DISCIPLINA DE BIOQUMICA FARMCIA Mdulo 1: Reao cido-base; pH e sistema tampo. 1.) Defina cidos e bases no conceito de Bronsted, mostrando exemplos. 2.) Qual o pH de solues 0,1M dos cidos fortes: -HCl; -HNO3. 3.) Qual o grau de dissociao dos cidos fracos H2S (Ka=1x10-7) e cido actico (Ka=2x10-5) em solues 0,1M. Qual o respectivo pH dessas solues. 4.) Conceitue pK, utilizando-se da equao de Henderson-Hasselbalch. 5.) Esquematize a curva de titulao de H3PO4 com base forte, colocando pH em funo de volume de base adicional, indicando os pKs. 6.) Indique como se pode preparar 1L de um tampo a pH=7,0, capaz de manter o pH estvel com adio de 10mL de HCL 0,1M, dispondo-se das solues: a)1M H3PO4 b) 1M cido actico c) 1M NaOH Mdulo 2 Aminocidos 1.) Quais dos aminocidos tm dois carbonos quirais e qual deles no possui isomeria ptica? 2.) Mostre por que a forma associada de um aminocido, R-H2C(NH2)-COOH, no pode ser encontrada em soluo aquosa. 3.) O etanol no tem carter cido em gua, enquanto fenol e cido actico se dissociam em soluo aquosa, sendo o cido actico (pK=4,8) mais forte que o fenol (pK=10). Como se pode explicar o comportamento destes compostos em gua a partir de suas estruturas moleculares? 4.) Esquematize a curva de titulao da glicina a partir de pH=1 e do cido asprtico a partir de pH=11. Coloque o pH na ordenada e, na abscissa, a quantidade de equivalentes de cido ou base forte. 5.) Quais os pontos isoeltricos de glicina (pKs=2,5 e 9,5), cido asprtico (pKs=2,5; 4,0 e 9,5), lisina (pKs=2,5; 9,5 e 10) e histidina (pKs=2,5; 6,0 e 9,5)?

Mdulo 3 Estrutura primria de protenas. 1.) Defina estrutura primria, secundria, terciria e quaternria de uma protena, dando exemplos. 2.) Esquematize a estrutura tridimensional de uma ligao peptdica.

3.) Com os dados abaixo, defina a seqncia do peptdeo analisado: a)hidrlise cida total resultou em: Arg, Tyr, Leu,Ala, Glu Lys, Ser e Pro; b) dansilao e hidrlise produziu: dansil-Leu; c) dois ciclos consecutivos de degradao de Edman liberaram, respectivamente Leu e Tyr; d) tripsina liberou 2 peptdeos cujas composies, aps hidrlise cida total, foram, respectivamente, Tyr, Leu e Arg e Ser, Glu, Pro, Ala e Lys; e) carboxipeptidase A no liberou nada, mas carboxipeptidase C liberou Ser; f) endopeptidase V8 liberou o tripeptdeo Lys-Pro-Ser e o pentapeptdeo que, tratado com carboxipeptidase C, liberou Ala. 4.) Mostre a reao de xido-reduo da cistena que importante na estrutura de peptdeos. 5.) Mostre as frmulas de tripeptdeos que a pH=7,0 possuem: a. carga neutra; b. carga positiva; c. carga negativa. Mdulo 4 Cintica e termodinmica. 1.) Defina reaes exotrmicas e endotrmicas. Qual a relao entre estes conceitos e a funo termodinmica entalpia? 2.) Defina reaes exergnicas e endergnicas. Qual a relao destes conceitos com G0 . 3.) G0 caracterstico de cada reao (desde que a temperatura seja constante) e no varia com as concentraes de reagentes e produtos no equilbrio. G, por outro lado, no caracterstico da reao, podendo assumir qualquer valor em funo das concentraes iniciais de reagentes e produtos (quociente Q na expresso de G). Mostre por que estas afirmaes so verdadeiras discutindo a expresso que relaciona G0 e G. 4.) Na reao genrica AB Keq=103. Qual o valor de G0? No ponto de equilbrio as concentraes molares de A e B podem variar? Como varia G com as concentraes molares iniciais de A e B?

5.) Ainda para a reao AB (questo 4) proponha uma condio na qual a reao inversa seja espontnea. Mostre que a sua proposta possvel calculando o respectivo G. Esta questo possui mltiplas respostas ou apenas uma resposta nica. 6.) Para a reao AB (questo 4), se a constante de velocidade de primeira ordem, k1 for igual a 10, qual deve ser o valor da constante k-1 para a reao inversa? Para um mesmo K, constante de equilbrio, pode haver mltiplos valores de k1 e k-1? Qual a interpretao termodinmica para a sua resposta? Mdulo 5 Estrutura 3D de protenas. 1.) Distinga estrutura secundria e terciria de uma protena. D exemplos. 2.) Descreva -hlice e folha pregueada. Aponte as diferenas essenciais entre estas formas de estrutura secundria, encontradas em peptdeos. 3.) Mostre porque uria desorganiza a -hlice. 4.) O que efeito hidrofbico e qual o seu papel na manuteno da estrutura terciria das protenas? Qual o fator preponderante no efeito hidrofbico: o entlpico ou o entrpico? Explique qualitativamente sua resposta. 5.) Descreva a experincia clssica de Anfinsen com a enzima ribonuclease A, indicando sua concluso principal. Qual o papel das pontes de dissulfeto na manuteno da estrutura nativa (terciria) da ribonuclease. Conceitue estrutura nativa e desnaturao de protenas, mostrando o que. Isso tem a ver com a atividade enzimtica da ribonuclase A. Que funo termodinmica promove espontaneamente a transio da ribonuclease de desnaturada para nativa? 6.) Duas protenas, apesar de terem diferenas quanto a alguns de seus aminocidos, so capazes de desempenhar a mesma funo. Explique como isto possvel. Mdulo 6 Cintica enzimtica. 1.) As velocidades de uma reao enzimtica foram determinadas para diversas concentraes de substrato, conforme a tabela abaixo: [S] ( M) V ( mol/L.min) 5 22 10 39 20 65 50 102 100 120

200 135 Os grficos de, respectivamente, V em funo de [S] e 1/V em funo de 1/ [S] podem servir para determinar KM e Vmax? Como? 2.) Numa reao enzimtica, o valor de Vmax, mas no o de K M diretamente proporcional concentrao da enzima? Justifique. 3.) A velocidade inicial de uma reao enzimtica em funo da concentrao do substrato S, na ausncia e na presena dos inibidores A (IA) e B (IB) segue os dados da tabela abaixo: [S] Velocidade ( mol/L x min) ( M Sem I Com IA Com IB ) 1,25 1,72 0,98 1,01 1,67 2,04 1,17 1,26 2,5 2,63 1,47 1,72 5,0 3,33 1,96 2,56 10,0 4,17 2,38 3,49 a. Qual a classe dos inibidores A e B? b. Determine Vmax e KM na ausncia e presena dos inibidores. 4.) Utilizando-se dos valores de KM e Vmax determinados nas questes 1 e 3, esquematize num mesmo grfico, para as duas reaes, V em funo da concentrao de substrato, expressa em mltiplos de KM. No eixo dos Y ajuste arbitrariamente as escalas para cada reao fazendo coincidir os pontos de V = Vmax. Como so as curvas para duas reaes? Justifique o resultado. 5.) O que so enzimas alostricas? Defina utilizando-se de grficos esquemticos de V em funo de [S], compare uma enzima michaeliana (da questo 4) com uma enzima alostrica positiva e com uma enzima alosterica negativa. Mdulo 7 Mecanismos de catlise enzimtica. 1.) Considerando a equao G0 = -2,3 RT log K, sendo: R = 1,98 x 10 -3 kcal/molK; T = 298K e 2.3 RT = 1,36 kcal/mol. Calcule os valores de G0 quando K varia de 105 a 10-5. Faa uma tabela. 2.) Porque a hidrlise de ATP necessita catlise enzimtica, sendo este um composto rico em energia? Utilize-se do grfico esquemtico de variao de G (energia livre) em funo de coordenada de reao para responder a esta questo, definindo estado de transio e energia de ativao.

3.) Examine a reao de hidrlise de RNA catalisada pela RNase A para verificar que se trata de um mecanismo de catlise cido-base. 4.) Faa o grfico da velocidade de uma reao enzimtica em funo do pH para uma enzima estvel entre pHs 3 e 12, considerando que o substrato no possui grupos ionizveis e a atividade enzimtica exige no centro ativo uma carboxila (pKa = 5) desprotonada e um grupo amino (pKa = 9) protonado. 5.) O que caracteriza o mecanismo covalente de catlise. Procure um exemplo de enzima que utiliza este mecanismo de catlise. Mdulo 8 Aucares: estrutura e funo. 1.) Desenhe o conjunto dos ismeros de D-aldoses de 6 C, atravs das frmulas de projeo de Fisher. Quantos epmeros possui uma hexoaldose. Identifique todos os epmeros de D-glicose. Existem pares enantiomricos na famlia D de monossacardeos. Explique. 2.) Descreva o fenmeno da mutarrotao de D-glicose, incluindo as reaes qumicas pertinentes com as respectivas frmulas estruturais dos reagentes. O que este fenmeno tem a ver com os conceitos de C anomrico e anmeros. 3.) Compare os dissacardeos maltose e sacarose, identificando a ligao glicosdica em cada caso. Por que maltose redutora e sacarose no . 4.) Analise a estrutura do glicognio. Procure destacar as vantagens e desvantagens da funo deste polmero como composto de reserva energtica. 5.) Verifique as principais caractersticas dos polissacardeos estruturais, comparando celulose, quitina e glicosaminoglicanos (estes tambm chamados mucopolissacardeos). Mdulo 9 Gliclise 1.) Classifique as reaes da gliclise, destacando as que so de xidoreduo. 2.) Equacione a reao de oxidao de gliceraldedo-3-fosfato, destacando o oxidante e o redutor. 3.) Na reao do item 2.) parte da energia utilizada para produzir ATP. Mostre como isso possvel, equacionando as etapas relevantes da reao. Defina fosforilao ao nvel do substrato.

4.) Equacione a reao lquida da transformao de glicose em piruvato. Como regenerada a capacidade oxidante do sistema NAD+/NADH necessria atividade glicoltica nos glbulos vermelhos humanos (que no tm mitocndria) e na cultura de levedo sem O2 (fermentao). 5.) Examine uma tabela com as 10 reaes da via glicoltica que contenha, respectivamente, o G0 e o G das reaes. Quais so as reaes irreversveis da gliclise? 6.) Porque os valores de G0 e de G da mesma reao podem ser diferentes? Para decidir se a via glicoltica numa determinada clula reversvel ou irreversvel, que valor mais relevante, G0 ou G? Mdulo 10 Gliconeognese 1.) Explique como a hemcia mantm glicose a 5 mM e G6P a 0,0083 mM, se a converso de glicose em G6P muito exergnica. Como seriam afetadas as concentraes relativas dos intermedirios da gliclise se a glucoquinase (Km = 5mM) fosse colocada artificialmente na hemcia em lugar da hexoquinase (Km = 0,1mM)? 2.) Na gliconeognese, como so revertidas as reaes de glicose G6P e F6P F-1,6-BP, que so altamente exergnicas. 3.) Conceitue ciclo ftil. 4.) A reverso da reao de PEP + ADP piruvato + ATP no pode ocorrer por um processo relativamente fcil como a reverso de glicose + ATP G6P + ADP. Qual a soluo bioqumica que os sistemas biolgicos utilizam para ir de piruvato a PEP? 5.) Qual o consumo de energia na sntese de glicose a partir de piruvato, medido em equivalentes de ATP. Indique as reaes onde h consumo. Compare o rendimento da via glicoltica com o consumo da gliconeognese, so iguais ou diferentes? Mdulo 11 Lpides, Membrana & Transporte 1.) A reao de ninhidrina permite identificar especificamente aminas primrias em cromatografia de camada delgada como manchas prpuroazuladas. Que fosfolpides de hepatcito de rato voc espera identificar por esse processo? 2.) O que concentrao micelar crtica. Como varia tamanho e forma de micelas formadas por anfiflicos de uma nica cauda hidrocarbonada? Explique.

3.) Explique porque soda funciona bem para desentupir pias entupidas com gordura animal. 4.) Descreva os mecanismos pelos quais detergentes extraem protenas integrais de membrana, mantendo-as em soluo. 5.) Para saber se uma bactria tomava leucina e etileno glicol por transporte mediado ou no mediado, foram feitas medidas de velocidade inicial de tomada em funo da concentrao de ambas substncias, resultando na tabela fornecida abaixo. O que voc conclui do exame dessa tabela? Explique e calcule Kt e Vmax se encontrar evidncias de transporte mediado. Componente Leucina Concentrao Velocidade [M] Inicial (unidades arbitrarias) -6 1 x 10 110 2 x 10-6 220 -6 5 x 10 480 -5 1 x 10 830 3 x 10-5 1700 -4 1 x 10 2600 5 x 10-4 3100 -3 1 x 10 3200 1 x 10-3 1 -3 5 x 10 5 0,01 10 0,05 50 0,1 100 0,5 500 1,0 1000

Etileno glicol

6.) Clulas epiteliais de intestino de camundongo isoladas em cultura transportam L-leucina e D-leucina mostrando Kt (mM) e Vmax, respectivamente iguais a: 0,24 e 420 para L-leucina e 4,7 e 310 para Dleucina, ambos em presena de Na+ no meio de cultura. Mas na ausncia de Na+ , L-leucina mostra 0,24 e 23 enquanto D-leucina mostra 4,7 e 5 para Kt (mM) e Vmax, respectivamente. Classifique esse transportador de leucina quanto ao tipo e mecanismos de ao. Que efeitos voc esperaria se nesse meio de cultura fosse colocada valinomicina (ionforo de Na+)? E se fosse dissolvida ouabana (inibidor da ATPase Na+/K+) no meio de cultura? Explique. Mdulo 12 Ciclo de Krebs 1.) Escreva a equao geral, estequiometricamente equilibrada, que identifica apenas reagentes e produtos da reao de transformao de piruvato em

acetil-CoA. Equacione todas as etapas que compe esta reao identificando a natureza da reao, as enzimas envolvidas e seus respectivos cofatores e coenzimas. 2.) Como a equao qumica, estequiometricamente equilibrada, que representa a oxidao de acetil-CoA no ciclo de Krebs? Como se pode medir o rendimento do ciclo de Krebs em termos de coenzimas reduzidos (poder redutor) e ATP (ligaes de fosfato de alta energia). 3.) Identifique os tipos de reaes que ocorrem no ciclo de Krebs, mostrando as respectivas equaes qumicas. 4.) Equacione a descarboxilao oxidativa de -cetoglutarato a succinato, respeitando a estequiometria da reao. Mostre as etapas que compe esta reao com respectivos enzimas e coenzimas. 5.) Quais so as enzimas do ciclo de Krebs sujeitas a regulao? Explique como cada uma delas regulada. 6.) Explique porque piruvato estequiometricamente convertido a CO2 na respirao de fatias de msculo mantidas em soluo fisiolgica, enquanto oxalacetato e citrato tem efeito cataltico neste mesmo processo. Mostre porque a respirao pode ser sustentada pelo consumo estequiomtrico de citrato, mas no de acetato, quando o ciclo de Krebs inibido por malonato. Mdulo 13 Cadeia respiratria e fosforilao oxidativa 1 1.) Entre os transportadores universais de eltrons da cadeia respiratria esto NAD+ e os nucleotdeos de flavina (FAD e FMN), quais so as diferenas entre estes transportadores de eltrons quanto a potencial redox e forma de interao com as enzimas com as quais atuam? 2.) Que caractersticas qumicas fazem de ubiquinona um transportador de eltrons de propriedades e funes singulares na cadeia respiratria? 3.) Porque F1 e Fo so ambos necessrios para a sntese de ATP? 4.) Classifique os seguintes inibidores quanto a seus mecanismos de ao na cadeia respiratria: a) rotenona; b) antimicina A; c) oligomicina e d) DNP (2,4-dinitrofenol). Mdulo 14 Cadeia respiratria e fosforilao oxidativa 2. 1.) Descreva o mecanismo de ao do DNP (2,4-dinitrofenol), mostrando porque o mecanismo de ao deste inibidor uma demonstrao experimental importante da hiptese quimiosmtica da fosforilao oxidativa.

2.) Em mitocndrias isoladas, rotenona e cianeto bloqueiam o consumo de oxignio quando a cadeia alimentada com NADH, mas apenas cianeto bloqueia consumo de oxignio quando os eltrons vem de succinato. Mostre como esses resultados podem ser explicados. 3.) Em mitocndrias isoladas, o transporte de eltrons no ocorre na ausncia de ADP e Pi, mesmo que haja abundncia de succinato para fornecer eltrons. Como se explica que mitocndrias nessas condies passam a transportar eltrons e consumir oxignio se forem tratadas com DNP? 4.) Ambos, oligomicina e cianeto, bloqueiam fosforilao e transporte de eltrons, na cadeia respiratria alimentada por succinato. DNP permite distinguir estes dois inibidores. Como? Mdulo 15 - cidos Graxos: sntese e degradao 1.) Demonstre como os cidos graxos so ativados antes de serem degradados. Em que compartimento celular isso ocorre? 2.) Sabe-se que os cidos graxos so estocados no citoplasma e degradados na matriz mitocondrial. Explique como acil-CoA transportada para a matriz mitocondrial para que sejam oxidadas. 3.) Explique os passos da -oxidao dos cidos graxos, partindo de uma molcula de acil-CoA. Quais so os produtos gerados nessas reaes? 4.) Na -oxidao, a cadeia de cidos graxos degradada aos pares de carbono. Na sntese de cidos graxos, a cadeia cresce tambm aos pares de carbono. No entanto, o precursor na elongao da cadeia, durante a sntese, malonil-CoA e no acetil-CoA. Explique porque. 5.) Equacione as etapas que compe o conjunto de reaes que permitem adicionar acetil-CoA cadeia de cido graxo crescente durante a sntese de palmitato. Mostre que etapa torna o processo favorecido termodinamicamente. 6.) Compare a -oxidao e a biossntese de palmitato, mostrando diferenas e semelhanas em: a. carregadores de grupos acila; b. reaes de xido-reduo; c. coenzimas de xido-reduo; d. gasto ou produo de energia em termos de equivalentes de ATP e de coenzimas redutoras. Mdulo 16 - Ciclo das Pentoses

1.) Mostre a parte oxidativa do ciclo das pentoses com as equaes das reaes envolvidas, indicando os agentes oxidantes e a origem do carbono presente no CO2 liberado. 2.) Compare NADH e NADPH, indicando suas funes no metabolismo de carboidratos. Explique porque a via da pentose-fosfato muito mais ativa no tecido adiposo que no msculo. 3.) Quando h necessidade de NADPH, o ciclo das pentoses pode funcionar dando um resultado lquido que eqivale oxidao total de glicose a CO2. Explique este processo atravs das respectivas reaes estequiometricamente equilibradas. 4.) Compare as reaes catalisadas por transaldolases e transcetolases, indicando reagentes, produtos e a natureza das reaes. 5.) Ribose 5-fosfato pode ser obtida para a sntese de nucleotdeos atravs da via das pentoses, com ou sem oxidao da glicose. Mostre como isso possvel com as respectivas equaes qumicas. 6.) Explique como a via da pentosefosfato controlada, tendo em vista que grande parte das reaes dessa via reversvel. 7.) Explique as reaes que ocorrem na via da pentose-fosfato na seguinte situao: NADPH requerido mais do que ribose-5-fosfato e, ao contrrio da questo 3, glicose-6-fosfato convertida a piruvato. Mdulo 17 Fotossntese 1 1.) Porque as folhas das plantas so verdes? Explique em termos de composio e espectro de absoro dos pigmentos foliares. 2.) H muito tempo, foi observado que a eficincia da fotossntese, medida em termos de O2 produzido por energia luminosa absorvida, cai drasticamente quando uma fonte de luz monocromtica alcana o comprimento de onda de 700 nm (queda no vermelho). Alm disso, observou-se tambm que a aplicao concomitante de um feixe de luz de baixa intensidade e comprimento de onda de 650 nm complementava a luz vermelha de 700 nm, recuperando a eficincia fotossinttica de liberar O2. Que importncia teve no passado a descoberta deste fenmeno e qual a explicao atual para sua existncia? 3.) O que fotofosforilao cclica e no que difere da fotofosforilao no cclica? Quando o [NADPH / NADP+] alto, a produo de O2 durante fotofosforilao suprimida. Explique o fenmeno considerando os papis dos dois fotossistemas.

4.) Porque a descoberta da reao de Hill, em 1939, deu apoio hiptese anterior de Van Niel, propondo que o O2 da fotossntese vem da gua? Mdulo 18 Fotossntese 2. 1.) Compare a fase clara da fotossntese com o processo de respirao na mitocndria, indicando diferenas e semelhanas. 2.) Sabe-se que a produo de O2 na fotossntese requer o funcionamento de dois fotossistemas. Explique resumidamente como ocorre a interao entre os dois fotossistemas, incluindo doador e receptor de eltrons no processo. 3.) Explique como algumas bactrias anaerbicas podem realizar a fotossntese. 4.) Explique como organismos fotossintetizantes sintetizam carboidratos a partir de CO2 e H2O. 5.) Explique a regulao do ciclo de Calvin, mencionado as enzimas-chave sujeitas a regulao e como as reaes da fase controlam o processo da fixao de CO2. Mdulo 19 Metabolismo do glicognio 1.) A ativao de glicose-1-fosfato (G1-P), requer a clivagem de uma ligao de alta energia, liberando PPi. Considere os passos de ativao de G1-P e a reao de regenerao de UTP e analise o gasto de energia necessrio para a sntese de glicognio. Compare o gasto de energia para a adio de um resduo de glicose ao glicognio, com a obteno de energia a partir da liberao de glicose na degradao do glicognio. 2.) Qual a finalidade das reservas de glicognio do fgado e msculo? Qual a principal diferena bioqumica entre esses tecidos? 3.) Equacione as etapas de mobilizao da glicose a partir do glicognio no fgado e no msculo. Mostre: a.) no fgado (desde a fosforlise at a liberao de glicose no plasma); b.) no msculo (desde a fosforlise at o aproveitamento na gliclise). 4.) Qual a funo da hidrlise de PPi no controle da sntese de glicognio? 5.) Esquematize a estrutura do glicognio incluindo as ligaes na cadeia principal e nos pontos de ramificao. Explique as vantagens desta estrutura para um polissacardeo de reserva em animais, comparando com outro de cadeia linear como a amilose.

6.) A -amilase tambm catalisa a degradao de glicognio. Compare a amilase com a glicognio fosforilase quanto ao tipo de reao que catalisa e seus produtos formados. 7.) Esquematize as etapas de degradao total do glicognio, indicando as enzimas envolvidas, reagentes e produtos da reao. 8.) Mostre como so coordenadas sntese e degradao do glicognio. Restrinja-se ativao e inativao da fosforilase e da sintase, explicando a natureza do processo e as enzimas envolvidas. (No considere o controle hormonal) Mdulo 20 Controle Hormonal do Metabolismo. 1.) Os hormnios podem ser de natureza qumica muito diferente, por exemplo, adrenalina, uma catecolamina, e glucagon, um peptdeo. Apesar disso, desencadeiam o mesmo processo metablico no fgado, isto , mobilizao de glicose da reserva de glicognio. Se um hormnio um sinal qumico, como possvel que substncias quimicamente to diferentes transmitam a mesma sinalizao metablica para o hepatcito? 2.) O sinal hormonal, por exemplo, da adrenalina no hepatcito, rapidamente decodificado e amplificado numa cascata que alterna ativaes alostricas e reaes enzimticas. Mostre quais so os fundamentos desse processo que garantem essa rapidez e amplificao. 3.) A induo enzimtica uma importante forma de adaptao do hepatcito s necessidades metablicas do organismo, mas no serve para respostas ultra-rpidas como a mobilizao de glicose da reserva de glicognio. Explique porque. 4.) As vias metablicas clssicas como, por exemplo, a gliclise e a via de biossntese de cidos graxos, cuidam da grande massa do trabalho metablico, como, respectivamente, produo e armazenamento de energia. H no entanto, vias ou circuitos, quantitativamente insignificantes, mas fundamentais, para o controle das vias metablicas massivas. Os circuitos, ou vias regulatrias, acionados pelos hormnios pertencem a este grupo. Que circuito regulatrio permite adrenalina promover a gliclise no msculo e a gliconeognese no fgado? 5.) O nvel de glicose no sangue aps um perodo de jejum de aproximadamente 0,8 mg/ml (4 mM). Depois da ingesto de alimentos, o nvel de glicose passa a ser de aproximadamente 1,2 mg/ml (6 mM). Explique porque os nveis de glicose variam to pouco em situaes alimentares to diferentes. Como esses nveis so controlados? 6.) Glucocorticides so hormnios esterides que possuem receptores em praticamente todo tipo de clula, desencadeiam uma resposta lenta e

participam da regulao do metabolismo de acares. Verifique quais so as etapas do mecanismo de ao desses hormnios. Mdulo 21 Metabolismo de Aminocidos. 1.) Como a reao de transaminao e qual a sua importncia para o metabolismo de aminocidos? 2.) A amnia pode ser txica para a mitocndria heptica? Como se explica bioquimicamente esta toxidez? Que reaes e respectivas enzimas protegem a mitocndria da toxidez de amnia? 3.) Uma das duas principais reaes de entrada de NH3 no metabolismo a reao catalisada pela glutamina sintetase. Mostre a equao dessa reao. Qual a importncia da glutamina para o metabolismo? D exemplos. 4.) O que so aminocidos glicognicos e cetognicos? D exemplos e explique mostrando as reaes relevantes do metabolismo. 5.) Humanos sintetizam parte dos aminocidos que precisam, o restante obtido da dieta e por isso, chamados essenciais. Mostre, com as reaes pertinentes, porque e como alguns aminocidos so sintetizados por humanos e qual a limitao que impede a sntese dos essenciais. Mdulo 22 Ciclo do nitrognio 1.) CO2 e N2 existem na atmosfera e so fontes dos elementos C e N para os seres vivos. CO2 eficientemente fixado pelas plantas em geral atravs da fotossntese. N2 por outro lado, apesar de extremamente abundante, 70 a 80% do ar, no fixado pela grande maioria das plantas, que necessitam espcies reduzidas ou oxidadas de N2 para a sntese de compostos nitrogenados. Somente algumas poucas formas de bactrias tm a capacidade de fixao de N2. Compare o processo de fixao de CO2 com o de fixao de N2, e procure mostrar porque as plantas fixam muito bem CO2, mas no N2. 2.) Equacione a reao da nitrogenase e mostre aonde ocorre. 3.) Certas bactrias oxidam NH3 a nitritos e nitratos, enquanto plantas e bactrias em geral reduzem nitritos e nitratos a NH3. Qual a funo desses processos bioqumicos na vida desses organismos? 4.) Animais em geral no possuem reservas na forma de protenas, ou qualquer outra macromolcula nitrogenada. Quais as conseqncias desse fato para o balano de nitrognio nesses organismos em condies de alimentao abundante e de jejum acentuado?

Laboratrio 1: FOTOMETRIA E ESPECTROFOTMETROI. FUNDAMENTOS A Colorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um procedimento analtico atravs do qual se determina a concentrao de espcies qumicas mediante a absoro de energia radiante (luz). Fotometria uma tcnica de anlise quantitativa que envolve a medida de intensidade de absoro de luz monocromtica de um composto qumico em soluo. Serve para identificar o comprimento de onda caracterstico para cada composto e para quantificao do composto atravs de: - Absoro direta - Atravs de mtodo colorimtrico Essa intensidade de absoro depende do comprimento de onda escolhido ( Mx - onde o composto absorve mais luz), do percurso que o feixe de luz percorrer na soluo e da concentrao do composto nessa soluo. A lei de Lambert-Beer estabelece que a absorbncia diretamente proporcional concentrao da espcie absorvente. A frao de luz que passa por uma amostra (a transmitncia) est relacionada logaritmicamente, e no linearmente, com a concentrao da amostra (Figura 1).

bIo

It

Fig.1 A lei de Lambert-Beer relaciona esses trs fatores e estabelece que: onde : A = .b.c (1)

A Absorbncia definida pela reao seguinte: (intensidade de luz incidente; Io, transmitida, It): A = - log It/I0, que por ser uma razo, no possui unidade. Absortividade molar (caracterstico de cada substncia), em unidades de L.(mol.cm)-1 b Caminho ptico (percurso da luz monocromtica na soluo), em cm c Concentrao da substncia em mol/L. Desta forma, mantendo-se o caminho ptico constante, a absorbncia tornase diretamente proporcional concentrao da substncia no respectivo Mx. Nestas condies, podemos utilizar uma soluo de concentrao conhecida do composto a ser analisado (ou outra substncia de caractersticas qumicas semelhantes) para construir um diagrama de absorbncia em funo da concentrao da substncia em questo. Com este diagrama, denominado curva padro, podemos medir a quantidade do composto em amostras de concentrao desconhecida, pela simples medida de suas absorbncias desde que, estas estejam nas mesmas condies utilizadas para a construo da curva padro (mesmos reagentes, mesma temperatura, etc). Um dos mtodos utilizados para dosagem de protena chamado de mtodo do Biureto. Esse mtodo faz uso da propriedade de ons Cu2+ em meio alcalino de formar ligaes com o nitrognio das ligaes peptdicas. Desta reao (reao de biureto) resulta uma colorao prpura intensa. Este fato pode ser explorado para se determinar por colorimetria a quantidade de protena de uma soluo. A cor desenvolvida numa reao de ons de Cu 2+ em meio alcalino com estas protenas deve-se exclusivamente s ligaes peptdicas e a sua intensidade proporcional a quantidade de tais ligaes. A absorbncia detectada no espectrofotmetro (figura2) . Figura 2

Laboratrio 1A: DOSAGEM DE PROTENA POR FOTOMETRIA

II. OBJETIVO Determinao da concentrao de uma protena em soluo aquosa por fotometria.

III. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL A. DETERMINAO DO MX Adicionar no tubo 1: - 1,0 ml de padro de albumina - 0,5 ml de gua - 2,5 ml de reagente de biureto no tubo 2: 1,5 ml de gua 2,5 ml de reagente de biureto

Aps adio dos reagentes, agitar e incubar os tubos por 15 min a 37oC. Transferir contedo dos tubos para cubetas do espectrofotmetro e ler as absorbncias nos comprimentos de onda 400, 420, 450, 470, 500, 520, 550, 580, 600, 630, 650, 680 e 700 nm. Usar a soluo de biureto como branco (tubo 2). Com isso, voc estar construindo a curva de absorbncia em funo do comprimento de onda para estabelecer o Mx. B. 1. DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PROTENA

-

Preparar os tubos como descrito na tabela 1 utilizando uma soluo de 8mg/ml de albumina (protena padro) e a soluo de protena desconhecida. No tubo branco no dever ser adicionada soluo de protena. A ordem de adio dos componentes da reao deve ser: primeiro soluo desconhecida de protena gua por ltimo o regente biureto. 2. Aps adio do reagente, agitar e incubar os tubos por 15 min a 37oC. 3. Transferir contedo dos tubos para cubetas do espectrofotmetro e ler as absorbncias a 540 nm.

4. Utilizando a curva padro (tubos de 1 a 5) e o valor medido de absoro a 540nm da amostra desconhecida, calcular a concentrao de protena nesta amostra.

Tabela 1: Curva padro para determinao de concentrao de protenasTubos branco 1 2 3 4 5 (amostra desconhecida) Padro de Albumina (8mg/ml) Protena desconhecida gua Destilada Reagente do Biureto Absorbncia (540 nm)

0 0,1ml 0,2ml 0,4ml 0,7ml 1,0ml 0

1,0 ml

1,5 ml 1,4 ml 1,3 ml 1,1 ml 0,8 ml 0,5 ml 0,5 ml

2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml

Laboratrio 1b: ESPECTROFOTMETROI. FUNDAMENTOS Certos aminocidos e bases pricas e pirimdicas possuem anis aromticos o que os leva a absorver em comprimentos de onda especficos na regio de UV. II. OBJETIVOS Determinao do espectro de absoro de luz dos aminocidos III. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 1. Pipetar 1 ml de cada soluo em uma cubeta de quartzo de espectrofotmetro e determinar nas diferentes solues fornecidas: Leucina (0,2 mg/ml) Triptofano (0,2 mg/ml) Adenina (0,2 mg/ml) Timina (0,2 mg/ml)

a) MAX b) Absorbncia obtida em MAX c) Calcular de cada substncia

2. Transferir 1 ml das diluies para cubetas de espectrofotmetro e medir absorbncia. a) Curva de absorbncia em diferentes concentraes de Triptofano em TUBOS Branco 1 2 3 4 TRIPTOFANO (1 mg/ml) 0 0,1 ml 0,2 ml 0,4 ml 0,7 ml GUA DESTILADA 5,0 ml 4,9 ml 4,8 ml 4,6 ml 4,3 ml ABSORBNCIA OBTIDA

MAX

b) Fazer curva de absorbncia x concentrao e verificar se a mesma obedece a lei de Beer.

Laboratrio 2: AMINOCIDOSI. FUNDAMENTOS Aminocidos

TITULAO

E

CROMATOGRAFIA

DE

As unidades constituintes das protenas so os L -aminocidos. Como o prprio nome indica, estes compostos apresentam pelo menos um grupo amino (-NH2) e um grupo carboxlico (-COOH). Em consequncia deste fato, ao serem dissolvidos em gua, os aminocidos apresentam carter anfotrico, ou seja comportam-se como cido e como base. Os grupos amina e carboxila podem sofrer protonaes e desprotonaes reversveis, comportando-se como eletrlitos fracos. Se os considerarmos em suas formas de cidos conjugados: -NH+3 e -COOH, veremos que cada um deles apresentar um valor de pKa. Assim, um aminocido apresenta pelo menos dois valores de pKa e dependendo da natureza ionizvel ou no do grupo R (radical) ligado ao carbono , pode ocorrer ou no um terceiro valor de pKa. Em pH 7,0 e no estado slido, o amino grupo apresenta-se protonado (forma cida) e o grupo carboxila desprotonado (forma bsica) (Figura 1).

Figura 1

Cromatografia - Separao de aminocidos Um dos problemas que continuamente desafiam os bioqumicos a separao e a purificao de um ou mais compostos de uma mistura complexa. Uma grande variedade de tcnicas modernas, tanto analticas quanto preparativas, so denominadas de cromatografia. O que elas possuem em comum a propriedade de fracionar uma mistura complexa de substncias usando diferentes caractersticas qumicas entre os componentes da mistura, o que faz com que eles interajam diferencialmente com a fase estacionria e com uma fase mvel. Existem quatro tipos principais de cromatografia: cromatografia lquida, cromatografia gasosa, cromatografia de camada fina e cromatografia em papel. A seleo do tipo de cromatografia para realizar uma determinada etapa de separao dependente do material a ser isolado. Freqentemente, diversos mtodos cromatogrficos podem ser usados seqencialmente para que seja obtido um composto na forma pura.

Um leito cromatogrfico pode ser construdo de vrias formas, mas ele sempre consistir, basicamente, de duas fases: a fase estacionria e a fase mvel. A fase estacionria (que pode ser slida, lquida ou pode consistir de uma mistura de um slido com um lquido). A fase mvel (que pode ser lquida ou gasosa) preenche os interstcios da fase estacionria e deve ser capaz de fluir atravs desta fase. As fases mvel e estacionria devem ser escolhidas de forma que os compostos que sero separados durante o processo cromatogrfico possuam um coeficiente de partio definido entre as duas fases. Neste processo, vrios mecanismos de distribuio podem ser empregados: a distribuio pode ser uma simples partio entre dois lquidos imiscveis; pode ser um equilbrio de adsoro entre uma fase estacionria adsorvente e uma fase lquida mvel; ou um equilbrio de troca inica entre uma fase estacionria trocadora de on e uma fase mvel constituda por uma soluo de um eletrlito. Cromatografia de aminocidos em papel O movimento na zona de soluto pode ser explicado da seguinte forma: As fibras de celulose do papel possuem uma forte afinidade pela gua presente na mistura de solvente, mas muito pouca afinidade pela fase orgnica. O papel, assim, pode ser visto como um suporte inerte contendo uma fase estacionria aquosa (polar). Na medida que o solvente flui atravs de uma seo do papel contendo o soluto, uma partio deste composto ocorre entre a fase mvel orgnica (pouco polar) e a fase estacionria aquosa (polar). Desta forma, parte do soluto deixa o papel e entra na fase mvel. Quando a fase mvel alcana uma seo do papel que no contm soluto, o fenmeno de partio ocorre novamente. Desta vez, o soluto transferido da fase mvel para a fase estacionria. Com o fluxo contnuo de solvente, o efeito desta partio entre a fase mvel e a fase estacionria a transferncia do soluto do seu ponto de aplicao ao papel para um outro ponto localizado a alguma distncia do local de aplicao, no sentido do fluxo de solvente. Aps o equilbrio do papel com o vapor de um solvente saturado com gua, o desenvolvimento do solvente produz a separao (figura 2).

Quanto mais apolar for o grupo R, maior a mobilidade do aminocido com a fase mvel. Conseqentemente a relao (RF) entre a distncia percorrida pelo aminocido no papel e a distncia percorrida pela fase mvel ser tambm maior. A Tabela I apresenta valores de R F de alguns aminocidos nas condies descritas. Atravs da cromatografia em papel identificaremos um aminocido desconhecido em comparao com quatro outros conhecidos (denominados de aminocidos-padro). Com ajuda da Tabela II e dos valores de pKa obtidos na titulao, confirmaremos a identidade do aminocido. A solubilidade relativa dos aminocidos nestas duas fases pode ser mudada por alteraes na polaridade do solvente, ou no pH da soluo, o qual ir alterar o estado inico dos aminocidos. Sob um conjunto adequado de condies, ento, cada molcula de uma mistura ir se deslocar a uma diferente velocidade sobre a fase estacionria e estar a uma distncia especfica de um do ponto de origem, quando cessar o fluxo de solvente. Devido ao fato dos aminocidos no absorverem luz no comprimento de onda visvel, eles no podem ser vistos. Assim, algum mtodo deve ser usado aps a cromatografia para localiz-los. A reao de ninhidrina usada para este propsito por que reage com grupamentos amino livres produzindo um composto colorido (usualmente prpura) (ver Figura 3). Diversos aminocidos, contudo, produzem diversas tonalidades de cores com a ninhindrina, o que pode ajudar em sua identificao. A reao da ninhindrina com prolina, por exemplo, gera um composto amarelo e a reao da ninhindrina com a tirosina produz uma colorao azul metlica.

Figura 3

Titulao de aminocidos Definio: titulao a adio lenta de uma base ou um cido a solues de aminocidos permitindo a obteno dos respectivos pKas. A curva de titulao mostra como varia o pH em funo de equivalentes do titulante adicionados. Para um aminocido deve-se observar, no mnimo, dois patamares nessa curva correspondendo titulao dos grupos carboxilato e alfa-amino, respectivamente. No meio de cada um desses patamares h um ponto de inflexo, cujo valor de pH numericamente igual ao pKa do grupo correspondente. Essa relao numrica entre pH e pKa facilmente compreensvel da anlise da equao de Henderson-Hasselbalch. II. OBJETIVOS 1. 2. 3. Identificao de um aminocido atravs de seu RF e de seus pKas, determinados, respectivamente, pelas tcnicas de cromatografia em papel e de titulao. Comparao da curva de titulao de um aminocido com a de um cido fraco monoprtico, principalmente examinando os pKas obtidos. Verificao do pH de diversos fluidos biolgicos (de origem vegetal e animal) e no biolgicos, conforme mostrado na figura 2-15 do Rawn, Biochemistry, pg 39 e na figura 4-9 do Lehninger, Principles of Biochemistry, pg 77.

TABELA I RF de vrios aminocidos determinados nas seguintes condies: solvente de Partridge, n-butanol/cido actico glacial/gua (4:1:1), papel Whatman no 1 e temperatura 20oC Aminocid RF Aminocido RF o Cys 0,8 Ala 0,38 Lys 0,14 Pro 0,43 His 0,2 Tyr 0,45 Arg 0,2 Trp 0,5 Asp 0,24 Met 0,55 Gly 0,26 Val 0,6 Ser 0,27 Phe 0,68 Glu 0,3 Ile 0,72 Thr 0,35 Leu TABELA II Aminocido Glu Lys Gly His Cys Thr Asn Ala Leu Pro

pKa 2,19 4,25 9,67 2,18 8,95 10,53 2,34 9,6 1,82 6 9,17 1,71 8,33 10,78 2,62 10,43 2,2 8,8 2,3 9,7 2,36 9,6 1,99 10,6

II. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL A. CROMATOGRAFIA EM PAPEL 1. Tomar uma folha (23 x 16 cm) de papel Whatman no 1 e fazer um trao a lpis ao longo do comprimento maior a 2 cm da borda. Evitar tocar no papel durante toda a operao. Deixar uma margem de 1,5cm de cada lado. Marcar seis pontos sobre essa linha que distem 4 cm um do outro e numer-los a lpis de 1 a 6. As amostras devem ser aplicadas nos pontos numerados com auxlio de um capilar de tal modo que a mancha formada sobre o papel seja a menor possvel. 2. Nos nmeros de 1 a 4 aplicar os padres e no nmero 6, a mistura de padres. A amostra desconhecida aplicada no nmero 5. 3. Enrolar o papel de modo a transform-lo em um cilindro e prender as extremidades superiores com clip. 4. Colocar 25 ml de solvente de Partridge, n-butanol/cido actico glacial/gua (4:1:1), em uma placa de Petri e mergulhar o cilindro de papel em seu interior de modo que este fique perfeitamente na vertical. Evitar que o papel toque na parede da placa. 5. Cobrir o sistema com um bquer de 2 litros e deixar o solvente migrar 10 cm. 6. Retirar o papel e marcar imediatamente a linha de frente do solvente. 7. Secar o papel na capela. 8. Mergulhar em soluo 0,1% de ninhidrina em acetona e levar estufa (80oC-100oC) por alguns minutos. 9. Delimitar com lpis as manchas que aparecem no papel. 10. Determinar o RF dos padres e do aminocido desconhecido.

B. TITULAO

1. Colocar 50 ml da soluo do aminocido (0,10 M) em pH 1,0 em um bquer e titular com soluo 0,5 M de KOH medindo o pH aps cada adio de 1 ml at atingir pH 11,0. 2. Colocar 50 ml de cido actico 0,15 M em outro bquer e titular com soluo 0,5 M de KOH medindo o pH aps cada adio de 0,5 ml at pH 12,0. 3. Selecionar alguns fluidos biolgicos, com os quais no haja problemas de manipulao e medir seu pH. Eventualmente com auxlio de uma pipeta Pasteur adicionar uma vez, HCl gota a gota e outra vez, KOH. Observar a resistncia ou no variao do pH.

Laboratrio 3: PURIFICAO DE PROTENAS SDS-PAGE E PONTO ISOELTRICO (pI)I. FUNDAMENTOS A. Mtodos de Purificao de Protenas possvel purificar e isolar protenas utilizando-se princpios fsico-qumicos, que levam em conta as propriedades caractersticas dessas biomolculas. Uma dessas caractersticas est baseada na solubilidade das diferentes cadeias laterais dos aminocidos, que dependem da concentrao de sais dissolvidos no solvente (fora inica da soluo), da polaridade do solvente (constante dieltrica desse solvente), do pH do meio (ponto isoeltrico da protena) e da temperatura. Em uma soluo aquosa de baixa fora inica, a solubilidade de uma protena, em geral, aumenta com a concentrao salina. Esse fenmeno conhecido como salting in. Em solues com alta fora inica, entretanto, a solubilidade de uma protena em geral decresce, fenmeno que resulta da competio entre os ons salinos adicionados e o soluto (protena), diminuindo a capacidade de solvatao do solvente aquoso. Esse fenmeno conhecido como salting out, constituindo uma das tcnicas mais utilizadas para a purificao de protenas. Sulfato de Amnio [(NH4)2SO4] o sal mais utilizado para salting out, uma vez que sua solubilidade alta (3,9 M a 0C), permitindo gerar solues aquosas de alta fora inica. Protenas em geral possuem uma grande variedade de aminocidos com grupamentos ionizveis com diferentes pKs. A um pH caracterstico para cada protena, as cargas positivas da molcula so balanceadas pelas cargas negativas, conferindo protena carga total zero. Neste pH, denominado ponto isoeltrico (pI), a molcula torna-se imvel em presena de um campo eltrico. Como pode ser visto na figura 1, a solubilidade da lactoglobulina pode variar com a concentrao salina (NaCl). No entanto, em qualquer caso, ao se ajustar o pH para valores prximos ao pI da protena, ocorre uma solubilizao mnima e a maior frao de protenas ficar insolvel. Em muitas situaes, pode-se utilizar os conceitos de salting out e de precipitao no pI para purificar uma protena especfica.

Solubilidade mg/mL

pH

Figura 1 Solubilidade da Lactoglobulina em funo do pH, a diferentes concentraes de NaCl

B. Eletroforese e Separao de Protenas Totais (SDS-PAGE) A separao de macromolculas (protenas, DNA e RNA) pode ser feita aplicando-se um campo eltrico numa matriz slida, como um gel ou papel, que contem a mistura de interesse. Esse mtodo, amplamente utilizado, denomina-se Eletroforese e baseia-se na migrao das molculas em relao a um campo eltrico, devido sua carga. Normalmente se utiliza um gel, devido a supresso das correntes de conveno produzidas por pequenos gradientes de temperatura e tambm porque o gel funciona como uma peneira molecular, permitindo a separao das macromolculas por peso molecular. O gel de eletroforese constitudo de um polmero de acrilamida cuja estrutura est demonstrada na Figura 2. Esta polimerizao ocorre na presena de radicais livres, os quais so gerados por persulfato de amnio e estabilizados por TEMED (N,N,N,Ntetrametilenenodiamino). A polimerizao tambm depende da presena de um agente, o NNmetileno-bis-acrilamida, que facilita a ligao das cadeiras entre si, formando um gel cuja porosidade determinada pelo comprimento das cadeias e pelo grau de interligao entre estas.

Figura 2. A ESQUERDA AO DE PENEIRAMENTO DE UM GEL POROSO DE ACRILAMIDA. A DIREITA FORMAO DE UM GEL DE POLIACRILAMIDA. O TAMANHO DO PORO PODE SER CONTROLADO PELO AJUSTE DA CONCENTRAO DO MONMERO ATIVADO (EM AZUL) E DO INTERLIGANTE (EM VERMELHO).A separao de protenas ocorre em condies desnaturantes. A mistura de protenas e dissolvida em tampo de amostra. Este tampo de amostra, contem SDS (dodecil sulfato de sdio) que um detergente aninico que acaba rompendo as ligaes no covalentes existentes na protena nativa. Neste tampo tambm temos -mercaptoetanol que reduz as pontes de dissulfeto existentes na protena.

II. OBJETIVOS Precipitar as protenas totais de uma soluo de leite em p, utilizando os conceitos de precipitao no pI Utilizar eletroforese em gel de poliacrilamida/SDS (SDS-PAGE) para separar as protenas de diferentes amostras e estimar sua concentrao

III. PROTOCOLO EXPERIMENTAL A. Precipitao no pI 1. Preparar uma srie de tubos de ensaio de acordo com a tabela 1

Tabela 1 Tubo cido Actico 0,1 mM cido Actico 1,0 mM cido Actico 50 mM cido Actico 1,0 M cido Actico 2,0 M pH Turvao (sim? no?) 2. 3. 4.

1 1,0 mL

2 1,0 mL

3 1,0 mL

4

5

1,0 mL 6,7 5,7 4,7 3,7 1,0 mL 2,7

Adicionar, a cada um dos tubos, uma alquota (5,0 mL) de soluo de leite em p desnatado (5%, previamente centrifugado). Agitar os tubos e aguardar 5 minutos Separar alquotas de 1,0 mL, distribuir em tubos plsticos pequenos e centrifugar (5000 rpm, 5 minutos, temperatura ambiente). Descartar a fase sobrenadante e ressuspender o precipitado em NaOH 0,1M (1,0 mL) (Observao: utilizar o mesmo procedimento mesmo para os tubos que aparentemente no apresentam precipitado) Aps a dissoluo total do precipitado, separar uma alquota da soluo obtida (10,0 L) para SDS-PAGE

5.

B. Eletroforese em gel de poliacrilamida/SDS (SDS-PAGE) B.1. Amostras para aplicar em eletroforese Para este experimento, sero utilizadas como amostras: alquotas de protenas purificadas anteriormente, a partir de uma soluo de leite em p (5%) (Amostras 1 a 5) a soluo contendo o extrato bruto de protenas totais de leite em p (5,0 L) para comparao (Amostra 6) Soro Bovino diludo a 10% (10,0 L), para comparao (amostra 7) Albumina Bovina a 4,0 mg/mL (5,0 L) (padro de peso molecular 66,0 KDa) (padro)

B.2. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida/SDS (SDS-PAGE)

OBSERVAES E PRECAUES: Acrilamida neurotxica quando no polimerizada. Utilize sempre luvas descartveis para manipular solues contendo acrilamida Evite inalar TEMED (mesmo diludo, pode ser txico) e butanol

III. PROTOCOLO EXPERIMENTAL 1. Inicialmente montam-se as placas de vidro com os espaadores posicionados. Vedar o espao entre as placas com agarose (1% aquecida em ebulio). Aguardar resfriamento.

Figura 3. Esquema do aparato para Eletroforese

2.

Preparar a soluo para o gel de resoluo (de corrida): gua destilada (3,7 mL) Soluo A (1,8 mL) Soluo B (1,9 mL) APS (Persulfato de Amnio) (0,12 mL) (soluo a 10%) TEMED (0,45 mL) (diludo 40 vezes)

OBS: Adicionar o TEMED por ltimo, pois ele o agente polimerizante deste gel. 3. Utilizar a soluo imediatamente aps o preparo (aplicando-a no espao entre as placas de vidro com uma pipeta. Sero necessrios aproximadamente 4,0 mL de soluo. Aguardar a polimerizao do gel (5 minutos). Ser necessrio deixar aproximadamente 1,0 cm de espao para aplicar o gel de empilhamento

OBS: A soluo comea a polimerizar muito rapidamente, necessrio ateno e rapidez para aplicar a soluo no aparato de eletroforese 4. Preparar a soluo para o gel de empilhamento: gua destilada (1,66 mL) Soluo A (0,3 mL) Soluo C (0,75 mL) APS (Persulfato de Amnio) (0,05 mL) (soluo a 10%) TEMED (0,24 mL) (diludo 40 vezes) OBS: Adicionar o TEMED por ltimo, pois ele o agente polimerizante deste gel. 5. Utilizar a soluo imediatamente aps o preparo, aplicando-a sobre o gel de resoluo (deve preencher um espao de cerca de 1 cm de altura). Colocar um pente plstico para formar os poos onde as amostras sero aplicadas (de acordo com a demonstrao). Sero necessrios aproximadamente 1,60 mL de soluo. Aguardar a polimerizao do gel (15 minutos)

OBS: A soluo comea a polimerizar muito rapidamente, necessrio ateno e rapidez para aplicar a soluo no aparato de eletroforese 6. Montar o aparato para eletroforese (de acordo com demonstrao em sala e a figura 3), adicionar na cuba o tampo de corrida at cobrir os poos do gel para eletroforese.

7.

Adicionar tampo de amostra (10 L) a cada uma das amostras, e aquecer (2 minutos, 100 C) para desnaturar as protenas. Resfriar (gelo) e aplicar 15 L nos poos do gel para eletroforese seguindo a ordem da tabela 2.

Tabela 2 Poo no 1 Amostra Padr o 8.

2 3 4 5 6 7 8 Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra 1 2 3 4 5 6 7

Aplicar a tenso nos eletrodos do aparato de eletroforese (150 V) e aguardar (30 minutos) at que o corante marcador (Azul de Bromofenol) se aproxime da base do gel Interromper a eletroforese e mergulhar o gel em uma soluo de colorao: Coomassie Blue R (0,25g) em metanol : cido actico : gua (45% : 10% : 45%). Aguardar (5-10 minutos) Substituir a soluo de colorao pela soluo de descolorao: metanol : cido actico : gua (45% : 10%: 45%) (15 minutos) Verificar as protenas coradas, e estimar por comparao, a purificao da amostra

9.

10. 11.

B.3. APNDICE (SOLUES UTILIZADAS) SOLUO A : Acrilamida Bis-acrilamida 45 g Acrilamida 1,2 g Bis-Acrilamida gua destilada (at 100 mL) SOLUO B: Tris-HCl pH 8,8 18,17 g Tris (em 50 mL de gua destilada) Ajustar o pH para 8,8 (com HCl) Adicionar SDS (4,0 mL, soluo a 10%) Completar o volume com gua destilada (at 100 mL) SOLUO C: Tris-HCl pH 6,8 6,06 g Tris (em 50 mL de gua destilada) Ajustar o pH para 6,8 (com HCl) Completar o volume com gua destilada (at 100 mL) TAMPO DE CORRIDA: 3,0 g de Tris, 14,4 g de Glicina e 10, 0mL de SDS (10%) Ajustar o volume de gua destilada para 1000 mL TAMPO DE AMOSTRA: SDS 10% (5,0 mL), 2-mercaptoetanol (0,5 mL), Glicerol (2,0 mL), EDTA 0,1M (0,1 mL), Azul de Bromofenol 1% (1,0 mL), Soluo C (2,5 mL) e gua destilada (at 20,0 mL)QUESTES

Laboratrio 4: CINTICA ENZIMTICA

I. FUNDAMENTOS A Cintica Enzimtica estuda os mecanismos e a velocidade de reaes qumicas catalisadas por enzimas. H na estrutura da enzima, uma determinada regio diretamente responsvel pela ao cataltica. Essa regio denominada stio ativo e a sua conformao correta fundamental para a atividade enzimtica. Ali se localizam diversos resduos de aminocidos que podem desempenhar funes de orientao do substrato e de direta interao com este, permitindo que a reao ocorra. Em 1913, L. Michaelis e M. L. Menten, desenvolveram estudos considerando as principais propriedades das enzimas e aplicando as teorias conhecidas de Cintica Qumica para um modelo simplificado, o qual envolvia a enzima livre (E), o substrato (S), o complexo enzima-substrato (ES) e o produto (P). Esse modelo pode ser expresso pela equao qumica: k1 k-1 k2

E + S

ES

E + P

Michaelis e Menten, com essas consideraes, desenvolveram a expresso de velocidade para uma reao catalisada enzimaticamente, onde V funo de [S] e V max e Km so constantes:

v =

Vmx . [S] Km + [S]

Na figura 1 est apresentada a curva de velocidade inicial de reao em funo da concentrao de substrato para uma enzima que siga o modelo proposto por Michaelis e Menten. Essa enzima dita de caractersticas michaelianas e obedece expresso de velocidade apresentada acima.

Vel. Inicial Reao min.l) mol / (

V mx

V x / 2 m

K m

C ce tra on n o d S bstrato (M e u )

Figura 1 Velocidade de reao em funo da concentrao de substrato para uma enzima michaeliana. Nesta curva pode-se facilmente identificar o efeito de saturao do substrato. Nestas circunstncias, o sistema tende a adquirir velocidade de reao mxima (Vmx), grandeza a qual funo da concentrao inicial da enzima livre (E). Podemos tambm definir uma concentrao de substrato na qual obtm-se metade de Vmx. Esse valor de [S] numericamente igual ao K m, parmetro que dentro de certos limites mede a afinidade da enzima pelo substrato. O mtodo mais preciso para determinao grfica dessas grandezas num experimento de Cintica Enzimtica atravs do grfico de duplo-recproco ou de Lineweaver-Burk. Para tanto deve-se plotar 1/V em funo de 1/[S]. A enzima escolhida para este estudo a invertase de levedura que catalisa a hidrlise da sacarose para produzir glicose e frutose:

C12H22O11 + H 2OSacarose

C 6H12O6 + C 6H12O6Glicose Frutose

A determinao da velocidade da reao (ou da atividade enzimtica) pode ser feita atravs da dosagem dos acares redutores formados (frutose e glicose). A dosagem baseia-se na reao entre o cido 3,5-dinitro-saliclico (DNS) e os acares redutores. Estes monossacardeos reduzem o DNS fornecendo um produto de cor caracterstica, cuja formao pode ser acompanhada a 540 nm. Conhecendo-se por colorimetria a quantidade ( mols) de acares redutores formada, por um clculo estequiomtrico simples, pode-se determinar a quantidade correspondente ( mols) de sacarose hidrolisada. Nestas experincias as velocidades da reao sero expressas em mols de sacarose hidrolisada por minuto. Para estudos de velocidade, o tempo de reao deve ser medido com a maior exatido possvel. Para isso, o grupo dever organizar-se de maneira a no permitir que a reao se inicie em tempos diferentes nos vrios tubos. Para tal, importante manter

os tubos em gelo durante a adio dos reagentes. Esses devem ser adicionados na ordem em que aparecem nos protocolos, com a enzima sendo adicionada por ltimo. Leva-se ento os tubos, todos juntos, ao banho a 37C para reagir. Transcorrido o tempo determinado, os tubos devem voltar, todos juntos e simultaneamente, para o gelo. Neste ponto a reao pra. A atividade enzimtica medida em unidade (U), sendo que 1U a quantidade de enzima necessria para a formao de 1 mol de produto por minuto.

II. OBJETIVOS Estudar as influncias das concentraes de enzima e substrato nas velocidades de uma reao enzimtica, examinar as curvas obtidas experimentalmente, calcular os parmetros cinticos e discutir seus valores e importncia.

III. PROTOCOLO EXPERIMENTAL A. Construo da Curva Padro 1. Adicionar a seis tubos (180 X 20mm) volumes crescentes de soluo padro redutora (glicose 6 mM + frutose 6 mM), conforme indicado abaixo. Complete o volume em cada tubo para 2,0 mL com tampo. Adicionar em seguida 2 mL do reagente DNS. As quantidades esto indicadas na tabela abaixo. Sol. Padro redutora (mL) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Sol. tampo (mL) 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 Reagente DNS (mL) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Absorvncia (540 nm) 0,000 Sacarose hidrolisada ( mols) 0,00

Tubos branco 1 2 3 4 5 2.

Aps a adio do DNS (cido 3,5-dinitro-saliclico), colocar os tubos em banhomaria fervente por 10 min. Aps este tempo, esfriar em gua corrente e adicionar 8 mL de gua destilada. Homogeneizar e ler as absorvncias a 540 nm contra o branco. Construir o grfico absorvncia versus concentrao de sacarose hidrolisada. Este grfico ser a nossa curva padro.

3.

B. Efeito da concentrao da enzima 1. Numerar sete tubos de ensaio (180 X 20 mm) e adicionar os reagentes conforme tabela abaixo. Manter todos os tubos no gelo. Sacarose Tampo Sol. 5% em pH 4,77 enzima tampo (mL) (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,9 0,7 0,5 0,3 0,1 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1,0 Conc. enzima ( M) 0,00 Sacarose hidrolisada por min. ( mol/min ) 0,00

Tubos

Abs. 540 0,000

branco 1 2 3 4 5 6 2.

Aps a adio da enzima, agitar suavemente. Retirar os tubos do gelo e coloclos imediatamente (e simultaneamente) em banho-maria a 37C por 5 min. Transcorrido este tempo, os tubos devem retornar imediatamente para o gelo. Assume-se que nesse instante a reao pra. Ainda no gelo, adicionar a cada tubo 2 mL de DNS. Na presena de DNS, devido alcalinidade do reagente, a enzima pra de funcionar. Transferir os tubos para banho-maria fervente e esperar 10 min. Findo este tempo, esfriar em gua corrente e adicionar 16 mL de gua destilada em cada tubo. Agitar com inverso da posio na vertical (3 vezes). Ler as absorvncias a 540nm. Fazer o grfico colocando a concentrao da enzima ( M) nas abscissas e nas ordenadas, a velocidade de hidrlise expressa em mols de sacarose hidrolisada por minuto. Durante a aula de laboratrio ser fornecido o valor da concentrao da enzima na soluo estoque.

3.

4.

C. Efeito da concentrao de substrato 1. Numerar sete tubos de ensaio (180 X 20 mm) e adicionar os reagentes segundo o protocolo baixo. Manter todos os tubos no gelo.

Tubos

Sacarose Tampo Sol. 5% tampo pH 4,77 enzima (mL) (mL) (mL) 1,0 0,05 0,1 0,3 0,5 0,7 1,0 1,0 1,45 1,4 1,2 1,0 0,8 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Conc. Abs. 540 sacarose (mM) 0,00 0,000

branco 1 2 3 4 5 6 2. 2.1.

Sacarose hidrolisada por min ( mols/min) 0,00

Proceder exatamente como no caso do estudo da concentrao da enzima (item anterior).

Aps a adio da enzima, agitar suavemente. Retirar os tubos do gelo e coloc-los imediatamente (e simultaneamente) em banho-maria a 37C por 5 min. Transcorrido este tempo, os tubos devem retornar imediatamente para o gelo. Assumese que nesse instante a reao pra. Ainda no gelo, adicionar a cada tubo 2 mL de DNS. Na presena de DNS, devido alcalinidade do reagente, a enzima (valor elevado de pH) pra de funcionar. Transferir os tubos para banho-maria fervente e esperar 10 min. Findo este tempo, esfriar em gua corrente e adicionar 16 mL de gua destilada em cada tubo. Agitar com inverso da posio na vertical (3 vezes). Ler as absorvncias a 540nm. 3. Fazer um grfico da velocidade versus concentrao inicial do substrato. Estimar os valores de Vmx e Km.

2.2.

4. Fazer o grfico de Lineweaver e Burk e calcular os valores de Vmx e Km. 5. Comparar o valor de Km com o encontrado na literatura cientfica.

Laboratrio 5: REAO DE TRANSAMINAOI. FUNDAMENTOS Enzimas transaminases ou aminotransferases so importantes no metabolismo de aminocidos, pois transferem o grupo NH3+ de um aminocido para um cetocido. Foram identificadas mais de 50 tipos de transaminases, presentes em todos os tipos de clulas e sendo encontradas tanto no citossol como em mitocndrias de clulas eucariticas. O grupo NH3+ de todos os aminocidos (com exceo de Lys, Arg e Thr) podem ser removidos por transaminases em diferentes organismos. As transaminases possuem especificidade diferenciada: relativamente especfica para o cetocido aceptor do grupo NH3+ e, numa menor intensidade, para o aminocido doador. A coenzima PLP (piridoxal-fosfato) essencial para as transaminaes e vrias outras enzimas envolvidas no catabolismo de aminocidos (figura 1). PLP derivada da vitamina B6, hidrossolvel, o piridoxal. A figura 2 mostra como os processos catablicos dos diversos aminocidos colaboram com o eficiente funcionamento do ciclo de Krebs pelo fornecimento de intermedirios desse ciclo.

NH3+ R C H AMINOCIDO COOR

O C COO -CETOCIDO

O C HO H3 C + N H

H CH2 O P HO H3 C

NH3 CH2 CH2 + N H Piridoxamino-fosfato O P

Piridoxal-fosfato

O NH3+ -OOC -OOC CH2 CH2 C H COOCH2 CH2 C COO-

GLUTAMATO

-CETOGLUTARATO

Figura 1. Reao de transaminao, mostrando a dependncia pela coenzima PLP no processo de transferncia dos grupos amino entre aminocidos e cetocidos.

Figura2. O cido glutmico (Glu), produzido em diversas transaminaes, pode tanto sofrer desaminao oxidativa, produzindo o - cetoglutarato e o on NH4+, que ser utilizado no ciclo da uria, como doar o grupo NH3+ para a biossntese de outros aminocidos. O Glu o principal doador de grupos NH3+ nesta funo. A figura 3 ilustra esses processos metablicos.

Figura 3 II. METODOLOGIA Uma alquota de homogeneizado de fgado de camundongo (ou de galinha) ser utilizado como fonte de transaminases hepticas. Uma mistura de aminocidos e de cetocidos ser incubada com uma alquota do homogeneizado de fgado. A identificao dos produtos da reao catalisada pela transaminase presente no homogeneizado ser realizada por cromatografia em papel.

III. PROTOCOLO EXPERIMENTAL A. Preparao do homogeneizado de fgado Essa etapa foi realizada previamente. Fgados de camundongos (5 a 7 animais) ou de galinha foram extrados e lavados com PBS (tampo fosfato: 0,05M, pH 7,4), picados e macerados para homogeneizao com PBS (at 10,0 mL de volume final). O homogeneizado foi centrifugado (800 g, 15 minutos) para eliminar clulas remanescentes, ncleos e debris celulares. O sobrenadante foi aliquotado para utilizao em sala de aula, mantido em gelo e em seguida mantido congelado (-20C) at sua utilizao. B. Preparao da Mistura Reacional O sistema completo da reao composto por um aminocido, um cetocido, o preparado enzimtica, arsenito de sdio e o tampo. O arsenito de sdio empregado com a finalidade de evitar a oxidao dos cetocidos pelo sistema enzimtico. A mistura da reao composta por: 0,3mL de soluo de cetoglutarato 0,2M pH 7,4 0,3mL de soluo de Alanina a 0,2M pH 7,4 0,3mL de preparao enzimtica 0,5mL de tampo fosfato 0,05M pH7,4 0,4 mL de soluo de arsenito de sdio 0,2M Deve-se montar a reao. E tambm um controle negativo contendo todos os componentes exceto a preparao enzimtica. Incubar os tubos (reao e controle negativo) a 37C, por 30 minutos. Em seguida, inativar a reao em banho-maria fervente por 3 minutos. Centrifugar a 5000 rpm, 10 minutos (centrfuga Eppendorf). Decantar o sobrenadante transferindo para um segundo tubo Eppendorf e fazer a cromatografia com os padres adequados. C. Cromatografia Em um papel de filtro Whatman nmero 1 (10 cm X 20 cm) traar com um lpis uma linha horizontal de 2,5 cm de altura a partir da origem (ponto de contato do papel com a soluo na cuba de cromatografia). Marcar 7 pontos com 2,5 cm de distncia entre si. Aplicar, com um capilar de vidro fino, sobre os pontos marcados, uma pequena alquota dos padres de Alanina, Glutamato, Piruvato, e -cetoglutarato, a mistura de reao, o branco (controle negativo) e 2,4-dinitrofenil-hidrazina. Sobre os pontos onde

foram aplicados o -cetoglutarato, o piruvato e a mistura de reao, adicionar 1 aplicao capilar de 2,4-dinitrofenil-hidrazina. O solvente utilizado para a cromatografia ser uma mistura de butanol/etanol/NH 4OH 0,5M na proporo 70:20:30. Aps o solvente alcanar 1 cm do final do papel, secar o papel a 80C em estufa e marcar os produtos coloridos formados. Revelar os aminocidos do cromatograma com a soluo de ninhidrina, secando em seguida o papel. Marcar a posio das manchas que aparecerem.