INTRODUO AO LABORATRIO E SOLUES

1a AULA

INTRODUO AO LABORATRIO E SOLUES

INSTRUES

1.Lembre-se que o laboratrio um lugar para trabalhos srios e no para brincadeiras.

2.Leia os guias das prticas com antecedncia para obter melhor aproveitamento das aulas.

3.Realize somente os experimentos indicados na aula. No permitido realizar aqueles no autorizados.

4.Tendo qualquer dvida solicite aos professores os devidos esclarecimentos.

5.Comparea s aulas nos dias e nos laboratrios designados para sua turma.

6.No permitido fumar ou consumir alimentos durante as aulas prticas.

7.Para sua prpria segurana, vista um guarda-p (avental) ao entrar no laboratrio.

8.No troque os reagentes de uma mesa para outra.

9.No final de cada aula, limpe todo o material: Passe gua de torneira nos tubos e outros materiais utilizados. As pipetas devem ser colocadas dentro das cubas.

10.Quando houver quebra ou danos nos materiais ou aparelhos, comunique aos professores.

11.Se engolir um pouco de cido, lave rapidamente a boca com bastante gua e em seguida

com soluo de carbonato de sdio 2%.

PRINCPIOS DE TCNICA

a.Pipetas graduadas, no devem ser sopradas ao fim do escoamento. Portanto recomenda-se empregar o comeo (o zero) e no o fim da graduao para dispensar volumes pequenos.

b.Uma mesma pipeta no pode ser usada para medir solues diferentes a no ser que seja lavada.

c.Nunca aquecer material volumtrico.

d.Antes de retirar de um frasco uma soluo qualquer, ler o rtulo.

e.Para aspirar solues de cidos e lcalis concentrados, usar uma pipeta de segurana (pera), antes testada com gua.

f. Nunca devolver uma soluo para o frasco estoque.

UNIDADE DE VOLUME

A unidade fundamental de volume na medida de lquidos o litro (l) e o mililitro (ml) o seu submltiplo, correspondente milsima parte do litro.

MATERIAIS FUNDAMENTAIS DE LABORATRIO

VIDRARIA - De um modo geral, encontramos num laboratrio de Qumica dois tipos de material de vidro, volumtrico e no volumtrico. Dentre os volumtricos temos: pipetas, provetas e bales volumtricos.

PIPETAS - So destinadas a transferir determinados volumes de lquido. H dois tipos: graduados e volumtricos. Nestas prticas, s pipetas graduadas so usadas. Elas tm volumes de 1, 2, 5 e 10 ml e permitem escoar volumes variveis de lquido, de acordo com a sua graduao, dividida em dcimos ou centsimos de ml.

PROVETAS - (Cilindros graduados) - So de medida volumtrica no muito rigorosa, graduadas para diversos volumes de lquido: 25, 50, 100, 250 ... ml.

BALES VOLUMTRICOS - So bales aferidos a fim de conterem um volume determinado por um trao de referncia (50, 100, 250, 500 ... ml). So usados no preparo de solues que exijam grande exatido na sua concentrao. No entanto, para esta exatido ser garantida, todas as operaes de preparo de solues devem ser feitas na temperatura do aferimento do material volumtrico, geralmente 20o C.

MATERIAL NO VOLUMTRICO

Os principais tipos de vidraria utilizados nestas prticas so: tubo de ensaio, bquer, erlenmeyer e funil. So tambm freqentemente usados estantes e pinas para tubos de ensaio.

TCNICA DE LEITURA DE MATERIAL VOLUMTRICO

Faz-se pela observao da coincidncia entre a curvatura que se forma na superfcie livre do lquido (menisco) e a graduao existente no material volumtrico. A parte inferior do menisco deve coincidir com o trao de graduao correspondente ao volume desejado. Para evitar erro, sua vista, o menisco e o trao de graduao devem estar num mesmo plano horizontal.

VELOCIDADE DE ESCOAMENTO

Se o escoamento for muito rpido (soprando na pipeta, por exemplo), a quantitade de lquido que resta na pipeta aderido s paredes ser maior do que a que deve ficar. Com gua, considera-se o que o tempo mnimo para o escoamento total de pipetas de 1 ml e 5 ml deve ser de 15 segundos.

EXPERINCIAS

Treinamento com pipetas - Procure identificar as pipetas de diferentes capacidades e graduaes (1, 2, 5 e 10 ml) que esto em sua bancada. Faa ento os exerccios seguintes, comeando com uma pipeta de 10 ml:

Introduza a extremidade inferior da pipeta em gua destilada contida em um bquer. Aspire com a boca at que o nvel da gua ultrapasse o trao superior da aferio (zero). Tire rapidamente a boca da abertura da pipeta e obture a mesma com o indicador da mo direita. Diminua a presso exercida pelo indicador sobre a abertura, de modo a deixar a gua cair gota a gota, at que a parte inferior do menisco coincida com o zero (mantendo a pipeta na vertical e a marca no nvel dos olhos). Acertado o zero, comece ento a escoar lentamente volumes variveis (10 ml, 9 ml, 8 ml, 7 ml, 6 ml), acertando a cada vez o menisco no zero.

REPITA O EXERCCIO

Com uma pipeta de 5 ml, escoando: 5 ml - 4 ml - 3 ml - 2 ml.

Com uma pipeta de 2 ml, escoando: 2 ml - 1,7 ml - 1,5 ml - 1 ml.

LEMBRE-SE

Volumes compreendidos entre 10 e 5 ml devem ser transferidos com uma pipeta de 10 ml, volumes entre 5 ml e 2 ml devem ser transferidos com uma pipeta de 5 ml, volumes entre 2 e 1 ml com uma pipeta de 2 ml e volumes entre 1 e 0,1 ml com uma pipeta de 1 ml.

SOLUES

As principais maneiras de definir a concentrao de uma soluo so atravs da percentagem, da molaridade ou da normalidade.

Uma soluo percentual contm uma quantidade medida do soluto numa determinada quantidade do solvente. Os trs principais tipos de solues percentuais resultam da definio destas quantidades por peso ou por volume:

1 - Soluo percentual peso por volume - % p/v - Ex.: soluo de cloreto de sdio 2% (2 g do sal em 100 ml da soluo)

2 - Soluo percentual peso por peso - % p/p - Ex.: soluo de cido clordrico 37% (37 g do cido em 100 g da soluo)

3 - Soluo percentual volume por volume - % v/v - Ex.: soluo de cido actico 5% (5 ml do cido em 100 ml da soluo)

Uma soluo molar aquela que contm o peso molecular do soluto em gramas, por litro de soluo. representada por 1 M ou M. Pode haver mltiplos ou submltiplos do peso molecular : 2 M - 4 M - 0,1 M - 0,2 M etc. Uma soluo M de cloreto de sdio contm 58,5 g (p.m.) do sal, em um litro. Uma soluo 2 M conter 2x58,5g = 117 g. Uma soluo 0,1 M conter 5,85 g.

Solues normais so aquelas que contm um equivalente-grama do soluto por litro de soluo. Podemos ter mltiplos e submltiplos do equivalente-grama: 1 N, 2 N, 0,1 N... O clculo do equivalente-grama depende da natureza qumica do soluto. Se um cido, calcula-se dividindo o peso molecular pelo nmero de tomos de H ionizveis. Ex.: sol. HCl 1 N (36,5 g/l); sol. HCl 0,1 N (3,65 g/l); sol. H2SO4 1 N (98/2 = 49 g/l).

EXPERINCIA - PESAGEM E PREPARAO DE SOLUO

Preparar 25 ml de uma soluo de cloreto de sdio 20 % p/v.

TCNICA

Coloque todos os pesos da balana em zero.

O ponteiro deve estar no centro, posio de equilbrio.

Sobre o prato coloque um bquer. Observe que o ponteiro deslocou-se para cima. Mova os pesos das escalas at restabelecer o equilbrio. Por exemplo, se o bquer pesou 68 g, o peso da escala de 10/100 g dever estar em 60 e o da escala 1/10 g em 8.

Anote o peso do bquer: __________

Ao peso do bquer some a quantidade de NaCl necessria para se preparar 25 ml da soluo a 20 % p/v.

Anote o resultado do clculo bquer + NaCl: ___________

Desloque os pesos da balana at obter o total calculado. Observe que o equilbrio da balana foi desfeito. Para restabelec-lo, adicione NaCl ao bquer. Temos assim pesada a quantidade de sal necessria para se preparar os 25 ml da soluo a 20%.

Preparao da soluo

Ao cloreto de sdio contido no bquer junte cerca de 10 ml de gua destilada. Misture com basto de vidro at dissolver. Transfira a soluo do sal para uma proveta de 25 ou 50 ml, tomando cuidado para no perder lquido. Ao bquer adicione 5 ml de gua destilada e transfira para a proveta. Complete o volume at a marca de 25 ml com gua destilada no deixando ultrapassar a marca.

OBSERVAES

Nas cincias modernas, a tendncia substituir o termo peso por massa.

As quantidades definidas por volume so sujeitas a alteraes significativas pela temperatura. Em ambientes onde a temperatura no pode ser controlada rigorosamente, recomendvel definir todas as quantidades pelas massas.

SOLUES-TAMPO

Tampes so solues que resistem a variaes de pH. So constitudos de cidos fracos e seus sais ou de bases fracas e seus sais. Ex.: tampo acetato (cido actico + acetato de sdio).

MECANISMO DE AO

Vamos tomar como exemplo o tampo acetato.

Se a este tampo se adicionar um cido forte como o HCl, haver formao de um sal neutro e de um cido fracamente ionizado, e o pH da soluo permanecer quase o mesmo.

CH3COOH

CH3COONa + HCl ( NaCl + CH3COOH

(sal neutro) (cido fraco)

Se ao mesmo tampo adicionarmos uma base forte como o hidrxido de sdio, haver formao de acetato de sdio (menos alcalino que o NaOH) e gua. Tambm neste caso o pH quase no se modificou.

CH3COOH + NaOH (CH3COONa + H2O

CH3COONa

TAMPES FISIOLGICOS

Um dos mecanismos de controle da neutralidade dos lquidos celulares devido ao de tampes. Os principais tampes que estabilizam o pH do sangue na faixa de 7,35 a 7,45 so: bicarbonato/cido carbnico, fosfato e hemoglobina. A manuteno deste pH importante porque valores de pH acima de 7,7 ou abaixo de 6,8 so incompatveis com a vida.EXPERINCIAS COM TAMPES

Distribuir em quatro bquers marcados:

Bquer 1 e 2: 25 ml de gua destilada

Bquer 3 e 4: 25 ml de sol. tampo acetato 0,1 N pH 5.

Medir com papel indicador o pH aproximado dos lquidos dos 4 bquers. Anotar o resultado no quadro a seguir.

Aos bquers 1 e 3 adicionar em cada, uma gota de HCl concentrado.

Aos bquers 2 e 4 adicionar em cada, uma gota de sol. NaOH 50%.

Misturar por leve agitao.

Medir com papel indicador o pH dos lquidos em cada bquer e anotar.

BquerpH inicialpH aps HClpH aps NaOH

1

2

3

4

Baseado nos resultados da tabela, o que concluiu?

AMINOCIDOS

1. REAO XANTOPROTICA

Pesquisa de Tirosina e Triptofano

Esta reao positiva com compostos portadores de radicais aromticos substitudos.

Nas protenas estes radicais aparecem na tirosina e no triptofano.

Tirosina Triptofano

Os radicais aromticos destes aminocidos reagem com o cido ntrico formando nitroderivados que em meio alcalino so alaranjados.

TCNICA

Marcar 3 tubos de ensaio e colocar em cada um as seguintes substncias:

Ao no 1 - juntar 1 ml de ovoalbumina

Ao no 2 - juntar 1 ml de amido

Ao no 3 - juntar 1 ml de gua (tubo controle)

Adicionar a cada tubo, 10 gotas de cido ntrico concentrado (muito corrosivo; usar pipeta de 5 ml e apenas com imerso da ponta, no com aspirao). Agitar levemente e colocar no banho-maria fervente por 5 min. Esfriar em gua corrente e acrescentar 4 ml de NaOH 2 N. Anotar os resultados em forma de tabela como segue, marcando com um sinal + o(s) teste(s) positivo(s) e com um sinal - os negativos:

TuboReao

1

2

3

O aparecimento de colorao alaranjada indica a positividade do teste, confirmando a presena dos aminocidos tirosina e triptofano. Nas condioes descritas, a fenilalanina no reage.

2. REAO DE MILLON

Pesquisa de tirosina.

Esta reao devida a presena do grupo hidroxifenil. Nas protenas o nico grupo deste tipo encontrado no aminocido tirosina. O teste de Millon usa como reagente o nitrato de mercrio, dissolvido numa soluo de cido ntrico. O grupo hidroxifenil produz um fenolato de mercrio de cor avermelhada.

TCNICA

Marcar 3 tubos de ensaio e colocar em cada um as seguintes substncias:

Ao no 1 - juntar 1 ml de ovoalbumina

Ao no 2 - juntar 1 ml de fenol 1 %

Ao no 3 - juntar 1 ml de gua (tubo controle)

Adicionar a cada tubo, 5 gotas do reativo de Millon (corrosivo e txico). Agitar levemente e colocar no banho-maria fervente por 5 min. Esfriar em gua corrente e anotar os resultados em forma de tabela como anteriormente. Que concluiu ?

3. REAO DO BIURETO

Reao geral para protenas.

Esta reao denominada do biuretoporque um composto chamado biureto o mais simples que apresenta este teste positivo. O biureto um composto artificial, obtido pelo aquecimento forte de uria, e tem a seguinte frmula:

H2N - CO - NH - CO - NH2 Biureto

O biureto o composto mais simples capaz de reagir em meio alcalino com cobre divalente produzindo um complexo de cor violeta. Outros compostos com duas ligaes amida dispostas de maneira semelhante ao biureto respondem de maneira semelhante; portanto observamos a reao do biureto principalmente com as protenas, que tm muitas ligaes peptdicas:

- NH - CHR - CO - NH - CHR - CO - NH - CHR - CO - NH - CHR - CO - NH - CHR - CO -

Ligaes peptdicas

Os complexos coloridos formados com cobre divalente em meio alcalino tm estruturas parecidas:

Complexo Cprico do Biureto Complexo Cprico da Protena

A reao das protenas com o reativo do biureto no muito sensvel, porm to segura que ela usada como referencial para a dosagem da concentrao protica no plasma e soro do sangue humano.

TCNICA

Marcar 3 tubos de ensaio e colocar em cada um 2 ml do reativo do biureto (sulfato cprico complexado com tartarato em meio alcalino).

Ao no 1 - juntar 1 ml de ovoalbumina

Ao no 2 - juntar 1 ml de amido

Ao no 3 - juntar 1 ml de gua (tubo controle)

Misturar por leve agitao dos tubos, esperar 10 minutos, anotar os resultados em forma de tabela.

PROTENAS

REAES DE PRECIPITAO

As protenas podem ser precipitadas de suas solues por ao de cidos fortes, por solues concentradas de sais (p.e. sulfato de amnio), por solventes orgnicos (p.e. lcool) e ainda por sais de metais pesados, em determinadas condies. Ainda que superficialmente parecidas, as reaes de precipitao de protenas podem ter mecanismos muito diferentes. A precipitao de protenas acompanha-se quase sempre de uma desnaturao das mesmas; no entanto, s vezes esta mudana de conformao reversvel. Por outra lado, existem formas de desnaturao irreversvel (p.e. com bases fortes ou detergentes), que no levam as protenas precipitao.

1. PRECIPITAO PELO CIDO TRICLOROACTICO

cidos fornecem ons negativos e precipitam as protenas sob forma de sais; no entanto, este mecanismo vem associado com uma destruio daquelas partes da conformao nativa que dependem de pontes de hidrognio e de ligaes inicas. A atividade de cidos particularmente eficientes para precipitar protenas, como p.e. os cidos tricloroactico, tngstico e pcrico, explica-se porque estes reagentes atacam, adicionalmente, os centros hidrofbicos das protenas.

TCNICA

Marcar 3 tubos de ensaio e colocar em cada um 2 ml de ovoalbumina. Posteriormente, adicionar em cada um as seguintes solues (cuidado):

Ao no 1 - juntar 1 ml sol. cido actico 20 %

Ao no 2 - juntar 1 ml sol. cido clordrico 20 %

Ao no 3 - juntar 1 ml sol. cido tricloroactico 20 %

Agitar e misturar bem. Observar e anotar os resultados em forma de tabela como segue, marcando pelo nmero de sinais + , a quantidade de precipitado que apareceu.

TuboPrecipitado

1

2

3

Que concluiu sobre a eficincia dos diferentes cidos para precipitar a protena ? Existe relao entre a molaridade do cido e o seu efeito sobre a ovoalbumina?

2. PRECIPITAO COM SAIS DE METAIS PESADOS

As bases, mesmo fortes, no precipitam as protenas apesar de elas quebrarem tambm as pontes de hidrognio e ligaes inicas. No entanto, o meio alcalino aumenta substancialmente o nmero de cargas negativas presentes nas protenas. Nestas condies, reativos como os ons de metais pesados (p.e. mercrio, chumbo), precipitam as protenas devido formao de sais insolveis (proteinatos) dos metais. ( de se observar que, mesmo em ausncia de protenas, estes metais em condies alcalinas formam hidrxidos, tambm insolveis. O precipitado final consiste, portanto, de dois componentes).

proteina + OH - (proteina

protena - + metal +(proteinato de metal, insolvel

metal + + OH -

(metal-OH, insolvelTCNICA

Marcar 3 tubos de ensaio e colocar em cada um 2 gotas de NaOH (corrosivo; usar pipeta de 5 ml e apenas com imerso da ponta, no com aspirao).

Ao no 1 - juntar 1 ml de ovoalbumina

Ao no 2 - juntar 1 ml de ovoalbumina e 5 gotas de soluo de acetato de chumbo 10 %

Ao no 3 - juntar 1 ml de gua e 5 gotas de soluo de acetato de chumbo 10 %

(tubo controle)

Misturar por leve agitao dos tubos, esperar 10 minutos, e anotar os resultados em forma de tabela como segue, marcando com um sinal - o teste negativo e com um ou vrios sinais + , a quantidade de precipitado que apareceu nos testes positivos.

TuboPrecipitado

1

2

3

Que concluiu sobre a natureza do precipitado no tubo no 2?

3. PRECIPITAO POR SATURAO SALINA E COM SOLVENTE ORGNICO

Muitas protenas so hidrosolveis. Todas elas devem sua solubilidade a uma extensa camada de gua estruturada que interage com cargas eltricas e resduos polares na superfcie da molcula proteica. A adio de sais (sulfato de amnio) ou solventes misturveis com gua (lcool, acetona) leva a solvatao das respectivas molculas ou ons, em competio com a protena, que se torna insolvel na retirada da sua camada superfcial de gua estruturada. No entanto, boa parte desta precipitao reversvel pela adio de mais gua, ao contrrio das experincias anteriores.

TCNICA

Marcar 2 tubos de ensaio e colocar em cada um 1 ml de ovoalbumina. A seguir, adicionar a estes tubos:

Ao no 1 - juntar 3 ml de sol. saturada de sulfato de amnio

Ao no 2 - juntar 3 ml de lcool

Misturar bem e deixar em repouso antes de anotar os resultados. Depois de 5 min, adicionar a cada tubo, 5 ml de gua destilada e misturar outra vez. Na tabela abaixo, utilize um ou mais sinais + para indicar a quantidade de precipitado que apareceu antes e depois da adio de gua:

Tubo1O precipitado2O precipitado

(aps adio de gua)

1

2

Que concluiu sobre a reversibilidade das precipitaes nos tubos 1 e 2 ?

4. PRECIPITAO ISOELTRICA

O ponto isoeltrico de uma protena o valor de pH no qual a molcula apresenta

carga total nula.

As protenas apresentam uma solubilidade mnima nos seus pontos isoeltricos, ou seja, um mximo de precipitaco. Este efeito pode ser demonstrado mais rapidamente em condies que removem parcialmente a proteo fornecida pela camada superficial de gua, o que pode ser obtido pela adio de lcool.

TCNICA

Marcar 3 tubos de ensaio e colocar em cada um 2 ml dos seguintes tampes:

Ao no 1 - soluo tampo pH 6,0

Ao no 2 - soluo tampo pH 4,7

Ao no 3 - soluo tampo pH 3,0

A cada tubo adicionar 1 ml de ovoalbumina e 4 ml de lcool. Misturar bem por agitao eficiente. Observar e anotar os resultados em forma de tabela como segue, marcando com um sinal + o(s) teste(s) positivo(s) e com um sinal - os negativos:

TuboReao

1

2

3

Que concluiu sobre o ponto isoeltrico da ovoalbumina ? Quais aminocidos ionizados so mais abundantes nesta protena ?ENZIMAS / UREASE

UREASE (uria amidohidrolase E.C.3.5.1.5)

A urease uma enzima encontrada nas sementes das leguminosas, especialmente no feijo de porco (Canavalia ensiformis), mas tambm nas sementes da melancia (Citrullus vulgaris). Atua especificamente sobre a uria transformando-a em CO2 e amnia.

DETERMINAO DA ATIVIDADE

A atividade da enzima pode ser demonstrada fazendo-a reagir com uma soluo de uria a pH 7, muito fracamente tamponada. A soluo contm um indicador, vermelho de fenol (Vermelho Neutro), que muda de amarelo para rosa (pH 6,8 a 8,4). Estando a enzima ativa, ocorrer liberao de NH3 em quantidade suficiente para sobrepujar a ao do tampo tornando o meio da reao alcalino. Como conseqncia da subida do pH, a soluo, originalmente amarela, passa cor rsea.

urease

uria + indicador ( 2 NH3 + CO2 + indicador

(substrato) cor amarela

(produtos) cor rsea

RESUMINDO:Se a enzima estiver com atividade, ocorrer mudana de cor de

amarela para rsea. Por que ?

1. TESTE DE ATIVIDADE ENZIMTICA

Marcar 2 tubos e distribuir neles as substncias nas quantidades indicadas na tabela a seguir. Na ltima coluna, marque com um + ou um - a mudana de cor observada:

TubosUria tamponada com indicador Urease guaA

G Mudana de cor

I

13 ml3 gotas-T

23 ml-3 gotasA

R

2. ESPECIFIDADE

A urease altamente especfica para a uria. Isto pode ser demonstrado fazendo a enzima reagir com um composto com estrutura semelhante do substrato, a tiouria H2N-CS-NH2, e verificar se houve mudana de cor.

Marcar 2 tubos e distribuir neles as substncias nas quantidades indicadas na tabela a seguir. Na ltima coluna, marque com um + ou um - a mudana de cor observada:

TubosUria

tamponada com indicadorTiouria

tamponada com indicadorUreaseA

G Mudana de cor

I

12 ml-3 gotasT

2-2 ml3 gotasA

R

3. DESNATURAO PELO CALOR

Devido sua natureza protica, as enzimas so sensveis ao de temperaturas elevadas, que podem destruir a funo cataltica do seu centro ativo.

Colocar num tubo 3 ml de gua destilada e 3 gotas de urease. Agitar. Colocar em banho maria fervente por 3 minutos. Esfriar em gua corrente.

Em outro tubo pipetar 2 ml de uria tamponada e juntar 1 ml da urease fervida (tubo anterior). Agitar. Verificar se houve modificao de cor da soluo nos prximos 5 minutos. Explicar porque a urease foi diluda antes de esquentar e porque a elevao da temperatura desnatura as protenas.

4. INIBIO

Grupos sulfidrila (SH) prximos ao centro ativo da urease so essenciais para a manuteno da conformao ativa. Compostos como os sais de metais pesados (Hg, Pb, Ag) ao se combinarem com os grupos SH, causam modificaes permanentes na conformao da enzima, provocando diminuio e perda de sua atividade:

enzima - SH + Hg2+ ( enzima - S - Hg+ + H+

ativa

inativa

Marcar 2 tubos e distribuir neles as substncias nas quantidades indicadas na tabela a seguir. Na ltima coluna, marque com um + ou um - a mudana de cor observada, aps 5 minutos de observao:

TubosUreaseguaHgCl2Uria tamponada com indicadorA

GMudana de cor

I

13 gotas1 ml8 gotas3 mlT

23 gotas1 ml-3 mlA

R

CARBOIDRATOS

1. TESTE DE MOLISCH

Reao geral para carboidratos.

A ao desidratante de cidos concentrados sobre os monossacardeos leva formao de furfural e derivados. As aldopentoses formam o furfural e as hexoses produzem o hidroximetilfurfural. Os aldedos de furano podem se condensar com fenis e aminas dando compostos coloridos do tipo trifenilmetano. Este o fundamento da reao que considerada geral para carboidratos e conhecida como teste de Molisch. Reagem pentoses e hexoses no apenas como monossacardeos livres, mas tambm so positivos no teste todos os compostos que levam carboidratos ligados: polissacardeos, glicoprotenas, glicolipdeos e outros, que so hidrolisados pelo cido sulfrico concentrado. Exemplo:

5-Hidroximetilfurfural Derivado Trifenilmetano

TCNICA

Marcar 3 tubos e distribuir neles:

tubo 1 - 2 ml de sol. glicose 1 %

tubo 2 - 2 ml de sol. amido 1 %

tubo 3 - 2 ml de gua destilada (tubo controle)

Aos 3 tubos adicionar 5 gotas de sol. de alfa naftol. Misturar por leve agitao. Pipetar com muito cuidado cerca de 2 ml de cido sulfrico (extremamente corrosivo, no aspirar o cido, usar pipeta de 10 ml) e deixar o cido escoar lentamente pela parede do tubo sem agitar, a fim de se formar uma camada de cido por debaixo da soluo teste. Sem agitar, colocar o tubo na estante. A reao positiva quando aparece um anel violeta na interfase. O surgimento de colorao esverdeada na camada inferior devida a impurezas do naftol. Anotar os resultados em forma de tabela.

2. TESTE DE BIAL

Reao para identificao de pentoses.

O mecanismo da reao de Bial (ou reao do orcinol) semelhante ao da reao de Molisch, ou seja, com cido concentrado se forma o furfural. A diferena que neste caso o cido usado o cido clordrico e o fenol o orcinol. Consequentemente, o produto formado e sua cor sero diferentes.

TCNICA

Marcar 3 tubos e colocar em cada um, 1 ml do reativo de Bial (HCl com orcinol e FeCl3).

Ao tubo 1 adicionar 1 ml de soluo de pentose (arabinose)

Ao tubo 2 adicionar 1 ml de soluo de glicose

Ao tubo 3 adicionar 1 ml de gua destilada (tubo controle)

Levar os tubos ao banho-maria fervente por 30 segundos e anotar os resultados em forma de tabela. O teste positivo quando se forma uma colorao esverdeada.

3. TESTE DE SELIWANOFF

Distino entre aldoses e cetoses.

Nas condies do teste, as cetohexoses transformam-se nos derivados do furfural mais rapidamente que as aldohexoses. Em conseqncia, nas referidas condies e sendo curto o tempo de incubao, o resorcinol forma um produto colorido apenas com as cetohexoses. No entanto, prolongando-se o tempo de incubao, as aldoses reagem de maneira semelhante.

TCNICA

Marcar 4 tubos e colocar em cada um, 3 ml do reativo de Seliwanoff (HCl com resorcinol).

Ao tubo 1 adicionar 1 ml de soluo de frutose

Ao tubo 2 adicionar 1 ml de soluo de glicose

Ao tubo 3 adicionar 1 ml de soluo de sacarose

Ao tubo 4 adicionar 1 ml de gua destilada (tubo controle)

Colocar todos os tubos ao mesmo tempo no banho-maria fervente e cronometrar o aparecimento de colorao vermelha. Anotar os resultados na seguinte tabela:

1 min2 min4 min6 min

Frutose

Glicose

Sacarose

gua

Qual o melhor tempo para diferenciar entre a frutose e a glicose ? Quem dos dois monossacardeos a cetose ? Por que a sacarose reage?

4. TESTE DE BENEDICT

Reao para identificar carboidratos redutores.

Os monossacardeos e alguns dissacardeos possuem em suas estruturas grupos aldedo ou cetona, livres ou hidratados. Estes podero reduzir certos ons metlicos contidos em reagentes especiais. A maioria destes reagentes contm sais de cobre e so usados para pesquisa de acares redutores. Um destes reagentes o de BENEDICT que contm sulfato cprico, carbonato de sdio e citrato de sdio. Este ltimo composto produz um complexo azul com cobre divalente e isto evita a formao de hidrxido cprico insolvel no meio alcalino:

Cuprocitrato (Cu2+)

Sob ao de um agente redutor, o cobre divalente reduzido a cobre monovalente que no pode formar um complexo solvel com o citrato. Conseqentemente, o cobre precipita sob a forma de hidrxido cuproso, de cor amarela. Por aquecimento, o hidrxido cuproso passa a xido cuproso de cor vermelha:

redutorcalor

Cuprocitrato (Cu2+)(hidrxido cuproso (Cu+)(xido cuproso(Cu+)

solvel, azulinsolvel, amareloinsolvel, vermelho

TCNICA

Marcar 4 tubos e colocar em cada um, 3 ml do reativo de Benedict.

Ao tubo 1 adicionar 1 ml de soluo de glicose

Ao tubo 2 adicionar 1 ml de soluo de frutose

Ao tubo 3 adicionar 1 ml de soluo de sacarose

Ao tubo 4 adicionar 1 ml de gua destilada (tubo controle)

Colocar todos os tubos no banho-maria fervente por 3 min. Retirar os tubos e anotar os resultados em forma de tabela. O que concluiu ?

5. TESTE DE IODO

Identificao de polissacardeos.

Alguns polissacardeos reagem com iodo formando produtos coloridos. Com o amido, a cor azul, com o glicognio castanho-avermelhado. Os monossacardeos no reagem. No amido, a frao no ramificada (amilose) que responsvel pela formao do complexo da cor azul; a amilopectina reage de forma semelhante ao glicognio.TCNICA

Marcar 3 tubos e distribuir neles:

Tubo 1 - 2 ml de amido 1 %

Tubo 2 - 2 ml de glicose 1 %

Tubo 3 - 2 ml de gua destilada (tubo controle)

Aos 3 tubos adicionar duas gotas da soluo de Lugol. Este reativo uma soluo de poli-iodetos, produzidos por dissoluo de iodo metlico numa soluo de iodeto de potssio, e ele reage como se fosse iodo elementar. Anotar os resultados em forma de tabela.

REVERSO DA REAO DO IODO PELO CALOR

Colocar o tubo 1 do ensaio anterior no banho-maria fervente por alguns minutos at o desaparecimento da cor azul. Resfriar em gua corrente. O que observou ?

A cadeia da amilose (frao no ramificada do amido) tem a conformao de uma hlice que absorve o iodo no interior da espiral. Este complexo forma-se por interaes fracas que podem ser desfeitas pelo calor.

HIDRLISE DO AMIDO

O amido quando tratado por um cido a quente, sofre uma hidrlise sucessiva, dando vrias dextrinas e como produtos finais, maltose e glicose.

As dextrinas tm tamanhos diferentes, mas conservam, em princpio, a estrutura em hlice do amido. Em consequncia, as dextrinas absorvem o iodo e sua reao com o reativo de Lugol gera solues coloridas; as diferenas de colorao permitem classificar as diferentes dextrinas. (O reativo de Lugol uma soluo de poli-iodetos, produzidos por dissoluo de iodo metlico numa soluo de iodeto de potssio, e ele reage como se fosse iodo elementar). As cores observadas so as seguintes:

AMIDO

cor azul

AMILODEXTRINA

cor roxa

ERITRODEXTRINA

cor alaranjada

ACRIDEXTRINA

no d cor

A maltose e glicose possuem propriedades redutoras que podem ser reconhecidas pela reao de BENEDICT. O reativo de BENEDICT contm sulfato cprico, carbonato de sdio e citrato de sdio. O ltimo composto produz um complexo azul com cobre divalente, que evita a formao de hidrxido cprico insolvel no meio alcalino. A ao de um agente redutor (maltose e glicose) reduz o cobre divalente a cobre monovalente, o qual no pode formar um complexo solvel com citrato. Consequentemente, o cobre precipita sob forma de hidrxido cuproso, de cor amarela. Por aquecimento, o hidrxido cuproso passa a xido cuproso de cor vermelha:

redutorcalor

Cuprocitrato (Cu2+)(hidrxido cuproso (Cu+)(xido cuproso(Cu+)

solvel, azulinsolvel, amareloinsolvel, vermelho

TCNICA

Preparar um banho de gua fervente e numerar 7 tubos de ensaio.

Num Erlenmeyer, colocar 30 ml da soluo de amido a 15 % e 7 ml de HCl 2N.

Transferier 3 ml desta mistura para cada um dos tubos.

Ao tubo 1 adicionar 1 gota do reativo de Lugol e observar a cor azul que se desenvolve.

Colocar os tubos restantes no banho de gua fervente. Cada tubo ser retirado ao trmino dos perodos de tempo indicados no quadro abaixo e, depois de resfriado em gua corrente, receber uma gota de Lugol, com exceo do tubo 7.

Ao tubo 7 adicionar 3 ml do reativo de Benedict e retornar ao banho de gua fervente. O aparecimento de um precipitado vermelho ou alaranjado indica a presena de substncia redutora, no caso maltose ou glicose.

TUBOMINUTOS DE

REAOCOR

COM IODOPRODUTOS

IDENTIFICADOS

10

22

35

410

515

620

725Reao de Benedict

LIPDIOS

1. SAPONIFICAO

Colocar num tubo de ensaio grande (25 x 200 mm) cerca de 0,5 g de gordura animal e adicionar 10 ml de soluo alcolica de KOH 0,5 N (extremamente corrosiva, no aspirar com a boca, usar pipeta de 10 ml).

Adaptar ao tubo de ensaio um tubo condensador cheio de gua de torneira, que ir minimizar a evaporao do lcool. Colocar o conjunto (tubo grande + tubo condensador) em banho maria fervente e deixar l por 5 minutos. Retirar o tubo do banho e remover o tubo condensador. Desprezar qualquer sobra eventual de material slido e continuar apenas com o lquido contido no tubo grande.

Adicionar 10 ml de gua destilada mistura de saponificao. Agitar. Observar a formao de espumas. Guardar o contedo do tubo para as experincias seguintes.

2. PREPARAO DE CIDOS GRAXOS LIVRES

Adicionar mistura de saponificao, j diluda com gua destilada, 1 ml de cido clordrico concentrado, gota a gota, agitando o tubo posteriormente com cuidado (o cido corrosivo, portanto no aspirar com a boca, usar pipeta de 10 ml). Colocar novamente o tubo no banho maria at obter uma boa separao de camada oleosa, acima da camada aquosa (os cidos graxos livres so pouco solveis na gua e menos densos que ela).

Deixar o tubo esfriar num recipiente com gua gelada. A camada superior solidificar, pois os cidos graxos de gordura animal so em grande parte saturados, tendo alto ponto de fuso, ao contrrio dos cidos graxos insaturados que predominam na gordura vegetal.

Decantar o lquido do tubo e guardar apenas a parte slida para as experincias seguintes.

3. SOLUBILIDADE DOS CIDOS GRAXOS LIVRES

Retirar com auxlio de um basto de vidro, uma pequena quantidade dos cidos graxos isolados e colocar num tubo de ensaio limpo e seco. Adicionar 2 ml de ter. Agitar. O que observou?

4. FORMAO DE SABES SOLVEIS POR REDISSOLUO DOS CIDOS GRAXOS LIVRES.

Adicionar ao tubo da experincia 2, que contm a maior parte dos cidos graxos isolados, 10 ml de gua destilada e 5 ml de soluo alcolica de KOH 0,5 N (extremamente corrosiva, no aspirar com a boca, usar pipeta de 10 ml). Levar ao banho maria por 3 minutos. Agitar. Observar a formao de espumas. Conservar o contedo do tubo para a experincia seguinte.

5. FORMAO DE SABES INSOLVEIS

Tomar 2 tubos de ensaio e pipetar em cada um 2 ml da soluo de sabes solveis obtida na experincia anterior. Ao primeiro adicionar 10 gotas de soluo de cloreto de clcio 5% e ao segundo 10 gotas de soluo de acetato de chumbo 10 %. Observar a formao de precipitados (sabes insolveis de clcio e chumbo, alm dos respectivos hidrxidos).

6. REAO DO COLESTEROL COM O REATIVO DE LIEBERMAN-BURCHARD

Colocar 1 ml de uma soluo diluda de colesterol em um tubo de ensaio limpo e seco. Adicionar 10 gotas de anidrido actico e 3 gotas de cido sulfrico concentrado (os dois reativos so extremamente corrosivos, no aspirar com a boca, usar pipeta de 10 ml). Observar aps alguns minutos o aparecimento de uma colorao esverdeada. Esta reao, de mecanismo oxidativo, identifica os esterides que possuem dupla ligao entre os carbonos 5 e 6 (anis A e B), como o colesterol.

COLESTEROL

CTION CARBNICO

PENTAENLICO

IDENTIFICAO DE CIDOS NUCLICOS

Os cidos nuclicos presentes num tecido (especialmente o DNA) podem estar firmemente ligados a ctions ou a protenas catinicas, tais como histonas e protaminas. Assim, estas protenas estaro presentes juntamente com os cidos nucleicos, quando estes ltimos forem precipitados a partir de um homogenato de fgado de rato. Os polinucleotdeos podem ser precipitados pela ao de solues salinas, ou por lcool em presena de sais. Nesta prtica, usamos um mtodo mais antigo que utiliza o cido tricloroactico para precipitar complexos nucleoproticos. O precipitado nucleoprotico posteriormente dissociado a quente, libertando-se os cidos nuclicos sob forma de oligonucleotdeos solveis, enquanto que as protenas permanecem insolveis. Em seguida, no extrato solvel dos oligonucelotdeos ser testada a presena dos acares caractersticos do RNA e DNA.

A reao do orcinol (reativo de Bial) permite identificar o RNA, atravs da ribose presente. Determinaes quantitativas foram procedidas usando esta reao (conforme Schneider & Hoogebom e Dische & Schwartz, 1937).

+ HCl+ orcinol

Ribose(Furfural(Derivado Trifenilmetano

No passado, a reao da difenilamina com desoxirribose foi muito utilizada para identificar e determinar quantitativamente o DNA (reao descrita por Dische em 1930, e mais usada na sua verso modificada por Burton em 1956). O DNA em meio cido hidrolizado libertando desoxirribose, e esta, atravs do seu grupamento CHO livre, reage com a difenilamina com formao de composto de cor azul, com absoro a 600 nm.

TCNICA

1. Obteno de homogenato de fgado de rato.

2. Extrao de cidos nucleicos do homogenato.

3. Identificao de DNA no extrato cido pela reao da difenilamina.

4. Identificao de RNA no extrato cido pela reao do orcinol.

PROCEDIMENTO

1. Obteno de extrato cido de cidos nuclicos.

1.1. Homogenizar o fgado de um rato em nove volumes de sol. cido ctrico 2%. Pipetar 2 ml do homogenato num tubo de centrfuga e adicionar 1 ml de sol. cido tricloroactico 20 %. Agitar. Deixar em repouso por 10 minutos.

1.2. Centrifugar a 2000 rpm por 10 minutos. Desprezar o sobrenadante.

1.3. Ao sedimento (cidos nucleicos e protenas), juntar 5 ml de sol. cido tricloroactico 5%. Misturar cuidadosamente com basto de vidro e decantar a suspenso para um tubo de ensaio (o tubo de centrfuga no pode ser esquentado).

1.4. Levar ao banho maria fervente por 20 minutos. Esfriar e transferir novamente a supenso para o tubo de centrfuga.

1.5. Centrifugar a 2000 rpm por 10 minutos. Decantar o sobrenadante para um tubo de ensaio limpo (o sobrenadante conter quase todo RNA e DNA existente nos 2 ml de homogenato usados inicialmente).

2. Identificao dos cidos nucleicos no extrato cido.

2.1. Identificao do DNA. Pipetar num tubo de ensaio 2 ml do sobrenadante da etapa 1.5 e em outro tubo, 2 ml de gua destilada (Branco). Adicionar aos dois tubos 2 ml do reativo da difenilamina (corrosivo, no aspirar com a boca, usar pipeta de 10 ml). Agitar. Aquecer os dois tubos a 100o C por 10 minutos. O que observou?

2.2. Identificao do RNA. Pipetar num tubo de ensaio 0,2 ml do sobrenadante da etapa 1.5 e em outro tubo, 0,2 ml de gua destilada (Branco). Adicionar aos dois tubos 0,8 ml de gua destilada e 2 ml do reativo de orcinol (corrosivo, no aspirar com a boca, usar pipeta de 10 ml). Agitar. Levar ao banho maria fervente por 10 minutos. O que observou?

4INTRODUO AO LABORATRIO E SOLUES