacopeial Convention,

Rockville, 2000.

USP Chapter in USP Second Supplement USP-NF, 2896 – 2900 (2000).

ǗSTǗN, M.; SUNGUR, S.; ERSOY, L., Comparison of HPLC and derivative

spectrophotometric method for the determination of paracetamol and

acetylsalicylic acid in tablets, Pharmazie 47, 558 – 559 (1992).

WALASH, M.I.; EL-BRASHY, A.M.; SULTAN, M.A., Polarographic behaviour and

determination of paracetamol and salicylamide after treatment with nitrous acid,

Mikrochimica Acta 113, 113 –124 (1994).

WEINBERGER, R., practical capillary eletrophoresis, ACADEMIC PRESS, NEW

YORK, (1993).

WESTON, A.; BROWN, P.R, “HPLC and CE: Principles and Practice” San Diego:

Academic Press. pag. 280, (1997).

YING F.S & KAP L.M, Analysis of organic acids and inorganic anions in beverage

drinks by capillary electrophoresis, Electrophoresis, 24, 3224-3232 (2003)

ZHANG, L.; HU, Q.; CHEN, G.;FANG, Y., Simultaneous determination of the

active ingredients in composite pseudoephedrine hydrochloride tablets by capillary

electrophoresis, Analytica Chimica Acta 424, 257 – 262 (2000).

Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )

Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas










http://www.livrosgratis.com.br/cat_1/administracao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_2/agronomia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_3/arquitetura/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_4/artes/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_5/astronomia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_6/biologia_geral/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_8/ciencia_da_computacao/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_9/ciencia_da_informacao/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_7/ciencia_politica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_10/ciencias_da_saude/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_11/comunicacao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_12/conselho_nacional_de_educacao_-_cne/1















http://www.livrosgratis.com.br/cat_13/defesa_civil/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_14/direito/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_15/direitos_humanos/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_16/economia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_17/economia_domestica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_18/educacao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_19/educacao_-_transito/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_20/educacao_fisica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_21/engenharia_aeroespacial/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_22/farmacia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_23/filosofia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_24/fisica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_25/geociencias/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_26/geografia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_27/historia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_31/linguas/1







Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo

http://www.livrosgratis.com.br/cat_28/literatura/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_30/literatura_de_cordel/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_29/literatura_infantil/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_32/matematica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_33/medicina/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_34/medicina_veterinaria/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_35/meio_ambiente/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_36/meteorologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_45/monografias_e_tcc/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_37/multidisciplinar/1





http://www.livrosgratis.com.br/cat_38/musica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_39/psicologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_40/quimica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_41/saude_coletiva/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_42/servico_social/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_43/sociologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_44/teologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_46/trabalho/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_47/turismo/1







Aplicações da eletroforese capilar na determinação de...

Documents

Transcript of Aplicações da eletroforese capilar na determinação de...