APOPTOSE NA MATURAÇÃO E ELIMINAÇÃO PLACENTÁRIA DA...

Karina Kelly de Oliveira Luquesi Meça

APOPTOSE NA MATURAÇÃO E ELIMINAÇÃO PLACENTÁRIA DA B RUCELOSE

BOVINA

Belo Horizonte

Faculdade de Medicina

Universidade Federal de Minas Gerais

2006

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Karina Kelly de Oliveira Luquesi Meça

APOPTOSE E SUA RELAÇÃO COM A MATURAÇÃO E ELIMINAÇÃO PLACENTÁRIA

NA BRUCELOSE BOVINA

Dissertação apresentada ao curso de Pós-Graduação em Patologia Geral, da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre.

Orientador: Prof. Anilton Cesar Vasconcelos.

Belo Horizonte

Faculdade de Medicina


2006

Programa de Pós-Graduação em Patologia Geral


Dissertação intitulada “Apoptose na maturação e eliminação placentária da brucelose bovina”, de

autoria da mestranda Karina Kelly de Oliveira Luquesi Meça, aprovada em 17 de fevereiro de 2006

pela banca examinadora constituída pelos seguintes professores:

Folha de aprovação

Prof. Dr. Anilton Cesar Vasconcelos (Orientador)

Prof. Dr. Humberto Eustáquio Coelho

Prof. Dr. Antônio Marques de Pinho Júnior

Profa. Ana Margarida Miguel Ferreira Nogueira

Coordenadora do programa de Pós-Graduação em Patologia Geral

Belo Horizonte, 17 de fevereiro de 2006

Av. Alfredo Balena 190/ sala 7009

Belo Horizonte, MG – CEP 30130 –100

Fone: (031) 3248.9641 FAX: (031) 3248.9939

Dedico este trabalho ao DEUS TODO PODEROSO, CRIADOR DO UNIVERSO e ao seu filho JESUS CRISTO e ao ESPÍRITO SANTO, aos meus pais, José e Josefa pelo amor, incentivo e apoio incondicional e ao meu namorado João Iury pelo amor e dedicação constantes.

AGRADECIMENTOS

-A Deus, ao Senhor Jesus Cristo e ao Espírito Santo, pela vida, pelo amor, pelo zelo e pela

capacitação e oportunidade.

-Ao Prof. Dr. Anilton Cesar Vasconcelos, pela valiosa e preciosa amizade, pela dedicação, pela

realização deste sonho e também pela experiência e grande aprendizado.

-Ao Prof. Dr. Humberto Eustáquio Coelho, por ter acreditado em mim e me dado esta grande

oportunidade, de mudança de vida, pelos seus ensinamentos preciosos, pela sincera e valiosa

amizade.

-À Profª. Drª. Luciana Moro, pela cooperação na execução do trabalho e pela constante

disponibilidade ao longo dos dias de convivência no laboratório.

- Ao Prof. Dr. Almir de Sousa Martins, pela ajuda, pela confiança e pela sincera amizade.

-À técnica de laboratório Soraia Silva, pela ajuda e cooperação.

-Às pós-graduandas do laboratório de Apoptose: Janaína de Jesus Batista, pelo incentivo e

companheirismo; Helen Lima Del Puerto, minha irmã querida, pela amizade e cooperação e Paula

Peixoto Campos, pela grande ajuda e apoio e pelo companheirismo.

-À minha mãe e ao meu pai, pelo amor derramado em meu coração a cada dia, pela força e

incentivo e por nunca deixarem de acretitar em mim.

-Aos meus irmãos na fé, pelo sustento em orações.

-Ao João Iury, pelo amor e presença constante, pelo incentivo e pela compreensão nos momentos

mais difíceis.

-A todos os professores do curso de pós-graduação em Patologia Geral, pela contribuição na minha

formação acadêmica.

-Ao CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, pela concessão da

bolsa de estudos, essencial para o desenvolvimento deste trabalho.

“Porque o Senhor dá a sabedoria, da sua boca vem o conhecimento e entendimento. Ele reserva a verdadeira sabedoria para os retos, escudo é para os que caminham na sinceridade” ( Provérbios 2: 6,7)

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO 1 Pág.

FIGURA 1 Placenta bovina madura, a termo, com diminuição da celularidade. Apoptose

caracterizada morfologicamente por retração celular, anoiquia (seta vasada),

condensação citoplasmática e nuclear, além de fragmentação nuclear (seta

preta) e formação de corpos apoptóticos (seta branca). Hematoxilina-Eosina,

Barra = 10 µm. .......................................

13

FIGURA 2 Placentite necrotizante brucélica em bovino. Áreas de necrose, com debris

celulares (setas brancas) e infiltrado inflamatório composto

predominantemente por polimorfonucleares (setas negras). O tecido

placentário (∗ branco) não evidencia muitas figuras de apoptose.

Hematoxilina-Eosina, Barra = 10 µm. ...........................................................

14

FIGURA 3 Representação esquemática do mecanismo proposto para explicar a retenção

placentária em bovinos brucélicos. .....................................................................

15

CAPÍTULO 2 Pág.

FIGURA 1 Placentome of a non vaccinated healthy puerperal cow (Cow 20, Group NC).

Decreased cellularity of the trophoblasts of the cotiledonary villi with no

inflammatory infiltrate neither necrosis. Intense and diffuse TUNEL-positive

labeling showing genome fragmentation in cells with morphological evidence of

apoptosis (TUNEL, Bar =10µm)……………………………………………………

43

FIGURA 2 Placentome of a B-19 vaccinated cow challenged with Brucella abortus, with

abortion and positive bacteriology (Cow 9, Group B++). Trophoblasts of the

cotiledonary villi and of the syncityal epithelium of the maternal cripts with no

TUNEL labelling. Maternofetal spaces with evident inflammatory infiltrate and

necrosis, with positive labelling in cellular debris. (TUNEL, Bar =10µm)……………

44

FIGURA 3 Graph showing distribution of the apoptotic indices (mean ± sem) obtained from non

vaccinated healthy cows (Group NC, n=5), from B-19 vaccinated cows challenged

with Brucella abortus with normal gestation and negative bacteriology at parturition

(Group B -, n=5), from B-19 vaccinated cows challenged with Brucella abortus with

no abortion and positive bacteriology at parturition (Group B+, n=5) and from B-19

vaccinated cows challenged with Brucella abortus with abortion and positive

bacteriology (Group B++, n=5). .................................................................................

45

FIGURA 4 Placentome of a non vaccinated healthy puerperal cow (Cow 20, Group NC). Thin

layers of the trophoblasts in the cotiledonary villi with shrunken cells and chromatin

condensation, few with apoptotic bodies. No inflammatory infiltrate neither necrosis.

Decreased cellularity.(HE, Bar =10µm). .....................................................................

46


abortion and positive bacteriology (Cow 9, Group B++). Intense and diffuse

inflammatory infiltrate, composed by mononuclear and some polymorphonuclear

cells (HE, Bar =10µm). ...............................................................................................

47

FIGURA 6 Distribution of the inflammatory indices (mean ± sem) obtained from B-19

vaccinated cows challenged with Brucella abortus with normal gestation and

negative bacteriology at parturition (Group B -, n=5), from B-19 vaccinated cows

challenged with Brucella abortus with no abortion and positive bacteriology at

parturition (Group B+, n=5) and from B-19 vaccinated cows challenged with

Brucella abortus with abortion and positive bacteriology (Group B++, n=5)………..

48


abortion and positive bacteriology (Cow 5, Group B++). Large necrotic areas, with

cellular debris filling up the maternofetal spaces. Thicke layers of the trophoblasts in

the cotiledonary villi and of the syncityal epithelium in maternal cripts with few

shrunken cells. Most of trophoblasts and syncityal epithelium show sparse chromatin

in their nuclei. (HE, Bar =10µm). ...............................................................................

49

FIGURA 8 Graph showing distribution of the necrotic indices (mean ± sem) obtained from B-19

vaccinated cows challenged with Brucella abortus with normal gestation and

negative bacteriology at parturition (Group B -, n=5), from B-19 vaccinated cows


parturition (Group B+, n=5) and from B-19 vaccinated cows challenged with

Brucella abortus with abortion and positive bacteriology (Group B++, n=5). ………..

50

FIGURA 9 Linear Regression showing inverse relationship between Apoptosis and

Inflammation in placentomes of healthy (NC, n=5) and Brucella abortus challenged

puerperal cows, with normal gestation and negative bacteriology at parturition (B -,

n=5), from cows challenged with Brucella abortus with no abortion and positive

bacteriology at parturition (B+, n=5) and from cows challenged with Brucella

abortus with abortion and positive bacteriology (B++, n=5)…………………………..

51

FIGURA 10 Linear Regression showing inverse relationship between Apoptosis and Necrosis in

placentomes of healthy (NC, n=5) and Brucella abortus challenged puerperal cows,

with normal gestation and negative bacteriology at parturition (B -, n=5), from cows


parturition (B+, n=5) and from cows challenged with Brucella abortus with abortion

and positive bacteriology (B++, n=5)………………………………………………….

52

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AI Do inglês Apoptotic Index

bcl-2 Gene anti- apoptótico (B cell lymphoma 2)

DNA Do inglês Deoxyribonucleic Acid - Ácido desoxirribonucléico

ex Exemplo

Group B - Do inglês B-19 vaccinated cows challenged with Brucella abortus with normal

gestation and negative bacteriology at parturition - Vacas vacinadas e

desafiadas sem abortamento e sem bacteriologia positiva

Group B + Do inglês B-19 vaccinated cows challenged with Brucella abortus with no

abortion and positive bacteriology at parturition - Vacas vacinadas e desafiadas

sem abortamento e com bacteriologia positiva

Group B ++ Do inglês B-19 vaccinated cows challenged with Brucella abortus with abortion

and positive bacteriology – Vacas vacinadas e desafiadas com abortamento e

bacteriologia positiva

Group NC Do inglês Non vaccinated healthy cows – Vacas do grupo controle negativo

HE Hematoxilina e Eosina

H2O2 Peróxido de hidrogênio

IFN-γ Interferon gama

II Do inglês Inflammatory Index

NI Do inglês Necrotic Index

PGF Prostaglandina F

PBS Do inglês Phosphate Buffered Saline - Tampão de salina fosfatada

RP Retenção de placenta

TdT Do inglês Terminal deoxynucleotidyl Transferase - Transferase terminal de

deoxinucleotídio

TNF-α Do inglês Tumor Necrosis Factor alfa - Fator de necrose tumoral alfa

TUNEL Do inglês “Terminal deoxynucleotidyl Transferase Urydine Nick End Labeling”

- Marcação in situ da fragmentação do genoma com transferase terminal de

deoxinucleotídio

UTP Do inglês Urydine Tri Phosphate - Trifosfato de uracila

SUMÁRIO

Página

PREFÁCIO ..................................................................................................................... 01

CAPÍTULO 1. Inibição de apoptose e retardo da maturação placentária: um

provável mecanismo da retenção placentária na brucelose bovina (revisão de

literatura) .......................................................................................................................

02

Resumo............................................................................................................................. 04

Revisão de literatura..................................................................................................... 05

Brucelose................................................................................................................... 05

A placenta bovina e a maturação placentária............................................................ 06

Apoptose.................................................................................................................... 10

Apoptose na maturação e liberação da placenta......................................................... 11

Considerações Finais..................................................................................................... 16

Abstract........................................................................................................................... 17

Referências bibliográficas............................................................................................. 18

CAPÍTULO 2. Apoptosis and placental maturation in cattle with brucellosis......................................................................................................................

26

Abstract………………………………………….……………………………………. 28

Introduction …………………………………………………………………………... 29

Material and methods…………………………..…………………………………….. 33

Samples ……………………………………………………………………………. 30

In situ detection of DNA fragmentation................................................................... 30

Morphometrical and statistical analysis................................................................... 31

Results............................................................................................................................ 33

Discussion....................................................................................................................... 35

Conclusion..................................................................................................................... 38

Acknowledgements......................................................................................................... 38

References....................................................................................................................... 39

Figures and legends......................................................................................................... 43

COMENTÁRIOS FINAIS .............................................................................................. 53

PREFÁCIO

Esta dissertação objetivou avaliar quantitativamente a apoptose em placentomos de bovinos

infectados experimentalmente com Brucella abortus. Adicionalmente analisou-se

morfometricamente a resposta inflamatória e a ocorrência de necrose, procurando-se interelacionar

estas com eventuais conseqüências no processo na maturação e eliminação placentária. Determinou-

se o Índice Apoptótico do trofoblasto no periparto de vacas com e sem infecção brucélica e com e

sem aborto. Avaliou-se a resposta inflamatória e a necrose nos placentomos de vacas no periparto

com e sem infecção brucélica, buscando uma eventual associação entre infecção brucélica,

placentite, atraso na maturação placentária e a ocorrência de aborto.

A dissertação está redigida na forma de capítulos, sendo o primeiro capítulo um artigo de

revisão de literatura no qual se levanta a questão central do tema proposto para a pesquisa. Neste

artigo, além de se situar o leitor com referências recentes sobre apoptose na maturação placentária e

sobre brucelose bovina, se lança a hipótese de que a inibição da apoptose causada pela infecção

brucélica poderia estar envolvida no atraso da maturação placentária, responsável pela retenção

placentária. Este artigo já foi aceito pela revista Bioscience Journal e será publicado na edição do

mês de abril de 2006. O segundo capítulo é um artigo com os resultados e conclusões da abordagem

experimental que foi proposta para estudar morfologicamente e morfometricamente as lesões

placentárias na brucelose bovina. Este segundo artigo foi submetido para a revista Veterinary

Pathology.

Apesar de alguma incoerência no estilo e formato principalmente das citações e referências

bibliográficas quando se compara os dois capítulos, optou-se, nesta dissertação, por manter na

íntegra os capítulos como eles foram redigidos e submetidos. Acredita-se que tais pequenas

diferenças em termos de formato não venham a dificultar a análise do conteúdo científico aqui

reunido.

CAPÍTULO 1

INIBIÇÃO DE APOPTOSE E RETARDO DA MATURAÇÃO PLACENT ÁRIA: UM

PROVÁVEL MECANISMO DA RETENÇÃO PLACENTÁRIA NA BRUCE LOSE BOVINA

(REVISÃO DE LITERATURA)




APOPTOSIS INHIBITION AND DELAY OF PLACENTAL MATURAT ION: A

PROPOSED MECHANISM OF PLACENTAL RETAINMENT IN BOVIN E

BRUCELLOSIS (REVIEW)

Karina Kelly de Oliveira Luquesi MEÇA*,

Anilton Cesar VASCONCELOS**,

Luciana MORO**

*Mestranda em Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais

(UFMG) Laboratório de Apoptose, Departamento de Patologia Geral do Instituto de Ciências

Biológicas da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Caixa

Postal 2486, CEP 31270010, Belo Horizonte, MG.

**Doutor. Professor adjunto do Departamento de Patologia Geral do Instituto de Ciências

Biológicas da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Caixa

Postal 2486, CEP 31270010, Belo Horizonte, MG.




APOPTOSIS INHIBITION AND DELAY OF PLACENTAL MATURAT ION: A

PROPOSED MECHANISM OF PLACENTAL RETAINMENT IN BOVIN E

BRUCELLOSIS (REVIEW)

RESUMO

A brucelose é uma doença de grande importância em saúde pública, causa grande perda de

produtividade em rebanhos bovinos, além de prejuízos em decorrência das barreiras sanitárias no

mercado internacional. No bovino, a brucelose induz aborto, mortalidade neonatal, placentite

necrotizante e retenção de placenta. Como tecidos em necrose usualmente são friáveis, seria

esperado que a placenta se desprendesse mais rapidamente e não ficasse retida em decorrência da

placentite necrotizante na brucelose. Há evidências de que bactérias do gênero Brucella inibem a

apoptose ao infectar determinados tipos celulares. A Brucella abortus tem a habilidade de infectar e

se multiplicar no trofoblasto. A expulsão adequada da placenta no momento do parto depende da

maturação deste órgão, que decorre da diminuição da celularidade e da ocorrência de apoptose nos

tecidos fetal e materno. Propõe-se aqui que a Brucella abortus, direta ou indiretamente, iniba a

apoptose de células placentárias e, conseqüentemente, retarde a maturação placentária. Esse fato

poderia explicar melhor a retenção placentária que se desenvolve na brucelose bovina.

Unitermos: Apoptose, brucelose, retenção de placenta.

Revisão de Literatura

Brucelose

A brucelose bovina ocorre de maneira endêmica e a estimativa de animais soropositivos no

Brasil varia entre 2,5% e 7,5%, dependendo da região. Além da possível contaminação dos

consumidores de produtos de origem animal, a brucelose pode causar até 20% de perda de

produtividade em rebanhos bovinos. Além disso, a brucelose torna a carne, leite e derivados

vulneráveis a barreiras sanitárias no mercado internacional, causando um prejuízo de 32 milhões de

dólares ao ano para a economia brasileira (POESTER; GONÇALVES; PEREIRA, 2002).

Representantes do gênero Brucella são pequenos cocobacilos, Gram negativos, imóveis

(CORBEL; STUART; BREWER, 1984). São muito resistentes e podem sobreviver por grandes

períodos no meio ambiente (CRAWFORD; HUBER; BRUCE, 1990). Sua multiplicação ocorre nas

células do hospedeiro ou em meio de cultura, sendo considerado um parasito intracelular facultativo

(SMITH; FICHT, 1990).

Nos bovinos, a Brucella abortus pode ser encontrada principalmente nos testículos,

glândulas sexuais e útero gestante, onde o eritritol é encontrado em grande concentração. O eritritol

estimula a multiplicação brucélica, já que a energia produzida pelo seu metabolismo é maior do que

a produzida pela utilização da glicose. Assim, a Brucella abortus se concentra nesses locais,

culminando com placentite necrotizante focal, aborto, retenção placentária e infertilidade

(CORBEL, 1997; SMITH; FICHT, 1990).

A placenta bovina e sua maturação

Durante a gestação são formadas entre 70 a 120 carúnculas no endométrio bovino

(MARQUES JÚNIOR; BARRETO FILHO; SATURNINO, 1993). As carúnculas compõem a parte

materna da placenta, sendo recobertas pelas membranas fetais que crescem e se expandem para

dentro do lume uterino, formando estruturas fetais irregulares, que são conhecidas como cotilédones

(SCHAFLER; FISHER; DAVIES, 2000). Os componentes fetais se constituem de endotélio,

mesênquima e trofoblasto. Os maternos são epitélio uterino, tecido conjuntivo e endotélio

(RAMSEY, 1982). Entre os cotilédones há áreas de tecido coriônico liso (RAMSEY, 1982). Assim,

a placenta bovina é classificada como cotiledonária (WOODING, 1992), epiteliocorial ou

sinepiteliocorial, vilosa (RAMSEY, 1982), devido à presença dos vilos; não deciduada, pois as

partes materna e fetal podem ser separadas sem causar danos à mucosa uterina após o parto

(BJORKMAN, 1970; STEVEN, 1975).

Com o crescimento placentário, os cotilédones projetam vilos coriônicos que se interdigitam

com as criptas carunculares formando a unidade funcional da placenta, o placentomo (AMOROSO,

1952; STEVEN, 1975). Essas interdigitações aumentam a superfície de contato entre o tecido fetal e

materno (STEVEN; MORRIS, 1975). Segundo King, Atkinson e Robertson (1982), com a invasão

dos vilos, os placentomos crescem aproximadamente cinco mil vezes, involuindo próximo ao parto.

Vilos coriônicos são cones mesenquimatosos vascularizados, revestidos por células

trofoblásticas cuboidais ou células principais mononucleadas e células gigantes com dois ou mais

núcleos (BJÖRKMAN, 1970; JAINUDEEN; HAFEZ, 1993).

As células trofoblásticas cuboidais mononucleadas possuem núcleos arredondados com

grandes nucléolos. As células gigantes possuem núcleos esféricos, amplamente separados, com

nucléolos evidentes e citoplasma abundante. O epitélio da cripta uterina é cúbico ou achatado. Suas

células possuem núcleos esféricos e nucléolos bem evidentes (BJÖRKMAN, 1969).

Durante a gestação, as células binucleadas coriônicas migram do epitélio coriônico para se

fundir com as células epiteliais uterinas, dando origem às células multinucleadas, o que resulta no

epitélio materno-fetal híbrido, explicando a classificação em placenta sinepiteliocorial

(WOODING, 1992).

A liberação da placenta após o parto envolve a perda da adesão materno-fetal e ocorre

somente após a maturação do placentomo. As contrações uterinas durante o parto ajudam

mecanicamente a eliminação placentária. Um fator determinante na liberação é a desagregação da

vilosidade materno-fetal (BJORKMAN, 1969).

O processo de maturação placentária envolve o achatamento do epitélio nas carúnculas

maternas, que é intensificado 3 a 5 dias antes do parto (GRUNERT, 1984) e a diminuição do

número de células binucleadas do trofoblasto e células epiteliais das carúnculas maternas

(SANTOS, 1995; WANGO, HEAP, WOODING, 1992). O feto aparentemente participa da

manutenção da população de células binucleadas (WOODING, 1992) e as alterações hormonais

antes do parto parecem favorecer a diminuição dessas células (MARTINS, 1999a). O número de

células nas criptas carunculares declina a partir dos 270 dias de gestação (BARRETO FILHO;

MARQUES JÚNIOR, 1993; WOICKE et al., 1986).

A redução do suprimento sangüíneo das carúnculas maternas e da circulação placento-fetal

ajuda na desagregação feto-maternal após o parto. As vilosidades coriônicas tornam-se menos

aderidas às criptas carunculares devido aos períodos alternados de hiperemia e isquemia e às

enzimas proteolíticas, tais como a colagenase, que diminuem a adesão da matriz extracelular na

interface materno-fetal (JEFFREY; EHLICH; ROSWIT, 1991).

A liberação fisiológica da placenta ocorre geralmente entre 3 a 6 horas após o parto. A

proteólise do cotilédone e a diminuição da adesividade na interface carúncula-cotilédone resultam

na liberação da placenta. As colagenases são capazes de reduzir a viscosidade específica do

colágeno. A atividade dessas enzimas durante a liberação da placenta é aumentada nas vilosidades

de vacas saudáveis e diminuída em vacas com retenção placentária (GROSS; WILLIAMS;

MANSPEACKER, 1985).

A progesterona é o antagonista direto das contrações uterinas induzidas tanto pela ocitocina

quanto pelas prostaglandinas. No dia anterior ao parto as concentrações plasmáticas de progesterona

caem acentuadamente (HAFEZ; JAINUDEEN, 1995).

Na semana anterior ao parto, há o aumento rápido nas concentrações do cortisol fetal, que

inibe gradualmente a síntese de progesterona pelo útero e placenta (HUNTER et al., 1977) e induz a

produção de estrogênios (HOFFMANN et al. 1979; MCDIARMID, 1983). Cerca de 7 dias antes do

parto há um aumento abrupto das concentrações plasmáticas de estrógeno (CHEW et al., 1977).

O aumento de estrógeno e a diminuição de progesterona no final da gestação estimulam a

secreção da PGF2α (LINDELL; KINDAHL; EDQVIST, 1977), que começa a aumentar 24 a 36

horas antes do parto atingindo o pico no momento do mesmo (GOFF; HORST, 1997). A PGF2α

causa a luteólise (KORDTS; JOCHLE, 1975; LEWING; PROULX; MAPLETOFT, 1985), aumenta

o número de receptores para ocitocina e inibe a síntese de progesterona no útero (GOFF; HORST,

1997), desencadeando o parto (HADLEY, 1996).

Segundo Gross, Williams e Moreland. (1986), a administração de PGF2α uma hora antes do

parto previne a retenção de placenta. As células binucleadas dos vilos coriônicos são a principal

fonte de produção de prostaglandinas na placenta, a partir do ácido araquidônico (GROSS;

WILLIAMS, 1986).

Com o aparecimento das contrações uterinas há a compressão mecânica dos placentomos

induzindo o relaxamento das vilosidades coriônicas o qual favorece o desprendimento dos

cotilédones (CHALLIS; LYE, 1994). Em seguida, com a presença de contrações abdominais, o feto

é forçado para o interior da pelve e os placentomos são comprimidos contra o feto pela pressão da

parede abdominal e contrações uterinas. Após a expulsão fetal o fluxo sangüíneo umbilical é

interrompido. Com isso há isquemia dos vilos coriônicos e contração dos capilares facilitando a

separação entre os vilos e as criptas. Nesse estágio, as contrações uterinas diminuem de amplitude,

mas permitem a liberação da placenta (HAFEZ; JAINUDEEN, 1995).

Segundo Woicke et al. (1986), distúrbios no processo de maturação podem resultar na

retenção placentária. Esses autores demonstraram experimentalmente que vacas com parto normal

apresentavam o epitélio materno descontínuo com intenso achatamento e diminuição do número de

células maternas. Por outro lado, animais com retenção apresentaram o epitélio das criptas

carunculares contínuo e com células cuboidais, indicando ausência de maturação.

A retenção de placenta (RP) ou retenção das membranas fetais é conceituada como a

ausência da separação da carúncula materna (retenção primária), ou a dificuldade mecânica em

expelir a membrana fetal já separada (retenção secundária) (EILER, 1997).

Em bovinos, a recuperação do trato reprodutivo no período pós-parto permite o aumento da

eficiência reprodutiva e conseqüentemente melhor desempenho da atividade pecuária. A expulsão

placentária no tempo normal e a adequada involução uterina possibilitam, juntamente com outros

fatores, o retorno à atividade ovariana luteínica cíclica pós-parto. Com isso há um rápido

restabelecimento do ambiente uterino para uma nova gestação (MARTINS, 1999a).

É difícil definir precisamente a retenção patológica da placenta considerando-se o tempo

decorrido após o parto (LAVEN; PETERS, 1996). As escalas de tempo usadas variam entre 6 e 71

horas (VAN WERVEN et al., 1992). Segundo Eiler (1997), os efeitos danosos à performance

reprodutiva, produção de leite, doença pós-parto e taxa de abate são principalmente detectados

quando a retenção excede o período de 12 horas.

A incidência da RP em bovinos é muito variável, pois depende de como é definida e do país

de origem (LAVEN; PETERS, 1996). Segundo Paisley, Mickelsen e Anderson (1986) ela

normalmente varia de 3 a 12 %. Em alguns países subdesenvolvidos a incidência pode chegar a 30

% (ex.: Bangladesh) (PUTRO, 1988; SAMAD; RAHMAN; ISLAM, 1989).

A RP ocorre com freqüência em vacas leiteiras levando a transtornos reprodutivos no

período pós-parto. Os efeitos da RP na fertilidade podem ser divididos em efeitos diretos e

indiretos. O principal efeito direto da RP é o aumento no intervalo entre partos (BORSBERRY;

DOBSON, 1989; ERB et al., 1981). Os efeitos indiretos da RP na fertilidade estão associados com o

desenvolvimento de metrite (CURTIS et al., 1985).

A placenta retida é isquêmica, hipóxica e carente de nutrientes. No entanto, ela continua

metabolicamente ativa por vários dias. Na presença de estresse metabólico, liberam-se mediadores

bioquímicos que causam imunossupressão no útero (PGE2), aumento da permeabilidade vascular

(histamina e prostaglandinas), aumento da atividade lisossômica (proteólise), danos endometriais

(liberação de histaminas por mastócitos) e redução da quimiotaxia e migração de leucócitos. A

associação desses fatores pode levar à metrite e à conseqüente diminuição da fertilidade (EILER,

1997).

Segundo Holm, Salvatore e Zeek-Mining (1964), a gestação prolongada pode levar à RP por

ocasionar mudanças proliferativas no epitélio caruncular que, mecanicamente, impediriam a

liberação da placenta. Da mesma forma, por deficiência mecânica de liberação, a placentite e a

cotiledonite podem favorecer a RP. Metrite aguda pós-parto (ex.: pelo Actinomyces pyogenes) pode

levar à inércia uterina, RP e placentite (LAVEN; PETERS, 1996).

Apoptose

Apoptose ou morte celular programada é um tipo de morte celular ativa que requer energia,

síntese (KERR; WYLLIE; CURRIE, 1972) e degradação protéicas. Trata-se de um mecanismo

fisiológico de controle celular que regula o tamanho dos tecidos, exercendo um papel oposto ao da

mitose (VASCONCELOS, 1995).

A ausência ou a exacerbação do fenômeno de apoptose podem resultar em conseqüências

desastrosas para os tecidos (MILLER; MARX, 1998). Dessa forma, a inibição da apoptose contribui

para o desenvolvimento de tumores, já a indução excessiva pode acarretar imunossupressão

(WYLLIE; KERR; CURRIE, 1980) e várias doenças neuro-degenerativas, tais como a Doença de

Alzheimer (BARINAGA, 1998).

À microscopia óptica, as células apoptóticas são retraídas (tipicamente circundadas por um

halo claro) e possuem citoplasma acidofílico. Os núcleos dessas células sofrem uma série de

alterações incluindo marginação da cromatina, condensação e fragmentação, seguidas pela

fragmentação da célula em corpos apoptóticos (WYLLIE, 1980). A morte celular por apoptose não

altera as células circunjacentes, diferentemente da célula necrótica que induz inflamação. Assim, a

célula em apoptose se fragmenta silenciosamente, empacotando seus constituintes e os oferece às

células adjacentes que os fagocitam e os reciclam (BORISENKO et al., 2003).

Apoptose na maturação e liberação da placenta

Tanto a proliferação celular quanto a apoptose desempenham papel importante na função

placentária. Ambos os processos são inversamente proporcionais ao longo da gestação (BOOS;

JANSSEN; MÜLLING, 2003). Segundo Smith, Baker e Symonds (1997), a apoptose atinge células

de todos os tipos na placenta humana. A sua ocorrência aumenta consideravelmente no terço final

da gestação (BOOS; JANSSEN; MÜLLING, 2003; SMITH; BAKER; SYMONDS, 1997). Nesse

caso, a apoptose parece estar relacionada com o mecanismo de remodelação placentária auxiliando

na manutenção adequada das proporções teciduais (SMITH; BAKER; SYMONDS, 1997).

Fisiologicamente, a apoptose possibilita a eliminação de células desnecessárias a fim de se

manter a homeostase tecidual (WÖHRL; HÄCKER, 1999). Nos momentos que antecedem o parto a

placenta precisa já estar hipocelularizada para que seja liberada normalmente (BARRETO FILHO;

MARQUES JÚNIOR, 1993). Vacas com retenção placentária apresentam um aumento de células

epiteliais maternas (SANTOS; MARQUES JÚNIOR, 1998). Estudos morfológicos demonstraram

que a maturação placentária está relacionada com a diminuição da população celular dos tecidos

fetal e materna no placentomo (BARRETO FILHO; MARQUES JÚNIOR, 1993; MALARD et al.,

1996; MARQUES JÚNIOR, 1988; SANTOS, 1995; SANTOS; MARQUES JÚNIOR; BARRETO

FILHO, 1997) e com a ocorrência de apoptose (MARTINS, E., 1999; MARTINS, V. M. V., 1999;

NUNES et al., 2000a, 2000b). A apoptose é um evento fisiológico ativo que parece ser requerido

tanto para a maturação, quanto para a liberação normal da placenta após o parto (MARTINS, E.,

1999; MARTINS et al., 2004; MARTINS, V. M. V., 1999; NUNES et al., 2001;). Martins, (1999)

especulou que as mudanças hormonais envolvidas com o parto estimulariam a apoptose nas células

trofoectodermais e maternas, uma vez que a apoptose é mais intensa no momento do parto. Além

disso, observou-se que o número de células apoptóticas em placentomos de vacas que pariram e

liberaram normalmente a placenta foi significativamente maior do que nas que tiveram parto a

termo com RP. Contrariamente, Boos, Janssen e Mülling, (2003) encontraram maior número de

células apoptóticas em placentomos de vacas que apresentaram RP. Possivelmente, o achado de

Boos, Janssen e Mülling (2003) tenha sido diferente em decorrência da técnica de marcação

utilizada na contagem de células e corpos apoptóticos, uma vez que os autores utilizaram-se da

reação de TUNEL. A reação de TUNEL não deve ser utilizada na quantificação de apoptose, uma

vez que dá muito falso negativo, principalmente em alguns tecidos, tais como a placenta. Martins,

(1999) e Martins, (1999) utilizou a coloração de HE, baseando-se nos aspectos morfológicos de

apoptose, para a quantificação. Além disso, a apoptose foi também investigada via teste

imunoenzimático ELISA e eletroforese de DNA em gel de agarose, corroborando a avaliação

microscópica.

Figura 1. Placenta bovina madura, a termo, com diminuição da celularidade. Apoptose

caracterizada morfologicamente por retração celular, anoiquia (seta vasada), condensação

citoplasmática e nuclear, além de fragmentação nuclear (seta preta) e formação de corpos

apoptóticos (seta branca). Hematoxilina-Eosina, Barra = 10 µm.

Figura 2. Placentite necrotizante brucélica em bovino. Áreas de necrose, com debris

celulares (setas brancas) e infiltrado inflamatório composto predominantemente por

polimorfonucleares (setas negras). O tecido placentário (∗ branco) não evidencia figuras de

apoptose. Hematoxilina-Eosina, Barra = 10 µm.

Figura 3. Representação esquemática do mecanismo proposto para explicar a retenção

placentária em bovinos brucélicos.

Os macrófagos presentes na placenta retida apresentam a mesma distribuição que na

placenta normal, porém sua atividade de fosfatase ácida é reduzida em relação à placenta não retida.

Esses macrófagos poderiam estar desempenhando um papel de células de limpeza dos corpos

apoptóticos na placenta não retida, daí estarem mais ativos. Por outro lado, como a placenta retida

apresenta um número menor de células em apoptose, o grau de atividade dos macrófagos seria

menor (MIYOSHI; SAWAMUKAI; IWAGA, 2002)

Na brucelose, apesar de se verificar placentite necrotizante, é comum a retenção placentária

que acaba por promover metrite e infertilidade. O paradoxo aparente é de como um órgão em

necrose ainda se mantém retido, já que o esperado – pela friabilidade característica dos tecidos em

necrose – era que se desprendesse ainda mais rapidamente. Quando a bactéria do gênero Brucella

infecta o macrófago, ela impede a fusão do fagolisossomo e inibe a secreção de TNF-α e a apoptose

(MARIA-PILAR et al., 2005). Gross et al. (2000) relataram que monócitos humanos infectados por

Brucella suis apresentam superexpressão do gene Al, um membro da família bcl-2 implicado na

sobrevivência de células hematopoiéticas. Evidenciaram ainda que a infecção pela B. suis torna as

células semelhantes a macrófagos resistentes à apoptose induzida por Fas ligante e por IFN-γ,

sugerindo que a infecção pela Brucella protege a célula de vários processos citotóxicos que ocorrem

na resposta imune. Tanto as células infectadas, quanto as não infectadas são protegidas, indicando

haver a participação de mediadores solúveis liberados durante a infecção (GROSS et al., 2000).

Considerando o fato de que a B. abortus infecta e se multiplica no retículo endoplasmático rugoso

do trofoblasto (RAMIREZ-ROMERO, 1998), é possível que esse microorganismo possa estar

inibindo a apoptose e, conseqüentemente, a maturação placentária. Indiretamente, poderia também

haver a inibição da maturação placentária através da liberação de mediadores solúveis pelos

macrófagos infectados e presentes na placenta.

Considerando a importância da apoptose no processo de maturação e liberação placentária

normais, postula-se que a infecção brucélica e a inflamação dela decorrente inibam a via apoptótica.

Consequentemente haveria retardo da maturação e liberação placentárias normais com conseqüente

RP.

Considerações Finais

Propõem-se aqui que a infecção brucélica e a inflamação dela decorrente inibam a

ocorrência de apoptose, levando ao retardo da maturação e da liberação placentárias com sua

conseqüente retenção.

Assim, a retenção de placenta que se desenvolve na brucelose bovina parece se associar à

inibição direta e/ou indireta da apoptose nas células placentárias.

ABSTRACT

Brucellosis is an important disease in public health, causing significant decrease in

productivity of affected bovine flocks and also justifying sanitary barriers in the international

market. Brucella bovis commonly induces abortion, neonatal death, necrotizing placentitis and

retention of placenta in cattle. Since necrotic tissues are usually friable, one should not expect

placenta with necrotizing placentitis to be retained. Apoptosis seems to play an important role in

placental maturation and release. There are some evidences that bacteria of the genus Brucella can

inhibit apoptosis when infecting some specific cells. Brucella abortus infect and multiply in

trophoblastic cells. Placental expulsion at the moment of the birth depends on the decrease in

cellularity and on the occurrence of apoptosis in fetal and maternal placental tissues. It is proposed

here that Brucella abortus, directly or indirectly, can inhibit apoptosis of placental cells e,

consequently, delay the placental maturation. This fact could better explain the retained placenta

usually seen in cattle brucellosis.

Uniterms: Apoptosis, brucellosis, retained placenta

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AMOROSO, E. C. Placentation. In: PARKES, A. S. Marshall’s physiology of reproduction. 3.

ed. London: Longmans Green, 1952. p. 127-311.

BARINAGA, M. Is apoptosis key in Alzheimer’s Disease?. Science, Washington, v. 281, n. 5381,

p. 1303-1304, Aug. 1998.

BARRETO FILHO, J. B.; MARQUES JUNIOR, A. P. Aspectos histológicos da placenta de vacas

zebu. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, v. 45, n. 4, p.

385-393, Ago. 1993.

BJORKMAN, N. Light and electron microscopic studies on cellular alterations in the normal

bovine placentome. Anatomical Record, New York, v. 163, n. 1, p. 17-29, Jan.1969.

BJORKMAN, N. An atlas of placental fine srtucture. London: Baillièri Tindall & Cassel, 1970.

p.96.

BOOS, A.; JANSSEN, V.; MÜLLING, C. Proliferation and apoptosis in bovine placentomes during

pregnancy and around induced and spontaneous parturition as well as in cows retaining the fetal

membranes. Reproduction, Cambridge, v. 126, n. 4, p. 469–480, Oct. 2003.

BORISENKO, G. G.; MAYSURA, T.; LIU, S.; TYURIN, V. A; JIANG, J.; SERINKAN, F. B.;

KAGAM, V. E. Macrophage recognition of externalized phosphatidylserine and phagocytosis of

apoptotic Jurkat cells-existence of a threshold. Archives of biochemistry and biophysics, Orlando,

v. 413, n. 1, p. 41-52, May, 2003.

BORSBERRY, S.; DOBSON, H. Periparturient diseases and their effects on reproductive

performance in five dairy herds. Veterinary Record, London, v. 124, n. 9, p. 217-219, Mar, 1989.

CHEW, B. P.; KELLER, H. F.; ERB, R. E.; MALVEN, P. V. Periparturient concentrations of

prolactin, progesterone and the estrogens in blood plasma of cows retaining and not retaining fetal

membranes. Journal of Animal Science, Savoy, v. 44, n. 6, p. 1055-1060, June. 1977.

CHALLIS, J. R.; LYE, S. J. Parturition. In: KNOBIL, E.; NEILL, J. D. The Physiology of

Reproduction. 2.ed. New York: Raven, 1994, p. 985-1018.

CORBEL, M. J.; STUART, F. A.; BREWER, H. E. Observations on serological cross reaction

between smooth Brucella species and organisms of other genera. Developments in Biological

Standardization, New York, v.56, p. 341-348, 1984.

CORBEL, M. J. Brucellosis: an overview. Emerging Infectious Diseases, Atlanta, v. 3, n. 2, p.

213-221, Apr./June 1997.

CRAWFORD, R. M.; HUBER, J. D.; BRUCE, S. Epidemiology and surveillance. In: NIELSEN,

K.; DUCAN, J. R. (Ed.). Animal brucellosis. Boca Raton: CRC, 1990. p. 131-152.

CURTIS, C. R.; ERB, H. N.; SNIFFER, C. J.; SMITH, R. D.; KRONFELD, D. S. Path analysis of

dry period nutrition, postpartum metabolic and reproductive disorders, and mastitis in holstein

cows. Journal of Dairy Science, Savoy, v. 68, n. 9, p. 2347-2360, Sept. 1985.

EILER, H. Retained placenta. In: YOUNGQUIST, R. S. (Ed.). Current therapy in large animal

theriogenology. Philadelphia: W. B. Saunders, 1997. p. 340-348,.

ERB, H. N.; MARTIN, S. W.; ISON, N.; SWAMINATHAN, S. Interrelationship between

production and reproductive diseases in holstein cows, path analysis. Journal of Dairy Science,

Savoy, v. 64, n. 2, p. 282-289, Feb. 1981.

GOFF, J. P.; HORST, R. L. Physiological changes at parturition and their relationship to metabolic

disorders. Journal of Dairy Science, Savoy, v. 80, n. 7, p. 1260-1268, July 1997.

GROSS, T. S.; WILLIAMS, W. F.; MANSPEACKER, J. E. In vitro placental prostaglandin

synthesis in the late pregnant and peripartum cow. Biology of Reproduction, New York, v. 32, n.

1, p. 154, Feb. 1985.

GROSS, T. S.; WILLIAMS, W. F. Bovine placental prostaglandin synthesis: principal cell

synthesis as modulated by the binucleate cell. Biology Reproduction, New York, v. 38, n. 5, p.

1027-1034, June.1988.

GROSS, T. S.; WILLIAMS, W. F.; MORELAND, T. W. Prevention of the retained fetal membrane

syndrome (retained placenta) during induced calvining in dairy-cattle. Theriogenology, New York

v. 26, n. 3, p. 365-370, Sept.1986.

GROSS, A.; TERRAZA, A.; OUAHRANI-BETTACHE, S.; LIAUTARD, J.; DORNAND, J. In

Vitro Brucella suis Infection Prevents the Programmed Cell Deah of Human Monocytic Cells.

Infection Immunity , Washington, v. 68, n. 1, p. 342-351, Jan., 2000.

GRUNERT, E. Placental separation/retention in the bovine. International Congress on Animal

Reproduction Artificial Insemination ., Illinois, v. 6, n. 11, p. 17-24, June. 1984.

HADLEY, MacE. Endocrinology of pregnancy, parturitions, and lactation. In: HADLEY, MacE.

Endocrinology. 3. ed. New Jersey: Prentice Hall, 1996. p. 444-465.

HAFEZ, E. S. E.; JAINUDEEN, M. R. Gestação, fisiologia pré-natal e parto. In: HAFEZ, E.S.E.

Reprodução Animal. 6. ed. São Paulo: Manole, 1995. p. 217-240.

HOFFMANN, D.; WAGNER, W. C.; HIXON, J. G.; BAHR, J. Observations concerning the

functional status of the corpus luteum and the placenta around parturition in de cow. Animal

Reproduction Science, Amsterdam, v. 2, n. 1/3, p. 253-266, June 1979.

HOLM, L. W.; SALVATORE, C.; ZEEK-MINING, P. The histology of the post term bovine

placenta. American Journal of Obstetrics and Gynecology, St. Louis, v. 88, n. 4, p. 479-489,

Feb. 1964.

HUNTER, J. T.; FAIRCLOUGH, R. J.; PETERSON, A. J.; WELCH, R. A. S. Fetal and maternal

hormonal changes preceding normal bovine parturition. Acta Endocrinologica, Oslo, v. 84, n.3, p.

653-662, Mar. 1977.

JAINUDEEN, M. R.; HAFEZ, E. S. E. Gestation, prenatal physiology, and parturition. In: HAFEZ,

E. S. E. (Ed.). Reproduction in farm animals, 6. ed. Philadelphia: Lea & Febiger, 1993. p. 213-

236.

JEFFREY, J. J.; EHLICH, L. S.; ROSWIT, W. T. Serotonin: an inducer of collagenase in

myometrial smooth muscle cells. Journal of Cellular Physiology, New York, v. 146, n. 3, p. 399-

406, Mar. 1991.

KERR, J. F. R.; WYLLIE, A. H.; CURRIE, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with

wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer, Edinburgh, v. 26, n. 4, p.

239-257, Aug. 1972

KING, G. J.; ATKINSON, B. A.; ROBERTSON, H. A. Implantation and early placentation in

domestic ungulates. Journal of Reproduction and Fertility, Cambrigde, v. 31, p. 17-30, Nov.

1982. Supplement.

KORDTS, E.; JOCHLE, W. Induced parturition in dairy cattle: a comparison of a corticoid

(flumethasone) and prostaglandin (PGF2α) in different age groups. Theriogenology, New York, v.

3, n. 4, p. 171-178, Apr. 1975.

LAVEN, R.A.; PETERS, A.R. Bovine retained placenta: aetiology, pathogenesis and economic

loss. Veterinary Record, London, v.139, n. 19, p.465-471, Nov. 1996.

LEWING, F. J.; PROULX, J.; MAPLETOFT, R. J. Induction of parturition in the cow using

cloprostenol and dexamethasone in combination. Canadian Veterinary Journal, Otawa, v. 26, n.

10, p. 317-322, 1985.

LINDELL, J. O.; KINDAHL, H.; EDQVIST, L. E. Prostaglandin release at dexamethasone induced

parturitions in cows. Acta Veterinaria Scandinavica, Vanlose, v. 18, n. 2, p. 257-265, 1977

MALARD, P. F.; BARRETO FILHO, J. B.; SANTOS, R. L.; MARQUES JUNIOR, A. P.

Proporção volumétrica dos componentes estruturais da placenta de vacas zebu ao longo da gestação.

Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, v. 48, n. 5, p. 553-558,

Out. 1996.

MARIA-PILAR, J. B.; DUDAL, S.; DORNAND, J.; GROSS, A. Cellular bioterrorism: how

Brucella corrupts macrophage physiology to promote invasion and proliferation. Clinical

Immunology, Orlando, v.114, n. 3, p.227–238, Mar. 2005.

MARQUES JÚNIOR, A. P.; BARRETO FILHO, J. B.; SATURNINO, H. M. Aspectos

morfométricos da placenta de vacas zebu (Bos taurus indicus). Arquivo Brasileiro de Medicina

Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, v. 45, n. 2, p. 213-219, Abr. 1993.

MARQUES JÚNIOR, A. P. Leucocyte chemotaxis activity by cotiledons of dairy cows with

normal delivery and retained placenta. 1988. 182 f. Thesis (PhD in Pathology) – Postgraduate

Program in Veterinary Science ,University of Ilinois, Urbana, 1988.

MARTINS, E. Apoptose na maturação e eliminação placentária em Bos taurus taurus. 1999.

134 f. Tese (Doutorado em Reprodução Animal) - Curso de Pós-Graduação em Ciência Animal,

Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 1999.

MARTINS, V.M.V. Maturação e expulsão placentária em Bos taurus taurus e Bos taurus

indicus. 1999. 110 f. Tese (Doutorado em Reprodução Animal) - Curso de Pós-Graduação em

Ciência Animal, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 1999.

MARTINS, V.M.V.; MARQUES JÚNIOR, A. P.; VASCONCELOS, A. C.; MARTINS, E.;

SANTOS, R. L.; LIMA, F. P. C. Maturação e expulsão placentária em vacas das raças Holandesa e

Nelore. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, v. 56, n. 2, p.

157-167, Abr. 2004.

MIYOSHI, M.; SAWAMUKAI, Y.; IWAGA, T. Reduced Phagacytotic Activity of Macrophages in

the Bovine Retained Placenta. Reproduction in Domestic Animal, Berlin, v. 37, n. 1, p. 53-56,

Feb. 2002.

McDIARMID, S. C. Induction of parturition in cattle using corticosteroid: a review. Part I. Reasons

for induction, mechanisms of induction and preparations used. Animal Breeding Abstracts,

Budapest, v. 51, n. 6, p. 404-419, June 1983.

MILLER, L. J.; MARX, J. Apoptosis. Science, Washington, v. 281, n. 5381, p. 1301, Aug. 1998.

NUNES, J. E. S.; VASCONCELOS, A. C.; MARTINS, E.; MARTINS, V. M. V.; MARQUES-

JÚNIOR, A. P. Apoptose em placentomos de zebuínos (Bos taurus indicus) e o processo de

maturação e liberação placentária. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE VETERINÁRIA, 27.,

CONGRESSO PAULISTA DE VETERINÁRIA, 5., CONFERÊNCIA ANUAL DA SPMV, 55.,

2000, Águas de Lindóia. Resumos... Águas de Lindóia: Sociedade Brasileira de Medicina

Veterinária, 2000a.

NUNES, J.E.S.; VASCONCELOS, A.C.; MARTINS, E.; MARTINS, V.M.V.; MARQUES-

JÚNIOR, A.P. Maturação e eliminação placentária em Bos taurus taurus e apoptose. In:

CONGRESSO BRASILEIRO DE VETERINÁRIA, 27., CONGRESSO PAULISTA DE

VETERINÁRIA, 5., CONFERÊNCIA ANUAL DA SPMV, 55., 2000 Águas de Lindóia,

Resumos... Águas de Lindóia: Sociedade Brasileira de Medicina Veterinária, 2000b.

NUNES, J. E. S.; VASCONCELOS, A. C.; MARTINS, E.; MARTINS, V.M.V.; MARQUES

JUNIOR, A. P. Maturação e liberação placentária em bovinos e a sua relação com apoptose.

Revista Brasileira de Reprodução Animal, Belo Horizonte, v. 25, n. 4, p 513-525, Out./Dez.

2001.

PAISLEY, L. C., MICKELSEN, W. D., ANDERSON, P. B. Mechanism and therapy for retained

fetal membranes and uterine infections of cows: a review. Theriogenology, New York, v. 25, n. 3,

p. 353–381, Mar. 1986.

POESTER, F. P.; GONÇALVES. V. S. P.; PEREIRA, L. A. Brucellosis in Brazil. Veterinary

Microbiology , Amsterdam, v. 90, n.1-4, p. 55-62, Dec. 2002.

PUTRO, P. P. Effects of intrauterine dilute iodine solution infusion on the incidence of retained

placenta and endometritis in dairy cows. Acta Veterinaria Scandinavica, Vanlose, v. 83, p. 58-65,

1988. Supplement.

RAMIREZ-ROMERO, R. Is Brucella abortus a facultative intracellular pathogen with

mitochondria-like activity? Medical Hypotheses, Edinburgh, v. 51, n. 1, p. 41-5. July 1998.

RAMSEY, E. M. The placenta - human and animal. New York: Praeger 1982.

SAMAD, M. A.; RAHMAN, M. H.; ISLAM, T. S. Factors associated with placental retention in

dairy cattle. Indian Journal of Dairy Science, New Delhi, v. 42, n. 4, p. 720-723, Dec. 1989.

SANTOS, R. L. Estudo morfológico da placenta de vacas leiteiras com liberação normal e com

retenção. 1995. 102 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Curso de Pós-Graduação em

Medicina Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 1995.

SANTOS, R. L.; MARQUES JUNIOR, A. P. Estudos histoquantitativos do placentomo de vacas

leiteiras com liberação normal e com retenção. Veterinária Notícias, Uberlândia, v. 4, n. 1, p. 39-

42, 1998.

SANTOS, R. L.; MARQUES JUNIOR, A. P.; BARRETO FILHO, J. B. Morphometric analysis of

collagen in placentomes of dairy cows with normal delivery and with placental retention. Brazilian

Journal of Veterinary Research Animal Science, Seropedica, v.34, n.3, p. 240-242, May/June

1997.

SCHAFLER, D.H., FISHER, P.J., DAVIES, C.J. The bovine placenta before and after birth:

placental development and function in health and disease. Animal Reproduction Science,

Amsterdam, v. 60, p. 145-160, July. 2000. Special Issue.

SMITH, L. D.; FICHT, T. A. Pathogenesis of Brucella. Critical Reviews Microbiology, Boca

Raton, v. 17, n. 3, p. 209-230, 1990.

SMITH, S. C.; BAKER, P. N.; SYMONDS, E. M. Placental apoptosis in normal human pregnancy.

American Journal of Obstetrics and Gynecology, St. Louis, v. 177, n. 1, p.57-65, July, 1997.

STEVEN, D. H. Anatomy of the placental barrier. In: STEVEN, D. H. (Ed.). Comparative

placentation. London: Academic, p. 25-57, 1975.

STEVEN, D. H., MORRIS, G. Development of the foetal membranes. In: STEVEN, D. H. (Ed.).

Comparative placentation. London: Academic, p. 58-86, 1975.

VAN WERVEN, T.; SCHUKKEN, Y. H.; LLOYD, J.; BRAND, A.; HEERINGA, H. Tj.; SHEA,

M. The effects of duration of retained placenta on reproduction, milk production, postpartum

disease and culling rate. Theriogenology, New York, v. 37, n. 6, p. 1191-1203, June 1992.

VASCONCELOS, A. C. Apoptose ou morte celular programada e sua importância em patologia

Veterinária. In: ENCONTRO NACIONAL DE PATOLOGIA VETERINÁRIA, 7., 1995. Belo

Horizonte. Anais... Belo Horizonte: Editora da Fundação de Estudo e Pesquisa em Medicina

Veterinária e Zootecnia, 1995. p. 69.

WANGO, E. O.; HEAP, R. B.; WOODING, F. B. P.; Regulation of steroid synthesis and

metabolism in isolated binucleate cells of the placenta in sheep and goats. Journal of

Reproduction and Fertility, Cambrigde, v. 94, n. 1, p. 203–211, Jan. 1992.

WOHRL, W., HÄCKER, G. Extent and limitation of the control of nuclear apoptosis by DNA-

fragmenting factor. Biochemical Biophysical Research Communicatinos., v. 254, n. 3, p. 552-

558, Jan. 1999.

WOICKE, J.; SCHOON, H. A.; HEUWIESER, W.; SCHULZ, L. C.; GRUNERT, E.

Morphological and functional aspects of placental maturation mechanisms in the cow. I. Light

microscopy. Zentralblatt Fuer Veterinaermedizin Reihe A, Berlin, v. 33, n. 9, p. 660–667, Nov.,

1986.

WOODING, F. B. P. Current topic: the synepitheliochorial placenta of ruminants: binucleate cell

fusions and hormone production. Placenta, London, v. 13, n. 2, p. 101-113, Mar./Apr. 1992.

WYLLIE, A. H. Glucocorticoid induced thymocyte apoptosis in associated with endogenous

endonuclease activation. Nature, London, v. 284, n. 5756, p. 555-556, Apr. 1980

WYLLIE, A. H.; KERR, J. F. R.; CURRIE, A. R. Cell death: the significance of apoptosis.

International Review of Cytology, San Diego, v. 68, p. 251-305. 1980.

CAPÍTULO 2

APOPTOSIS AND PLACENTAL MATURATION IN CATTLE WITH BRUCELLOSIS

APOPTOSIS AND PLACENTAL MATURATION IN CATTLE BRUCELLOSIS

Karina Kelly de Oliveira Luquesi MEÇA;

Anilton Cesar VASCONCELO;

Luciana MORO;

Fernando Padilla POESTER;

Renato Lima SANTOS;

Andrey Pereira LAGE;

Tatiana Alves da PAIXÃO

Laboratory of Apoptosis, Department of General Pathology, Institute of Biological Sciences,

Federal University of Minas Gerais, Postal Box 2486 - 31270-010 – Belo Horizonte, MG. BRAZIL,

Phone: +5531 3499 2887 (KKOLM, ACV, LM)

School of Veterinary, Federal University of Minas Gerais, 31270-010 – Belo Horizonte, MG.

BRAZIL (RLS; APL; TAP)

(Apoptosis in brucellic placentitis...)

Corresponding author: Anilton C. Vasconcelos Laboratory of Apoptosis, Department of General

Pathology, Institute of Biological Sciences, Federal University of Minas Gerais, Postal Box 2486 -

31270-010 – Belo Horizonte, MG. BRAZIL, Phone: +5531 3499 2887, FAX: +5531 3499 2879,

Email: [email protected]

APOPTOSIS AND PLACENTAL MATURATION IN CATTLE BRUCELLOSIS

(Apoptosis in brucellic placentitis...)

Abstract

Placentomes of 20 puerperal cows were studied in a double blind assay, distributed (n=5/group) in

four groups: Group NC (non vaccinated healthy cows); Group B - (B-19 vaccinated cows

challenged with Brucella abortus with normal gestation and negative bacteriology at parturition),

Group B+ (vaccinated and challenged with no abortion and positive bacteriology) and Group B++

(vaccinated and challenged with abortion and positive bacteriology). Placentome samples were

analyzed to quantify inflammatory infiltrate, necrosis and apoptosis. Apoptotic index was higher in

group NC (54,70±7,78) than in challenged animals (P<0,0001). In infected animals, apoptosis was

more intense in group B- (47,21±7,88), intermediate in B+ (42,98±9,33) and smaller in B++

(38,20±7,86). No inflammation neither necrosis were detected in Group NC. Inflammatory

infiltrates were more intense in Group B++ (22,28±6,27), decreasing in B+ (7,65±5,28) being

minimal in B- (1,61±3,32). Necrosis was also more intense in Group B++ (35,43±13,11) than in B+

(7,44±2,22) and B- (0,50±0,94). Absence of difference in necrosis between B- and B+ indicates that

the isolation of the Brucella abortus presents low previtive value. Pearson´s test showed a negative

correlation between inflammatory infiltrate and apoptotic index (r=-0,7404) and between necrotic

area and apoptotic index (r=-0,7528). The more intense the inflammatory and necrotic area in

placenta, the smaller the apoptotic index and the placental maturation. Thus, brucellic infection and

consequent inflammation and necrosis seem to delay placental maturation. These data may help

explaining the placental retention, usually seen in bovine brucellosis.

Key Words: Apoptosis, Bovine, Brucella, Placenta

Introduction

Brucellosis is a worldwide human zoonosis caused by intracellular gram-negative bacteria of

the genus Brucella. Virulence factors play an important role in allowing Brucella infection and

proliferation within macrophages 24. Brucella enters macrophages through lipid raft microdomains,

avoids phagolysosome fusion, and inhibits TNF-alpha secretion and apoptosis 8,19. Both invaded

and noninvaded cells were protected, indicating that soluble mediators released during infection

were involved in the phenomenon 13.

In cattle, Brucella bovis causes a genital disease manifested in males by orchitis and

epididymitis and lymphadenitis, and in females abortion, neonatal death, necrotizing placentitis, and

retention of placenta with reduced fertility in the flock 1. Since necrotic tissues are usually friable,

one should not expect placenta with necrotizing placentitis to be retained.

Apoptosis seems to play an important role in placental maturation and release 3, 4, 20, 32.

There are some evidences that bacteria of the genus Brucella can inhibit apoptosis when infecting

some specific cells 8, 19 . Brucella abortus infect and multiply in trophoblastic cells. Placental

expulsion at the moment of the birth depends on the decrease in cellularity and on the occurrence of

apoptosis in fetal and maternal placental tissues 3, 4, 20, 32 . It is proposed here that Brucella abortus,

directly or indirectly, can inhibit apoptosis of placental cells and, consequently, delay the placental

maturation. This fact could better explain the retained placenta usually seen in cattle with

brucellosis.

The aim of this paper is to evaluate the occurrence of apoptosis, inflammation and necrosis

in placentomes of cows infected or not with Brucella abortus, and correlate the findings in a way to

detect an eventual association between brucelic infection, placentitis, delay in placental maturation

and aborption.

Material and Methods

Samples

Placentomes of 20 puerperal cows were studied in a double blind assay, distributed

(n=5/group) in four groups: Group NC (non vaccinated healthy cows); Group B - (B-19 vaccinated

cows challenged with Brucella abortus with normal gestation and negative bacteriology at

parturition), Group B+ (B-19 vaccinated cows challenged with Brucella abortus with no abortion

and positive bacteriology at parturition) and Group B++ (B-19 vaccinated cows challenged with

Brucella abortus with abortion and positive bacteriology). Most of these 20 cows were crossbred,

young and primipara. Placentome sampling was performed imediately after fetal expulsion. One

placentome was collected from the distal region of the uterus, acording to technique previously

described 20 . From each collected placentome, three fragments were removed for light microscopy

and fixed by immersion in Bouin solution for 24 hours after what they were immersed in 70%

methanol. Placentome samples were processed reoutinely for histology. Slides with 4µm thick

sections were stained with hematoxylin–eosin and others were submitted to TUNEL reaction (in situ

detection of DNA fragmentation).

In situ detection of DNA fragmentation

The TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated-UTP nick end-labelling)

technique was applied for detection of in situ genome fragmentation, using a commercial Oncogene

kit (Cat # QIA33, Oncogene Research Products, Cambridge, MA, USA). Reactions were carried out

as described by the manufacturer. Briefly, slides were incubated with 20µg/ml of proteinase K (Cat

# P5568, Sigma, St. Louis, MO, USA) and endogenous peroxidase was quenched three times with

3% H2O2 in methanol. TdT and deoxynucleotides were applied and slides were placed in humid

atmospere at 37º C for about 2-6 hours. The reaction was stopped by a blocking buffer, and then

slides were treated with peroxidase streptavidin conjugate, placed in humid atmospere at 37º C for

0,5-1 hours. Finally they were washed and treated with diaminobenzidine and counterstained with

light green or Harris Hematoxiline.

Morphometrical and Statistical analysis

All morphometric evaluations were done in a double blind assay by the same observer, using

a specific software (Kontron KS300, v. 2.0). Morphometry of the areas of inflammatory infiltrates

and necrosis within the placentomes were performed with images obtained from a 10x

planapochromatic objective. Infiltrates and necrotic debris were surrounded and quantified.

The Inflammatory Index was obtained by following fórmula:

Inflammatory Index (II) = (Σ areas of inflammation/ total area of the field) x 100

The necrotic Index was obtained by following fórmula:

Necrotic Index (NI) = (Σ areas of necrosis/ total area of the field) x 100

Morphometry of the apoptotic cells within the placentomes were performed with images

obtained from a 40x planapochromatic objective. Apoptotic cells were counted considering

morphological characteristics of apoptosis in HE sections and TUNEL labeling. Cells were

considered apoptotic only when showing at least three of the following criteria: 1). Anoikia (cellular

retraction and loss of adhesions between cells and matrix); 2). Condensation of the cytoplasm; 3).

Nuclear condensation (nuclear chromatin dense, sometimes lined up in the nuclear membrane, with

a “crescent” pattern); 4). Nuclear fragmentation; 5). Formation of apoptotic bodies.

The Apoptotic Index was obtained by following fórmula:

Apoptotic Index (AI) = (Σ Apoptotic cells /Σ Total cells) x 100

A cut-off value of the minimal representative number of microscopical fields was

established to perform the morphometry, as described elsewhere 24 . The number of microscopical

fields was considered representative when increase in the sampling size did not result in

considerable decrease in the value of the variation coefficient. By using this approach, ten

microscopical fields per slide were used to quantify areas of inflammation, of necrosis and the

apoptotic index.

An entirely random experimental design was used in a double blind essay. Morphometric

data were submitted to one-way analysis of variance and the averages of each treatment were

contrasted by Newman-Keuls Multiple Comparison Test. Results were expressed as mean ±

standard error of the mean. Averages of the Apoptotic Indices of each animal were correlated with

the other parameters (inflammatory and necrotic indices) and a linear regression was also used to

obtain graphs showing the association of Apoptotic and Inflammatory Indices and of Apoptotic and

Necrotic Indices. All statistical analyses were performed using GraphPad Prism version 3.0

software.

Results

Apoptosis was easily recognized in most of the microscopical fields and in all processed

samples. Even in HE-stained sections of groups NC and B-, images of cellular retraction with loss

of adhesions between cells, cytoplasmic and nuclear condensation, nuclear fragmentation and

formation of apoptotic bodies were evident. Placentomes of non vaccinated healthy puerperal cows

(Group NC) usually showed decreased cellularity of the trophoblasts of the cotiledonary villi with

no inflammatory infiltrate neither necrosis. Evident maternofetal spaces suggested well-matured

placenta. Also, there were intense and diffuse TUNEL-positive labeling showing genome

fragmentation in cells with morphological evidence of apoptosis (Fig. 1).

Placentomes of B-19 vaccinated cows challenged with Brucella abortus with normal

gestation and negative bacteriology at parturition (Group B -) had less decreased cellularity of the

trophoblasts in the cotiledonary villi. Inflammatory infiltrate and necrosis were absent or minimal,

and only evident in a few slides. Maternofetal spaces were still evident, supporting that placentas

were all well-matured. Less intense TUNEL-positive labeling but still diffuse and evident indicated

that apoptosis occurred in all samples of that group.

Placentomes from B-19 vaccinated cows challenged with Brucella abortus with no abortion

and positive bacteriology at parturition (Group B+) and from B-19 vaccinated cows challenged with

Brucella abortus with abortion and positive bacteriology (Group B++) showed higher cellularity of

the trophoblasts of the cotiledonary villi and of the syncityal epithelium of the maternal cripts.

Maternofetal spaces were less evident, sometimes filled with necrotic debris and inflammatory

cells. Underlining mesenchyma usually showed stronger leukocyte infiltrate and necrosis than

groups control and B-. By and large, placentas of groups B+ and B++ gave the impression of being

less mature than those of other groups. TUNEL-positive labeling and morphological evidence of

apoptosis were decreased when compared to groups controls and B-. TUNEL labeling patterns of

groups NC and B++ are showed on Fig. 1 and 2, respectively.

The apoptotic index was higher in group NC (54,70± 7,78) than in challenged animals

(P<0,0001). In infected animals, apoptosis was more intense in group B- (47,21± 7,88),

intermediate in B+ (42,98± 9,33) and smaller in B++ (38,20± 7,86) (Fig. 3).

Placental lesions were present in all infected cows, but no significant inflammation neither

necrosis were detected in Group NC (Fig. 4). Placentomes from cows of groups B-, B+ and B++

showed a suppurative necrotizing placentitis sometimes associated with bacterial clusters. When

present, maternofetal spaces were filled with necrotic debris and inflammatory cells. Neutrophils

and mononuclear cells were predominant. Underlining mesenchyma usually showed stronger

leukocyte infiltrate and necrosis than groups control and B-. Inflammatory infiltrates were more

intense in Group B++ (22,28± 6,27), decreasing in B+ (7,65± 5,28) being minimal in B- (1,61±

3,32) (Fig. 6). Morphological evidence of the inflammatory infiltrates within the placentomes of a

B++ cow is showed on Fig. 5.

Areas of necrosis were easily identified and quantified by morphometry. Cellular debris,

pyknosis, karyorrhexis, karyolysis and absence of nuclei were considered evident signs of necrosis

during morphometry. Similarly to inflammatory indice, necrosis was also more intense in Group

B++ (35,43± 13,11) than in B+ (7,44± 2,22) and B- (0,50± 0,94) (Fig. 8), and absent in Group NC.

Morphological evidence of the necrotic foci within the placentomes of a B++ cow are showed on

Fig. 7.

Pearson´s test showed a negative correlation between inflammatory infiltrate and apoptotic

index (r= -0,7404) (Fig. 9) and necrotic area and apoptotic index (r=-0,7528) (Fig.10). Linear

regression graphs were plotted to show the inverse relationship.

Discussion

In this study, apoptosis was more intense in group NC than in Brucella challenged animals

(P<0,0001). Placental growth, resizing and maturation involving both cellular proliferation and

apoptosis have an important role in placental function 4 . Physiologically, apoptosis allows the

elimination of unnecessary cells in order to keep tissular homeostasis 36 . Apoptosis is important in

placental remodelling, in order to keep an adequated ratio of tissular components during pregnancy

32 . Apoptosis occurs in all types of cells in human placenta, increasing significantly at the final third

of pregnancy 4, 32 . In cows, apoptosis has an important role in placental maturation and release.

Placental detachment and expulsion at the moment of the birth depends on the decrease in

cellularity and on the occurrence of apoptosis in fetal and maternal placental tissues 3, 5, 17, 18, 20, 27, 30,

31, 32. Apoptotic cells were more frequent in placentomos of cows with normal parturition and

placental release than in placentomes of cows with retained placenta 20, 27 . Cows with placental

retention usually show an increase in maternal epitelial cells 31 . Even though macrophages showed

the same distribution in both retained and released placenta, the acid phosphatase activity is

decreased in retained placenta 22 . Higher acid phosphatase activity in released placenta may be

associated with higher phagocytic activity 22 and apoptotic bodies removal in non retained placenta.

Therefore, it seems to be acceptable that placenta from cows of group NC could be considered more

mature than those of Brucella challenged animals.

In this paper apoptosis was quantified using morphological criteria and TUNEL labelling.

Labelled cells in TUNEL slides occurred mostly at the same regions as in sections stained with HE.

Also, most of the labelled cells showed morphological characteristics of apoptosis. Few cells with

morphology of apoptosis were not labelled as described elsewhere 29 . TUNEL reaction is a

technique that allows the in situ detection of DNA fragmentation, which happens in apoptosis 10, 12

but also in necrosis and autolysis 2, 16, 23, 25, 26 . The enzyme terminal deoxynucleotidyl transferase

does not discriminate the type of genomic fragmentation, either internucleosomal (apoptosis) or

randomic (necrosis and/or autolysis) therefore false positive with necrosis is expected 21 . Despite

this fact, it is a well-accepted laboratorial approach to apoptosis although may present some

problems with sensibility and specificity 16 . Protein crosslinking due to fixation process can

decrease sensibility of TUNEL reaction 12 . Sensibility of TUNEL reaction should always be

evaluated using morphological criteria to confirm apoptosis on light microscopy 26 . Apoptotic cells

show cellular and nuclear shrinkage, chromatin condensation and celular and nuclear fragmentation,

and that these morphological features are consistent enough to define apoptotic cell death on

histological sections 14, 15, 23 .

In Brucella challenged animals, apoptosis decreased from group B- to B+ and was smaller in

B++. Brucellosis is an important disease of cattle and causes several reproductive problems with

abortion, neonatal death, retention of placenta and reduced fertility in the flock 6 . Several in vitro

studies have showed Brucella s abillity to inhibit apoptosis, preventing its host cell elimination and

permitting intracellular survival of the bacterium 7, 8, 9, 13, 19, 35, 36 . Apoptosis can be a host protective

mechanism against intracellular bacteria, therefore inhibiting apoptosis may promote intracellular

survival of Brucella 35, 36 . When Brucella infects macrophages, it impairs the fusion of

fagolysossome and inhibit the secretion of TNF-α and concomitantly inhibits apoptosis 18 .

Interestingly, both invaded and noninvaded monocytes were protected from apoptosis, indicating

that soluble mediators released during infection were involved in the phenomena 13 . Brucella seems

to modulate the monocyte/macrophage's apoptotic response to the advantage of the pathogen 13, 34 .

During the early phase of infection, lymphocytes and monocytes of naturally infected animals show

a delay of apoptosis in vitro compared to the same cells coming from healthy controls and

vaccinated animals 9, 34 . B. abortus can alter macrophage pathways to recruit additional

macrophages for future infection while simultaneously inhibiting apoptosis and innate immune

mechanisms within the macrophage 8 . Despite all these in vitro evidences of Brucella inhibiting

apoptosis, so far no one has shown the direct in vivo involvement of apoptosis in brucellic

necrotizing placentitis. Inhibition of apoptosis and consequently a delay in placental maturation

may be a mechanism of placental retention in brucellic infection. Since necrotic tissues are usually

friable, one should not expect placenta with necrotizing placentitis to be retained.

No inflammation neither necrosis were detected in Group NC. Inflammatory infiltrates were

more intense in Group B++, decreasing in B+, being minimal in B-. Quite similar to inflammatory

indice, necrosis were also more intense in Group B++ than in B+ and B-. Microscopically, there

was a moderate, sometimes severe, multifocal, lymphocytic and histiocytic, necrosuppurative

placentitis with marked loss of trophoblastic epithelial cells. The superficial chorioallantoic stroma

contained abundant necrotic debris as well as numerous swollen capillaries protruding multifocally

from the denuded surface. These findings were similar to previous studies 1, 11, 28, 33 . Trophoblast

necrosis and ulceration of chorioallantoic membranes are common findings in brucellosis.

Placentomal trophoblasts become separated from maternal syncytial epithelium and when lining

chorionic villi were separated from B. abortus by intact basement membranes 1 . The tips of

maternal septa had a lymphoplasmacytic infiltrate with small multifocal erosions and ulcerations of

maternal epithelium 28 .

In this paper results of a morphometrical approach to apoptosis, necrosis and inflammation

in control and in infected placenta shows that Brucella abortus, directly or indirectly, can inhibit

apoptosis of placental cells and, consequently, delay the placental maturation. This fact could better

explain the retained placenta usually seen in cattle with brucellosis. Abscence of difference in

necrosis between B- and B+ indicates that the isolation and identification of the Brucella abortus

presents low preventive value in relation to the injuries. Pearson´s test showed a negative

correlation between inflammatory infiltrate and apoptotic index and between necrotic area and

apoptotic index. Therefore, apoptosis is decreased in placentome when inflammation and necrosis

are occurring as a consequence of Brucella abortus infection. Decrease in apoptosis is related to

delay in placental maturation, which may help explaining placental retention in Brucellosis.

Conclusion

Apoptosis play a role in placental maturation, decreasing cellularity previously to parturition,

preparing the detachment of the organ after birth.

Brucellic infection causes necrosis and inflammation in placentomes and also somehow decreases

the occurrence of apoptosis, delaying placental maturation.

Acknowledgements

Funds in support of this work have been provided by FAPEMIG (CDS 1216/95) and CNPq

(Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico). KKOL Meça was the recipient

of master´s program grant. The authors thank Santiago Oliva, for technical assistance and support.

Correspondence and reprint requests: Laboratório de Apoptose, Departamento de Patologia Geral,

Instituto de Ciências Biológicas da UFMG Caixa Postal 2486, Belo Horizonte, MG Brazil - E-mail:

[email protected]

References

1. Anderson TD, Cheville NF. Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected

trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic

reticulum. Am J Pathol 124: 226-37, 1986

2. Ansari B, Coates BD, Greenstein BD, Hall PA. In situ end labelling detects DNA strand breaks

in apoptosis and in other physiological and pathological states. J Pathol 170: 1-8, 1993

3. Barreto Filho JB, Marques Junior AP. Histological aspects of the placenta of zebu cows. Arq

Bras Med Vet Zootec 45: 385-393, 1993

4. Boos A, Janssen V, Mülling C. Proliferation and apoptosis in bovine placentomes during

pregnancy and around induced and spontaneous parturition as well as in cows retaining the fetal

membranes. Reproduct 126: 469–480, 2003

5. Cirelli N, Moens A, Lebrun P, Gueuning C, Delogne-Desnoeck J, Vanbellinghen AM, Meuris

S. Apoptosis in human term placenta is not increased during labour but can be massively

induced in vitro. Biol Reprod 61: 458-463, 1999

6. Corbel MJ. Brucellosis: an overview. Emerg Infect Dis 3: 213-221, 1997

7. Dornand J, Gross A, Lafont V, Liautard J, Oliaro J, Liautard JP. The innate immune response

against Brucella in humans. Vet Microbiol 90: 383-94, 2002

8. Eskra L, Mathison A, Splitter G. Microarray analysis of mRNA levels from RAW264.7

macrophages infected with Brucella abortus. Infect Immun 71: 1125-33, 2003

9. Galdiero E, Romano Carratelli C, Vitiello M, Nuzzo I, Del Vecchio E, Bentivoglio C, Perillo G,

Galdiero F. HSP and apoptosis in leukocytes from infected or vaccinated animals by Brucella

abortus. New Microbiol 23: 271, 2000

10. Gavrieli Y; Sherman Y, Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via

specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol 119:.493-501, 1992

11. Gidlewski T, Cheville NF, Rhyan JC, Miller LD, Gilsdorf MJ. Experimental Brucella abortus

induced abortion in a llama: pathologic effects. Vet Pathol 37: 77-82, 2000

12. Gold R, Schmied M, Breitschopf H, Tokyka KV, Lassmann H. Differentiation between cellular

apoptosis and necrosis by the combined use of in situ tailing and nick translation techniques.

Lab. Invest 71:219-227, 1994

13. Gross A, Terraza A, Ouahrani-Bettache S, Liautard J, Dornand J. In vitro Brucella suis

infection prevents the programmed cell death of human monocytic cells. Infect Immun 68: 342-

51, 2000

14. Hacker G. The morphology of apoptosis. Cell Tissue Res 301: 5-17, 2000

15. Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging

implications in tissue kinetics. Brit J Cancer 26: 239-257, 1972

16. Labat-Moleur F, Guillermet C, Lorimier P, Robert C, Lantuejoul S, Brambilla E, Negoescu A.

TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement. J

Histochem Cytochem 46: 327-334, 1998

17. Lea RG, Al-Sharekh N, Tulppala M, Critchley HOD. The immunolocalization of bcl-2 at the

maternal-fetal interface in healthy and pregnancies. Hum Reprod 12: 153-158, 1997

18. Malard PF, Barreto Filho JB, Santos RL, Marques Junior AP. Volumetric proportion of the

structural components of the placenta of zebu cows during pregnancy. Arq Bras Med Vet

Zootec 48: 553-558, 1996

19. Maria-Pilar JB, Dudal S, Dornand J, Gross A. Cellular bioterrorism: how Brucella corrupts

macrophage physiology to promote invasion and proliferation. Clin Immunol 114: 227-38, 2005

20. Martins VMV, Marques Jr AP, Vasconcelos AC, Martins E, Santos RL, Lima FCL Placental

maturation and expulsion in Holstein and Nelore cows. Arq Bras Med Vet Zootec. 56: 157-167,

2004

21. Mesner Jr PW, Kaufmann SH. Methods utilized in the study of apoptosis. Adv Pharmacol 41:

57-87, 1997

22. Miyoshi M, Sawamukai Y, Iwaga T. Reduced Phagacytotic Activity of Macrophages in the

Bovine Retained Placenta. Reprod Dom Anim 37: 53-56, 2002

23. Moffitt P. A methyl green-pyronin technique for demonstrating cell death in the murine tumour

S180. Cell Biol Intern. 18: 677-679, 1994

24. Moro L, Vasconcelos AC, Santos FGA, Alves CM, Nunes JES, Sampaio IBM. Determination

of the minimal representative number of microscopic fields to quantify apoptosis in canine

lymph nodes. Arq Bras Med Vet Zootec 56: 408-410, 2004

25. Mundle SD, Raza A. The two in situ techniques do not differentiate between apoptosis and

necrosis but rather reveal distinct patterns of DNA fragmentation in apoptosis. Lab Inv 72: 611-

613, 1995

26. Negoescu A, Lorrimier P, Labat-Moleur F, Drouet C, Robert C, Guillermet C, Brambilla C,

Brambilla E. In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation

on cell preparations. J Histochem Cytochem 44: 959-968, 1996

27. Nunes JES, Vasconcelos AC, Martins E, Martins VMV, Marques Jr AP. Placental maturation

and release in cattle and its relationship with apoptosis. Rev Bras Reprod Animal 25: 513-525,

2001

28. Palmer MV, Cheville NF, Jensen AE. Experimental infection of pregnant cattle with the vaccine

candidate Brucella abortus strain RB51: pathologic, bacteriologic, and serologic findings. Vet

Pathol 33: 682-91, 1996

29. Sanders EJ, Wride MA. Ultrastructural identification of apoptotic nuclei using the TUNEL

technique. Histochem J 28: 275-281, 1996

30. Santos RL, Marques Jr AP, Barreto Filho JB. Morphometric analysis of collagen in placentomes

of dairy cows with normal delivery and with placental retention. Braz J Vet Res Animal Sci 34:

240-242, 1997

31. Santos RL, Marques Jr AP. Histoquantitative studies of the placentomos of milking cows with

placental release and retention. Vet Noticias 4: 39-42, 1998

32. Smith SC, Baker PN, Symonds EM. Placental apoptosis in normal human pregnancy. Am J

Obstetr Gynecol 177: 57-65, 1997

33. Tobias L, Schurig GG, Cordes DO. Comparative behaviour of Brucella abortus strains 19 and

RB51 in the pregnant mouse. Res Vet Sci 53: 179-183, 1992

34. Tolomeo M, Di Carlo P., Abbadessa V, Titone L, Miceli S, Barbusca E, Cannizzo G, Mancuso

S, Arista S, Scarlata F. Monocyte and lymphocyte apoptosis resistance in acute and chronic

brucellosis and its possible implications in clinical management. Clin Infect Dis 36: 1533-1538.

2003

35. Wang M, Qureshi N., Soeurt N, Splitter G. High levels of nitric oxide production decrease early

but increase late survival of Brucella abortus in macrophages. Microb Pathog 31: 221-230, 2001

36. Wohrl W, Häcker G. Extent and limitation of the control of nuclear apoptosis by DNA-

fragmenting factor. Biochem Biophys Res Comm 254: 552-558, 1999

Figures and legends

Fig. 1. Placentome of a non vaccinated healthy puerperal cow (Cow 20, Group Negative Control).

Decreased cellularity of the trophoblasts of the cotiledonary villi with no inflammatory infiltrate

neither necrosis. Intense and diffuse TUNEL-positive labeling showing genome fragmentation in

cells with morphological evidence of apoptosis (TUNEL, Bar =10µm).

Fig. 2. Placentome of a B-19 vaccinated cow challenged with Brucella abortus, with abortion and

positive bacteriology (Cow 9, Group B++). Trophoblasts of the cotiledonary villi and of the

syncityal epithelium of the maternal cripts with no TUNEL labelling. Maternofetal spaces with

evident inflammatory infiltrate and necrosis, with positive labelling in cellular debris. (TUNEL, Bar

=10µm).

Fig. 3. Graph showing distribution of the apoptotic indices (mean ± sem) obtained from non

vaccinated healthy cows (Group NC, n=5), from B-19 vaccinated cows challenged with Brucella

abortus with normal gestation and negative bacteriology at parturition (Group B -, n=5), from B-19

vaccinated cows challenged with Brucella abortus with no abortion and positive bacteriology at

parturition (Group B+, n=5) and from B-19 vaccinated cows challenged with Brucella abortus with

abortion and positive bacteriology (Group B++, n=5).

Fig. 4. Placentome of a non vaccinated healthy puerperal cow (Cow 20, Group NC). Thin layers of

the trophoblasts in the cotiledonary villi with shrunken cells and chromatin condensation, few

apoptotic bodies. No inflammatory infiltrate neither necrosis. (HE, Bar =10µm).


positive bacteriology (Cow 9, Group B++). Intense and diffuse inflammatory infiltrate, composed

by mononuclear and some polymorphonuclear cells (HE, Bar =10µm).

Fig. 6. Distribution of the inflammatory indices (mean ± sem) obtained from B-19 vaccinated cows

challenged with Brucella abortus with normal gestation and negative bacteriology at parturition

(Group B -, n=5), from B-19 vaccinated cows challenged with Brucella abortus with no abortion

and positive bacteriology at parturition (Group B+, n=5) and from B-19 vaccinated cows challenged

with Brucella abortus with abortion and positive bacteriology (Group B++, n=5).


positive bacteriology (Cow 5, Group B++). Large necrotic areas, with cellular debris filling up the

maternofetal spaces. Thicke layers of the trophoblasts in the cotiledonary villi and of the syncityal

epithelium in maternal cripts with few shrunken cells. Most of trophoblasts and syncityal epithelium

show sparse chromatin in their nuclei. (HE, Bar =10µm).

Fig. 8. Graph showing distribution of the necrotic indices (mean ± sem) obtained from B-19

vaccinated cows challenged with Brucella abortus with normal gestation and negative bacteriology

at parturition (Group B -, n=5), from B-19 vaccinated cows challenged with Brucella abortus with

no abortion and positive bacteriology at parturition (Group B+, n=5) and from B-19 vaccinated

cows challenged with Brucella abortus with abortion and positive bacteriology (Group B++, n=5).

Fig. 9 . Linear Regression showing inverse relationship between Apoptosis and Inflammation in

placentomes of healthy (NC, n=5) and Brucella abortus challenged puerperal cows, with normal

gestation and negative bacteriology at parturition (B -, n=5), from cows challenged with Brucella

abortus with no abortion and positive bacteriology at parturition (B+, n=5) and from cows

challenged with Brucella abortus with abortion and positive bacteriology (B++, n=5).

Fig. 10 . Linear Regression showing inverse relationship between Apoptosis and Necrosis in

placentomes of healthy (NC, n=5) and Brucella abortus challenged puerperal cows, with normal

gestation and negative bacteriology at parturition (B -, n=5), from cows challenged with Brucella

abortus with no abortion and positive bacteriology at parturition (B+, n=5) and from cows

challenged with Brucella abortus with abortion and positive bacteriology (B++, n=5).

COMENTÁRIOS FINAIS

Nesta dissertação se caracterizou morfologicamente a apoptose em placentomos de vacas

saudáveis e infectadas com Brucella abortus. A quantificação morfométrica da apoptose, assim

como da inflamação e necrose, permitiu inferir que a apoptose, como mecanismo de redução da

celularidade placentária durante o processo de maturação e preparação para o parto, é reprimida

quando ocorrem inflamação e necrose – conseqüências comuns da infecção brucélica.

A apoptose tem um papel importante na redução da celularidade durante o processo de

maturação placentária. A infecção brucélica causa inflamação e necrose nos placentomos e inibe a

ocorrência da apoptose, atrasando a maturação placentária e consequentemente a liberação. Isto

ajuda a explicar a retenção placentária que ocorre freqüentemente na brucelose.

Assim, esta dissertação acaba por trazer nova informação, contribuindo para explicar o

paradoxo - de como a placenta em necrose ainda se mantém retida, já que o esperado – pela

friabilidade característica dos tecidos em necrose – era que se desprendesse ainda mais rapidamente.

Considerando a importância da apoptose no processo de maturação e liberação placentária normal,

confirmou-se que o processo infeccioso e inflamatório atrasa a ocorrência da apoptose nesse

processo e conseqüentemente a maturação e a liberação placentária normal causando a retenção da

placenta e suas conseqüências. Na brucelose, apesar de se verificar placentite necrotizante, é

comum a retenção placentária que acaba por promover metrite e infertilidade.

Em termos de perspectivas futuras, um próximo desafio passa a ser compreender como o

processo ocorre, quais as vias metabólicas e os genes que são expressos, durante a maturação

placentária normal e durante a infecção brucélica.

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APOPTOSE NA MATURAÇÃO E ELIMINAÇÃO PLACENTÁRIA DA...

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