Apostila Tecnicas Laboratoriais

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Programação de aulas práticas de DQA 111 para o 1.º semestre de 2003 Mês Dias Assunto Aula Fev. 19 e 21 Informações Gerais 1 26 e 28 Microscopia I 2 Mar. 7 e 12 Microscopia II - (*) Relatório 1 3 14 e 19 Técnicas de preparação de lâminas – Uso de corantes 4 21 e 26 Técnica do esfregaço – Coloração de Gram 5 28 e 2/4 Técnica de cortes histológicos 6 Abr. 3 a 21 P e r í o d o d e P r o v a s P 1 23 e 25 Observação de grãos de amido 7 30 e 2/5 Observação de ciclose e plasmólise – (*) Relatório 2 8 Mai. 7 e 9 Observação de bactérias a fresco. Inoculação. 9 14 e 16 Observação de culturas. Coloração de Gram. 10 21 e 23 Inoculação de fungos (tec. "aquário”) 11 28 e 30 Observação e identificação de fungos – (*) Relatório 3 12 Jun. 4 e 6 Avaliação Prática de Laboratório I. 13 11 ou 12 Avaliação Teórica de Laboratório I. 14 1 6 a 30 P e r í o d o d e P r o v a s P 2 DQA 111 - Biologia e Microbiologia 1

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Programação de aulas práticas de DQA 111 para o 1.º semestre de 2003

Mês Dias Assunto AulaFev. 19 e 21 Informações Gerais 1

26 e 28 Microscopia I 2Mar. 7 e 12 Microscopia II - (*) Relatório 1 3

14 e 19 Técnicas de preparação de lâminas – Uso de corantes 421 e 26 Técnica do esfregaço – Coloração de Gram 528 e 2/4 Técnica de cortes histológicos 6

Abr. 3 a 21 P e r í o d o d e P r o v a s – P 123 e 25 Observação de grãos de amido 730 e 2/5 Observação de ciclose e plasmólise – (*) Relatório 2 8

Mai. 7 e 9 Observação de bactérias a fresco. Inoculação. 914 e 16 Observação de culturas. Coloração de Gram. 1021 e 23 Inoculação de fungos (tec. "aquário”) 1128 e 30 Observação e identificação de fungos – (*) Relatório 3 12

Jun. 4 e 6 Avaliação Prática de Laboratório I. 1311 ou 12 Avaliação Teórica de Laboratório I. 14

1 6 a 30 P e r í o d o d e P r o v a s – P 2

Dia da Semana Turma Horário Quartas-feiras Lab. 3 7h30 – 9h10 Quartas-feiras Lab. 1 9h20 – 11h00 Quartas-feiras Lab. 2 11h10 – 12h50 Sextas – feiras Lab. 4 10h10 – 11h50 Aulas na sala J 204, Laboratório de Biologia e MicrobiologiaObrigatório o uso de avental

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Informações sobre o funcionamento do laboratório de Biologia e Microbiologia

1. Sistema de Avaliação

A média semestral de trabalhos (MT1 e MT2) será proveniente da média aritmética ponderada de três notas, a saber:

Nota da avaliação prática individual semestral – com peso de 40% , a ser realizada no horário normal de laboratório, nas últimas semanas do primeiro e segundo semestres, conforme a programação fornecida.

Nota da avaliação teórica individual semestral – com peso de 40% , a ser realizada no horário da última aula teórica de cada semestre.

Média das notas dos Relatórios – com peso de 20 % , que serão solicitados durante o ano, conforme o andamento das aulas.

Atenção: Não haverá Avaliação Substitutiva nem para a Avaliação Prática, nem para a Avaliação Teórica. Casos não previstos deverão ser encaminhados aos Professores para a busca de uma solução.

2. Uso do Laboratório

2.1. O laboratório é dotado de um escaninho para a guarda de material como bolsas, pastas e mochilas. Logo ao entrar no laboratório, o aluno deverá guardar seus pertences num local desocupado, levando para a bancada de trabalho apenas o material referente à aula, como apostila, caderno e materiais para apontamento. É conveniente desligar aparelhos telefônicos celulares. Caso o aluno esteja esperando uma ligação importante, deverá levar o celular consigo para que atenda a chamada imediatamente.

2.2. O uso do avental é obrigatório. O aluno deve vesti-lo logo ao chegar ao seu local de trabalho. Após, o aluno deve lavar as mãos com sabão bactericida disponível no laboratório. Ao final da aula é obrigatória a lavagem das mãos, por motivos de segurança.

2.3. Após colocar o avental, as pessoas que tenham cabelos compridos, deverão prendê-los por motivo de segurança (uso de fogo).

2.4. Sobre a bancada de trabalho haverá um pulverizador com álcool etílico e um pano descartável. A área de trabalho deverá ser pulverizada com álcool e limpa com o pano fornecido, sempre ao início e também ao final de cada sessão de trabalho. Ou seja,

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SEMPRE, no trabalho em biologia e microbiologia, a PRIMEIRA e a ÚLTIMA coisa a ser feita é a descontaminação da área de trabalho.

2.5. O aluno encontrará uma caixa contendo um conjunto de objetos de uso comum para as disciplinas de Biologia e Microbiologia de Alimentos. Esses objetos serão usados em diversas ocasiões durante o ano, conforme a necessidade. É dever do aluno verificar a integridade do material recebido e comunicar ao Professor qualquer irregularidade encontrada. De acordo com orientação do Professor, o aluno retirará da caixa os materiais necessários à aula para uso. Ao final da aula, os materiais removidos serão devolvidos e a caixa fechada, para uso do próximo grupo. Os demais materiais necessários à aula serão colocados sobre a bancada pelo Laboratorista.

2.6. Debaixo da sua bancada de trabalho, o aluno encontrará um armário onde existe um microscópio binocular para uso em grupo e também um conjunto de corante para a execução da técnica de coloração de Gram, que deverá ser compartilhado com os colegas da “ilha” de trabalho. Também encontrará um recipiente de vidro destinado à coloração de lâminas. Qualquer irregularidade deverá ser sempre comunicada ao Professor.

2.7. Cada aluno deverá possuir uma caneta capaz de escrever em vidro (caneta de retroprojetor ou específica para vidraria de laboratório). Ou seja, é uma caneta por aluno e não uma caneta por grupo.

3. Identificação de Placas de Petri e de Tubos

A disciplina utiliza um sistema de identificação da vidraria utilizada pelos grupos durante as experiências, que consta de um código composto por duas letras e três conjuntos de números, como demonstrado a seguir.

As letras a serem escritas são “BM” – iniciais de Biologia e Microbiologia, e que diferenciará o material de seus alunos do material de alunos de outras disciplinas, que compartilhem as estufas.

O primeiro número indicará o dia da semana da aula :2, para Segunda-feira; 3, para Terça-feira; 4, para Quarta-feira; 5, para Quinta-feira e, 6, para Sexta-feira.

O segundo número indicará o horário de início da aula. Por exemplo, 13h50min será escrito 1350.

E finalmente, o terceiro número será indicador do grupo de trabalho. Esse número consta na caixa de energia de cada “ilha” de trabalho, identificando os grupos, de 1 até 10.

Por exemplo, o código BM4730-2 numa placa ou num tubo de ensaio, indicará para o Professor ou Laboratorista, que se trata de um material do Grupo 2, da Turma das 7h30min da Quarta-feira, de Biologia e Microbiologia. O código BM313-7 indicará o material do Grupo 7, das 13h00, da Terça-feira e assim por diante.

4. Localização da Identificação nas Placas de Petri

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O código de identificação deverá ser escrito na TAMPA ou na borda externa da TAMPA da placa de Petri. O fundo da placa deverá ser reservado para indicar divisões de setores .

Estas informações foram retiradas da apostila de Microbiologia de Alimentos, de C. J. Kunigk e E. Tríboli (2001).

TÍTULO : MICROSCOPIA I

Material :

microscópio

Procedimento :

Retire o microscópio de seu estojo e coloque-o sobre a mesa Se o microscópio estiver desmontado, siga as instruções para sua montagem

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Observe a figura abaixo e procure identificar todas as suas partes

TÉCNICA DE UTILIZAÇÃO E CUIDADOS

A primeira regra a ser observada é carregar corretamente o microscópio. Deve-se segurar o braço com uma das mãos e apoiar o pé sobre a outra mão, mantendo-se o aparelho na posição vertical. Fora dessa posição, partes ópticas podem soltar-se e cair, com conseqüências desastrosas. Choques devem ser evitados, pois os eixos dos sistemas

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ópticos podem sair de concordância inutilizando parcialmente o aparelho. Cuidados devem ser tomados para não arranhar as lentes.

Outra recomendação importante é iniciar o trabalho limpando o microscópio não só para obter bons resultados como também para aumentar a sua durabilidade; a poeira é grande inimiga dos instrumentos ópticos. As partes mecânicas podem ser limpas com um pano macio e, o aparelho e as lentes com papel absorvente macio.

Deve-se cuidar, a seguir, da iluminação. O diafragma deve ser aberto e o condensador deve ser aproximado da platina (ou prato). Agora, com a objetiva de menor aumento, e por meio do parafuso macrométrico baixa-se o tubo do microscópio (ou eleva-se a platina) até que a objetiva fique próxima da platina e, olhando através das oculares abaixar o tubo (ou elevar a platina ) até obter iluminação forte e uniforme do campo.

A operação seguinte é subir o tubo (ou abaixar a platina) e colocar a lâmina com a preparação sobre a platina. Olhando por fora do aparelho, baixa-se a objetiva até alguns milímetros da preparação e, em seguida, olhando pelas oculares, sobe-se o tubo ( ou abaixa-se a platina) cuidadosamente até observar uma imagem mais ou menos nítida, sempre utilizando o parafuso macrométrico. Por fim, utilizando o parafuso micrométrico, faz-se a focalização fina, isto é, procura-se maior nitidez possível da imagem.

TÍTULO : MICROSCOPIA II : PREPARANDO MATERIAL PARA EXAME

Material :

água

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conta-gotas folha de jornal tesoura lâmina, lamínula papel macio

Procedimento :

Com um papel macio dobrado limpe bem uma lâmina e uma lamínula Coloque lâmina e lamínula limpas sobre o papel, segurando-as sempre pelos bordos,

para não deixar marcas de dedos na superfície do vidro Recorte as letras A, O, E e F da folha de jornal Coloque no centro da lâmina os quadradinhos de papel contendo as letras voltadas

para cima, uma ao lado da outra Pingue sobre elas uma ou duas gotas de água e acrescente a lamínula sem deixar

bolhas de ar retidas na preparação Se a água extravasar para fora da lamínula, enxugue o excesso com papel-filtro

Focalizando a preparação:

Gire o macrométrico para elevar o tubo do microscópio (ou abaixar o prato) e coloque a objetiva de menor aumento em posição. Deixe um espaço entre a objetiva e o prato

Coloque a preparação sobre o prato de modo que a letra O fique bem no centro do orifício deste e prenda com a presilha

Gire novamente o macrométrico para abaixar o tubo (ou levantar o prato), deixando a objetiva o mais perto possível da lamínula, mas sem tocá-la

Olhe agora pelas oculares e gire o macrométrico lentamente para levantar o tubo do microscópio (ou abaixar o prato) até encontrar a imagem da letra impressa no papel. Se você assim o fizer e não conseguir localizar a imagem, não force o tubo. Retorne ao ítem anterior e tente novamente. Depois de localizada a imagem você deve fazer a focalização micrométrica. Há diferença entre a letra O quando vista diretamente e quando vista através da ocular ? Qual ?

Mova vagarosamente a lâmina da direita para a esquerda, para cima e para baixo. Registre

Desloque a lâmina, colocando a letra A ( e repita depois para as letras E e F). O que ocorre com a imagem da(s) letra(s) ?

Focalize agora as letras com a objetiva de aumento médio e depois com a objetiva de maior aumento.

Ao focalizar qualquer material com estas objetivas tome cuidado para não abaixar o tubo do microscópio (ou levantar o prato) enquanto estiver olhando pela ocular. Isto poderá resultar em quebra da lâmina, inutilizando sua preparação.

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TÍTULO : OBSERVAÇÃO DE CÉLULAS DA MUCOSA BUCAL E DO EPITÉLIO DE CEBOLA

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Material :

microscópio lâmina, lamínula papel absorvente palito de dente pinça faca cebola azul de metileno lugol fucsina água conta-gotas

Procedimento :

LÂMINA 1: Mucosa bucal

Com o palito, raspe, cuidadosamente, a parte interna de sua boca Coloque o material que está na ponta do palito numa lâmina que contenha uma gota de

água Espalhe, suavemente, o material e cubra com lamínula Observe ao microscópio e procure identificar as células Sem retirar a lâmina do microscópio, e observando através das oculares, coloque uma

gotas de azul de metileno junto à lamínula No lado oposto da lamínula encoste um pedaço de papel absorvente para absorver a

água e “puxar” o corante. Observe

LÂMINA 2 : Epitélio de cebola

Corte uma cebola ao meio e observe a disposição das escamas Corte-a, novamente ao meio, e separe as escamas Pegue uma das escamas e faça, na parte côncava um leve corte transversal e, com

uma pinça, retire uma finíssima película que reveste internamente a escama Coloque uma gota de água numa lâmina e sobre esta o pedacinho da epiderme que

você retirou da escama Cubra com uma lamínula e retire o excesso de água Observe ao microscópio Sem retirar a lâmina do microscópio, e observando através das oculares, coloque uma

gota de fucsina junto à lamínula No lado oposto da lamínula encoste um pedaço de papel filtro para absorver a água e

assim entrar o corante Observe Faça uma nova preparação, porém ao invés da fucsina utilize lugol.

Responda :

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Você conseguiu observar as células nos dois materiais com a mesma facilidade ? Por quê ?

Qual o aspecto geral do material da lâmina 1 e da lâmina 2 ? Você observou núcleo e nucléolo nos dois materiais ?

Após a observação dos 2 materiais, complete o quadro abaixo:

Observação ao microscópio Lâmina 1 : Mucosa Bucal Lâmina 2 : Epitélio de cebola

SEM CORANTE núcleo

nucléolo

membrana plasmática parede celular

COM CORANTE azul de metileno fucsina lugol núcleo

nucléolo

membrana plasmática parede celular

DESENHO

Você observou dois materiais, sendo um de origem animal e outro de origem vegetal

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A partir das observações microscópicas feitas como você identificaria um tecido animal e o diferenciaria de outro vegetal ?

TÍTULO : ESFREGAÇO DE SALIVA - OBSERVAÇÃO DE BACTÉRIAS

Material :

lâmina microscópio palito de dente bico de Bunsen água bateria de Gram : violeta genciana, fucsina, lugol óleo de imersão papel filtro suporte para coloração álcool 95 %

Procedimento :

Com o auxílio de um palito de dente coletar o material existente na base dos dentes Espalhar o material na lâmina, suavemente Secar à temperatura ambiente Observe o material, a fresco, no microscópio (1) Preparar novo material. Secar à temperatura ambiente Passar, rapidamente, por 3 vezes, na chama do bico de Bunsen, para fixar o material A seguir, colocar a lâmina no suporte para proceder à coloração Cobrir o esfregaço com violeta genciana, por um minuto Inverter a lâmina para escorrer o corante. Cobrir com lugol, por um minuto e escorrer. Agora, gotejamos álcool 95 % sobre o esfregaço, até não sair mais corante Lavar, levemente, com água Cobrir com fucsina por 30 segundos e retirar o corante, escorrendo-o Lavar com água Secar, suavemente, com papel filtro Após a secagem, observar ao microscópio em vários aumentos Por último, acrescentar uma gota de óleo de imersão e observar com a objetiva

apropriada

Responda :

Qual a função de cada corante e do lugol nessa técnica ? Que tipos de bactérias puderam ser observadas nessa preparação ?

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TÍTULO : CORTES HISTOLÓGICOS

Material :

lâmina de gilete nova medula de sabugueiro ou de hortência lâmina, lamínula água conta-gotas papel-filtro caule, raiz ou folha

Procedimento :

Corte a medula ao meio, no sentido longitudinal Entre as duas metades coloque um pedaço do material que se quer observar Ponha uma gota de água no centro de diversas lâminas limpas Corte fatias finas Transfira os cortes para a gota de água, um corte para cada lâmina, desprezando os

cortes pouco finos Cubra o material com lamínula Retire, com papel-filtro, o excesso de água Observe ao microscópio

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TÍTULO : IDENTIFICANDO TIPOS DE GRÃOS DE AMIDO

Material : microscópio 7 lâminas, 7 lamínulas, 7 espátulas água, papel filtro, conta gotas lugol ou solução de iodo batata farinha de trigo feijão milho arroz banana coroa-de-cristo

Procedimento :

Corte uma batata e raspe um pouco da parte interna dela com uma espátula Coloque a massa raspada numa lâmina com uma gota de água e cubra com uma

lamínula Observe ao microscópio o aspecto geral dos grãos de amido Com aumento maior procure identificar o hilo e as camadas de deposição do amido Após essa observação, coloque, sem retirar a lâmina do microscópio e sem deixar de

observar através das oculares, uma gota de lugol ou solução de iodo próximo à lamínula

Do outro lado da lamínula colocar um papel filtro para absorver a água e entrar o lugol. Observe

Use do mesmo procedimento para cada um dos materiais Faça um desenho de cada material, indicando o aumento com que foi feita a

observação

Responda : Onde está localizado o hilo em cada material ? E as faixas de deposição de amido ? Todos os grãos de amido são iguais ? Por que foi sugerido que se usasse iodo ou lugol ?

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TÍTULO: OBSERVAÇÀO DA CICLOSE

Material :

microscópio lâmina, lamínula pinça conta-gotas água papel filtro Elódea

Procedimento :

Retire, com uma pinça, uma folhinha da planta aquática Elódea Coloque-a numa lâmina com uma gota de água e cubra-a com uma lamínula Retire o excesso de água com papel filtro Observe com a objetiva de menor aumento para ter uma idéia geral da folha Em seguida, coloque uma objetiva de maior aumento e observe os cloroplastos Após algum tempo, observe o movimento dos cloroplastos dentro das células

Responda :

Após quanto tempo os cloroplastos começaram a se movimentar ? Que estruturas celulares você pôde observar ?

Faça um esquema, com legenda e indicando o aumento, do material observado.

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TÍTULO : PLASMÓLISE E DEPLASMÓLISE

Material :

Folhas de Tradescantia lâmina, lamínula água solução de sacarose microscópio papel filtro conta-gotas pinça de pontas finas

Procedimento :

Retirar, com a pinça, delicadamente, um fragmento do epitélio inferior da folha de Tradescantia

Colocá-lo numa lâmina com uma gota de água e cobrir com lamínula, evitando deixar bolhas de ar

Observe, ao microscópio, células que contenham pigmento avermelhado Verifique o espaço ocupado pelo vacúolo dentro da célula Sem deixar de observar pelas oculares, colocar num dos lados da lamínula umas gotas

de solução de sacarose, enquanto com o papel filtro retira a água do lado oposto Observe o que ocorre com o vacúolo com a entrada de sacarose na célula Novamente, com um conta-gotas, coloque água de um lado da lamínula, retirando a

sacarose, com papel filtro, do outro lado Observe

Responda :

O que acontece, e por qual processo, quando o material está imerso em água ? E quando acrescentamos a sacarose ? Esse processo é reversível ? O que poderá acontecer às células se forem mantidas na solução de sacarose ?

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Faça esquema das células nas duas situações.

TÍTULO : CULTURAS DE BACTÉRIAS E FUNGOS

Material :

meio de cultura em placas de Petri inoculação por : microscópio lâmina bateria de Gram

Procedimento :

Inocular as culturas conforme orientação dada em aula para cada grupo Anote a sua : Deixar na estufa Observar o aspecto da cultura na próxima semana (utilize o quadro anexo) Preparar um esfregaço do material obtido e utilizar a coloração de Gram para as

bactérias. Registre

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Para os fungos : retirar um pouco do material e colocá-lo numa lâmina com uma gota de água e cobrir com lamínula

Observar ao microscópio Fazer esquemas com legendas Ainda com os fungos, preparar uma lâmina com meio de cultura para os fungos Deixar mais uma semana na estufa e observar ao microscópio Registre.

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Departamento de Engenharia Química e de Alimentos

DQA 111 – BIOLOGIA E MICROBIOLOGIA

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LABORATÓRIO - 1.ª PARTE

Prof.ª Rosana Grandini

São Caetano do Sul

Fevereiro de 2003

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