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Redutasebonucleótido

QUÍMICA BIOINORGÂNICALicenciatura em Bioquímica

2012/2013

HENRIQUEFERNANDES([email protected])|JOÃORODRIGUES([email protected])

MetaloproteínadeFerro

ProfessoraResponsável:Prof.Dr.AnaCrisinaFreire



Redutasebonucleótido QUÍMICA BIOINORGÂNICALicenciatura em Bioquímica

2012/2013CLASSIFICAÇÃO

RibonucleósidodifosfatoRedutase

Nome

2’-desoxiribonucleósido-difosfato:oredoxina-dissulfito2’-oxidoredutaseNomeSistemáco

Oxidoredutase

ClasseEnzimáca

1.17.4.1

NúmeroES

9047-64-7sy

NúmeroCAS

ClasseI —Formanaturalmaisabundante; —Usaoradicardarosinaparaavaraponteférrea. —ReduzNDPsadNDPs.

ClasseII —Encontradaemcianobactérias; —Recorreàadenosinacobalaminaparageraroradical.

ClasseIII —Encontradaapenasemseresvivosanaeróbiosfacultavosouobrigatórios; —Oradicalforma-senumresíduodeglicinapróximodocentroférreo.

ClassesdeRNR[1]

[1]Stubbe,J.A.C.J.e.J.(2011)."ClassIRibonucleodeReductases:MetallocofactorAssemblyandRepairInVitroandInVivo."AnnualReviewofBiochemistry80:733-767.





2012/2013

Ins/tuiçõeseInves/gadores

• MassachusesInstuteofTechnology(MIT)

• NozomiAndo,DepartamentodeQuímica• JoAnneStubbe,DepartamentosdeQuímicaeBiologia• CatherineL.Drennan,DepartamentodeQuímica

• UniversidadedeOslo

• K.KristofferAndersson,DepartamentodeBiociênciasMoleculares• MahiasKolberg,DepartamentodeBiociênciasMoleculares

• UniversidadedeEstocolmo

• MargaretaSahlin,DepartamentosdeBiosicaeBiologiaMolecular

• FaculdadedeCiênciasdaUniversidadedoPorto

• NunoM.F.S.A.Cerqueira,REQUIMTE• PedroAlexandrinoFernandes,REQUIMTE

•

MariaJoãoRamos,REQUIMTEHENRIQUEFERNANDES([email protected])|JOÃORODRIGUES([email protected])




2012/2013RNR

Caracterís/cas:Tetrâmero(duasR1eduasR2)CadasubunidadeR2possuíumnúcleodiférrico

[2] J.Shao, B.Z., Bernard Chu e Y.Yen (2006). "RibonucleodeReductase Inhibitors and Future Drug Design." Current Cancer DrugTargets6:409-431.

Imagensdocentrometálicoobdasaparrdoficheirodecoordenadas1AV8eporvisualizaçãoemChimera®.





2012/2013

DescriçãodaGeometriaFe(III)






2012/2013MecanismoReacional

R1R2

Imagensdocentrometálicoobdasaparrdoficheirodecoordenadas1AV8e1RLReporvisualizaçãoemChimera®.

[3]JillianL.Dempsey,J.R.W.,eHarryB.Gray(2010)."Proton-CoupledElectronFlowinProteinRedoxMachines."AmericanChemicalSociety110:7024-7039. HENRIQUEFERNANDES([email protected])|JOÃORODRIGUES([email protected])




2012/2013

MecanismoReacionalFormaçãodoRadical

O

H

Y122

Fe2+Fe2+

O

O O

O

E115

E238

O

O

E204

O

O

D84

N N

NN

H118

H241

Apoproteína

+2Fe(II)

Geometria:TetraédricacomligeiradistorçãoFe2+:d6deSpinAlto

Mecanismoinspiradonoargo[4]edesenhadoemCSChemBioDrawUltra®.[4] Mahias Kolberg, K. R. S., Pa ̊l Graff, K. Kristoffer Andersson (2004). "Structure, funcon, and mechanism of ribonucleodereductases."1-34. HENRIQUEFERNANDES([email protected])|JOÃORODRIGUES([email protected])




2012/2013


O

H

Y122

Fe2+Fe2+

O

O O

O

E115

E238

O

O

E204

O

O

D84

NN

NN

H118

H241

+O2

Fe(IV)—O—Fe(III)

EstadodeTransiçãoU

PossívelMecanismo:

Fe(III)—O—O—Fe(III)Peróxido

Fe(IV) Fe(IV)

O

O

Mecanismoinspiradonoargo[4]edesenhadoemCSChemBioDrawUltra®.[4] Mahias Kolberg, K. R. S., Pa ̊l Graff, K. Kristoffer Andersson (2004). "Structure, funcon, and mechanism of ribonucleodereductases."1-34. HENRIQUEFERNANDES([email protected])|JOÃORODRIGUES([email protected])




2012/2013


Mecanismoinspiradonoargo[4]edesenhadoemCSChemBioDrawUltra®.[4] Mahias Kolberg, K. R. S., Pa ̊l Graff, K. Kristoffer Andersson (2004). "Structure, funcon, and mechanism of ribonucleodereductases."1-34.

O

H

Y122

Fe3+Fe4+

O

O

O

O

E115

E238

O

O

E204

O

O

D84

NN

NN

H118

H241

O

OH

Fe(IV)—O—Fe(III)

EstadodeTransiçãoU

+e-(W48.)

EstadodeTransiçãoX

+H2O

O

.

Y122

Fe3+Fe3+

O

HO

O

O

E115

E238

O

O

E204O

O

D84

NN

NN

H118

H241O

OH2

H2O

FormaAva





2012/2013

MecanismoReacionalReaçãocomADP

ADP

Mecanismoinspiradonoargo[4]emodeladoemChimera®aparrdosficheirosdecoordenadas1RLReADP(ligando)[4] Mahias Kolberg, K. R. S., Pa ̊l Graff, K. Kristoffer Andersson (2004). "Structure, funcon, and mechanism of ribonucleodereductases."1-34. HENRIQUEFERNANDES([email protected])|JOÃORODRIGUES([email protected])

l




2012/2013

RadicalCisteinil



i i l




2012/2013

Radical

Carbonilo



M i R i l




2012/2013

+

—



M i R i l




2012/2013



M i R i l




2012/2013

dADP



M i R i l




2012/2013


PoraçãodaTiorredoxinaapontedissulfuretoéquebrada(Redução)





2012/2013SAXS

• TitulaçãodasubunidadeR1comsubunidadeR2

• Aumentodovolumedas

par•culascomatulação

• Tetrâmerocomestequiometria1:1

[8] Nozomi Andoa, E. J. B., Chrisna M.Zimanyib, Michael A.Funkb, Kenichi Yokoyamab, Francisco J. Asturiasd, JoAnne Stubbeb,eCatherineL.Drennan"StructuralinterconversionsmodulateacvityofE.coliribonucleodereductase."HENRIQUEFERNANDES([email protected])|JOÃORODRIGUES([email protected])




2012/2013SAXS

• Paraconcentraçõessuperioresa4mg/mLotetrâmeroformaagregados

[9]U.Uhlin,V.D.,P.V.Konarev,D.I.SverguneL.Thelander"AfirstSAXStest-runtoestablishtheformaonoftheClassIribonucleode

reductase(RNR)complexoftheT4phage."331-332.


Í Â




2012/2013SAXS

PerfisdeSAXSsimuladospeloprogramaChimera®


Í ÂDi í Ci l




2012/2013

DicroísmoCircularMagné/co

[4] Mahias Kolberg, K. R. S., Pa ̊l Graff, K. Kristoffer Andersson (2004). "Structure, funcon, and mechanism of ribonucleodereductases."1-34.[5]AneB.Tomter,C.B.B.I.,A ̊smundK.Røhr,K.KristofferAndersson,eEdwardI.Solomon(2008)."CircularDichroismandMagnec

CircularDichroismStudiesoftheBiferrousSiteoftheClassIbRibonucleodeReductasefromBacilluscereus:ComparisontotheClassIaEnzymes."Biochemistry47:11300-11309.

EnsaiodeDCM;A–Dadosrecolhidosa4°C;B–Dadosrecolhidosa1,6Ke7T.[5]

• Curva a vermelho corresponde aonúcleo de ferro da RNR (subunidadeR2)daE.coli .

• Pico a 7500 cm-1 evidenciam que osdois Fe(II) (d6) são de spin alto masapresentam sinais opostos pelo queevidenciam um campo paramagnécofraco.


Í ÂE t i




2012/2013

EspectroscopiaElectrónica

Legenda:...... 0,1sdepoisdamistura--- 1,1sdepoisdamistura— 20sdepoisdamistura

Intermediárioµ-1,2-peróxido

diférrico(III)Fe3+—O—O—Fe3+

RadicalTirosil

[8]JeffreyBaldwin,W.C.V.,NellyKhidekel,PierreMoenne-Loccoz,CarstenKrebs,AliceS.Pereira,BrendaA.Ley,BoiHanhHuynh,ThomasM.Loehr,Pamela J. Riggs-Gelasco, Amy C. Rosenzweig, e J. Marn Bollinger, Jr. (2001). "Raonal Reprogramming of the R2 Subunit of Escherichia coliRibonucleodeReductaseintoaSelf-HydroxylangMonooxygenase."AmericanChemicalSociety123(29):7017-7030.

R2-W48F/D84E avada por O2emedidoem“stopped-flowspectrofotometry”.Os

espectros foram obdos por mistura deiguais volumes de uma solução de O2saturada e uma solução de 0,14mM daproteínaemtampão.


Í ÂEspectroscopia de




2012/2013

EspectroscopiadeMössbauer—>MMO

A—Após0,025segundosB—Após0,08segundosC—Após0,3segundosD—Após60segundos

--- EspectroExperimental

— EspectroTeórico(nãoprevêaexistênciadeumaespécieintermediária)

[8]JeffreyBaldwin,W.C.V.,NellyKhidekel,PierreMoenne-Loccoz,CarstenKrebs, Alice S.Pereira,BrendaA. Ley,Boi Hanh Huynh, Thomas M.Loehr,PamelaJ.Riggs-Gelasco,AmyC.Rosenzweig,eJ.MarnBollinger,Jr.(2001)." Rao nal R ep ro gram mi ng o f the R 2 S ub un it o f E sche ri ch ia col iRibonucleode Reductase into a Self-Hydroxylang Monooxygenase."

AmericanChemicalSociety123(29):7017-7030.

“Mössbauer spectra of freeze-quenched” de amostrasobdasporreaçãode0,56mMdeapoproteínaR2-W48F/D84E,1,7mMFe(II)e1,9mMO2at5°Cem50mMNa-

Hepes(pH7.6).


QUÍMICA BIOINORGÂNICA




2012/2013

EXAFS—IntermediárioX

[6]PamelaJ.Riggs-Gelasco,L.S.,ShuxianChen,DougBurdi,BoiHanhHuynh,LawrenceQue,Jr.,eJoAnneStubbe(1997)."EXAFSCharacterizaonoftheIntermediateXGeneratedDuringtheAssemblyoftheEscherichiacoliRibonucleodeReductaseR2DiferricTyrosylRadicalCofactor."AmericanChemicalSociety120.

Resultados de EXAFS; A corresponde à formanavaantesde seangiro intermediárioX;Bcorresponde ao intermdiário X da R2; CcorrespondeaumaformadaY122marcada.

TransformadadeFourierparaosvalores obdos por EXAFS aparr de 5 amostras contendointermediárioX


QUÍMICA BIOINORGÂNICAIntermediário X




2012/2013

IntermediárioXCoordenação

Correspondema transferência d-d permidas por spin para o Fe(IV)(d4)despinalto.OFe(III)despin alto não possuí nenhumatransiçãod-dpermidaporspin.

Bandasdetransferênciadecarga

[7]NatasˇaMic´,L.S.,GerhardSchenk,J.MarnBollinger,Jr.,eEdwardI.Solomon(2003)."Rapid-Freeze-QuenchMagnecCircularDichroismofIntermediateXinRibonucleodeReductase:NewStructuralInsight."AmericanChemicalSociety125(37):11200-11201.

IntermediárioR2-Y122F/Y356F-X;A–ResoluçãogaussianadosdadosdeDCMa10K;B—ResoluçãogaussianadosdadosdeDCMa1,7K7T.






2012/2013

Compostosinté/cos

[10]LawrenceQue,J.(1997)."Oxygenacvaonatnon-hemediironacvesitesinbiology:lessonsfrommodelcomplexes."JournalChemistrySociety:3933-3940.

Exemplo de dois compostos

que mimezam o centrometálico da RNR. (Rosa) Fe;(Vermelho) O; (Cinzento) C;(Roxo) N; (Azul) N do grupoamino






2012/2013BibliografiaComplementar

[11]LivJ.Rather,E.B.,WaelIsmaileGeorgFuchs(2011)."ThereducingcomponentBoxAofbenzoyl-coenzymeAepoxidasefromAzoarcusevansiiisa[4Fe–4S]protein."Elsevier1814:1609-1615.[12] Guro K. Sandvik1, A. B. T., Jonas Bergan, Giorgio Zoppellaro, Anne-Laure Barra, A ̊smund K. Røhr, MahiasKolberg,SanEllefsen,K.KristofferAnderssoneGoranE.Nilsson(2012)."StudiesofRibonucleodeReductaseinCrucianCarp—AnOxygenDependentEnzymeinanAnoxiaTolerantVertebrate."PlosOne7(8).[13]BradS.Pierce,T.E.E.,eMichaelP.Hendrich(2002)."MechaniscImplicaonsfortheFormaonoftheDiiron

ClusterinRibonucleodeReductaseProvidedbyQuantaveEPRSpectroscopy."AmericanChemicalSociety125:8748-8759.[14] Ane B. Tomter, G. Z., Florian Schmitzberger, Niels H. Andersen, Anne-Laure Barra, Henrik Engman, Pa ̈rNordlund,e K. KristofferAndersson(2011)."HF-EPR,Raman, UV/VIS Light Spectroscopic, and DFT Studies of theRibonucleodeReductaseR2TyrosylRadicalfromEpstein-BarrVirus."PlosOne6(9).

[15]Wen-GeHan,T.L.,TimothyLovell,eLouisNoodleman(2005)."AcveSiteStructureofClassIRibonucleodeReductase Intermediate X: A Density Funconal Theory Analysis of Structure, Energecs, and Spectroscopy."AmericanChemicalSociety127:15778-15790.[16]NunoM.F.S.A.Cerqueira,P.A.F.,LeifA.Eriksson,eMariaJoãoRamos(2006)."DehydraonofRibonucleodesCatalyzedbyRibonucleodeReductase:TheRoleoftheEnzyme."BiophysicalJournal90:2109-2119.

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