Apostila de Aulas Pr_ticas Imuno
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA DISCIPLINA DE IMUNOLOGIA Imunologia APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS 2006 PROFª ÂNGELA DA COSTA PEREIRA PROFª INÊS APARECIDA TOZETTI PROFº ANDRÉ LUIS SOARES DA FONSECA
Transcript of Apostila de Aulas Pr_ticas Imuno
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA DISCIPLINA DE IMUNOLOGIA
Imunologia
APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS 2006
PROFª ÂNGELA DA COSTA PEREIRA PROFª INÊS APARECIDA TOZETTI
PROFº ANDRÉ LUIS SOARES DA FONSECA
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SUMÁRIO
PARTE I
Técnicas de obtenção e conservação do material usado em Imunologia.........................
Diluições.........................................................................................................................
Cromatografia em Coluna................................................................................................
Eletroforese de proteínas.................................................................................................
Princípio Teórico da Fixação de Complemento...............................................................
Reação de Imunohemólise...............................................................................................
Reação de Fixação do Complemento..............................................................................
Precipitação em meio semi-sólido...................................................................................
Reação de Aglutinação....................................................................................................
Reação de Aglutinação Rápida para Pesquisa de Anticorpos Anti-Brucella.................
Reação de Microaglutinação Passiva - Reação de VDRL.............................................
Reação de Aglutinação indireta ou passiva Fator Reumatoide......................................
Imunohematologia Sistema ABO..................................................................................
Teste de Coombs Diagnostico da D.H.R.N...................................................................
Reação de Inibição de Aglutinação Passiva.....................................................................
ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY)………...........................
Reação de Imunofluorescência.........................................................................................
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PARTE II OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Resistência Inespecífica................................................................................................
Células do Sistema Imune............................................................................................
Formação de Células T e B e Órgãos Linfóides...........................................................
Antígeno.......................................................................................................................
Imunoglobulinas (I)......................................................................................................
Imunoglobulinas (II)....................................................................................................
Sistema Complemento.................................................................................................
Fagocitose....................................................................................................................
Complexo Principal de Histocompatibilidade (CHP/MHC).........................................
Células Apresentadoras e de Antígeno e Mecanismo de Apresentação........................
Linfócitos T...................................................................................................................
Linfócitos B e Resposta Primária e Secundária.............................................................
Genética de Imunoglobulinas........................................................................................
Interação do Sistema Imune..........................................................................................
Tolerância Imunológica.................................................................................................
Reações de Hipersensibilidade.....................................................................................
Transplantes..................................................................................................................
Eletroforese...................................................................................................................
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PARTE III ESTUDOS DIRIGIDOS E EXERCÍCIOS
Radioimunoensaio...........................................................................................................
ELISA.............................................................................................................................
Western blotting..............................................................................................................
Imunohistoquímica..........................................................................................................
Exercício sobre Resposta Imune às infecções..................................................................
Citometria de Fluxo.........................................................................................................
Referências Bibliográficas...............................................................................................
Anexo Portaria 23 para normatização do diagnóstico sorológico da Brucelose...............
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PARTE I TÉCNICAS
UTILIZADAS NAS AULAS PRÁTICAS
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TÉCNICAS DE OBTENÇÃO E CONSERVAÇÃO DO MATERIAL USADO EM IMUNOLOGIA
As reações imunológicas utilizadas em auxilio diagnóstico à clínica e na pesquisa experimental tem, mais freqüentemente o soro, como fonte de material do indivíduo (seja o homem ou outro animal). Embora essas reações possam também ser feitas no líquor e ainda em células linfóides deste indivíduo, o sucesso da reação dependerá, em grande parte, da boa condição em que essa material fonte se encontre à disposição do laboratório, o que decorrerá consequentemente da competência do médico, odontólogo, veterinário ou bioquímico na coleta de material, seja no consultório, no campo ou no próprio laboratório. Após a coleta, deve-se seguir o preparo e estocagem do material.
OBTENÇÃO DE SORO
O soro é a fração líquida do sangue, sem o fibrinogênio. Para obtê-lo colhemos uma amostra de 5 a 10 ml de sangue por punção intravenosa. Este sangue deve ser passado instantaneamente para um frasco, tendo-se para isto, o cuidado de retirar a agulha da seringa. O processo de coagulação do sangue começará a se estabelecer, então, de 30 minutos à 1 hora após a punção, coleta-se a fração líquida que se separou do coágulo . A seguir essa fração líquida é submetida à centrifugação de 1500 RPM durante 5 minutos para separar o soro do resto das hemácias. As hemácias se sedimentarão pela centrifugação e o sobrenadante se constituirá em uma amostra de soro isenta de hemólise e pronta para ser utilizada nas reações.
OBSERVAÇÕES IMPORTANTES
- Para se obter o soro, o sangue é colhido sem qualquer anticoagulante. - Antes de se passar o sangue da seringa para o frasco, este último já deve estar completamente seco e rotulado com a especificação do indivíduo. - O sangue colocado em frasco para a retração do coágulo deve ser mantido em repouso, sem agitação alguma. Se você precisar enviar a amostra do campo para a cidade procure antes retirar a fração líquida a partir do coágulo e enviá-la em um outro vidro bem tampado rotulado e acondicionado em caixa de isopor com gelo. O gelo deverá ficar dentro de um saco plástico para evitar penetração de água nos vidros com soro. - Você deverá também acondicionar em gelo, se tiver que mandar o soro de uma cidade para outro centro. - O laboratório se encarregará de centrifugação.
CONSERVAÇÃO DO SORO
- Em geladeira, se sua utilização for ocorrer nas primeiras 72 horas. - Em freezer, se for necessário uma estocagem por mais dias. Se necessário armazenar o soro, deve-se conservá-lo diluído a 1:2 em glicerina ou tratá-lo
com ázida sódica a 1% para inibição do crescimento de microrganismos e estocá-lo em freezer.
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DILUIÇÕES
A diluição é o ato de tornar mais fraca uma dada solução. Isto é conseguido geralmente adicionando-se a uma solução que se pretende diluir um diluente tal como água, ou cloreto de sódio a 0,85%, que não contenha nenhuma das substâncias diluídas, na quantidade requerida para conseguir uma diluição determinada. Usualmente se expressam as diluições como uma unidade da solução original sobre o total de unidades da solução final. Portanto, uma solução diluição 1/10 significa que uma unidade da solução concentrada foi diluída para um volume total de 10 unidades, ou seja, uma unidade em um total de 10 unidades. As diluições não devem ser interpretadas como significando uma unidade mais 10 unidades. As diluições podem ser representadas como 1:10, 1:50, etc, ou 1/10, 1/50 etc. Quando colocamos, por exemplo, 0,5 ml de NaCl a 0,85% em um tubo e adicionamos a esta solução 0,5ml de soro, ficamos com uma diluição do soro a 1:2, pois há 0,5 ml de soro em um volume total de 1,0 ml de solução, portanto uma diluição de 0,5:1,0 ou 1:2. Em imunologia clínica o título indica a concentração de anticorpo no soro do paciente. O título de anticorpo de um soro é a diluição mais alta de soro que reage com o antígeno. Por exemplo, se o último tubo que demonstra reação contém um volume de 1 ml e o soro neste tubo é uma parte em um total de 640 partes, o título é 640 unidade/ml de soro.
TÉCNICAS GERAL DAS DILUIÇÕES
Diluição em múltiplos de 10 Diluição a 1/10 1 ml + 9 ml ou 0,1 ml + 0,9 ml Diluição a 1/ 50 1 ml + 49 ml ou 0,1 ml + 4,9 ml 1 ml da diluição 1/10 + 4 ml do diluente Diluição 1/100 1 ml + 99 ml ou 0,1 ml + 9,9 ml 1 ml de 1/10 + 9 ml Diluição 1/500 1 ml 1/100 + 4 ml Diluição 1 /5000 1 ml 1/1000 + 4 ml Diluição 1/10000 1 ml 1/1000 + 9 ml
DILUIÇÕES VARIADAS Diluição a 1/5 = 1 ml + 4ml Diluição a 1/15 = 1 ml + 14 ml ou 0,1 ml + 1,4 ml Diluição a 1/20 = 1 ml + 19ml ou 0,1 ml + 1,9 ml Diluição a 1/25 = 1 ml + 24ml ou 0,1 ml + 2,4 ml
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DILUIÇÕES SUCESSIVAS
Nesta técnica se transfere sucessivamente volume determinado de um tubo para o tubo seguinte ao qual se adicionou uma certa quantidade de diluente. Exemplo - Diluições sucessivas na razão igual a 4: 1 - Distribuir nume série de tubos 3,0 ml do diluente em cada tubo. 2 - Ao tubo 1 adicionar 1 ml da solução corante (a ser diluída), homogeneizar com o auxilio
de uma pipeta. 3 - Transferir 1 ml do tubo 1 para o tubo 2, homogeneizar. 4 - Transferir 1 ml do tubo 2 para o tubo 3, homogeneizar. 5 - Prosseguir da mesma maneira até o último tubo da série, desprezando 1 ml do último
tubo.
As diluições obtidas serão: 1/4; 1/16; 1/64; 1/256; 1/1024;etc.
Exercício de Fixação:
1) Esquematize uma diluição 1/50 de uma solução previamente diluída a 1/10;
2) Esquematize uma diluição na razão 2 de um soro, utilizando inicialmente apenas o
volume de 0,5ml dessa amostra e diluindo até o 8º tubo;
3)Utilizando um volume de soro de 0,4ml, esquematize uma diluição na razão 3 até o 5º
tubo;
4)Esquematize uma diluição 1/64 de uma solução previamente diluída a 1/8;
5)Esquematize uma diluição 1/625, partindo de uma diluição 1/5;
6)Vamos imaginar que após a interação entre o antígeno e ao anticorpo, quando esses
estavam presentes em concentração suficiente, tenha ocorrido a formação de um
precipitado no fundo do tubo (como descrito abaixo na legenda). Com base no esquema
abaixo, determine o título dessa reação:
1/16 1/32 1/64 1/128 1/256
Ocorreu interaçãoAg-AC
Não ocorreu interação
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CROMATOGRAFIA EM COLUNA
Técnicas cromatográficas são atualmente métodos amplamente empregados para o fracionamento de proteínas e isolamento de imunoglobulinas. Nestas técnicas, uma amostra é depositada no ápice de um cilindro ou coluna de vidro, cheia de um gel sintético, e flui através do gel. As características físicas das moléculas de proteínas resultam em retenção destas na matriz do gel em graus diferentes, e a subsequente eluição, sob condições apropriadas, permite a separação das proteínas.
CROMATOGRAFIA POR TROCA IONICA
A cromatografia por troca iônica separa as proteínas aproveitando a diferença de suas cargas elétricas. A unidade funcional do gel é um grupamento carregado preso em um suporte, geralmente celulose. A dietilaminoetil-celulose (DEAE-celulose) é uma resina positivamente carregada, sendo usada para o fracionamento de moléculas negativamente carregadas. A carboximetil-celulose (CM-celulose) é uma resina carregada negativamente, e é usada para o fracionamento de moléculas positivamente carregadas.
A B C
PRINCÍPIOS DA CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA
A = a camada da coluna é feita de uma matriz de partículas de celulose positivamente carregadas.
B = a solução contendo moléculas negativamente carregadas e outras neutras é colocada na coluna.
C = as moléculas negativamente carregadas, na mistura protéica ligam-se à coluna e são retidas, enquanto que as moléculas neutras passam entre as partículas carregadas e são eluidas.
A troca do pH do tampão que passa através da coluna afeta a carga da molécula protéica. O aumento da molaridade do tampão fornece mais íons para competir com a proteína pela ligação ao gel. Pelo aumento da molaridade ou diminuição gradual do pH do tampão de eluição as proteínas são eluidas em função do número crescente de grupos carregados ligados ao gel. No quadro a seguir temos exemplificado a molaridade de NaCl e pH requeridos para eluir as proteínas plasmáticas humanas da DEAE-celulose.
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------------------------------------------------------------------------------------------------------------ Molaridade de NaCl PH Proteínas eluidas ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 0,025 7,8 IgG 0,045 7,0 transferrina, fibrinogênio 0,050 7,0 α 2 globulina, albumina, IgA 0,080 6,5 albumina, α 2 globulina, β lipoproteína 0,100 6,5 α2 globulina, β globulina, haptoglobina ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ A cromatografia em DEAE - celulose é uma técnica excelente para o isolamento de IgG, a qual pode ser obtida quase livre de todas as outras proteínas séricas. Os aminoácidos com carga positiva em um meio fortemente ácido ocuparão as posições do sódio de uma resina de troca catiônica, ligando-se à carga negativa da resina. Utilizando-se de um tampão, de modo que haja um aumento progressivo do pH, os aminoácidos tornam-se carregados negativamente, e serão eluidos da coluna trocando-se novamente os íons sódio. Exemplificamos abaixo a separação de aminoácidos com a resina de troca iônica sob condições ácidas. Os aminoácidos com a carga positiva trocam de posição com os cátions sódio da resina, no pH 2,0 (ambos aminoácidos A e B são adsorvidos). Aumentando-se o pH do tampão, os aminoácidos são eluidos de forma diferente, refletindo as diferenças nas constantes de dissolução dos grupos ionizáveis da resina. No pH 3,5 apenas o aminoácido B é eluido. O aminoácido A continua adsorvido à coluna. Já no pH 4,5 o aminoácido A também é eluido. OH pH 2,0 SO3- Na+ H3N+ COOH AMINOÁCIDO A OH SO3- Na+ H3N+ COOH AMINOÁCIDO B OH SO3- Na+ H3N+ COOH AMINOÁCIDO A OH SO3- Na+ H3N+ COOH AMINOÁCIDO A ELUÍDO pH 3,5 SO3- Na+ OH SO3- Na+ H3N+ COOH AMINOÁCIDO B ELUÍDO pH 4,5
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CROMATOGRAFIA POR GEL FILTRAÇÃO
A gel filtração separa as moléculas de acordo com o seu tamanho. A fase estacionária é mais comumente constituída de partículas hidrófilas tipo gel, como dextran (Sephadex) . As partículas são porosas contendo microcanais, cujos diâmetros permitem a passagem ou a retenção de moléculas de diferentes tamanhos. Assim, as moléculas protéicas mais volumosas que os poros das partículas, não podendo penetrar nestes, passam através do gel na fase liquida fora das partículas e são eluidas primeiro. O solvente e as moléculas menores que os canais, penetram no seu interior e ai são retidas. Por isso, as moléculas aprecem no eluente de coluna em ordem decrescente de tamanho. A IgM pode ser facilmente separada de outras imonoglobulinas séricas por gel filtração. A gel filtração é largamente usada também para separar as cadeias pesadas e leves das imunoglobulinas ou para isolar proteínas de Bence-Jones (cadeias leves) puras de urina de pacientes com mieloma múltiplo.
PRINCÍPIOS DA CROMATOGRAFIA POR GEL FILTRAÇÃO
A - O círculo aberto (O) representa as partículas de dextran polimerizado sobre as quais um a mistura de moléculas protéicas pequenas (.) e grandes (..) é depositada. B - As moléculas entram e passam através da coluna em proporções diferentes, dependendo primariamente do tamanho e são separadas por um simples processo de peneiração. C - As moléculas maiores são eluidas, enquanto as menores são retidas.
A B
C
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CROMATOGRAFIA POR AFINIDADE
A cromatografia por afinidade usa interações biológicas especificas reversível entre o material do gel e a substância a ser isolada. A ligação antígeno-anticorpo é uma das reações que podem ser aplicadas á cromatografia por afinidade. Um antígeno é acoplado à uma matriz insolúvel tal como a Sepharose, ou as moléculas de antígeno são insolubilizadas pela ligação cruzada com glutaraldeído. Quando a mistura de anticorpos de diferentes especificações é passada através da coluna, aqueles anticorpos especificos contra o antígeno são retidos pela ligação aos antígenos fixados ao gel. Estes anticorpos específicos podem ser recuperados pela lavagem da coluna com um tampão ácido, o qual desfaz as ligações antígeno-anticorpo. Uma técnica semelhante pode ser usada para purificar um antígeno, acoplando-se um anticorpo a uma matriz inerte.
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ELETROFORESE DE PROTEÍNAS
Princípio: Chama-se eletroforese, ao fenômeno da migração de partículas eletricamente carregadas sob a influência de um solvente condutor (tampão). Quanto mais carregada a partícula, com maior velocidade se distanciará dos componentes menos carregados de maneira que as partículas com pouca ou nenhuma carga permanecem relativamente estacionadas; por outro lado, as partículas carregadas avançam para o eletrodo de carga contrária. Assim, se a carga da superfície da partícula for positiva, sua migração será para o pólo negativo ou cátodo; se for negativa, migrará para o positivo ou ânodo. No caso das proteínas, estas possuem grupos amino e carboxílicos livres e devido a isso estão carregadas positiva ou negativamente em solução aquosa na dependência do pH do meio. Em meio alcalino se carregam eletronegativamente e quando submetidas a uma corrente elétrica migram para o ânodo com uma velocidade que guarda relação com o número de suas cargas. Assim,baseando-se na diferença de velocidade de migração das diversas proteínas, é possível a separação dos componentes protéicos do fluidos biológicos. Quando a soma das cargas positivas excede o número total de cargas negativas, em uma dada proteína, a molécula tem uma carga positiva. Em circunstâncias opostas, resulta uma carga negativa. Quando as cargas positivas e negativas se neutralizam, a proteína não tem carga e se denomina “isoelétrica”. Toda proteína tem seu “ponto isoelétrico”, o que é determinado pelo pH do meio onde a proteína é isoelétrica. O espectro das proteínas séricas varia entre pH 4,5 a pH 6,6. Algumas proteínas de localização intracelular, apresentam ponto isoelétrico acima deste espectro.
Esquema isoelétrico das proteínas séricas
pH 4,7 - 5,4 pH 5,4 - 5-8 pH 6,3
Albumina β globulina γ - globulina
α 1 - globulina β lipoproteína
α 2 - globulina
Na maioria das vezes, a eletroforese é executada com um tampão de pH fora do espectro isoelétrico. Em geral as proteínas séricas são separadas em um pH que varia de 8,8 a 9,0. Isto faz com que todas as proteínas se carreguem negativamente e migrem na mesma direção. As proteínas que tem pontos isoelétricos mais ácidos, estão altamente carregados e migram com maior rapidez. Conforme a velocidade de migração, elas podem separar-se em cinco grupos principais (por meio da eletroforese convencional de zona), a saber: albumina(fração mais rápida), em seguida a globulina Alfa (α)- 1, globulina Alfa (α)- 2, beta(β) globulina e gama(γ) globulina.
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APLICAÇÕES NA IMUNOLOGIA
A eletroforese de zona é extremamente valiosa para o diagnóstico dos distúrbios paraprotéicos humanos tais como mieloma múltiplo e microglobulina de Waldenstron. Nestes distúrbios ocorre geralmente um pico protéico restrito eletroforeticamente na região de γ - globulinas do eletroforetograma. Na eletroforese do soro, a maioria das imunoglobulinas migra para a zona designada γ - globulinas, mas também são encontradas quantidades significativas na zona de β - globulinas e, ocasionalmente, região das α2-globulinas. Picos nestas regiões são também compatíveis com distúrbios paraproteinemicos que envolvem imunoglobulinas. Uma diminuição na concentração de γ - globulinas, tal como ocorre na hipogamaglobulinemia, também pode ser detectada com esta técnica. Cadeias leves livres são prontamente detectáveis na urina quando presentes em quantidades aumentadas, como na proteinuria de Bence Jones do mieloma. Devem ser feitos testes quantitativos específicos, bioquímicos ou imunológicos, para a identificação da proteína em questão.
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TÉCNICA: ELETROFORESE DE PROTEÍNAS EM ACETATO DE CELULOSE
Material necessário • Fitas de acetato de celulose (CellogelR) • Tampão de corrida pH 8,6 forca iônica 0,036 (Veronal sódico 0,04M) • Corante Ponceau`s • Solução descorante (Metanol a 50%) • Solução de eluição (ácido acético a 80%) • Fonte de continua para 200 volts • Cuba de eletroforese • Espectrofotometro Pipetas, papel de filtro, microaplicador, tubos de ensaio e etc.. Método 1. Fazer a dosagem de proteínas totais da amostra de soro. 2. Colocar as fitas de cellogel imersas em tampão de corrida por pelo menos 10 minutos. 3. Preencher cada um dos compartimentos da cuba de eletroforese com tampão de corrida. 4. Retirar as fitas do tampão e secá-las com papel de filtro. 5. Colocá-las esticadas sobre o suporte da cuba, com a face absorvente voltada para cima
(Obs. Só uma superfície da fita é penetrável, essa é a face opaca, visível depois de seca . As tiras tem um angulo picotado, o qual deverá estar situado na posição inferior a direita do operador).
6. Observar para que ambas as extremidades da fita estejam em contato com a solução tampão e o picote da fita na canaleta positiva.
7. Lavar o microaplicador com água destilada e colocá-lo em contato com a amostra de soro. Fazer, então, uma leve aplicação do soro a cerca de 2,0 cm do polo negativo.
8. Tampa a cuba e ligar, ajustando para 200 Volts; deixar correndo a amostra por 35 minutos.
9. Terminada a corrida, desligar a cuba, retirar a fita e colocá-la em banho corante por 10 minutos.
10.Retirar as fitas do banho corante e transferir para um recipiente com a solução descorante, agitar para propiciar a descoloração da fita e transferir para outro banho descorante. Repetir o processo até as partes sem proteína na fita ficarem brancas.
11.Para a determinação quantitativa das frações protéicas, cortar as frações coradas e introduzí-las em tubos de ensaio respectivamente marcados, contendo 2 ml de solução de eluição. Agitar até a fita dissolver-se completamente. Fazer um tubo com um pedaço da fita sem proteína (branco) para zerar o aparelho.
12.Ler em espectrofotometro usando um comprimento de onda de 520nm, obtendo assim a densidade óptica da amostra (D.O.)
13.Fazer os, cálculos conforme modelo da apostila (pag.15)
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CÁLCULOS
Faz-se a leitura da densidade óptica de cada tubo. Somam-se as densidades ópticas de cada fração e para obter-se o valor relativo em % divide-se a D.O. de cada fração pela soma-se das D.O. e multiplica-se por 100. Depois, para verificar o valor absoluto (g/100ml), divide-se por 100.
EXEMPLO FRAÇÕES D.O. Valor relativo (%) Valor absoluto g/100ml
Albumina 0,553 65,8 4,67 αααα1- globulina 0,034 4,0 0,28 αααα2- globulina 0,061 7,3 0,52 ββββ- globulina 0,085 10,1 0,72 γγγγ- globulina 0,108 12,9 0,91
total 0,841 100,0 7,10
Proteína total = 7,10 g%
Valor relativo (%)
0,841----------------100%
0,553---------------- x
X = 0,553 x 100 = 65,80% 0,841
Valor absoluto (g/100ml)
65,80 x 7,10 = 467,18 : 100 = 4,67g/100ml
Valores normais : Albumina....................................................... 3,6 a 5,0 g/100 ml αααα1-globulina.................................................. 0,1 a 0,4 g/100 ml αααα2-globulina.................................................. 0,5 a 1,0 g/100 ml ββββ-globulina.................................................... 0,6 a 1,2 g/100 ml γγγγ-globulina..................................................... 0,6 a 1,6 g/100 ml
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REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO
I - Introdução: Em 1894, Pfeifer mostrou que, quando cobaias restabelecidas de cólera eram infectadas com o vibrião colérico, seu soro possuía forte atividade bacteriolítica contra esse microorganismo. Quando o soro da cobaia era aquecido, essa atividade desaparecia. Estudos posteriormente demonstraram que a atividade bacteriolítica se devia a duas substâncias encontradas no soro: uma resistente ao calor, encontrada somente no sangue de animal imune (anticorpo); e outra sensível ao calor (termolábil), presente no soro de quase todos os animais de sangue quente, imunes ou não (complemento). A bactéria que induziu a imunidade e contra a qual atividade era dirigida, é o ANTÍGENO. Quando ocorrer a união desses três elementos, antígeno da superfície bacteriana-Anticorpo-complemento in vivo ou in vitro poderá haver bacteriólise. Se o anticorpo estiver ausente, mesmo existindo complemento em abundância, este não poderá se fixar as bactérias e, portanto não as lisará. Se, ao contrário, o complemento estiver ausente, ocorrerá a união do anticorpo com a bactéria, mas não haverá bacteriólise. Em tal caso, diz-se que a bactéria está sensibilizada, e a adição subsequente do complemento acarretará rapidamente a bacteriólise. Outras substâncias, além das bactérias, podem agir como antígenos, sobretudo os glóbulos vermelhos, cuja destruição se denomina hemólise. O processo de hemólise, quando se processa in vitro, é facilmente visível a olho nu, por causa da liberação de hemoglobina das hemácias lisadas. Logo que se misturam os reagentes os eritrócitos formam uma suspensão vermelha opaca. Quando ocorre hemólise, a hemoglobina difunde-se no líquido, que toma coloração vermelha transparente, sem sedimento visível. Se não ocorre a hemólise, os glóbulos intactos depositam-se lentamente no fundo, formando sedimento vermelho, com sobrenadante claro e incolor. Antígenos solúveis também reagem com anticorpos específicos fixando o complemento. A aplicação da reação de fixação do complemento permite determinar a presença do anticorpo especifico no soro do paciente, o que serve para diagnosticar a infecção correspondente. Quando se mistura o soro desconhecido com um antígeno específico e o complemento, num tubo de ensaio, acontecerá uma das duas hipóteses: 1- Se o paciente tiver a infecção em questão e se, por conseguinte, seu soro tiver o anticorpo correspondente, o complemento será ligado ou fixado ao complexo antígeno-anticorpo específico e nenhum complemento será deixado livre. 2- Se o soro do doente não contiver o anticorpo especifico, o complemento permanecerá livre no líquido. Em nenhum dos casos haverá mudanças visíveis para relevar o que aconteceu, e é portanto necessário adicionar um indicador, que mostrará o complemento que ainda permanece livre. Isto se consegue adicionando-se hemácias de carneiro sensibilizadas. Se houver complemento livre, o sistema hemolítico se completa e ocorrerá hemólise. Se, ao contrário, o complemento tiver sido ligado ao complexo Ag-Ac, não ocorrerá hemólise, pois não haverá complemento livre para se complexar aos eritrócitos sensibilizados.
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REAÇÃO IMUNOHEMÓLISE Quando injetamos hemácias de carneiro num coelho, este animal produz anticorpos anti-hemácias de carneiro. Os anticorpos encontrados no soro do coelho podem ser demonstrados pela reação de imunohemólise entre outras. A reação de imune hemólise se verifica nas seguintes condições:
Fresco
+ Suspensão de hemácias de carneiro + incubação a 37º C
hemólise
Inativado a 56ºC/30`
+ Suspensão de hemácias de carneiro + incubação a 37ºC
ausência de hemólise
Soro de coelho imunizado contra hemácias de carneiro
Inativado a 56ºC/30`
+ Suspensão de hemácias de carneiro + Soro fresco de cobaia (complemento) + Incubação a 37ºC
hemólise
Nesta aula prática, os alunos executarão a reação de imuno-hemólise, com o objetivo de demonstrar que nesta reação participam três elementos distintos:
ANTÍGENO = ANTICORPO = COMPLEMENTO
Material: a - Estante de metal b - 3 tubos de ensaio c - Pipetas de 1 ml graduadas em 0,1 d - Suspensão de hemácias de carneiro a 5% e - Soro hemolítico (hemolisina) f - Complemento g - Solução tampão com veronal
Técnica: 1 - Numerar os tubos 2 - Pipetar 0,1 ml de suspensão de hemácias nos 3 tubos 3 - Pipetar 0,1 ml do soro hemolítico nos tubos 1 e 2 4 - Pipetar 0,5 ml de complemento nos tubos 1 e 3 5 - Pipetar solução fisiológica tamponada: (os respectivos valores em cada tubo)
0,8 ml no tubo 1 1,3 ml no tubo 2 0,9 ml no tubo 3
6 - Incubar em banho-maria a 37ºC, por 15 minutos.
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REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO Material: a - Antígeno b - Complemento c - Soros (já inativados ) d - Tampão e - Sistema hemolitico (hemácias de carneiro + hemolisina ) f - Estante de metal g - Tubos de 12 x 75 mm h - Pipetas de 1 ml em 0,1 Técnica: 1. Pipetar os reagentes segundo o quadro abaixo:
TUBOS Soro do paciente
Antígeno (dose ótima)
Complemento DH 50%
tampão
1(reação) 0,2 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,1 ml 2(controle do soro) 0,2ml - 05 ml 0,6 ml 3(testemunho do ag) - 0,5 ml 0,5 ml 0,3 ml 4(testemunho do C`) - - 0,5 ml 0,8 ml 2 - Agitar a estante e levá-la a incubação em geladeira 2-4ºC, por 18 horas e, a seguir, a 37ºC por 15 minutos. 3 - No dia seguinte, acrescentar 0,2 ml do sistema hemolítico (mistura de suspensão de hemácias + soro hemolitico a todos os tubos). 4 - Incubar em banho-maria a 37ºC durante 30 minutos.
QUADRO PARA ANOTAÇÃO DOS RESULTADOS:
RESULTADO INTERPRETAÇÃO Soro
Reação
Controle do soro
Testemunho do Ag
Testemunho do C
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REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO EM MEIO SEMI-SÓLIDO
Imunodifusão radial dupla (reacão de Ouchterlony) Esta técnica pode ser definida como a difusão de antígenos e anticorpos homólogos um em direção ao outro num meio gelificado, em que em determinado ponto de ótima proporção dos reagentes ou próximos deste, ocorre a reação de precipitação. Geralmente usam-se lâminas de microscopia revestidas com camada de gel de ágar a 1% em solução salina ou tamponada. Na imunodifusão radial dupla, os reagentes são colocados em orifícios separados e opostos feitos no gel. Os reagentes difundem-se radialmente formando uma linha visível resultante da precipitação e somente na região onde os dois reagentes se encontram nas proporções adequadas. O complexo antígeno - anticorpo se apresenta sob a forma de linha ou arcos de precipitação, sendo que, tais arcos podem fundir-se dando identidade total ou parcial (esporão) ou intercruzam-se, demonstrando independência imunológica total entre os reagentes pesquisados. Fatores que interferem na reação de precipitação são: pH, temperatura, forca iônica do tampão, tempo e principalmente as concentrações relativas de antígenos e anticorpo. O pH deve ser entre 6,5 a 8,8 pois em pH abaixo de 6,5 pode ocorrer precipitação não específica e o pH acima de 8,8 pode impedir a reação e dissociar complexos de Ag - Ac . A temperatura deve ser constante e entre a 4ºC e 37ºC . Na temperatura mais baixa, a reação ocorre mais lentamente e a temperatura acima de 37ºC pode resultar na formação das linhas de precipitação. A forca iônica maior ou menor do que a do tampão recomendado, poderá interferir na solubilidade das proteínas. A reação usualmente ocorre entre 16 a 24 horas, mas deve se esperar 40 a 48 horas para o resultado final. A principal aplicação desta técnica tem sido na identificação de antígenos e anticorpos em misturas desconhecidas (como os fluídos biológicos). Outra grande importância é a de se poder saber se duas substâncias são imunológicamentes idênticas, parcialmente idênticas ou independentes. A imunodifusão é usada também com finalidade diagnóstica, como por exemplo, na anemia infecciosa eqüina, na hepatite crônica ativa, bem como na paracoccidioidomicose.
MATERIAL
a) Solução de agar a 1% em solução fisiológica; b) Lâminas de microscopia; c) Pipetas graduadas de 5 ml; d) Tubos capilares; e) Solução de antígeno de Paracoccidioide brasiliensis f) Solução de anticorpos antiantígeno de Paracoccidioidis brasiliensis (soro controle) g)Soro humano para o teste h) Furador i) Câmara úmida
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TÉCNICA:
1 - Aplicar, de maneira uniforme sobre a lâmina, 3 ml de ágar fundido em solução fisiológica. Esperar esfriar. Levar à geladeira, em câmara úmida, por 5 minutos. 2 - Colocar a lâmina com o gel sobre o modelo (gabarito) e fazer os orifícios nos pontos indicados, utilizando um furador. 3- Aplicar, usando um capilar para cada amostra, os antígenos e anticorpos de acordo com o esquema; 4 - Deixar dentro da placa de Petri, ou de uma cuba apropriada, colocando, ao lado, algodão úmido para manter a umidade; 5 - Fazer a leitura após 24 ou 48 horas. OA O3 O4 O1 O2 OB A – Antígeno Pb (extraído do Paracoccidioidis brasiliensis)
B - Antígeno Pb (extraído do Paracoccidioidis brasiliensis)
1 - soro do paciente 1 3 - soro controle positivo 2 – soro controle positivo 4 - soro do paciente 2
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Após a leitura do resultado e interpretação faça o seguinte exercício para sua auto-avaliação: a) Utilizando os reagentes de acordo com a legenda abaixo, esquematize, através de linhas, o resultado esperado na seguinte reação de imunodifusão radial dupla: LEGENDA: A= Solução de anti-IgA das secreções B=Saliva humana C=Solução de anti-IgM D= Solução de cadeias pesadas α E=Solução de IgA sérica b) Através de seus conhecimentos sobre Imunoglobulinas justifique os resultados nos encontros das linhas: Entre B e C: ___________________________________________
Entre C e D: ___________________________________________
Entre D e E: ___________________________________________
Entre E e B: ____________________________________________
B
D
A E C
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REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO As reações de aglutinação são reações de floculação celular em que o antígeno faz parte da superfície de eritrócitos, bactérias ou mesmo de partículas inertes (ex: látex) que foram recobertas por um antígeno. Os anticorpos adicionais a estas suspensões combinam com o antígeno localizado na superfície das partículas unindo-as entre si, formando um agregado nítido. No teste de aglutinação direta eritrócitos, bactérias e uma variedade de espécies microbianas podem ser diretamente aglutinadas por anticorpos séricos. Testes para detectar anticorpos especificos são realizados pela titulação de soros imunes em diluições seriadas (2x) na presença de uma quantidade constante de antígeno. Após poucas horas de incubação, a aglutinação está completa e as partículas são examinadas diretamente ou microscopicamente para evidência dos grumos. Os resultados são expressos geralmente em títulos isto é, o inverso da maior diluição do soro na qual ocorre aglutinação. Por causa da variabilidade intrínseca no sistema de teste, um título precisa diferir em pelo menos duas diluições (dois tubos) para ser diferente de qualquer titulo dado. Os testes são feitos em pequenos tubos de ensaio em volumes de 0,2 - 0,5 ml ou em placas de microaglutinação com quantidade bem menores de reagentes, resultando em maior sensibilidade. Na aglutinação indireta faz-se adsorsão passiva ou acoplamento químico de antígenos solúveis a eritrócitos ou outras partículas inertes. Muitos antígenos se acoplam espontaneamente com eritrócitos e formam reagentes estáveis para a detecção de anticorpos. Os testes de aglutinação indireta podem ser também realizados em tubos ou placas de microaglutinação. Em anti-soros com títulos aglutinantes altos, um fenômeno de pro-zona pode obscurecer os resultados. O fenômeno de pro-zona produz reações de aglutinação falsamente negativas em concentrações altas de anticorpos. As reações de aglutinação requerem a presença de eletrólitos, uma vez que os eletrólitos vão neutralizar a carga elétrica da partícula que em pH neutro possuem carga livre ou resultante negativa . Neutralizada esta força repulsiva, as células se aproximam permitindo a formação de pontes moleculares. Exemplo de reações de aglutinação empregadas com finalidade de diagnóstico: 1 - Reação de Widal - para febre tifóide; 2 - Reação de Wiel-Felix - para riquetsiose; 3 - Reação de aglutinação rápida e aglutinação lenta para brucelose; 4 - Reação de aglutinação de Paul-Bunnell - Davidson - para monucleose; 5 - Reação de Coombs - para revelar anticorpos incompletos em várias doenças; 6 - Reação de aglutinação para lepstospirose; 7 - Reação de aglutinação para listeriose; 8 - Reação de Waaller - Rose - para diagnóstico da artrite reumatóide; 9 - Reação de crio-hemaglutininas para pneumonia atípica primária; 10 - Reação de inibição de hemaglutinação - para diagnóstico de várias viroses; 11 - Reação de aglutinação direta para toxoplasmose; 12 - Reação de hemaglutinação indireta para toxoplasmose, para doença de chagas, etc.
OUTRAS APLICAÇÕES DAS REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
1 - Classificação de Salmonellas, Shigelas e colipatogênicos; 2 - Classificação de pneumococos e estreptococos; 3 - Determinação dos grupos sangüíneos e fator Rh.
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REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO RÁPIDA EM PLACA PARA PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI-BRUCELA
Objetivo: Demonstração da Aglutinação Direta da suspensão bacteriana de Brucella
abortus por anticorpos anti-brucela presentes no soro.
O antígeno utilizado nessa reação foi preparado de acordo com técnica internacional recomendada pelo Ministério da Agricultura, estando em uma concentração celular de 11%, em salina fenicada a 8,5% e corada com verde brilhante e cristal violeta.
TÉCNICA
01 - Com uma pipeta específica para reação aglutinação direta para o diagnóstico da brucelose (Pipeta de Bang) ou com pipeta de 0,2 ml, pipetar 0,08; 0,04; 0,02; 0,01 e 0,05 ml do soro teste depositando separadamente cada fração do material sobre uma série de quadrados numa placa de vidro específica para esta reação (ou pipetar individualmente cada uma das quantidades indicadas colocando-as em lâminas individuais de microscopia, previamente identificadas com a respectiva diluição);
02 - Agitar o frasco do antígeno padronizado e colocar uma gota do antígeno de Brucela
(30 µl) ao lado da fração de soro.(Cuidado para não encostar a pipeta com antígeno na fração de soro para não haver contaminação do antígeno).
03 - Misturar cada composição soro-antígeno com um bastão, iniciando com a diluição
contendo 0,05 ml até a diluição contendo 0,08 ml de soro (ou seja, no sentido da maior para a menor diluição). As diluições finais serão aproximadamente 1:25 ; 1:50 ; 1:100 ; 1:200 ; 1: 400;
04 - Agitar a placa com suaves movimentos circulares de 15 a 20 vezes por 3 minutos; 05 - Fazer a leitura observando a aglutinação com uma fonte de luz apropriada. Reação
positiva (+): presença de aglutinação. Reação negativa (-): não aglutinação. NOTA: O resultado encontrado é expresso por um título, ou seja, o inverso da maior diluição onde se identificou a reação (no caso, aglutinação direta). Atenção: Em soros apresentando títulos altos de anticorpos pode ocorrer o fenômeno de pró-zona, que é um evento em que o excesso de anticorpos presentes no soro teste faz com que a equivalência da interação Ag/Ac somente ocorra após altas diluições desse soro. Por isso, ao contrário do que comumente ocorre, nas reações em que se visualizam a pró-zona, as primeiras diluições de soro mostram-se negativas e as últimas (maiores) diluições apresentam reação positiva. Em face da importância da Brucelose com zoonose, o Conselho Federal de Medicina Veterinária editou portaria específica que orienta a realização e a interpretação das reações sorológicas para o diagnóstico da Brucelose Animal.(Vide anexa no fim da apostila).
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REAÇÃO DE MICROAGLUTINAÇÃO PASSIVA - REAÇÃO DE VDRL
(VENERAL DISEASES RESEARCH LABORATORY) A reação do VDRL é usada para o diagnóstico sorológico da sífilis, através de uma técnica de microaglutinação passiva feita em placa escavada. Pacientes com sífilis desenvolvem uma resposta de anticorpos contra um hapteno ubiquitário que existe nos tecidos dos mamíferos. Trata-se de um fosfolipídio, que pode ser extraído em alto grau de pureza do coração de bovino e é denominado cardiolipina. Anticorpos para antígenos cardiolipínicos são conhecidos como anticorpos de Wasserman ou reagínicos. Infecções pelo Treponema pallidum levam à liberação nos fluídos orgânicos de cardiolipina, a qual faz parte normalmente da membrana mitocondrial, e à produção de anticorpos. Cardiolipina sozinha, entretanto, somente se liga a anticorpos, mas não estimula sua produção, isto é, é um hapteno. Para tornar-se imunogênica a cardiolipina deve se ligar a uma proteína carreadora. A cardiolipina, reforçada pela adição de doses adequadas de colesterol e de lecitina constitui excelente antígeno para a detecção da reagina sifilítica, seja em testes de aglutinação passiva, nos quais o hapteno é adsorvido a superfície de cristais de colesterol (reação de floculação de Kline, V.D.R.L, etc), seja em testes de fixação do complemento (reação de Wasserman). MATERIAL NECESSÁRIO: 1 - Lâminas escavadas; 2 - Suspensão do antígeno; 3 - Soros a testar, soros positivo e negativo, inativados a 56ºC durante 30 minutos; 4 - Pipetas Pasteur; 5 - Seringa de 1 ml sem o bisel (ponta); TÉCNICA: 01 - Em cada escavação da placa colocar 01 gota (0,05 ml ) dos diferentes soros; 02 - Acrescentar a cada soro uma gota de suspensão antigênica com uma seringa de 1,0 ml (agulha sem bisel); 03 - Agitar, no agitador próprio, durante 04 minutos, a 180 r.p.m., ( a agitação pode ser manual); movimentos rotatórios da placa sobre a superfície da mesa com amplitude de mais ou menos 03 cm; 04 - Leitura: A leitura deve ser feita imediatamente após a agitação observando ao microscópio de acordo com a intensidade da reação. INTERPRETAÇÃO - Partículas finamente dispersas - não reativo - Partículas agrupadas em pequenos grumos - soro fracamente reativo. - Partículas agrupadas em grandes grumos - soro fortemente reativo.
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REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO INDIRETA: Teste para a pesquisa do Fator Reumatóide Látex
Princípio: O fator reumatóide é uma macroglobulina (IgM) que se encontra presente no soro de 85 a 90% dos pacientes com Artrite Reumatóide e em 3 a 5% dos indivíduos normais. O fator reumatóide é considerado um anticorpo contra a IgG. Pode ser detectado por uma reação de aglutinação passiva ou indireta, onde o antígeno, IgG humana desnaturada pelo calor, se encontra adsorvido a superfície de um suporte inerte de látex de poliestireno. Este antígeno reage imunológicamente com o anticorpo (fator reumatóide) presentes no soro, resultando numa aglutinação visível macroscópicamente. TÉCNICA: 01 - Preparar uma diluição a 1/20 do soro, pipetando 0,95 ml do tampão glicina e a seguir 0,05 ml do soro teste no tubo contendo o tampão e homogeneizar bem; 02 - Colocar no círculo central da placa fornecida, 1 gota da diluição 1/20 do soro a testar; 03 - Colocar no círculo à esquerda 01 (uma) gota do soro controle positivo e no círculo a direita 01 ( uma) gota do soro controle negativo; 04 - Adicionar uma gota do reativo látex globulina, previamente agitado, a cada um dos círculos; 05 - Misturar e distribuir o conteúdo de cada círculo por toda sua área com um estilete. Usar um para cada círculo; 06 - Agitar suavemente a placa com movimentos circulares, e observar macroscopicamente o resultado da reação por tempo não maior que 2 minutos. RESULTADO: NEGATIVO: Suspensão homogênea; POSITIVO: Aglutinação nítida que se apresenta como grumos visíveis
macroscópicamente dentro de 2 minutos.
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IMUNO-HEMATOLOGIA
1) Grupos sangüíneos - Sistema ABO
De acordo com a existência ou não dos aglutinógenos A e/ou B, nas hemácias, os indivíduos da espécie humana podem ser divididos em 04 grupos: A,B, AB e O. Landsteiner (1990) verificou que era regra todo indivíduo apresentar no seu plasma aglutininas contra os aglutinógenos que lhes eram estranhos: ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ Grupos Aglutinógenos nas Aglutininas no hemácias Plasma ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ A A Anti B B B Anti A O - Anti A e Anti B AB A e B - ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ Isso torna possível a tipagem do sangue de um indivíduo dentro do sistema ABO quer pelas hemácias, quer pelo plasma.
1 - TIPAGEM SANGÜÍNEA PESQUISANDO ANTÍGENO NAS HEMÁCIAS. (REAÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO DIRETA)
MATERIAL: a) Sangue total; b) Soro anti A; c) Soro anti B; d) Pipetas Pasteur; e) Lâminas de microscopia. TÉCNICA: Seguir o esquema que se segue 1 gota: sangue 1 gota: sangue soro anti A soro anti B - Misturar com o bordo de uma lâmina limpa. A leitura é feita por visualização da
aglutinação:
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- 2 - TIPAGEM SANGÜÍNEA PESQUISANDO ANTICORPOS NO SORO. MATERIAL: a) Soro desconhecido; b) Hemácias A; c) Hemácias B; d) Pipetas de Pasteur; e) Lâminas. Seguir o esquema 1 gota: soro 1 gota: soro 1 gota hemácia A 1 gota de hemácia B - Misturar com o bordo de uma lâmina limpa e efetuar a leitura pela presença ou não de aglutinação.
GRUPO SANGÜÍNEO - SISTEMA Rh
De acordo com a existência ou não do antígeno D(Rh) nas hemácias os indivíduos da espécie humana são Rh+ (positivo) ou Rh - (negativo). O sistema Rh possui ainda outros antígenos, mas na prática transfusional apenas o antígeno D (Rh) é pesquisado por ser mais imunogênico. MATERIAL: a) Sangue total; b) Soro anti D (Rh); c) Lâminas; d) Pipetas Pasteur. TECNICA: A tipagem comumente é feita em lâmina usando-se como reagente soro anti - D (Rh) observando-se a aglutinação ou não das hemácias a temperatura ambiente. Sangue: 1 gota de sangue
Soro: anti -D
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TESTE DE COOMBS
A prova de Coombs, também denominada prova de antiglobulina humana, consiste no emprego do soro antigamaglobulina humana (soro de Coombs) para promover a aglutinação de hemácias previamente incubadas com anticorpos incompletos. Teste de Coombs indireto é utilizado para o diagnóstico de anticorpos incompletos no soro de qualquer pessoa possivelmente sensibilizada por antígenos eritrocitários do sistema Rh (sensibilização pós-transfusional ou no decurso de gestação). O teste de Coombs direto é feito para diagnóstico da D.H.R.N. Em recém-nascido de mães sensibilizadas. Consiste na lavagem de hemácias já sensibilizadas, de crianças e adição de soro de Coombs.
TÉCNICA PARA O TESTE INDIRETO
01 - Preparar uma suspensão a 5% de hemácias O-Rh positivas; 02 - Colocar em um tubo de ensaio uma gota do soro a ser testado (marcar T no tubo); em um 2º tubo colocar uma gota de soro controle positivo (marcar (+) no tubo); em um 3º tubo colocar uma gota de soro controle negativo (marcar (-) no tubo). 03 - A cada um dos tubos acrescentar uma gota de suspensão de hemácias O Rh (+) 5%; 04 - Adicionar 02 gotas de albumina bovina a 22% em cada tubo; 05 - Agitar, para misturar, e incubar a 37ºC durante 15 minutos; 06 - Retirar o tubo do banho-maria e completar até 01 cm da borda com solução fisiológica ou PBS FOSFATO e centrifugar a 3000 rpm ( + ou - 03 minutos); decantar o sobrenadante por inversão do tubo; ressuspender o sedimento de hemácias e repetir esta operação por mais 02 vezes. A lavagem é feita para evitar a reação das proteínas livres; 07 - Após a última lavagem, decantar completamente o sobrenadante, invertendo o tubo e enxugando a borda do mesmo com papel absorvente. 08 - Adicionar ao sedimento de hemácias, 02 gotas de soro de Coombs; 09 - Agitar suavemente para misturar e centrifugar imediatamente ( 01 minuto a 1000 r.p.m). INTERPRETAÇÃO 10 - Aglutinação presente: Teste positivo Aglutinação ausente: Teste negativo
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MÉTODO DE INIBIÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVA
As variações sobre os métodos de aglutinação surgiram ampliando as possibilidades de diagnóstico e pesquisa de anticorpos e de antígenos, à medida que autorizaram uma sensibilidade maior para a pesquisa daqueles reagentes. Com o objetivo de conduzir os alunos de graduação desta instituição para a compreensão de mais uma variação, o método de Inibição da Aglutinação Passiva, escolhemos fazer a pesquisa de antígenos do vírus da Hepatite B por tal método. A reação será realizada em placas de microaglutinação, e a diluição dos soros e reagentes será feita através de pipetas automáticas. Esse tipo de placa presta-se a reações em que trabalhamos com pequenos volumes de reagentes. Cada poço da placa de microaglutinação e reconhecido também por “well”. Observe, na placa, que os poços estão distribuídos formando linhas: linhas A, B, C etc.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H
PROCEDIMENTO
1) Utilizando a linha A, colocar 50µl de tampão diluente em cada poço, a partir do 2º poço até o 11º poço dessa linha; 2) Colocar 100 µl de soro humano no 1º poço; 3) Homogeneizar o conteúdo do 1º poço e passar 50µl para o 2º poço ; homogeneizar novamente e passar 50 µl do 2º poço para o 3º ; proceder com esta diluição até o último poço (numero 11); 4) Desprezar 50µl do 11º poço (último); 5) Agitar levemente a placa; 6) Colocar 50µl de soro anti-antígeno Hbs em cada poço, do 1º ao 11º poço; 7) Agitar levemente a placa; 8) Colocar 50µl de hemácia sensibilizada com o antígeno do vírus Hepatite B em todos os poços; 9) Selar com fita Durex para que não haja evaporação dos reagentes e colocar a placa sobre uma superfície rígida, onde não sofra vibrações; 10) Ler a reação após 2 horas.
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ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) Este teste foi desenvolvido em 1971 por Engvall e Perlmann como alternativa ao radioiumunoensaio. Anticorpos ou antígenos podem ser conjugados a enzimas de maneira que, ao ser adicionado o substrato da enzima à reação, é gerado um produto colorido que poderá ser observado a olho nu (ensaio qualitativo) ou ter sua densidade óptica medida por espectrofotometria (ensaio quantitativo). A enzima peroxidase é muito utilizada para este teste, e reage especificamente com seu substrato, o peróxido de hidrogênio, gerando um complexo que na presença de um terceiro composto um doador de elétrons (cromógeno ) forma um polímero intensamente colorido. O cromógeno mais utilizado em ELISA é o OPD (ortofenileno diamina).
O princípio básico é a adsorção de um dos reagentes (antígeno ou o anticorpo) a uma fase sólida, tal como placas de poliestireno ou polivinil, materiais que possibilitam a ligação covalente de proteínas. Tais placas contêm séries de poços onde serão depositados os reagentes. O teste detecta quantidades extremamente pequenas de antígenos ou anticorpos, podendo ter elevada precisão se os reagentes e os parâmetros do ensaio forem bem padronizados. A adsorção não específica de componentes à placa pode ser reduzida incluindo-se uma proteína inerte (caseína, gelatina, BSA) no diluente da amostra (bloqueio). Os conjugados devem ser preparados com anticorpos de alta afinidade, preferencialmente monoclonais. Independente do método escolhido para leitura é necessário determinar o limite de reatividade ou “cut-off” do teste, que pode ser obtido pela relação entre a coloração da amostra e a coloração do controle positivo (D.O da amostra/D.O do controle positivo). Vários métodos são realizados utilizando o principio do enzima-imunoensaio, entre eles os mais empregados são:
• Método indireto: amplamente empregado para a pesquisa de anticorpos apresentando como vantagem a utilização de um único conjugado em diferentes sistemas.
• Método de captura: Um anticorpo específico é adsorvido à placa para reter o objeto da pesquisa, que poderá ser o antígeno ou mesmo uma classe de anticorpo em particular. O conjugado utilizado deverá ser específico para a estrutura capturada na placa.
TÉCNICA DE ELISA INDIRETO
PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI-T. cruzi
PRIMEIRA AULA – SENSIBILIZAÇÃO E BLOQUEIO DA PLACA
Material necessário:
Placas de poliestireno
Solução contendo antígenos de T. cruzi
Solução tamponada de Caseína a 1%
Solução tampão para lavagem
Pipetas automáticas
Pipetas Pasteur
Estufa à 37°C
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Metodologia: Sensibilização da placa:
1. Pipetar 200µl de solução contendo antígenos de T. cruzi em cada poço da placa de poliestireno.
2. Incubar 2 horas à 37°C em estufa. Boqueio de placa previamente sensibilizada:
1. Trabalhando com a placa previamente sensibilizada, desprezar a solução de antígenos de T. cruzi.
2. Lavar três vezes utilizando tampão de lavagem e pipeta Pasteur, cada poço da placa. 3. Inverter a placa e bater sobre papel de filtro para retirar o excesso de tampão. 4. Adicionar 200µl de solução de bloqueio (Caseína a 1%) a cada poço da placa e incubar
overnight a 37°C. 5. Lavar três vezes utilizando tampão de lavagem e pipeta Pasteur, cada poço da
placa. SEGUNDA AULA – Detecção de anticorpos anti-T. cruzi.
Material necessário: Placas previamente sensibilizadas com antígenos de T. cruzi e bloqueadas. Pipetas automáticas Pipetas Pasteur Soro Controle Positivo Soro Controle Negativo Soros testes Conjugado enzimático Solução reveladora (peróxido de hidrogênio+OPD) Metodologia:
1. Pipetar em duplicata (em dois poços consecutivos) 100µl dos soros controles e dos soros testes de acordo com o esquema abaixo:
A: Controle negativo B: Controle negativo C: Controle positivo D: Controle Positivo E: Soro teste 1 E: Soro teste 2
F: Soro teste 3 G:Soro teste 4
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2. Levar para incubação em estufa durante 15 minutos à 37º C.
3. Desprezar o conteúdo da placa e lavra três vezes com solução tampão.
4. Inverter e bater a placa sobre superfície com papel de filtro.
5. Adicionar 100µl de conjugado a cada poço da placa.
6. Novamente incubar 15 minutos à 37ºC.
7. Lavar três vezes a placa com solução tampão.
8. Inverter e bater a placa.
9. Adicionar 100µl de solução reveladora (substrato+cromógeno) em cada poço.
10. Incubar a placa 30 minutos à 37ºC.
11. Leitura visual de placa pronta
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REAÇÕES DE IMUNOFLUORÊSCÊNCIA
FINALIDADE: Detecção de anticorpos ou de antígenos. É possível tornar visível a reação Ag-Ac marcando um dos reagentes com substâncias ditas fluorocromos, que tem a capacidade de absorver a energia luminosa, armazená-la durante curto espaço de tempo (10-9 a 10-7 de segundos) para, em seguida emiti-la sob a forma de uma radiação de maior comprimento de onda, resultando em fluorescência. A fluorescência é a emissão de luz de uma cor, isto é, comprimento de onda, enquanto uma substância é irradiada com luz de cor diferente. O comprimento da onda emitido (fluorescente) terá necessariamente menor energia, ou seja maior comprimento de onda do que o da luz incidente ou absorvida. Os fluorocromos mais usados em laboratório clínico são a fluoresceína e a rodamina. Ambos os fluorocromos são empregados sob a forma isotiocianato, que se conjuga facilmente as proteínas em pH alcalino (acima de 9 ). Os fluorocromos apresentam espectros de absorção e emissão característicos. A absorção máxima do isotiocianato de fluoresceína é de 490 - 495 nm, e emite sua cor verde característica a 517 nm. O isotiocianato de tetrametilrodamina, que emite cor vermelha, tem um máximo de absorção a 550 nm e emissão máxima a 580 nm. Para a observação microscópica da fluorescência é necessária uma adaptação do microscópio óptico comum, contendo uma fonte de luz excitadora de alta intensidade; filtros de excitação para produzir um comprimento de onda capaz de causar ativação do fluorocromo e filtros para evitar a passagem pela ocular, de luz de baixo comprimento de onda. D - - - - - - - - - - - - - - - - Radiação de longos comprimentos de onda _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Radiação de curtos comprimentos de onda A - Lâmpada de halogênio B - Preparo fluorescente C - Filtros excitadores D - Filtros de barreiras Esquema do sistema óptico do microscópio de fluorescência. As técnicas utilizadas para o estudo de imunofluorescência comportam duas modalidades principais:
A B
C
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1 - Imunofluorescência direta - baseia-se na detecção de antígenos utilizando anticorpos específicos marcados com isotiocianato de fluoresceína. É o processo comumente usado para a identificação de microorganismos por imunofluorescência, como estreptococos beta-hemolíticos do grupo A, bacilo diftérico; sorotipos de colibacilos enteropatogênicos; sorotipos de leptospiras, etc. 2 - Imunofluorescência indireta - baseia-se na detecção de anticorpos utilizando um antígeno conhecido e um soro anti-imunoglobulina humana, marcado com fluoresceína. Sobre a preparação de antígeno fixado à lâmina, aplica-se primeiro o anticorpo específico não fluorescente; após haver a reação Ag-Ac, lava-se a preparação para remover todas proteínas (imunoglobulina) não fixadas pelo antígeno, e a seguir, trata-se com um anticorpo fluorescente com especificidade dirigida para os determinantes antigênicos do anticorpo ligado ao antígeno. Usa-se esta técnica na pesquisa de anticorpos circulantes no diagnóstico de: toxoplasmose, sífilis, doenças de Chagas, leptospirose, esquistossomose, anticorpos antireóide, antinucleoproteína, anti-DNA, anti HIV, etc.
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TÉCNICA DA REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA PARA TOXOPLASMOSE
1 - Secar bem as lâminas fixadas com antígeno; 2 - Marcar as lâminas com os respectivos soros; 3 - Preparar diluições dos soros em solução salina tamponada pH 7,2, na razão de 1/16 ; 1/64 ; 1/256 ; 1/1024 ; 1/4096, da seguinte maneira: a - Colocar no tubo 1/16 1,5 ml de salina tamponada e 0,3 ml nos demais tubos. b - Pipetar no 1º tubo 0,1 ml do soro, homogeneizar bem e passar 0,1 ml para o 2º tubo, homogeneizar bem e passar 0,1 ml para o 3º tubo e assim sucessivamente. 4 - Preparar diluições a 1/16 do soro controle positivo e do soro controle negativo. 5 - Depositar pequenas gotas (0,02 ml) das diluições dos soros em cada área das lâminas, como demonstrado no esquema abaixo.
TOXO 1/16 1/1024 _ 1/256
1/64 1/4096 + 6 - Incubar a 37ºC em câmara úmida, por 30 minutos; 7 - Remover os soros de cada lâmina sob delicado jato de água e lavá-las por imersão por duas vezes em PBS, 5 (cinco) minutos de cada vez; 8 - Enxugar o verso e as bordas das lâminas com papel absorvente e ao redor das áreas da reação. Secá-las com ar quente. 9 - Depositar uma pequena gota do conjugado fluorescente liquido antiimunoglobulina humana (cerca de 0,02 ml), diluído conforme seu título, em cada área das lâminas. 10 - Incubar novamente as lâminas a 37ºC por 30 minutos, em câmara úmida; 11 - Lavá-las 2 (duas) vezes em PBS, 10 minutos cada lavagem; secar como no indicado do item 8 e montá-las com glicerina alcalina e lamínula. 12 - Observar os preparados ao microscópio de fluorescência, com objetiva de imersão, campo escuro, filtro excitador BG 12/2 mm ou KP 500 e filtro barreira 50. Como título tomar o inverso da maior diluição do soro para a qual se evidencia fluorescência em toda a periferia dos toxoplasmas, ainda que de pequena intensidade. Nas reações negativas os toxoplasmas não apresentam fluorescência ou esta fica localizada apenas nas extremidades dos parasitas (coloração polar).
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PARTE II
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Esta parte da apostila apresenta de forma sucinta os objetivos gerais e específicos de algumas unidades do nosso programa. Tal seção tem como finalidade permitir ao aluno uma auto-avaliação sobre o tema tratado em sala de aula. Responda-os com cuidado e atenção, esforçando-se para saber descrever com clareza sobre o que está sendo perguntado. Se tiver dúvidas sobre qualquer uma das respostas, pesquise, discuta com os colegas ou procure os professores da disciplina.
Ao final de cada unidade e após os estudos, que deverão ser feitos em casa, os alunos deverão ter compreendido o assunto tratado se forem capazes de responder aos seguintes objetivos:
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UNIDADE:
RESISTÊNCIA INESPECÍFICA Objetivos gerais e específicos: 1. Entender os fenômenos de defesa como mecanismos de adaptação às agressões do meio
ambiente;
2. Conceituar e diferenciar resistência inespecífica e específica;
3. Citar os principais mecanismos de resistência inespecífica;
4. Descrever os principais elementos da pele e de que forma atuam na resistência inespecífica;
5. Descrever os principais elementos da mucosa e de que forma atuam na resistência
inespecífica.
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UNIDADE: CÉLULAS DO SISTEMA IMUNE
Objetivos gerais e específicos: a - Reconhecer as células que participam da resposta e fenômenos imunológicos. b- Diferenciar morfologicamente cada célula que participa dos eventos da resposta imunológica. c- Definir a função da cada célula dentro da resposta imunológica. d- Diferenciar as células que atuam na defesa especifica, daqueles que atuam na defesa inespecifica. e- Diferenciar quanto a origem e função os linfócitos T e os linfócitos B.
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UNIDADES: FORMAÇÃO DE CÉLULAS T E B e
ÓRGÃOS LINFÓIDES Objetivos gerais e específicos:
1) Reconhecer quais são e qual a função dos órgãos linfóides primários no sistema
imunológico.
2) Reconhecer quais são e qual a função dos órgãos linfóides secundários no sistema
imunológico.
3) Descrever as características histológicas e anatômicas dos órgãos linfóides primários
e secundários.
4) Relacionar funcionalmente a membrana do saco vitelino, o fígado fetal e a medula
óssea, para o sistema imune.
5) Relacionar os passos envolvidos na formação de células T efetoras, à partir da
célula primitiva.
6) Relacionar os passos envolvidos na formação de plasmócitos secretores de
anticorpos, à partir da célula primitiva.
7) Comparar e justificar os efeitos da timectomia neo-natal e na fase adulta.
8) Reconhecer aspectos da adaptabilidade dos órgãos linfóides secundários para a fase
de reconhecimento antigênico na resposta imune.
9) Explicar o centro germinativo nos linfonodos.
10) Justificar a hiperplasia de um órgão linfóide secundário, considerando as fases de
uma resposta imunológica.
11) Reconhecer a principal via de acesso das “estruturas estranhas”, aos órgãos linfóides
secundários.
12) Explicar o tráfego de linfócitos no organismo.
13) Explicar como os linfócitos efetores produzidos em um linfonodo têm acesso a um
sítio de infecção em outra região ou tecido.
14) Reconhecer o papel das vênulas pós-capilares de endotélio alto nos linfonodos com
relação ao tráfego de linfócitos.
15) Justificar a proliferação linfocitária nos órgãos linfóides secundários.
16) Justificar a proliferação celular nos órgãos linfóides primários.
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UNIDADE:
ANTÍGENOS Objetivos gerais e específicos: 1. Definir o termo imunogenicidade e antigenicidade.
2. Exemplificar a situação em que uma substância apresenta antigenicidade e não
apresenta imunogenicidade.
3. Explicar a condição para que haja formação de uma resposta imunológica para os
haptenos.
4. Conceituar e exemplificar “hapteno”.
5. Citar e explicar os fatores que contribuem para a imunogenicidade de uma molécula.
6. Conceituar “epítopo”.
7. Reconhecer a estrutura de um epítopo em uma molécula protéica.
8. Justificar a diversidade de epítopos em uma determinada substância imunogênica.
9. Explicar três formas de ação dos adjuvantes imunológicos, em geral .
10. Citar os adjuvantes imunológicos mais empregados.
11. Explicar os fenômenos de reatividade cruzada, entre antígenos.
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UNIDADE: IMUNOGLOBULINAS (objetivos I)
Objetivos gerais e especificos: a) Conceituar o termo imunoglobulinas.
b) Determinar a estrutura básica de uma molécula de imunogobulina.
c) Definir a natureza química de uma molécula de imunoglobulina.
d) Identificar na molécula as regiões Fab e Fc.
e) Citar as diferentes classes de imunoglobulinas existentes.
f) Definir sitio combinatório.
g) Definir a quantidade relativa de IgG encontrada no soro, em relação as outras
imunoglobulinas.
h) Definir as principais propriedades biológicas da IgG.
i) Esquematizar o mecanismo de formação de IgAS desde sua síntese até sua chegada
na secreções.
j) Determinar a importância da IgAS na defesa local das mucosas.
k) Reconhecer as principais propriedades biológicas da IgM.
l) Reconhecer a forma de participação da IgE nas reações alérgicas.
m) Definir as imunoglobulinas que apresentam peça J e qual a função desta peça.
n) Relatar a importância da transferência placentária de imunoglobulina na espécie
humana; qual a classe que desempenha este papel e a que se deve esta propriedade.
o) Definir a imunoglobulina de maior peso molecular.
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UNIDADE:
IMUNOGLOBULINAS (objetivos II) Objetivos gerais e especificos: a) Conceituar o termo Imunoglobulinas.
b) Reconhecer a estrutura básica de uma molécula de imunoglobulina.
c) Definir a natureza química de uma molécula de imunoglobulina.
d) Identificar os fragmentos resultantes após a clivagem enzimática de uma molécula
de imunoglobulina pela ação de pepsina e da papaína.
e) Diferenciar os diversos isótipos de cadeias leves e de cadeias pesadas existentes.
f) Reconhecer as imunoglobulinas que apresentam subclasses e diferenciar estas
subclasses de acordo com a nomeclatura vigente.
g) Conceituar e exemplificar alotipia em cadeias leves e pesadas.
h) Conceituar idiótipos.
i) Esquematizar uma molécula de IgG reconhecendo nela os seguintes tópicos.
1- Cadeia pesada
2- Cadeia leve
3- Domínios variáveis e constantes nas cadeias leves e pesadas
4- Região carboxi-terminal
l) Definir a quantidade relativa de IgG encontrada no soro, em relação as outras
imunoglobulinas.
m) Identificar as sub-classes de IgG existentes.
n) Definir as principais propriedades biológicas da IgG.
o) Definir a propriedade de opsonização de que é dotada a IgG.
p) Reconhecer as subclasses existentes de IgA.
q) Discriminar estruturalmente uma molécula de IgG e uma de IgAS.
r) Esquematizar o mecanismo de formação da IgAS desde sua síntese até sua chegada
nas secreções.
s) Explicar a importância da IgAS na defesa local das mucosas.
t) Determinar estruturalmente a composição de uma molécula de IgM.
u) Determinar o peso molecular e quantidade relativa de IgM encontrada no soro.
v) Reconhecer as principais propriedades biológicas da IgM.
w) Determinar estruturalmente a composição de uma IgD.
x) Reconhecer a forma de participação de IgE nas reações alérgicas.
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UNIDADE: SISTEMA COMPLEMENTO
Objetivos gerais e específicos: ♦ Descrever os efeitos biológicos surgidos pela ativação do Sistema do Complemento. ♦ Identificar a via alternativa, clássica e efetora do sistema do complemento. ♦ Identificar os fatores ativadores da via clásssica e da via alternativa do Sistema do
Complemento. ♦ Reconhecer o mecanismo de ativação da via alternativa e da via clássica do Sistema do
Complemento. ♦ Justificar o papel inespecífico da ação do sistema do complemento. ♦ Justificar a participação de uma resposta imuno especifica na ativação do Sistema do
Complemento. ♦ Identificar a analogia entre as enzimas C4b2a e C 3bBb.
♦ Explicar o desenvolvimento de uma alça de amplificação na ativação da via alternativa.
♦ Explicar a ausência da alça de amplificação da via alternativa nos processos fisiológicos de ativação do Sistema do Complemento.
♦ Explicar o mecanismo da ação dos fragmentos de ação biológica, produzidos pela ativação do Sistema do Complemento, nos fenômenos de aumento de permeabilidade capilar, agregação plaquetária, quimiotaxia para PMN e lise celular.
♦ Reconhecer as bases de um mecanismo homeostático em relação à ativação do sistema do complemento.
♦ Justificar, através dos textos bibliográficos, por que na maioria das células os mecanismos de lise pelo Complemento não são possíveis.
♦ Justificar a ação lesiva do sistema do complemento para células do próprio hospedeiro.
♦ Demonstrar como o sistema do complemento participa da eliminação de antígenos que não são celulares ou que não tem membrana exposta.
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UNIDADE: FAGOCITOSE
Objetivos gerais e específicos:
a) Definir fagocitose, pinocitose, endocitose e exocitose. b) Identificar as principais células que participam da resistência inespecífica. c) Identificar os principais fatores quimiotáticos para PMN e macrófagos. d) Citar as principais substâncias que desempenham o papel de opsoninas. e) Definir opsonização. f) Explicar a importância do fenômeno da opsonização. g) Caracterizar o sinal de ativação do fagócito no momento da opsonização. h) Explicar a fase de englobamento realizada pelo fagócito i) Explicar a fase de digestão durante a fagocitose. j) Definir as duas principais vias de destruição da partícula fagocitada. k) Caracterizar a via oxigênio dependente. l) Citar os radicais livres produzidos na via oxigênio dependente e definir sua
importância na destruição de estrutura fagocitada. m) Caracterizar a via oxigênio independente. n) Citar as principais enzimas que atuam a via oxigênio independente. o) Relacione a fagocitose a mecanismos de resistência inespecífica.
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UNIDADE: Complexo de Histocompatibilidade Principal(CHP, “MHC”)
Objetivos gerais e específicos: 1) Definir o que é CHP e onde este se localiza, no camundongo e no ser humano: 2) Citar quais são os produtos da decodificação do CHP; 3) Denominar os produtos do CHP Humano; 4) Estabelecer a função dos antígenos de classe I e classe II; 5) Esquematize as estruturas das moléculas de classe I e II; (Faça um desenho
esquematizando as principais características de ambas). 6) Localizar as moléculas de classe I e de classe II nas diferentes populações celulares; 7) Reconhecer na molécula de classe I, a região de ligação ao peptídeo; 8) Reconhecer na molécula de classe II, a região de ligação ao peptídeo; 9) Relacionar as moléculas de classe I e II do CHP com os antígenos exógenos e
aqueles de síntese endógena.
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UNIDADE:
Células Apresentadoras de Antígenos (APCs) e mecanismos de Apresentação de Antígenos
1) Definir quais são as principais células apresentadoras de antígenos e onde elas se localizam;
2) Definir as principais características quanto às estruturas de superfície celular e fagocitose de cada APC;
3) Exemplificar qual é a molécula que poderia sugerir uma função de célula apresentadora de antígeno;
4) Descrever no macrófago, quais são as etapas que culminam com a apresentação de antígenos pelas células;
5) Definir em qual situação, uma molécula viral pode ser apresentada no contexto de moléculas de classe I do CHP:
6) Esquematizar como ocorre o processo de apresentação de antígenos no contexto de moléculas de classe II;
7) Numa infecção por um patógeno intracelular em uma célula cilíndrica do trato digestivo superior, estabelecer de que forma o organismo reconhecerá que naquela célula está se desenvolvendo uma infecção e como esta será debelada;
8) Estabelecer onde ocorre a interação entre antígenos próprios e as moléculas do CHP e como ocorre este mecanismo;
9) Explicar porque a apresentação de antígenos externos se dá no contexto de moléculas de classeII;
10) Definir qual o papel do INF- γ na apresentação do antígeno.
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UNIDADE: Linfócitos T
1. Definir estrutural e funcionalmente os principais marcadores de superfície dos
linfócitos T 2. Esquematizar as etapas de ativação dos linfócitos T auxiliares; 3. Reconhecer o mecanismo de interação da célula apresentadora de antígeno com os
linfócitos T CD4+. 4. Definir a etapa seguinte à ativação dos LT auxiliares; 5. Reconhecer o mecanismo de interação na apresentação de Ag aos linfócitos T
citotóxicos ou CD8+. 6. Definir como ocorre a ativação do repertório de células T citotóxicas (CTL); 7. Definir e diferenciar linfócitos TH1 e TH2 8. Elaborar um quadro comparativo, quanto a função e produtos das subpopulações
TH1 e TH2. 9. Definir funcionalmente e quanto às células produtoras as seguintes citocinas: 10. IL-2 11. IL-3 12. IL-4 13. IL-5 14. IL-6 15. IL-10 16. INF-γ 17. TNF 18. IL-12
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UNIDADE: Linfócitos B e
Resposta Humoral Primária e Secundária
1. Reconhecer os marcadores de superfície dos linfócitos B e função fisiológica dos mesmos;
2. Definir a ontogenia dos linfócitos B no homem;
3. Definir as fases de ativação dos linfócitos B;
4. Definir o mecanismo do capuz ou “Capping” e citar a função do mesmo;
5. Explicar porque se pode dizer que um linfócito B é uma APC;
6. Diferenciar a ativação por antígenos timo-dependentes e timo-independentes;
7. Definir mudança de classe ou “Switch”que ocorre durante a síntese de imunoglobulinas;
8. Definir o resultado final da ativação do repertório de linfócitos B;
9. Estabelecer a finalidade da ativação do repertório de linfócitos B;
10. Definir a primeira imunoglobulina a ser produzida em resposta a uma infecção;
11. Estabelecer as fases que precedem a interação entre linfócitos B e linfócitos T e o objetivo
desta interação;
12. Definir as principais interleucinas produzidas pelos linfócitos T que têm ação sobre
linfócitos B e em que fase elas agem e de que forma;
13. Identificar as fases da curva que representa uma resposta humoral e a característica de cada
fase.
14. Estabelecer a diferença que existe entre as fases das respostas primárias e secundária;
15. Explicar a que se deve a maior produção de Ig durante uma resposta humoral secundária;
16. Explicar porque a resposta secundária é a mais rápida do que a resposta primária;
17. Estabelecer com relação ao comportamento de linfócitos B, o que é esperado quando se
imuniza artificialmente uma criança e porque;
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UNIDADE: Genética das Imunoglobulinas
Objetivos gerais e específicos: 1. Conceitue “Fenômeno de Restrição Isotípica”. 2. Conceitue “Fenômeno de Restrição Alélica”. 3. Justifique a necessidade de haver imunoglobulinas de diferentes classes. 4. Identifique os segmentos gênicos responsáveis pela codificação das cadeias pesadas
das imunoglobulinas. 5. Identifique os segmentos gênicos responsáveis pela codificação das cadeias leves
Kappa das imunoglobulinas. 6. Identifique os segmentos gênicos responsáveis pela codificação das cadeias leves
lambda das imunoglobulinas. 7. Explique as causas da grande variabilidade de sítios combinatórios das
imunoglobulinas. 8. Identifique o processo de “diversidade funcional por inserção”. 9. Defina intron e exon. 10. Identifique a seqüência genética existente para a síntese das diferentes cadeias
pesadas de imunoglubulinas. 11. Responda: é possível que um linfócito B apresente em sua superfície diferentes
classes de imunoglobulinas ao mesmo tempo ? Em que situações? 12. Diferencie o rearranjo gênico que existe durante a fase primordial e a fase tardia de
síntese das imunoglobulinas. 13. Diferencie os rearranjos gênicos que existem nas cadeias leves e pesadas. 14. Identifique a diferença na codificação genética entre imunoglobulina de membrana e
imunoglobulina secretada. 15. Explicar por que uma célula que sofreu um “Switch” para a síntese de IgG não
mais poderá voltar a sintetizar IgM;
16. Responder: por ‘que, durante o “Swicth”, há variação na síntese da porção constante
da cadeia pesada de imunoglubolinas e não ocorre o mesmo para a porção variável?
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INTERAÇÃO DO SISTEMA IMUNOLÓGICO
Se você foi capaz de responder a estes questionários contendo os objetivos específicos já é capaz de compreender as diversas faces do sistema imune. Portanto, é bem possível que você já possa prever como será, ou como deverá ser, a reação do organismo frente a alteração do padrão fisiológico do mesmo. Tente, então, realizando um esquema completo, identificar a cinética de uma infecção viral numa célula hepática e a resolução desta infecção pelo sistema imunológico, utilizando todos os conceitos que você já aprendeu.
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UNIDADE Tolerância Imunológica
Objetivos gerais e específicos: 1. Conceituar “Tolerância imunológica”. 2. Reconhecer sua participação e importância no Sistema Imunológico. 3. Conhecer os fatores favorecedores da resposta ao tolerogênico. 4. Explicar os mecanismos imunológicos pelos quais o sistema imunológico
desenvolve tolerância aos antígenos próprios e não próprios. 5. Justificar o papel do contato de longa duração na duração de tolerância. 6. Explicar a participação da via oral na indução da tolerância. Explicar a importância
da drenagem venosa na tolerância por via oral.
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UNIDADE HIPERSENSIBILIDADE
1. Definir o que é uma reação de hipersensibilidade. 2. Classificar as reações de hipersensibilidade quanto aos seus mediadores imunológicos,
segundo Gel e Coombs 3. Relacionar as reações de hipersensibilidade da classificação de Gel e Coombs, nos tipos
imediatos e tardios. 4. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade tipo I. 5. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade tipo II. 6. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade tipo III. 7. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade IV. 8. Identificar qual o infiltrado celular característico de uma reação inflamatória desencadeada
por uma reação de hipersensibilidade tipo I. 9. Identificar qual o infiltrado celular característico de uma reação inflamatória desencadeada
por uma reação de hipersensibilidade tipo III. 10. Identificar qual o infiltrado celular característico de uma reação inflamatória desencadeada
por uma reação de hipersensibilidade tipo IV.
11. Justificar a presença destas células do infiltrado na hipersensibilidade tipo I.
12. Justificar a presença destas células do infiltrado na hipersensibilidade tipo III.
13. Justificar a presença destas células do infiltrado na hipersensibilidade tipo IV.
14. Identificar a classe de imunoglobulina envolvida na mediação da hipersensibilidade tipo I. 15. Identificar a(s) classe(s) de imunoglobulina(s) envolvida(s) na mediação da
hipersensibilidade tipo II. 16. Identificar a classe de imunoglobulina envolvida na mediação da hipersensibilidade tipo III. 17. Reconhecer a propriedade fundamental das imunoglobulinas mediadoras da
hipersensibilidade tipo I. 18. Citar os mediadores farmacológicos na hipersensibilidade tipo I. 19. Reconhecer a origem, ação e efeito dos mediadores farmacológicos na hipersensibilidade
tipo I. 20. Descrever a natureza do edema formado na hipersensibilidade tipo I. 21. Descrever a natureza do edema formado na hipersensibilidade tipo III.
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22. Diferenciar o mecanismo de formação de edema na hipersensibilidade tipo I e III. 23. Descrever os principais mecanismos da lesão celular por hipersensibilidade tipo II. 24. Reconhecer a localização do Ag na hipersensibilidade tipo II. 25. Justificar uma neutropenia após a administração do antibiótico cloranfenicol. 26. Explicar as reações aceitas para a permanência de imunecomplexos circulantes o
organismo. 27. Explicar o papel do sistema do complemento nas reações de hipersenbilidade tipo III. 28. Explicar a reação de Arthus. 29. Diferenciar a formação de uma reação de Arthus com uma reação tipo III sistêmica. 30. Justificar fenômenos hemorrágicos presentes na reação inflamatória por hipersensibilidade
tipo III. 31. Entender a origem da histamina e seu papel na hipersensibilidade tipo III. 32. Justificar a isquêmia que pode acompanhar as reações de hipersensibilidade tipo III. 33. Identificar o principal mediador imune da reação inflamatória tipo IV na classificação de
Gel e Coombs. 34. Caracteritizar os tipos celulares predominantes no infiltrado inflamatório mediado por
hipersensibilidade tipo IV. 35. Justificar a presença destas células no infiltrado . 36. Justificar a induração que caracteriza as reações intradérmicas de hipersensibilização tipo
IV. 37. Justificar o eritema que caracteriza as reações intradérmicas de hipersensibilidade tipo IV. 38. Compreender a utilização de testes intradérmicos de hipersensibilidade tipo IV para
avaliação de imunidade celular. 39. Justificar a escolha dos Ag em uso nos testes intradérmicos de avaliação de imunidade
celular. 40. Explicar o mecanismo da injúria tecidual pelo mecanismo de hipersensibilidade tipo IV,
reconhecendo os fatores liberados por células responsáveis.
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UNIDADE: TRANSPLANTES
Objetivos gerais e específicos: 1. Reconhecer quais a estruturas moleculares das células de um enxerto, que são
responsáveis pela indução da rejeição aos mesmos. 2. Relacionar estas estruturas moleculares e o MHC. 3. Associar MHC e HLA. 4. Citar os principais locus da região HLA. 5. Conhecer a nomenclatura correspondente aos enxertos. 6. Montar um exemplo de um perfil para a expressão fenotípica de todos esses locus
em um indivíduo. 7. Citar as provas de seleção para doador vivo para os transplantes. 8. Justificar a importância da Prova Cruzada que antecede os transplantes. 9. Interpretar uma prova cruzada positiva. 10. Justificar o valor da análise do perfil de HLA na seleção do doador vivo 11. Explicar os mecanismos de agressão às células enxertadas. 12. Reconhecer os tipos de rejeição aos enxertos identificando os principais elementos
da resposta imune, envolvidos. 13. Explicar a reação de Enxerto X Hospedeiro e justificar a sua presença nos
transplantes de medula óssea.
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SUBUNIDADE:
“ELETROFORESE DE PROTEÍNAS”.
OBJETIVOS GERAIS E ESPECÍFICOS: Ao final do exercício desta prática no laboratório o aluno deve estar apto a: 1- Explicar o princípio de uma eletroforese de proteínas; 2- Reconhecer o que atuou como suporte na corrida eletroforética realizada no
laboratório; 3- Justificar a importância do pH alcalino do tampão utilizado; 4- Reconhecer e explicar o fato das albuminas migrarem com maior velocidade; 5- Fundamentar a razão de todas as proteínas migrarem em um único sentido; 6- Dar a definição de ponto Isoétrico de uma proteína e explicar sua participação no
princípio desta técnica;
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PARTE III
ESTUDOS DIRIGIDOS EXERCÍCIOS
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RIE (RADIOIMUNISAIO)
Abaixo está representado um método de reação Ag/Ac que você já tem as condições necessárias para compreender. Essa reação se presta ao diagnóstico sorológico da HEPATITE A. Essa reação processa-se em tubos onde seguiu-se a metodologia abaixo. Após a leitura e compreensão responda o que se pede abaixo: METODOLOGIA: A cada tubo foi adsorvido previamente anticorpos anti-IgM humana. A adsorção se dá por ligações covalentes entre os anticorpos e o material do tubo (poliestireno). Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina, para assim recobrir os espaços não ocupados pelo anticorpo (bloqueio do tubo). 1- Ao tubo foi adicionado soro suspeito para o exame. 2- A seguir procedeu-se a incubação a 37º C por 30 minutos, uma condição
favorecedora da interação Ag/Ac. 3- Posteriormente realizou-se a lavagem do sistema. 4- Adicionou-se a seguir, antígeno extraídos do vírus da Hepatite A. 5- Realizou-se nova lavagem do sistema. 6- Adicionou-se então anticorpos anti-vírus da hepatite A, marcador com l125 (um
isótopo radioativo cuja emissão de radiação pode ser medida em um cintilômetro). 7- Seguiu-se nova etapa de lavagem. 8- Mediu-se a radiação do tubo. PERGUNTA-SE a- O que estava sendo pesquisado b- diga qual a importância clínico- laboratorial de termos adsorvidos, ao tubo, anticorpos anti-IgM e não anti-IgG.
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ELISA ( ENZIME LINKED IMUNOSORBENT ASSAY) Abaixo está apresentado um método de reação Ag/Ac que você já tem as condições necessárias para compreender. Essa reação se presta ao diagnóstico sorológico da AIDS . Acompanhado será fornecido uma placa com 96 poços onde seguiu-se a metodologia abaixo. METODOLOGIA A cada poço foi adsorvido previamente antígenos extraídos dos vírus da AIDS. A adsorção se dá através de ligações covalentes entre os antígenos e o material da placa. Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina, para assim recobrir os espaços não ocupados pelo antígeno (bloqueio da placa). 1- Foram adicionados aos poços 1 e 2 soros procedentes de dois pacientes suspeitos de
terem anticorpos anti-HIV ( vírus da imunodeficiência humana causador da AIDS). 2- A placa foi levada a uma estufa a 37 ºC por 30 minutos, uma condição favorecedora
da interação Ag/Ac. 3- A seguir esse poço foi lavado com uma solução tampão com finalidade de retirar
moléculas livres. 4- Posteriormente adicionou-se ao poço anticorpos anti-imunoglobulinas humanas. As
moléculas desses anticorpos tinham, ligadas em si, no Fc, uma enzima (peroxidase) cujo substrato pode ser o peróxido de hidrogênio. Esse substrato ao sofrer a ação daquela enzima manifesta uma cor alaranjada que se revela quando se adiciona ao meio uma substância reveladora ( no caso o ortofenilenodiamino-OPD). A ligação da enzima ao anticorpo não altera as propriedades anticórpicas desse.
Ao conjunto anticorpo anti-imunoglobulina mais enzima chamamos de conjugado.
5- Após a adição do referido conjugado, lavou-se o poço com solução tampão. 6- A seguir adicionou-se ao poço uma solução de peróxido de hidrogênio mais OPD. 7- Logo após observou-se que a solução no poço 1 ficou alaranjada enquanto que no
poço 2 não houve alteração. Responda: a- Esquematize os dois poços evidenciando as reações Ag/Ac que ocorrerem ou
deixarem de ocorrer. b- Após a realização do item 3, esquematize o que permaneceu no poço 1. c- Como você interpreta o resultado visível nos poços 1 e 2 respectivamente?
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WESTERN BLOTTING É um dos métodos mais utilizados para identificar proteínas reconhecidas por anticorpos, sendo designado também de immunoblotting, diferenciando-se do “Southern ou Northen blotting”, que se prestam a identificação de ácidos nucléicos. Abaixo está apresentado um exemplo de Western blotting que se presta ao diagnóstico sorológico da AIDS. Leia com atenção e responda. 1- Para a realização de um Western blotting inicialmente as proteínas virais são separadas, de acordo com seu tamanho, por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio - um detergente (SDS-PAGE).
2- Em seguida as proteínas fracionadas no gel são transferidas por corrente elétrica, para uma membrana de nitrocelulose que posteriormente será recortada em tiras. Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina ou a caseína, para assim recobrir os pedaços não ocupados pelo antígeno (bloqueio da fita). 3- A cada tira é adicionado em recipiente apropriado soro de paciente suspeito de ter anticorpos anti-HIV. 4- Segue-se um período de incubação de 30 minutos a 37º C, e extensiva lavagem para
a remoção das proteínas livres. 5- Posteriormente adicionou-se ao poço anticorpos anti-imunoglobulinas humanas
marcadas com uma enzima (peroxidade). Ao conjunto anticorpo anti-imunoglobulina mais enzima chamamos de conjugado.
6- Após a adição do referido conjugado, lavou-se o poço com solução tampão. 7- A seguir adicionou-se ao poço uma solução de peróxido de hidrogênio mais OPD. 8- Em seguida observou-se que algumas fitas apresentavam bandas (faixas) coradas
denotando reação, enquanto outras não se coraram. RESPONDA: 1- Poderíamos pesquisar subclasses de IgG, ou mesmos outro isótipo de
imunoglobulinas? Como? 2- O que significa exatamente a presença de bandas coradas, com relação as possíveis interações ocorridas?
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IMUNOHISTOQUÍMICA A aplicação da imunohistoquímica (IHQ) à rotina diagnóstica já é uma realidade em nosso meio. De modo genérico, podemos considerar como principais indicações para o exame: ♦ Diagnóstico histogenético de neoplasias morfologicamente diferenciadas ♦ Subtipagem de neoplasias ♦ Caracterização da origem de carcinomas. ♦ Caracterização de produtos de secreção de células neoplásicas ♦ Discriminação da natureza benigna X maligna de determinadas proliferações
celulares. ♦ Avaliação prognóstica de neoplasias ♦ Identificação de agentes infecciosos.
Como exemplo, temos representado abaixo uma reação de IHQ para a pesquisa de receptores de estrógeno em células de adenocarcinoma de mama, um fator prognóstico neste caso.
1- Para a realização reação de imunohistoquímica utilizamos cortes de tecido incluído em parafina com aproximadamente 3 µ de espessura, colocados em lâminas tratadas com silano ( silanizadas), para propiciar uma forte adesão do corte histológico à lâmina
2- Em seguida as lãminas são desparafinizadas, sendo deixadas na estufa à 60°C por 24 horas, no xilol à 60°C e no xilol a temperatura ambiente para desparafinização
3- Após a desparafinização as lâminas são levadas à uma sequência de banhos de álcool absoluto até 80% para hidratação.
9- Posteriormente segue-se a etapa conhecida como recuperação antigênica. Necessária para que se restabeleça a estrutura antigênica das proteínas estruturais, modificada pela ação do formol. Tal etapa poderá ser feita por dois métodos:
Calor úmido: em solução tampão citrato de sódio pH 6,0 4M, em banho-maria, panela de pressão ou microondas por tempo determinado. Enzimático: tratamento do corte com proteinase K
10- Segue-se o bloqueio da peroxidase endógena com H2O2 11- Adição de anticorpo monoclonal de coelho específico, anti-receptor para estrógeno 12- Incubação por 30 minutos à 37°C e overnight na geladeira. 13- No dia seguinte etapa de lavagem com solução tampão 14- Adição de um anticorpo anti- anticorpo de coelho, marcado com estrepavidina,
incubação à 37°C 15- Nova etapa de lavagem 16- Adição de complexo biotina-estreptoavidina complexada com, nova incubação à
37°C 17- Lavagem e adição de solução de Dab (Diaminobenzidina 60mg%) 18- Contra coloração com hematoxilina. 19- Observação no microscópio de núcleos corados de marrom. RESPONDA: Qual a finalidade das etapas de lavagem? Por que fazemos a recuperação antigênica? Como seria um resultado negativo?
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EXERCÍCIO SOBRE RESPOSTA IMUNE À INFECÇÃO VIRAL E BACTERIANA
1.Sabendo-se que os vírus ao infectarem um organismo, inserem seu genoma no genoma de uma célula do hospedeiro e que assim, esta célula passa a ostentar em sua superfície, moléculas codificadas pelo genoma viral, descreva todos os prováveis eventos de uma resposta imunológica, que você conhece, através dos quais este hospedeiro reagirá à infecção viral. 2.Se em uma situação hipotética, nosso organismo for infectado por uma bactéria extracelular qualquer, tal como uma do gênero Streptoccocus, que possua em sua parede antígenos de natureza polissacarídica e glicoproteíca, qual seria a resposta esperada do sistema imune?.
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CITOMETRIA DE FLUXO Pela acadêmica de Farmácia Daniela Silva Moreira Introdução: A citometria de fluxo consiste em um método laboratorial para definir o tamanho, morfologia e outras características de uma população de células, muito utilizado na classificação de leucemias. É uma técnica de medição das propriedades óticas da células individuais, ou partículas em geral, em um fluxo contínuo passando uma de cada vez, seqüencialmente, em frente a um feixe laser com sensores para medir fluorescência e dispersão de luz. Um citomêtro de fluxo pode medir estes parâmetros a uma taxa de milhares de células por minuto.
Esta metodologia de análise é aplicável em diversas áreas de pesquisa, tais como botânica, genética, microbiologia, zoologia, medicina e outras. Permite o estudo da variabilidade genômica pelo perfil colorimétrico do conteúdo de DNA, é também utilizada para identificar as sub-populações de linfócitos especifícos, para contagem de CD4 e CD8, pode também estimar a distribuição das populações celulares ou fases do ciclo celular, fração de crescimento e propriedades cinéticas, registrar os parâmetros cinéticos do tumor a ploidia do tumor, a fração de proliferação tumoral e a percentagem de células encontradas nas fases S e G1, G2 e M do ciclo celular, indicando fatores prognósticos e rumos terapêuticos. As células devem estar em uma suspensão de células simples com o mínimo de agregação (suspensão monodispersa). Essas células são rotuladas com uma “etiqueta” fluorescente. As informações podem ser adquiridas na citometria de fluxo utilizando células vivas, ou fixas com paraformaldeído. A linha simples de fluxo das células passa pelo raio laser do instrumento. E assim, cada célula fornece 5 números: tamanho, granulosidade, e intensidade de fluorescência verde, vermelho e muito mais vermelho. Desenvolvimento: A citometria de fluxo mede características corpóreas e químicas de células ou partículas que estão em suspensão uma a uma num determinado ponto. Podemos obter medidas corpóreas das células como tamanho, forma e complexidade interna e, é claro qualquer componente da célula ou função que possam ser detectada por um composto fluorescente quando examinada. As aplicações incluem: análise de fenótipo, classificação estéril, análise de DNA, análise e classificação de cromossomo, estudos funcionais.
Embora faça medidas em uma célula de cada vez, pode processar milhares de células em alguns segundos. Contanto que diferentes tipos de células possam ser distintas por características estruturais quantitativas, a citometria de fluxo pode ser usada para a contagem de células de diferentes tipos em uma mistura.
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-Técnica de Citometria de Fluxo A técnica de citometria automatizada de fluxo envolve, primeiro, a coloração da
população de células-alvos com um corante fluorescente ( geralmente iodeto de propídio), através da ligação de um anticorpo monoclonal específico para a população alvo, marcado com o corante fluorescente. A população alvo colorida é, então, passada por um pequeno tubo que cria um fluxo de células únicas, fluxo este que, por sua vez atravessa um raio laser. A energia da luz emitida pelo laser excita o corante fluorescente contido em cada célula, e o número de células é calculado com base na intensidade da fluorescência . Estes dados são em seguida registrados e mostrados na forma de histograma, que representa o perfil da população de células- alvo. Embora não identifiquem células individuais, estes histogramas, gerados a partir da fluorescência, conseguem identificar a tendência central de uma determinada população de células.
Os citômetros de fluxo envolvem fluidos sofisticados, o sistema óptico do laser detectores eletrônicos, conversores analógicos para digitais e computadores.
- Separação de linfócitos por citometria de fluxo: Os linfócitos são classificados em 3 sub-populações: linfócitos T, linfócitos B e
os linfócitos NK. Os linfócitos T são ainda sub-classificados em duas sub-populações funcionais: os CD4 auxiliares e os CD8 citotóxicos.
A metodologia mais atual para a contagem de CD4 e CD8 e para a identificação das sub-populações de linfócitos específicos, utiliza uma técnica sofisticada de citometria de fluxo, baseada em anticorpos monoclonais marcados com substâncias fluorescentes, dirigidas contra os marcadores de superfície CD4, CD8 e CD3.
Provoca-se uma excitação desses elementos fluorescentes com uma luz “laser”e a identificação ótica é feita de maneira automatizada pelo sistema . A cada sessão, 100 microlitos de sangue total é investigado com anticorpos monoclonais específicos dirigidos contra os marcadores CD3, CD4e CD8.
O marcador CD3 é expresso na superfície de células “T” maduras ( CD4 e CD8). O CD4 é expresso na superfície de células (linfócitos) CD4+, mas também, em monócitos. O CD8, por sua vez é expresso na superfície dos linfócitos CD8+ e em algumas células NK. A utilização dos CD3 irá discriminar os linfócitos CD8+ das NK, minimizando o erro.
A contagem absoluta das sub-populações de linfócitos é obtida a partir de 3 determinações sequenciais separadas: a contagem total dos glóbulos brancos do sangue total; o diferencial de glóbulos brancos; a porcentagem de células positivas à citometria de fluxo.
A importância clínica de se fazer citometria de fluxo para separar e contar o número de linfócitos T CD4+ e CD8+, é devido os níveis normais se alterarem nas imunodeficiências e em certas doenças, como por exemplo na infecção pelo HIV. E através desses níveis de linfócitos podemos indicar a progressão ou regressão de uma doença, e assim determinar um tratamento para a doença.
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Conclusão:
Portanto a técnica de citometria de fluxo vem sendo muito utilizada, pois é um teste simples, que permite a separação e contagem de células com excelente sensibilidade diagnóstica. Além de ser um método aplicável em diversas áreas, como ; microbiologia, genética, medicina e outras. Permitindo o diagnóstico e prognóstico de diversas doenças, usado na classificação de leucemias, identificação das sub-populações de linfócitos do sangue, determinar a quantidade de DNA numa população celular, também utilizado para determinar as fases do ciclo celular na fração de proliferação de tumores, etc, e assim direcionando os rumos terapêuticos.
• Bibliografia:
-Di Dio, Renato CD4/CD8 → www.criesp.com .br/inform/ Cd4/Cd8 .htm
-Citometria de Fluxo → www.hcan.org.br/g 105.html
-Citometria do DNA → www.capacity.com.br/citometria -www.uronews.org.br/hot news .6.htm -www.do.med.unipi.it/apher/write/cytome.htm -www.icnet.uk/axp/facs/davies/flow.html
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BIER, O.; MOTA, I. ; SILVA, W. D. Imunologia Básica e Aplicada. 4ª edição. Rio de
Janeiro. Editora Guanabara. 1989. CALICH, V. L.; VAZ, C. A. C. Imunologia Básica 2000. FUNDENBERG, H. H. ; STITES, D. P. CALDWELL, J. L. ; WELLS, J.V. Imunologia
Básica e Clínica. 2ª edição. Rio de Janeiro. 1980.Editora Guanabara. HOXTER, G. Aplicações Clínicas da Imunoeletroforese. Revista LAES. Edição Extra,
maio/85, Ano VI, Vol. II:46-60. VOOS, A.. Eletroforese. Revista LAES, Ano IX, nº 52:08-26 ALVES, V. A. F.; BACCHI, C. E.; VASSALO, J. Manual de Imunohistoquímica. 2ª ed.
São Paulo 1999. Obs.: Algumas técnicas foram obtidas a partir dos Kits reagentes.
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Anexo
CONSELHO FEDERAL DE MEDICINA VETERINÁRIA
PORTARIA N.º 23 Ministério da Agricultura e do Abastecimento PORTARIA nº 23, DE 20 DE JANEIRO DE 1976 Aprova as Normas para a Profilaxia da Brucelose Animal
O MINISTRO DE ESTADO DA AGRICULTURA E DO ABASTECIMENTO, no uso de suas atribuições, tendo em vista o disposto no art. 86, do Regulamento do Serviço de Defesa Sanitária Animal, aprovado pelo Decreto nº 24.548, de 03 de julho de 1934 e considerando a necessidade de atualizar a legislação existente sobre profilaxia da Brucelose, resolve:
Art. 1º. Aprovar as Normas para a Profilaxia da Brucelose Animal, anexas à presente Portaria, assinadas pelo Diretor Geral do Departamento Nacional de Produção Animal.
Art. 2º. Revogar as Portarias Ministeriais números 486 e 222, de 22 de abril de 1958 e 5 de março de 1969, respectivamente.
NORMAS PARA A PROFILAXIA DA BRUCELOSE ANIMAL CAPÍTULO I - DO DIAGNÓSTICO
Art. 1º. O diagnóstico de rotina da Brucelose em bovinos será realizado através das provas de soroaglutinação rápida ou lenta, cuja interpretação obedecerá aos quadros a seguir:
Bovinos não vacinados ou vacinados com idade superior a 8 meses 1/25
(25 UI/ml) 1/50
(50 UI/ml) 1/100
(100 UI/ml) 1/200
(200 UI/ml) Interpretação
- - - - Negativa I - - - Negativa + - - - Negativa + I - - Suspeita + + - - Suspeita + + I - Suspeita + + + - Positiva + + + I Positiva + + + + Positiva
Bovinos de 30 meses ou mais, vacinados entre 3 e 8 meses de idade 1/25
(25 UI/ml) 1/50
(50 UI/ml) 1/100
(100 UI/ml) 1/200
(200 UI/ml) Interpretação
- - - - Negativa I - - - Negativa + - - - Negativa + I - - Negativa + + - - Negativa + + I - Suspeita + + + - Suspeita + + + I Suspeita + + + + Positiva Convenções: I: Aglutinação incompleta; +: Aglutinação completa; UI: Unidades internacionais
Art. 2º. A prova do anel no leite, em amostras compostas, será utilizada para determinação da taxa de prevalência da Brucelose em rebanhos leiteiros.
Art. 3º. Como provas especiais, poderão ser utilizadas as provas de fixação do complemento, precipitação pelo rivanol, redução pelo mercapto-etanol, prova do antígeno tamponado acidificado (prova do cartão - "card test") e prova individual do anel do leite, visando dirimir eventuais dúvidas, em provas de rotina no caso de rebanhos-problema.
Art. 4º. A prova de sêmen-plasma-aglutinação será utilizada em reprodutores dos Centros de Inseminação Artificial e além da prova de soroaglutinação.
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Art. 5º. Como necessário, poderão ser realizados exames bacteriológicos de fetos abortados, anexos fetais, leite, sêmen e outros materiais possivelmente infetados.
CAPÍTULO II - DOS ANIMAIS REAGENTES
Art. 6º. Os animais que revelarem reação positiva serão marcados a ferro candente, no lado esquerdo da cara, com um P contido um circulo de 8 cm (oito centímetro) de diâmetro conforme Anexo 1.
Art. 7º. Recomenda-se o sacrifício dos bovinos com reação positiva, considerando a porcentagem de incidência da doença e as condições locais, observando-se os seguintes critérios.
a. os sacrifício será realizado em matadouro sob inspeção federal e o julgamento efetuado de acordo com as disposições em vigor, constantes do Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal (RIISPOA);
b. o Serviço de Inspeção Federal no estabelecimento onde será realizado o sacrifício deverá ser notificado com antecedência, de forma a permitir a adoção das medidas previstas no RIISPOA.
Art. 8º. Nos casos em que não seja possível o sacrifício, recomenda-se a adoção das seguintes providências:
a. isolar os animais reagentes;
b. isolar as vacas reagentes por ocasião do parto, até que cessem os corrimentos vaginais, aplicando rigorosos cuidados higiênicos complementares;
c. enterrar o feto e seus anexos, quando observado aborto, desinfetando os locais contaminados.
Art. 9º. Os bovinos positivos ou suspeitos de Brucelose, não poderão ser objeto de comércio, salvo quando comprovadamente destinadas ao abate ou a instituições científicas.
CAPÍTULO III - DA VACINAÇÃO DE BEZERRAS
Art. 10. A imunização dos bovinos contra a Brucelose será levada a efeito pela vacinação de bezerras, somente uma vez, com vacina viva, elaborada com a amostra 19 de Br. abortus, controlada pelo órgão oficial competente.
Art. 11. A aplicação da vacina da amostra 19, será efetuada sob a responsabilidade de médico veterinário, observando-se o seguinte critério:
a. vacinar somente bezerras entre 3 e 8 meses de idade, não se admitindo vacinação de machos;
b. marcar as bezerras vacinadas, com ferro candente, no lado esquerdo da cara, com um V, acompanhado do algarismo final do ano da vacinação, conforme modelo do anexo 2. Excluem-se da marcação, as bezerras destinadas ao Registro Genealógico, quando devidamente identificada;
c. emitir atestado de vacinação, em 3 (três) vias, destinando-se a 1ª ao proprietário, a 2ª ao serviço veterinário oficial e a 3ª ao emitente.
CAPÍTULO IV - DA VACINAÇÃO DE FÊMEAS ADULTAS
Art. 12. A vacinação de fêmeas adultas com a amostra 19 poderá ser autorizada em propriedades onde estiverem ocorrendo surtos de abortos brucélicos, observando-se as seguintes condições:
a. a vacinação será realizada apenas uma vez, em cada propriedade afetada, mediante requerimento do proprietário e autorização expressa do responsável pelo programa de combate à Brucelose na respectiva Unidade da Federação;
b. as fêmeas vacinadas com a idade superior a 8 (oito) meses, serão identificadas com ferro candente, no lado direito da cara, com um P contido um circulo de 8 cm (oito centímetros) de diâmetro, conforme Anexo 1.
c. o proprietário dos animais deverá assinar termo de compromisso, aceitando as condições estabelecidas.
CAPÍTULO V - DA PRODUÇÃO E DO CONTROLE DE VACINAS
Art. 13. A vacina com a amostra 19 será produzida por laboratórios autorizados, observando-se a legislação federal específica e de acordo com as técnicas recomendadas pelo órgão competente do Ministério da Agricultura.
Art. 14. Cada partida de vacina produzida será oficialmente controlada, cabendo ao órgão local do Ministério da Agricultura o acompanhamento e controle da produção, dos protocolos, do estoque de vacina, bem como a coleta de amostras das partidas produzidas.
Art. 15. Os frascos de vacina levarão etiquetas oficiais, que serão fornecidas pela unidade de controle, após a liberação da partida correspondente.
Art. 16. A vacina com a amostra 19 será apresentada sob a forma liofilizada, admitindo-se a vacina líquida até o aparelhamento dos laboratórios produtores, a critério da Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura.
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Art. 17. A comercialização da vacina será objeto de fiscalização oficial e sua aquisição e aplicação sob responsabilidade de médico veterinário.
CAPÍTULO VI - DA PRODUÇÃO E DO CONTROLE DE ANTÍGENOS
Art. 18. Os antígenos para diagnóstico da Brucelose, prova rápida, lenta e do anel no leite, serão produzidos por um só laboratório oficial, obedecendo as técnicas de produção e controle recomendadas pela Organização Mundial da Saúde.
Art. 19. A produção de antígenos para diagnóstico de Brucelose pelos demais laboratórios oficiais poderá continuar até a instalação e o funcionamento do laboratório central do Ministério da Agricultura, submetida cada partida a controle oficial.
Art. 20. O controle da distribuição de antígenos para diagnóstico de Brucelose, será efetuado pelo órgão competente do Ministério da Agricultura, devendo o mencionado produto ser fornecido somente a médicos veterinários.
CAPÍTULO VII - DO CONTROLE DE TRÂNSITO
Art. 21. Somente será fornecido certificado de inspeção sanitária animal, para fins de trânsito interestadual, quando os reprodutores apresentarem resultados negativos atestados acompanharão os animais.
Art. 22. Não será exigido atestado negativo para fêmeas bovinas com idade inferior a 30 (trinta) meses, quando acompanhadas de atestado de vacinação contra a Brucelose, estando as bezerras e novilhas devidamente marcadas e identificadas.
Art. 23. O trânsito internacional de bovinos, sêmen e produtos derivados reger-se-á pela legislação específica vigente.
Art. 24. O atestado de exame negativo para Brucelose será válido por 60 (sessenta) dias, a contar da data da realização do respectivo exame.
CAPÍTULO VIII - DO REGISTRO GENEALÓGICO, DAS EXPOSIÇÕES E FEIRAS AGROPECUÁRIAS
Art. 25. A inscrição de bovinos no Registro Genealógico e a participação dos mesmos em Exposições e Feiras Agropecuárias, dependerá da apresentação de:
a. atestado de vacinação contra a Brucelose, para fêmeas bovinas até 30 (trinta) meses de idade, vacinadas entre 3 e 8 meses de idade, ou
b. atestado negativo para Brucelose, admitindo-se o título máximo aglutinante até 1:50 para fêmeas bovinas com idade superior a 30 (trinta) meses, vacinadas na idade recomendada.
CAPÍTULO IX - DA CERTIFICAÇÃO DE PROPRIEDADE LIVRE
Art. 26. Os criadores poderão inscrever-se um esquema voluntário, para obtenção do Certificado de Propriedade Livre de Brucelose.
Art. 27. Os animais da propriedade serão identificados por tatuagem ou outra forma, inclusive pelo Registro Genealógico.
Art. 28. As condições que uma propriedade deve preencher para ser considerada livre de Brucelose serão estabelecidas através de instrução da Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura.
CAPÍTULO X - DA PROFILAXIA DA BRUCELOSE SUÍNA
Art. 29. A profilaxia da Brucelose suína será baseada na adoção das seguintes medidas:
a. diagnósticos da situação, através de exame dos rebanhos em áreas de suinocultura mais expressiva, utilizando-se as provas de soroaglutinação rápida e lenta ou a prova com antígeno acidificado tamponado (prova do cartão - "card test"), realizadas nos suínos com idade superior a 6 (seis) meses;
b. nas provas de soroaglutinação rápida e lenta, considera-se com infetado o rebanho no qual forem identificados um ou mais suínos com aglutinação completa na diluição de 1:100, sendo neste caso, positivos os animais com títulos iguais ou superiores a 1:25;
c. utilizando-se a prova de antígeno acidificado temponado (card test), os animais são classificados somente em positivos e negativos;
d. são considerados negativos os rebanhos que não apresentarem qualquer animal com aglutinação superior a 1:100 - Incompleta;
e. nas provas de soroaglutinação rápida e lenta, também não é admitida a classificação de suínos suspeitos, sendo que a interpretação das mesmas obedecerá o critério constante dos quadros a seguir:
Suínos procedentes de rebanhos negativos 1/25
(25 UI/ml) 1/50
(50 UI/ml) 1/100
(100 UI/ml) Interpretação
I - - Negativa + - - Negativa
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+ I - Negativa + + - Negativa + + I Negativa + + + Positiva
Suínos procedentes de rebanhos positivos, positivos retestados, parcialmente testados ou desconhecidos
1/25 (25 UI/ml)
1/50 (50 UI/ml)
1/100 (100 UI/ml)
Interpretação
I - - Negativa + - - Positiva + I - Positiva + + - Positiva + + I Positiva + + + Positiva
Art. 30. A presença de suínos infetados numa criação justifica o sacrifício do rebanho, considerados os antecedentes clínicos e epidemiológicos.
CAPÍTULO XI - DA BRUCELOSE OVINA E CAPRINA
Art. 31. A profilaxia da Brucelose ovina e caprina será baseada na adoção das seguintes medidas.
a. levantamento da prevalência da doença nas áreas de criação;
b. controle rigoroso de plantéis indenes, especialmente dos reprodutores utilizados;
c. vigilância severa e permanente das importações de ovinos e/caprinos.
Art. 32. A interpretação dos resultados das provas sorológicas de aglutinação para ovinos e caprinos, obedecerá o seguinte critério:
a. reação suspeita, quando o título não ultrapassar de 1:25;
b. reação positiva, quando o título for de 1:50 ou maior.
Parágrafo único. Nos casos positivos e suspeitos, além das soroaglutinações rápida e lenta, serão precedidas provas de fixação do complemento.
CAPÍTULO XII - DAS DISPOSIÇÕES GERAIS
Art. 33. A Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura baixará instruções complementares permanecendo em uso os atuais formulários para exames de Brucelose e vacinação, até que sejam estabelecidos novos modelos.
Art. 34. Os casos omissos e as dúvidas suscitadas na execução e interpretação destas normas serão resolvidos pelo Diretor da Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura.
JOSÉ PEDRO GONZALES Diretor Geral do DNPA
