Apostila Prática de Processos Bioquímicos_versão2

of 41 /41
Universidade do Estado do Rio de Janeiro FACULDADE DE TECNOLOGIA ENGENHARIA DE PRODUÇÃO DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E AMBIENTAL PROCESSOS BIOQUÍMICOS MANUAL DE PRÁTICAS DE PROCESSOS BIOQUÍMICOS APOSTILA DAS AULAS PRÁTICAS Denise Celeste Godoy de Andrade Rodrigues Telma Temóteo dos Santos Agosto de 2011

Embed Size (px)

Transcript of Apostila Prática de Processos Bioquímicos_versão2

  • Universidade do Estado do Rio de Janeiro

    FACULDADE DE TECNOLOGIA ENGENHARIA DE PRODUO

    DEPARTAMENTO DE QUMICA E AMBIENTAL PROCESSOS BIOQUMICOS

    MANUAL DE PRTICAS DE

    PROCESSOS BIOQUMICOS

    APOSTILA DAS AULAS PRTICAS

    Denise Celeste Godoy de Andrade Rodrigues

    Telma Temteo dos Santos

    Agosto de 2011

  • ndice 1. ESPECTROFOTOMETRIA E CURVAS-PADRO .............................................................2 2. QUANTIFICAO DE MICRO-ORGANISMOS ................................................................6

    2.1 Roteiro da Prtica 1 Quantificao de Micro-organismos...................................................8 2.1.1. Preparo da Suspenso de Clulas..................................................................................8 2.1.2 Determinao do peso seco de clulas (%p/v)................................................................8 2.1.3. Turbidimetria ...............................................................................................................8 2.1.4. Contagem de clulas em cmara de NEUBAUER ........................................................9 2.1.5. Determinao do volume do centrifugado (% v/v) ......................................................10 2.1.6. Estudo Dirigido..........................................................................................................10 2.1.7. Relatrio da Prtica 1 .................................................................................................11

    3. DOSAGEM DE ACARES..................................................................................................12 3.1 Mtodo do DNS (3,5 dinitro salicilato)...............................................................................13 3.2 Roteiro da Prtica 2 - Curva Padro do Mtodo DNS .........................................................14

    3.2.1. Preparo da Soluo Padro de Glicose: 5 mols/mL ..................................................14 3.2.2. Construo da Curva Padro ......................................................................................14 3.2.3. Estudo Dirigido..........................................................................................................15 3.2.4. Relatrio da Prtica 2 .................................................................................................16

    4. ACCARES REDUTORES (AR) E ACARES REDUTORES TOTAIS (ART)..................17 4.1 Roteiro da Prtica 3 - Determinao de Acares Redutores (AR) e Acares Redutores Totais (ART) ...........................................................................................................................20

    4.1.1. Determinao de Acares Redutores (AR)................................................................20 4.1.2. Determinao de Acares Redutores Totais (ART)...................................................20 4.1.3. Dosagem de acares pelo mtodo do DNS................................................................21 4.1.4 Relatrio da Prtica 3..................................................................................................22

    5. Grau Brix.................................................................................................................................23 5.1 Roteiro da Prtica 4 - Determinao do BRIX ....................................................................24

    5.1.1. Procedimento.............................................................................................................24 5.1.2. Relatrio da Prtica 4 .................................................................................................25

    5. Cintica do Crescimento Microbiano........................................................................................26 5.1 Roteiro da Prtica 5 - Cintica do Crescimento de Clulas de Leveduras ............................29

    5.1.1. Preparo da soluo de YED 2% e inoculao das clulas ............................................29 5.1.2. Determinao da concentrao de biomassa (X) .........................................................29 5.1.3. Relatrio DA Prtica 5 ...............................................................................................30

    6. Produo de Etanol ..................................................................................................................31 6.1 Roteiro da Prtica 6 - Produo de Etanol em caldo de cana-de-acar ...............................32

    6.1.1. Fermentao ..............................................................................................................32 6.1.2. Inibio da fermentao por NaF (inibidor da enolase) ...............................................32 6.1.3. Relatrio da Prtica 6 .................................................................................................33

    6.2 Roteiro da Prtica 7 - Produo de Etanol em YED a 2% ...................................................34 6.2.1. Preparo da soluo de YED 2%..................................................................................34 6.2.2. Produo de clulas e de etanol e consumo de glicose ................................................34 6.2.3. Determinao do lcool pelo mtodo do dicromato.....................................................35 6.3.4. Relatrio da Prtica 7 .................................................................................................36

    7. Acidez de vinhos......................................................................................................................37 7.1. Roteiro da Prtica 8 - Determinao da acidez total de vinhos ...........................................38

    7.1.1. Procedimento.............................................................................................................38 7.1.2.Relatrio da Prtica 8..................................................................................................39

    8. Preparo de Solues e Indicadores............................................................................................40

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 2

    1. ESPECTROFOTOMETRIA E CURVAS-PADRO

    O termo espectro foi utilizado inicialmente por Newton, quando este descobriu que a luz

    branca, ao atravessar um prisma, dividida em vrias cores. Atualmente, sabe-se que o espectro

    visvel apenas uma pequena parte do espectro eletromagntico. A luz , portanto, definida

    como uma forma de energia eletromagntica, formada por ondas que apresentam comprimentos

    diferentes. O comprimento de onda medido em nm onde 1,0 nm equivale a 10-9m. A tabela 1.1

    mostra as regies do espectro em relao ao comprimento de onda.

    Tabela 1. 1: Regies do espectro em funo do comprimento de onda Regio Comprimento de onda (nm) Raios X 0,1 a 100 Ultravioleta 100 a 400 Visvel 400 a 800 Infravermelho 800 a 5.000 Mico-onda 5.000 a 30.000

    A capacidade que as diversas substncias qumicas tm de absorverem luz em

    determinados comprimentos de onda pode ser utilizada para a sua determinao quantitativa e

    qualitativa, uma vez que o espectro de absoro caracterstico para uma determinada substncia

    e a quantidade de absoro (intensidade) dependente da concentrao do composto.

    Os mtodos instrumentais esto sendo expandidos para a escala industrial e abrangem as

    mais diversas anlises nas inmeras reas de atuao na industria qumica destacando-se os

    mtodos espectrofotomtricos.

    A espectrofotometria medida de absoro ou transmisso de luz uma das mais

    valiosas tcnicas analticas amplamente utilizadas em laboratrios de rea bsica, bem como em

    anlises clnicas e biolgicas. Alguns exemplos de aplicao incluem: determinao de atividade

    enzimtica ou nas dosagens de compostos orgnicos em fluidos biolgicos, como glicose, uria,

    protenas, etc, em que se dosa um produto colorido, obtido por meio de uma reao qumica, ou

    um produto incolor que absorva na regio do UV ou do IV.

    A tcnica baseia-se no fato de que quando um feixe de luz monocromtica atravessa uma

    soluo com molculas absorventes, parte da luz absorvida pela soluo e o restante

    transmitido. A absoro de luz depende basicamente da concentrao das molculas absorventes

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 3

    e da espessura da soluo caminho ptico (Figura 1.1). Deve-se utilizar um feixe de luz

    monocromtica de comprimento de onda adequado, capaz de excitar o composto estudado.

    Beer em 1852 observou a relao existente entre a transmisso e a concentrao do meio

    onde passa o feixe de luz. Uma determinada soluo absorve a luz proporcionalmente

    concentrao molecular do soluto, isto , " A intensidade de um feixe de luz monocromtico

    decresce exponencialmente medida que a concentrao da substncia absorvente aumenta

    aritmeticamente ".

    Figura 1. 1: Esquema de Absoro da Luz

    Fonte: http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/curvapadrao.html

    A anlise quantitativa em espectrofotometria realizada atravs da medida da

    absorbncia, a qual se relaciona linearmente com a concentrao dentro de uma faixa de

    concentrao, seguindo a lei de Lambert- beer. Para medidas de absoro de luz visvel e

    ultravioleta na pesquisa bioqumica a indstria especializada fabrica vrios tipos de aparelhos,

    comumente chamados de espectrofotmetros (Figura 1.2).

    Nos espectrofotmetros a luz, fornecida por uma lmpada, fracionada pelo prisma ou

    rede de difrao (monocromador) nos comprimentos de onda que a compem (luzes

    monocromticas). O comprimento de onda selecionado dirigido para a soluo contida em um

    recipiente transparente (cubeta). Parte da luz absorvida e parte transmitida. A reduo da

    intensidade luminosa medida pelo detector (clula fotoeltrica) porque o sinal eltrico de sada

    do detector depende da intensidade da luz que incidiu sobre ele. O sinal eltrico amplificado e

    visualizado no galvanmetro em nmeros lido como uma absorbncia e proporcional

    concentrao da substncia absorvente existente na cubeta.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 4

    Figura 1. 2: Esquema ptico dos principais componentes do espectrofotmetro. As letras representam: (a) fonte de luz, (b) colimador, (c) prisma ou rede de difrao, (d) fenda seletora de X, (e) compartimento de

    amostras com cubeta contendo soluo, (f) clula foteltrica, (g) amplificador.

    Se houver proporcionalidade entre a absorbncia e a concentrao da substncia, pode-se

    determinar a concentrao da substncia em amostras de concentrao no conhecida com base

    numa curva de calibrao, que relaciona absorbncia e concentrao. Na Figura 1.3

    apresentada uma curva de calibrao, que corresponde relao grfica entre os valores de

    absorbncia e os de concentrao.

    Figura 1. 3: Curva de Calibrao: Absorbncia em funo da Concentrao

    Para se plotar uma curva padro necessria a leitura de pelo menos quatro pontos, se

    esta estiver na faixa de linearidade ou de dez pontos, caso no esteja. Alm disso, preciso

    trabalhar, ao menos em triplicata para cada ponto. A curva obtida a partir da insero de uma

    linha de tendncia que passe pelos pontos experimentais. No exemplo da Figura 1.3 observa-se

    que o ajuste dos pontos experimentais foi feito com uma reta. A qualidade do ajuste avaliada

    pelo valor do R2, no mostrado neste exemplo.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 5

    Com base na anlise grfica da Figura 1.3 possvel verificar a linearidade da reao e

    calcular um fator de converso de valores de absorbncia em concentrao.

    FC = Mdia (Cp/Ap)

    C = A.FC Onde:

    FC - fator de converso ou fator da curva

    Ap - absorbncia do padro

    Cp - concentrao do padro

    C - concentrao da amostra

    A - absorbncia da amostra

    Observao:

    Pode-se trabalhar com a Absorbncia (A), como mostrado no texto, ou com a

    Transmitncia (T).

    Na prtica, a transmitncia, que medida em uma escala de 0 (no escuro) a 100% (com o

    branco na passagem da luz), pouco utilizada, pois substituda pelo valor de densidade ptica

    (D.O.) ou absorvncia, termo mais aceito atualmente, que corresponde ao logaritmo do inverso

    da transmitncia:

    A = log 1/T

    Referncias:

    BRACHT, A; ISHII-IWAMOTO, E. L. Mtodos de Laboratrio em Bioqumica. So

    Paulo: Manole, 2003.

    http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/curvapadrao.html

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 6

    2. QUANTIFICAO DE MICRO-ORGANISMOS

    Os micro-organismos possuem a capacidade de ocupar e modificar um determinado

    ambiente de forma rpida. A partir da proliferao, os micro-organismos tambm excretam

    enzimas que modificam reagentes para a formao de novos produtos. Diante disso, a

    quantificao microbiana um importante acompanhamento em processos industriais que

    envolvam micro-organismos diretamente, exemplo da fermentao alcolica, ou para se verificar

    a minimizao dos mesmos quando estes no so desejveis, como o caso das salas de preparo

    de injetveis nas indstrias farmacuticas.

    Como exemplo de quantificao microbiana na industria tm-se a Portaria n 518/04, que

    estabelece que a quantidade de bactrias heterotrficas presentes na gua no pode ultrapassar

    500 UFC/ml seno h a necessidade de reteste,inspeo da fonte ou outras providncias cabveis.

    Uma situao oposta, ao se considerar alimentos com atividade prbitica, a contagem mnima

    deve ser de 108 a 109 UFC na dose diria recomendada ou a empresa deve comprovar a eficcia

    do produto como probitico.

    O crescimento dos micro-organismos pode ser mensurado por diferentes tcnicas, tais

    como pelo acompanhamento da variao no nmero ou peso de clulas, por exemplo. A escolha

    do mtodo funo do Micro-organismo e das caractersticas do meio de fermentao (cor,

    slidos presentes, etc.).

    No existe um mtodo absoluto para a quantificao microbiana ou determinao da

    viabilidade celular de uma populao de clulas. Para estimar a proporo de clulas viveis em

    uma cultura ou processo fermentativo, mtodos baseados no plaqueamento ou observao

    microscpica tm sido utilizados. Os mtodos de contagem direta so rpidos e simples,

    exigindo um mnimo de equipamento, permitindo que seja observada, simultaneamente, a

    morfologia celular.

    Outros mtodos amplamente empregados so densidade tica (ou absorbncia), peso seco

    de clulas, volume de centrifugado, nmero mais provvel, dentre outros. Alguns destes mtodos

    sero vistos na prtica 1.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 7

    Referncias:

    Brasil, Portaria n 518, de 25 de maro de 2004. Estabelece os procedimentos e

    responsabilidades relativos ao controle e vigilncia da qualidade da gua para consumo

    humano e seu padro de potabilidade, e d outras providncias. D.O.U. - Dirio Oficial da

    Unio; Poder Executivo, de 26 de maro de 2004. Disponvel online em: . Acesso em: 31/07/2008.

    FDA, Bacteriological Analytical Methods, 2001. Disponvel online em:

    . Ultimo acesso em: 29/07/2008.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 8

    2.1 Roteiro da Prtica 1 Quantificao de Micro-organismos Material 1 balo volumtrico de 100 mL 6 bales volumtricos de 250 mL 2 bales volumtricos de 1000 mL 1 Becher de 100 mL 1 Basto de vidro 1 tubo de centrfuga pipetas volumtricas de 2, 3, 5, 10 e 15 mL 1 pesa-filtro

    Equipamentos estufa espectrofotmetro UV-Visvel centrfuga balana dessecador cmara de Neubauer microscpio

    Reagentes Fermento

    Biolgico gua

    Objetivo: Determinar a concentrao de clulas de levedura em uma suspenso, usando 4

    diferentes tcnicas de quantificao.

    2.1.1. Preparo da Suspenso de Clulas

    Pesar cerca de 1 g de fermento biolgico em um becher de 100 mL

    Dissolver em gua destilada e diluir em balo volumtrico de 100 mL

    2.1.2 Determinao do peso seco de clulas (%p/v)

    Pipetar 10 mL da suspenso de clulas recm preparada, previamente agitada e

    transferir para pesa-filtro de tara conhecida.

    Secar em estufa entre 100 e 120C at peso constante.

    Determinar, por diferena de massa, o peso seco de clulas e expressar o resultado em

    termos de massa seca de clulas (g) / 100 mL de suspenso.

    2.1.3. Turbidimetria

    Diluir alquotas de 2, 3 e 5 mL da suspenso de clulas em bales volumtricos de 250

    mL e alquota de 15 mL em balo volumtrico de 1.000 mL (fazer em duplicata).

    Ler a absorbncia das suspenses diludas em espectrofotmetro (=570 nm), usando

    gua destilada como branco.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 9

    2.1.4. Contagem de clulas em cmara de NEUBAUER

    Diluir a suspenso 50 vezes.

    Gotejar a suspenso diluda em cmara de NEUBAUER e cobrir com a lamnula.

    Efetuar a contagem de 5 dos 25 quadrados da cmara (Figura 2.1). Expressar o

    resultado em termos do nmero de clulas / mL da suspenso original, com base no

    seguinte clculo:

    ( 5 quadrados) x (5x104) x diluio

    Figura 2. 1: Cmara de Neubauer. A. O crculo indica a rea aproximada coberta pelo aumento de 100 vezes ao microscpio (10X ocular e 10X objetiva) de uma cmara de contagem padro. B. Aspecto de um quadrado

    integrante do quadrado mdio, mostrando que devem ser contadas as clulas que tocam as linhas do topo e da esquerda do quadrado, desprezando aquelas que tocam a linha de baixo e da direita do quadrado.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 10

    2.1.5. Determinao do volume do centrifugado (% v/v)

    Pipetar 10 mL da suspenso de clulas recm preparada, previamente agitada e

    transferir para tubo de centrfuga graduado.

    Centrifugar por 15 minutos. Anotar o volume de clulas.

    Expressar o resultado em termos de volume de clulas / 100 mL da suspenso.

    2.1.6. Estudo Dirigido

    1) Pesquisar outras metodologias para quantificao de micro-organismos e para controle de

    qualidade.

    2) Quais as possveis fontes de erro das tcnicas utilizadas nesta prtica?

    3) Discutir a aplicabilidade de cada tcnica utilizada nesta prtica.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 11

    2.1.7. Relatrio da Prtica 1 Componentes do Grupo: 1) Preencher os espaos abaixo, efetuando os clculos necessrios: - Determinao do volume do

    centrifugado (% v/v)

    volume da suspenso: __________

    volume de clulas: __________

    % v/v: __________

    - Determinao do peso seco de clulas (%p/v)

    volume da suspenso: __________

    tara do pesa-filtro: __________

    pesa-filtro + clulas secas: __________

    peso das clulas secas: __________

    Peso seco (g/100 mL): __________

    - Contagem de clulas em cmara de NEUBAUER Contagem quadrados: A = _____ , B = _____, C = _____, D = _____, E = _____

    5 quadrados (A+B+C+D+E) = _______

    [clulas] da suspenso diluda 50 vezes = ( 5 quadrados) x (5x104) x (diluio)

    [clulas] da suspenso original = _______ (n clulas / mL)

    - Turbidimetria Diluio Vol. Susp.

    (mL) Vol. balo

    (mL) ABS

    570nm ABS mdia N clulas

    clulas/mL Peso seco

    (g/100 mL)

    2) Construir os seguintes grficos, determinando a reta de calibrao e o fator da curva: Absorbncia 570 nm x peso seco das suspenses diludas Absorbncia 570 nm x n clulas/mL das suspenses diludas

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 12

    3. DOSAGEM DE ACARES

    Os carboidratos, ou acares, com frmula emprica (CH2O)n so um dos maiores grupos

    de compostos orgnicos conhecidos na natureza, e juntamente com as protenas formam os

    principais constituintes dos organismos vivos. Os carboidratos simples mais abundantes so as

    pentoses e hexoses. Os acares possuem um ou mais tomos assimtricos de carbono, portanto

    podem existir na forma de estereoismeros.

    Os carboidratos tm diversas classificaes, de acordo com seu tamanho, com o grupo

    funcional que derivado, entre outras. As classificaes podem ser: monossacardeos,

    oligossacardeos e polissacardeos.

    Os monossacardios so carboidratos simples que no podem ser hidrolisados a acares

    de menor peso molecular. Podem ser classificados em aldoses (poliidroxialdedos) e cetoses

    (poliidroxicetonas), sendo subdivididos em trioses, tetroses, pentoses e hexoses, de acordo com o

    nmero de carbonos na cadeia.

    Os oligossacardios so polmeros compostos de resduos de monossacrdios unidos por

    ligaes hemiacetlicas, neste caso denominadas ligaes glicosdicas, em nmero que variam de

    duas, at, aproximadamente, dez unidades. So compostos importantes na determinao de

    estruturas de polissacardios.

    Na indstria existem diversas reaes tanto de degradao como de formao de aucares

    que so determinantes no controle de qualidade dos produtos produzidos.

    Um acar redutor um acar no qual o carbono da carbonila no est envolvido em

    uma ligao glicosdica e, portanto, pode sofrer oxidao.

    Os monossacardeos podem ser oxidados por agentes oxidantes relativamente suaves, tais

    como os ons frrico e cprico. O carbono do grupo carbonila oxidado a cido carboxlico.

    Todos os monossacardeos so potencialmente redutores, devido a presena da carbonila. Outros

    carboidratos necessitam ser hidrolisados para se tornarem redutores.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 13

    3.1 Mtodo do DNS (3,5 dinitro salicilato)

    Um dos mtodos empregados na quantificao de acares redutores o mtodo do DNS.

    um mtodo rpido e prtico na determinao de acares redutores, e tem grande

    aplicabilidade industrial. Como exemplo de aplicao temos: controle de qualidade na

    caracterizao das matrias primas para fins de processamento, e verificao se determinado

    produto est dentro dos parmetros e padres exigidos pela legislao; indstria aucareira, no

    acompanhamento do processo de fermentao, que permite verificar as taxas de consumo de

    acar pelo micro-organismo.

    A determinao de acares redutores pelo mtodo do DNS baseia-se na reduo, em

    meio alcalino, do 3.5-dinitrosalicilato (colorao amarela). O produto formado estvel, com

    colorao laranja-avermelhado (3-amino 5-nitro salicilato) na proporo estequiomtrica e

    mxima absoro da luz visvel no comprimento de onda de 535 nm. Neste mtodo ocorre a

    seguinte reao de oxidao (Figura 3.1):

    Figura 3. 1: Reao de oxidao da carbonila pelo reagente DNS.

    Para se aplicar o mtodo necessrio se fazer inicialmente uma curva-padro do acar

    que se deseja quantificar, como ser realizado na prtica 2 deste manual.

    Referncias:

    MILLER, G.L., Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Anal. Chem., n. 31, p.426, 1959.

    WANG, Nam Sun. Glucose assay by dinitrosalicylic colorimetric method. Disponvel em: http://terpconnect.umd.edu/~nsw/ench485/lab4a.htm. Acesso em: 10 ago 2011.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 14

    3.2 Roteiro da Prtica 2 - Curva Padro do Mtodo DNS

    Material 1 balo volumtrico de 100 mL 1 Becher de 50 e de 100 mL 1 Basto de vidro Buretas de 10 e 50 mL 7 tubos de ensaio com tampa de rosca Pipeta volumtrica de 1 mL

    Equipamentos espectrofotmetro UV-Vis balana termmetro banho-maria

    Reagentes Glicose Reagente DNS

    Objetivo: Construir uma curva padro para determinao de acares redutores pelo mtodo do

    DNS, empregando a glicose como padro.

    Sensibilidade do mtodo: 1-20 mols glicose

    3.2.1. Preparo da Soluo Padro de Glicose: 5 mols/mL

    Pesar, em um becher de 100 mL, 90 mg glicose. Anotar a massa para realizar os

    clculos.

    Solubilizar com gua destilada e transferir para balo volumtrico de 100 mL.

    Avolumar o balo.

    3.2.2. Construo da Curva Padro

    Em tubos de ensaio com tampa, e com auxlio da bureta de 10 mL, preparar os

    seguintes pontos da curva, em duplicata com exceo do branco:

    gua destilada (mL)

    Soluo Padro (mL)

    branco 1,0 - 1 0,8 0,2 mL 2 0,6 0,4 mL 3 0,4 0,6 mL 4 0,2 0,8 mL 5 - 1,0 mL

    Adicionar 1 mL de DNS em cada tubo. Agitar e aquecer 100C em banho-Maria

    durante 5 min.

    Resfriar e acrescentar 13 mL de gua destilada em cada tubo, com auxlio da bureta de

    50 mL. Tampar os tubos e homogeneizar (volume final = 15 mL).

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 15

    Proceder a leitura da absorbncia em espectrofotmetro em: = 540 nm.

    3.2.3. Estudo Dirigido 1) Pesquisar outras metodologias para quantificao de acares. 2) Ler o artigo Comparao de Mtodos para Determinao de Acares Redutores e

    Totais em Mel, disponvel na pasta da Disciplina de Processos Bioqumicos ou no link http://www.scielo.br/pdf/cta/v23n3/18834.pdf

    3) Quais as possveis fontes de erro na prtica em questo?

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 16

    3.2.4. Relatrio da Prtica 2 Componentes do Grupo: 1) Preencher os espaos abaixo, efetuando os clculos necessrios:

    Tubo ABS (540 nm) ABS mdia [glicose] (g/mL) 1

    2

    3

    4

    5

    2) Construir a curva padro de glicose: Abs x [glicose] g/mL, determinando o coeficiente

    angular e o fator da reta obtida.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 17

    4. ACCARES REDUTORES (AR) E ACARES REDUTORES TOTAIS (ART)

    A qualidade da cana-de-acar era determinada exclusivamente pela sacarose aparente

    (POL). Atualmente, englobam-se caractersticas fsico-qumicas e microbiolgicas dessa

    matria-prima, que podem afetar, significativamente, a recuperao deste acar na fbrica e a

    qualidade do produto final.

    Dois tipos de fatores afetam a qualidade da matria-prima destinada indstria:

    fatores intrnsecos: relacionados composio da cana (teores de sacarose, acares

    redutores, fibras, compostos fenlicos, amido, cido acontico e minerais), sendo estes

    afetados de acordo com a variedade da cana, variaes de clima (temperatura, umidade

    relativa do ar, chuva), solo e tratos culturais;

    fatores extrnsecos: relacionados a materiais estranhos ao colmo (terra, pedra, restos de

    cultura, plantas invasoras) ou compostos produzidos por microrganismos devido sua

    ao sobre os acares do colmo.

    Desta forma, existem indicadores que permitem avaliar tanto a riqueza da cana como a

    qualidade da mesma para a recuperao dos acares. A Figura 4.1 ilustra a coleta de amostras

    de cana para avaliao da sua qualidade. A Tabela 4.1 apresenta os principais indicadores da

    qualidade da cana.

    Figura 4. 1: Coleta de amostras de cana no caminho na entrada da empresa. Fonte: http://www.agencia.cnptia.embrapa.br/gestor/cana-de-cucar/arvore/

    CONTAG01_138_22122006154842.html

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 18

    Tabela 4. 1: Indicadores da qualidade e valores recomendados para a cana-de-acar.

    Fonte: Ripoli e Ripoli (2004).

    Abaixo, seguem as definies de alguns destes indicadores:

    POL: teor de sacarose aparente na cana. Para a indstria canavieira, quanto mais elevados os

    teores de sacarose, melhor.

    Pureza: determinada pela relao POL/Brix x 100. Quanto maior a pureza da cana, melhor a

    qualidade da matria-prima para se recuperar acar. Todas as substncias que apresentam

    atividade ptica podem interferir na POL, como acares redutores (glicose e frutose),

    polissacardeos e algumas protenas.

    ATR ou ART (Acares Redutores Totais): indicador que representa a quantidade total de

    acares da cana (sacarose, glicose e frutose). O ART determinado pela relao POL/0,95 mais

    o teor de acares redutores. A concentrao de acares na cana varia, em geral, dentro da faixa

    de 13 a 17,5%. Entretanto, importante lembrar que canas muito ricas e com baixa percentagem

    de fibras esto mais sujeitas a danos fsicos e ataque de pragas e microrganismos. Os estudos

    mostram que nas primeiras 14 horas de deteriorao da cana, 93% das perdas de sacarose foram

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 19

    devidas ao de microrganismos, 5,7% por reaes enzimticas e 1,3% por reaes qumicas,

    resultantes da acidez.

    Acares redutores: a quantidade de glicose e de frutose presentes na cana, que afetam

    diretamente a sua pureza, j que refletem em uma menor eficincia na recuperao da sacarose

    pela fbrica.

    A determinao de acares redutores pode ser realizada pelo mtodo de DNS,

    utilizando-se como padro a glicose. Na determinao de acares redutores totais, promove-se

    preliminarmente a hidrlise da sacarose com cido clordrico quente, como ser realizado na

    prtica 3.

    Referncias: RIPOLI, T. C. C.; RIPOLI, M. L. C. Biomassa de cana-de-acar: colheita, energia e

    ambiente. Piracicaba: Barros & Marques Ed. Eletrnica, 2004. 302 p. VIAN, Carlos Eduardo Freitas. Qualidade de matria-prima. Disponvel em: http://www.agencia.cnptia.embrapa.br/gestor/cana-de-acucar/arvore/CONTAG01_138_22122006154842.html. Acesso em: 10 Jul 2011.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 20

    4.1 Roteiro da Prtica 3 - Determinao de Acares Redutores (AR) e Acares Redutores Totais (ART) Material balo volumtrico de 500 mL 6 bales volumtricos de 100 mL pipetas volumtricas de 1, 2, 5, 10, 25 e

    50 mL provetas de 25 e 100 mL 8 tubos de ensaio com tampa de rosca Buretas de 10 e 50 mL Becher de 100 mL

    Equipamentos espectrofotmetro UV-

    Vis banho-maria termmetro

    Reagentes 100 mL de Caldo de cana HCl 1:1 NaOH 0,1 mol/L Reagente DNS Padro de glicose (aula

    anterior)

    Objetivo: Determinar a concentrao de sacarose, glicose e frutose presentes no caldo de cana.

    4.1.1. Determinao de Acares Redutores (AR)

    Diluir 1, 5 e 10 mL de caldo de cana in natura, ou melao, em bales volumtricos de

    100 mL.

    Pipetar 1 mL do caldo de cana, ou melao, diludo e transferir para tubo de ensaio com

    tampa, devidamente identificado. Guardar as amostras para dosagem posterior.

    4.1.2. Determinao de Acares Redutores Totais (ART)

    Diluir 50,00 mL de caldo de cana in natura, ou melao, em balo volumtrico de 500

    mL.

    Adicionar a seguir 70 mL de gua destilada. Inserir um termmetro no balo e levar o

    conjunto para banho-maria (~70C)

    Quando a temperatura da soluo atingir 65C, retirar o balo do banho-maria e

    adicionar imediatamente 25 mL de HCl 1:1. Homogenizar e deixar em repouso,

    temperatura ambiente, por 30 minutos.

    Aps este tempo, avolumar o balo at volume final.

    Transferir 2, 10 e 25 mL do hidrolisado diludo para bales volumtricos de 100 mL.

    Adicionar NaOH 0,1 mol/L at completar o volume do balo.

    Pipetar 1 mL de cada soluo acima para tubo de ensaio com tampa, devidamente

    identificado. Guardar as amostras para dosagem posterior.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 21

    4.1.3. Dosagem de acares pelo mtodo do DNS

    Preparar um padro de glicose, como na prtica anterior, para ler a absorbncia junto

    com as amostras.

    Proceder a dosagem de acares redutores (amostras do item 4.1) e redutores totais

    (amostras do item 4.2) pelo mtodo do DNS: adicionar 1 mL de DNS s amostras j

    colocadas nos tubos e levar ao banho-maria por 5 min. Deixar esfriar e completar com

    13 mL de gua destilada.

    Preparar amostra em branco (1 mL de gua + 1 mL de DNS).

    Proceder a leitura da absorbncia em espectrofotmetro em: = 540 nm.

    Se a absorbncia da amostra estiver fora da curva de calibrao, repetir o procedimento

    variando a diluio do hidrolisado.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 22

    4.1.4 Relatrio da Prtica 3 Componentes do Grupo: 1) Dados obtidos na Prtica:

    Diluio (AR) ABS (AR) Diliuo (ART) ABS (ART)

    Concentrao do Padro de Glicose (g/mL) = _____

    ABS do padro de glicose = _____

    2) Calcular o teor de sacarose e de acares redutores no caldo de cana (g/100mL) usando

    as seguintes equaes:

    % AR = (C x B x F x 10-4) / P ________ (g/100 mL)

    % ART = (A x B x F x 10-4) / P ________ (g/100 mL)

    % sacarose = [%ART - %AR] x 0,95 ________ (g/100 mL)

    onde: A = absorbncia da amostra processada conforme item 2. B = concentrao do padro de glicose em g/mL (ponto da curva de calibrao) C = absorbncia da amostra processada conforme item 1. P = absorbncia do padro de glicose (ponto da curva de calibrao) F = fator de diluio

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 23

    5. Grau Brix

    Uma das variveis agroindustriais mais facilmente determinadas em laboratrio ou

    mesmo em campo, o Brix. Quando se trata de cana madura existe estreita relao entre essa

    porcentagem e o contedo de sacarose na soluo. A cana considerada madura com Brix mnimo

    de 18 entre outros fatores. Por consenso, admite-se o Brix como sendo a porcentagem de slidos

    solveis contidos em uma soluo aucarada, ou seja:

    1 BRIX corresponde a 1 g de slidos dissolvidos em 100 g de soluo 20C

    Sendo a sacarose um dos slidos do caldo (80-90%), o aumento do seu contedo acaba

    por resultar em aumento do Brix do caldo. Portanto, em solues com alto teor de acares,

    como por exemplo o melao, o valor do Brix uma medida aproximada do teor de acares

    presentes no meio.

    A medida do Brix pode ser feita atravs de refratmetro ou pelo Sacarmetro de Brix, que

    que ser utilizado na prtica 4. A escala do Sacarmetro de Brix varia de 0 a 90 Brix com

    divises de 0,1 / 0,2 / 0,5 e 1 Brix.

    Referncias:

    DOUMER, M. E.; MARTINS, G. A.; MOREIRA, A. da S.; SILVA, S. D. dos A..

    Avaliao de graus brix de cana-de-acar (Saccharum spp.) da parte inferior e

    superior de colmos. Disponvel em:

    http://www.ucpel.tche.br/cic/cdcic2009/pdfs/1464.pdf Acessado em: mai 2011.

    INCOTERM. Instrues de Uso do sacarmetro de Brix. Disponvel em:

    http://www.incoterm.com.br/download_anexo/5733_MANUAL.pdf. Acesso em mai

    2011.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 24

    5.1 Roteiro da Prtica 4 - Determinao do BRIX Material proveta de 500 mL

    Equipamentos sacarmetro de Brix termmetro

    Reagentes 500 mL de Caldo de cana

    Objetivo: Determinar o teor de slidos dissolvidos em uma soluo, atravs da medida da

    densidade utilizando o sacarmetro de BRIX.

    5.1.1. Procedimento

    Transferir o caldo de cana ou melao para a proveta de 500 mL

    Mergulhar o sacarmetro de BRIX cuidadosamente, de modo a no umedecer a haste

    acima do lquido. Deixar o instrumento flutuar livremente e no deixar tocar nas

    paredes ou no fundo da proveta. Aguardar 5 minutos.

    Proceder a leitura olhando em nvel com a superfcie da soluo, anotando o valor do

    BRIX.

    Verificar a temperatura da soluo.

    Efetuar as correes, utilizando a tabela 5.1. A correo aditiva quando a temperatura

    da soluo for maior do que a temperatura padro (20C) e subtrativa quando a

    temperatura da soluo for menor do que a temperatura padro.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 25

    5.1.2. Relatrio da Prtica 4 Componentes do Grupo: Leitura no sacarmetro (BRIX): _____ B temperatura padro 20C Temperatura da soluo: _____C Fator de correo: ______ BRIX = leitura no sacarmetro +/- fator de correo: ______ B Tabela 5. 1: Tabela de Correo para Grau Brix

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 26

    5. Cintica do Crescimento Microbiano

    Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do nmero de clulas e

    no ao aumento das dimenses celulares. Quando se estuda a cintica de crescimento a escolha

    da tcnica de quantificao microbiana um parmetro importante, pois dela depende os

    clculos que sero realizados. importante tambm se determinar a taxa de crescimento

    microbiano e o tempo de gerao do micro-organismo em estudo, nas condies de processo

    utilizadas.

    A Taxa de crescimento (velocidade especfica de crescimento) a variao no nmero

    ou massa de microrganismos por unidade de tempo.

    Define-se Tempo de gerao como o intervalo de tempo necessrio para que uma clula

    se duplique. O tempo de gerao varivel para os diferentes organismos, podendo ser de 10 a

    20 minutos at dias, sendo que em muitos dos organismos conhecidos, este varia de 1 a 3 horas.

    O tempo de gerao no corresponde a um parmetro absoluto, uma vez que dependente de

    fatores genticos e nutricionais, indicando o estado fisiolgico da cultura.

    O conhecimento da cintica de um processo ou da cintica de crescimento microbiano

    importante industrialmente, pois permite a anlise de perigos e pontos crticos do processo

    (APPCC); previso de eventos fora do processo; determinao de vida-de-prateleira; anlise de

    Risco.

    Na Figura 5.1 mostrada uma curva tpica de crescimento microbiano. O crescimento

    microbiano pode apresentar quatro fases distintas, a saber:

    Fase Lag ou de Adaptao - fase de adaptao metablica ao novo ambiente, onde

    ocorre rearranjo do sistema enzimtico (sntese de enzimas), traumas fsicos (choque

    trmico, radiao, entre outros) e traumas qumicos (produtos txicos, meio de cultura).

    O nmero de indivduos no aumenta nesta fase, podendo at mesmo decrescer. A

    durao dessa fase depende das condies ambientais nas quais as clulas se encontravam

    anteriormente.

    Fase Log ou Exponencial - Nesta etapa, as clulas esto plenamente adaptadas,

    absorvendo os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. Fase

    na qual o nmero de clulas da populao dobra a cada gerao. A taxa de

    crescimento exponencial varivel, de acordo com o tempo de gerao do organismo em

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 27

    questo. Geralmente, procariotos crescem mais rapidamente que eucariotos. Esta taxa de

    crescimento no pode ser mantida indefinidamente em um sistema fechado. Aps um

    determinado perodo de crescimento exponencial, as condies ambientais tornam-se

    desfavorveis pela escassez de nutrientes essenciais, acmulo de metablitos txicos e

    limitao de espao. A taxa de crescimento da populao diminui e segue-se a fase

    estacionria.

    Fase Estacionria - Fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente

    devido s condies limitantes do meio. As clulas continuam metabolizando e se

    dividindo, mas parte das clulas torna-se invivel e a taxa de diviso celular muito

    prxima da taxa de morte celular, o que mantm constante o nmero de clulas viveis

    na populao. A curva de crescimento atinge um plat. A durao da fase estacionria

    depende do balano entre a taxa de diviso celular e o nmero de clulas que vo se

    tornando inviveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido s condies

    ambientais tornarem-se progressivamente desfavorveis. na fase estacionria que so

    sintetizados vrios metablitos secundrios, que incluem antibiticos e algumas enzimas.

    Nesta etapa ocorre tambm a esporulao das bactrias.

    Fase de Declnio ou de Morte - Fase de declnio exponencial do nmero de clulas

    viveis: a taxa de morte celular torna-se maior que a taxa de diviso. O nmero de clulas

    viveis entra em declnio progressivo at a completa extino da populao.

    Figura 5. 1: Curva caracterstica do crescimento celular de um micro-organismo

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 28

    Leitura Complementar: STREMEL, D. S., VIDAURRE, T.C., SILVA, F.S., KELLER, L.E. Estudo da cintica

    de crescimento microbiano do Bacillus subtilis em meio alternativo na produo de Biocontrolador de fungos fitopatognicos. XVIII Congresso Regional De Iniciao Cientfica e Tecnolgica.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 29

    5.1 Roteiro da Prtica 5 - Cintica do Crescimento de Clulas de Leveduras Material pipetas volumtricas de 1, 2, 3, 5 mL pipetas graduadas de 5, 10 e 25 mL proveta de 100 mL 5 Becher de 50 ou 100 mL 8 tubos com tampa de rosca 1 Erlenmeyer de 250 mL Basto de vidro

    Equipamentos espectrofotmetro UV-Vis agitador tipo shaker balana

    Reagentes fermento biolgico extrato de lvedo glicose KH2PO4 (NH2)2SO4

    Objetivo: Determinar a taxa especfica de crescimento de clulas de levedura em meio sinttico

    (YED 2%).

    5.1.1. Preparo da soluo de YED 2% e inoculao das clulas

    Preparar a soluo de YED em erlenmeyer de 250 mL: 1 g de extrato de lvedo, 2 g de

    glicose, 0,2 g de KH2PO4 e 0,2 g de (NH4)2SO4. Acrescentar 100 mL de gua destilada

    e solubilizar todos os reagentes.

    Pesar entre 90 e 100 mg de fermento biolgico. Anotar a massa.

    Inocular o meio sinttico transferindo o fermento para a soluo de YED 2%, com o

    auxlio da prpria soluo.

    Colocar o erlenmeyer em agitador tipo shaker e iniciar agitao contnua.

    5.1.2. Determinao da concentrao de biomassa (X)

    Aps inocular as clulas, retirar uma alquota de 3 mL.

    Transferir um pouco da amostra para a cubeta e proceder a determinao de biomassa

    em 570 nm, utilizando a curva de quantificao de micro-organismos.

    Se a absorbncia for maior do que o ltimo ponto da curva, proceder diluio da

    mesma.

    Repetir o procedimento, retirando alquotas a intervalos de 30 min, aumentando a

    diluio, se necessrio.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 30

    5.1.3. Relatrio DA Prtica 5 Componentes do Grupo: 1) Determinao da concentrao de biomassa (X)

    Tempo (h)

    Absorbncia (570 nm)

    diluio [biomassa] (g/ mL)

    0 1 2 3 4

    2) Construir a curva de crescimento: (i) [biomassa] x tempo, (ii) Ln [biomassa] x tempo. 3) Determinar a taxa especfica de crescimento (X) das clulas de levedura em meio YED.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 31

    6. Produo de Etanol

    O lcool (etanol) pode ser obtido de diversas formas de biomassa, sendo a canade-acar

    a realidade econmica atual. Investimentos portentosos esto sendo efetuados para viabilizar a

    produo de lcool a partir de celulose, sendo estimado que, em 2020, cerca de 30 bilhes de

    litros de lcool poderiam ser obtidos desta fonte, apenas nos EUA. O benefcio ambiental

    associado ao uso de lcool enorme, pois cerca de 2,3 t de CO2 deixam de ser emitidas para cada

    tonelada de lcool combustvel utilizado, sem considerar outras emisses, como o SO2.

    A cana-de-acar a segunda maior fonte de energia renovvel do Brasil com 12,6% de

    participao na matriz energtica atual, considerando-se o lcool combustvel e a co-gerao de

    eletricidade, a partir do bagao. Dos 6 milhes de hectares, cerca de 85% da cana-de-acar

    produzida no Brasil est na Regio Centro-Sul (concentrada em So Paulo, com 60% da

    produo) e os 15% restantes na regio Norte-Nordeste.

    Na safra 2004, das cerca de 380 milhes de toneladas modas, aproximadamente 48%

    foram destinadas produo de etanol. O bagao remanescente da moagem queimado nas

    caldeiras das usinas, tornando-as auto-suficientes em energia e, em muitos casos, superavitrias

    em energia eltrica que pode ser comercializada. No total foram produzidos 15,2 bilhes de litros

    de etanol e uma gerao de energia eltrica superior a 4 GWh durante a safra, o que representa

    aproximadamente 3% da nossa gerao anual.

    O etanol um produto da fermentao do acar, mais freqente entre os micro-

    organismos. As principais produtoras de lcool so as leveduras principalmente linhagens de

    Saccharomyces cerevisae. As leveduras so, como na maioria dos fungos, organismos aerbicos.

    No entanto, sob condies de anaerobiose fermentam carboidratos etano e gs carbnico.

    C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2

    A fermentao da glicose etanol e gs carbnico pela levedura Saccharomyces

    cerevisae segue o caminho da frutose bifosfato. A transformao de piruvato etanol resume-se

    em duas etapas. Primeiro, o piruvato descarboxilado a acetaldedo sob ao da piruvato-

    descarboxilase (e cooperao da tiaminopirofosfato). O acetaldedo , em seguida, reduzido a

    etanol pela lcool-desidrogenase com NADH2.

    Referncias:

    http://www.biodieselbr.com/energia/alcool/etanol.htm

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 32

    6.1 Roteiro da Prtica 6 - Produo de Etanol em caldo de cana-de-acar Material 2 Erlenmeyer de 500 mL Proveta de 200 mL 2 Becher de 50 mL Becher de 100 mL Basto de vidro Fermentmetro

    Equipamentos balana

    Reagentes 350 mL de Caldo de cana 60 g de fermento biolgico NaF

    Objetivo: Produzir etanol utilizando caldo de cana como matria prima e observar as fases da

    fermentao alcolica.

    6.1.1. Fermentao

    Pesar cerca de 25 g de fermento biolgico em becher.

    Transferir 150 mL de caldo de cana para o erlenmeyer de 500 mL.

    Acrescentar o fermento biolgico previamente pesado e adaptar o fermentmetro.

    Anotar a massa total do conjunto (m).

    Deixar que a fermentao se processe, pesando e anotando a massa do conjunto a cada

    30 min.

    6.1.2. Inibio da fermentao por NaF (inibidor da enolase)

    Repetir o procedimento do item 6.1, acrescentando-se ao caldo de cana 0,315 g de NaF.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 33

    6.1.3. Relatrio da Prtica 6 Componentes do Grupo: 1) Para os procedimentos 6.1 e 6.2, responda:

    a) Qual a quantidade de gs carbnico produzido? b) Qual a quantidade de etanol produzido? c) Qual a quantidade de glicose consumida?

    2) Calcule o grau de inibio provocado pelo NaF.

    3) Calcule o rendimento e a eficincia da fermentao. Dado: rendimento terico = 0,511

    4) Construa o grfico SCO2 x t, Setanol x t.

    5) Pesquise a funo da enzima enolase.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 34

    6.2 Roteiro da Prtica 7 - Produo de Etanol em YED a 2% Material Parte 1: Erlenmeyer de 250 mL Provetas de 50 e 100 mL Pipeta volumtrica de 1 mL 2 Becher de 50 e 100 mL 10 tubos com tampa de rosca 3 tubos de centrfuga 4 bales volumtricos de 250 mL 2 bales volumtricos de 100 mL Basto de vidro Pipeta graduada de 5 mL Bureta de 25 mL Parte 2: Pipetas graduadas de 1, 5 e 10 mL 3 Erlenmeyer com tampa de borracha Proveta de 200 ou 250 mL Proveta de 25 mL ou pipeta graduada de

    20 mL Bureta de 25 mL

    Equipamentos Parte 1: Balana Espectrofotmetro Destilador centrfuga

    Reagentes Parte 1: 60 g de fermento

    biolgico Glicose Padro de glicose de

    10 mol/mL DNS Extrato de lvedo KH2PO4 (NH4)2SO4 NaOH 0,1 N

    Parte 2: Padro de dicromato de

    potssio H2SO4 concentrado H3PO4 85 % Indicador Sulfato ferroso amoniacal

    Objetivo: Calcular a eficincia de uma fermentao de glicose por clulas de leveduras atravs

    da medida da produo de etanol e do consumo de glicose.

    6.2.1. Preparo da soluo de YED 2%

    Colocar em um erlenmeyer de 250 mL: 1 g de extrato de lvedo, 2 g de glicose, 0,2 g de

    KH2PO4 e 0,2 g de (NH4)2SO4. Acrescentar 100 mL de gua destilada e solubilizar todos

    os reagentes.

    Retirar uma alquota de 3 mL para a dosagem de acar pelo mtodo do DNS.

    6.2.2. Produo de clulas e de etanol e consumo de glicose

    Inocular o erlenmeyer de 250 ml, contendo YED com 20 % (pu/v) de clulas. Agitar e

    imediatamente retirar uma alquota de 1,0 ml (tempo 0) e verter para balo volumtrico

    de 250 mL, completando com gua destilada. Fazer a leitura da ABS a 570 nm (dosagem

    de clulas).

    Manter o mosto inoculado agitando periodicamente por 1 h.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 35

    Aps 1 h de fermentao, retirar alquota de 3 ml para determinao da concentrao

    celular. Diluir a amostra 1:250 e ler a ABS a 570 nm.

    Centrifugar cerca de 30 ml do meio fermentado. Recolher o sobrenadante (tempo 1 h).

    Do sobrenadante, guardar 5 ml para determinao do teor de acar e colocar 10 ml no

    compartimento do destilador.

    No destilador, adicionar em seguida 10 ml de H2O e 0,5 ml de NaOH 0,1 N. Fechar o

    sistema e recolher os 8 ml iniciais do destilado. Completar este volume a 10 ml com

    exatido. Congelar a amostra para posterior determinao do teor de etanol pelo mtodo

    do dicromato.

    Diluir 100 vezes uma alquota dos sobrenadantes (tempos 0 e 1 h) e determinar a

    quantidade de glicose pelo mtodo do DNS.

    6.2.3. Determinao do lcool pelo mtodo do dicromato

    Colocar 10 ml de soluo de dicromato em 3 frascos cnicos e adicionar, em seguida,

    5 ml de H2SO4 concentrado, resfriando-se em gua da torneira.

    Colocar em cada frasco 5,0, 2,5 e 1,0 ml do destilado e completar o volume a 5,0 ml de

    gua, quando for o caso.

    Agitar e aguardar, em repouso, durante 15 min para o etanol ser quantitativamente levado

    a cido actico.

    Aps 15 min, adicionar 165 ml de gua destilada, 18 ml de cido fosfrico e 0,5 ml de

    indicador.

    Titular com sulfato ferroso amoniacal at a cor da soluo mudar de prpura para verde e

    anotar o volume consumido (n).

    Para o ensaio em branco adicionar 5 ml de gua destilada no lugar da amostra e repetir o

    procedimento. Anotar o volume consumido (N).

    Clculos: Alquota de 5 ml do destilado A = 2 (1 n/N) Alquota de 2,5 ml do destilado A = 4 (1 n/N) Alquota de 5 ml do destilado A = 10 (1 n/N) Onde A = concentrao de etanol na amostra original (%)

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 36

    6.3.4. Relatrio da Prtica 7 Componentes do Grupo: 1) Calcular as concentraes de glicose e de clulas para os tempos 0 e 1 h. 2) Calcular a massa de etanol formado. 3) Calcular o rendimento e a eficincia da fermentao a partir dos resultados.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 37

    7. Acidez de vinhos

    Sabe-se que a acidez dos vinhos se deve a presena de cidos como o tartrico, mlico e

    ctrico, entre os mais importantes. Estes cidos garantem a conservao do vinho bem como

    outras caractersticas de suma importncia. O grau de acidez est tambm relacionado com a

    acidez total titulvel, o pH, a quantidade de cidos dissociados e no dissociados, e a quantidade

    relativa de cada um dos cidos presentes.

    Dentro dos padres comerciais, a acidez do sumo fica no intervalo de 0,6 a 0,9 %

    (expresso como a quantidade de cido tartrico por 100ml de sumo ou vinho). Os vinhos doces

    tm acidez no intervalo de 0,4 a 0,65%. Na fabricao do vinho importante saber a acidez

    titulvel do mostro para poder determinar a quantidade correta de dixido de enxofre que ser

    adicionada e tambm decidir se ou no necessria uma correo da acidez.

    A acidez titulvel do vinho normalmente expressa em cido tartrico % (m/v); massa

    molar do C2H4O2(COOH)2 = 150,09g/mol. Lembrar que o cido tartrico tem dois hidrognios

    titulveis ate a viragem da fenolftalena.

    cido tartrico ( g/100mL) = (Vb).(C NaOH).( 150,09).(100)

    (1000).2.(Vam) onde: Vb o volume, em mL, da soluo de NaOH usada na titulao. C NaOH a concentrao da soluo de NaOH, em mol/L. Vam o volume, em mL, da amostra titulada.

    Esta determinao est sujeita interferncia do CO2 dissolvido. Este erro pode ser

    minimizado diluindo o vinho com gua quente, prximo da fervura, e depois deixando esfriar at

    a temperatura ambiente antes de titular. Geralmente esse erro pequeno.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 38

    7.1. Roteiro da Prtica 8 - Determinao da acidez total de vinhos Material

    2 Erlenmeyers de 250 mL 1 Becher de 100 mL Pipeta volumtrica de 25 mL

    Reagentes

    Vinhos branco e tinto secos gua destilada Soluo alcolica de fenolftalena a 1% NaOH 0,1 M

    Objetivo: determinar a acidez titulvel do vinho branco e tinto. O cido tartrico expressa a acidez titulvel do vinho. Esta expresso pode ser obtida por meio de uma equao que determina a concentrao do cido tartrico em g/mL. 7.1.1. Procedimento

    Transferir 25 mL de vinho branco seco para um erlenmeyer de 250 mL. Adicionar 100 mL de gua deionizada e 5 gotas de soluo alcolica de fenolftalena a

    1%. Titular com uma soluo padro de NaOH 0,1M. O ponto final indicado pela permanncia de uma leve cor rsea por mais de 30

    segundos. Repetir o procedimento acima para o vinho tinto, com o cuidado de que o ponto final

    evidenciado pelo aparecimento de uma cor cinza-esverdeada.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 39

    7.1.2.Relatrio da Prtica 8 Componentes do Grupo:

    1) Calcule a acidez do vinho analisado.

    2) Determine o erro da anlise, comparando o valor obtido com o contido no rtulo.

    3) Compare com os valores comerciais.

  • Apostila das aulas prticas de Processos Bioqumicos

    Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 40

    8. Preparo de Solues e Indicadores

    Reagente DNS

    Preparar separadamente, por dissoluo quente e a agitao, as solues abaixo:

    - 10g cido 3,5-dinitro saliclico em 200 mL NaOH 2 mol/L (fica uma massa pastosa)

    - 300 g tartarato duplo de sdio e potssio (C4H4O6.Na.K.4H2O) em 500 mL gua destilada

    Misturar as duas solues e completar o volume a 1000 mL com gua destilada aquecida.

    Meio sinttico YED 2%

    Solubilizar em gua destilada o extrato de lvedo (1%), glicose (2%), KH2PO4 (0,2%) e

    (NH4)2SO4 (0,2%)

    Indicador: 0,25 g de sal de brio do cido 4-difenilalanina-sulfnico dissolvido, com

    leve aquecimento, em 50 ml de gua. Filtrar em papel de filtro faixa azul. Lquido

    sobrenadante usado.

    Soluo padro de dicromato de potssio: 8,454 g K2Cr2O7 dissolvidos em gua,

    completado a 250 mL.

    Soluo de sulfato ferroso amoniacal: 67,55 de FeSO4(NH4)2SO4.6H2O, dissolvido em

    300 mL de gua e 10 mL de H2SO4 concentrado. Filtrar em papel faixa azul para balo de

    500 mL e completar o volume com gua destilada.