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Marco A. Z. ArrudaAPLICAÇÃOAPLICAÇÃOExtração Extração de de proteínas proteínas -- Ponto NuvemPonto Nuvem
SurfactantesSurfactantes nãonão--iônicos iônicos
SurfactantesSurfactantes iônicosiônicos
SurfactantesSurfactantes anfóterosanfóteros((zwiteriônicoszwiteriônicos)
PréPré--concentraçãoconcentração
SemiSemi--purificaçãopurificação
PurificaçãoPurificação
)
Temperaturas evitam Temperaturas evitam desnaturaçãodesnaturação
APLICAÇÃOAPLICAÇÃOExtração Extração de de proteínas proteínas -- Ponto NuvemPonto Nuvem
5 grandes frações:5 grandes frações:Albumina (59%)Albumina (59%)αα1 1 (5%)(5%)αα22 (8%)(8%)ββ (12%)(12%)γγ (16%)(16%)
Proteínas do plasma sangüíneoProteínas do plasma sangüíneo
76 proteínas76 proteínasMonitorar Monitorar doençasdoenças
Interesse Interesse protéicoprotéico
Marco A. Z. Arruda
APLICAÇÃOAPLICAÇÃOExtração Extração de de proteínas proteínas -- Ponto NuvemPonto Nuvem
Otimizar um sistema utilizando Otimizar um sistema utilizando TritonTriton XX--114 114 na extração e/ou semipurificação de proteínas na extração e/ou semipurificação de proteínas de plasma sangüíneode plasma sangüíneo
Caracterizar as proteínas das fases pobre e Caracterizar as proteínas das fases pobre e rica no rica no surfactante
CH2C
CH3 CH3
CH3CH3
CH3 C O (CH2CH2O)7_ 8H
surfactante
Marco A. Z. Arruda
FASE RICAFASE RICA
FASE POBREFASE POBRE
Marco A. Z. Arruda
Extração Extração de de proteínas proteínas -- Ponto NuvemPonto NuvemAPLICAÇÃOAPLICAÇÃO
Homogeneização Homogeneização ((vórtexvórtex)) Tempo de contato entre a Tempo de contato entre a
proteína e o proteína e o surfactantesurfactanteNaClNaCl(s)(s) + 8 + 8 mLmL surf.+surf.+
200 µL tampão 200 µL tampão KK22HPOHPO44/ / NaOHNaOH + +
amostraamostra
Variáveis:Variáveis:
* Concentração do * Concentração do surfactante surfactante (2 a 15% m/v)(2 a 15% m/v)
* Volume de amostra* Volume de amostra(100 a 2000 µL) (100 a 2000 µL)
* Concentração de * Concentração de NaClNaCl(6 a 12% m/v)(6 a 12% m/v)
* pH de extração* pH de extração(6,4 a 7,4)(6,4 a 7,4)
* Tempo de contato* Tempo de contato(0 a 20 minutos)
Centrifugação Centrifugação 3000 3000 rpmrpm (10 min)(10 min)
(0 a 20 minutos)Proteínas totais: Proteínas totais:
Método de Método de BradfordBradford
APLICAÇÃOAPLICAÇÃOExtração Extração de de proteínas proteínas -- Ponto NuvemPonto Nuvem
Marco A. Z. Arruda
PMPMkDakDa
116116
66,266,2
45,045,0
35,035,0
25,025,0
FRFR FPFP
Condição Condição ótima ótima
TXTX--114 5% (m/v)114 5% (m/v)
100 µL de 100 µL de amostraamostra
10% (m/v) de 10% (m/v) de NaClNaCl
pH 7,2pH 7,2
0 min0 min
tt trabalho 25ºCtrabalho 25ºC% extração: 65,0 % extração: 65,0 -- 84,6%84,6%
RSDsRSDs < 15%< 15%
Metodologia simples, rápida e versátil na Metodologia simples, rápida e versátil na extração/semiextração/semi--purificação de proteínas purificação de proteínas
Sistema Sistema micelarmicelar contribui na manipulação e no contribui na manipulação e no tratamento de biomoléculas tratamento de biomoléculas
Marco A. Z. Arruda
Extração Extração de de proteínasproteínasPonto Nuvem
APLICAÇÃOAPLICAÇÃO
Ponto Nuvem
Etapas básicas na extraçãoEtapas básicas na extração//separaçãoseparaçãode de proteínas
Marco A. Z. Arruda
AmostraAmostra
Ruptura celularRuptura celular
CentrifugaçãoCentrifugação
Análise/Análise/DetDet..
SolubilizaçãoSolubilização
proteínas
FracionamentoFracionamento
Marco A. Z. ArrudaAnálise/DeterminaçãoAnálise/DeterminaçãoProteínas totaisProteínas totais
BiuretoBiureto Mistura de cobre e hidrMistura de cobre e hidróóxido de sxido de sóódiodiocom um com um complexante complexante para estabilizapara estabilizaçãçãoo
LowryLowry Mistura de Mistura de molibdatomolibdato, , tungstato tungstato e e áácido fosfcido fosfóórico que sofre redurico que sofre reduçãção quando reage como quando reage com
proteproteíínas na presennas na presençça de Cu (II)a de Cu (II)
BradfordBradford Determina proteDetermina proteíínas totais utilizando nas totais utilizando o corante o corante ““Coomassie Brilliant BlueCoomassie Brilliant Blue”” BGBG--250250
Análise/DeterminaçãoAnálise/Determinação
Proteínas totais Proteínas totais -- BradfordBradfordInteração ocorre com macromoléculas de proteínas contendo aminoácidos com cadeias laterais básicas
ou aromáticas
NC2H5
CH3
SO3-Na+
C
NH
OC2H5
NC2H5
-O3S
Coomassie Brilliant Blue G-250Marco A. Z. Arruda
Análise/DeterminaçãoAnálise/Determinação
Proteínas totais Proteínas totais -- BradfordBradford
ausência de proteínasausência de proteínas
Marco A. Z. Arruda
595 595 nmnm
presença de proteínaspresença de proteínas
Marco A. Z. Arruda
Espectrometria de massasEspectrometria de massasAnálise/DeterminaçãoAnálise/Determinação
•• Determinação da estrutura primária;Determinação da estrutura primária;
•• alta sensibilidade;alta sensibilidade;
•• rapidezrapidez
••MALDIMALDI--TofTof--MSMS (do ingl(do inglêês, s, MatrixMatrix--AssistedAssisted Laser Laser DesorptionDesorption//IonizationIonization
Time of Time of Flight Mass Spectrometry Flight Mass Spectrometry
Matrizes para MALDII- Ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (CCA)II- Ácido sinpínico
CH CH COOHH3CO
HOOCH3
CH CCOOH
HO
CN
I II
Marco A. Z. Arruda
Análise/DeterminaçãoAnálise/Determinação
Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda
Analisador de massas baseado em tempo de vôo
Feixe de Laser
pulsado
++
+
++
+++
++
+++
+
++ +
+
Marco A. Z. Arruda
Aceleração de partículas carregadas
Campo elétrico
(5-20 kV)
Laser
Detector
Analisador de massas baseado em tempo de vôo
Alto vácuo: 10-5 – 10-8 mbar
Processador de sinal
Marco A. Z. Arruda
Analisador de massas baseado em tempo de vôo
Laser
Detector
Processador de sinal
Marco A. Z. Arruda
Analisador de massas baseado em tempo de vôo
Laser
Detector
Processador de sinal
Marco A. Z. Arruda
Analisador de massas baseado em tempo de vôo
Laser
Detector
Processador de sinal
Marco A. Z. ArrudaSpectrum
Analisador de massas baseado em tempo de vôo
Laser
Detector
Processador de sinal
Marco A. Z. ArrudaSpectrum
Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArrudaAnálise/DeterminaçãoAnálise/Determinação
APLICAÇÕESAPLICAÇÕES
ParkPark, Z, Z--Y & Russel, D. H.Y & Russel, D. H.
Anal. Anal. ChemChem.. 73(2001)255873(2001)2558
•• IdentificaIdentificaçãção de proteo de proteíínas em uma mistura nas em uma mistura ((concconc. de 1. de 1-- 5 5 µµmol/L) usando MALDI.mol/L) usando MALDI.
•• DesnaturaDesnaturaçãção to téérmica e qurmica e quíímica (mica (hidrocloretohidrocloretode de guanidinaguanidina, DTT e , DTT e iodoacetaminaiodoacetamina). As ). As amostras foram digeridas.amostras foram digeridas.
Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda
Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArrudaAPLICAÇÕESAPLICAÇÕES
A bu n
d ân c
i a d e
ìons
Massa (m/z)
39 39 fragfrag..6 6 protprot..
A bu n
d ân c
i a d e
ìons
Massa (m/z)
A bu n
d ân c
i a d e
ìons
26 26 fragfrag..6 6 protprot..
Massa (m/z)
76 76 fragfrag..
11 11 protprot..
Espectros de massas de mistura de proteínas. A) nãoEspectros de massas de mistura de proteínas. A) não--desnaturada, B) desnaturação química e C) desnaturada, B) desnaturação química e C) desnaturação térmica.desnaturação térmica.
CaCa, , FeFe, Mg, K, Cu, , Mg, K, Cu, ZnZn......
••Agentes sinalizadoresAgentes sinalizadores••NutrientesNutrientes••ContaminantesContaminantes••Ligados a proteínasLigados a proteínas••Incorporados em suasIncorporados em suasestruturasestruturas
MetalômicaMetalômicaEstrutura terciária da Estrutura terciária da CalmodulinaCalmodulinade um terminal N com de um terminal N com CaCa ligado àligado àsua estruturasua estrutura8,523 8,523 kDakDaIshida Ishida etet alal., ., BiochemBiochem., 2000 ., 2000 fonte: www.fonte: www.rcsbrcsb..orgorg//pdbpdb/cgi /cgi
Marco A. Z. Arruda
METALÔMICAMETALÔMICA
Lactoferrina Lactoferrina alteraalteraçãção de conformao de conformaçãção o seletividade seletividade
Marco A. Z. Arruda
APLICAÇÕESAPLICAÇÕES
Marco A. Z. Arruda
Calo de Calo de CitrusCitrus(25x)(25x)
Amostra Amostra Material Material embriogembriogêêniconicoExtração proteínas:Extração proteínas:300 mg amostra +300 mg amostra +TrisTris--HClHClSDSSDSββ--mercaptoetanolmercaptoetanolGlicerolGlicerolAzul de Azul de bromofenolbromofenol
Mistura:Mistura:moagem (4°C),moagem (4°C),agitação (20 min) eagitação (20 min) eultracentrifugaçãoultracentrifugação(5 min (5 min –– caca. 8500 g)
VerbiVerbi, F. M. , F. M. etet alal., ., JBBMJBBM, aceito , aceito
. 8500 g)
Separação eletroforética – SDS PAGE
Marco A. Z. Arruda
i=10mA i=10mA E=40VE=40V
i=30mAi=30mAE=120VE=120Vcaca.. 10 h10 h1010--1515ooCC
GelGelseparadorseparador3,0% (m/v)3,0% (m/v)
pH 6,8pH 6,8
Gel deGel decorridacorrida
12,5% (m/v)12,5% (m/v)pH 8,8pH 8,8
Resultado da separação eletroforética
Obtained Obtained gelgel
11 22 33 44PMPM
((kDakDa))116116
66.266.2
45.045.0
35.035.0
25.025.0
18.418.4
14.414.4
Branco, 86, 81, 75, 62, Branco, 86, 81, 75, 62,
55, 53, 36, 32, 27, 26,555, 53, 36, 32, 27, 26,5
19, 15, 14 19, 15, 14 kDakDa
Marco A. Z. Arruda
Decomposição das proteínas e do gel
0033
790062
400031
Potência(W)
Tempo(min)
EtapaPrograma
HNOHNO33/H/H22OO22: 4:1 : 4:1 mLmLquase à secura (60quase à secura (60--7070ooC)C)volumes ajustados para 5mLvolumes ajustados para 5mLcom HNOcom HNO33 0,2% (v/v)
Teores de C Teores de C resres.:.:0,52 0,52 –– 1,50%1,50%
Marco A. Z. Arruda0,2% (v/v)
---2,36±0,7121,8±5,4744,0±6,02235±35,514---4,42±0,94---24,7±7,18---15---------6,02±2,3042,4±7,1619---------19,7±0,74126±19,624
23,5±6,721,30±0,14------210±42,626,517,7±5,364,78±1,08---------275,70±1,445,05±1,56---2,47±0,45283±33,332
---2,75±0,58---------3617,1±4,940,91±0,23---6,85±0,98---5329,1±5,93------6,31±0,97---553,39±0,82------------6229,7±4,587,50±1,52------61,7±7,6475
------105±12,7------81
14,1±4,4415,9±2,32---96,8±16,6---86
ZnCuFeKCa
MetaisPM (kDa)
SRSR--TRXRF (LNLS) TRXRF (LNLS) -- n=3, (n=3, (µµg gg g--11))
GEPAM GEPAM –– BioanalíticaBioanalítica
Joselito NardyJoselito Nardy Ribeiro (PD)Ribeiro (PD)
Jerusa Simoni Garcia (Dr) Jerusa Simoni Garcia (Dr)
Cristiana Cristiana Schmidt de Magalhães (Dr) Schmidt de Magalhães (Dr)
Aline Aline Soriano Soriano Lopes (Lopes (MScMSc))
Alessandra Alessandra Sussulini Sussulini ((MScMSc))
Marcelo A. Marcelo A. OseasOseas da Silva (IC)da Silva (IC)
Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda
OBRIGADO!!OBRIGADO!!
Marco A. Z. Arruda