APOSTILA AULAS PRATICAS

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1 Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul Unidade de Ensino de Ivinhema/MS Projeto de Ensino Práticas de Biologia Celular – Citologia & Citogenética Ciências Biológicas Dezembro 2007

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Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul Unidade de Ensino de Ivinhema/MS

Projeto de Ensino Práticas de Biologia Celular – Citologia & Citogenética

Ciências Biológicas Dezembro 2007

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UEMS - Unidade de Ensino de Ivinhema Coordenador do Projeto: Jairo Campos Gaona Carga horária total do Projeto: 62 (31 semanas) Início: 09 de março 2007 Término: 30 de novembro 2007

Participantes

Professor Jairo Campos Gaona/ Coordenador

Lucilene Anita Pereira Silva/ Técnica de Laboratório

Diogo Freitas Souza/Monitor

Jaqueline Bogás Cardoso Bonin/Monitora

Paulo Sauda Neto/Monitor

1a Série:

Anderson Pereira Dos Santos

Claudia Macedo Nazaro

Deisiany Mayara Betineli Da Costa

Fátima Aparecida Rodrigues

Jaqueline Resende Lira

Marcelo Fernando Pereira

Stela Moreira Zancanaro

Suelen Nunes Venâncio

2a Série:

José Caccia

Lucas Murilo Souza Santos Farias

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SUMÁRIO Preparo das Soluções ............................................................................................................................4 Roteiro de aula pratica No 01: Microscópio e Epitélio Bucal. ................................................................6 Roteiro de aula N° 02: Análise de Células Animais (sangüíneas) e Vegetais. ........................................7 Roteiro de aula pratica Nº 03: Observação de Protozoários. ..................................................................9 Roteiro de aula prática Nº 04: Fungos, Algas e Líquens. .....................................................................11 Roteiro de aula pratica N° 05: Diferenciação de Paredes Celulares de Células Vegetais. .....................13 Roteiro de aula prática N° 06: Plastos e Amido. ..................................................................................15 Roteiro de aula pratica N° 07: Análise de Plastos. ...............................................................................17 Roteiro de aula pratica N° 08: Divisão Celular e Cromossomos (mitose).............................................18 Roteiro de aula prática N° 09: Mitose - Procedimento II. ....................................................................19 Roteiro de aula prática N° 10 e 11: Cromossomos de Insetos. .............................................................21 Roteiro de aula pratica No 12: Bactérias ..............................................................................................23 Roteiro de aula prática N° 13: Fungos. ................................................................................................25 Roteiro de aula prática N° 14: Observação de Grãos de Pólen. ............................................................27 Roteiro de aula prática N° 15 e 16: Meiose. ........................................................................................29 Roteiro de aula prática N° 17 e 18: Identificação de Material Permanente. ..........................................32 Roteiro de aula prática N° 19: Ciclo celular - Mitose & Meiose – Laboratório virtual. ........................33 Roteiro de aula prática N° 20: Lipídios. ..............................................................................................34 Roteiro de aula prática N° 21 e 22: Inclusão em Parafina e Basofilia...................................................36 Roteiro de aula prática N° 23: Lâminas Permanentes. .........................................................................39 Roteiro de aula prática N° 24: Cromossomos de insetos II ..................................................................42 Roteiro de aula prática N° 25: Decalque, Reação de Feulgen & Verde Janus.......................................44

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Preparo das Soluções Ácido Clorídrico 1 M 8,4ml de ácido clorídrico concentrado 100ml de água destilada q.s.p. Colocar 50ml de água destilada em um balão volumétrico, adicionar o ácido clorídrico, homogeneizando a mistura. Completar para 100ml com água destilada, agitar bem. Água sulfurosa 1g de metabissulfito de potássio 200 ml de água destilada 10 ml de HCl 1N Pesar 1g de metabissulfito de sódio adicionar 10 ml de HCl 1N, completar para 200ml com água destilada e colocar em frascos. Álcool Etílico 50% 50,25ml de álcool etílico absoluto 99,5% 49,75 ml de água destilada Álcool Etílico 70% 70,35ml de álcool etílico absoluto 99,5% 29,65ml de água destilada Álcool Etílico 80% 80,40ml de álcool etílico absoluto 99,5% 19,6ml de água destilada Álcool Etílico 95% 95,47ml de álcool etílico absoluto 99,5% 4,53ml de água destilada Azul de Metileno 1% 1g de azul de metileno 100ml de água destilada q.s.p. Colocar 50ml de água destilada em um béquer adicionar o azul de metileno. Misturar bem com uma baqueta. Completar o volume de água destilada para 100ml e fazer a homogeneização da solução. Filtrar. Azul de Toluidina 0,5% 0,5g de azul de toluidina 5,0g de borato de sódio 100ml de água destilada Dissolver o borato de sódio em +/- 80ml de água destilada em agitador magnético com aquecimento. Adicionar o azul de toluidina continuar agitando por 30 minutos. Completar o volume para 100 ml e agitar com aquecimento por mais 30 minutos. Filtrar antes do uso. Carnoy (3:1) 75ml de álcool etílico absoluto 25ml de ácido acético glacial. Eosina Amarela 0,5%/Eosina Azul de Metileno 0,5% (Solução aquosa) 0,5g de eosina amarelada ou eosina azul de metileno 100 ml de água destilada q.s.p. Pesar 0,5g de eosina colocar em um béquer e adicionar 100ml de água destilada. Fucsina ácida 1 g de fucsina ácida 1 ml de ácido acético 300 ml de água destilada

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HCL 5 N 70ml de água destilada 50ml de HCl 12 N Hematoxilina de Ehrlich (aprox. 0,7 %) 2 g de hematoxilina 100 ml de álcool 96 % 10 ml de ácido acético 100 ml de glicerina pura 3 g de alúmen de potássio 100 ml de água destilada Dissolver a hematoxilina em álcool. Dissolver o alúmen em água destilada. Adicionar a solução de hematoxilina, aos poucos, sob agitação. Acrescentar aos poucos a glicerina e o ácido acético. Filtrar. Amadurecer durante mais ou menos 2 a 3 meses. Utilizar vidro claro para armazenar a hematoxilina e tampar somente com gaze. Orceína Acética 1-2% 5ml de ácido acético 0,1g de orceína 5ml de água destilada Dissolver a orceína em água destilada aquecida, adicionar o ácido acético e filtrar. Parafina Histológica-ponto de fusão 56-58 °C Derreter a parafina em estufa termostática à temperatura entre 58 a 60 °C. Filtrar em papel de filtro n° 2. A parafina deve ser mantida liquefeita em estufa com temperatura ajustada 2 C acima do seu ponto de fusão. Reativo de Schiff 100ml de água destilada 1g de fucsina básica 4g de metabissulfito de sódio 1ml de HCl concentrado 200mg de carvão ativo Levar 100ml de água destilada à ebulição. Retirar do fogo e juntar a de fucsina básica. Resfriar até 60 °C e filtrar. Acrescentar o de metabissulfito de sódio. Dissolver bem. Adicionar o HCl. Deixar 24 horas em repouso, no escuro. Juntar o carvão ativado. Agitar durante uns 5 minutos e filtrar em papel duplo. Conservar em geladeira em vidro âmbar. *Para ativar o carvão: filtrar com água destilada e colocar em estufa a 60 °C. Solução de Lugol (1/20) 1ml de lugol 20ml de água destilada Solução salina 0,9 0,9g de NaCl 100 ml de água destilada q.s.p. Sudan IV 600mg de Sudan IV 200ml de etanol 70% Aquecer o etanol adicionar o Sudan IV, dissolver completamente, deixar em repouso por uma noite, filtrar. Verde Janus B a 0,7% 0,7g de Verde Janus 100g de álcool 70% q.s.p. Pesar 0,7g de Verde Janus adicionar o álcool 70% e homogeneizar bem.

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Curso Ciências Biológicas Projeto de Ensino Práticas de Biologia Celular – Citologia & Citogenética

Roteiro de aula pratica No 01: Microscópio e Epitélio Bucal.

Introdução:

O microscópio sendo a principal ferramenta no estudo da citologia e citogenética tem uma grande importância na área das ciências biológicas e suas aplicações nas áreas agrárias, medicas e do uso na análise de materiais diversos (física, geologia), sendo indispensável o seu conhecimento para qualquer pessoa que queira atuar nessas áreas.

O principal objetivo dessa prática é ensinar os princípios básicos do microscópio e suas principais funções, para que os acadêmicos possam se familiarizar com seu uso e potencialidades e utilizar o conhecimento de forma a aproveitar melhor o aprendizado. Materiais e Equipamentos Instrumental Lâminas, microscópio óptico, lamínulas, palitos para retirar amostras da bochecha, papel filtro. Químicos Azul de metileno 1%. Biológicos Amostras de mucosa bucal. Procedimentos Depois de enxaguar bem a boca, retire uma amostra raspando suavemente a bochecha interna com um palito e descarte a primeira amostra. Retire no mesmo local uma segunda amostra de células da mucosa bucal (sem lastimar a bochecha). Para coletar o material forçar a bochecha para dentro, com auxilio do polegar para que a parte interna fique exposta facilitando a raspagem. Ao fazer a secunda raspagem passe a amostra para a lâmina, por meio de esfregaço, segundo o desenho. Deixe a amostra secar por 20 segundos. Pingue uma gota de azul de metileno na concentração de 1% sobre a amostra. Deixe agir o azul de metileno de dois a cinco minutos sem lamínula, não deixe secar. Em seguida coloque a lamínula sobre azul de metileno e retire o excesso do azul utilizando papel filtro ou papel higiênico. Leve a amostra ao microscópio óptico e observe o material nas objetivas de 40X e 100X. Resultados Desenhe o que foi observado no microscópio óptico. Diference a célula dos outros materiais observados. Observe e diferencie as partes constituintes das células, como: núcleo, membrana plasmática, e citoplasma. Discuta os resultados com bibliografia, relate e conclua. Bibliografia AMABIS JM, MSRTHO GR. Curso básico de biologia, v.1. Células e tecidos. São Paulo: Moderna, 1985. JORDÃO BQ et al. Práticas de Biologia Celular. Londrina: UEL, 1998.

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Roteiro de aula N° 02: Análise de Células Animais (sangüíneas) e Vegetais.

Introdução

A célula, unidade fundamental da vida, apresenta morfologia característica fácil de ser diferenciada ao microscópio fotônico. Células animais e vegetais diferenciam molecular e estruturalmente refletindo em uma morfologia própria. Para que o aluno venha se familiarizar com uso do microscópio de luz, é necessário que o mesmo aprenda a diferenciar os tipos de células, sejam elas vegetais ou animais. Esta aula tem como principal objetivo analisar as células vegetais e sanguíneas, levando em consideração as suas características morfológicas específicas, forma e estrutura. Materiais e Equipamentos Instrumental Microscópio óptico, lâminas, lamínulas, rolha ou isopor, bisturi ou lâmina de barbear, algodão, luvas descartáveis, pinça, placa de petri. Químicos Álcool. Biológicos Folhas vegetais (frescas), amostra sangüínea. Procedimento A (observação de células sangüíneas) Limpar o local utilizando algodão umedecido em álcool. Utilizar a lanceta picadora para retirar a amostra sanguínea. Colocar uma gota pequena do sangue na extremidade direita da lâmina. Com a outra mão segurar a lamínula contra o sangue formando um ângulo de 45°. Deslocar a lamínula da direita para esquerda em um só movimento, firme, porem suave e uniforme, preservando o ângulo inicial entre as duas, lâmina e lamínulas. Secar ao ar, agitando a lâmina. Levar a lâmina ao microscópio óptico para a analise e observação. Procedimento B(observação das células vegetais) Pegue a rolha (ou isopor) e faça um corte longitudinal utilizando um bisturi ou uma gilete. Após cortar a rolha, pegue a folha (fresca) e coloque entre as suas metades da rolha fazendo assim uma espécie de “sanduíche”. Faça um corte transversal com a gilete na rolha que contem a folha (obs: cortar o mais fino possível, sem desfragmentar a folha). Com a pinça, coloque o filete de folha na lâmina. Leve a amostra ao microscópio para observação em 10 e 40x. Resultados Procure observar ao microscópio (40, 100x) as características das células sangüíneas e vegetais. Diferencie estruturas. Desenhe as células observadas. Quais as diferenças observadas entre as células vegetais e sangüíneas. Compare os dois resultados e Discuta!!!

Bibliografia: AMABIS JM, MARTHO GR. Curso básico de biologia, v.1. Células e tecidos. São Paulo: Moderna, 1985. JORDÃO BQ et al. Práticas de Biologia Celular. Londrina: UEL, 1998. http://www.coralx.ufsn/parasitologia/laboratorio/esfregaco.html.

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Figura 1: procedimento de coleta da amostra sangüínea.

Figura 2: procedimento de corte da folha vegetal.

Figura 3: observação da célula vegetal no microscópio óptico.

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Roteiro de aula pratica Nº 03: Observação de Protozoários.

Introdução A biologia, sendo um campo amplo de pesquisa possibilita o estudo de seres multicelulares e

unicelulares. A diversidade biológica abrange grande número de organismos unicelulares, com diferentes histórias evolutivas (filogenia) agrupados de forma artificial como Protistas (Algas e Protozoários).

Essa aula tem como principal objetivo reconhecer ao microscópio indivíduos do Reino Protista, mas especificamente, protozoários e suas principais características morfológicas e estruturais. Materiais e Equipamentos Instrumental Microscópio óptico, lâmina, lamínula, papel de filtro, placa de petri, conta gotas. Químicos Álcool 70%, ácido acético 50%, óleo de imersão. Biológicos Amostra de água, arroz e alface. Procedimentos Colete uma amostra de água não tratada (rios, riachos, lagos ou outra). Coloque essa a mostra em uma placa de pétri, uma com alface e outra com arroz. Deixe a cultura em descanso por uma semana. Utilizando um conta gotas retire uma amostra de água da cultura em descanso. Com o mesmo conta gotas pingue uma gota da amostra em uma lâmina. Em seguida, coloque uma lamínula sobre a mesma. Retire o excesso de água com o papel filtro. Leve a lâmina em um microscópio óptico e observe o material nas objetivas de 10, 40 e 100x. Obs: Colocar uma gota de ácido acético 50% ou álcool 70% para fixar o material. Resultados Desenhe o que foi observado no microscópio óptico. Identifique os diferentes tipos de protozoários encontrados. Observe as estruturas dos protozoários. Discuta os resultados com a bibliografia, relate e conclua. Bibliografia AMABIS JM, MARTHO GR. Curso básico de biologia, v.1. Células e tecidos. São Paulo: Moderna, 1985. JORDÃO BQ et al. Práticas de Biologia Celular. Londrina: UEL, 1998. NEEDHAM JG, NEEDHAM PR. Guía para el estúdio de los seres vivos de las águas dulces. Barcelona:

Reverté, 1978. RUPPERT ED, Fox RS, Barnes RD. Zoologia de Invertebrados. 7th ed. São Paulo: Rocca, 2005. http://www.ruhr.de/postnuke/html/index. php http://upsidedownhippo.com/

Figura 1: Paramecium sp figura 2: Bursária sp

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Estrutura do fitoflagelado, Euglena Gracilis

Estrutura de um esporozoário Estrutura de um Paramecium

(Fonte das figuras: Ruppert & Barnes, 6a ed, 1996) Exemplos de Ciliados: e Sarcodina:

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Roteiro de aula prática Nº 04: Fungos, Algas e Líquens.

Introdução Tendo em vista as características evolutivas dos seres vivos, os eucariotes como as algas e os fungos são

organismos adaptados a ambientes aquáticos e terrestres, possuindo nas suas estruturas internas e externas características que os diferenciam de outros grupos como protozoários, plantas e animais. Apesar dos fungos possuírem parede celular como as algas e as plantas eles diferem por possuírem uma composição diferente na parede, não ter pigmentos fotossintetizantes, não armazenar amido como substância de reserva e não ter grandes vacúolos. Já as algas são confundidas freqüentemente com vegetais por possuírem estruturas morfológicas semelhantes, mas existem características específicas das algas que diferenciam do Reino Plantae (vegetal), como por exemplo, clorofilas diferentes e estruturas moleculares específicas das suas células, capacidade de locomoção, a formação de colônias e muitas delas ser comumente unicelulares, as algas multicelulares na formam os tipos de tecido vascular encontrados nas plantas. Esta aula tem como objetivo principal observar e diferenciar as principais características de fungos e algas, possibilitando aos alunos um maior conhecimento sobre os mesmos. Materiais e Equipamentos Instrumental Placa de pétri, microscópio óptico, lâmina, lamínula, papel filtro, conta gotas, pinça, lupa. Químicos Ácido acético e/ou lático 45%, azul de metileno 1%. Biológicos Amostra de fungos (pão e/ou outros alimentos embolorados), algas (lodo de riacho, água de estanques sem tratamento) e líquens (encontrados sobre rochas, muros abandonados ou em plantas). Procedimentos A(algas) Colete uma amostra de alga (em rios e riachos). Obs.: para coletar a alga retire o “lodo” que fica nas margens e superfície dos rios ou riachos. Com auxílio de uma pinça fina retire um filamento de alga e coloque sobre a lâmina. Com o auxilio de um conta gotas, pingue uma gota de água sobre a amostra. Em seguida coloque uma lamínula sobre a amostra. Retire o excesso de água com o auxilio do papel filtro. Leve a amostra ao microscópio óptico e observe o material nas objetivas 10x 40x e 100x. Procedimentos B(fungos) Faça uma cultura de fungo (bolor de pão, extrato de tomate, queijo ou outros alimentos) Colete uma amostra da cultura. Com o auxilio de uma pinça, pegue a amostra e coloque em uma placa de pétri. Em seguida leve a placa de pétri até a lupa. Observe o material. Coloque uma sub-amostra (pouco) em uma lâmina adicione uma gota de azul de metileno 1%, azul de toluidina 0,25% ou lugol e cobrir com uma lamínula para observar ao microscópio nas objetivas 10x 40x. De uma folha vegetal mofada ou embolorada peguei uma amostra com uma fita adesiva (durex) colocando a fita sobre a folha e retire o material, depois colocar fita sobre uma lâmina contendo uma gota de ácido lático ou acido acético 45% segurando pelos extremos da lâmina, observe ao microscópio nas objetivas 10x 40x. Procedimentos com Liquens Pegue amostras de diferentes liquens e observe na lupa. Com uma pinça retire uma pequena sub-amostra e coloque em uma lâmina, com a pinça e/ou com agulhas finas separe o material em pequenas partes, adicione uma gota de azul de metileno e cobra com uma lamínula, observe ao microscópio nas objetivas 10x 40x, diferencie as células dos fungos e das algas. Resultados Desenhe o que foi observado, coloque os aumentos totais usados na lupa e no microscópio.

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Identifique as diferentes estruturas, do que foi observado, compare com a bibliografia. Quais são as diferenças na composição da parede celular de fungos e algas. Discuta os resultados com a bibliografia, relate e conclua. Bibliografia: MADIGAN MT, MARTINKO JM, PARKER J. Microbiologia de Brock - 10ª ed. - Pearson - Prentice Hall, São

Paulo, 2004 (2003 em ing). NEDER RN. Microbiologia: Manual de laboratório, São Paulo: Nobel, 1992. PELCZAR Jr. MJ, Microbiologia: Conceitos e Aplicações, vol 1, São Paulo: editora Makron Books 1996. RAVEN PH, EVERT RF, EICHORN SE. Biologia Vegetal. 7a ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007

(2005 em ing). TRABULSI LR, Microbiologia, 3° edição, São Paulo: editora Atheneu, 2002. VALENCIA HA. Manual de práticas de microbiologia básica. Colección Notas de clase, Facultad de Ciencias,

Bogotá: Universidad Nacional de Colombia, 2004.

Figura 1: algas Fonte: www.planetarios.com Micrasterias sp, alga verde. Fonte: Madigan et al., 2004.

Ciclo de vida de um cogumelo. Ciclo de vida de um bolor.

Figura 2: fungos Fonte:www.enq.ufsc.Br Fonte: Madigan et al., 2004. Figura 3: liquens. Fonte: Raven et al., 2005.

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Roteiro de aula pratica N° 05: Diferenciação de Paredes Celulares de Células Vegetais. Introdução

Entre vários componentes de uma célula vegetal, a parede celular é uma estrutura de suma importância para o vegetal, que é uma matriz extracelular constituída principalmente por celulose. Essa parede celular tem funções especificas e essenciais como absorção, transporte e secreção de substância. Além de ajudar nas atividades de proteção contra agentes patogênicos (fungos, bactérias e vírus) e outros parasitas como insetos e nematódeos. Esta prática tem como principal objetivo, a observação e diferenciação dos vários tipos de parede celular, e verificar a propriedade citoquímicas da basofília do azul de toluidina.

Basofilia: é a capacidade de coloração de substancia com caráter básico. Acidofila: é a capacidade de coloração de substancias de caráter acido.

Materiais e Equipamentos Instrumental Microscópio óptico, lâmina, lamínula, lâmina de barbear, isopor, placa de petri, pinça, conta gotas. Químicos Azul de toluidina 0,20%, água destilada. Biológicos Caule de abóbora (Cucúrbita sp.), cebola (Allium cepa), folhas de Pingo de ouro (Duranta repens), Roseira (Rosa sp), coração roxo Tradescantia e outros vegetais. Procedimentos Cucúrbita sp Faça com o auxilio de uma lâmina de barbear, um corte transversal bem fino do caule da abóbora. Coloque sobre uma lâmina com a pinça e coloque uma gota de azul de toluidina a 0,20%. Aguarde um minuto e cubra com a lamínula, evitando a formação de bolhas de ar. Leve até o microscópio óptico e observe na objetiva de 10x e 40x. Esquematize na objetiva de 40x.

Epiderme da cebola Retire um fragmento da epiderme superior de uma das camadas foliares do bulbo de cebola. Faça uma preparação a fresco e com água, examinando ao microscópio nas objetivas de 10 e 40x. Depois substitua a água da preparação por azul de toluidina e observe no microscópio. Resultados Cucúrbita sp Na observação analise com atenção a parede celulósica das células dos seguintes tecidos que compõem esse corte; epiderme, colênquima, esclerênquima, parênquima e feixes vasculares. Analise as observações e discuta com bibliografia. Epiderme da cebola Que estruturas celulares se mostram basófilas. Observe, esquematize e descreva o que foi observado. Resultados & Discussão A partir das observações explique o que foi observado desde o ponto de vista químico e estrutural. Bibliografia: Raven, PH et al. Biologia vegetal, 5° ed, Rio de janeiro: Guanabara Koogan, 1996. Jordão, B Q, Pratica de Biologia celular, Londrina, UEL, 1998. Rodrigues AN, Estelita MEM. Anatomia da raiz de Cyperus giganteus Vahl (Cyperaceae) em desenvolvimento. Rev. bras. Bot.vol.27 no.4: São Paulo Oct./Dec.2004

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Pele de cebola ou Tradescantia. Corte transversal de caule. Fontes: http://www.scielo.br/img/fbpe/sa/v53n1/a10f9.gif, http://www.didier-pol.net/1thcmont.gif

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Roteiro de aula prática N° 06: Plastos e Amido.

Introdução:

O amido principal produto de reserva vegetal é geralmente encontrado em órgão de reserva nutritiva, como raízes do tipo tuberoso e grãos, têm diferentes formas que varia de acordo com cada estrutura específica. Entre varias adaptações, os vegetais desenvolveram as substâncias de reservas tanto para auxiliar no desenvolvimento embrionário como também em fontes de energia. No desenvolvimento embrionário essas reservas (amido) localizam-se tanto no pericarpo, aleurona e endosperma dos frutos e grãos (milho, cevada, soja e feijão entre outros). Como fonte de energia os vegetais armazenam suas substâncias energéticas (amido) nos parênquimas de reservas, que é permeado pelo tecido vascular dando origem às raízes tuberosas (cenoura, batata-doce, beterraba). Estas substancias de reserva encontram-se dentro de plastos, como os cloroplastos que se apresentam de cor verde pela clorofila, outros podem ser leucoplastos (brancos ou sem cor) e cromoplastos. O objetivo da prática é reconhecer estruturas de reserva (grãos de amido) em tecidos vegetais, morfologia e diferença entre espécies. Materiais e Equipamentos Instrumental Microscópio fotônico, Lâmina, Lamínula, Lâmina de barbear, Bisturi, Pinça. Químicos Azul de toluidina 0,2 % (solução ácida que vai corar substâncias básicas), água destilada, azul de metileno, eosina amarela 0,5 %, eosina azul 0,5 % Biológicos Tubérculos: batatas, mandioca, cenoura e beterraba. Grãos: cevada, feijão, milho, soja e trigo. Procedimentos: Corte o tubérculo ou a raiz ao meio e com lâmina de barbear faça uma pequena raspagem, retire somente o “leite” da raspagem e coloque sobre a lâmina sobre a mesma coloque uma gota de água destilada e coloque a lamínula e leve ao microscópio fotônico. (grãos, cortar ao meio e retirar a parte central em pequenas partículas e fazer como nos procedimentos anteriores). Observar sem corante: formatos e tamanhos diferentes e as birrefrigências (propriedade física) nas diferentes objetivas, os leucoplastos = branco e os cromoplastos=amarelo, laranja, vermelho.

Resultados Desenhe o que foi observado no microscópio Identifique os diferentes tipos de amido. Observe as estruturas dos amidos. Discuta os resultados com bibliografia, relate e conclua.

Bibliografia Raven PH, Evert RF. Biologia Vegetal. 5ª ed, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1992. Esau K. Anatomia das Plantas com Sementes. São Paulo: Edigard Blücher Ltda, 1976. Vidal WN, Vidal MRR. Botânica Organografia: Quadros sinópticos ilustrados de Fanerógamos. 4ª ed, Viçosa:

UFV, 2000.

Figura 1. Grão de amido, mostrando o hilo ou cicatriz ao centro, Fonte:

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http://www.cerelab.com.br/images/AmidoMilho.jp

http://www.scielo.br/img/revistas/pab/v38n1/a04fig01.gif

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Roteiro de aula pratica N° 07: Análise de Plastos.

Introdução As células vegetais têm organelas especificas (plastos) que as células animais não possuem, essas

organelas são responsáveis pela absorção de energia luminosa e outras funções, entre eles temos os cloroplastos, amiloplastos que armazenam amido. Assim podemos denominar essas organela de plastos, que possuem pigmentos diferentes, cromoplastos ou leucoplastos (incolores). Os plastos são relacionados com a reserva de alimentos ou com a coloração de muitos órgãos vegetais como; flores, frutas, folhas.e tubérculos. Os leucoplastos têm uma função mais nutritiva que de coloração, podendo ser encontrados em órgãos de reserva com tubérculos (raízes ou caules). Os plastos têm várias cores como: vermelho (eritroplastos), amarelo (xantoplastos) e os verdes (cloroplastos). Os eritroplastos têm essa coloração por possuírem uma grande quantidade de carotenos, já só xantoplastos têm uma coloração amarelada por possuírem uma grande quantidade de xantofila e os cloroplastos que é o mais predominante entre eles, tem uma coloração mais esverdeada por possuir uma alta concentração de clorofila. Material e Equipamentos Instrumental Microscópio fotônico, lâmina, lamínula, pinça, pincel, papel filtro, bisturi, lâmina de barbear, placa de pétri. Químico Água destilada e solução de lugol. Biológico Tubérculos (Daucus escarota, Solanum tuberosum), folhas e flores (Rosa sp. ou Hibiscus syriacus) Procedimentos Folha e flor Pegue uma flor ou folha (Rosa sp e/ou Hibiscus syriacus) Faça um corte transversal numa pétala. Passe o corte para uma lâmina, adicione uma gota de água destilada. Coloque uma lamínula, levando essa amostra ate o microscópio fotônico, para analisar nas objetivas de 10 e 40x. Depois da observação no microscópio adicione um pouco de lugol para analisar no microscópio novamente. Tubérculos Faça um corte transversal no tubérculo cenoura ou batata (Daucus escarota e Solanum tuberosum). Coloque o corte em uma lâmina com água e observe no microscópio fotônico. Depois de analisar sem solução de lugol, adicione uma gota para observação. Resultados Analise o que foi observado, e esquematize na objetiva de 40x. Diferencie os diferentes tipos de plastos encontrados e esquematize citando suas diferenças. Quais os plastos mais abundantes nas folhas e pétalas das flores. Quais os plastos predominantes nos tubérculos. Bibliografia http://www.maristas.org.br/colegios/assuncao/pags/site_colegio/espaco/citologia_paulo/212/citologia_11030216/plastos.htm http://www.maristas.org.br/colegios/assuncao/pags/site_colegio/espaco/citologia_paulo/213/citologia_11030354/plastos.htm Jordão, B Q, Pratica de Biologia celular, Londrina, UEL, 1998. Raven PH, Evert RF. Biologia Vegetal. 5ª ed, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1996.

www.luc.edu/depts/biology/111/elodea.jpg micol.fcien.edu.uy/atlas/50.jpg

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Roteiro de aula pratica N° 08: Divisão Celular e Cromossomos (Mitose I).

Introdução

Todos os indivíduos no inicio do seu desenvolvimento embrionário são formados por apenas uma célula que da origem a todas as outras células do organismo - pluricelulares. Essa única célula começa a sofrer mitose, que é um processo constante nos organismos, esse processo de divisão constante provoca o crescimento dos indivíduos. Durante este processo também ocorre à diferenciação celular, que possibilita a transformação das células, de modo que realize outras funções orgânicas. A mitose é um processo de divisão celular que forma células-filhas com o mesmo numero de cromossomos da célula mãe. Desse modo a mitose forma células idênticas às células que as originaram. Esse processo está dividido em quatro etapas para facilitar o entendimento, e essas etapas ocorrem nesta ordem e são: prófase, metáfase, anáfase e telófase. Materiais e Equipamentos Instrumental Microscópio óptico, lâminas, lamínulas, lâmina de barbear, estilete, béquer, lupa. Químicos Solução de álcool acético 3:1, solução de ácido clorídrico molar (1M), álcool 95%, solução de orceína acética 1,5%. Biológicos Meristemos apicais de raiz do broto de feijão e raiz do broto da cebola. Procedimentos Pegue as pontas das raízes (cebola ou feijão) e coloque em uma solução de álcool acético 3:1 onde deve permanecer para fixação, durante 15 minutos. Passe-as em seguida para uma solução de ácido clorídrico e álcool 95%, em quantidades iguais (1:1). Onde permaneceram por 10 minutos. Em seguida passe as raízes para uma outra solução de álcool acético onde deve ficar mais cinco minutos. Leve ate a lupa para cortar as coifas e faça um corte de cerca de 2mm das pontas, dissocie os corte, com uma lamínula esmague antes de levar ate ao microscópio fotônico. Coloque-as em uma lâmina com orceína acética 1 a 2%. Resultados Observe ao microscópio os aspectos dos cromossomos e as fases da divisão. Descreva as modificações sofridas pelo núcleo celular durante o processo. Esquematize as modificações de acordo com as etapas do processo. Discuta os resultados e o seu significado para os organismos. Bibliografia JUNQUEIRA LC, Uchoa LC, Carneiro j. Biologia celular, 8° ed, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2005. DE ROBERTIS EMF, HIB J. Bases da Biologia Celular e Molecular, 4° ed, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006 (2004).

Mitose. Foto: Lucilene. www.todabiologia.com/citologia/mitose2.jpg

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Roteiro de aula prática N° 09: Mitose - Procedimento II. Introdução

A divisão e a reprodução é uma propriedade fundamental das células. As células se reproduzem através da duplicação de seus conteúdos e posterior divisão em duas células filhas, este processo é a garantia de uma sucessão contínua de células idênticas com o mesmo conteúdo. Nos organismos multicelulares, apesar de inúmeras variações existentes, os diferentes tipos celulares apresentam um nível de divisão tal que é ótimo para o organismo como um todo, porque o que interessa é a sobrevivência do organismo como um todo e não de uma célula individual. Como resultado as células de um organismo dividem -se em níveis diferentes. Algumas células, como os neurônios quase nunca se dividem. Outras, como as epiteliais, dividem-se rápida e continuamente. O estudo clássico da divisão celular estabelece duas etapas no ciclo celular; de um lado aquela em que a célula se divide originando duas células descendentes e que é caracterizada pela divisão do núcleo (mitose) e a divisão do citoplasma (citocinese). A etapa seguinte, em que a célula não apresenta mudanças morfológicas, é compreendida no espaço entre duas divisões celulares sucessivas e foi denominada de interfase (com três fases G1, S, G2). A mitose (do grego: mitos = filamento) é um processo de divisão celular, característico de todas as células somáticas vegetais e animais. É um processo continuo que é dividido em 5 fases: Prófase, metáfase, anáfase, telófase, nas quais ocorrem grande modificações no núcleo, e a citocinese na qual apresenta-se a divisão do citoplasma.

Prófase: caracteriza-se pela contração dos cromossomos, que tornam-se mais curtos e grossos devido ao processo de enrolamento ou helicoidização. O nucléolo se desorganizam (desaparecem) e os centríolos ou centrossomos, que foram duplicados durante a interfase, migram um par para cada pólo celular.

Metáfase: O envoltório nuclear desaparece por completo. Nesta fase os cromossomos duplos ocupam o plano equatorial do aparelho mitótico. Os cromossomos adotam uma orientação radial, formando a placa equatorial. Os cinetócoros das duas cromátides estão voltados para os pólos opostos. Ocorre um equilíbrio de forças.

Anáfase: Inicia-se quando os centrômeros tornam-se funcionalmente duplos. Com a separação dos centrômeros, as cromátides separam-se e iniciam sua migração em direção aos pólos. O centrômero precede o resto da cromátide. Os cromossomos são puxados pelas fibras do fuso e assumem um formato característico em V ou L dependendo do tipo de cromossomo. A anáfase caracteriza-se pela migração polar dos cromossomos.

Telófase: A telófase inicia-se quando os cromossomos-filhos alcançam os pólos. Os microtúbulos (MT) cinetocoricos desaparecem e os MT polares alongam-se. Os cromossomos começam a se desenrolar, num processo inverso a Prófase. Estes cromossomos agrupam-se em massas de cromatina que são circundadas pôr cisternas de Retículo endoplasmático (RE), os quais se fundem para formar um novo envoltório nuclear.

Citocinese: É o processo de clivagem e separação do citoplasma. A citocinese tem inicio na anáfase e termina após a telófase com a formação das células filhas. Em células animais forma-se uma constrição, ao nível da zona equatorial da célula mãe, que progride e estrangula o citoplasma. Esta constrição é devida a interação molecular de actina e miosina e microtúbulos. Reaparecem os nucléolos. Como resultado de uma divisão mitótica teremos duas (2) células filhas com numero de cromossomos iguais a da célula mãe. Objetivo: diferenciar as etapas do ciclo celular e as fases da mitose em tecidos vegetais. Materiais e Equipamentos Instrumental Lâminas, lamínulas, lâmina de barbear ou bisturi, estilete, pinças, béquer, tubo de ensaio pequeno, placa de petri, papel de filtro, microscópio óptico, lupa. Químicos Solução de álcool etílico absoluto-ácido acético glacial (3:1), solução de ácido acético 45%; Corantes: solução de orceína acética 1% e/ou aceto-carmim 1%. Biológicos Meristemos apicais de raiz do broto de feijão e raiz do broto da cebola.

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Procedimentos Pegue as pontas (dois a três mm) das raízes (cebola e/ou feijão) e coloque em uma solução de álcool acético 3:1 onde deve permanecer para fixação em placa de petri, durante 10 a 15 minutos. Passe-as em seguida para uma solução de ácido acético 45% em tubo de ensaio, onde permanecerão por 5 minutos. Adicione umas gotas de corante e aqueça na lamparina, evitando que ferva, deixe repousar 2 min e aqueça de novo levemente. Coloque uma ou duas pontas das raízes em uma lâmina com uma gota de corante, coloque uma lamínula sem deixar formar bolhas de ar, esmague cuidadosamente o material com ajuda de um lápis até o material espalhar; com ajuda de papel filtro pressione a preparação com o polegar sem deixar escorregar a lamínula nem quebrar ela. Levar ao microscópio fotônico, observação nas objetivas de 10, 40 e 100x. Resultados Observe ao microscópio o tecido e identifique as células em mitose e em interfase. Diferencie, caracterize e desenhe as fases da mitose. Qual etapa do ciclo celular é mais freqüente?, explique. Nas metáfases conte o número de cromossomos Análise os dados da cebola e do feijão, discuta as diferenças. Bibliografia ALBERTS B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologia Molecular da Célula, 4a ed, Edit

Artes Médicas, Porto Alegre, 2004 (2002 ing.). CARVALHO HF, Recco-Pimentel SM. A Célula. 2a ed, São Paulo: Manole, 2007. DE ROBERTIS EMF, HIB J. Bases da Biologia Celular e Molecular, 4a ed, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,

2006 (2004). GONZÁLEZ T, SPINEL C (ED). Práticas de Laboratório: Biología Celular. Notas de clase, Facultad de

Ciencias, Bogotá: Universidad Nacional de Colombia, 2004. JORDÃO BQ et al. Práticas de Biologia Celular. Londrina: UEL, 1998. JUNQUEIRA LC, Uchoa LC, Carneiro J. Biologia Celular, 8a ed, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2005. Citologia Prof Cynara. http://www.cynara.com.br/citologia.htm

Anexo - Fases da mitose. I interfase, II Prófase, III Prometáfase, IV Metáfase, V e VI Anáfase, VII Telófase, VIII Citocinese. Fonte: pt.wikipedia.org/wiki/Mitose

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Roteiro de aula prática N° 10 e 11: Cromossomos de Insetos. Resumo

Os cromossomos são partículas microscópicas formadas por cromatina (DNA + Proteínas), eles podem ser visualizados quando a cromatina está altamente condensada nas fases de mitose ou de meiose durante o ciclo celular de células somáticas ou reprodutivas. Insetos apresentam tecidos como cérebro e gônadas para análise fácil e rápido de cromossomos. A prática permitirá observar e identificar cromossomos em diferentes órgãos de insetos. Introdução

Os cromossomos são arranjos de cromatina (ADN e proteínas) que contém a informação genética dos organismos (os genes). Essa cromatina pode estar altamente condensada e dessa forma podem ser visualizados os cromossomos em algumas etapas específicas do ciclo celular (mitose, endomitose ou meiose). Cromossomos em estas etapas podem ser mitóticos, politênicos (muitas fitas) ou meióticos, e podem ser facilmente observados em diferentes tecidos de insetos (gânglio cerebral, ovários, testículos, glândulas salivares e túbulos de Malpighi entre outros) e em diferentes fases ou estágios de vida (larva, pupa/ninfa e adulto) dos insetos. Insetos geralmente apresentam tecidos com células diplóides (2n - ou com dois conjuntos de cromossomos), mas também podem apresentar tecidos com muitos conjuntos de cromossomos (poliploidia ou endopoliploidia).

Os insetos Diptera (borrachudos, moscas, mosquitos entre outros) são cromossomicamente incomuns, pois têm menor número de pares de cromossomos, geralmente 2-10, do que os números usuais em outros insetos. Em muitos tecidos de insetos, além de ciliados, mamíferos e plantas, as células perdem a capacidade de se dividir (mitose) em uma dada fase inicial do desenvolvimento, e os cromossomos continuam a replicar-se por um processo de endomitose sem a divisão do núcleo. Tais células são chamadas endopoliplóides, podendo conter em seus núcleos os chamados cromossomos politênicos. Os cromossomos politênicos corados têm padrão característico de bandas escuras, alternadas com regiões pálidas não coradas, as interbandas. Materiais e Equipamentos Instrumentos Agulhas de dissecção, lâminas, lamínulas, lâmina de barbear ou bisturi, estilete, pinças finas, béquer, tubo de ensaio pequeno, placa de petri, papel filtro, microscópio fotônico, lupa. Químicos Solução carnoy: álcool etílico absoluto-ácido acético glacial (3:1), solução de ácido acético 50% (1 água: 1 de ácido acético glacial); Corantes: solução de orceína acética 1-2% Biológicos Larvas, pupas e/ou adultos de insetos (mosquitos) ninfas e/ou adultos (gafanhotos). Procedimentos Pegue o material biológico (larvas, pupas/ninfas e/ou adultos dos insetos) e com ajuda de pinças e/ou agulhas de ponta fina, retire com cuidado a parte posterior do corpo (dois últimos segmentos abdominais) expondo os túbulos de Malpighi, os ovários (alongados) ou os testículos (mais pequenos e arredondados). Coloque os órgãos (tecido) retirado em uma lâmina com solução carnoy (1-2 gotas) onde deve permanecer para fixação 5 minutos. Passe em seguida o material para uma solução de ácido acético 50% na mesma lâmina, onde permanecerão por mais 5 minutos. Passe o material (na mesma lâmina) para uma gota de corante orceína e deixe repousar 2 a 5 min, dissecando (cortando) o tecido em pequenos fragmentos com ajuda das agulhas. Coloque uma lamínula sem deixar formar bolhas de ar, e esmague cuidadosamente o material com ajuda de um lápis até o material espalhar; com ajuda de papel filtro pressione a preparação com o polegar sem deixar escorregar a lamínula nem quebrar ela. Levar ao microscópio fotônico e observar nas objetivas de 10, 40 e 100x.

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Resultados Observe ao microscópio o tecido e identifique as células com seus núcleos. Diferencie, caracterize e desenhe os cromossomos. Que características (tamanho, forma) podem ser apreciadas?, explique. Identifique fases diferentes e conte o número de cromossomos Análise os dados, discuta as observações. Bibliografia ALBERTS B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologia Molecular da Célula, 4a ed, Edit

Artes Médicas, Porto Alegre, 2004 (2002 ing.). CARVALHO HF, Recco-Pimentel SM. A Célula. 2a ed, São Paulo: Manole, 2007. Campos J, Andrade CFS & Recco-Pimentel SM. Malpighian tubule polytene chromosomes of Culex

quinquefasciatus (Diptera, Culicinae). Mem. Inst. Oswaldo Cruz 98(3):383-386, 2003. http://www.scielo.br/pdf/rsp/v37n4/16789.pdf

Campos G J, Recco-Pimentel SM & Andrade CFS. Polytene chromosome analysis of a population of Simulium

pertinax (Diptera: Simuliidae). Rev. Bras. Genet. 19:47-52, 1996.

DE ROBERTIS EMF, HIB J. Bases da Biologia Celular e Molecular, 4a ed, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006 (2004).

GONZÁLEZ T, SPINEL C (ED). Práticas de Laboratório: Biología Celular. Notas de clase, Facultad de Ciencias, Bogotá: Universidad Nacional de Colombia, 2004.

JORDÃO BQ et al. Práticas de Biologia Celular. Londrina: UEL, 1998. JUNQUEIRA LC, Uchoa LC, Carneiro J. Biologia Celular, 8a ed, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2005. Cromossomos metafásicos:

Simulium pertinax (borrachudo) Aedes aegypti (mosquito) Cromossomos politênicos:

Drosophila melanogaster (mosca da fruta) Culex quinquefasciatus (mosquito pernilongo)

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Roteiro de aula pratica No 12: Bactérias Introdução

As bactérias apresentam uma estrutura celular bastante simples. Diferente do que ocorre com as células animais e vegetais, elas nem sempre apresentam as mesmas características, com isso, apresentam variações em sua forma, tamanho, virulência. Esta forma de vida unicelular e procarionte pode ser encontrada isolada ou em colônias. Muitas bactérias possuem estruturas extracelulares como flagelos ou cílios, organelas de locomoção presentes nas bactérias móveis. Muitas delas podem possuir esporos (formações que conferem resistência às bactérias), devido ao meio ambiente inadequado à sua condição de vida, esta é uma forma delas se manterem vivas até encontrarem sua condição ideal de sobrevivência. Há ainda aquelas que não possuem esporos, estas são chamadas de vegetativas. De forma geral, as bactérias apresentam entre suas organelas: cápsula, membrana plasmática, ribossomos, parede celular, DNA, flagelo e pílus. Elas podem ser classificadas em dois grupos: gram-positiva ou gram-negativas. As gram-positivas possuem uma parede celular mais espessa e constituição química formada por poliptídeos, açúcares aminados (glucozamina, ácido murâmico) e fosfato de ribitol.

As bactérias classificam-se morfologicamente de acordo com a forma da célula e com o grau de agregação: Quanto à forma: Coco – de forma esférica ou subesférica (do género Coccus); Bacilo – em forma de bastonete (do género Bacillus); Vibrião – em forma de vírgula (do género Vibrio); Espirilo – de forma espiral/ondulada (do género Spirillum); Espiroqueta - em forma acentuada de espiral. Objetivo

Observar e caracterizar a morfologia celular de bactérias (procariotes) e identificar e diferenciar estruturas de parede celular de bactérias Gram – e Gram +. Material e Equipamentos Instrumentos Agulhas de disecção, bastonetes de vidro, lâminas, lamínulas, estilete, pinças finas, placas de petri, conta gotas, papel filtro, microscópio fotônico, lupa; lamparina. Químico Solução carnoy: álcool etílico absoluto-ácido acético glacial (3:1), solução de ácido acético 50% (1 água: 1 de ácido acético glacial); Corantes: Azul de metileno 1%, Azul de toluidina 0,6%, solução de orceina acética 1-2%, solução de iodo 1%, óleo de imersão. Biológico Amostras de epitélios bucais; Culturas de bactérias com vários dias em condições de laboratório. Bactérias Com ajuda de um bastonete ou agulha esterilizada na lamparina, colete uma amostra pequena da cultura e coloque espalhando em uma camada fina sobre a lâmina, tipo um esfregaço. Deixe secar ao ar, 1 a 2 min. Passar a lâmina sobre a chama para fixação, sem deixar esquentar (não deve fumacear ou ferver) Depois de esfriar uns 2 min, cobrir a lâmina com corante 1 a 3 min. Lavar com água, escorrer e deixar secar ao ar. Levar ao microscópio, use as objetivas de 40 e 100x para observação. Coloração de Gram Cobrir o esfregaço fixado pelo calor (depois de esfriar) com cristal violeta, por 1 min. Adicionar a solução de iodo por 3 min. Descorar rapidamente com álcool 70% por aprox 20 seg. Contracorar (corar de novo) com safranina por 1-2 min.

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Método de Coloração de Gram (fonte: Madigan et AL., 2004): Resultados Desenhe e compare os resultados com os colegas. Com ajuda da bibliografia, discuta os resultados, caracterize morfológica e estruturalmente as bactérias e diferencie, caracterize usando as obejtivas de 40 e 100x. Bibliografia: MADIGAN MT, MARTINKO JM, PARKER J. Microbiologia de Brock - 10ª ed. - Pearson - Prentice Hall, São

Paulo, 2004 (2003 em ing). NEDER RN. Microbiologia: Manual de laboratório, São Paulo: Nobel, 1992. PELCZAR Jr. MJ, Microbiologia: Conceitos e Aplicações, vol 1, São Paulo: editora Makron Books 1996. RAVEN PH, EVERT RF, EICHHORN SE. Biologia Vegetal. 7a ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007

(2005 em ing). TRABULSI LR, Microbiologia, 3° edição, São Paulo: editora Atheneu, 2002. VALENCIA HA. Manual de práticas de microbiologia básica. Colección Notas de clase, Facultad de Ciencias,

Bogotá: Universidad Nacional de Colombia, 2004. Anexo - Bactérias (morfologia):

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Roteiro de aula prática N° 13: Fungos.

Introdução Na natureza há diferentes tipos de fungos. Podemos dizer que eles são uma forma de vida bastante

simples. Com relação às diferenças, existem aqueles que são extremamente prejudicais para a saúde do homem, causando inúmeras enfermidades e até intoxicação. Encontramos também os que parasitam vegetais mortos e cadáveres de animais em decomposição. Temos também os que são utilizados para alimento e até aqueles dos quais se pode extrair substâncias para a elaboração de medicamentos, como, por exemplo, a penicilina. Há alguns tipos de fungos que surge através dos espórios, células quase microscópicas que encontramos flutuando no ar. Os espórios ao caírem em solo úmido e ambiente ideal para o crescimento de um novo fungo se desenvolvem rapidamente. Por não possuir clorofila, que é essencial para garantir a alimentação das plantas, esta forma de vida age como parasita, se alimentando da comida de outras formas de vida.

Os fungos são decompositores e colonizadores do solo, parasitas e até patógenos. Podemos dizer que eles são uma forma de vida bastante simples. Com relação às diferenças, existem aqueles que são extremamente prejudicais para a saúde do homem, causando inúmeras enfermidades e até intoxicação. Encontramos também os que parasitam vegetais mortos e cadáveres de animais em decomposição.

Temos também os que são utilizados para alimento e até aqueles dos quais se pode extrair substâncias para a elaboração de medicamentos, como, por exemplo, a penicilina. Há alguns tipos de fungos que surgem através dos esporos, estruturas microscópicas que encontramos flutuando no ar e que quando germinam formam células eucarióticas com parede celular composta por quitina principalmente. Por não possuir clorofila, que é essencial para garantir a alimentação das plantas, esta forma de vida age como parasita, se alimentando da comida de outras formas de vida. Objetivo: Diferenciar estruturas de fungos (eucariotes).

Materiais e Equipamentos Instrumental Cultura de Fungos e bactérias: boca, nariz, barba, ouvido e rosa. Químicos Violeta de metila, lugol 1/20, safranina, álcool etílico, água destilada, azul de metileno, azul de toluidina e ácido acético. Biológicos Placa de pétri, microscópio óptico, pinça, lupa, conta gotas, pipeta, papel de filtro, óleo de imersão, lâmina, lamínula, lamparina.

Procedimento I Análise macroscópica I (a olho desarmado) Observar as UFCs (unidades formadoras de colônias de fungos) com a placa de petri ainda fechada (parte superior – com a tampa para baixo). Quantificar (por contagem) as UFCs, caso seja possível (quando não existe sobrecrescimento de UFCs). Observar cada UFC quanto a: (i) aspecto (filamentoso, não-filamentoso), (ii) coloração (branca, verde, negra, castanha, outros). Com a placa de petri ainda fechada, inverter a placa e observar fundo da mesma, tentando correlacionar as UFCs que foram vistas por cima com as observadas por baixo. Procedimento II Faça uma cultura de fungos em placa de petri com médio Batata-Destrose-Agar (BDA) Com ajuda de um bastonete, agulha ou pinça esterilizado na lamparina, colete uma amostra pequena da cultura e coloque em uma lâmina espalhando, adicione uma gota de ácido acético 50% por 1 min e depois uma gota de azul de metileno 1%, az, de toluidina, Lugol e/ou orceína e cobrir com uma lamínula para observar ao microscópio nas objetivas 10, 40 e 100x. Preparo da lâmina para observação ao microscópio

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Retirar, com auxílio de uma pinça e um estilete, pequena quantidade do micélio e/ou estruturas reprodutivas de uma UFC. Colocar o material retirado sobre uma lâmina previamente limpa e seca Colocar, com o auxílio de um conta-gotas, 1 gota de água destilada Desfiar suavemente o material sobre a lamínula, utilizando duas pinças (uma delas para manter parte do material firme e a outra para puxar outra parte do material). Discussão Observe os diferentes tipos de bactéria (bacilo, coco, vibrião, espirilo, espiroqueta). Esquematize o material encontrado. Diferencie os diferentes tipos de fungos e esquematize-os. Bibliografia MADIGAN MT, MARTINKO JM, PARKER J. Microbiologia de Brock - 10ª ed. - Pearson - Prentice Hall, São

Paulo, 2004 (2003 em ing). NEDER RN. Microbiologia: Manual de laboratório, São Paulo: Nobel, 1992. PELCZAR Jr. MJ, Microbiologia: Conceitos e Aplicações, vol 1, São Paulo: editora Makron Books 1996. RAVEN PH, EVERT RF, EICHHORN SE. Biologia Vegetal. 7a ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007

(2005 em ing). TRABULSI LR, Microbiologia, 3° edição, São Paulo: editora Atheneu, 2002. VALENCIA HA. Manual de práticas de microbiologia básica. Colección Notas de clase, Facultad de Ciencias,

Bogotá: Universidad Nacional de Colombia, 2004. http://pt.wikipedia.org/wiki/Imagem:Col%C3%B4niasBact%C3%A9rias.jpghttp://pt.wikipedia.org/wikihttp://pt.wikipedia.org/wiki/Imagem:Col%C3%B4niasBact%C3%A9rias.jpghttp://pt.wikipedia.org/wiki/Imagem:Col%C3%B4niasBact%C3%A9rias. http://www.uefs.br/disciplinas/bio221/fungos_assexuais_pratica.rtfhttp://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorungos.htm Anexos - Fungos:

Aspergillus sp Penicilum sp

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Roteiro de aula prática N° 14: Observação de Grãos de Pólen.

Introdução O pólen é o conjunto dos minúsculos grãos produzidos pelas flores das plantas angiospermas (ou pelas

pinhas masculinas das gimnospérmicas), que são os elementos reprodutores masculinos ou microgametófitos, onde se encontram os gametas que vão fecundar os óvulos, para os transformar em sementes e frutos.Os grãos de pólen são normalmente arredondados, embora os dos pinheiros sejam alados, e podem ser muito pequenos, apenas alguns micrometros. O mais pequeno grão de pólen conhecido é o do Myossotis com cerca de 6 µm (0,006 mm) de diâmetro. A forma e ornamentação dos grãos de pólen é típica de cada família ou mesmo de cada espécie de plantas.O pólen contém uma grande proporção de proteínas (16 a 40 %) contendo todos os aminoácidos conhecidos, assim como numerosas vitaminas, principalmente as vitaminas C e PP, sendo a principal fonte de alimentação das abelhas. Outro importante produto fabricado com pólen é a geléia real. Esta composição do pólen pode ser responsável pelas alergias que lhe são atribuídas. Pesquisas recentes indicam que o pólen é o alimento mais completo e valioso da natureza, pois além de conter todos os aminoácidos essenciais ao organismo humano, também é rico em oligoelementos minerais, fibras, hormônios vegetais e vitaminas (conforme mencionado anteriormente). Objetivo

Observar grãos de pólen em natura e corados de diferentes espécies; comparar as características. Material e Métodos Instrumental Microscópio fotônico, Lâmina, Lamínula, estilete da ponta fina, pincel. Material Químico Óleo de imersão, corantes (orceína, azul de metileno e azul de toluidina). Material biológico Flores de azaléia, lírio, espirradeira, hibisco, maracujá, cravo-de-defunto, margarida, rosa, pinos. Procedimentos Colocar uma gota de água sobre uma lâmina e, com o auxilio de estilete da ponta fina, esmagar sobre a lâmina a antera de maneira a liberar os grãos de pólen na gota d’água. O recolher os grãos com um pincel. Remover os fragmentos grandes da antera. Cobrir a gota d’água com lamínula. Observar os grãos de pólen ao microscópio e desenha-los. Fazer ainda, outra preparação utilizando outro tipo de flor. Observar na objetiva de 10, e 40X. Coloque uma gota de óleo de imersão sobre a lamínula e observe na objetiva de 100 X. Aplique um corante lateralmente embaixo da lamínula e observe se aparecem mudanças. Identifique estruturas, se necessário faça um esmagamento com cuidado. Obs: o pólen da flor de Pinus não precisa ser esmagado somente passar um pincel ou estilete da ponta fina sobre as anteras. Dependendo do desenvolvimento da antera é possível observar células em meiose.

Bibliografia OLIVEIRA F et al. Praticas de morfologia vegetal. São Paulo: Atheneu, 2000. RAVEN PH, EVERT RF, EICHHORN SE. Biologia Vegetal. 7a ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007. http://pt.wikipedia.org/wiki/P%C3%B3len

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Anexos:

Figura 1: esquema de um grão de pólen Figura 2:grão de pólen

Fonte: http://www.universitario.com.br/celo/topicos/subtopicos/botanica/anatomia_vegetal/flor/flor.html

Figura 3:diferentes tipos de grãos de pólen. Fonte: http://www.iac.sp.gov.br/bragantia/volume/5901/1078.pdf

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Projeto de Ensino Práticas de Biologia Celular – Citologia & Citogenética

Roteiro de aula prática N° 15 e 16: Meiose. Resumo

O objetivo desta prática é visualizar a meiose, um processo especial de divisão celular dentro do ciclo celular dos organismos eucarióticos, no qual são formados gametas ou esporos (células haplóides) a partir de células diplóides. Podem ser usados tecidos reprodutivos de fungos, vegetais, e/ou animais. As fases do processo de meiose serão diferenciadas, caracterizadas, analisadas e comparadas com as fases do processo de mitose. Introdução

Organismos simples podem reproduzir-se através de divisões simples. Este tipo de reprodução assexuada é simples e direta e produz organismos geneticamente iguais. A reprodução sexual por sua vez envolve uma mistura de genomas de dois indivíduos, para produzir um indivíduo que difere geneticamente de seus parentais. O ciclo reprodutivo sexual envolve a alternância de gerações de células haplóides, com gerações de células diplóides. A mistura de genomas é realizada pela fusão de células haplóides que formam células diplóides. A meiose é a divisão celular, essencial para a formação de gametas, que ocorre em células diplóides e leva à formação de células haplóides. A meiose permite a recombinação gênica, de tal forma que cada célula diplóide é capaz de formar quatro células haplóides geneticamente diferentes entre si. Isso explica a variabilidade das espécies de reprodução sexuada. Na mitose, quando o DNA dos cromossomos homólogos é duplicado pelo processo de replicação na interfase do ciclo celular, cada um desses cromossomos é replicado dando origem às cromátides irmãs que são então separadas durante a anáfase e migram para os pólos celulares. Desta maneira na mitose cada célula filha recebe uma cópia do cromossomo paterno e uma cópia do cromossomo materno.

A meiose (do gr. meioum = diminuir) ocorre nas células produtoras de gametas. Os gametas femininos e masculinos (óvulos e espermatozóides) são produzidos nos ovários e nos testículos (as gônadas femininas e masculinas). A meiose é precedida por um período de interfase (G1, S, G2) com eventos semelhantes aos observados na mitose, e num determinado momento da fase G2 do ciclo celular ocorrem alterações que levam as células a entrar em meiose e darem origem a células haplóides (n), ou seja, células que possuem a metade do número de cromossomos da espécie diplóide. Podemos definir meiose como sendo o processo pelo qual número de cromossomos é reduzido a metade. O gameta é dotado de uma cópia do cromossomo materno ou paterno. A meiose é um processo que envolve duas (2) divisões celulares com somente uma duplicação de cromossomos. A meiose ocorre apenas nas células das linhagens germinativas masculinas e femininas e é constituída por duas divisões celulares: Meiose I e Meiose II. Podemos ter diferentes tipos de meiose: gamética (animais, alguns protistas e algas), espórica (em plantas e em muitas algas) e zigótica (fungos e algumas algas).

Fases: Na primeira divisão meiótica, durante a prófase I os cromossomos homólogos divididos longitudinalmente emparelham e podem trocar material genético num processo nomeado "crossing over" que aumenta a variabilidade dos descendentes, começa o desenvolvimento do complexo sinaptonémico, há formação de quiasmas (forma de cruz) e síntese de moléculas. O invólucro nuclear e os nucléolos dissociam-se. Durante á metáfase I, os cromossomos homólogos dispõem-se no plano equatorial da célula. Na anáfase I não ocorre a divisão dos centrômeros, migrando os cromossomos homólogos inteiros para um dos pólos. Durante a telófase I os cromossomos desfazem a formação espiral ou iniciam, diretamente a segunda divisão meiótica das células.

Na segunda divisão meiótica, A prófase II é mais rápida que a prófase I, formando-se o fuso acromático. Na metáfase II os cromossomos dispõem-se na placa equatorial e ligam-se as fibras ao fuso enquanto as bolas se dispersam em relação ao tempo equatorial. Durante a anáfase II os cromossomos filhos migram para os pólos opostos. Na telófase II os cromossomos desfazem a formação espiral e reaparecem os nucléolos, o citoplasma divide-se em quatro células haplóides originadas a partir da célula que deu início ao processo. Objetivo: visualizar, caracterizar e diferenciar as etapas (fases) da meiose em fungos, vegetais e/ou animais. Materiais e métodos Instrumental Lâminas, lamínulas, lâmina de barbear ou bisturi, estiletes, pinças, placa de petri, papel filtro, microscópio fotônico, lupa, lamparina de álcool.

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Químicos Carnoy (álcool etílico absoluto e ácido acético glacial 3:1), solução de ácido acético 50%; Corantes: solução de orceína acética 1%, e/ou aceto-carmim 1%, e/ou carmin propiônico. Biológicos Fungos, anteras imaturas de inflorescências ou flores de diferentes plantas (ex., milho), e insetos. Procedimentos Colha o material biológico e fixe-o em carnoy (3:1) por 5-10 min. Retire vários botões de diversos pontos da inflorescência, remova as anteras (ou os fungos ou as gônadas de animais invertebrados ou vertebrados) colocando sobre a lâmina e com auxilio dos estiletes e/ou pinças libere as células sobre uma gota de corante. Cubra com lamínula e esmague (bata) suavemente sobre esta, com a ponta do estilete ou de uma caneta. Com as plantas e fungos, aqueça o preparado brevemente na lamparina sem deixar ferver, duas ou três vezes. Com ajuda de papel filtro pressione e remova o excesso de corante. Levar ao microscópio fotônico, observação nas objetivas de 10, 40 e 100x. Pode vedar a lamínula com esmalte incolor, passando duas ou três vezes. Resultados Observe ao microscópio o material biológico e identifique as células em meiose e em interfase. Diferencie, caracterize e desenhe as fases da meiose. Qual etapa do ciclo celular é mais freqüente no tecido observado? Explique. Nas metáfases I II conte o número de cromossomos Análise os dados de diferentes materiais biológicos (animais, fungos e plantas), discuta as diferenças. Discussão Por que o número de cromossomos deve ser reduzido na meiose? (Milho, 2n=20 cromossomos, n=10). Por que o processo de meiose permite variabilidade genética? Bibliografia: ALBERTS B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologia Molecular da Célula, 4a ed, Edit

Artes Médicas, Porto Alegre, 2004 (2002 ing.). CARVALHO HF, Recco-Pimentel SM. A Célula. 2a ed, São Paulo: Manole, 2007. DE ROBERTIS EMF, HIB J. Bases da Biologia Celular e Molecular, 4a ed, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,

2006 (2004). GONZÁLEZ T, SPINEL C (ED). Práticas de Laboratório: Biología Celular. Notas de clase, Facultad de

Ciencias, Bogotá: Universidad Nacional de Colombia, 2004. JORDÃO BQ et al. Práticas de Biologia Celular. Londrina: UEL, 1998. JUNQUEIRA LC, Uchoa LC, Carneiro J. Biologia Celular, 8a ed, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2005. RAVEN PH, EVERT RF, EICHHORN SE. Biologia Vegetal. 7a ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007

(2005 em ing). Citologia Prof Cynara. http://www.cynara.com.br/citologia.htm Anexos: http://pt.wikipedia.org/wiki/Meiose

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Fases da mitose e da meiose. I interfase, II Prófase, III Prometáfase, IV Metáfase, V e VI Anáfase, VII Telófase, VIII Citocinese. Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Mitose e Raven et al, 2005.

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Curso de Ciências Biológicas Projeto de Ensino Práticas de Biologia Celular – Citologia & Citogenética

Roteiro de aula prática N° 17 e 18: Identificação de Material Permanente. Resumo

As características morfológicas e estruturais das células e dos tecidos permitem a identificação de material. Com uso de lâminas permanentes será identificado material histológico presente no laboratório. Introdução

As células conformam os tecidos que por sua vez constituem os diversos órgãos do corpo, nos mamíferos essas células e a matriz extracelular (modificação de superfície celular produzida pelas células) estruturam o tecido. A matriz é quase inexistente em alguns tecidos, porém, em outros é abundante e contém macromoléculas importantes do ponto de vista estrutural e funcional. Apesar da complexidade do organismo dos mamíferos, há apenas quatro tipos básicos de tecidos: epitelial, conjuntivo, muscular e o nervoso. O tecido conjuntivo caracteriza-se pela riqueza e material extracelular produzido por suas células. O tecido muscular é formado por células alongadas especializadas na contração, enquanto o tecido nervoso é formado por células com prolongamentos especializadas em receber, gerar e transmitir os impulsos nervosos. Os epitélios são constituídos por células geralmente poliédricas, justapostas, entre as quais se encontra pouca substância extracelular. Geralmente as células epiteliais aderem-se firmemente umas às outras, formando camadas celulares contínuas que revestem a superfície externa e as cavidades do corpo (boca, fossas nasais, tubo digestivo, entre outros). Objetivo

Visualizar, caracterizar e diferenciar lâminas permanentes de diferentes tecidos. Com auxilio de livros, atlas (de biologia celular e histologia) e arquivos eletrônicos serão diferenciadas, caracterizadas e identificadas lâminas permanentes presentes no laboratório. Materiais e métodos Instrumental Lâminas permanentes, microscópio fotônico, lupa, computador. Biológicos Lâminas permanentes de diferentes tecidos. Procedimentos Separar o material (lâminas) por semelhança, usar a lupa. Levar ao microscópio fotônico, observação nas objetivas de 10, 40 e 100x. Análise da morfologia celular e da estrutura tecidual. Caracterize as células, faça um desenho. Identificação compare o material com livros e arquivos eletrônicos. Marcar as lâminas identificadas. Resultados e Discussão Observações ao microscópio do material biológico, identificando células e tecidos. Diferencie, caracterize e desenhe as estruturas mais relevantes. Separar e marcar o material para ser incluído na coleção. As características observadas estão relacionadas com as imagens bibliográficas? Bibliografia: CARVALHO HF, Recco-Pimentel SM. A Célula. 2a ed, São Paulo: Manole, 2007. CAMBELL MK, FARRELL SO. Bioquímica: vol 2, biologia molecular. São Paulo: Thomson Learning, 2007. DE ROBERTIS EMF, HIB J, PONZIO R. Biologia Celular e Molecular (De Robertis). 14a ed, Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 2003. GENESER F. Histologia. 3a ed, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2003. JUNQUEIRA LC, CARNEIRO J. Histologia Básica, 10a ed, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004. KÜHNEL W. Atlas de citologia, histologia e anatomia microscópica, para teoria e prática, Guanabara

Koogan, Rio de Janeiro, 1991. SOBOTTA J, WELSCH U (edt). Sobotta / Atlas de histologia – citologia, histologia e anatomia microscópica.

6a ed, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2003.

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Curso de Ciências Biológicas - 2007 Projeto de Ensino Práticas de Biologia Celular – Citologia & Citogenética

Roteiro de aula prática N° 19: Ciclo celular - Mitose & Meiose – Laboratório virtual. Resumo

Nas práticas 8/9 e 14/15 foram abordados os eventos mitose e meiose respectivamente. O objetivo desta prática é verificar as fases e diferenças desses dois processos no ciclo celular dos organismos eucarióticos. Para tanto serão usados locais da internet com tutoriais sobre esses assuntos. http://www.biologia.arizona.edu/

Introdução

Animações gráficas permitem visualizar de forma resumida os processos celulares, facilitando o entendimento de diferentes atividades da fisiologia (funcionamento) celular. Objetivo

Visualizar, caracterizar e diferenciar as etapas (fases) da mitose e meiose. Materiais e métodos Instrumental Computadores e acesso à rede (internet). Procedimentos Procure na rede o local: http://www.biologia.arizona.edu/ Entrar em: Biologia Celular

Depois em: Ciclo celular e mitose

Acompanhe as páginas (3) até o final entrando em página seguinte No final da página de mitose, tem uma animação, execute ela! Volte na página inicial - Biologia Celular - e entre em: Meiose Siga as páginas até o final e entre nas animações No final tem uma comparação de fatos entre mitose e meiose, veja!! Resultados Revise os conteúdos das páginas eletrônicas e seus conceitos. Do observado, faça desenhos resumo. Trabalhe a guia de exercícios tanto de mitose como da meiose! Discussão Troque informações com os colegas e monitores, faça perguntas, discuta! Revise outros locais na rede e compare as páginas e animações Bibliografia Bionet – Biologia Celular, UFMT. http://www.ufmt.br/bionet/principal.htm Citologia Prof Cynara. http://www.cynara.com.br/citologia.htm KIMBALL JW. Kimball’s Biology Pages. http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/

http://cellbio.utmb.edu/cellbio/ http://celulas.no.sapo.pt/inicial_central.htm http://hivmedicine.aidsportugal.com/hivmedicine2003/pathogen.htm http://io.uwinnipeg.ca/~simmons/Cell%20Tour/index.htm http://kentsimmons.uwinnipeg.ca/cm1504/15pptfall05/Cell%20Tour_files/frame.htm http://www.cofc.edu /~delliss/IntroBioPage%20F'06/Intro%20Bio%20ppt/ http://www.ibiblio.org/virtualcell/; http://microbes.limnology.wisc.edu; www.sbmicrobiologia.org.br; www.splammo.net; www.unb.br/ib/cel/microbiologia/index.html; http://cromatina.icb.ufmg.br/

http://www.biologia.arizona.edu/; http://pt.wikipedia.org/wiki/Meiose

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Roteiro de aula prática N° 20: Lipídios. Introdução. Os lipídeos são substâncias caracterizadas pela baixa solubilidade em água e outros solventes polares, e alta solubilidade em solventes apolares. São vulgarmente conhecidos como gorduras e suas propriedades físicas estão relacionadas com a natureza hidrófoba das suas estruturas, sendo todos sintetizados a partir da acetil-CoA. Na verdade, todas as relevâncias do metabolismo lipídico advêm desta característica hidrofóbica das moléculas, que não é uma desvantagem biológica (mesmo o corpo possuindo cerca de 60% de água). Justamente por serem insolúveis, os lipídios são fundamentais para estabelecer uma interface entre o meio intracelular e o extracelular, francamente hidrófilos. Todos os seres vivos possuem a capacidade de sintetizar os lipídios, existindo, entretanto, alguns lipídios que são sintetizados unicamente pelos vegetais, como é o caso das vitaminas lipossolúveis e dos ácidos graxos essenciais. Cutina, Suberina e outras deposições de lipídios podem ser visualizadas pelos “corantes Sudão”, tipo Sudan black ou Sudan IV (Cortelazzo, 2007 em Carvalho & Recco-Pimentel, 2007). Materiais e métodos Instrumental Lâmina, lamínula, microscópio fotônico, lâmina do tipo gilete, placa de petri, pincel fino. Químicos Água, álcool, corantes: Sudan Black, Sudan IV. Biológicos Laranja e limão (Citrus sp.); outros materiais vegetais (cortes transversais). Procedimentos Pegue a laranja ou limão, e faça um corte bem fino com o auxilio de uma lâmina (gilete), de maneira que a luz ultrapasse o material. Ou também cortes de galhos, raízes, ou hastes finos. Coloque o material sobre uma placa de petri e em seguida pingue uma gota de sudan IV. Com o auxilio de um pincel, pegue o material e coloque sobre uma lâmina. Para poder visualizar, coloque uma lamínula sobre a lâmina e leve ao microscópio fotônico nas lentes de 10x, 40x e 100x. Resultados e Discussão Identifique o que foi observado. Esquematize (desenhe) o que foi observado nas objetivas de 40x e 100x. Bibliografias: CARVALHO HF, Recco-Pimentel SM. A Célula. 2a ed, São Paulo: Manole, 2007. Rodrigues AN, Estelita MEM. Anatomia da raiz de Cyperus giganteus Vahl (Cyperaceae) em desenvolvimento. Rev. bras. Bot.vol.27 no.4: São Paulo Oct./Dec.2004. Disponível em: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-84042004000400003 http://www.geocities.com/capecanaveral/launchpad/9071/Lipidios.html http://www.dbc.uem.br/docentes/praticas. www.qmc.ufsc.br/quimica/pages/especiais/revis... Anexo: Cyperus giganteus ou "piri", (Fonte: Rodrigues & Estelita, 2004). Nessa região observa-se a deposição da lamela de suberina, na endoderme, e a lignificação do parênquima medular (figuras 14, 15). Em regiões subseqüentes, as células da hipoderme se impregnam de substâncias lipofílicas e fileiras de células braciformes, do córtex interno, colapsam em arranjo radial finalizando a diferenciação do aerênquima (figuras 15, 16). As células da endoderme adquirem espessamento e sofrem lignificação e impregnação por substâncias fenólicas (figura 16). A raiz madura apresenta cerca de 30 polos de protoxilema; estando também presentes alguns idioblastos na região medular.

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Roteiro de aula prática N° 21 e 22: Inclusão em Parafina e Basofilia. Introdução

Para o preparo de lâminas permanentes de material incluído em parafina é necessário que previamente seja adequadamente coletado (fresco) e processado. O processamento consiste de vários passos: fixação (preservação da química e morfologia celular, impede a autólise ou degradação bacteriana do material biológico e facilita a coloração); lavagem (caso tenha sido fixado com compostos da família do formol); desidratação (em séries de álcool e xilol); diafanização ou clareamento (em xilol ou óleo de cedro); embebização e inclusão (em resina ou parafina); corte; desparafinização (em xilol ou quente); reidratação (em séries de álcool e em água); coloração; desidratação (em séries de álcool e xilol) e montagem .

Basofilia: é a capacidade de coloração de substância (corante) com caráter básico, ou a afinidade de um substrato por corantes básicos. Corantes basofílicos (ou acidófilos) coram compostos ácidos como DNA, RNA, a ribonuclease, ácidos mucopolissacarídeos na matriz extracelular e os petidoglicanos da parede das bactérias entre outros. Entende-se a basofilia como o fenômeno citoquímico no qual um substrato carregado negativamente, chamado aniônico, reage eletrostaticamente com um corante carregado positivamente, dito catiônico. Exemplos destes corantes temos Azul de Toluidina, Azul de Metileno e Azul de Alcian. A hematoxilina, embora não seja um corante, pode ser considerada um complexo de corantes que comportam-se como corante catiônico. Esses corantes reagem com os elementos ionizáveis nos tecidos que apresentam os grupamentos aniônicos, como os grupamentos: fosfato (PO4

2-) dos ácidos nucléicos, sulfato (SO42- e SO3

-) dos glicosaminoglicanos ácidos sulfatados da matriz extracelular e os grupamentos carboxila (CO2

-) das proteínas e glicosaminoglicanos ácidos carboxilados (Carvalho & Recco-Pimentel, 2007). Material e Equipamentos Instrumental Lâmina, lamínula, microscópio óptico, lâminas de barbear, placa de petri, pincel fino. Químico Azul de toluidina 0,20%, azul de metileno 0,1% filtrados, água destilada; ácido acético 45%, solução Carnoy, 100 mL de cada solução alcoólica. Biológico Minhocas, ou vísceras (fígado, rim, coração) de aves ou camundongos. Procedimentos Sacrificar as minhocas em éter etílico (frasco com um chumaço de algodão embebido com éter, 4-5 min). Cortar o material biológico em pedaços pequenos (3-6) mm. Fixar em Solução Carnoy, 10 a 20 min com três trocas, ideal 2-4 h com trocas constantes (até ficar limpo). Retirar do fixador e enxugar rapidamente em toalha de papel. Desidratar em banhos seriados de álcool 80, 90, 100, 5 a 10 mim cada banho; + dois banhos de xilol de 1 min. Embeber na Parafina liquida a 56oC (5 min, permitindo a impregnação) e incluir na parafina formando blocos de 1 cm2 e deixar esfriar a temperatura ambiente (pode colocar no freezer, 5 a 10 min). Fazer cortes muito finos com a gilete o com bisturi sobre placa de petri. Coletar 2-3 cortes e colocar sobre lâmina, com a lâmina levemente inclinada adicionar 2 a3 gotas de xilol 2 a 3 vezes para retirar a parafina ou levar a estufa aquecida a 50-60 graus 2 a 5 min para fixar o tecido na lâmina. Aplicar o procedimento de hidratação-coloração-deshidratação que está a seguir. Sem meio de montagem (bálsamo, entellan, euparal, ou permount) use esmalte transparente, coloque 2 gt e uma lamínula. Obs: para poder visualizar, leve ao microscópio óptico nas lentes de 10x, 40x e 100x; tirar fotos com máquinas digitais. Prática de Basofilia Materiais

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Lâminas com cortes em Parafina do tecido fixado em Carnoy (figado, rim, outro); Séries gradativas de etanol, 50, 70, 80, 95 e 100% (v/v); Hematoxilina Mayer; Solução Scott; Eosina; Azul de Toluidina; Xilol; Lamínulas e meio de montagem (Entellan, Permount, Bálsamo de Canadá ou Esmalte transparente); Microscópio. Procedimento Pegue uma lâmina com corte. Previamente os cortes em parafina foram montados sobre lâminas, e desparafinizados com xilol. As lâminas serão acondicionadas em jarras Coplin (caixas de vidro) contendo xilol. As lâminas serão removidas do xilol e transferidas às soluções indicadas a seguir (deixando em cada solução o tempo indicado em parênteses): Obs: Não permita que as lâminas sequem em qualquer etapa do procedimento. Transfira as lâminas seqüencialmente às jarras Coplin contendo:

Etanol Absoluto (1 min). Etanol 95% (1 min). Etanol 80% (1 min). Etanol 70% (1 min). Etanol 50% (1 min). Água destilada (1 min). Hematoxilina (3 min). Água destilada ou corrente continuamente (2 a 3 min). Solução Scott (3 min) – opcional (se tiver). Eosina (30 segundos). Mergulhe 2X em etanol 95%. Mergulhe 2X em Etanol Absoluto. Mergulhe 5X em água corrente. Core com azul de Toluidina (10 segundos). Mergulhe rapidamente em água destilada. Mergulhe 1X em etanol 95%. Mergulhe 5X em dois banhos Etanol Absoluto. Coloque em Xilol I (2 minutos). Coloque em um segundo Xilol II (2 minutos).

Remova as lâminas do Xilol II, adicione uma gota de meio de montagem e coloque uma lamínula. Examine as lâminas com objetivas de baixo aumento (10X) e maior (40X) do microscópio óptico. No use o óleo de imersão – o meio de montagem pode tomar vários dias para secar completamente e as lâminas devem ser tratadas cuidadosamente. Informe-se dos cuidados com as lâminas. *Obs, seja particularmente cuidadoso para não sujar as lentes com o meio de montagem.

Região Hiperbasofílica do fígado de um rato Desenhar cada lâmina e comparar com preparações comerciais de material corado por basofilia. Notas: Esta técnica foi elaborada originalmente para a análise de mastócitos (no tecido conjuntivo), para demonstrar a coloração diferencial das células. A técnica resultará em células com o citoplasma rosa e o núcleo azul a roxo. Esta é a cor padrão em células animais, as células de plantas usualmente coram em verde com núcleos vermelhos. Com o corante basofílico, o colágeno (um material extracelular) cora em rosa, e os eritrócitos (hemácias) coram em vermelho. O procedimento é uma modificação de coloração Hematoxila & Eosina padrão usada pela maioria dos citólogos. O procedimento adiciona o uso de azul de toluidina, um corante metacromático. Isto é, o corante tem cores diferentes dependendo da natureza química de sua polimerização. Coloração intensa com estes corantes é conhecida como hiperbasofilia, e é freqüentemente usada em diagnóstico clinico de patologias. Resultados e Discussão

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Identifique o que foi observado. Esquematize (desenhe) o que foi observado nas objetivas de 40x e 100x. Relate e discuta. Bibliografia: (Pegar Livros de biologia celular, histologia e zoologia na biblioteca) AMABIS JM, MARTHO GR. Curso básico de biologia, v.1. Células e tecidos. São Paulo: Moderna, 1985. CARVALHO HF, Recco-Pimentel SM. A Célula. 2a ed, São Paulo: Manole, 2007. http://homepages.gac.edu/~cellab/index-1.html http://homepages.gac.edu/~cellab/chpts/chpt2/ex2-2.html http://homepages.gac.edu/%7Ecellab/chpts/chpt2/figure2-4.html JORDÃO BQ et al. Práticas de Biologia Celular. Londrina: UEL, 1998. JUNQUEIRA LC, Uchoa LC, Carneiro J. Biologia Celular, 8a ed, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2005. RUPPERT ED, Fox RS, Barnes RD. Zoologia de Invertebrados. 7a ed. São Paulo: Rocca, 2005. VIDAL BC, MELO ML S. Biologia celular. Livraria Atheneu, Rio de Janeiro e São Paulo, 1987.

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Curso Ciências Biológicas - 2007 Projeto de Ensino Práticas de Biologia Celular – Citologia & Citogenética

Roteiro de aula prática N° 23: Lâminas Permanentes. Resumo

Verificar o contraste de coloração em tecidos e na descrição da morfologia celular, por meio do uso de metodologia de fixação, hidratação, coloração e desidratação para lâminas permanentes de tecidos animais. Esse tipo de técnica permite exame adequado em biologia celular e histologia. Introdução

A hematoxilina é um composto que se obtém da planta leguminosa Haematoxylum campechianum, conhecida também pelo nome de Pau Campeche. É um produto natural que ao ser oxidado resulta numa substância de cor azul-púrpura escura denominada hemateína. É utilizada em histologia para colorir os componentes aniônicos (ácidos) dos tecidos, aos quais dá uma coloração violeta. Colore intensamente os núcleos das células, devido ao fato de que estes contêm ácidos nucléicos ricos em radicais ácidos. As estruturas que a hematoxilina colore são chamadas basofílicas. Como é obtida da planta e logo deve sofrer o processo de oxidação, sua capacidade de tingimento é muito limitada. Portanto, deve combinar-se com íons metálicos, especialmente os sais de ferro (III) o alumínio (II), que atuam como mordentes. Ainda que a hematoxilina seja um sal neutro, se caracteriza por ser um corante básico, já que o componente cromógeno reside no complexo catiônico (básico) da mesma. É de se notar que a coloração histológica pela hematoxilina não indica tanto a constituição química dos componentes celulares, senão a densidade de cargas elétricas negativas dos mesmos.

Estrutura da hematoxilina A Eosina Amarelada é um corante vermelho arosado com leve tom amarelado com fluorescência róseo-

alaranjada quando em solução alcóolica ou aquosa, bordô escuro quando sólido, resultante da ação do bromo sobre a fluoresceína. É usado em conjunto com outros corantes (tal como o Orange G, o Verde Luz Amarelado e a Fucsina Ácida) na coloração de citoplasma, colágeno e fibras musculares para exame sob o microscópio. É um corante ácido que confere cor vermelha em tais colorações. Na célula, sua estrutura aniônica (-) liga-se a estruturas acidófilas ou eosinófilas corando o citoplasma e outras estruturas que têm afinidade com a porção básica (proteínas citoplasmáticas, hemoglobina, mitocôndrias, alguns grânulos de armazenagem e secreção) - estruturas catiogênicas (+).

A Eosina Azul de Metileno tem um muito leve tom azulado. Os dois corantes são intercambiáveis, e é comum o uso de um pelo outro.

Essa aula tem como principal objetivo, verificar o contraste de coloração em tecidos e na descrição da morfologia celular, por meio do uso de metodologia de fixação, hidratação, coloração e desidratação para lâminas permanentes de tecidos animais. Esse tipo de técnica permite exame adequado em biologia celular e histologia.

Eosina Amarelada Eosina Azul de Metileno

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Material e Equipamentos Instrumentos Lâmina, lamínula, microscópio, lâminas de cortar novas, Béquer, placa de petri, pincel fino, estufa Químico Parafina histológica; Água destilada (H2Od); ácido acético 45%; Solução Carnoy: álcool etílico absoluto-ácido acético glacial (3:1); séries de etanol, 50, 70, 80, 95 e 100% (v/v) (100 mL de cada solução alcoólica), Xilol; Corantes como Azul de toluidina 0,20%, pH 4,0 (C15H16ClN3S); azul de metileno 0,1% (C16H18ClN3S. 3H2O) filtrados, e hematoxilina e eosina. Biológico Vísceras frescas de aves (coração, rim e fígado de frango), retirar e fixar rapidamente em Carnoy. Procedimentos Sacrificar o material biológico em éter etílico (frasco com um chumaço de algodão embebido com éter, 4-5 min). Retirar e/ou cortar o material biológico com uso de bisturi (navalha ou lâmina de barbear) em pedaços pequenos (3-6) mm, caso seja muito grande o material. Fixar em Solução Carnoy, 10 a 20 min - três (3) a cinco (5) trocas, use mais se necessário; ideal 2-4 h à 4oC. Retirar o material do fixador e enxugar com cuidado rapidamente em toalha de papel. Desidratar em banhos seriados de álcool 80, 90, 100, 5 a 10 mim cada banho; + dois banhos de xilol de 1 min. Incluir o material na Parafina a 58oC (use um Béquer para derreter a parafina) formando blocos de ~1,5 cm2 e deixar esfriar a temperatura ambiente 5 min, depois coloque em geladeira (ou freezer, 20 a 40 min) Fazer cortes muito finos com a gilete o com bisturi sobre placa de petri. Coletar 2-3 cortes e colocar sobre lâmina, com a lâmina levemente inclinada adicionar 2 a3 gotas de xilol para retirar a parafina ou levar a estufa aquecida a 50-60 graus 2 a 3 min para fixar o tecido na lâmina. Aplicar o procedimento de hidratação-coloração-desidratação do corte: Importante: não deixe que a lâmina com o corte seque durante todo o processo.

1. Goteje duas ou três gotas de cada solução sobre a lâmina(s) de forma seqüencial, deixando o tempo indicado (em parênteses), logo retire inclinando levemente em um Baker de descarte:

o Etanol Absoluto (1 min) o Etanol 95% (1 min) o etanol 80% (1 min) o etanol 70% (1 min) o etanol 50% (1 min) o Água destilada (1 min) o Corar com Hematoxilina (3 min) o Pingue água destilada ou corrente continuamente (2 a 3 min) o Corar com Eosina (30 segundos) o Etanol 95%, duas vezes (2X) o Uma gota de Etanol Absoluto, duas vezes (2X) o Uma gota de água, cinco vezes (5X) o Contra-corar com azul de toluidina (10 seg) o Passe água destilada rapidamente o Uma gota de etanol 95%. o Uma gota de etanol Absoluto, dez vezes (10X) o Coloque etanol Absoluto (1 gt) por (20 seg) o Retire e adicione Xilol (1 gt) (2 min) não deixe secar o Coloque de novo Xilol (2 min)

2. Retire o xilol, adicione uma gota de meio de montagem ou de esmalte* e uma lamínula. 3. Examine as lâminas com as objetivas de pouco aumento (10X) e maior aumento (40X) do microscópio.

Não use a lente para óleo de imersão (100X) até que a preparação tenha secado completamente - o meio de montagem pode tomar vários dias até secar suficientemente, as lâminas devem ser tratadas adequadamente. Deixe as lâminas em local arejado na posição horizontal.

*Sem meio de montagem (entellan ou permount) use esmalte transparente, coloque 2 gt e uma lamínula.

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Obs, para poder visualizar, leve ao microscópio fotônico nas lentes de 10x, 40x e 100x; tirar fotos com maquinas digitais. Seja particularmente cuidadoso para não sujar as lentes do microscópio com o meio de montagem ou esmalte. Resultados e Discussão (a) Identifique o que foi observado; (b) Esquematize (desenhe) o que foi observado nas objetivas de 10, e 40x; c) Relate e discuta; após 5 a 7 dias observe na objetiva de 100X. Bibliografias AMABIS JM, MARTHO GR. Curso básico de biologia, v.1. Células e tecidos. São Paulo: Moderna, 1985. CARVALHO HF, Recco-Pimentel SM. A Célula. 2a ed, São Paulo: Manole, 2007. http://homepages.gac.edu/~cellab/index-1.html http://homepages.gac.edu/~cellab/chpts/chpt2/ex2-2.html http://homepages.gac.edu/%7Ecellab/chpts/chpt2/figure2-4.html http://pt.wikipedia.org/wiki/Hematoxilina http://pt.wikipedia.org/wiki/Eosina JUNQUEIRA LC, Uchoa LC, Carneiro J. Biologia Celular, 8a ed, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2005. RUPPERT ED, Fox RS, Barnes RD. Zoologia de Invertebrados. 7a ed. São Paulo: Rocca, 2005. VIDAL BC, MELO ML S. Biologia celular. Livraria Atheneu, Rio de Janeiro e São Paulo, 1987.

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Roteiro de aula prática N° 24: Cromossomos de insetos II Resumo

Os cromossomos são estruturas celulares microscópicas, eles podem ser visualizados quando a cromatina está condensada nas fases de mitose ou de meiose do ciclo celular, e também em células endomitóticas com cromossomos politênicos. A prática permitirá comparar e identificar cromossomos com técnicas citológicas de Orceína e citoquímicas de Feulgen (reativo de Schiff). Introdução

Os Insetos apresentam órgãos como cérebro, gônadas, glândulas salivares e túbulos de malpighi entre outros, para análise fácil e rápida dos cromossomos. Em muitos tecidos de insetos, além de ciliados, mamíferos e plantas, as células perdem a capacidade de se dividir (mitose) em uma dada fase inicial do desenvolvimento, e os cromossomos continuam a replicar-se por um processo de endomitose sem a divisão do núcleo. Tais células são chamadas endopoliplóides, podendo conter em seus núcleos os chamados cromossomos politênicos. Técnicas de citologia com uso de orceína coram DNA e proteínas, já técnicas citoquímicas como Feulgen são específicas e coram aldeídos e cetonas, e desta forma DNA denaturado. A reação de feulgen tem duas etapas essenciais, a hidrolise e a ligação do ácido apurínico com o reativo de Schiff. O processo de hidrolise (com o HCl) desnatura o DNA abrindo a dupla hélice e hidrolisa a ligação das purinas (adenina e guanina) com a pentose, liberando neste açúcar o aldeído para reagir com o reativo de Schiff. A hidrolise tem um tempo ideal dependendo da temperatura e da concentração do HCl, passado este tempo inicia-se uma perda gradual de pirimidinas e despolimerização do ácido apurínico (Mello & Vidal, 1978; Vidal & Mello, 1987). Objetivo: Comparação de técnicas citológicas e citoquímicas para cromossomos de insetos. Materiais e métodos Instrumentos Agulhas de dissecção, lâminas, lamínulas, lâmina de barbear ou bisturi, estilete, pinças finas, Becker, tubo de ensaio pequeno, placa de petri, papel filtro, microscópio fotônico, lupa. Químicos Água, Solução salina 0,9, carnoy: álcool etílico absoluto-ácido acético glacial (3:1), solução de ácido acético 50% (1 água: 1 de ácido acético glacial); Ácido lático; HCL 5 N (70ml de água + 50ml de HCl 12 N); Corantes: solução de orceína acética 1-2%; Reativo de Schiff (1g de Fuchsina básica + 200 cc de água destilada fervendo, esfriar até 50oC, + 2 a 4g de metabisulfito de K ou Na, dissolver bem, + 10 ml de HCl 1N: 8,25 ml 12N + água até 100 ml de solução, 1 a 3 horas no escuro (ideal 24 horas), + 200 mg carvão ativado, filtrar e manter em geladeira e no escuro). Biológicos Larvas, pupas e/ou adultos de insetos díptera (mosquitos) e himenópteros (abelhas) ninfas e/ou adultos de ortóptera (gafanhotos), outros. Procedimentos Colete o material biológico (larvas, pupas/ninfas e/ou adultos dos insetos) fresco ou fixado. 1. Orceína Utilizando-se larvas, pupas e adultos poderão ser feitas lâminas para obtenção dos cromossomos de gânglios cerebrais, glândulas salivares, ovários (alongados), testículos (mais pequenos e arredondados) e/ou túbulos de Malpighi, pela técnica convencional de coloração com Orceína Acética (OA). Disecte os insetos em água ou em solução salina 0,9% para a retirada dos órgãos. Coloque os órgãos (tecidos) retirados em uma lâmina com água por 2-5 min (hipotonia). Com ajuda de uma agulha ou pinça passe o tecido para uma lâmina com solução fixadora carnoy (1-2 gotas) onde deve permanecer para fixação rápida 2-3 min. Pode dar um banho adicional (ou não) de ácido acético 50-100% 2-5 min Coloração com OA 1-2% 2-3 min. Transfira o material para uma gota de ácido acético glacial - ácido lático P.A. 85-90%(1:1 v/v) ou uma solução de ácido acético 50%, 2 a 5 min, dissectar (cortar, dissecar) o tecido em pequenos fragmentos com ajuda das agulhas de ponta fina. Coloque uma lamínula sem deixar formar bolhas de

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ar, e esmague cuidadosamente o material com ajuda de um lápis até o material espalhar; com ajuda de papel filtro pressione a preparação com o polegar sem deixar escorregar a lamínula nem quebrar ela. Levar ao microscópio fotônico e observar nas objetivas de 10, 40 e 100x. 2. Reativo de Schiff (reação de Feulgen) As larvas, pupas e/ou adultos serão dissecadas em fixador de Carnoy fresco. Com ajuda de pinças e/ou agulhas de ponta fina, exponha as glândulas salivares na parte superior do corpo, ou retire com cuidado a parte posterior do corpo (dois últimos segmentos abdominais) dos insetos expondo os túbulos de Malpighi, e a seguir coloque esse material em água destilada por 20 min.

Depois passe para HCl 5N de 30 min a 45 min à temperatura ambiente (20 a 25oC). Após a hidrólise, o material será lavado duas vezes (2 min) em água destilada ou corrente. Colocar em reativo de Schiff por 0,5 a 1 h. Substituído o reativo por água sulfurosa (1g de metabissulfito de potássio em 200 ml de água destilada, mais 10 ml de HCl 1N) por 10 min. Finalmente lavar o material biológico com água corrente, 2 vezes, 5 min. Remover o órgão de interesse sobre uma lâmina com ácido acético 50% ou ácido lático 50% e colocar lamínula para a observação ao microscópio. Obs, se necessário será feita uma recoloração com orceína acética a 1-2% por 3 min. O excesso de corante será retirado com ácido acético a 50% e realizado o esmagamento das células (quando necessário) Resultados -Observe ao microscópio o material processado, identifique as células, núcleos e cromossomos. -Diferencie, caracterize e desenhe os cromossomos nas duas técnicas. -Quais são as diferenças observadas. -Análise os dados, explique e discuta as observações. Bibliografia ALBERTS B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologia Molecular da Célula, 4a ed, Edit

Artes Médicas, Porto Alegre, 2004 (2002 ing.). CARVALHO HF, Recco-Pimentel SM. A Célula. 2a ed, São Paulo: Manole, 2007. Campos J, Andrade CFS & Recco-Pimentel SM. Malpighian tubule polytene chromosomes of Culex

quinquefasciatus (Diptera, Culicinae). Mem. Inst. Oswaldo Cruz 98(3):383-386, 2003. http://www.scielo.br/pdf/rsp/v37n4/16789.pdf

Campos G J, Recco-Pimentel SM & Andrade CFS. Polytene chromosome analysis of a population of Simulium

pertinax (Diptera: Simuliidae). Rev. Bras. Genet. 19:47-52, 1996.

DE ROBERTIS EMF, HIB J. Bases da Biologia Celular e Molecular, 4a ed, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006 (2004).

French, W. L., Baker, R.H. & Kitzmiller, J.B. Preparation of mosquito chromosomes. Mosquito News 22 (4): 377-383, 1962.

JORDÃO BQ et al. Práticas de Biologia Celular. Londrina: UEL, 1998. JUNQUEIRA LC, Uchoa LC, Carneiro J. Biologia Celular, 8a ed, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2005. MELLO ML S, VIDAL BC. A reação de Feulgen. Ciência e Cultura, 30 (6): 666-676, 1978. VIDAL BC, MELLO ML S. Biologia celular. Livraria Atheneu, Rio de Janeiro e São Paulo, 1987. Cromossomos metafásicos: Cromossomos politênicos:

Aedes aegypti (Orceína) Culex quinquefasciatus (Orceína)

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Roteiro de aula prática N° 25: Decalque, Reação de Feulgen & Verde Janus.

Resumo

Os tecidos moles como fígado são usados para decalques (inprinting). A prática permitirá usar decalques com técnicas de Reação de Feulgen para componentes ácidos como ADN e Verde Janus para mitocôndrias. Introdução Para visualizar as células de órgãos com tecidos moles (que desprendem) como fígado, baço e testículos entre outros, preparações de lâminas pela técnica de decalque ou inprinting (imprimir) permitem a análise citológica fácil e rápida. O decalque consiste em encostar levemente um fragmento do órgão com tecido fresco sobre uma lâmina. A reação de Feulgen é a mais usada em citoquímica, é específica e estequiométrica. Pode identificar poliploidia, perdas e modificações no DNA. As mitocôndrias podem ser facilmente diferenciadas de outras organelas usando-se o corante verde janus. Esse corante pode ser uma substância redox, capaz de assumir características de um composto reduzido ou oxidado, em contato com a mitocôndria, pode ser oxidado (perda de elétrons) para uma forma corada pelo citocromo c oxidase, um dos componentes da cadeia respiratória (Pimentel, 2007). Obs. O indicador verde Janus B muda de coloração de acordo com a quantidade de oxigênio presente. Em presença de oxigênio - o indicador oxida-se a cor azul, na ausência de oxigênio - reduz-se a cor rosa.

Objetivo

Aplicar técnicas citológicas e citoquímicas em decalques de camundongo Mus musculus. Materiais e métodos Instrumentos Agulhas de dissecção, lâminas, lamínulas, lâmina de barbear ou bisturi, estilete, pinças finas, beaker, tubo de ensaio pequeno, placa de petri, papel filtro, microscópio fotônico. Químicos Água; solução salina 0,9; Carnoy (3:1); ácido acético 50%; Ácido lático; HCL 12 e 5 M; tampão fosfato pH 7,0; verde janus; Reativo de Schiff. Biológicos Camudongo, Mus musculus. Procedimentos Anestesie o camundongo em um frasco de vidro com um chumaço de algodão embebido em éter etílico, 6 a 10 min com tampa fechada. Com ajuda de um bisturi, retire com cuidado o fígado do camundongo em placa de petri (obs. outros órgãos devem ser aproveitados ou fixados para uso posterior). Corte fígado em cinco fragmentos, se possível mantenha em uma solução de tampão fosfato pH 7,0. 1. Decalque: Com ajuda de uma pinça encoste (imprima) o fragmento de forma firme, mas levemente, cinco vezes sobre uma lâmina. Deixe secar, até ficar levemente úmido, 1 a 3 min. Fixar em carnoi 3:1, 1 min (pingue umas gotas cobrindo os decalques). Retirar o carnoi e cobrir com álcool 70%, 5min (ou aplique o verde janus 0,7% em álcool). Retirar o álcool e Secar ao ar, 5 min (guardar em freezer se necessário). 2. Verde Janus: 8 a 10 lâminas com decalques de fígado de camundongo, após ter retirado o carnoi. Adicione o corante verde janus 0,7%, cobrindo os decalques por 2 a 3 min. Retire o corante e passe água rapidamente. Secar ao ar, passar em xilol (com a lâmina inclinada pingar umas gotas). Observar ao microscópio em 10 e 40 x. Montar em meio de montagem (Bálsamo de Canadá, Entellan ou esmalte transparente) e lamínula. 3. Reação de Feulgen (Reativo de Schiff):

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Pegue 8 a 10 lâminas com decalques de fígado de camundongo. Depois passe para HCl 5N de 40 a 45 min à

temperatura ambiente (20 a 25oC). Retire da hidrolise e Passe HCl 0,1 M, frio. Após a hidrólise, o material será lavado duas vezes em água destilada ou corrente. Colocar em reativo de Schiff por 40 min a 1 h. Passe o material por 3 banhos de água sulfurosa (18 ml H2Od: 1 g de metabissulfito de potássio: 1 ml de HCl 1M), isto via retirar o excesso de corante não ligado ao substrato. Lavar o material biológico com água destilada, 3 vezes, 2 min. Secar, passar xilol (pingar algumas gotas). Observação ao microscópio.* Montar em meio de montagem e colocar lamínula. * Obs: se necessário será feita uma recoloração com orceína acética a 0,5 a 1% por 2 min. O excesso de corante será retirado passando duas vezes água, secar, e passar xilol antes de montar. Resultados -Observe ao microscópio o material processado, identifique as células, núcleos e mitocôndrias. -Diferencie, caracterize e desenhe o material biológico observado. -Quais são as diferenças observadas nas duas técnicas. -Análise os dados, explique e discuta as observações. Bibliografia ALBERTS B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologia Molecular da Célula, 4a ed, Edit

Artes Médicas, Porto Alegre, 2004 (2002 ing.). Pimentel ER. Mitocôndria. Em: Carvalho HF, Recco-Pimentel SM. A Célula. 2a ed, São Paulo: Manole, 2007. DE ROBERTIS EMF, HIB J. Bases da Biologia Celular e Molecular, 4a ed, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,

2006 (2004). JORDÃO BQ et al. Práticas de Biologia Celular. Londrina: UEL, 1998. JUNQUEIRA LC, Uchoa LC, Carneiro J. Biologia Celular, 8a ed, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2005. MELLO ML S, VIDAL BC. Práticas em Biologia celular. Rio de Janeiro: Edgar Blucher, 1980. VIDAL BC, MELLO ML S. Biologia celular. Livraria Atheneu, Rio de Janeiro e São Paulo, 1987.